KR20010005974A - 현미경법 이미징 장치 및 방법 - Google Patents

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Abstract

물체는 광원에 의해 조명되며 투명 및 불투명 스트라이프의 주기적인 패턴은 상기 물체(0)상에 포개진다. 최소한 3 개의 이미지는 얕은 초점 깊이의 현미경에 의해 상기 패턴의 상이한 공간 위상에 기록되고, 단지 초점이 맞는 세부만을 포함하는 3 차원 이미지는 상기 주기적인 패턴을 제거하는 이미지 처리에 의해 상기 기록된 이미지로 부터 생성된다. 2 개의 코히어런트 비임의 간섭 주변 또는 조명 마스크(14)는 상기 주기적인 패턴을 생성시킨다. 상이한 공간 위상은 상기 마스크를 이동시키거나 상기 코히어런트 비임의 일시적인 위상 차를 조절함으로써 생성된다.

Description

현미경법 이미징 장치 및 방법{MICROSCOPY IMAGING APPARATUS AND METHOD}
본 발명은 현미경법 이미징 장치 및 이미징 방법에 관한 것이며, 구체적으로 기술하면, 단지 초점이 맞는 세부(細部)만을 일반적으로 포함하는 이미지를 생성하는 현미경법 이미징 장치 및 그 방법에 관한 것이다. 본 발명은 초점이 맞는 3 차원적 체적 구조의 이미지를 만들어 내는 데 사용될 수 있는 이미지를 생성하는 데 적합하다.
종래의 광(光) 현미경의 경우에 있어서는 3 차원적 구조가 성공적으로 이미지화될 수 없다. 결과적인 이미지는 3 차원적 구조의 초점 정합 영역의 모난 이미지와 아울러, 상기 초점 정합 영역의 상·하부의 초점이 흐린 상기 구조의 이미지로 이루어져 있다. 종래의 광 현미경은 초점이 맞지 않는 세부를 배제할 수 없다.
차후에 초점이 맞는 완전한 3 차원적 체적 구조의 이미지를 형성하도록 결합될 수 있는 초점이 맞는 상기 구조의 개별 계층 또는 층의 이미지를 제공하기 위해 3 차원적 구조를 광학 방식으로 입체 절단하는 공초점(共焦点;confocus) 현미경이 개발되어 왔다. 불행하게도, 인코히어런트(incoherent) 광원이 사용되는 경우에는공초점 현미경의 광 수집이 일반적으로 불량하다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 극히 얕은 깊이의 초점을 얻을 수 있지만, 값비싼 장치 및 레이저 광의 초점이 맞춰져야 하는 조명/이미징 핀홀(pinhole)을 필요로 한다.
미국 특허 제 5,381,236 호에는 3 차원적 구조의 개별 특징의 범위(거리)를 결정하는 데 사용되는 광학 센서가 기재되어 있다. 상기 센서는 상기 구조를 조명하며 역전가능한(즉,패턴이 180°로 이상(移相)됨) 주기 패턴형 광원을 지닌다. 상기 광원의 패턴에 정렬되는 검출기 요소의 어레이는 상기 구조를 조명하는 패턴의 이미지 및 그 패턴의 역전 이미지를 검출하는 데 사용된다. 상기 패턴이 단지 자신의 초점이 맞는 구조의 그러한 부분상에서 양호하게 이미지화됨에 따라, 이는 초점이 맞는 상기 구조의 부분의 범위(거리)가 결정되는 것을 가능하게 한다. 미국 특허 제 5,381,236 호에 기재된 장치 및 방법은 상기 검출기의 개별 요소들을 작동시키기 위해 광원의 패턴과 정확하게 정렬되어야 하며 또한 광원의 패턴과 정확하게 정합되어야 하는 불리한 점을 지닌다. 실제로, 이는 거의 달성하기가 불가능하다고 알려져 왔다.
본 발명은 공초점 이미지와 유사한 방식으로, 실질적으로 단지 초점이 맞는 세부만을 포함하고 구조의 광학 입체 절단을 통해 구조의 3 차원적 이미지를 만들어 내는 데 사용될 수 있는 이미지를 생성시키는 현미경법 이미징 장치 및 이미징 방법을 제공하고자 한 것이다. 본 발명은 검출기 및 패턴 구성요소의 정확한 정렬 또는 정합에 대한 필요성없이 광학 입체 절단을 달성하고 그와 동시에 선호적인 광 수집을 제공한다.
한 실시 태양에 있어서, 본 발명은 광원으로 견본을 조명하는 단계; 상기 견본상에 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성시키는 단계; 상기 견본의 제 1 이미지를 기록하는 단계; 상기 견본상의 패턴의 공간 위상을 변경시키고 상기 견본의 제 2 이미지를 기록하는 단계; 상기 견본상의 패턴의 공간 위상을 변경시키고 상기 견본의 제 3 이미지를 기록하는 단계를 최소한 한 번이상 반복하는 단계로서, 상기 견본의 최소한 3 번 기록된 이미지를 이루는 패턴의 공간 위상이 상이한 반복 단계; 및 상기 3 번이상 기록된 이미지로 부터 공간 패턴을 제거하여 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성하도록 3 번이상 기록된 견본의 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법을 제공한다.
상기에 언급한 선행 기술이 마스크 패턴과 연관된 엄중한 요건에 맞는 정합형 검출기 그리드(grid)에 의존하지만, 본 발명은 그와 같은 정합형 검출기 그리드에 대한 필요성이 없다는 점에서 유리하다. 이미지 데이터의 처리는 간단하며 본 발명은 실 시간에 종래의 현미경으로 부터 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성시킬 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 방법은 초점이 맞는 상기 견본의 3 차원적 이미지를 생성시키도록 상이한 초점 위치로 반복된다. 하기에 기술되는 본 발명의 특정한 실시예에 있어서, 견본의 표면 바탕의 3 차원적 이미지는 그리하여 얻어진다.
상기 패턴의 공간 위상은 연속적으로나 또는 개별 단계로 변경될 수 있다. 상기 공간 위상이 연속적으로 변경되는 부분에서는, 상기 기록된 견본의 이미지가 미리 결정된 시간에 걸쳐 적분된다. 이는 계산되어지고 또한 실제로 상기 패턴의 공간 위상이 연속적으로 변경되는 경우에 고품질의 이미지가 얻어지는 것으로 확인되어진다. 따라서, 상기 공간 위상을 변경시키는 광범위한 수단은 본 발명에 적용된다.
또 다른 실시 태양에 있어서, 본 발명은 최소한 3 개의 동일한 견본의 이미지의 이미지 데이터를 처리하는 방법으로서, 상기 이미지가 상부에 포개지는 실질적으로 주기적인 패턴을 지니고, 3 개의 이미지상의 패턴의 공간 위상이 상이한 이미지 데이터 처리 방법을 제공하는 데, 상기 이미지 데이터 처리 방법은 상기 패턴이 없는 복합 이미지를 생성시키도록 상기 데이터를 분석하는 단계를 포함한다.
여전히 또 다른 실시 태양에 있어서, 본 발명은 광원; 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성시키는 패터닝 수단; 견본상에서 상기 광원으로 부터 조명되는 광의 초점을 맞추고 상기 견본상의 패턴을 생성시키는 초점 정합 수단; 상기 견본상에 생성된 패턴의 공간 위상을 조절하는 이상(移相) 수단; 상기 견본의 이미지를 검출하는 검출기; 및 상기 견본의 이미지를 분석하는 수단으로서, 상기 패턴의 공간 이상이 최소한 3 개의 이미지에서 상이한 분석 수단, 및 상기 견본의 3 개의 이미지로 부터 상기 공간 패턴을 제거하여 상기 견본의 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성시키는 수단을 포함하는 분석기를 포함하는 현미경법 이미징 장치를 제공한다.
바람직하기로는, 상기 패터닝 수단은 1 차원적 국부 주기 특성을 지니는 마스크의 형태를 이루고 마스크 패턴은 상기 견본상에 투사되는 것이다. 예를 들면, 상기 마스크는 선형 격자(linear grating)일 수 있다. 상기 마스크는 또한 나선형 격자를 포함하는 원형 마스크일 수도 있다. 이 후자의 경우에는, 상기 패턴이 상기 원형 마스크의 에지를 향해 위치해 있는 격자의 일부를 통해서나 또는 상기 원형 마스크의 에지에서 상기 견본을 조명함으로써 편리하게 상기 견본상에 투사되는 데, 이러한 부분에서는, 상기 나선형 격자는 평행 선의 격자에 접근한다. 이러한 나선형 격자의 이점은 상기 격자의 연속 이동이 상기 마스크의 회전에 의해 달성된다는 것이다. 변형적으로는, 코히어런트 광원이 사용되는 경우, 상기 패터닝 수단은 상기 제 1 광원으로 부터 조명되는 광을 간섭하도록 배치되는 제 2 코히어런스 광원에 의해 제공될 수 있다.
부가적인 실시 태양에 있어서, 본 발명은 종래의 현미경을 수정하기에 적합한 장치를 제공하며, 상기 장치는 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성시키는 패터닝 수단, 상기 패턴의 공간 위상을 조절하는 이상 수단 및 상기 공간 패턴이 생성되어진 견본의 이미지를 분석하는 수단으로서, 상기 패턴의 공간 이상이 최소한 3 개의 이미지에서 상이한 분석 수단, 및 광학적으로 입체 절단된 상기 견본의 이미지를 생성시키도록 상기 3 개의 이미지로 부터 공간 패턴을 제거하는 수단을 지니는 분석기를 포함한다.
다른 한 부가적인 실시예에 있어서, 본 발명은 광학적으로 입체 절단된 견본의 이미지를 생성시키도록 종래의 현미경을 적응시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 견본상에 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성시키도록 상기 현미경의 광학 시스템내에 패터닝 수단을 도입시키는 단계; 상기 패턴의 공간 위상을 조절하여 상기 견본상의 최소한 3 개의 상이한 공간 이상된 패턴을 생성시키는 공간 이상 수단을 제공하는 단계; 및 상기 견본의 최소한 3 개의 개별 이미지를 분석하는 수단으로서, 각각의 이미지가 상기 패턴의 상이한 공간 이상을 갖는 분석 수단, 및 상기 견본의 이미지로 부터 공간 패턴을 제거하여 광학적으로 입체 절단된 상기 견본의 이미지를 생성하는 수단을 지니는 분석기를 제공하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명의 이점은 종래의 현미경인 편재해 있는 일부 실험 장치가 광학적으로 입체 절단된 이미지를 제공할 수 있도록 용이하게 개조될 수 있다는 점이다.
본 발명은 또한 최소한 3 개의 동일한 견본의 이미지의 이미지 데이터를 처리하는 방법으로서, 상기 이미지가 상부에 포개지는 실질적으로 주기적인 패턴을 지니고 3 개의 이미지상의 패턴의 공간 위상이 상이한 이미지 데이터 처리 방법을 제공하는 데, 상기 이미지 데이터 처리 방법은 상기 패턴이 없는 복합 이미지를 상기 이미지로 부터 생성시키도록 상기 데이터를 분석하는 단계를 포함한다.
지금부터 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 기술하면 다음과 같다.
도 1은 본 발명에 따른 현미경법 이미징 장치의 개략적인 다이어그램이다.
도 2는 본 발명의 광학 시스템의 개략적인 다이어그램이다.
도 3은 도 2의 시스템의 측정된 축 응답을 보여 준다.
도 4(a)는 본 발명에 따라 얻어지는 백합 화분 입자(필드 사이즈가 100㎛ х 70㎛ 임)의 자동초점 이미지를 보여 준다.
도 4(b)는 현미경이 중간 깊이 면에서 초점정합되는 경우 (본 발명에 따르지 않은) 백합 화분 입자의 종래의 이미지를 보여 준다.
도 1에 도시된 이미징 장치는 종래의 현미경의 대부분의 특징을 지니며 구체적으로 기술하면, 인코히어런트 광원(10), 하나 이상의 렌즈(11)의 형태를 이루는 것이 바람직스러우며 O 형상으로 이미지화되는 물체상에 상기 광원(10)으로 부터 조명되는 광의 초점을 맞추는 초점 정합 수단을 포함한다. 비임 스플리터(12)는 상기 물체로 부터 반사되는 광이 CCD 카메라의 형태를 이루는 것이 바람직스러운 광 검출기(13)를 향해 반사되도록 상기 광원 및 상기 물체사이에 배치된다. 그 이외에도, 상기 장치는, 예를 들면, 격자(grating) 형태로 패터닝되고, 상기 물체가 0 이 아니며 공간적인 면에서 실질적으로 주기적인 패턴으로 조명되도록 상기 광원(10)이 구비되어 있는 마스크(14)를 포함한다. 그리하여, 마스크 패턴은 그러한 견본상에 투사된다. 바람직하기로는, 상기 마스크 패턴은 단지 1 차원으로 국부 주기 특성을 지니는 것이다. 상기 검출기의 면(面)은 투사된 패턴이 광학적으로 입체 절단된 상기 물체의 이미지가 형성되는 것을 가능하게 하도록 초점이 맞춰지는 면에 결합된다.
상기 장치는 최소한 3 개의 상기 마스크 패턴의 위상이 생성되도록 상기 물체상에 초점이 맞춰지는 마스크 패턴의 공간 위상을 조절하는 공간 이상(移相) 수단(15)을 부가적으로 포함한다. 상기 이상 수단(15)은 상기 물체상에 초점이 맞춰지는 패터닝된 광의 공간 위상이 변경될 수 있도록 상기 물체에 대하여 증분적으로나 또는 연속적으로 상기 마스크를
이동시키는 캐리지(carriage) 의 형태를 이룰 수 있다. 선형 격자의 형태를 이루는 마스크의 경우에, 상기 캐리지는 상기 이미지 장치의 축에 수직으로 상기 격자를 이동시키도록 배치된다. 상기 공간 위상을 조절하는 다른 한 선택은 상기 투사된 패턴의 위상을 이동시키도록 상기 비임 스플리터의 이동을 포함한다. 상기 패턴은 상이한 방식으로 그러한 견본상에 생성될 수 있다. 상기 패턴은 선택적으로 예를 들면 나란한 스트라이프와 같은 패턴을 갖는 리본 벨트를 사용하여 생성될 수 있다. 여기서, 광원은 상기 견본상에 리본의 패턴을 투사한다. 그러한 리본은 광이 단지 상기 광원 및 상기 물체사이에 있는 리본의 그러한 부분을 통해 비춰지도록 상기 광원주위에 루프를 형성한다. 변형적으로는, 상기 리본은 상기 견본주위에 루프를 형성한다.
다른 한 선택은 상기 리본이 거울주위에 루프를 형성하고, 상기 리본의 일부가 상기 광원 및 상기 거울사이에 배치된다는 것이다. 상기 리본을 통과한 광은 그후 상기 거울에 의해 상기 견본상에 반사된다. 그와 같은 리본은 이리하여 항상 동일한 방향으로 연속적이거나 증분적으로 이동될 수 있다. 이는 톱니 방식으로 이동시키거나 또는 이동 방향을 역전시킬 필요없이 예를 들면 정확히 나란한 스트라이프(직사각형 면을 포함하는 마스크의 경우와 같이)의 패턴을 생성시키는 이점을 제공한다.
도 1에서, 상기 이상 수단(15)은 상기 이미지 장치의 축과 수직인 면에 배치된 3 개의 미리 결정된 위치로(페이지내로 및 페이지로 부터) 상기 마스크(14)를 이동하도록 배치되는 캐리지의 형태를 이룬다. 상기 캐리지의 3 개의 위치는 상기 마스크의 3 개의 상이한 공간 위상이 상기 물체상에 초점 정합되도록 선택된다. 예를 들면, 상기 3 개의 위상은 ψ, ψ+ 120°및 ψ+240°일 수 있다. 변형적인 공간 이상은, 예를 들면 ψ, ψ+90°, ψ+180° 및 ψ+270°로 생성될 수 있다. 상기에 제공된 2 가지 예 각각의 경우, 개별 공간 위상사이의 각도 차는 동일하지만, 상기 각도 차가 동일할 필요는 없다. 다시 말하면, ψ,ψ+90° 및 ψ+270°의 공간 이상이 또한 사용될 수 있다.
상기 이미지 장치는 상기 검출기에 접속되어 상기 검출기의 출력을 분석하는 분석기(16)를 부가적으로 포함한다. 상기 분석기(16)는 복수 개의 버퍼의 형태를 이루며 각각이 상기 마스크의 상이한 위상으로 조명되는 상기 물체의 하나 이상의 이미지를 개별적으로 저장하는 메모리 수단(17)을 포함할 수 있다. 상기 분석기(16)는 상기 이미지로 부터 상기 마스크 패턴을 제거하여 광학적으로 절단된 상기 물체의 이미지를 나타내도록 3 개이상의 저장된 이미지를 분석하는 패턴 제거 수단(18)을 부가적으로 포함한다. 상이한 초점 위치에서,상기 패턴 제거 수단(18)에 의해 발생되는 복수 개의 상이하고 광학적으로 입체 절단된 이미지를 결합시킴으로써 상기 물체의 3 차원 이미지를 생성시키는 표준 렌더링(rendering) 기법을 이용하는 3 차원 이미징 수단(19)이 편리하게 제공된다.
상기 패턴 제거 수단(18)은 외곽 부분을 제외한 초점이 맞는 이미지를 직접 결정하도록 작동될 수 있다. 예를 들면, 3 개의 이미지가 동일하게 이격된 3 개의 공간 위상에서 생성되는 I1, I2, I3인 경우에, 상기 초점이 맞는 이미지(I)는,
과 같은 등식을 사용하여 결정될 수 있다. 그러나, 상기 이미지의 각각의 픽셀에 대하여 이러한 절차를 구현하는 것은 계산 집약적이다. 변형적으로는, 전용 이미지 처리 장치에 대한 필요성없이 실 시간 이미징이 이행되는 것을 가능하게 하기 위해, 상기 분석기(16)는 상기 패턴 제거 수단(18)에 접속된 조사표(look-up table)을 포함할 수 있다. 상기 조사표는 상기 3 개의 입력 이미지 값에 대하여 상기 등식에 대한 있을 수 있는 모든 해의 목록이며 상기 이미지가 각각의 픽셀에 대한 등식의 해의 계산을 통하기 보다는 오히려 상기 표를 참조하여 결정되는 것을 가능하게 한다.
상기에 기술된 이미징 장치는 상기 장치의 초점이 흐려짐에 따라 상기 물체의 이미지에 내재하는 0 이 아닌 공간 주파수가 감소한다는 사실을 이용한다. 이는 마스크 패턴이 단지 초점이 맞는 상기 물체의 그러한 부분들상에 양호하게 이미지화됨으로써 바람직스럽지 못한 외곽 부분 패턴이 포개진다 하더라도 초점이 맞는 상기 물체의 그러한 부분들을 입체 절단하는 수단을 제공한다. 동일한 초점 위치에서 그러나 상기 패턴의 포개지는 상이한 공간 위상으로 3 개이상의 상기 패턴의 이미지를 기록함으로써, 분석될 이미지가 상기 포개진 이미지를 제거하여 광학적으로 입체 절단된 상기 물체의 이미지를 나타내는 것이 가능하다.
바람직하기로는, 상기 마스크(14)는 방형(方形)파인 선형 격자의 형태를 이루는 것인 데, 그 이유는 이러한 것이 가장 많은 광 처리 능력을 제공하기 때문이다. 동일 폭의 교번하는 투과 또는 비투과 대역이 적합하다. 보다 넓은 대역의 패턴은 결과적으로 보다 깊은 광학 입체 절단을 초래시킨다. 양호한 결과는 5-30 미크론, 보다 구체적으로는 12½ 미크론의 폭의 대역을 사용하여 얻어졌지만, 상이한 폭들이 필요한 광학 입체 절단에 따라 적합할 것이다. 그러나, 실질적으로 주기적인 광 강도 패턴이 적용되는 경우에는 그러한 광 강도 패턴이 사용될 수 있다. 적합한 교번 마스크는 나선형 격자를 포함한다. 더욱이, 2 차원적인 주기적 패턴도 또한 사용될 수 있지만, 본래 결과적인 이미지의 분석은 다소 복잡하다.
패턴 간격이 광학 입체 절단의 깊이를 결정함에 따라, 이상적으로는 마스크의 간격(공간 주기성)이 선택되고 조명 배율은 패턴의 기본 패턴만이 물체상에 투사되도록 조정된다. 격자의 위상(ψ ,ψ+120°,ψ+240°)이 물체상에 투사되는, 상기에 기술된 선형 방형파의 경우에, 조파(調波)는 3 개의 이미지의 차후 처리에서 자동적으로 제거됨으로써, 물체상에 투사되는 제 3 의 조파를 회피하는 것이 필수적이지 않다. 이는 이미징 시스템의 전반적인 설계에서 보다 큰 자유도를 제공하며 그러한 장치의 광 수집을 개선시킨다. 대체로, 물체상에 투사되는 패턴의 n 개의 이상사이의 차가 각각의 경우에 동일한 것인 부분에서는 n 번째 조파 및 그의 조파들이 자동적으로 제거된다.
패턴의 3 개 이상의 개별적인 미리 결정된 이상이 물체상에 투사되는 이미징 장치가 상기에 기술되었다. 패턴의 공간 위상이 예를 들면 회전하는 나선형 마스크 또는 그리드 형 마스크의 연속적인 이동을 사용하여 연속적으로 변화되는 부분에서는, 물체의 이미지가 광학 입체 절단된 이미지를 발생시키도록 미리 결정된 시간에 걸쳐 적분된다.
상기 이미징 장치는 변형적으로 코히어런트 광원을 사용할 수 있다. 이는 다시 마스크가 강도 또는 위상 패터닝을 지니는 것을 허용한다. 주기 위상 패터닝의 사용은 상기 장치의 광 수집이 주기적인 강도 패터닝의 경우에서 보다 크기 때문에 선호된다. 또 다른 변형예에서는, 2 개의 광원으로 부터 방출되는 광이 물체 체적의 주변 패턴을 발생시키는 것을 방해하도록 조정되는 2 개의 코히어런트 광 비임이 사용될 수 있다. 2 개의 코히어런트 광 비임이 사용되는 부분에서는 상기 2 개의 비임사이의 일시적인 위상 차가 주변 패턴의 필요한 공간 이상을 달성하도록 변경될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 코히어런트 광원이 사용되는 부분에서는 주변 패턴이 물체 체적을 통해 깊이있게 연장됨으로써 검출 평면의 정확한 축 정렬이 더 이상 중요하지 않게 된다. 이러한 해결 방안은 형광 이미징에 특히 적합하다.
본 발명의 특정 실시예의 광학 시스템은 단순히 진폭 투과율 또는 반사율(τ(t1,w1))의 물체상에 이미지화되는 조명 마스크(S(t0,w0))로 이루어져 있다. CCD 카메라에 의해 최종적인 이미지가 이미지 평면(t,w)내에 기록된다. 본 발명자가 이미지 강도를,
(1)
로서 기재하는 것을 허용하는 마스크가 간섭없이 조명된다. 상기 식에서, h₁,₂는 2 개의 렌즈의 진폭 점상 분포 함수(amplitude point spread function)를 나타낸다. 또한, 본 발명자는 광학 좌표((t,w))를 이용하도록 선택하며, 상기 광학 좌표((t,w))는에 의하여 실수 좌표(x,y)에 관련되는 데, 상기 식에서,는 개구수(NA)이며는 파장을 나타낸다.
지금 부터
(2)
로서 간단하게 기재할 수 있는 1 차원 그리드의 형태로 조명 마스크가 취해진다고 가정하는 데, 상기 식에서은 변조 깊이를 나타내며는 임의 공간 위상을 나타낸다. 정규화된 공간 주파수()는에 의해 실제 공간 주파수()에 관련되는 데, 상기 식에서는 그리드 평면 및 견본 평면사이의 배율을 나타낸다. 지금 부터 식(1)에 식(2)를 대입하면,
(3)
으로 제공되는 데, 상기 식에서는일 때 식(1)에 의해 제공되며, 물론 종래의 광시야(wide field) 이미지를 나타낸다.및는및각각의 형태의 마스크에 기인하는 이미지를 나타낸다. 지금 부터
를 형성하는 경우, 견본의 이미지로 부터 그리드 패턴이 제거된다. 이는 상대적인 공간 위상(,및)에 각각 해당하는 3 개의 이미지(,및)를 취함으로써 달성된다. 따라서, 광학적으로 입체 절단된 이미지가 얻어지는 데, 이러한 입체 절단된 이미지는,
를 계산함으로써를 포함하지 않는 데, 이는 통신 시스템에서의 제곱 검파(square law detection)와 유사하다.
실시간에 광학적으로 입체 절단된 이미지를 만들어 낼 수 있는 본 발명의 시
스템의 능력을 보여주기 위해, 종래의 현미경의 조명 경로내에 40 라인/mm 의 1 차원 그리드가 도입되었다. 무한대 튜브 길이의 광학 기기가 사용되었기 때문에, 견본상에 그리드의 이미지를 투사하고 CCD 카메라상에 견본을 이미지화하도록 개별 렌즈들을 도입시키는 것이 필요하였다. 이는 결과적으로 (50/180)M 의 견본 및 조명 평면사이의 실효 배율을 초래시키는 데, 여기서 M 은 대물 렌즈의 공칭(公稱) 배율이다. 15W 텅스텐-할로겐 램프는 그린 필터(green filter;대역폭 100nm)와 함께 광원으로 사용되었다. 이미지는 CCD 카메라에 기록되었고 메이트록스 미티어 프레임 그래버(Matrox Meteor frame grabber)에 전송된다. 그리드는 임의의 3 개의 연속 카메라 이미지가 그리드(도 2)의 투사된 이미지의 위치에서의 한 주기의 1/3 주기의 공간 이동에 해당하도록 카메라 프레임 속도와 동기되는 간단한 톱니 방식으로 이동된다. 각각의 프레임의 적분 시간동안 그리드가 이동중에 있다는 사실은 결과적으로의 계수만큼의 식(3)에서의및의 값의 감소를 초래시키는 데, 여기서는 카메라의 적분 시간이고는 연속 프레임의 기록사이의 시간이다. 본 발명의 경우에,이므로 이러한 계수는 단지 1.955 이다. 최악의 경우, 즉인 경우에, 상기 계수는 단지 0.827 까지 떨어진다. 광학적으로 입체 절단된 이미지는 본 발명의 8 비트 카메라로 부터 얻어진,및의 모든 가능한 조합을에 매핑시킨 조사표(look up table)와 함께 식(4)을 사용하여 얻어졌다.
교정 축 변환 스테이지와 함께 평면 거울이 사용된 본 발명의 현미경의 광학 입체 절단 강도를 측정하기 위하여, 2 개의 올림퍼스 엠디 플랜(Olympus MD Plan) 대물 렌즈에 대해 도 3에 결과적인 축 응답이 도시되어 있다. 50X 0.75 NA 의 사용은 0.91㎛ 의 측정 값과 잘 비교되는 0.87㎛ 의 반치 전폭(full width half maximum;FWHM)이 예상된다는 점에 유념하기로 한다. 이론적으로는 150X, 0.95NA 건조 대물 렌즈가 ν=0.8, 결과적으로는 0.27㎛ 를 제공하여야 한다고 예상된다. 실제로는 0.95 라기 보다는 오히려 0.85 인 이러한 렌즈의 개구수에 해당하는 0.43㎛ 가 측정된다. 이러한 불일치는 다른 측정이 많은 개구 렌즈들로 이행됨에 따라 일관되고 다양한 원인에 기인할 수 있는 데, 그 중 하나의 원인은 동공(pupil) 기능의 실효 어포다이제이션(apodisation)을 초래시키는 주변 광선의 격심한 감쇠인 것처럼 보인다.
도 4에서는 백합 화분 입자의 두꺼운 체적 구조를 이미지화한 이미지가 도시되어 있다. 도 4(a)는 본 발명에 따라 50X, 0.75 NA 대물 렌즈를 사용하는 30㎛ 축 스캔을 통해 각각의 픽셀에서의 최대 이미지 강도를 표시함으로써 얻어진 자동 초점 이미지를 나타낸다. 상기 입자의 전체 표면 구조는 전체 이미지 체적에 걸쳐 잘 해상(解像)된다. 그 반면에, 도 4(b)는 상기 입자의 중간 평면에서 취해진 종래의 이미지를 보여준다. 여기에는 초점이 맞지 않아 선명하지 않은 부분이 다수 존재하는 데, 이는 어떤 의미있는 3 차원적 이미지 처리가 이행되는 것을 방지한다는 점이 자명하다.
종래의 현미경은 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성하도록 용이하게 수정될 수 있다는 점이 명백해질 것이다. 그러한 수정은 상기에 기술한 분석기의 추가 및 현미경의 조명 시스템내로 패터닝된 마스크 및 캐리지를 도입하는 것으로 이루어져 있다. 상기 마스크 및 캐리지의 도입은 다시 추가적인 광학 기기의 도입을 필요로 할 수 있지만, 종래의 현미경이 물체상에 초점이 맞춰지는 아이리스(iris)를 포함하는 부분에서는, 상기 아이리스가 단순히 부가적인 변경없이도 상기 마스크 및 캐리지에 의해 대체될 수 있다.
상기에 기술한 이미징 장치는 예를 들면 암시야 및 차동 간섭 대비를 포함하는 광범위한 이미징 양식에서 사용될 수 있다. 또한, 상기 이미징 장치는 모든 종래의 현미경법 용도에 사용될 수 있다. 특히 상기 장치는 생물 의학 용도에 사용될 수 있으며 광학적으로 입체 절단된 형광 이미징이 광원으로서의 레이저에 대한 필요성없이 효과적으로 이행될 수 있는 이점을 지닌다.

Claims (33)

  1. 견본의 이미지를 생성시키는 방법에 있어서, 광원으로 상기 견본을 조명하는 단계; 상기 견본상에 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성시키는 단계; 상기 견본의 제 1 이미지를 생성시키는 단계; 상기 견본상에서 상기 패턴의 공간 위상을 변경시켜 상기 견본의 제 2 이미지를 기록하는 단계; 상기 견본상에서 상기 패턴의 공간 위상을 변경시켜 상기 견본의 제 3 이미지를 기록하는 단계를 최소한 한 번 이상 반복하는 단계로서, 상기 견본의 최소한 3 번 기록된 이미지에서의 패턴의 공간 위상이 상이한 반복 단계; 및 상기 이미지로 부터 공간 패턴을 제거하여 상기 견본의 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성하도록 상기 견본의 3 번 이상 기록된 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 2 개의 코히어런트 광원은 상기 견본을 조명하고 상기 견본상에 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성시키는 데 사용되는 견본의 이미지 생성 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 견본상에 상기 패턴을 투사하도록 마스크를 사용하는 단계를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 마스크는 단지 한 방향으로만 국부 주기성을 지니는 견본의 이미지 생성 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 마스크는 실질적으로 나란한 가변 불투명도의 스트라이프(stripe)를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 마스크는 반경 방향으로 연장하는 스트라이프를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 마스크에서 실질적으로 투명한 스트라이프가 실질적으로 불투명한 스트라이프와 교번하는 견본의 이미지 생성 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 스트라이프의 불투명도는 주기성이 존재할 수 있는 방향으로 유연하게 변하는 견본의 이미지 생성 방법.
  9. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 마스크는 나선형 패턴을 지니는 견본의 이미지 생성 방법.
  10. 제 3 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 패턴의 공간 위상을 변경시키는 단계는 상기 마스크를 이동시키는 단계를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법.
  11. 제 3 항 내지 제 8 항중 어는 한 항에 있어서, 상기 패턴의 공간 위상을 변경시키는 단계는 주기성이 존재할 수 있는 방향으로 마스크를 이동시키는 단계를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 3 개의 기록된 이미지의 공간 위상은 각각 φ°,φ°+120°,φ°+240°이며,φ°는 임의 위상인 견본의 이미지 생성 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 패턴의 공간 위상을 실질적으로 연속되게 변경시키는 단계를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 패턴의 공간 위상을 실질적으로 증분되게 변경시키는 단계를 포함하는 견본의 이미지 생성 방법.
  15. 동일한 견본의 최소한 3 개의 이미지의 이미지 데이터를 처리하는 방법으로서, 상기 이미지가 상부에 겹쳐지는 실질적으로 주기적인 패턴을 지니고, 상기 3 개의 이미지상의 패턴의 공간 위상이 상이한 방법에 있어서, 상기 패턴이 없는 복합 이미지를 생성하도록 상기 데이터를 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 패턴이 단지 한 방향으로만 국부 주기성을 지니는 방법.
  17. 광원; 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성시키는 패터닝 수단; 견본상에 상기 광원으로 부터 방출된 광의 초점을 맞춰서 상기 견본상에 상기 패턴을 생성하는 초점 정합 수단; 상기 견본상에 생성된 패턴의 공간 위상을 조절하는 이상(移相) 수단; 상기 견본의 이미지를 검출하는 검출기; 및 상기 견본의 최소한 3 개의 이미지를 분석하는 수단으로서, 상기 패턴의 공간 이상이 상기 최소한 3 개의 이미지에서 상이한 분석 수단, 및 상기 견본의 3 개의 이미지로 부터 상기 공간 패턴을 제거하여 상기 견본의 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성하는 수단을 지니는 분석기를 포함하는 현미경법 이미징 장치.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 패터닝 수단은 상기 견본을 조명하고 상기 견본상에 실질적으로 주기적인 패턴을 생성시키는 2 개의 코히어런트 광원을 포함하는 현미경법 이미징 장치.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 패터닝 수단은 마스크, 및 상기 견본상에 상기 패턴을 투사하는 수단을 포함하는 현미경법 이미징 장치.
  20. 제 19 항에 있어서,상기 마스크는 단지 한 방향으로만 국부 주기성을 지니는 현미경법 이미징 장치.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 상기 마스크는 실질적으로 나란한 가변 불투명도의 스트라이프를 포함하는 현미경법 이미징 장치.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 마스크는 반경 방향으로 연장하는 스트라이프를 포함하는 현미경법 이미징 장치.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 마스크에서 실질적으로 투명한 스트라이프는 실질적으로 불투명한 스트라이프와 교번하는 현미경법 이미징 장치.
  24. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 스트라이프의 불투명도는 주기성이 존재할 수 있는 방향으로 유연하게 변하는 현미경법 이미징 장치.
  25. 제 21 항 내지 제 24 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트라이프는 폭이 5 내지 30 미크론인 현미경법 이미징 장치.
  26. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 상기 마스크는 나선형 패턴인 현미경법 이미징 장치.
  27. 제 19 항 내지 제 26 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 이상 수단은 상기 마스크를 이동시키도록 이루어진 현미경법 이미징 장치.
  28. 제 19 항 내지 제 25 항에 있어서, 상기 이상 수단은 주기성이 존재할 수 있는 방향으로 상기 마스크를 이동시키도록 이루어진 현미경법 이미징 장치.
  29. 제 17 항 내지 제 28 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 이상 수단은 실질적으로 연속 방식으로 상기 패턴의 위상을 이동시키도록 이루어진 현미경법 이미징 장치.
  30. 제 17 항 내지 제 28 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 이상 수단은 실질적으로 증분 방식으로 상기 패턴의 위상을 이동시키도록 이루어진 현미경법 이미징 장치.
  31. 제 17 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 견본의 형광 이미지를 검출하는 검출기를 포함하는 현미경법 이미징 장치.
  32. 제 17 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 따른 장치로 종래의 현미경을 수정하도록 이루어진 장치에 있어서, 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성하는 패터닝 수단, 상기 패턴의 공간 위상을 조절하는 이상 수단 및 상기 공간 위상이 상부에 생성되어진 견본의 이미지를 분석하는 수단으로서, 상기 패턴의 공간 이상이 최소한 3 개의 이미지에서 상이한 분석 수단, 및 상기 3 개의 이미지로 부터 상기 공간 패턴을 제거하여 상기 견본의 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성시키는 수단을 지니는 분석기를 포함하는 장치.
  33. 견본의 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성하도록 종래의 현미경을 적용시키는 방법에 있어서, 상기 견본상에 실질적으로 주기적인 공간 패턴을 생성시키도록 상기 현미경의 광학 시스템에 패터닝 수단을 도입시키는 단계; 상기 견본상에 최소한 3 개의 상이한 공간 이상된 패턴을 생성시키도록 상기 패턴의 공간 위상을 조절하는 공간 이상 수단을 제공하는 단계; 및 각각이 상기 패턴의 상이한 공간 이상을 지니는 상기 견본의 최소한 3 개의 개별 이미지를 분석하는 수단, 및 상기 견본의 이미지로 부터 상기 공간 패턴을 제거하여 상기 견본의 광학적으로 입체 절단된 이미지를 생성하는 수단을 지니는 분석기를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
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