JP3066874B2 - 顕微鏡撮像装置および方法 - Google Patents

顕微鏡撮像装置および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に合焦細部（in−focus detail）のみ
を含む像を生成するための顕微鏡撮像（イメージング）
装置（microscope imaging apparatus）および撮像方法
と、そのための方法に関する。本発明は、ボリューム
（体積）構造（volume structure）の合焦３次元像（in
−focus three dimensional image）を作るために用い
ることができる像を生成するのに適している。
従来の光学顕微鏡では、３次元構造を正常に撮像（im
age）することはできない。得られる画像は、３次元構
造の合焦領域（in−focus region）の鮮明な像と、その
合焦領域の上および下の構造の焦点のぼけた像とからな
る。従来の光学顕微鏡では、焦点から外れた部分の細部
（detail）を除外することは不可能である。
完全なボリューム構造の合焦３次元像を形成するため
に組み合わせ可能な、構造の個々の層あるいは薄層の合
焦像（in−focus image）を提供するための、３次元構
造を光学的に切断する共焦点顕微鏡が開発されている。
残念ながら、非コヒーレント光源が使用されるとき、共
焦点顕微鏡の光収支（light budget）は、通常、不満足
なものである。レーザー走査共焦点顕微鏡は、非常に浅
い焦点深度を実現するが、高価な装置とレーザー光がそ
こを通過して焦点を結ぶ照明／結像ピンホールを必要と
する。
米国特許第5,381,236号においては、３次元構造の個
々の特徴部のレンジ（距離）を決定するために使用され
る光学センサが説明されている。このセンサは、構造を
照明し可逆的である周期的なパターンを形成する光源を
有する（すなわち、パターンは180゜位相シフトされて
いる）。パターンの像とその構造を照明するパターンの
反転（reversal）とを検出するために、光源のパターン
に対して配列された検出器要素のアレイが使用されてい
る。パターンは、構造のそれ自身の焦点の合っている部
分に対してのみ良く撮像されるであろうから、その構造
の合焦部分のレンジ（距離）の決定を可能にする。米国
特許第5,381,236号で説明されている装置および方法
は、動作するためには、検出器の個々の素子が光源のパ
ターンに対して正確に配列され、また適合されていなけ
ればならないという短所を有する。実際には、これは実
現がほとんど不可能であることが分かっている。
本発明は、共焦点像（confocal image）と同様な方法
で実質的に合焦細部のみを有し、かつ構造の光学的セク
ショニング（切断）によりその構造の３次元像を作るた
めに使用することができる像を作るための、顕微鏡撮像
装置および撮像方法を提供しようとするものである。本
発明は、検出器およびパターン要素の正確な配列あるい
は整合の必要なしに、光学的セクショニングを実現し、
同時に有利な光収支をもたらす。
１つの局面において、本発明は、試料の像を生成する
方法であって、前記試料を光源により照明するステップ
と、前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成
するステップと、前記試料の第１の像を記録するステッ
プと、前記試料の上の前記パターンの空間位相を変えて
前記試料の第２の像を記録するステップと、前記試料の
上の前記パターンの前記空間位相を変えて前記試料の第
３の像を記録するステップを少なくとも１回繰り返すス
テップであって、前記試料の少なくとも３つの記録像に
おける前記パターンの前記空間位相が異なっているステ
ップと、前記空間的パターンを前記像から除去し、それ
により前記試料の光学的切片像を生成するために、前記
試料の前記３つ以上の記録像を解析するステップと、を
有する試料の像を生成する方法を提供する。
上述した従来技術は、厳しい条件でマスクパターンに
対して配列された整合検出器格子（matched detector g
rid）に依存しているが、本発明には、このような整合
検出器格子の必要がないという利点がある。像データの
処理は簡単であり、本発明は、従来の顕微鏡から光学的
切片像（optically sectioned image）をリアルタイム
で作ることを可能にする。
好ましい実施態様においては、試料の合焦３次元像を
作成するために、上述の方法が異なる焦点位置（focal
position）で繰り返される。その結果、以下に詳細に説
明する本発明の具体的な実施態様において、試料の表面
組織（surface texture）の３次元像が得られる。
パターンの空間位相は、連続的に、あるいは離散的な
ステップで、変えられてもよい。空間位相が連続的に変
えられる場合には、試料の記録像は、所定の時間にわた
って積分される。パターンの空間位相が連続的に変えら
れる場合には、高品質な像が得られることが計算され、
また実際に確認されている。上に述べたように、空間位
相を変化させるための広範の手段が、本発明の出願目的
である。
さらに別の局面において、本発明は、同一試料の少な
くとも３つの像の画像データの処理方法であって、前記
像はその上に重畳されたほぼ周期的なパターンを有し、
３つの像の前記パターンの空間位相は異なり、前記パタ
ーンを含まない複合画像を生成するように、前記データ
の解析を含む画像データの処理方法を提供する。
さらに別の局面において本発明は、光源と、ほぼ周期
的な空間的パターンを生成するパターン形成手段と、前
記光源からの光を試料の上に集束し、前記試料の上に前
記パターンを生成する集束手段と、前記試料の上に生成
された前記パターンの前記空間位相を調整する位相シフ
ト手段と、前記試料の像を検出するための検出器と、前
記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つの
像で異なっていて、前記試料の像を解析する手段と、前
記試料の前記３つの像から前記空間的パターンを除去
し、それにより前記試料の光学的切片像を生成する手段
とを有するアナライザと、を有する顕微鏡撮像装置を提
供する。
パターン形成手段は、１次元の局所的な周期性を有す
るマスクの形態であることが望ましく、またマスクパタ
ーンは試料に投影されていることが望ましい。たとえ
ば、マスクは、線形格子（linear grating）でもよい。
またマスクは、スパイラル格子（spiral grating）を有
する円形のマスクでもよい。この後者の場合に、円形の
マスクの端縁に向かってあるいは端縁に位置する格子の
一部を介して試料を照明することにより、この部分にお
いてスパイラル格子は平行な線の格子に近似しているの
で、パターンは好都合に試料に投影される。このスパイ
ラル格子の利点は、マスクの回転により格子の連続した
動きが実現されることである。あるいはコヒーレント光
源が使用される場合には、パターン形成手段は、第１の
光源からの光に干渉するように配置された第２のコヒー
レント光源により提供されてもよい。
さらに別の局面において本発明は、ほぼ周期的な空間
的パターンを生成するパターン形成手段と、前記パター
ンの前記空間位相を調整する位相シフト手段と、前記パ
ターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つの像で
異なっていて、前記空間的パターンがその上に生成され
る試料の像を解析するための手段と、前記３つの像から
前記空間的パターンを除去し、それにより前記試料の光
学的切片像を生成する手段を有するアナライザと、を有
する従来の顕微鏡を改造するように適応された装置を提
供する。
さらに他の実施態様において本発明は、試料の光学的
切片像を発生するために従来の顕微鏡を適応させる方法
を提供する。この方法は、前記試料の上にほぼ周期的な
空間的パターンを生成するために、顕微鏡の光学系にパ
ターン形成手段を導入するステップと、前記試料の上に
少なくとも３つの異なる空間的位相シフトパターンを作
成するために、前記パターンの前記空間位相を調整する
空間位相シフト手段を設けるステップと、それぞれ前記
パターンの異なる空間位相シフトを有する前記試料の少
なくとも３つの別々な像を解析するための手段と、前記
試料の前記像から前記空間的パターンを除去し、それに
より前記試料の光学的切片像を生成する手段を有するア
ナライザを設けるステップと、を有する。
このように、実験室装置の広く普及した部分である従
来の顕微鏡が、光学的切片像を提供可能なように容易に
転換されることができることは、本発明の利点である。
本発明は、さらに、同一試料の少なくとも３つの像の
像データを処理する方法を提供する。像はその上に重畳
されたほぼ周期的なパターンを有し、３つの像の上のパ
ターンの空間位相は異なっている。前記像から、パター
ンを含まない合成像（composite）を生成するように、
像データのこの処理方法は、データ解析を含んでいる。
添付図面を参照して、実施例により、本発明の実施態
様を説明する。
図１は、本発明による顕微鏡撮像装置の略図である。
図２は、本発明の光学系の略図である。
図３は、図２の系の軸方向応答の測定結果を示す。
図４（ａ）は、本発明により得られたユリの花粉粒
（視野寸法は100μｍ×70μｍである）の自動焦点像（a
utofocus image）である。
図４（ｂ）は、顕微鏡の焦点を中央の深度面（mid−d
epth plane）に合わせたときの、ユリ花粉粒の従来の像
（本発明によらない）を示す。
図１に示す撮像装置は、従来の顕微鏡の特徴の多くを
有し、特に、非コヒーレント光源10と、撮像されるべき
物体Ｏに光源10からの光を集束させる一つ以上のレンズ
11の形態であることが望ましい、集束手段とを有してい
る。ビームスプリッター12は、CCDカメラの形態である
ことが望ましい光検出器13に向かって物体からの反射光
が反射されるように、光源と物体の間に位置している。
さらに、この装置は、たとえば、格子（grating）の形
態でパターンが形成され、非ゼロの空間的にほぼ周期的
なパターンで物体が照明されるように光源10に備えられ
たマスク14を具備している。かくして、マスクパターン
は試料に投影される。マスクパターンは、１次元内のみ
で局所的な周期性を有することが望ましい。検出器面
は、物体の光学的切片像が形成されることを可能にする
ために、投影されたパターンが集束される平面に結合し
ている。
さらにこの装置は、マスクパターンの少なくとも３つ
の異なる位相が生成されるように、物体に集束されるマ
スクパターンの空間位相を調整するための、空間位相シ
フト手段15を有する。位相シフト手段15は、物体に集束
されパターンが形成された光の空間位相が変化させられ
るように、物体に対して段階的にあるいは連続的にマス
クを移動させるためのキャリッジの形態であってもよ
い。線形格子の形態のマスクの場合には、キャリッジ
は、撮像装置の軸線に垂直に格子を動かすために、配置
される。空間位相を調整する他の選択肢には、投影され
たパターンの位相をシフトするような、ビームスプリッ
ターの移動が含まれる。
パターンは、試料上で異なる方法で生成できる。たと
えば平行なストライプのパターンを搭載したリボンベル
トを使用することにより、パターンは随意に生成され
る。ここで、光源は、試料上に、リボンのパターンを投
影する。光が光源と物体の間に置かれたリボンのループ
の部分を通ってのみ照らすように、リボンは光源の周り
にそのループを形成する。あるいは、リボンは試料の周
りにループを形成する。
他の選択肢は、リボンが鏡の周りにループを形成する
ことであり、リボンの一部分が光源と鏡の間に置かれ
る。リボンを通過した光は、次に鏡により試料上に反射
される。かくして、このようなリボンは、常に同じ方向
に、連続的にあるいは段階的に動かすことができる。こ
のようなリボンは、鋸歯状に動かしたりあるいは動作方
向に反転させたりする必要なしに、（長方形のパネルを
有するマスクのように、）たとえば正確に平行なストラ
イプのパターンを生成する利点をもたらす。
図１において、位相シフト手段15は、撮像装置の軸線
に垂直な平面内に配置された（紙面の中へまた外へ）３
つの所定の位置にマスク14を移動させるように配置され
た、キャリッジの形態である。キャリッジに対する３つ
の位置は、マスクの３つの異なる空間位相が物体に集束
されるように選択される。たとえば、３つの位相はφ，
φ＋120゜およびφ＋240゜であってもよい。たとえば、
φ，φ＋90゜，φ＋180゜およびφ＋270゜の、別の空間
位相シフトが生成されてもよい。上記の２つの例のそれ
ぞれにおいて、個々の空間位相の間の角度差は同じであ
るが、角度差が同一であることは不可欠ではない、すな
わち、φ，φ＋90゜およびφ＋270゜の空間位相シフト
が使用されてもよい。
さらに、撮像装置は、検出器に接続され、検出器の出
力を解析するアナライザ16を有する。アナライザ16は、
たとえば、それぞれマスクの異なる位相で照明された物
体の３つ以上の像を別々に蓄積する複数のバッファの形
態であるメモリ手段17を有してもよい。さらに、マスク
パターンを像から除去して物体の光学的切片像を明らか
にするように、アナライザ16は、３つ以上の蓄積された
像を解析するためのパターン除去手段18を有する。パタ
ーン除去手段18によって生成された異なる焦点位置にお
ける複数の異なる光学的切片像を合成することにより、
物体の３次元像を生成するために、標準的なレンダリン
グ技術を使用する３次元イメージング手段19が適宜に設
けられる。
パターン除去手段18は、合焦像（in−focus image）
から縞（fringing）を差し引いたものを直接決定するた
めに作動してもよい。たとえば、３つの像が３つの等間
隔の空間位相において生成されたI1,I2,I3である時、合
焦像Ｉは、次式を用いることにより決定できる。
しかし、画像の各ピクセルに対してこの手順を実行す
るには、非常に多くの計算をしなければならない。ある
いは、専用の画像処理装置を必要とせずにリアルタイム
イメージングを可能にするためには、アナライザ16は、
パターン除去手段18に接続されたルック・アップ・テー
ブルを具備してもよい。ルック・アップ・テーブルは、
３つの入力画像値に対する上述の式のすべての起こり得
る解の表であり、各ピクセルについての式の解の計算で
はなく、テーブルの参照により、像Ｉの決定を可能にす
る。
上述の撮像装置は、装置の焦点がぼかされるにつれ
て、物体の像の任意の非ゼロ空間周波数が減衰すること
を利用している。これは、物体の焦点のあった部分上に
のみマスクパターンが良く映し出されることを意味し、
かくして、望ましくない縞状（fringe）パターンが重畳
されてはいるが、物体の焦点のあった部分をセクショニ
ングする手段を提供する。同一焦点位置であるけれども
パターンの異なる重畳された空間位相で物体の３つ以上
の像を記録することにより、物体の光学的切片像を明ら
かにするために、重畳されたパターンを除去するために
像を解析することが可能である。
マスク14は方形波パターンである線形格子の形態であ
ることが望ましく、これは最大の光スループットを与え
る。交互の透明および非透明の等しい幅のバンドが適当
である。より広いバンドのパターンはより深い光学的断
面（optical section）をもたらす。幅５〜30μｍ、特
に12.5μｍのバンドを用いて良い結果が得られるが、必
要とされる光学的セクショニングによっては異なる幅が
適切であろう。しかし、任意に適用されたほぼ周期的な
光強度パターンが使用されてもよい。好適な他のマスク
には、スパイラル格子が含まれる。さらに、２次元の周
期的パターンを用いてもよいが、結果として生じる像の
解析は、必然的に幾分複雑となる。
パターン間隔が光学的セクショニングの深さを決定す
るから、理想的にはマスクのパターン間隔（空間的周期
性）が選択され、また照明倍率は、パターンの基本波の
みが物体に投影されるように決められる。格子の３つの
位相φ，φ＋120゜およびφ＋240゜が物体に投影される
上述の線形方形波格子の場合には、３つの像の引き続く
処理において３次高調波は自動的に相殺されるので、物
体に投影される３次高調波を防止することは必須ではな
い。これは撮像システムの総合的な設計に大きな自由度
をもたらし、装置の光収支を改善する。一般に、物体に
投影されるパターンのｎ個の位相シフトの間の差分が各
場合について同じであるときは、ｎ次高調波およびその
高調波が自動的に相殺される。
パターンの３つ以上の離散的な所定の位相シフトが物
体に投影される撮像装置を以上に説明した。たとえば回
転するスパイラル・マスクあるいはグリッド型マスクの
連続した動きを用いて、パターンの空間位相が連続的に
変化される場合には、光学的切片像を生成するために、
物体の像は所定の時間にわたって積分される。
あるいは、撮像装置はコヒーレント光源を使用しても
よい。これは、マスクが強度あるいは位相パターンを有
することを許容する。装置の光収支が周期的強度パター
ン形成の場合より大きいので、周期位相パターン形成
（period phase patterning）の使用が望ましい。さら
に別の装置では、物体ボリューム（object volume）内
に縞状パターンを生成するために、２つの光源からの光
が干渉するように配置された２つのコヒーレント光ビー
ムが使用されてもよい。２つのコヒーレント光ビームが
使用される場合には、縞状パターンの所要の空間位相シ
フトを生ずるために、２つのビームの間の時間的位相差
は変えられてもよい。１つ以上のコヒーレント光源が使
用される場合には、縞状パターンは物体ボリュームを介
して深く延びており、したがって検出平面な正確な軸方
向の配列（アライメント）はもはや重要ではない。この
方法は蛍光イメージングに特に適切である。
本発明の具体的な実施態様の光学系は、単に振幅透過
率あるいは反射率τ（t1,w1）の物体に映し出される照
明マスク、Ｓ（t0,w0）からなる。最終の像は、像平面
（t,W）内のCCDカメラにより記録される。マスクはイン
コヒーレントに照明され、像強度は次の式で表される。
Ｉ（t,w） ＝∬Ｓ（t0,w0）｜∬h1（t0＋t1,w0＋w1）τ（t1,w1） h2（t1＋t,w1＋ｗ）dt1dw1|2dt0dw0 （１） ここでｈ1,2は２つのレンズの振幅点拡がり関数を表
す。さらに、 を介して実座標（x,y）に関連する光学座標（t,w）を組
み入れることとする。ここでn sin αは開口数（NA）で
あり、λは波長を表す。
ここで照明マスクは、単純化のために、次式で書くこ
とができる１次元格子の形態をとると仮定する。
Ｓ（t0,w0）＝１＋m cos（t0＋φ０） （２） ここでｍは変調深さを、またφ０は任意の空間位相を
示す。正規化された空間周波数は、＝βλv/NAを介
して実際の空間周波数νに関連している。ここでβはグ
リッド平面と試料平面の間の倍率を表す。ここで式
（２）を式（１）に代入すれば、式（３）が得られる。
Ｉ（t,w）＝I0＋ICcosφ０＋ISsinφ０ （３） ここでI0はＳ＝１として式（１）により与えられ、当
然、従来の広視野像を表す。ICおよびISは、それぞれ、
m cos（t0）およびm sin（t0）の形式のマスクによ
る像を表す。ここで とすれば、グリッドパターンを試料の像から除去でき
る。それぞれ相対的空間位相φ０＝0,φ０＝２π/3およ
びφ０＝４π/3に対応している３つの像I1,I2およびI3
を撮影することにより、これは実現される。このように
して、下式を計算することにより、I0を含まない光学的
切片像が得られる。
これは通信システムにおける２乗則検波に類似してい
る。
光学的切片像をリアルタイムで生成するこのシステム
の能力を証明するために、従来の顕微鏡の照明経路に1m
m当たり40本の１次元格子を導入した。無限大の光学的
筒長を用いたので、試料上に格子の像を投影し、またCC
Dカメラに試料を映し出すために、別々なレンズの導入
が必要であった。これは、照明平面と試料との間に（50
/180）Ｍの実効的な倍率をもたらした、ここでＭは、対
物レンズの公称倍率である。15Wのタングステン・ハロ
ゲン電球が、緑色フィルタ（帯域幅100nm）とともに光
源に使用された。像はCCDカメラで記録され、Matrox Me
teor社製のフレーム・グラッバー（frame grabber）に
転送された。格子は、任意の３つの連続したカメラ像が
格子の投影された像の位置における１周期の３分の１の
空間的シフトに対応するように、カメラのフレーム・レ
ートに同期して単純な鋸歯状に動かされた（図２）。各
フレームの積分時間の間に格子が動いているという事実
は、式（３）におけるICおよびISの値をsin c（πt/3
T）のファクタだけ減少させる。ここでｔはカメラの積
分時間（integration）であり、Ｔは連続したフレーム
の記録の間の時間である。この場合Ｔ＝2t＝40ミリ秒で
あり、したがってこの係数はわずか0.955である。最悪
の場合には、Ｔ＝ｔであり、この係数はわずか0.827に
低下する。光学的切片像は、８ビットカメラからのI1,I
2およびI3のすべての起こり得る組み合わせをIpにマッ
ピングするルック・アップ・テーブルとともに式（４）
を用いて得られる。
顕微鏡の光学的切断（セクショニング）強度を測定す
るために、較正された軸移動ステージとともに平面鏡を
使用した。その結果の２つのオリンパス社製のMD Plan
対物レンズに対する軸方向応答を図３に示す。50×,0.7
5NAの使用は、このシステムのν＝0.4に対応し、このシ
ステムに対しては、0.91μｍの測定値に良く匹敵する0.
87μｍの半値全幅（FWHM）を予測できる。理論的には、
150×,0.95NAの乾燥対物レンズは、ν＝0.8、したがっ
て0.27μｍの半値全幅を生ずると予測される。実際に
は、0.95よりむしろ0.85であるこのレンズの開口数に対
応する0.43μｍと測定される。この相違は、大口径レン
ズで行われた他の測定と矛盾せず、種々の原因によるも
のかもしれない。その原因の１つは、瞳関数の実効的な
アポダイゼイションを招く周縁光線の強い減衰である可
能性が高い。
ユリの花粉粒の厚いボリューム構造を映し出す像を図
４に示す。図４（ａ）は、50×,0.75NA対物レンズを用
いた本発明による30μｍの軸方向走査を通じて各ピクセ
ルにおける最高の像強度を表示することにより得られた
自動焦点像を表す。粒の全表面組織は、像ボリュームの
全体上で良く解像されている。他方、図４（ｂ）は、粒
を通る中間の平面において撮られた従来の像を示す。こ
れには、かなり多量の焦点の外れたぼけがあり、意味の
ある３次元画像処理を実行することが妨げられることが
明確である。
光学的切片像を生成するように、従来の顕微鏡を容易
に改造できることは明白であろう。上述したように、こ
の改造は、顕微鏡の照明系の中へのパターン形成された
マスクおよびキャリッジの導入と、アナライザの追加か
らなる。マスクおよびキャリッジの導入は、代わりに付
加的な光学系の導入を必要とするかもしれないが、従来
の顕微鏡が、物体に集束された絞りを有する場合には、
単に絞りをマスクおよびキャリッジにより置換するだけ
でよい。
上述の撮像装置は、たとえば暗視野および差分干渉コ
ントラスト（differential interference contrast）を
含む広範囲の撮像様式で使用することができる。さら
に、この撮像装置は、従来の顕微鏡のすべての応用に使
用することができる。特に、この装置は、生物医学的な
応用に使用することができ、また光源としてレーザーを
必要とせずに光学的に切片化された螢光イメージングを
効率的に行うことができるという利点を有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ネイル、 マーク、 アンドリュー、 アクウィラ イギリス国 オーエックス２ ９エルビ ー オックスフォード ボトレイ ポプ ラーロード 22 (72)発明者 ジャッカティス、 リンヴィダス イギリス国 オーエックス２ ８エヌテ ィー オックスフォード マリオット クローズ ３ (56)参考文献 特開 平２−89015（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−505096（ＪＰ，Ａ) 米国特許5381236（ＵＳ，Ａ) 国際公開97／6509（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G02B 21/00 G02B 21/06 - 21/36 G01B 11/00 - 11/30

Claims (33)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料の像を生成する方法であって、 前記試料を光源により照明するステップと、 前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成する
    ステップと、 前記試料の第１の像を記録するステップと、 前記試料の上の前記パターンの空間位相を変えて前記試
    料の第２の像を記録するステップと、 前記試料の上の前記パターンの前記空間位相を変えて前
    記試料の第３の像を記録するステップを少なくとも１回
    繰り返すステップであって、前記試料の少なくとも３つ
    の記録像における前記パターンの前記空間位相が異なっ
    ているステップと、 前記空間的パターンを前記像から除去し、それにより前
    記試料の光学的切片像を生成するために、前記試料の前
    記３つの以上の記録像を解析するステップと、を有し、 前記記録された像を像のペアにグルーピングし、像の各
    ペア中の前記記録された像の間の差の平方の和の平方根
    を計算することによって、合焦像が得られ、 ３つの像が記録されている場合には、式 （ここで前記３つの記録された像がI1,I2およびI3であ
    り、前記合焦像がＩである） に従って、前記空間パターンが除去される、試料の像を
    生成する方法。
  2. 【請求項２】前記試料を照明し前記試料の上にほぼ周期
    的な空間的パターンを生成するために、２つのコヒーレ
    ント光源が使用される請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記試料の上に前記パターンを投影するマ
    スクを使用するステップを含む請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記マスクが１方向にのみ局部的な周期性
    を有する請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記マスクがさまざまな不透明度のほぼ平
    行なストライプを有する請求項３または４に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】前記マスクが半径方向に延びるストライプ
    を有する請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記マスクにおいて、ほぼ透明なストライ
    プがほぼ非透明のストライプと交互に配置する請求項５
    または６に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記ストライプの不透明度が、周期性が見
    出される方向になめらかに変化する請求項５または６に
    記載の方法。
  9. 【請求項９】前記マスクがスパイラル・パターンを有す
    る請求項３または４に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記パターンの前記空間位相を変える前
    記ステップが、前記マスクを移動させることを含む請求
    項３乃至９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記パターンの前記空間位相を変える前
    記ステップが、周期性が見出される方向に前記マスクを
    移動させることを含む請求項３乃至８のいずれか１項に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】３つの記録像の前記空間位相が、それぞ
    れφ0,φ０＋120゜，φ０＋240゜であり、φ０は任意の
    位相である請求項１乃至11のいずれか１項に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】前記パターンの前記空間位相をほぼ連続
    的に変化させることを含む請求項１乃至12のいずれか１
    項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記パターンの前記空間位相をほぼ段階
    的に変化させることを含む請求項１乃至12のいずれか１
    項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】同一試料の少なくとも３つの像の画像デ
    ータの処理方法であって、前記像はその上に重畳された
    ほぼ周期的なパターンを有し、３つの像の前記パターン
    の空間位相は異なり、前記パターンを含まない複合画像
    を生成するように、前記データを解析することを含み、 前記記録された像を像のペアにグルーピングし、像の各
    ペア中の前記記録された像の間の差の平方の和の平方根
    を計算することによって、合焦像が得られ、 ３つの像が記録されている場合には、式 （ここで前記３つの記録された像がI1,I2およびI3であ
    り、前記合焦像がＩである） に従って、前記空間パターンが除去される、画像データ
    の処理方法。
  16. 【請求項１６】前記パターンが１方向にのみ局部的な周
    期性を有する請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】光源と、 ほぼ周期的な空間的パターンを生成するパターン形成手
    段と、 前記光源からの光を試料の上に集束し、前記試料の上に
    前記パターンを生成する集束手段と、 前記試料の上に生成された前記パターンの空間位相を調
    整する位相シフト手段と、 前記試料の像を検出するための検出器と、 前記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つ
    の像で異なっていて、前記試料の前記少なくとも３つの
    像を解析する手段と、前記試料の前記３つの像から前記
    空間的パターンを除去し、それにより前記試料の光学的
    切片像を生成する手段とを有するアナライザと、を有
    し、 前記記録された像を像のペアにグルーピングし、像の各
    ペア中の前記記録された像の間の差の平方の和の平方根
    を計算することによって、合焦像が得られ、 ３つの像が記録されている場合には、式 （ここで前記３つの記録された像がI1,I2およびI3であ
    り、前記合焦像がＩである） に従って、前記空間パターンが除去される、顕微鏡撮像
    装置。
  18. 【請求項１８】前記パターン形成手段が、前記試料を照
    明し前記試料の上にほぼ周期的なパターンを生成する２
    つのコヒーレント光源を有する請求項17に記載の装置。
  19. 【請求項１９】前記パターン形成手段が、マスクと、前
    記試料の上に前記パターンを投影する手段とを有する請
    求項17に記載の装置。
  20. 【請求項２０】前記マスクが１方向にのみ局部的な周期
    性を有する請求項19に記載の装置。
  21. 【請求項２１】前記マスクがさまざまな不透明度のほぼ
    平行なストライプを有する請求項19または20に記載の装
    置。
  22. 【請求項２２】前記マスクが半径方向に延びるストライ
    プを有する請求項20に記載の装置。
  23. 【請求項２３】前記マスクにおいて、ほぼ透明なストラ
    イプがほぼ非透明のストライプと交互に配置している請
    求項21または22に記載の装置。
  24. 【請求項２４】前記ストライプの不透明度が、周期性が
    見出される方向になめらかに変化する請求項21または22
    に記載の装置。
  25. 【請求項２５】前記ストライプが５μｍ幅と30μｍ幅の
    間である請求項21乃至24のいずれか１項に記載の装置。
  26. 【請求項２６】前記マスクがスパイラル・パターンを有
    する請求項19または20に記載の装置。
  27. 【請求項２７】前記位相シフト手段が前記マスクを動か
    すように適合された請求項19乃至26のいずれか１項に記
    載の装置。
  28. 【請求項２８】前記位相シフト手段が、周期性が見出さ
    れる方向に前記マスクを動かすように適合された請求項
    19乃至25のいずれか１項に記載の装置。
  29. 【請求項２９】前記位相シフト手段が、前記パターンの
    前記位相をほぼ連続的にシフトするように適合された請
    求項17乃至28のいずれか１項に記載の装置。
  30. 【請求項３０】前記位相シフト手段が、前記パターンの
    前記位相をほぼ段階的にシフトするように適合された請
    求項17乃至28のいずれか１項に記載の装置。
  31. 【請求項３１】前記試料の蛍光像を検出するための検出
    器を有する請求項17乃至30のいずれか１項に記載の装
    置。
  32. 【請求項３２】ほぼ周期的な空間的パターンを生成する
    パターン形成手段と、 前記パターンの前記空間位相を調整する位相シフト手段
    と、 前記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つ
    の像で異なっていて、前記空間的パターンがその上に生
    成される試料の像を解析するための手段と、前記３つの
    像から前記空間的パターンを除去し、それにより前記試
    料の光学的切片像を生成する手段を有するアナライザ
    と、を有する、 従来の顕微鏡を請求項17乃至30のいずれか１項に記載の
    装置に改造するように適合された装置。
  33. 【請求項３３】試料の光学的切片像を発生するために従
    来の顕微鏡を適合させる方法であって、 前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成する
    ために、顕微鏡の光学系にパターン形成手段を導入する
    ステップと、 前記試料の上に少なくとも３つの異なる空間的位相シフ
    トパターンを作成するために、前記パターンの空間位相
    を調整する空間位相シフト手段を設けるステップと、 それぞれ前記パターンの異なる空間位相シフトを有する
    前記試料の少なくとも３つの別々な像を解析するための
    手段と、前記試料の前記像から前記空間的パターンを除
    去し、それにより前記試料の光学的切片像を生成する手
    段を有するアナライザを設けるステップと、を有し、 前記記録された像を像のペアにグリーピングし、像の各
    ペア中の前記記録された像の間の差の平方の和の平方根
    を計算することによって、合焦像が得られ、 ３つの像が記録されている場合には、式 （ここで前記３つの記録された像がI1,I2およびI3であ
    り、前記合焦像がＩである） に従って、前記空間パターンが除去される、試料の光学
    的切片像を発生するために従来の顕微鏡を適合させる方
    法。
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