KR20010005952A

KR20010005952A - 단백질을 구강으로 운반하는 방법

Info

Publication number: KR20010005952A
Application number: KR1019997009029A
Authority: KR
Inventors: 니콜라스에이. 페파스; 안토니엠. 로만; 튜네지 나가이; 마리코 모리스쉬타
Original assignee: 펄듀 리서치 파운데이션
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2001-01-15
Also published as: WO1998043615A1; YU49699A; BR9808466A; AU727053B2; NZ500075A; EP0975328A1; CN1259045A; TR199903240T2; CA2285457A1; NO994757D0; IL132176A0; JP2002512607A; PL335974A1; NO994757L; AU6880998A

Abstract

척추동물에 생활성 화합물을 구강으로 투여하는 방법 및 그 조성물에 대해 설명한다. 이 방법은 팽창가능한 하이드로겔 매트릭스와 하이드로겔 매트릭스에 포함된 생체활성 화합물로 구성된 조성물을 척추동물에 구강으로 투여하는 것으로 구성된다.

Description

단백질을 구강으로 운반하는 방법{METHOD FOR ORAL DELIVERY OF PROTEINS}

인슐린과 같은 단백질로 된 물질을 구강계로 수송하는데에는 주로 두 가지 문제가 있다. 첫째로는 위장계(GI) 주로 위에 있는 분해 효소에 의해 대부분 단백질이 비활성화된다는 것이다. 이와 같은 문제는 약물이 GI 관의 좀더 유익한 환경 특히 내장의 하부 지역으로 방출되기 전에 위장의 유해한 환경으로부터 단백질을 보호할 수 있는 담체를 고안하여 해결할 수 있다. 또한, 구강으로 투여되는 단백질을 분해할 수 있는 GI 계에 존재하는 효소 작용을 지연시킬 수 있는 단백질 분해효소 저해물질을 이용할 수 있다. 또 다른 문제점으로는 내장에서 혈류을 가로질러 원래 크기가 큰 펩티드를 느리게 이동된다는 것이다. 연구자들은 이와 같은 경계를 통과하는데 도움을 주는 흡수 증강제를 첨가하여 이와 같은 장애물을 통과시키려고 하였다. 그러나, 현재 이용되는 수송 비이클은 효과가 낮다. 따라서, 효과적이고 상대적으로 적은 비용으로 만들 수 있는 경구 운반 시스템이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 하이드로겔 매트릭스 담체 및 생체활성 화합물로 구성된 조성물 및, 내장으로 활성 형의 화합물을 운반하는데 이와 같은 조성물을 이용하는 용도에 관계한다. 가장 바람직한 하이드로겔 매트릭스중에 하나는 테트라에틸렌 글리콜 디메타아크릴레이트와 교차결합된 폴리(메타아크릴산-g-에틸렌글리콜) 혼성고분자 구조, "P(MAA-g-EG) 하이드로겔"로써, 산성 펜던트 기가 있고, 그래프트 사슬과 양성자가 첨가된 펜던트 기 사이에 인터폴리머 복합체가 형성되었기 때문에 pH에 따라 팽창되는 성질을 가진다. 산성 매체에서 이와 같은 시스템은 인터폴리머 복합체로 인하여 상대적으로 덜 팽창된다. 염기성 용액에서는 펜던트 기는 이온화되고, 복합체는 분해된다. 이와 같은 하이드로겔의 pH에 따라 팽창하는 성질 및 이들의 생체흡착 성질을 이용하여 단백질을 구강을 통하여 운반하는데 이용되는 이상적인 하이드로겔을 만들었다.

본 발명은 팽창가능한 하이드로겔 매트릭스로 구성된 조성물 및 척추동물의 내장으로 활성형의 생체활성 화합물을 구강으로 운반하는데 이와 같은 조성물을 이용하는 것에 관계한다.

도 1은 P(MAA-g-EG) 하이드로겔에서 가역적인 복합체 형성을 보여준다. C는 포집된 생체활성 화합물을 나타낸다.

도 2는 PEG 그래프트(MW 1000) 및 MAA:EG(몰비가 37℃에서 1:1 )을 포함하는 샘플을 pH 함수에 따른 평형상태의 고분자 용적 분취물을 나타낸다.

도 3은 PEG 그래프트(MW 1000) 및 MAA:EG(몰비가 37℃에서 1:1 )을 포함하는 샘플을 pH 함수에 따른 평형상태의 매쉬 크기를 나타낸다.

도 4는 37℃에서 완충 염 용액내에서 pH 3.2() 및 7.4()에서 용액내에 프록시필린의 조절된 방출 및 pH 3.2() 및 7.4()에서 비타민 B₁₂의 조절된 방출을 나타낸다.

도 5는 37℃에서 P(MAA-g-EG) 하이드로겔로부터 테오필린의 in-vitro 박동식 방출을 나타낸다.

도 6은 37℃에서 P(MAA-g-EG) 하이드로겔로부터 반코마이신의 in-vitro 박동식 방출을 나타낸다.

도 7은 37℃에서 P(MAA-g-EG) 하이드로겔로부터 인슐린의 in-vitro 박동식 방출을 나타낸다.

도 6은 pH 3.2 및 7.4에서 소의 하악선 뮤친과 접촉하였을 때, 분자량이 1000인 그라프트 PEG 사슬과 MAA/EG 1:1을 포함하는 P(MAA-g-EG) 하이드로겔의 흡착성 성질을 나타낸다.

도 7은 25U/㎏(), 50U/㎏(), 50U/㎏()(N-5) 인슐린 용액에서 인슐린 적하된 P(MAA-g-EG) 하이드로겔을 쥐의 구강으로 투여한 후에 혈당 농도를 나타낸다.

도 8은 아프로티닌() 없이 그리고 아프로티닌() 존재하에, 50U/㎏(), 50U/㎏()(N-5) 인슐린 용액에서 인슐린 적하된 P(MAA-g-EG) 하이드로겔을 쥐의 구강으로 투여한 후에 혈당 농도를 나타낸다.

도 9는 젤라틴 캡슐을 이용하여, P(MAA-g-EG) 미소구(25U/㎏ 인슐린 약량)를 쥐의 구강으로 투여한 후에 건강한 수컷 Wistar 생쥐()와 당뇨가 있는 Wistar 생쥐()에서 혈당 반응을 나타낸다.

도 10은 Eudragit 캡슐을 이용하여, 구강으로 P(MAA-g-EG) 미소구(25IU/㎏)를 투여한 후에 당뇨병이 있는 수컷 생쥐에서 혈당 반응을 나타낸다.

도 11은 젤라틴 캡슐을 이용하여, P(MAA-g-EG) 미소구(10IU/㎏ 인슐린 약량)를 쥐의 구강으로 투여한 후에 건강한 개(25㎏)에서 혈당 반응을 나타낸다.

도 12는 젤라틴 캡슐을 이용하여, P(MAA-g-EG) 미소구(10IU/㎏ 인슐린 약량)를 쥐의 구강으로 투여한 후에 당뇨병 개(25㎏)에서 혈당 반응을 나타낸다.

본 발명은 척추동물의 구강으로 투여한 후에 생물학적으로 활성이 있는 단백질 및 제약학적 물질을 수송하는데 이용되는 조성물에 관계한다. 여기에서 이용되는 생물학적으로 활성이 있는 화합물이란 살아있는 세포에 효과를 가지는 임의 화합물을 말하는 것으로, 예를 들면 세포에서 생화학적 효과를 유도할 수 있는 화합물을 말한다. 한 구체예에서, 구강으로 투여되는 화합물은 팽창가능한 하이드로겔 복합체 및 팽창가능한 하이드로겔에 포함된 불안정한 단백질로 구성된다. 여기에서 이용되는 불안정한 단백질에는 온혈동물의 소화기관에 존재하는 효소에 노출되거나 또는 낮은 pH에 노출되어 단백질의 생물학적 활성이 파괴되거나 감소되는 것이 된다.

하이드로겔은 물에 팽창되는 것으로, 당분야에 공지된 교차결합된 고분자 매트릭스를 말한다(참고, Dresback, U.S. Patent No. 4,220,152; September 2, 1980). 하이드로겔은 척추동물에게 구강으로 단백질을 운반하는데 효과적인 운반 비이클이라는 것이 밝혀졌다. 하이드로겔의 팽창가능한 성질을 이용하여 조성물이 소화기관으로 통과할 때, 위장의 강한 환경으로부터 하이드로겔 내용물을 우선 보호하고, GI 기관에서 좀더 유리한 조건 예를 들면, 내장의 아래 부분으로 하이드로겔 내용물이 방출되도록 하는 것이다. 본 발명의 하이드로겔 조성물은 실제 팽창없이 위장을 통과하여, 소장에 국소화되고, 소장에서 팽창하여, 이들의 내용물을 방출시킨다.

하이드로겔에는 다양한 생물학적으로 활성을 가지는 화합물을 포집시키거나 적하시킬 수 있는데, 예를 들면, 제약학적 조성물, 생장 호르몬, 백신 조성물, 비타민, 스테로이드, 펩티드등이 포함되나 이에 국한시키지는 않으며, 이와 같은 생활성 화합물을 구강으로 투여시키기 위한 운반 비이클로 이용된다. 동물의 소화계내에서 수화되면, 하이드로겔에 적하된 화합물은 방출이 조절된다. 한 구체예에서, 본 발명의 하이드로겔 매트릭스는 폴리메타아크릴산으로 구성된 펠렛형으로, 폴리메타아크릴산 고분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 이온성 긴 사슬 고분자와 그래프트된다.

하이드로겔 펠렛은 교차결합 물질 존재하에 메타아크릴산으로 중합시켜 적절하게 합성한다. 교차결합제는 당분야에 공지된 다양한 생체 적합성이 있는 교차결합제에서 선택될 수 있는데, 예를 들면, 테트라에틸렌 글리콜 디메타아크릴레이트, 에틸렌 디메타아크릴레이트, 디에틸렌 디메타아크릴레이트, 트리에틸렌 디메타아크릴레이트, 테트라에틸렌 디메타아크릴레이트, 펜타에틸렌 디메타아크릴레이트, 이에 상응하는 디아크릴레이트 또는 메타아크릴레이트, 아크릴레이트 또는 메틸렌 비스-아크릴아미도 기로 구성된 성(star) 폴리머등이 포함된다. 중합반응은 유기 과산화물 또는 당분야에 공지된 UV 라디칼 개시물질등의 자유 라디칼 개시물질로 시작한다.

한 구체예에서, 하이드로겔 매트릭스는 생체 적합성 있는 교차결합된 물질과 교차결합된 메타아크릴산 및 폴리(알킬렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트(또는 모노아크릴레이트) 혼성 중합체로 구성된다. 여기에서 말하는 "폴리(알킬렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트"에는 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트, 폴리(프로필렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트, 폴리(에틸렌/프로필렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트를 포함하고, 이때 폴리(에틸렌/프로필렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트는 산화 에틸렌 및 산화 프로필렌 혼합물을 하이드록시 기능기 메타아크릴레이트로 개시하는 중합반응에 의해 만들어지는 중합체이다. 생성된 펜던트 폴리(알킬렌 글리콜) 기는 분자량이 약 200 내지 약 4000, 좀 더 적절하게는 약 200 내지 약 2000을 가지고, 한 구체예에서는 약 200 내지 약 1200을 가진다. 메타아크릴산 및 폴리(알킬렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트(또는 모노아크릴레이트)의 몰 비는 약 4:1 내지 약 1:4가 된다.

한 가지 적절한 구체예에서, 하이드로겔 매트릭스는 테트라에틸렌 글리콜 디메타아크릴레이트가 교차결합된 메타아크릴산 및 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트, "P(MAA-g-EG) 하이드로겔" 고분자로 구성된다. 중합체를 준비하는데 있어서, 분자량이 약 200 내지 약 2000인, 적절하게는 약 200 내지 약 1200인 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트는 메타아크릴산 및 테트라에틸렌 글리콜 디메타아크릴레이트가 된다. 메타아크릴산과 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트 단량체의 몰 비는 약 4:1 내지 약 1:4가 된다. 한 구체예에서, 메타아크릴산과 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트 단량체의 몰 비는 1:1이 된다. 교차결합제는 약 0.25 내지 10.00 mol%, 좀더 적절하게는 약 0.25 내지 1.00 mol%의 양으로 첨가되고, 한 구체예에서는 약 0.75mol%가 된다.

당분야에 고잊된 표준 기술을 이용하여 원하는 화합물을 하이드로겔에 적하시킬 수 있다. 한 구체예에서는 P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 직경이 약 50㎛ 내지 약 500㎛, 적절하게는 약 100-200㎛의 미소구로 형성된다. 하이드로겔 미소구는 한 구체예예 따르면, 중합된 매트릭스를 만들고, 매트릭스를 연마하여 원하는 평균 입자 크기를 가지는 하이드로겔 입자를 만들어 이루어진다. 하이드로겔 미소구에 우너하는 화합물을 적하하고, 당분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 표준 정제 또는 캡슐로 포장한다. 한 구체예에서 하이드로겔 입자는 젤라틴 캡슐에 포장한다.

한 구체예에서, 하이드로겔에는 균형 비율에 의해 생활성 화합물을 적하한다. 좀더 구체적으로, 하이드로겔은 pH〉5.8이고, 적하할 조성물을 포함하는 용액으로 수화시킨다. 그 다음 하이드로겔을 회수하고, pH〈5.8인 용액으로 세척하고, 적하된 하이드로겔을 건조시키고, 4℃에 저장한다. 본 발명의 하이드로겔을 적하하는 또 다른 방법은 단량체 및 교차결합제 용액에 원하는 화합물 수용액을 첨가하고, 혼합물의 중합반응을 개시하는 단계로 구성된다.

교차결합된 고분자 구조를 통하여 확산되는 화합물의 능력은 겔이 팽창하는 정도 및 화합물의 크기에 따라 달라진다. 하이드로겔이 팽창할 때, 교찰결합점 간에 고분자 사슬이 연장되고, 네트워크 메쉬 크기 또는 이에 상응하는 길이,

본 발명의 P(MAA-g-EG) 하이드로겔을 산성 조건(일반적으로 pH〈5.8)에 노출시키면, 폴리메타아크릴레이트기와 펜던트 폴리(알킬렌 글리콜)기 사이에 수소 결합 때문에 일시적으로 물리적인 교차 결합이 형성된다. 이와 같은 물리적인 교차 결합은 자연 상태에서 가역적이고, 환경의 이온 강도 및 pH에 따라 달라진다. 따라서, 교차 결합 정도 및 네트 워크 메쉬 크기 ε은 주변 환경의 pH 및 이온 강도에 따라 상당히 달라진다. 산성 매체에서, 이와 같은 시스템은 분자내 복합체가 형성되기 때문에 상대적으로 팽창이 덜 된다. 염기성 용액에서, 펜던트 기는 이완화되고, 복합체는 용해된다. 도 2에서는 P(MAA-g-EG)의 평형 팽창을 보여준다. pH에 따른 하이드로겔(PEG 그래프트 분자량 1000MW, MAA:EG 몰비 1:1)의 고분자 용적 분취물로 데이터를 나타낸 것이다. 낮은 pH에서 MAA 및 EG 동량의 몰비인 경우에, 복합체 형성 정도가 높고, 팽창 상태에서 겔에 고분자 용적 분취물 ₂₀은 거의 0.70에 근접한다. 그러나, 팽창 용액의 pH가 4.6까지 증가되면, 복합체는 분해되기 시작하고, 기본 구조의 사슬이 연장되어, 겔에서 평형 고분자 용적 분취물은 상당히 감소된다. 더 많이 팽창하고, 복합체가 형성안된 하이드로겔에는 구조에 더 많은 물이 결합되어 있기 때문에 고분자가 5%이하로 포함된다.

P(MAA:g-EG) 겔에서 복합체 형성/복합체 분리 현상 때문에, 네트워크의 메쉬 크기는 원하는 범위의 pH를 초과하는 경우에 상당히 변화하게 된다. 추가로, pH를 달리하는 용액에서 작은 변형(10% 미만)을 위한 모듈을 얻을 수 있다. 이와 같은 데이터를 이용하여, 공규 및 물리적인 교차결합 점사이에 고분자 사슬의 단부-단부간 거리를 결정하여 메쉬 크기를 pH에 따른 함수로 계산한다. 평균 메쉬 크기 또는 이와 관련된 길이는 팽창 용액의 pH에 상당히 영향을 받는다(도 3). 복합체가 형성되는 낮은 pH 용액에서, P(MAA-g-EG) 하이드로겔의 네트워크 메쉬 크기는 70 Å정도로 낮다. 그러나, pH가 증가되면, 물리적인 교차결합은 분해되고, 고분자 사슬이 연장되어, 네트워크의 메쉬 크기는 3배 증가되어 거의 210Å가 된다. 더욱 중요한 것은, 이상적인 네트워크를 가정하였을 경우에, 확산에 대해 이용할 수 있는 면적은 메쉬 크기와 동일하다. 따라서, 복합체가 형성된 하이드로겔(pH가 5.2 미만)보다 복합체가 형성안된 하이드로겔(pH는 5.2이상)에서 확산에 경우에 9배 이상 면적이 증가된다. 가역적인 복합체를 형성하는 자연 현상 때문에, P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 약물을 진동식으로 방출하는 이상적인 것이 된다. 또한, 약간의 pH 변화에도 네트워크 구조에 큰 변화가 있기 때문에, 이들 물질은 펩티드 및 단백질에 담체로 우수한 기능을 한다. 특히, 본 발명의 P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 분자량이 약 1,000 내지 약 100,000, 좀더 구체적으로는 약 1,000 내지 20,000의 분자량을 가지는 화합물의 운반 담체로 기능을 할 수 있다.

특정 약물의 담체로써 기능을 하기 위해 겔의 능력을 평가하는데 있어서, 중요한 변수는 네트워크 메쉬 크기에 대한 효과적인 분자 크기(유체 역학적인 직경, d_h) 비율이 된다. 이와 같은 네트워크의 크기-압출 특징을 연구하기 위해, 분자 크기가 다른 두 가지 용빌 즉, 프록시필린(분자량 238; d_h=4.3Å) 및 비타민 B₁₂(분자량 1355; d_h=17Å)이 복합체가 형성된 하이드로겔 및 복합체가 형성안된 하이드로겔로부터 방출되는 것에 대해 연구하였다(도 4). pH=3.2인 용액에서, 하이드로겔 고분자는 상당한 정도로 복합체가 형성되고, 약물 수송이 상당히 방해를 받았다. 그러나, 분자 크기가 작기 때문에, 프록시필린의 약 30%가 동일한 시간대에서 겔로부터 방출된다. 하이드로겔을 pH=7.4인 용액과 접촉시켰을 경우에, 펜던트 산 기의 이온화로 인하여, 하이드로겔의 사슬간 복합체가 분해된다. 그 결과로, 하이드로겔은 하이드로겔이 상당히 팽창되어, 고분자로부터 비타민 B₁₂및 프록시필린이 실제 확산된다.

2차원 시스템에서 이와 같은 방출 데이터는 전통적인 Fickian 식의 용액에 짧은 시간 근사치에 고정시키고, 확산 계수는 복합체가 형성된 그리고 복합체가 형성안된 P(MAA-g-EG) 하이드로겔을 통하여 프록시필린 및 비타민 B₁₂의 확산에 대해 계산할 수 있다(표 1). 분자량이 큰 용질, 비타민 B₁₂을 수송하는 경우에는 용질의 직경에 대해 네트워크 메쉬 크기의 비율이 증가되기 때문에, 프록시필린보다는 복합체 형성에 더 많이 영향을 받는다. 복합체가 형성안된 하이드로겔에서 비타민 B₁₂확산 상수는 복합체가 형성된 하이드로겔의 확산 상수보다 약 2배 많고, 프록시필린의 확산 상수는 복합체가 형성된 하이드로겔에 비해 복합체가 형성안된 하이드로겔의 경우에 그 크기가 약 1배 정도 된다.

복합체가 형성된 하이드로겔 및 복합체가 형성안된 하이드로겔에서 프록시필린 및 비타민 B₁₂에 대한 확산 상수

용질	pH	(Å)	d_h/	D_3.12x10⁸(㎠/s)
프록시필린	3.2	70.8	0.060	0.403
프록시필린	7.4	194.4	0.022	9.38
비타민 B₁₂	3.2	70.8	0.240	0.0168
비타민 B₁₂	7.4	194.4	0.087	6.75

비타민, 제약학적 조성물 및 다른 생물학적으로 활성이 있는 화합물의 구강 수송용 운반체로 기능을 할 수 있는 지에 대해 P(MAA-g-EG) 하이드로겔의 능력을 추가로 조사하기 위해서, 위장 조건에 유사한 조건하에서 다양한 화합물의 박동식 방출을 조사하였다. 실시예 1에서와 같이 테오필린(MW=180.2), 반코마이신(MW=1485.7), 인슐린(MW=5733.2)을 이용하여 In vitro 방출 실험을 실행하였다. 각 호합물은 평형 분할에 의해 P(MAA-g-EG) 하이드로겔에 적하하고, 적하된 하이드로겔은 2시간 동안 위산과 유사한 환경의 200㎖(pH=1.2)에 담군다. 그 다음, 고분자 미소입자는 pH=6.8 인산염 완충 용액으로 옮긴다. 주변 용액으로 방출되는 인슐린 농도를 HPLC을 이용하여 모니터하고, 티오필린, 반코마이신, 인슐린에 대한 결과는 도 5a-5c에 각각 나타내었다.

하이드로겔 매트릭스로부터 화합물이 방출되는 것은 산성 용액에서는 감소된다(도 2참고, 처음 2시간 동안 노출). 그러나, pH6.8의 완충 용액에서는 화합물이 신속하게 방출되는 것을 볼 수 있다. 약물의 분자량이 증가하기 때문에, 이와 같은 경향이 더 많이 나타난다. 예를 들면, P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 인슐린(MW=5733.2)의 경우에 효과적인 운반 수단이 되고; 실험 처음 상 동안에 가상 위산(pH=1.3)에서 고분자로부터 10% 미만의 인슐린이 방출된다. 그러나, 입자가 pH=7.4 완충 용액에 위치하게 되면, 하이드로겔은 신속하게 방출되어, 급속하게 인슐린을 방출한다. 이와 같은 결과로 그라프트 P(MAA-g-EG)는 구강으로 인슐린을 운송하는 시스템에 유용하다는 것을 나타낸다. 여기에서 이용된 것과 같이 인슐린에는 정제된 사람 및 동물 천연 인슐린 및 이들의 유도체, 가령 인슐린 리스프로 및 재조합 인슐린, 1가 또는 이가 인슐린 염 또는 인슐린 유도체가 포함된다.

추가로, P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 그라프트된 PEG 사슬이 존재하기 때문에 강한 점막 흡착성질을 나타내고, 이는 흡착 프로모터로 작용한다. 또한, P(MAA-g-EG)의 점막 흡착정질은 환경 유체의 pH에 상당히 영향을 받는다(도 6 참고). 겔과 점막 사이에 흡착성은 가장 내장 pH(pH=7.4)에서는 가장 위 환경에 비교하였을 때 상당히 크다. 그러나, 겔의 점막 흡착 성질을 실제 비교하기 위해, 흡착 작업을 표준화하여, 고분자 겔 분취물에 대해 설명하였다. 흡착 작업 표준화는 복합체가 형성안된 상태의 하이드로겔의 경우에 그 크기가 2배 정도가 된다. 따라서, P(MAA-g-EG) 하이드로겔의 점막 흡착 성질은 위장을 통과할 때 상대적으로 낮아지고, 복합체가 형성된 상태에서는 그대로 유지된다. 내장에 도착된 후에는, 사슬간 복합체는 분해되고, 위장 점막에 비해 내장의 점막에 하이드로겔이 흡착되는 것을 강화시키게 된다. 따라서, 척추 동물의 구강으로 투여한 후에 인슐린이 흡수되는 부분(예를 들면 내장)에 인슐린 담체가 더 많은 시간동안 잔류하게 된다.

다른 pH값에서 이와 같은 하이드로겔의 흡착 성질이 차이가 나는 것은 각 물질에서 PEG 사슬의 이동성 때문이다. 매우 팽창된 복합체를 형성안하는 조건에서는 펜던트 PEG 사슬은 자유롭고, 바로 점막으로 침투하여 흡착 고정물질로 작용한다. 복합체가 형성된 상태에서, P(MAA-g-EG의 펜던트 PEG는 기본 구조 사슬과 복합체를 형성하여 점막 표면과 상호작용을 할 수 없게 된다.

본 발명에 따르면, 하이드로겔 조성물을 이용하여 척추동물에 치료요법적으로 효과량의 단백질을 투여한다. 이 방법은 하이드로겔 담체내에 포함된 단백질로 구성된 조성물을 척추동물의 구강으로 투여하는 단계로 구성된다. 하이드로겔 매트릭스에 포함된 조성물에는 추가로 단백질 분해효소 저해물질, 당분야에 공지된 제약학적 수용 가능한 담체, 안정화제, 생체 적합성이 있는 충진제가 포함된다.

한 가지 적절한 하이드로겔 담체는 P(MAA-g-EG)이고, 한 구체예에서는 P(MAA-g-EG) 하이드로겔 매트릭스에는 인슐린으로 구성된 제약학적으로 수용 가능한 조성물을 포함한다. 또한, 한 구체예에 따르면, 인슐린 조성물에는 추가로 프로테아제 저해물질 또는 흡수 강화물질이 포함된다. P(MAA-g-EG) 하이드로겔내에 포함되는 인슐린으로 구성된 조성물은 인슐린을 동물의 혈류로 운반하는데 놀라운 효과가 있는 것을 알 수 있다(실시예 3, 4). 하이드로겔는 일반적으로 특정 형으로 준비되고, 당분야에 공지된 기술을 이용하여 적절한 구강 운반용 비이클(가령, 정제, 캡슐등)으로 포장된다.

한 구체예에서, 운반 시스템은 폴리(메타아크릴산) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 교차 결합된 혼성 중합체의 미소 입자로 구성되고, 인슐린을 포함한다. 조성물이 위장의 극한 조건에 통과하는 동안에, 이와 같은 시스템은 혼성중합체가 인슐린을 보호하기 위해 pH에 민감한 팽창 성질을 나타내기 때문에 특히 효과적이다. 펜던트 PEG 사슬은 또한 흡착성 프로모터로 작용하여 원하는 운반 부위에 하이드로겔 담체의 잔류 시간을 증가시킨다. 실시예 2에서 설명하는 것과 같이 하이드로겔의 흡착성질은 pH에 따라 큰 영향을 받기 때문에, 위장 표면보다는 내장 표면에 더 잘 흡착된다. 또한, 펜던트 PEG 고분자가 존재하여, 펩티드 안정화제로 작용하고, 인슐린과 같은 생활성 화합물의 생물학적 활성을 유지시키는데 도움이 된다.

하이드로겔 혼성중합체에서 사슬간에 복합체 형성은 주변 유체의 특징 및 pH에 민감하고, 혼성 중합체 및 그라프트 사슬 길이에 민감하다. 위의 산성 환경에서, 하이드로겔은 카르복실산 프로톤과 그라프트된 사슬에서 에테르 기 사이에 수소결합으로 안정화된 고분자간에 복합체가 형성되기 때문에 복합된 상태가 된다. 이와 같은 조건에서, 적어도 분자량이 1000인 화합물(예를 들면, 인슐린)은 막을 통하여 확산되지 않는데, 그 이유는 작은 포어 크기, ε 때문이다. 따라서, 이와 같은 화합물은 위산의 거친 환경으로부터 보호된다. 입자가 위를 통하여 내장으로 통과할 때, 주변의 pH가 겔의 전이 pH이상으로 증가된다. 복합체는 바로 분해되고, 네트워크 포어 크기는 신속하게 증가되어 분자량이 100,000인 화합물을 방출하게 된다. 따라서, P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 분자량이 1,000 내지 약 100,000인 화합물을 구강으로 운반하는 효과적인 비이클로 이용할 수 있다.

실시예 1 ; P(MAA-g-EG) 하이드로겔 내용물을 pH에 따라 방출

세 가지 크기가 다른 화합물(테오필린(MW 180.2), 반코마이신(MW 1485.7), 인슐린(MW 5733.2))에서 P(MAA-g-EG) 하이드로겔이 운송용 비이클로 작용할 수 있는 지에 대해 조사하였다.

메타아크릴산 및 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트을 자유 라디칼 용액 중합반응시키고, 올리고머 사슬은 테트라에틸렌 글리콜 디메타아크릴레이트에 교차결합시켜, 37℃에서 P(MAA-g-EG) 하이드로겔을 준비하였다. 그 다음 하이드로겔은 탈이온 수로 1주일간 세척하여, 반응안된 단량체 및 교차결합안된 올리고머 사슬을 제거하고, 진공하에서 건조시키고, 평균 입자 크기가 100-150㎛인 분말로 연마한다.

테오필린(MW 180.2), 반코마이신(MW 1485.7), 인슐린(MW 5733.2)을 이용하여 약물 포집 실험을 실행하였다. 각 약물은 pH 7.4 인산 완충 용액에 용해시키고, P(MAA-g-EG) 하이드로겔을 약물 용액에 첨가하여 평형 분할에 의해 하이드로겔에 약물 용액을 적하시킨다. 그 다음 하이드로겔 매트릭스는 산 용액과 접촉시켜, 고분자가 복합체 형성을 유도시키고, 하이드로겔 매트릭스 포어 크기를 줄인다. 하이드로겔 미소구는 여과에 의해 수득하고, 진공하에서 건조시킨다. 포집 효율은 초기 용액에서 잔류된 약물 농도와 분리된 하이드로겔을 세척하여 얻은 여과물에서 계산하는데, HPLC 분석으로 실행한다.

Japanese Pharmacopoeia(JP) paddle 방법에 따라 약물 방출 실험을 한다. 조성물은 100rpm, 37℃ 제1(pH 1.2) 및 제2(pH 6.8) JP 용액에서 paddle로 교반시킨다. 제1용액으로 처리한 후 2시간 후에, 고분자 샘플은 여과를 이용하여 수집하고, pH6.8의 제2용액으로 이동시킨다. 약물 농도는 HPLC에 의해 모니터한다.

실험 시작후 30분후에, 하이드로겔 매트릭스에 포집되는 평균 인슐린 농도는 거의 94%에 이르고, 따라서 고분자는 인슐린을 운반하는 적절한 운반체가로 본다. 테오필린, 반코마이신, 인슐린이 P(MAA-g-EG) 하이드로겔로부터 방출되는 실험은 각각 도 5a, 5b, 5c에 나타내었다. 하이드로겔 매트릭스로부터 화합물이 방출되는 것이 산성 용액에서는 감소된다(처음 노출후 2시간을 참고). 그러나, pH 6.8 완충 용액에서는 화합물이 신속하게 방출되는 것을 볼 수 있다. 이와 같은 경향은 분자량이 증가되면 더욱 나타나는데; 처음 실험 상에서 인슐린의 10% 미만이 유사 위액(pH=1.3)에서 고분자로부터 방출된다. 그러나, 입자가 pH=7.4 완충 용액에 있게되면, 하이드로겔은 신속하게 팽창하여, 인슐린이 급속하게 방출된다. 이와 같은 결과는 그라프트 혼성중합체 P(MAA-g-EG)가 구강으로 인슐린을 운반하는 시스템으로유용하다는 것을 말해준다.

실시예 2; In vitro 접막 흡착 연구

용액 중합반응 기술을 이용하여, P(MAA-g-EG) 하이드로겔을 박막으로 준비한다. 하이드로겔은 DMGA 완충 용액(pH=3.2 및 7.4)에서 평형을 이루도록 팽창된다. 팽창된 하이드로겔은 직경이 20㎝인 드스크로 절단하고, 25℃, 90% RH에서 텐실 테스트기에 둔다. 고분자 샘플은 시안아크릴레이트 의료 접착제를 이용하여 테스트기의 상측 홀더에 흡착되고, 반면에 겔화된 소 하악 뮤신 샘플은 접착제를 이용하는 경우에 아래측 부분에 고정된다. 두 개를 함께 15분 동안 가져다 놓고, 그 다음 1㎜/분으로 떼어놓는다. 이동에 대한 함수로 분리력을 측정한다. 생체 흡착 작업에 등가인 파열 작업은 곡선 아래 면적으로 계산된다.

P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 구강 인슐린 장치로 기능을 잘 하는데 그 이유는 이들은 프로테아제 저해물질의 작용을 지연시킬 수 있고, 내장 벽에 흡착할 수 있기 때문에 상당한 접촉을 할 수 있고, 이는 약물의 흡착을 돕게 된다.

인슐린을 포함하는 하이드로겔이 내장 유체에 있는 경우에, 하이드로겔은 신속하게 팽창하여 인슐린을 방출한다. 인슐린을 포함하는 P(MAA-g-EG) 미소입자는 1시간동안 인산 완충 용액에서 팽창되고, 그 다음 내장 유체로 이동된다. 내장 유체에서 인슐린의 단백질 분해는 인슐린 EIA kit를 이용하여 모니터한다. 단백질 분해효소 존재하에 1시간 이상 인슐린의 생물학적 활성의 50%이상이 유지되었다. 비교를 목적으로, 인슐린이 내장 유체에 용해되었을 때, 생물학적 활성은 신속하게 상실된다. P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 이온화된 펜던트 기에 칼슘을 결합시켜, 프로테아제 효소의 작용을 지연시킴으로써 인슐린을 보호한다.

따라서, P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 접착 프로모터로 작용하는 그라프트 PEG 사슬이 존재하기 때문에 점막흡착 성질을 나타낸다. P(MAA-g-EG) 하이드로겔의 점막흡착 특징은 주변 환경 유체의 pH에 강하게 영향을 받는다(도 6). 도 6의 곡선 아래 면적은 겔과 점막사이에 접착력과 등가이다. 내장 pH와 유사한 (pH = 7.4) 조건에서는 겔과 점막간에 흡착력은 상당히 많이 커진다. 그러나, 하이드로겔의 점막흡착력과 실제 비교를 위해서는, 흡착 작업을 표준화하여, 고분자 겔 분취물을 설명하였다(표 2 참고). 표준화된 흡착 작업은 복합체가 형성된 하이드로겔에 비하여 복합체가 형성안된 상태에서 하이드로겔에 대해 약 2배 크다. 따라서, 위장에서 보다는 내장의 점막에 하이드로겔이 더 잘 흡착된다. 따라서, 인슐린이 흡수되는 부위에서 인슐린 담체의 진류 시간이 더 크다.

분자량이 1000인 PEG와 1:1 MAA/EG를 포함하는 P(MAA-g-EG) 하이드로겔의 흡착력

pH	흡착작업W^*10⁶(J)	고분자 용적분위물 O_2'S	표준화된 흡착작업W/(O_2'S)^2/3*10⁶(J)
3.2	5.38	0.693	62.1
7.4	9.34	0.049	6720

각 물질에서 PEG 이동성으로 인하여 상이한 pH 값에서 하이드로겔의 흡착 성질이 다르다. 매우 팽창된 상태, 복합체를 형성하지 않은 상태에서, 그라프트 PEG 사슬은 자유롭고, 바로 점막으로 침투하여, 흡착에 대한 고정물질로 작용한다. 복합체를 이룬 상태에서는 P(MAA-g-EG)에서 그라프트 PEG 사슬은 기본 구조 사슬과 복합체를 형성하여 겔/점막 사이면에 침투할 수 없고, 일시적인 고정만 이루어진다.

실시예 3; 생쥐에 인슐린을 In vivo 로 투여

메타아크릴산 및 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트를 자유 라디칼 용액 중합반응시켜 그라프트 혼성 중합체를 준비한다. 그 다음 하이드로겔은 7일간 탈이온수로 세척하여 반응안된 단량체 및 교차결합안된 올리고머 사슬을 제거한다. 하이드로겔은 진공하에서 건조시키고, 분말로 연마한다. 분말은 여과하여, 직경이 100 - 150㎛인 입자를 얻는다. 평형 분할에 의해 결정형 돼지 인슐린(26.9 U/㎎)을 적하시킨다. 약물이 적하된 입자를 여과시키고, 세척하여 표면 약물을 제거하고, 진공하에서 건조시킨다.

Male Wlstar 쥐(200g)를 24시간동안 묶어 둔다. 쥐는 반듯이 누워있도록 하고, 젤라틴 캡슐을 이용하여 인슐린이 포함된 고분자 미소입자를 투여하는데, 캡슐은 위장에서 바로 용해된다. 실험하기 전과 실험 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8시간에 0.2㎖ 혈액 샘플을 취하여 혈당을 모니터한다. 혈청은 3분간 3000rpm에서 분리하여, 분석할 때 까지 보관한다. 혈청 인슐린 수준은 인슐린 EIA kit를 이용하여 효소 면역검사에 의해 결정한다. 혈청 포도당 농도는 포도당 B-Test kit를 이용하여 산화 포도당 방법으로 결정한다.

도 7에서는 인슐린이 P(MAA-g-EG) 미소입자에 포집된 것을 투여받은 쥐의 혈당 반응을 요약한 것이다. 고분자 약형을 제공받은 후 2시간이내에, 상당한 저혈당 효과(혈당 수준이 낮아짐)가 관찰되었다. 혈당 수준이 감소되는 것은 인슐린 약량에 상당히 영향을 받는다. 인슐린 용액을 제공받은 쥐에서는 반응이 관찰되지 않았다.

인슐린 및 프로테아제 저해물질인 아프로티닌을 포함하는 P(MAA-g-EG) 하이드로겔로 구성된 조성물을 투여한 효과를 도 8에 나타내었다. 기준 쥐에는 프로테아제(비교를 위한)를 포함하지 않고 인슐린만을 포함하는 하이드로겔을 투여하였고, 한 집단에는 50U/㎏ 인슐린(기준으로 사용)을 투여하였다. 인슐린 고분자 약형을 제공받은 두 집단은 투여후 2시간이내에 혈당이 상당히 감소하였다. 인슐린 및 프로테아제 저해물질인 아프로티닌 복합물을 제공받은 쥐는 혈당 수준이 최고로 감소되었다. 아프로티닌은 내장에서 분해 효소의 작용을 지연시키고, 적하된 인슐린이 국소적으로 더 오래 활성을 유지할 수 있도록 한다. 따라서, 혈류로 이동되는 인슐린은 하이드로겔 인슐린 및 프로테아제 저해물질 조성물을 제공받은(P(MAA-g-EG) 하이드로겔내에 포집됨) 쥐에서 최대가 되고 이는 혈당 농도를 최대로 감소되는 원인이 된다 .

실시예 4; 당뇨병이 있는 쥐와 개에서 In Vivo 연구

스트렙토조토신을 건강한 수컷 Wistar 쥐에 투여하여 당뇨병을 유발한다. 건강한 개에는 알록산을 투여하여 당뇨를 유도한다. P(MAA-g-EG) 미소구는 메타아크릴산 및 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타아크릴레이트(PEG MW = 1000) 자유 라디칼 거대 현탁 중합반응을 이용하여 준비한다. 교차 결합제로는 테트라에틸렌 글리콜 은 디메타아크릴레이트를 첨가한다. 열 반응 개시물질로는 2,2'-아조비스부티로니트릴(AIBN)를 총 단량체의 0.5%정도의 양으로 첨가한다.

인슐린을 P(MAA-g-EG) 미소구에 평형 분할을 이용하여 약물을 적하한다. 소 췌장 인슐린은 200㎕ 1N NaOH에 용해시킨다. 인슐린 용액은 20㎖ 인산완충 용액(pH=7.4)으로 희석시킨 다음 200㎕ 0.1N NaOH로 평형을 이룬다. 24시간 동안 인슐린 용액에 초기 건조된 P(MAA-g-EG)를 팽창시켜 약물을 적하한다. 입자는 그 다음 여과시키고, 100㎖ 0.1N HCl로 세척하여 미소구를 쭈그러뜨리고, 남아있는 완충 용액은 짜낸다. 약물이 적하된 미소구는 진공하에서 건조시키고, 4℃에서 저장한다. 적하 비율은 초기 인슐린 농도 및 세척액에서 얻은 여과물을 HPLC 분석하여 결정한다.

인슐린이 적하된 P(MAA-g-EG) 하이드로겔을 투여하기 전에, 수컷 Wistar 쥐(250g)를 24시간 묶어둔다. 쥐는 드러 누운채로 있고, 인슐린 적하된 P(MAAA-g-EG) 미소구 및 기준 용액은 젤라틴 캡슐 및 Eudraglt L 100 캡슐을 이용하여 만든다. 젤라틴 캡슐은 위에서 바로 용해되고, Eudraglt 캡슐은 상당히 느리게 용해된다.

실험하는 동안에, 쥐는 분리하고(우리당 4마리), 물은 먹을 수 있도록 한다. 투약후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8시간에 0.2㎖ 혈액을 경부 정맥에서 뽑아낸다. 혈류는 3000rpm에서 3분간 원심분리하여 분리한다. 혈당 수준은 포도당 B-test kit를 이용하여 산화 포도당 방법으로 측정한다.

당뇨가 있는 개(25㎏)는 조성물을 투여하기 전에 24시간 묶어둔다. 고분자 약형은 젤라틴 캡슐을 이용하여 투여한다. 투여시에 개에게 먹이를 공급한다.

실험하는 동안에, 개는 우리에 가두고, 물은 먹을 수 있도록 한다. 팽창 카테테르를 이용하여 혈액을 얻는다. 혈당 수준은 이동식 포도당 분석기를 이용하여 결정한다.

인슐린을 포함하는 고분자 담체를 경구로 투여한 후에 건강한 동물에서 혈당 수준을 낮추는데 효과가 있는 시스템은 많이 있지만, 당뇨가 있는 동물에서 유사한 결과를 관찰할 수는 없었다. 인슐린을 포함하는 P(MAA-g-EG) 미소구를 젤라틴 캡슐(25IU/㎏ doses)을 이용하여 당뇨가 있는 그리고 건강한 쥐에서 관찰된 혈당 반응은 도 9에 나타내었다. 당뇨가 있는 쥐에서 혈당 수준은 초기 수준에 최고 40%까지 낮아졌다. 혈당 수준은 8시간 이상 지속되고, 억제된 혈당 수준은 건강한 동물보다는 당뇨가 있는 동물에서 휠씬 크다. 따라서, 당뇨 동물에서 강한 저당 효과는 더 오래 지속되었다.

도 10에서는 인슐린 적하된 P(MAA-g-EG) 미소구를 포함하는 Eudragit 캡슐을 구강으로 투여한 후에 당뇨가 있는 쥐에서 혈당 반응을 나타낸 것이다. 이와 같은 약형을 투여받은 쥐에서 포도당 수준은 1회 투여후 적어도 8시간이내에 50%이상 감소되었다. Eudragit에 포집된 미소구는 젤라틴에 포집된 것보다는 더 효과적인데 그 이유는 Eudragit 캡슐에 포함된 미소구가 더 짧은 시간 동안에 상측 GI 기관의 환경에 노출되어 Eudragit 캡슐이 서서히 용해되기 때문이다.

건강한 개의 혈당은 한 개 고분자 약형(10 IU/㎏)을 구강으로 투여한 후에 상당히 낮아졌다. 0시간에 개에 먹이를 공급하고, 신체의 정상적인 반응은 기저 수준으로 유지되어야 한다. 음식을 공급한 후에, 혈당 수준이 2시간 이내에는 증가되나, 상측 내장에서 인슐린이 흡수되기 때문에, 혈당 수준이 20%이상 감소된다. 또한, 8시간 시점에서 제 2 감소가 있는데, 이는 기존에 쥐에서 볼 수 있는 것과 일치하는데 그 이유는 아마도 인슐린이 결장에서 흡수되기 때문이다. 또한, 8시간 후에 혈당 수분이 일정하게 감소되는데 그 이유는 인슐린이 결장에서 흡수되기 때문이다.

당뇨가 있는 개에서 포도당 반응은 경구 투약후에 인슐린을 흡수한다는 것을 증명한다. 당뇨가 있는 개의 혈당 수준은 젤라틴 캡슐(10IU/㎏ doses)을 이용하여 인슐린을 포함하는 P(MAA-g-EG) 미소구를 투여하여 조절할 수 있다. 음식을 공급한 후에, 고분자 약형을 투여한 후에, 개에서 혈당 수준은 처음에 급격하게 상승된다. 그러나, 1시간 후에, 혈당 수준은 인슐린이 흡수되기 때문에, 그 다음 3시간 동안 안정화된다. 고분자 약형을 투여받은 당뇨가 있는 개에서 혈당 수준은 임의 인슐린을 제공 받지 않은 개보다 40% 적다.

구강으로 인슐린을 수송하는 시스템은 상측 소장 기관과 같은 GI 기관을 따라 더욱 바람직한 흡수 지역으로 이동될 수 있도록 상당 시간 동안 생물학적으로 활성을 가지는 인슐린을 운반하고, 위장에서부터 보호될 수 있도록 한다. 이들 고유 성질로 인하여 복합체 P(MAA-g-EG) 하이드로겔이 이와 같은 곳에 이용하는데 이상적이다.

P(MAA-g-EG) 하이드로겔은 구강을 통하여 생물학적으로 활성을 가지는 인슐린을 효과적으로 운반할 수 있다. 이와 같은 물질은 당뇨가 있는 쥐 및 개에서 혈당 수준을 낮추고, 8시간 이상 거의 정상적인 수준으로 혈당을 유지할 수 있는 것으로 나타났다. 이와 같은 물질은 하이드로겔에 포집된 인슐린이 소장의 상부에 도달할 때 까지 인슐린을 방출시키지 않기 때문에 기능을 잘 한다. 소장에서, 하이드로겔은 담체가 흡착 부위에 잘 흡착될 수 있도록 강하게 점막에 흡착된다. 또한, 고분자는 내장에 단백질 분해 효소 활성을 지연시키는 작용을 한다. 효소 기능에서 고분자의 저해 효과는 고분자가 효소 기능에 필수적인 칼슘과 같은 양이온과 복합체를 형성할 수 있는 능력으로 인한 것이다.

Claims

경구로 투여할 수 있는 제약학적 조성물에 있어서, 조성물에는 팽창가능한 하이드로겔 매트릭스와 이에 포함된 열에 불안정한 단백질로 구성되고, 이때 하이드로겔 매트릭스는 메타아크릴 산 및 폴리(알킬렌 글리콜)모노메타아크릴레이트 교차결합된 혼성 중합체로 구성되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트는 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 하이드로겔 매트릭스는 테트라에틸렌 글리콜 디메타아크릴레이트와 교차결합된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 2 항에 있어서, 메타아크릴 산 및 폴리(에틸렌 글리콜)모노메타아크릴레이트의 몰비는 약 1:1인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 단백질은 분자량이 약 1,000 내지 약 20,000인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 단백질은 인슐린인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트는 분자량이 약 200 내지 약 4000인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 하이드로겔은 입자형이고, 캡슐에 포함되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 캡슐은 젤라틴 캡슐인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 프로테아제 저해물질이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
척추동물에 인슐린을 구강으로 투여하기 위한 조성물에 있어서, 조성물은 P(MAA-g-EG) 하이드로겔에 포함된 인슐린으로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 11 항에 있어서 추가로 프로테아제 저해물질이 포함된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 11 항에 있어서, 하이드로겔은 입자형이고, 캡슐에 포함되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 캡슐은 젤라틴 캡슐인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
척추동물에 치료요법적으로 효과량의 단백질을 투여하는 방법에 있어서, 제1항에 따른 조성물을 척추동물의 구강으로 투여하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 따른 조성물을 제조하는 방법에 있어서,

메타아크릴 산 및 폴리(알킬렌 글리콜) 디메타아크릴레이트 및 교차결합제를 중합시켜, 하이드로겔 매트릭스를 만들고;

하이드로겔 매트릭스는 단백질의 수용성 환경에 접촉시키고, 이때 용액은 pH가 5.4 이상 이고;

용액의 pH는 5.4이하로 조절하여;

단백질을 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 분리하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트는 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메타아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 방법.