KR20010005859A - 보조 펩타이드를 사용하는 펩타이드의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목적하는 생물학적 활성을 갖는 펩타이드의 유전자 재조합에 의한 제조에 있어서, 목적하는 펩타이드에 보조 펩타이드를 부가하여 이를 발현시키는 것을 특징으로 한다. 이로써 등전점을 조정하여 회수·정제공정에서의 응집의 방지; 이온교환 크로마토그래피에서의 회수율의 향상; 목적하는 펩타이드를 것 외의 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현시키는 경우에 있어서, 효소를 사용하여 목적하는 펩타이드를 유리시키는 효소 반응시의 당해 융합 단백질의 용해도의 향상, 목적하는 펩타이드의 효소에 의한 수식이 필요한 경우에 있어서, 효소반응시의 당해 펩타이드의 용해도의 향상 등을 수행하여 목적하는 펩타이드의 정제효율및 수율을 향상시킬 수 있다.

Description

보조 펩타이드를 사용하는 펩타이드의 제조방법{Process for producing peptide with the use of accessory peptide}
다수의 생리활성 펩타이드가 유전자 재조합 기술을 사용하여 미생물이나 동물세포 등을 숙주로 하여 생산되고 있다. 목적하는 펩타이드의 생산방법으로서는 세포외에 분비시키는 방법, 세포내에 목적하는 펩타이드의 N 말단부터 발현시키는 소위 직접발현법, 또한 목적하는 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 보호 펩타이드를 부가한 융합 단백질 발현방법 등이 공지되어 있다. 목적하는 펩타이드는 상기한 방법 등에 따라 세포 내외에 발현되어 화학적 또는 효소적인 절단이나 수식을 경유하여 목적하는 펩타이드를 생성시키고 정제공정에 의해 순화되어 목적하는 펩타이드를 수득한다는 방법이 실시되고 있다.
일반적으로 저분자량의 펩타이드를 생산하는 데는 세포내에 존재하는 단백질 분해 효소로 인한 분해를 피하기 위해 상기한 융합 단백질 발현법이 사용되고 있다. 이 경우, 목적하는 펩타이드와 보호 펩타이드 사이에 목적하는 펩타이드를 화학적 또는 효소반응을 이용하여 절단시키도록 디자인한 절단 부위영역을 부가하는 융합 단백질을 세포내에 발현시킨 다음, 화학적 또는 효소적 방법에 의해 융합 단백질로부터 목적하는 펩타이드를 절단하고 목적하는 펩타이드를 침전이나 크로마토그래피 공정을 경유하여 단리 정제를 하는 방법이 실시되고 있다.
또한 칼시토닌과 같은 C 말단이 아미드화된 펩타이드가 목적하는 펩타이드인 경우에는 당해 펩타이드에 관한 아미노산 서열의 C 말단 부위에 글리신이 부가된 펩타이드를 융합 단백질의 일부로서 발현시켜 단백질 분해효소에 의해 융합 단백질로부터 목적하는 글리신 부가 펩타이드를 절단시킨 다음, 수식 효소인 아미드화 효소를 작용시켜 아미드화 펩타이드를 생성하고 정제공정을 경유하여 목적하는 아미드화 펩타이드가 생산되고 있다.
그러나 공업적 스케일로 여러가지 펩타이드를 생산하고자 하는 때에는 여러가지의 절단 및 수식 반응조건 하에 목적하는 펩타이드의 용해성이나 겔화의 문제, 칼럼 크로마토그래피 공정에서 칼럼에 부하하는 시료 농도, 칼럼으로부터의 용출 조건 및 용출후의 안정성 등에 관해 문제가 생기는 경우가 있으며 그 원인은 목적하는 펩타이드의 물리화학적인 여러가지 성질에 기인하는 바가 크다.
예를 들면, 목적하는 펩타이드로서는 사람·글루카곤형 펩타이드-1(G1ucagon­Like Peptide-1, Bell GI 등, Nature, Vo1. 304, p368­371, 1983, 이하, GLP­1이라고 칭한다)나 인슐린 방출 촉진활성을 갖는 GLP­1의 유도체(이하, GLP-1 유도체라고 칭한다)를 들 수 있다. GLP-1은 프레프로글루카곤 유래의 37개 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드이고 프레프로글루카곤이 처리되어 GLP-1의 N 말단의 6개 아미노산이 결실한 GLP­1(7­37)이나 다시 GLP-1(7­36)의 C 말단이 아미드체에 수식된 GLP-1(7­36)NH2가 생합성된다(참조: Mojsow, S. 등 J. Clin. Invest. Vol 79, p616-619, 1987). 이들 펩타이드 호르몬(즉, GLP-1 이나 GLP­1유도체)은 췌장의 베타 세포에 작용하여 인슐린의 분비를 촉진하는 작용 등이 있으므로 최근에 이의 약리작용으로부터 당뇨병 치료약의 가능성을 시사하고 있다 (참조: Gutniak MK, 등, New England Medicine, Vo1, 326, p1316-1322, 1992, Nathan DM, 등 Diabetes Care, Vo1.15, p 270­275, 1992).
상기한 펩타이드의 제법으로서는 상기와 같은 종래 기술에 근거하여 대장균등을 숙주로 하는 융합 단백질 발현법으로 제조하는 경우를 생각할 수 있다. 예를 들면, GLP-1(7­37)의 경우, GLP-1(7­37)의 N 말단 부위 또는 C 말단 부위에 화학적 또는 효소적으로 융합 단백질로부터 GLP-1(7­37)을 절단 인출하기 위한 절단 부위영역을 개재시켜 보호 펩타이드를 부가하는 융합 단백질로서 발현시킨 다음, 화학적 또는 효소적으로 융합 단백질로부터 GLP­1(7-37)을 절단 인출함으로써 제조할 수 있다. 또한 GLP-1(7-36)NH2의 경우에는 상기한 공정에 수식 반응의 공정을 가함으로써 제조할 수 있다. 즉, 아미드화 수식 반응용으로 아미드화 효소의 기질로서 GLP-1(7­37)을 상기한 바와 같이 융합 단백질로서 발현[이 경우, GLP-1(7-37)은 GLP­1(7-36)NH2의 제조 중간체 펩타이드라고 간주할 수 있다]시킨 다음, 화학적 또는 효소적으로 융합 단백질로부터 GLP-1(7-37)을 절단 인출하고 수득된 GLP-1(7­37)을 아미드화 효소를 사용하는 아미드화 수식반응에 의해 목적하는 GLP-1(7­36)NH2를 제조할 수 있다.
그러나 상기한 방법에 따라 목적하는 펩타이드인 인슐린 방출 촉진활성을 갖는 GLP­1 유도체를 제조하는 경우라도 제법 공정상, 바람직하지 않은 문제가 생기므로 아직 공업화 수준으로 염가에 공급할 수 있는 제조법은 확립되어 있지 않으며 이의 제조법의 확립이 요구되고 있다.
예를 들면, 목적하는 펩타이드로서 GLP-1(7-37)을 열거하는 경우의 제조법으로서는 이미 기재한 바와 같이 통상적인 방법에 따라 보호 펩타이드와 GLP­1(7-37)로 이루어진 융합 단백질을 발현시켜 당해 단백질로부터 직접 GLP-1(7-37)을 절단 인출함으로써 제조할 수 있으며 당해 제법의 정제공정은 (1) 융합 단백질로부터 효소에 의해 GLP­1(7-37)을 절단 인출하고 (2) 크로마토그래피 공정이라는 방법을 사용할 수 있다. 그러나 GLP-1(7-37)은 정제중에 겔화 또는 응집을 일으키기 쉬우므로 극단적인 회수율의 저하나 수지 재생이 불가능해진다는 물리화학적 성질에 기인하는 제조공정상의 문제가 생기는 경우가 있다. 일단 겔화하는 경우, pH 10이상에서 가용화하여 정제할 수 있지만 바람직하지 않은 수식체나 입체 구조변화가 생긴다고 하는 문제가 보인다(참조: Senderoff RI, 등, J Pharm Sci, Vol. 87, P183-189, 1998).
또한 아미드화 펩타이드인 GLP-1(7-36) NH2를 목적하는 펩타이드로 하는 경우에는 아미드화 수식반응에 대한 문제가 생기는 경우가 있다. 즉, 아미드화 효소반응의 최적 pH는 약산성 내지 중성 부근이지만 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2의 이론상의 등전점은 각각 pI=5.5 및 pI=7.5이다. 따라서, 아미드화 효소 최적 pH 조건에서 GLP-1(7-37)에 대한 효소반응을 실시하면 기질인 GLP-1(7-37)의 등전점에 반응액의 pH가 근접하므로 GLP-1(7-37)의 등전점 침전를 형성하기 쉽다고 생각한다.
또한 GLP-1(7-37)이 침전함으로써 생성되는 GLP-1(7-36)NH2도 공침하여 효소반응이 충분하게 진행되지 않을 가능성이 있으며 제조공정상의 문제가 생긴다. 또한 GLP-1(7-36)도 처리(핸들링)할 때에 칼럼 공정에서 응집을 일으켜 칼럼 속에서 겔화를 일으키기 쉬운 펩타이드이므로 정제할 때에도 문제가 생기는 경우가 있다. 즉, GLP-1유도체에서도 상기에 기재된 물리화학적 성질에 기인하는 제조상의 문제가 생각된다.
상기와 같은 문제는 어느 쪽도 공업적 스케일로 GLP-1(7-37), GLP-1(7-36) NH2및 GLP-1 유도체를 제조하는 경우에 당해 목적하는 펩타이드 자체의 물리화학적 성질에 기인하는 공업적 제조상의 문제가 생기며 회수율 및 공정관리, 나아가서는 제조 원가상의 면에서 대단히 문제가 된다.
본 발명은 유전자 재조합 기술을 사용하는 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다
도 1은 보조 펩타이드를 이용하는 목적하는 펩타이드의 제조방법의 개략을 도시한 것이다.
도 2는 pG117S4HR6GLP-1의 작제방법을 도시하는 도면이다.
도 3은 pGP117S4HompRHKR의 작제방법을 도시하는 도면이다.
도 4는 pGP117S4HompRHPR의 작제방법을 도시하는 도면이다.
도 5는 pGP97ompPR의 작제방법을 도시하는 도면이다.
도 6은 pGP97ompPR의 작제에 사용하는 올리고뉴클레오티드 및 프라이머를 도시하는 도면이다.
도 7은 pGP97ompPR에 암호화된 융합 단백질(GP97ompPR)의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다. 밑줄 부위는 GLP-1(7-37)의 유래의 아미노산 서열을 도시한 것이며 2중 밑줄 부위는 보조 펩타이드의 서열을 도시한 것이다. ↓는 대장균 0mpT 프로테아제에 의한 절단 부위를 도시한 것이며 2중 밑줄 다음의 화살표는 Kex2 프로테아제에 의한 절단 부위를 도시한 것이다.
도 8은 pG97ompPR에 암호화된 융합 단백질(GP97ompPR)의 DNA 염기 서열을 도시하는 도면이고 염기번호1의 A에서 462의 T까지가 GLP-1(7-37)에 관한 융합 단백질을 암호화하는 영역이다. lac P0는 대장균 락토스 오페론의 프로모터/오퍼레이터 영역을 도시한 것이다.
도 9는 생산균의 배양과 융합 단백질(GP97ompPR)의 발현을 도시하는 전기영동도의 도면 대용사진이고 도면 내에 샘플링할 때에 a 내지 e의 시료의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동의 결과를 도시한 것이다. 도면 내의 화살표는 융합 단백질의 밴드를 도시한 것이다.
도 10은 봉입체에 내재하는 대장균 0mpT 프로테아제를 사용하는 융합 단백질(GP97ompPR)의 절단을 분석한 결과를 도시하는 도면이다.
도 11은 pG117S4HR6GLP-1에 암호화된 융합 단백질의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다. 도면 내에 밑줄 부위는 GLP-1(7-37) 유래의 아미노산 서열을 도시한 것이고 2중 밑줄 부위는 보조 펩타이드 유래의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 12는 pGP117S4HompRHKR에 암호화된 융합 단백질의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다. 도면 내에서 밑줄 부위는 GLP-1(7-37) 유래의 아미노산 서열을 도시한 것이며 2중 밑줄 부위는 보조 펩타이드 유래의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 13은 pGP117S4HompRHPR에 암호화된 융합 단백질의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다. 도면 내에서 밑줄 부위는 GLP-1(7-37)의 유래의 아미노산 서열을 도시한 것이며 2중 밑줄 부위 보조 펩타이드 유래의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 14는 SP 세파로스 빅 비드로부터 RHHGP(G)의 용출 패턴을 도시하는 도면이고 용출 개시위치를 ↓로 도시한 것이며 풀로 하는 분획을 도면에 도시한 것이다. 흡광도는 280nm에서 측정한다.
도 15는 RHHGP[G]로부터 Kex2 프로테아제에 의한 GLP-1(7-37)의 절단 인출 공정에서 각 정제공정의 분석 패턴을 도시하는 도면이고 A는 Kex2 프로테아제에 의한 절단전, B는 Kex2 프로테아제 절단후, C는 PorosR2 후의 역상 풀을 도시한 것이며 1은 RHHGP〔G], 2는 GLP-1(7-37)을 도시한 것이다. ·
도 16은 RHHGP〔G]의 아미드화 반응의 pH 의존성을 도시하는 도면이다.
도 17은 아미드화 반응에 있어서 RHHGP〔G〕가 RHHGLP-1로 변환되는 경시적 변화를 이온교환 HPLC에 의해 측정하는 도면이며 1은 RHHGP〔G], 2는 RHHGP-1을 도시한 것이다. 흡광도는 280nm에서 측정한다.
분석조건은 하기와 같다.
칼럼; Poros S/H 4.6mm I.D.x 50mm,
유속; 1.6m1/min
용액 A; 30mM BR 완충액 pH 6.0
용액 B; 30mM BR 완충액 pH 9.0
평형화; 용액 A
용출; 용액 B 0%→100% 직선 pH구배
도 18은 RHHGP-1을 기질로 하는 Kex2 프로테아제 처리반응의 pH 의존성을 도시하는 도면이다.
도 19는 마크로 프렙 High­S 에 의한 GLP­1(7-36)NH2정제에서 용출 패턴 및 형성된 pH 구배를 도시하는 도면이다. 흡광도는 280nm에서 측정한다.
도 20은 마크로 프렙 High­S에 의한 불순물의 제거 상황을 도시하는 도면이고 A는 칼럼에 적재한 시료, B는 용출 다음의 분석 HPLC 패턴을 도시한 것이며 또한 1은 GLP-1(7-37), 2는 GLP-1(7-36)NH2를 도시한 것이다. 흡광도는 280nm에서 측정한다.
도 21은 0mpT에 의한 제1 절단, Kex2 프로테아제에 의한 제2 절단을 경유하여 GLP-1(7-36) NH2를 제조할 때의 각 정제공정 표준품의 분석 HPLC 패턴을 정리하여 도시한 도면이다. A는 0mpT 반응후, B는 SP 세파로스 후, C는 Kex2 반응후, D는 마크로 프렙 High­S후, E는 PorosR2 후의 역상 HPLC 패턴을 도시한 것이며 또한 1은 GP97ompPR, 2는 보호 펩타이드, 3은 RHHGP〔G], 4는 RHHGP-1, 5는 GLP-1(7-36)NH2를 도시한 것이다. 흡광도는 280nm에서 측정한다.
분석조건은 하기와 같다.
칼럼; YMC Protein RP 4.6mm I. D.x150mm
유속; 1.0ml/min
용액 A; 0.1% TFA/10% 아세트니트릴
용액 B; 0.1% TFA/60% 아세트니트릴
평형화; 용액 A
용출; 용액 B 44%→74%/12분
도 22는 RHHGP[G], RHHGP-1, GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2용해도의 pH 의존성을 도시하는 도면이다.
도23은 Tween 80에 의한 RHHGP[G〕, RHHGP-1 및 GLP-1(7-36)NH2의 응집 억제효과를 도시하는 도면이고 A는 Tween 80에 의한 RHHGP[G〕및 RHHGP-1의 응집 억제를 도시한 것이며 B는 Tween 80에 의한 GLP-1(7-36)NH2응집 억제를 도시한 것이다.
도24는 NaC1 및 온도에 의한 GLP-1(7-36) NH2의 응집억제효과를 도시하는 도면이고 C는 NaC1에 의한 GLP-1[G] 응집억제를 도시한 것이며 D는 온도에 의한 GLP-1(7-36) NH2응집억제를 도시한 것이다.
발명의 실시 형태
본 발명에 따른 보조 펩타이드란 목적하는 펩타이드 자체의 물리화학적 성질에 유래하는 공업적 제조상의 문제를 회피하기 위해 사용하는 펩타이드이다. 목적하는 펩타이드 자체의 물리화학적 성질에 유래하는 제조상의 문제 중에서 당해 펩타이드의 제조공정상의 화학반응적 또는 효소반응적 처리 및 정제상의 문제, 예를 들면, 여러가지 절단 및 수식반응 조건하에 목적하는 펩타이드의 용해성이나 겔화의 문제, 또한 칼럼 크로마토그래피 공정에서 칼럼에 부하되는 시료 농도, 칼럼으로부터의 용출 조건 및 용출후의 안정성 등에 관한 문제가 특히 주목된다.
당해 보조 펩타이드는 목적하는 펩타이드가 갖는 물리화학적 성질에 따라 적절하게 작제할 수 있으며 예를 들면, 목적하는 펩타이드의 등전점이 중성 내지 약산성이며 또한 제조공정상의 최적 pH도 중성 내지 약산성이고 이러한 pH를 기초하여 목적하는 펩타이드의 용해도가 지나치게 낮은 경우에는 보조 펩타이드가 부가하는 목적하는 펩타이드의 등전점(pI)를 8 내지 12로 되도록 보조 펩타이드를 설계하는 것이 바람직하고 9 내지 11로 설계하는 것이 바람직하다. (당해 보조 펩타이드는 목적하는 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단의 어디에도 부가시킬 수 있다). 또한 당해 보조 펩타이드의 크기(길이)는 5 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는 것이 바람직하고 보다 바람직하게는 5 내지 30개의 아미노산 잔기 이하를 갖는 것이지만 염기성 아미노산 또는 산성 아미노산을 하나 이상 함유한다.
본 발명에 따라 생산할 수 있는 목적하는 펩타이드는 특별히 한정하지 않으며 상기한 GLP-1 유도체 이외에도 200개 아미노산 잔기 이하의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 제법에 적절하다. 이러한 펩타이드의 예로서는 부신 피질 자극 호르몬(Adrenocorticotropic hormone), 아드레노메듈린(Adrenomedu1lin), 아밀린(Amylin), 안지오텐신(Angiotensin) I, 안지오텐신(Angiotensin) II, 안지오텐신(Angiotensin)Ⅲ, A형 나트륨 이뇨 펩타이드(A­type Natriuretic Peptide), B 형 나트륨 이뇨 펩타이드(B­type Natriuretic Peptide), 브라디키닌(Bradykinin),빅 가스트린(Big Gastrin), 칼시토닌(Ca1citonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Ca1citonin gene re1ated peptide), 콜레시스토키닌(Cho1ecystokinin), 코르티코트로핀 방출인자(Corticotropin Re1easing Factor), 코르티스타틴(Cortistatin), C형 나트륨 이뇨 펩타이드(C­type Natriuretic Peptide), 데페신(Defesin) 1, 델타·슬립-유도 펩타이드(De1ta Sleep- Inducing Peptide), 다이노르핀(Dynorphin), 엘라핀(E1afin), α-엔도르핀(α­ Endorphin), β-엔도르핀(β­Endorphin), γ-엔도르핀(γ­Endorphin), 엔도셀린-1(Endothelin-1), 엔도셀린-2(Endothelin­2), 엔도셀린-3(Endothelin-3), 빅 엔도셀린-1(Big Endothelin-1), 빅 엔도셀린-2(Big Endothelin­ 2), 빅 엔도셀린-3(Big Endothelin-3), 엔케팔린(Enkephalin), 갈라닌(Galanin), 빅 가스트린(Big Gastrin), 가스트린(Gastrin), GIP(Gastric Inhibitory Polypeptide), 가스트린 방출 펩타이드(Gastrin Re1easing Peptide), 글루카곤(G1ucagon), 글루카곤형 펩타이드-2(Glucagon-like peptide­2), 성장 호르몬 방출인자(Growth Hormone Re1easing Factor), 성장 호르몬(Growth Hormone), 구아닐린(Guanylin), 우로구아닐린(Uroguanylin), 히스타틴5(Histatin 5), 인슐린(Insulin), 결합 펩타이드(Joining Peptide), 황체 호르몬 방출 호르몬(Luteinizing Hormone Re1easing Hormone), 흑색 세포 자극 호르몬(Me1anocyte Stimu1ating Hormone), 미드카인(Midkine), 모틸린(Motilin), 뉴로키닌 A(Neurokinin A) , 뉴로키닌 B(Neurokinin B), 뉴로메딘 B(Neuromedin B), 뉴로메딘 C(Neuromedin C), 뉴로펩타이드 Y(Neuropeptide Y), 뉴로텐신(Neurotensin), 옥시토신(0xytocin), 프로아드레노메듈린N-말단 20 펩타이드(Proadrenomedullin N-terminal 20 Peptide),크로모그라닌 A(Cromogranin A), 부갑상선 호르몬(Parathyroid Hormone), PTH 관련 펩타이드(PTH related peptide), 펩타이드 히스티딘-메티오닌27(Peptide Histidine-Methionin­27), 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩타이드 38(Pituitary Adeny1ate Cyc1ase Activating Po1ypeptide 38), 혈소판 인자-4(Platelet Factor­ 4), 펩타이드 T(Peptide T), 세크레틴(Secretin), 혈청 흉선인자(Serum Thymic Factor), 소마토스타틴(Somatostatin), 서브스턴스 P(Substance P), 티로트로핀 방출 호르몬(Thyrotropin Re1easing Hormone), 우로코르틴(Urocortin), 관 활성 장펩타이드(Vasoactive Intestinal Peptide), 바소프레신(Vasopressin) 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다.
또한 GLP-1 유도체로서는 상기한 GLP-1(7-37)이나 GLP-1(7-36)NH2이외에 GLP-1의 37개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드로부터 아미노산 잔기가 치환, 부가, 결실된 인슐린 방출 촉진활성을 갖는 펩타이드, 당해 펩타이드에 관한 아미노산이 다시 수식된 인슐린 방출 촉진활성을 갖는 펩타이드(예: 아미드체) 및 이들의 조합에 의해 수득되는 인슐린 방출 촉진활성을 갖는 펩타이드를 들 수 있다.
또한 본원 발명에 따른 제법에 의해 적절하게 제조할 수 있는 GLP-1 유도체로서는 4.5 내지 9.0의 등전점을 갖는 GLP-1 유도체가 바람직하며 바람직하게는 5.5 내지 7.5의 등전점를 갖는 GLP-1 유도체이다.
GLP­1 유도체의 구체적인 예로서는 본 발명의 실시예에 기재된 이외에 하기의 것을 예시로서 들 수 있다.
·GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-34)NH2, GLP-1(7-35)NH2및 GLP-1(7-37)NH2,
·GLP-1(7-37)-Arg, GLP-1(7-37)-Arg­Arg, GLP-1(7-37)-Lys, GLP-1(7-37)- Lys­Lys, GLP­1(7-37)-Lys­Arg 및 GLP-1(7-37)-Arg-Lys 및 이들의 C 말단 아미드체,
·GLP-1의 8위치의 아미노산인 A1a를 Thr, G1y 또는 Ser에 치환하는 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 26위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하는 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 34위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하는 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 36위치의 아미노산인 Arg를 Lys에 치환하는 GLP-1(7­37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 8위치의 아미노산인 A1a를 Thr, G1y 또는 Ser에 치환하고 다시 26위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하는 GLP­1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 8위치의 아미노산인 A1a를 Thr, G1y 또는 Ser에 치환하고 다시 34위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하는 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 8위치의 아미노산인 Ala를 Thr, Gly 또는 Ser에 치환하고 다시 36위치의 아미노산인 Arg를 Lys에 치환한 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 26위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 34위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환한 GLP­1(7-37) 및 GLP­l(7-36)NH2,
·GLP-1의 26위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 36위치의 아미노산인 Arg를 Lys에 치환한 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2, .
·GLP-1의 34위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 36위치의 아미노산인 Arg를 Lys에 치환한 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP­1의 8위치의 아미노산인 Ala를 Thr, Gly 또는 Ser에 치환하고 다시 26위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 34위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환한 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 8위치의 아미노산인 Ala를 Thr, Gly 또는 Ser에 치환하고 다시 26위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 36위치의 아미노산인 Arg를 Lys에 치환한 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 8위치의 아미노산인 Ala를 Thr, Gly 또는 Ser에 치환하고 다시 34위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 36위치의 아미노산인 Arg를 Lys에 치환한 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 26위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 34위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 36위치의 아미노산인 Arg를 Lys에 치환한 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2,
·GLP-1의 8위치의 아미노산인 Ala를 Thr, Gly 또는 Ser에 치환하고 다시 26위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 34 위치의 아미노산인 Lys를 Arg에 치환하고 다시 36위치의 아미노산인 Arg를 Lys에 치환한 GLP-1(71-37) 및 GLP-1(7-36)NH2.
목적하는 펩타이드의 예로서 GLP-1(7-37)을 들면 정제공정상의 문제, 예를 들면, GLP-1(7-37)에 기인한 겔화, 용해성 등을 해결하기 위해 GLP­1(7-37)에 염기성 아미노산을 갖는 보조 펩타이드를 부가하여 GLP-1(7-37)의 생산에 사용할 수 있다. 즉, 당해 보조 펩타이드를 GLP-1(7-37)에 부가함으로써 GLP-1(7-37)의 등전점(pI=5.5)을 알칼리로 전환시켜 친수성을 증가시킴으로써 정제공정상의 문제 인 칼럼 속의 응집성(겔화) 등을 회피할 수 있다. 또한 당해 보조 펩타이드를 GLP-1(7-37)에 부가함으로써 최초의 크로마토그래피 공정에서 대단히 순도가 높은 동시에 고수입량으로 보조 펩타이드와 GLP(7-37)로 이루어진 폴리펩타이드를 분리할 수 있게 되며 GLP-1(7-37)의 회수율이 증가하므로 당해 공정에서 보조 펩타이드를 사용하는 것은 대단히 유용하다.
또한 목적하는 펩타이드의 예로서 GLP-1(7-36)NH2를 들면 당해 물질은 아미드화 펩타이드이므로 이의 제조 중간체를 우선 목적하는 펩타이드로서 수득하는 것이 필요하며 구체적으로 당해 펩타이드는 GLP-1(7­37)이다. 즉, GLP­1(7-37)에 염기성 아미노산을 갖는 보조 펩타이드를 부가하여 GLP-1(7-36)NH2의 생산에 사용할 수 있다. 염기성 아미노산을 함유하는 보조 펩타이드를 부가함으로써 GLP-1(7- 37)의 등전점을 알칼리로 전환시킬 수 있으며 다음에 아미드화 수식반응을 할 때에 아미드화 효소 반응액의 pH에서 보조 펩타이드가 GLP-1(7-37)에 부가된 펩타이드의 용해성이 증가하므로 침전 형성이 억제되고 수율 및 수량을 증가시킬 수 있다. 또한 염기성 아미노산을 함유하는 친수성 보조 펩타이드를 부가 하는 것으로 목적하는 펩타이드의 용해도를 상승시키며 또한 아미드화 수식반응에서 기질로서 GLP-1(7-37)과 생성물로서 GLP-1(7-36)NH2가 가지는 응집성을 회피할 수 있으며 아미드화 효소반응 다음의 정제공정에서 대단히 유용하다.
상기한 어떤 경우에도 보조 펩타이드가 GLP-1(7-37)에 부가된 펩타이드는 등전점 8 내지 12를 갖는 것이 바람직하며 당해 펩타이드를 양이온 교환수지에 작용시킴으로써 고수율(98% 이상)로 당해 펩타이드를 수득할 수 있다.
보조 펩타이드가 부가된 펩타이드로부터 목적하는 펩타이드를 수득하기 위해 보조 펩타이드와 목적하는 펩타이드 사이에 화학적 또는 효소적으로 절단할 수 있는 절단 부위영역을 도입한다. 당해 절단 부위영역에 관해서도 목적하는 펩타이드가 갖고 있는 물리화학적 성질에 따라 절단 효율이 높은 절단 부위영역을 설정한다. 효소적 및 화학적인 절단 방법으로서는 문헌[참조: Methods in ENZYMOL0GY, 185권, Gene Expression Techno1ogy(David V.Goedde1 편집, 출판사 ACADEMIC PRESS, INC]에 기재되어 있는 방법도 사용할 수 있다.
화학적 절단 방법으로서는 메티오닌의 C 말단측을 브롬시안으로 절단하는 방법(참조: D.V. Goedde1 et a1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 76, p 106­110, 1979), ­Asp­Pro­ 서열의 사이를 포름산으로 절단하는 방법(참조: Biochem. Biophys. Res. Commun., Vo1. 40, p1173, 1970), ­Asn-Gly­ 서열 사이를 하이드록실아민으로 절단하는 방법 및 트립신의 C 말단측을 BNPS­스카톨 또는 N­클로로석신이미드로 절단하는 방법 등을 들 수 있다. 예를 들면, 목적하는 펩타이드에 관한 아미노산 서열중에 메티오닌이 함유되지 않는 경우에는 목적하는 펩타이드에 인접하는 절단 부위영역의 말단에 메티오닌을 도입하여 브롬시안 처리에 의해 화학적으로 절단 부위영역에서 절단을 할 수 있다.
또한 효소적 절단방법으로서는 절단 처리에 사용하는 효소가 기질로서 특이적으로 인식할 수 있는 절단 부위영역을 설정하면 양호하며 이들의 예로서는 X-Gly 또는 Pro­X­G1y­Pro 서열의 ­X­G1y­ 서열 사이를 콜라게나제(Collagenase)(Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, Vo1. 81, p 4692­4696, 1984), ­Asp­Asp­Asp-Lys­ 서열(서열 1)의 Lys의 C 말단측을 엔테로키나제(Enterokinase), -Ile­G1u­Gly­Arg­ 서열(서열 2)의 Arg의 C 말단측을 혈액 응고인자 Xa(b1ood coagulation Factor Xa)[일본국 공개특허공보 제(소)61-135591호], G1y­Pro­Arg­ 서열의 Arg의 C 말단측을 트롬빈(Thrombin)[일본국 공개특허공보 제(소)62-135500호], ­Arg­의 C 말단측을 트립신(Trypsin) 또는 클로스트리파인(Clostripain), Arg 또는 Lys의 C 말단측을 엔도프로테아제(endoprotease) Arg-C(참조: Nature, Vo1. 285,p456­461, 1980), Lys­Arg, Arg­Arg 또는 Pro-Arg 서열의 C 말단측을 사카로미세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) Kex2 프로테아제 및 이의 유도체[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun., Vo1. 144, p 807­814, 1987, 일본국 공개특허공보 제(평)1-199578], Lys의 C 말단측을 라이실 엔도펩티다제(1ys1 endopeptidase) 또는 엔도펩티다제(endopeptidase) Lys­C[일본국 공개특허공보 제(소)61-275222호], AsP 또는 Glu의 C 말단측을 스타필로코카스·아우레우스(S.aureus)V8프로테아제(Proc.Nat1. Acad. Sci. USA, Vol. 69, p3506­3509, 1972), ­Phe­Arg­ 서열의 C 말단측을 칼리크레인(Kallikrein)[일본국 공개특허공보 제(소)62­248489호], ­Pro­Phe­ His­Leu­Leu­Val-Tyr­ 서열(서열 3)의 Leu­Leu 사이를 레닌(renin)[일본국 공개특허공보 제(소)60-262595호],­Glu­Gly­Arg­ 서열의 C 말단측을 우로키나제(Urokinase)[일본국 공개특허공보 제(평)2-100685호], Val-Asp­Asp­Asp­ Asp­Lys 서열(서열 4)의 C 말단측을 엔테로펩티다제(entero­ peptidase)(Biotechno1ogy, Vo1. 6, P1204-1210, 1988), po1y­G1y의 C 말단측을 리소스타핀(lysostaphin)[일본국 공개특허공보 제(평)1-160496호], Lys­Arg, Arg­Arg 또는 Pro­ Arg 등의 C 말단측을 클루베로미세스·락티스(K1uverromyces 1 actis)[일본국 공개특허공보 제(평)1-124390호]로 절단하는 방법 등을 들 수 있다.
예를 들면, 본원 발명에 따른 실시예에서는 Kex2 프로테아제가 인식할 수 있는 아미노산 서열(Lys­Arg, Arg­Arg 또는 Pro­Arg 서열)을 절단 부위영역에 도입하여 당해 효소를 사용하여 보조 펩타이드로부터 목적하는 펩타이드를 절단한다.
따라서, 절단 처리에 사용하는 효소의 기질 특이성 및 목적하는 펩타이드의 아미노산 서열과 더불어, 절단 부위영역의 아미노산 서열중에 1개 이상의 메티오닌, 트립토판, 프롤린, 글리신, 시스테인, 알기닌, 리신, 아스파라긴산 또는 글루탐산을 존재시키는 것이 바람직하다.
또한, 최종 목적하는 펩타이드로 하기 위해 수식이 필요한 경우(예: 아미드화 펩타이드)는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드(이러한 경우, 최종 목적하는 펩타이드의 제조 중간체 펩타이드)로부터 당해 목적하는 펩타이드를 절단 인출 전 또는 절단 인출한 후에 수식반응(예: 아미드화 효소에 의한 아미드화 수식반응)을 할 수 있다. 또한 효율적으로 수식반응을 실시하고 싶은 경우, 목적하는 펩타이드를 절단 인출하기 전에 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 수식반응(예: 아미드화 수식반응)을 실시하고 보조 펩타이드가 부가된 최종 목적하는 펩타이드를 수득한 다음, 보조 펩타이드와 최종 목적하는 펩타이드 사이에 있는 절단 부위영역을 절단함으로써 최종 목적하는 펩타이드를 수득할 수 있다.
보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드를 고발현시키면 고순도의 목적하는 펩타이드를 고수율로 수득할 수 있지만 또한 대량의 목적하는 펩타이드를 수득하기 위해서는 종래의 융합 단백질 방법에 있어서 실시되고 있는 보호 펩타이드를 다시 부가하여 발현시켜 제조할 수 있다. 즉, 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 다시 보호 펩타이드를 부가한 융합 단백질로서 숙주 세포내에 고발현시켜 제조할 수 있다(보호 펩타이드의 부가는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단의 어느 쪽에도 부가할 수 있다).
본 발명에 따른 제조법에 사용할 수 있는 보호 펩타이드는 특별히 한정하지 않으며 종래 방법에서 사용하는 것을 적절하게 수식하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 일본국 공개특허공보 제(소)54-145289호에서는 보호 펩타이드로서 대장균 유래의 β-갈락토시다제에 따른 아미노산 서열을 갖는 단편을 사용할 수 있다. 당해 효소에 따른 아미노산 서열은 당업자에 공지되어 있고 β-갈락토시다제 유래의 펩타이드 단편은 널리 당업자에 의해 융합 단백질 방법에서의 보호 펩타이드로서 사용되고 있다. 본원 발명에 따른 제조법에 있어서도 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드의 특성을 고려하여 β-갈락토시다제에 따른 아미노산 서열을 적절하게 수식하는 펩타이드 단편을 보호 펩타이드로서 사용할 수 있다. 또한 보호 펩타이드에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 염기 서열을 화학적으로 합성할 수 있다.
보호 펩타이드를 갖는 융합 단백질에 관해서는 절단 처리반응 다음에 크로마토그래피 공정에서 단편 분리능을 높이기 위해서 당해 융합 단백질을 구성하는 보호 펩타이드 또는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드 및 당해 융합 단백질 자체에 관한 각 등전점이 상이하도록 연구하여 설정하는 것이 바람직하다. 보조 펩타이드와 목적하는 펩타이드에 관해서도 동일하다.
상기한 바와 같이 보호 펩타이드를 부가시키는 경우, 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드와 보호 펩타이드 사이에도 절단 부위영역을 설정하는 것이 필요하지만 상기한 설정 방침에 따라서 적시적절한 절단 효율이 높은 절단 부위영역을 설정할 수 있다. 단, 보호 펩타이드를 갖는 융합 단백질로부터 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드를 경유하여 목적하는 펩타이드를 수득하는 경우, 복수의 절단 부위영역이 설치되기 위해 각 부위에서 다단계의 융합 단백질의 절단방법이 필요하게 된다. 이 경우, 최초에 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드와 보호 펩타이드 사이의 절단 부위영역에서 절단 처리를 한 다음, 보조 펩타이드와 목적하는 펩타이드 사이의 절단 부위영역에서 절단 처리를 함으로써 목적하는 펩타이드를 수득할 수 있다.
상기한 제조방법이 광범위하게 사용될 수 있음을 확인하기 위해 각 절단 부위영역을 화학적 또는 효소적으로 절단하는 방법에 관해서 검토를 하고 어떤 절단 처리방법을 사용해도 실시할 수 있음을 확인했다. 이러한 절단 부위영역에 따른 펩타이드쇄의 부위 특이적 절단방법의 대표적인 예로서는 하기를 열거할 수 있다.
(1) 보호 펩타이드 및 목적하는 펩타이드가 시스테인 잔기를 이의 아미노산 서열중에 함유하지 않는 것을 이용하여 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드와 보호 펩타이드 사이에 시스테인을 삽입하고 시아노화, 알칼리 처리로써 당해 부위에서 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 방법,
(2) 각 절단 부위영역에서의 절단은 함께 동일한 효소로 실시하지만 효소 인식부위에 상이한 아미노산 서열을 사용하는 것으로 한쪽의 절단 부위영역에서의 반응조건하에서는 다른쪽의 절단 부위영역에서의 절단이 일어나지 않도록 하는 방법 및
(3) 각 절단 부위영역에서 함께 동일한 효소로 절단을 하지만 보조펩타이드와 목적하는 펩타이드 사이에 존재하는 절단 부위영역(절단 부위영역 2)의 아미노산을 수식함으로써 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드와 보호 펩타이드 사이에 존재하는 절단 부위영역(절단 부위영역 l)에 따른 절단의 반응조건 하에서는 절단 부위영역 2에서 절단이 일어나지 않도록 하고 절단 부위영역 1에서 절단한 다음, 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드를 정제하여 수식된 아미노산을 다시 수식하여 절단 부위영역 2를 상기한 효소로 절단할 수 있게 하는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 숙주세포는 특별히 한정하지 않으며 종래 방법에서 이미 사용하고 있는 원핵세포 또는 진핵세포, 예를 들면, 대장균 등의 미생물 세포, 효모 또는 동물세포 등을 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드를 암호화하는 염기 서열이 당해 서열을 갖는 발현 벡터에 의해 적절하게 발현할 수 있는 것을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 또한 고발현에 필요한 기타 요소, 예를 들면, 프로모터, 터미네이터, 스플라이스 부위 등에 관해서도 종래 방법에서 이미 공지되어 있는 것을 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 목적하는 펩타이드의 제법에서 목적하는 펩타이드를 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2로 하는 경우를 하기에 설명한다.
GLP-1(7-37) 발현 플라스미드(이하, pGP97ompPR)가 암호화하는 융합 단백질(이하, GP97ompPR)은 GLP-1(7-37)의 N 말단측에 염기성 펩타이드 영역을 함유하는 보조 펩타이드를 부가하는 펩타이드(이하, RHHGP[G]를 가지며 또한 RHHGP[G]의 N 말단측에 대장균 β-갈락토시다제 유도체(β­ga197S)를 보호 펩타이드로서 부가하는 융합 단백질이다. 당해 보호 펩타이드와 RHHGP[G]의 사이 및 RHHGP[G]에 따른 보조 펩타이드와 GLP-1(7-37) 사이에는 각각 절단 부위영역이 도입되어 있다. 당해 각 영역은 한쪽의 절단 부위영역에서는 대장균 유래의 내재성 0mpT 프로테아제에 의해 절단되도록 하고 다른쪽의 절단 부위영역에서는 Kex2 프로테아제[참조: 일본국 특허 제2643968호, 공개특허공보 제(평)10­229884호 등]에 의해 절단되도록 하는, 기질 특이성에 따른 아미노산 서열을 갖고 있다.
또한 GP97ompPR 에 관해서는 절단 처리반응 후의 크로마토그래피 공정에서 단편 분리능을 높이기 위해서 GP97ompPR을 구성하는 β-gal97S 또는 RHHGP[G] 및 GP97ompPR 자체에 따른 각 등전점이 상이하도록 연구되고 설정되어 있다. 예를 들면, 하기의 실시예에서는 GP97ompPR의 등전점이 5.95, β­ga197S의 등전점이 4.60 및 RHHGP〔G〕의 등전점이 10.09로 되도록 설정되어 있다.
다음에 pGP97ompPR에 의해 형질전환되는 대장균(W3110/pGP97ompPR)을 배양하여 GP97ompPR을 발현시킨다. GP97ompPR은 균체내에 불용성 단백질로서 고발현되어 봉입체 내에 축적된다. 최종 균체 농도는 약 0D 660nm=180이다.
균체 파쇄후, 요소를 사용하여 GP97ompPR를 가용화한 다음, 봉입체 내에 함유되는 내재성 0mpT 프로테아제에 의해 GP97ompPR 중에 존재하는 보호 펩타이드 β­ga197S와 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드 RHHGP[G] 사이의 절단 부위영역을 절단한다. 0mpT 프로테아제는 특이적으로 당해 절단 부위영역을 절단하고 절단효율은 85%이다.
다음에 β-gal97S와 RHHGP[G]의 분리 및 요소를 제거하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피를 실시한다. 미절단의 GP97ompPR(pI=5.95)와 β- ga197(pI=4.60)은 등전점이 산성쪽이기 때문에 이러한 칼럼에 흡착하지 않으며 RHHGP[G](pI=10.09)가 흡착된 다음, 용출한다. 이러한 1공정의 약간의 칼럼 처리에 의해 순도가 99%의 RHHGP〔G〕가 수득된다. 생산 공정의 최초의 칼럼공정에서 이러한 순도가 높으며 또한 고수율에서 RHHGP[G]가 수득되는 것은 공업적인 대량생산에서 대단히 유용하다.
Kex2 프로테아제를 사용하여 RHHGP[G](1.0g) 중에 존재하는 보조 펩타이드와 목적하는 펩타이드 사이의 절단 부위영역을 절단한다. 하기의 실시예에 따른 반응조건으로서는 절단효율 95%로 반응이 진행한다. 또한, 회수율은 90%이다.
다음에 GLP­1(7-37)을 더욱 정제하기 위해 역상 크로마토그래피를 실시한다. 본 공정의 회수율은 80%이며 전체 공정의 최종 수율은 약 64%이고 순도 98%의 GLP-1(7-37)이 0.72g 수득된다. 정제에 사용되는 배양액은 0.36ℓ 상당이며 배양액 1ℓ당 약 2.0g이 수득된다. 이러한 수율 및 수량은 함께 대단히 높으며 보조 펩타이드를 사용하는 본 발명에 따른 제법의 유용성을 실증할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 제조법은 목적하는 펩타이드를 충분히 공업적 스케일로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 제조법을 사용하는 GLP-1(7-37)의 제조에 관하여 각 공정에서 수율에 관해 하기의 표2-B에 도시한다.
표2-B에서 명백한 바와 같이 각 공정의 회수율은 대단히 높으며 최종 회수율은 64%로서 대단히 높은 것으로 나타난다.
또한 목적하는 펩타이드를 GLP-1(7-36)NH2로 하는 경우, 당해 펩타이드는 아미드화 펩타이드이므로 아미드화 수식반응이 필요해진다. 당해 펩타이드는 예를 들면, 다음과 같이 하여 수득할 수 있다.
상기와 같이 이미 수득된 RHHGP[G]에 아미드화 효소(B.B.R.C, Vol 150, p 1275­1281, 1988, EP299790A 등)를 사용하여 아미드화 수식반응을 실시한다. 하기의 실시예에 기재된 반응조건에서는 효소 기질로서 RHHGP[G] 및 반응 생성물인 아미드화된 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-36)NH2(이하, RHHGP-1으로 칭한다)의 응집이나 겔화는 일어나지 않으며 98%의 높은 반응율(회수율 95%)로 RHHGP-1을 생성할 수 있다. 이들 결과로부터 RHHGP[G]를 기질로서 아미드화 효소반응을 실시할 때에 보조 펩타이드의 유용성이 실증된다.
아미드화 수식반응후, Kex2 프로테아제를 사용하여 RHHGP-1 중에 존재하는 보조 펩타이드와 목적하는 펩타이드 사이의 절단 부위영역을 절단한다. 하기의 실시예에 따른 반응조건에서는 절단 효율 95% 이상(회수율 90%)으로 반응이 진행한다.
다음에 GLP-1(7-36) NHz를 또한 정제하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피를 실시한 다음, 소수성 크로마토그래피를 실시한다. 전체 공정의 최종 수율은 약 50%이고 순도 98%의 GLP-1(7-36)NH2가 13.5g 수득된다. 정제에 사용되는 배양액은 8ℓ 상당이고 배양액 1ℓ당 약 1.68g이 수득된다. 이러한 수율 및 수량은 모두 대단히 높으며 보조 펩타이드를 사용하는 본 발명에 따른 제법의 유용성이 실증될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 제조법은 목적하는 펩타이드를 충분히 공업적 스케일로 제조할 수 있다.
GLP-1(7-36)NH2의 제조에 따른 본 발명의 의도중 하나로서 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-37)로 이루어진 펩타이드를 경유함으로써 상기와 같이 아미드화 효소와 같은 수식 효소 등의 반응시에 응집성의 개선이나 용해도를 상승시킨다는 것을 들 수 있다. 그래서, 당해 유용성이 있는지 여부에 관해서 다시 검토해 보기 위해 RHHGP[G], RHHGP­1, GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2를 정제하고 각각의 펩타이드 용해도의 pH 의존성을 조사한다. 그 결과 GLP-1(7-37)은 예상한 바와 같이 pH 5.0 내지 pH 7.0의 범위로 용해도가 낮은 것이 명백해진다. 한편, RHHGP[G]는 pH 4.0 내지 pH 6.0부근까지 용해도가 높은 결과가 수득된다. 이 결과에 의해 아미드화 효소반응은 약산성 영역에서 실시되므로 효소 기질로서는 보조 펩타이드를 갖는 RHHGP[G]를 GLP-1(7-37) 대신에 사용하는 유용성이 확인된다.
각 펩타이드의 용해도의 pH 의존성을 검토한 실험에서 RHHGP[G] 및 RHHGP-1은 각각 pH 6.0, pH 6.4 부근에서 급격히 용해도가 저하된다. 또한 GLP-1(7-36)NH2는 경시적으로 침전 또는 미세 결정을 형성한다. 따라서, RHHGP[G] 및 RHHGP-1의 중성 내지 약알칼리 영역에서 용해도를 올리는 물질 및 약산성 내지 약알칼리 영역에서 목적하는 펩타이드의 용해성을 유지할 수 있는 물질이 있으면, 생산 공정상 대단히 유용하다고 생각된다.
그래서, 이러한 물질을 예의 검토한 결과 반응액에 RHHGP[G] 및 RHHGP-1의 경우에는 계면활성제의 첨가(예: Tween 80, 0.1% 첨가), GLP-1(7-36)NH2의 경우에는 계면활성제의 첨가(예: Tween 80, 0.3% 이상 첨가) 및/또는 염의 첨가(예: NaCl 100mM 이상 첨가)에 의해 효과적으로 응집을 방지할 수 있는 것을 밝혀냈고 본 발명에 따른 제법 공정에 도입하여 이의 유용성도 아울러 실증할 수 있다.
본 발명에 따른 제조법을 사용하는 GLP-1(7-36)NH2의 제조공정에 관해서 GLP-1(7-36)NH2의 10g 스케일의 정제를 실시한 각 공정 수율의 정리를 표1에 기재한다(생산균 W3110/pGP97ompPR을 20ℓ 배양하고 당해 배양액 8ℓ 상당분을 정제에 사용한다).
GLP-(7-36)NH2생산공정의 요약
공정 GLP-1(7-37)/GLP-1(7-36)NH2양(g) 단위공정수율(%) 총 회수율(%)
배양(8L 배양액 상당) 26.87 100 100
OmpT 반응 22.95 85.4 85.4
SP 세파로스 크로마토그래피 20.22 98.8 76.2
아미드화 효소반응 20.70 100 77.0
Kex2 효소반응 18.70 90.4 69.6
MacroPrep HS 크로마토그래피 16.78 93.7 62.4
Poros R2 13.48 80.4 50.2
배양으로부터 아미드화 효소반응의 공정은 GLP-1(7-37)의 양, Kex2 공정에서 Poros R2 크로마토그래피 공정까지는 GLP-1(7-36)NH2의 양을 도시한 것이다. GLP-1 1(7-37)/GLP-1(7-36)NH2의 양은 HPLC의 피크 면적과 아미노산의 수의 비율로부터의 환산치에서 구한다.
표 l에서 명백한 바와 같이 각 공정의 단위 공정수율은 대단히 높으며 또한 최종의 회수율이 약 50%로서 대단히 높은 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드의 제조법이 GLP-1(7-36)NH2의 제조에 적용될 수 있으며 또한 공업 생산 수준에서 스케일 업이 가능한 것은 분명하다. 또한 0mpT 프로테아제 및 Kex2 프로테아제에 의한 절단 처리반응의 공정에서 단위 공정수율이 각각 85% 및 90.4% 인 점으로부터 설정한 각 절단 부위영역에는 효소에 의한 절단 처리반응에 대단히 적합한 아미노산 서열이 사용되고 있는 것도 확인된다.
상기와 같이 본 발명에서는 인슐린 방출 촉진활성을 갖는 GLP-1 유도체의 제법을 예로 하여 목적하는 펩타이드가 원래 갖는 물리화학적 성질에 대한 제조공정상 문제점을 보조 펩타이드를 사용하여 개선할 수 있다는 것을 실증한다. 구체적인 예로서 열거한 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2로 대표되는 GLP­1 유도체가 가지는 물리화학적 성질에 의한 제조상의 문제는 본 발명에 따른 제법에 의해 극복할 수 있으며 본 발명이 당해 GLP-1 유도체의 제조에서도 유용한 것은 말할 필요도 없다.
또한 상기한 GLP-1 유도체의 제조에서도 보호 펩타이드를 부가하는 융합 단백질을 사용하는 제법에 따라 실시할 수 있지만 당해 융합 단백질로부터 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드를 경유하여 목적하는 펩타이드를 수득하는 경우, 복수의 절단 부위영역이 설치되기 위해 각 영역에서의 다단계의 융합 단백질의 절단방법이 필요해진다.
그래서 각 절단부위 영역을 화학적 또는 효소적으로 절단하는 방법에 대해 검토를 하고 특히 하기의 실시예에서 확인된 대장균 0mpT 프로테아제로 절단하는 방법 이외의 방법에 따라서도 할 수 있는 것을 확인했다. 이러한 절단 부위영역에 따른 펩타이드쇄의 대표적인 예로서는 하기를 들 수 있다.
(1) 보호 펩타이드 및 목적하는 펩타이드가 시스테인 잔기를 이의 아미노산 서열 중에 함유하지 않는 것을 이용하여 보호 펩타이드의 C말단에 시스테인을 삽입하고 시아노화, 알칼리 처리로써 당해 시스테인 N말단측에 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 방법,
(2) 각 절단 부위영역에서의 절단과 함께 Kex2 프로테아제로 실시하지만 효소 인식부위에 상이한 아미노산 서열을 사용하는 것으로 한쪽의 절단 부위영역에서의 반응조건하에서는 다른쪽의 절단 부위영역에서의 절단이 일어나지 않도록 하는 방법 및
(3) 각 절단 부위영역에서 함께 Kex2 프로테아제로 절단을 하지만 한쪽의 절단 부위영역(절단 부위영역2)의 아미노산을 수식함으로써 다른쪽의 절단 부위영역(절단 부위영역l)에 따른 절단의 반응조건 하에서는 전자의 절단 부위영역(절단 부위영역2)에서 절단이 일어나지 않도록 하고 후자의 절단 부위영역(절단 부위영역1)에서 절단한 다음, 보조 펩타이드와 목적하는 펩타이드로 이루어진 펩타이드를 정제하여 수식된 아미노산을 다시 수식하여 전자의 절단 부위영역(절단 부위영역2)을 Kex2 프로테아제로 절단할 수 있게 하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명은 공업적 스케일로 유전자 재조합 기술을 사용하여 목적하는 펩타이드를 효율적으로 생산할 때에 목적하는 펩타이드 자체가 갖는 물리화학적 성질 때문에 생기는 문제(예: 당해 펩타이드의 생산공정상의 화학반응적 또는 효소반응적처리 또는 정제공정에서의 저용해성과 겔화의 문제)를 개선하여 목적하는 펩타이드를 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명에 따른 목적하는 펩타이드란 최종적으로 수득하려고 하는 펩타이드 뿐만 아니라 이의 제조과정에서 필요한 제조중간체 펩타이드도 의미한다.
본 발명자등은 먼저 언급한 문제를 회피하기 위해 목적하는 펩타이드에 보조 펩타이드를 부가함으로써 목적하는 펩타이드가 갖는 문제점을 해소하여 목적하는 펩타이드를 효율적으로 제조하는 방법을 찾아내었다. 즉, 본 발명에 따른 펩타이드의 제조방법은 목적하는 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 제조하는 방법이고 하기의 공정을 포함하여 이루어진 당해 제조방법이다.
공정 (1); 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드 또는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 다시 보호 펩타이드가 부가된 융합 단백질을 암호화하는 염기 서열을 갖는 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하여 당해 배양물로부터 상기한 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드 또는 상기한 융합 단백질을 채취하는 공정;
공정 (2); 공정(1)에서 융합 단백질을 수득하는 경우, 당해 융합 단백질로부터 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드와 보호 펩타이드를 절단 분리하여 원하는 바에 따라 다시 정제하는 공정;
공정 (3); 목적하는 펩타이드에 수식이 필요한 경우, 공정(1) 또는 공정(2)에서 수득되는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 수식반응을 실시하는 공정;
공정 (4); 공정(1), 공정(2) 또는 공정(3)에서 수득되는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드로부터 보조 펩타이드와 목적하는 펩타이드를 절단 분리하여 원하는 바에 따라 다시 정제하는 공정; 및
공정(5); 공정(4)에서 수득하는 목적하는 펩타이드를 정제하는 공정.
하기에 GLP-1 유도체를 목적하는 펩타이드로서 본 발명을 구체적인 실시예에 따라 보다 상세하게 설명한다.
우선 목적하는 펩타이드로서 GLP-1(7-37)을 열거하는 경우의 제조법으로서는 이미 기재된 바와 같이 통상적인 방법에 따라 보호 펩타이드와 GLP-1(7-37)로 이루어진 융합 단백질을 발현시켜 당해 단백질로부터 직접 GLP-1(7-37)을 절단 인출함으로써 제조할 수 있지만 정제공정에 관해서 GLP-1(7-37)의 물리화학적 성질상, 정제중에 겔화 또는 응집을 일으켜 극단적인 회수율의 저하나 수지 재생이 불가능하게 되는 문제가 보인다. 그래서, 보조 펩타이드를 부가함으로써 GLP-1(7-37)의 물리화학적 성질을 변화시켜 상기한 결점을 회피할 수 있다. 하기에 구체적으로 당해 펩타이드의 제조법을 설명한다.
실시예 1 플라스미드의 구축
GLP­1(7-37)을 생산하기 위해서 디자인된 융합 단백질(GP97ompPR)을 암호화하는 pGP97ompPR 발현 플라스미드는 하기에 기재한 4단계의 스텝을 경유하여 작제한다. 또한, 제한효소 처리, 연결 반응, 5' 말단의 인산화, pCR의 조건은 통상적인 방법에 따른다.
(l) 스텝 1 pG117S4HR6GLP-1의 작제
대장균 0mpT 프로테아제에 의해 절단되는 GP97ompPR을 설계할 목적으로 0mpT 프로테아제의 인식 서열인 Arg­Arg 서열을 갖는 아미노산 서열 R 6(도 2 참조)을 암호화하는 R 6합성 DNA(도 6 참조)을 pG117S4HGP[참조: 일본국 공개특허공보 제(평)9­296000호]의 StuI 부위에 삽입하고 pG117S4HR6GLP-1을 작제한다(도 2).
(2) 스텝 2 pGP117S4HompRHKR의 작제
대장균 0mpT 프로테아제에 의한 절단 효율을 보다 높이기 위해 R 6 부분의 서열을 변화시킨다. pG117S4HR6GLP-1를 Nsi I 및 HindIII로 절단하여 수득되는 3.2kb의 단편(단편 A), pG117S4HR6GLP-1을 BamH I 및 Hind III로 절단하여 수득되는 0.2kb의 단편(단편 B) 및 0mpT 프로테아제의 인식 서열인 Arg­Arg 서열을 갖는 아미노산 서열 L 1(도 3 참조)의 일부를 암호화하는 L 1 합성 DNA(도 6 참조)을 연결시켜 pGP117S4HompRHKR을 작제한다.(도 3).
(3) 스텝 3 pGP117S4HompRHPR의 작제
절단 부위영역에서 대장균 0mpT 프로테아제 인식 서열과 Kex2 프로테아제 인식 서열이 상이하도록 하기 위해 Kex2 프로테아제 인식 서열을 Lys­Arg에서 Pro- Arg로 대체하는 것을 실시한다. P1 및 P2 프라이머(도 6 참조)를 합성하여 pGP117S4HompRHKR을 주형으로서 PCR을 실시하고 0.1kb의 DNA 단편을 조제한다. 수득되는 DNA 단편을 Bg1 I1 및 Sph I로 처리한 다음, pGP117S4HompRHKR을 Bg1 I1 및 Hind III로 절단하여 수득되는 3.2kb의 단편(단편 C)과 pGP117S4HompRHKR을 Sph I 및 Hind III로 절단하여 수득되는 0.2kb의 단편(단편 D)에 연결하여 pGP117S4HompRHPR을 작제한다(도 4).
(4) 스텝 4 pGP97ompPR의 작제(도 5)
보호 펩타이드 부분을 더욱 축소할 목적으로 pGP97ompPR를 작제한다. P 3 및 P 4 프라이머(도 6 참조)를 합성하여 pGP117S4HompRHPR를 주형으로서 PCR을 실시하여 DNA 단편을 조제한다. 수득되는 DNA 단편을 Pvu Il 및 Nsi I로 처리한 다음, pGP117S4HompRHPR를 Pvu I1 및 Nsi I로 절단하여 수득되는 3.2kb의 단편에 연결하여 pGP97ompPR을 작제한다.
작제된 플라스미드 pGP97ompPR이 암호화하는 융합 단백질(GP97ompPR)의 아미노산 서열을 도 7, 당해 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 염기 서열을 도 8에 도시한 것이다.
실시예 2 융합단백질(GP97ompPR)의 발현
pGP97ompPR을 갖는 대장균 W3110주를 30l·소형 발효기(jar fermenter)를 사용하여 4g/1 K2HP04, 4g/l KH2P04, 2.7g/1 Na2HP04, 0.2g/1 NH4C1, 1.2g/l(NH4)2S04,4g/l 효모 추출물, 2g/l MgS04·7H20, 40mg/l CaC12·2H20, 40mg/1 FeS04·7H20, 10mg/l MnS04·nH20, 10mg/l A1C13.·6H20, 4mg/l CoCl2·6H20, 2mg/l ZnS04·7H20, 2 mg/1 Na2MoO4ㆍ2H2O, 1mg/l CuCl2ㆍ2H2O, 0.5mg/l H3BO4, 10mg 테트라사이클린을 함유하는 배지(20 L, pH 7.0)로 배양 온도를 12시간까지는 32℃, 그 후에는 37℃로 하여 글루코스를 첨가하면서 24시간에 걸쳐 배양을 한다. 28% 암모니아액을 첨가하여 배지 pH를 7.0으로 제어한다. 도 9는 균체 농도(0D 660)의 추이와 각 샘플링 시점에서 융합 단백질(GP97ompPR)의 발현을 16% SDS­PAGE에 의해 조사한 결과이다. GP97ompPR은 봉입체로서 발현하고 배양 종료시에는 전체 균체 단백질의 30% 이상을 차지한다.
배양후, 맨튼고린 균질화기(15M­8TA)를 사용하여 배양액을 500Kg/cm2의 조건으로 균질화기로 처리하여 원심분리기에 의해 침전 분획(봉입체)를 회수한다. 다음에 수득되는 침전을 세정하기 위해 배양액과 등량의 탈이온수를 첨가하여 현탁한 다음, 다시 원심분리를 하여 침전을 회수한다. 이러한 세정 조작을 다시 또 한번 반복하고 최종적으로 수득되는 침전을 적정량의 탈이온수에 현탁한다.
실시예 3 GP97ompPR의 대장균 OmpT 프로테아제를 사용하는 처리
수득되는 봉입체 현탁액을 0D 660의 값이 1000으로 되도록 희석한 다음, 이의 1000ml를 채취하고 pH 미조정의 1M Tris­HC1을 250ml, 0.5M EDTA(pH 8.0)를 10ml, 분말 요소 1200g을 첨가한 다음, 탈이온수를 가하여 최종 용량을 5000ml로 한다. 다음에 염산을 사용하여 pH를 7.5로 조정하여 37℃에서 2시간 동안 가온한다. 이러한 조작에 의해 봉입체 내에 존재하고 있는 대장균 0mpT 프로테아제가 작용하여 GP97ompPR을 절단하고 RHHGP[G]가 유리된다. 도 10은 GP97ompPR에서의 RHHGP[G]의 절단 인출을 역상 HPLC에 의해 분석한 결과이다. 분석은 YMC PR0TEIN­PR 칼럼을 사용하고 용액 A에 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 10% 아세트니트릴 용액, 용액 B에는 0.095% 트리플루오로아세트산을 함유하는 70% 아세트니트릴 용액을 사용하고 1ml/min의 유속으로 용액 B를 13분 동안에 44% 내지 70%로 하는 직선 농도 구배에서 실시한다. 본 조작에 의해 85%의 GP97ompPR이 절단되어 반응 종료후의 시료에는 RHHGP[G]에 상당하는 피크가 수득된다(도21 A).
또한, 대장균 0mpT 프로테아제를 사용하는 절단 처리에 의한 융합 단백질로부터 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-37)의 절단 인출은 pGP97ompPR 유래의 융합 단백질에 한정되는 것이 아니라 실시예1에서 작제된 pG117S4HR6GLP-1, pGP117S4HompRHKR 및 pGP117S4HompRHPR 유래의 융합 단백질에서도 동일하게 할 수 있다. 이들 플라스미드 유래의 융합 단백질의 아미노산 서열을 도 11, 도 12 및 도 13에 도시한 것이다.
실시예 4. RHHGP[G]의 정제
대장균 0mpT 프로테아제 반응후, 요소, Tween 80을 각각 7M, 0.1%가 되도록 첨가한 다음, Na0H로 pH를 8.0으로 한다. 그 후, 원심분리하여 상등액을 얻는다. SP­Sepharose BigBeads(아마샴·파마시아바이오테크놀로지사)를 충전한 칼럼을 100mM Tris HC1(pH 8.0), 이어서 20mM Tris HCl(pH 8.0)/5M 요소/0.1% Tween 80으로 평형화한다. 상기한 상등액을 평형화된 칼럼에 첨가하고 상기 평형화액으로써 세정한 다음, 0.2M NaC1/20mM Tris HC1(pH 8.0)/0.1% Tween 80으로 세정하고 0.5M NaC1/20mM Tris HC1(pH 8.0)/0.1% Tween 80으로 용출한다(도 14).
본 용출액중의 RHHGP[G]의 순도는 98%로서 대단히 높다. 보조 펩타이드 부가 및, 저압 크로마토그래피 칼럼으로부터 스텝 용출이라는 간편한 공정에서 이러한 고순도의 펩타이드가 수득되는 이유는 보조 펩타이드 설계시에 친수성 아미노산의 도입이나 등전점을 고려하여 이온교환 칼럼에서의 정제를 하는 것에 기인한다.
상기한 결과가 본 공정 이후의 정제공정의 자원절약화에 크게 기여하는 것을 실시예5에 도시한 것이다.
실시예 5. RHHGP[G]에서 GLP-1(7-37)의 절단 인출 및 정제
실시예 4에서 정제된 RHHGP[G]를 다음에 도시하는 반응액 조성으로 하고 Kex2 프로테아제로 처리한다. 반응액 조성; 5.0mg/ml RHHGPG[G], 20mM Tris HC1, 0.1% Tween 80, 0.3M NaC1, pH 8.0, 2.0mM CaCl2, 8000unit/ml Kex2 프로테아제(약 1.0mg/L). 1시간dp 95%의 반응율을 얻는다(도 15-B). 본 반응중, GLP-1(7-37)의 침전 형성은 관찰되지 않는다.
효소 반응후, 즉시 본 반응액에 아세트산암모늄을 최종 10mM로 되도록 첨가하고 염산으로 pH 4.5로 한다. 10mM 아세트산 암모늄 (pH 4,5)로 평형화된 Poros R 2 칼럼에 10mg GLP-1(7-37) 상당량/1m1 수지가 되도록 부하하고 상기 평형화액에 계속해서 0.2% 아세트산/10% 아세트니트릴로 세정하고 0.2% 아세트산/40% 아세트니트릴로 용출한다. 아세트니트릴을 제거한 후, 동결건조품을 얻는다. GLP-1(7-37)의 회수율은 80%이며 순도는 99%이다(도 15-C).
보호 펩타이드와 목적하는 펩타이드로 이루어지는 융합 단백질로부터 직접 GLP-1(7-37)을 절단 인출하는 방법(예: 일본국 공개특허공보 제(평)9­296000호 참조)과 본 발명 방법의 비교를 표 2에 기재한다.
GLP-1(7-37) 생산공정의 비교
A
공정 순도(%) 단위공정수율(%) 총 회수율(%)
Kex2 효소반응 15 - 100
산 침전 처리 - 68 68
여과 75 88 60
양이온 교환 크로마토그래피 95 95 57
역상 크로마토그래피 99 72 41
B
OmpT 반응 24 - 100
여과 24 90 90
양이온 교환 크로마토그래피 99 99 89
kex2 효소반응 96 90 80
역상 크로마토그래피 98 80 64
A는 보호 펩타이드와 목적하는 펩타이드로 이루어지는 융합 단백질로부터 직접 GLP-1(7-37)을 절단 인출하는 방법에 따른다. B는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 다시 보호 펩타이드가 부가된 융합 단백질로부터 GLP-1(7-37)을 절단 인출하는 방법에 따른다.
RHHGP[G]를 중간체로 하는데 있어서, 순도 99%의 GLP-1(7-37)이 간편하고 또한 고수율로 수득된다. 본 정제방법에서는 HPLC을 사용하지 않으므로 공업적 스케일로의 확대가 용이한 것은 말할 필요도 없다.
다음에 목적하는 펩타이드에 수식이 필요한 경우의 예를 하기에 기재한다. GLP-1(7-36)NH2는 아미드화 펩타이드이므로 아미드화 수식반응이 필요하다.
실시예 6 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-37)의 아미드화 수식반응
아미드화 효소를 사용하여 실시예4에서 수득되는 RHHGP[G]를 RHHGP-1으로 변환한다. RHHGP[G]를 기질로 하는 경우의 반응조건을 결정하기 위해 0.5m1의 반응용적으로 pH, 온도, 황산구리 농도, 카탈라제 농도, 기질 농도, L-아스코르브산 및 농도 아미드화 효소농도를 최적화한다. 또한 RHHGP[G]와 RHHGP-1의 분리 분석은 이온교환 HPLC 칼럼(Poros S/H, 파세프팁 바이오시스템사)을 사용하고 바르비탈을 제거한 30mM Britton­Robinson 완충액(이하, BR 완충액) 존재하에 pH 구배 용출(6.0 내지 9.0)을 실시한다.
본 반응조건의 최적 pH는 5.0 내지 5.5이다(도 16). 최적 반응조건은 10mM 아세트산나트륨(pH 5.0), 5.0μM 황산구리, 0.5g/1L-아스코르브산, 1μM/ml 카탈라제, 5.0mg/m1 RHHGP[G], 온도 32℃, 1500unit/ml 아미드화 효소이다. 본 조건에 하기의 실시예 11에서 판명된 응집 억제효과를 갖는 Tween 80(0.1%)을 가하여 RHHGP[G] 용액 5ℓ를 상기한 조건으로 반응시키고 EDTA를 첨가하여 반응을 종료한다. 본 조건에 따른 반응의 결과로서 RHHGP[G]는 1시간에 98% 이상의 반응율로 RHHGP-1으로 변환된다(도 l7).
실시예 7. RHHGP-1으로부터 Kex2 프로테아제에 의한 GLP-1(7-36) NH2의 절단 인출
Kex2 프로테아제에 의한 처리반응은 기질로 되는 부분의 서열에 따라 pH 의존성 및 활성 변화를 나타낸다(EP 794255A). 그래서, 0.5m1 반응 용량으로 pH, 염화칼슘 농도 및 첨가 효소량을 최적화한다. RHHGP­1의 경우에는 pH 8.0으로 최대로 되는 것이 도시되었다(도 18). RHHGP-1을 기질로 하는 경우에 최적 반응조건은 10mM Tris·HC1(pH 8.0), 1mM 염화칼슘, 8,000units/m1 Kex2 프로테아제 및 반응온도 30 내지 32℃로 한다. 하기의 실시예 11의 결과로부터 반응 용액 속의 NaC1 농도를 0.1M 이상으로 하고 또한 Tween 80을 0.1% 반응용액 중에 첨가하는 것으로 응집을 회피할 수 있다.
실시예 6의 아미드화 반응후의 시료 용액을 본 조건에서 30℃로 2시간 동안 반응시켜 95% 이상의 반응율을 얻는다(도 21C). 본 반응중, GLP-1(7-36) NH2의 침전 형성은 볼 수 없다.
실시예 8 GLP-1(7-36)NH2의 정제
미량 혼재하는 불순물을 제거하기 위해 양이온 교환수지(MacroPrep High­ S, 바이오래드사)를 사용하고 pH 구배 용출로 GLP-1(7-36)NH2와 분리한다. 칼럼을 20mM BR 완충액(pH 4.5)/20mM NaCl/0,3% Tween 80으로 평형화한다. 시료 용액의 조성을 0.3M NaC1/0.3% Tween 80, pH 4.5로 한다. 당해 시료 용액을 칼럼에 첨가하여 평형화액에서 세정한다. 평형화액(A 액)과 용출액(B 액; 평형화액과 동일한 조성으로 pH 7.0)을 사용하여 50% B액으로부터 100% B액으로 선형 농도 구배로 GLP-1(7-36)NH2의 용출을 실시하고(도 l9) 불순물의 비율을 0.5% 미만으로 한다(도 20). 본 공정에서 실시예7까지 첨가된 각 시약, 미반응물 및 미량 불순물의 대부분은 제거되며 순도 98% 이상의 GLP-1(7-36)NH2가 수득된다(도 2lD). 풀된 용액은 pH 4.5, 4℃에서 보존한다.
실시예 9 GLP-1(7-36)NH2의 최종 정제
상기한 실시예 8에서 순도 98% 이상의 GLP-1(7-36)NH2가 수득된다. 그러나 의약품으로서 사용하는 경우에는 목적하는 펩타이드의 순도도 유지하면서 비펩타이드성의 내독소의 혼입을 피하지 않으면 안된다. 그래서 펩타이드성 의약품 최종정제에 빈번히 사용되는 분리 역상 HPLC 칼럼을 사용하여 내독소 등의 제거를 시도하였지만 칼럼 내에서 GLP-1(7-36)NH2의 응집 및 /또는 겔화가 일어나는 경우가 있다. GLP-1(7-36)NH2의 응집 용이성은 스케일 업할 때에 큰 위험인자로 되는 것으로 예측된다.
한편, 소수성 크로마토그래피 수지는 역상 크로마토그래피 수지와 같이 물질의 소수성을 이용하여 흡착시키는 것이지만 이의 관능기의 밀도는 일반적으로 낮으며 흡착 용량은 5-15mg/ml의 수지이다. 그러나 담체의 종류, 관능기의 종류는 풍부하고 GLP-1(7-36)NH2와 같은 응집 용이성을 갖는 펩타이드라도 고회수율을 부여하는 것을 선택할 수 있다. 그래서 여러가지 소수성 크로마토그래피 수지를 검토한 결과, 부틸기, 이소부틸기, 헥실기 또는 페닐기를 가지는 친수성의 담체로 이루어지는 수지 또는 Poros R2로 대표되는 폴리스티렌계 수지가 적합한 것으로 판명됐다. 하기에 이러한 수지의 하나로서 Poros R2(퍼셉티브바이오시스템사)가 기재된다.
본 수지의 GLP-1(7-36)NH2에 대한 최대 흡착용량은 약 12mg/m1 수지와 기타 소수성 크로마토그래피용 수지와 비교하여 높으며 용출시의 GLP-1(7-36)NH2농도가 높아지고 동결건조에 적합한 것이 시사된다.
800m1의 칼럼을 10mM 아세트산암모늄(pH 4.5)으로 평형화하여 실시예8에서의 시료 용액을 첨가하고 평형화액으로 세정한 다음, 다시 0.2% 아세트산으로 세정하여 0.2% 아세트산/40% 아세트니트릴로 용출한다. GLP-1(7-36)NH2의 회수율은 80%이며 순도는 98%이다(도 21E). 본 표준품은 휘발성의 산을 저농도 함유할 뿐이고 아세트니트릴을 제거한 다음, 용이하게 동결건조를 할 수 있다. 동결 건조품을 재용해하여 겔화법(리물스 ES-II 테스트, 와코쥰야쿠사)으로 내독소를 측정한 결과, 검출 한계 이하(0.03u/mg 이하)이다. 상기한 방법으로 기재된 칼럼 조작으로 고수율이면서 고순도의 GLP-1(7-36)NH2를 정제할 수 있으며 또한 동결건조할 수 있는 용매로 용출할 수 있는 것은 산업상 대단히 유용한 것은 말할 필요도 없다.
실시예 10 보조 펩타이드를 사용하는 것에 따른 응집성의 완화
보조 펩타이드를 이용하는 본 발명에 따른 제조법에서는 종래의 제법으로는 문제로 되어 있는 목적하는 펩타이드의 물리화학적 성질에 유래하는 특성인 응집성의 개선을 하나의 목적으로 함으로 당해 개선의 유무를 검토하는 것이 필요하다. 그래서 본 실시예에서는 보조 펩타이드와 GLP-1(7-37)로 이루어진 펩타이드 및 아미드화된 보조 펩타이드와 GLP-1(7-36)NH2로 이루어진 펩타이드의 응집성이 GLP-1 (7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2와 비교하여 개선되어 있는가를 검토한다.
우선, RHHGP[G]를 정제하여 이의 응집성이 GLP-1(7-37)과 비교하여 개선되어 있는가를 조사하는 동시에 응집을 억제하는 물질의 검색을 수행한다. 각 펩타이드의 시료는 RHHGP[G]에 관해서는 SP­Sepharose BigBeads 크로마토그래피로써 정제한 시료를 RHHGP-1에 관해서는 정제한 RHHGP[G]를 아미드화하는 시료를 GLP-1(7-37)에 관해서는 정제한 RHHGP[G]를 Kex2 프로테아제에 의해 절단한 시료를 GLP-1(7-36) NH2에 관해서는 RHHGP-1을 Kex2 프로테아제에 의해 절단한 시료를 각각 Poros R2 칼럼을 사용하여 아세트니트릴 농도 구배 용출하는 것으로 순도 98%까지 정제하여 동결건조하여 조제한다.
응집성은 각 펩타이드의 용해성에 밀접하게 관계한다고 생각되므로 각 펩타이드의 용해도의 pH 의존성을 검토한다. 그 결과를 도 22 및 도23에 도시한다. GLP-1(7-37)은 pH 5.5로부터 pH 6.5, 즉 아미드화 효소 반응조건 최적 pH인 약산성으로부터 중성 pH 조건하에서는 용해성이 낮으며 제조 중간체로서 부적절한 것으로 판단된다.
한편, RHHGP[G] 및 RHHGP-l은 pH 6.2 부근에서 용해도가 저하되지만 적어도 pH 5로부터 pH 6까지는 충분한 용해성을 유지할 수 있으므로 아미드화 효소 반응조건이라도 충분하게 효율적으로 반응을 실시할 수 있는 것을 확인할 수 있다.
실시예 11 응집 억제를 하는 물질의 스크리닝
보조 펩타이드를 이용하는 본 발명에 따른 제조법을 사용하는 GLP­1(7-36) NH2의 공업적 수준에서의 제조방법의 확립에 있어서 중성으로부터 약 알칼리성의 영역에서 RHHGP[G] 및 RHHGP-1의 용해도를 높이는 물질 및 약산성으로부터 약 알칼리성의 영역에서 GLP-1(7-36)NH2의 용해성을 유지할 수 있는 물질이 있으면 보다 양호하다[GLP-1(7-36)NH2는 도 22에 도시한 시험에서 GLP­1(7-37)보다 지연되지만 pH 5.3으로부터 pH 8.0의 넓은 범위에서 경시적으로 침전하거나 미세 결정을 형성하는 것이 명백해졌다].
상기한 각 펩타이드의 용해성을 유지할 수 있도록 용액에 첨가하는 물질로서 계면활성제, 당류, 소금, 유기용매 등이 후보로서 생각된다. 그래서, 계면활성제로서는 Tween 80, Triton X-100, 당류로서는 글루코스, 만니톨, 슈크로스, 염으로서는 NaCl, 유기용매로서는 에탄올, 글리세롤, DMS에 대해서 이의 응집 억제능의 검토를 실시한다.
RHHGP[G], RHHGP-1 및 GLP-1(7-36)NH2의 10mg/m1 수용액을 조정하고 미리 0.lml의 300mM BR 완충액(pH 7.9) 및 0.1m1의 10배 농도의 피검사 물질 용액이 들어간 플라스틱 튜브에 각 펩타이드 용액 0.8m1를 가하고 pH를 RHHGP[G]는 pH 7.5­ 8.5, RHHGP-1은 pH 8.0, GLP-1(7-36)NH2는 pH6.5으로서 응집이 일어나기 쉬운 pH로 조제하고 탁도(660nm의 흡광도)를 경시적으로 측정한다. 수득되는 결과중에서 Tween 80, NaC1 및 온도에 따른 응집능 억제효과를 도23 및 도24에 도시한다.
RHHGP[G], RHHGP­1은 0.1% Tween 80에서 침전 형성이 강하게 억제되지만(도23 A) GLP-1(7-36)NH2에서는 0.3% 이상의 Tween 80(도 23 B), 100mM 이상의 NaC1(도 24 C) 및/또는 저온(도 24 D)에서 응집이 억제되는 것으로 판명됐다.
상기한 결과에 따라 실제의 생산 시스템에서의 pH 조건에 관해 본 발명에 따른 펩타이드의 제조법을 사용하는 경우, 반응액에 소금 및 계면활성제의 첨가가 목적하는 펩타이드의 응집억제에 유용한 것이 실증되어 고순도이면서 고수량으로 목적하는 펩타이드를 생산할 수가 있는 것으로 나타난다.
실시예 12 절단 부위영역에서의 절단방법
절단 부위영역에서 절단 처리를 할 때에 사용되는 절단방법에 관해 검토한다. 즉, (1) 절단 부위영역 1: 시아노화/알칼리화, 절단 부위영역2: kex2 프로테아제, (2) 절단 부위영역 1: kex2 프로테아제, 절단 부위영역2: Kex2 프로테아제, 및 (3) 절단 부위영역 l: DTNB[5,5'-ditiobis-(2­nitrobenzoic acid)] 부가/Kex2 프로테아제, 절단 부위영역 2: 환원/Kex2 프로테아제인 경우의 각 절단방법에 관해서 목적하는 펩타이드를 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2로서 검토한 바, 본 발명에 따른 제법에서 보호 펩타이드를 갖는 융합 단백질을 사용하는 경우에 다단계 절단반응에 따른 절단이 화학적 또는 효소적 처리에 의해 실시할 수 있는 것이 명백해졌다.
각 방법에 따른 결과를 하기에 기재한다. 절단반응후에 생성되는 보조 펩타이드와 GLP-1(7-37)로부터 이루어진 폴리펩타이드의 친수성을 증가시켜 중성부근에서 용해성을 개선하기 위해 모든 보조 펩타이드중에 4개의 연속하는 히스티딘 서열을 도입한다.
A. (l)의 방법을 사용하는 시스테인 잔기에서의 특이적 절단을 경유하는 GLP-1(7-37)의 제조방법
본 방법은 목적하는 펩타이드가 시스테인을 함유하지 않는 경우, 한쪽의 절단 부위영역중(절단 부위영역1)의 시스테인 잔기를 화학적으로 절단하는 방법이며 예를 들면, 발현한 융합 단백질을 수득한 다음에 CADP(1-cyano­4-dimethy1amino­ pyridinium tetraf1uoroborate)로 시스테인 잔기를 시아노화한 다음, 알칼리(Na0H)처리하는 것보다 절단 부위영역의 시스테인의 N-말단측에서 특이적으로 절단할 수 있는 것을 확인한다.
즉, 우선 보조 펩타이드로서 GCHHHH(서열 5)의 아미노산 서열에 인접한 절단 부위영역1의 아미노산 서열로서 PGGRPSRHKR(서열 6)을 선택하여 융합 단백질중에 도입한다. 당해 융합 단백질을 30mg/m1의 농도로 50mM Tris· HC1(pH 8.2), 5M 요소, 10mM DTT(dithiothreitol)에 용해하고 30℃의 항온조 속에서 30분동안 보온하여 시스테인을 완전히 환원한다. 이것을 10mM Tris­HC1(pH 8.2), 5M 요소로 평형화한 겔여과 칼럼(파마시아사제 PD10 칼럼)에서 DTT를 제거한다.
시스테인을 시아노화하기 위해 아세트산을 최종 0.1M로 되도록 가한 다음, CADP를 시스테인의 4배몰량으로 가하여 30℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 잔존 SH 기를 DTNB로 정량하는 것으로 시아노화 반응을 검증한다.
10mM 아세트산, 5M 요소로 평형화한 PD10 칼럼에서 과잉의 시약을 제거하고 Na0H를 최종 50mM로 되도록 첨가하고 실온에서 30분 동안 방치하여 시아노화된 시스테인 부위에서 상기한 융합 단백질을 특이적으로 절단한다. 절단율은 약 50­70%이다.
다른쪽의 절단 부위영역(절단 부위영역2)에 관해서는 실시예7과 동일한 방법으로 절단한다.
B. (2)의 방법을 사용하는 Kex2 프로테아제에 의한 절단 부위영역의 절단
각 절단 부위영역은 Kex2 프로테아제 절단 부위영역을 갖고 있지만 한쪽의 절단 부위영역(절단 부위영역2)의 아미노산 서열은 다른쪽의 절단 부위영역(절단 부위영역1)에서의 절단에 따른 반응조건으로는 거의 절단되지 않도록 설계된다.
Kex2 프로테아제의 절단 부위영역에 관한 절단 인식서열의 최적화에서 P1, P 2 서브사이트 이외에 P 4 아부위의 아미노산 잔기에 전하가 본 효소의 활성에 크게 영향을 주며 특히 P 4 아부위에 산성 아미노산이 존재하면 일정한 조건하에서는 융합 단백질이 전혀 절단되지 않는 것이 공지되어 있다[참조: 일본국 공개특허공보 제(평)9­296000호). 이것을 사용하여 예를 들면, 보조 펩타이드로서의 HRHKRSHHHH(서열 7)로 이루어지는 아미노산 서열에 인접한 절단 부위영역2의 아미노산 서열을 SDHKR(서열 8)로서 p 4 아부위에 아스파라긴산(D)을 도입한 바, 융합 단백질중의 절단 부위영역1에 따른 Kex2 프로테아제에 의한 절단으로는 90% 이상이 절단되지만 절단 부위영역2는 절단으로부터 보호된다. 이 결과로부터 P 4 아부위에 아스파라긴긴산을 도입하는 것으로 절단 부위영역1이 특이적으로 절단되는 것이 명백해진다.
수득되는 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-37)을 분리하기 위해 이온교환과 겔 여과기능을 갖는 칼럼 크로마토그래피(예: 셀로파인 C­200 칼럼 크로마토그래피)를 실시한 바, 목적하는 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-37)이 특이적으로 흡착된다. 일부 미반응의 융합 단백질도 흡착하지만 소금 농도 구배로 용이하게 분리할 수 있다. 회수율은 94%이다. 또한, 이러한 크로마토그래피는 다른 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-36)NH2에도 적용할 수 있다.
다음에 아미드화 수식반응을 실시한 다음에 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-36)NH2로부터 GLP-1(7-36)NH2를 절단 인출하기 위해 절단 부위영역2에서 Kex2 프로테아제에 의한 절단 처리를 실시한다. 요소(변성제)가 존재하고 또한 알칼리성이라는 제1 절단 조건하에서는 Kex2 프로테아제는 절단 부위영역2를 절단하지 않지만 요소가 없는 상태에서는 적당한 pH를 선택하는 것으로 절단 부위영역2를 인식할 수 있는 것이 판명됐다. 최적 pH는 6.5 내지 7.3이며 절단 부위영역1에서 절단반응조건의 pH 8.2로는 절단되기 어려운 것으로 나타난다.
이것은 상기한 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-36)NH2가 여기에 보호 펩타이드가 다시 부가되는 융합 단백질과는 상이하고 요소 비존재하에서도 넓은 pH 영역에서 가용성이기 때문이다. 그래서 Kex2 프로테아제를 반응시켜 역상 HPLC에서 펩타이드를 분리 정량하고 98% 이상의 절단에서 종료로 한다. 본 시스템은 반응액중에 요소를 함유하지 않으므로 Kex2 프로테아제의 실활은 거의 일어나지 않는다. 따라서 필요한 Kex2 프로테아제 양은 기질과의 몰비로 1:20000 내지 1:40000으로서 극단적으로 적게 끝나는 이점이 있다.
상기한 바와 같이 각 절단 부위영역에 따른 절단 처리에 있어서 동일한 효소를 사용하는 것으로 GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36)NH2가 생산할 수 있는 것을 실증할 수 있다.
C. (3)의 방법을 사용하는 시스테인의 특이적인 수식을 이용하는 절단방법
본 방법은 상기한 B.(2)의 방법과 거의 동일한 방법이지만 목적하는 펩타이드에 시스테인 잔기가 존재하지 않는 경우, 한쪽의 절단 부위영역(절단 부위영역2)의 P 4 아부위에 도입한 시스테인 잔기를 수식, 즉 시스테인의 측쇄를 DTNB(dithionitrobenzoic acid)로 처리하는 것으로 다른쪽의 절단 부위영역(절단 부위영역 l)에 따른 Kex2 프로테아제 절단반응시의 절단으로부터 보호하고 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-37)로 이루어진 펩타이드를 수득한 다음에 환원을 실시하고 절단 부위영역 2를 Kex2 프로테아제로 절단하는 방법이다. 이러한 수식반응에는 설폰 산화, DTNB에 의한 비대칭 디설파이드화가 대표적인 예로서 들 수 있지만 시스테인 측쇄에 음전하를 주는 방법이면 양호하며 특별히 한정하지 않는다. 예를 들면, 보조 펩타이드로서 HRHKRSHHHH(서열 7)로 이루어지는 아미노산 서열에 인접한 절단 부위영역 2의 아미노산 서열을 SCHKR(서열 24)로서 융합 단백질에 도입한다.
상기한 바와 같이 디자인된 융합 단백질을 발현시켜 수득되는 융합 단백질에 DTNB 처리를 실시하여 시스테인을 비대칭 설파이드로 한다. 완전히 시스테인이 수식되는 것을 확인한 다음, Kex2 프로테아제에 의한 절단 처리반응을 실시하고 정량적으로 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-37)로 이루어진 펩타이드가 수득되는 것을 확인한다. 즉, 절단 부위영역 2에서 Kex2 프로테아제의 아미노산 서열 인식부위의 P 4 아부위를 시스테인으로 하고 이의 측쇄 특이적으로 음전하를 도입하는 것으로 절단 부위영역 l에 따른 Kex2 프로테아제에 의한 절단시에 절단 부위영역 2는 절단으로부터 보호된다.
다음에 상기 B와 동일하게 정제 및 아미드화 반응을 실시하고 DTT를 가하여 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-36)NH2를 환원하고 소수성 칼럼 크로마토그래피에 의해 순도98%까지 정제하여 동결건조를 한다. 본 제품을 5mg/m1의 농도로 20mM BisTris(pH 7.0), 2mM 염화칼슘에 용해하고 1000유니트/m1의 Kex2 프로테아제를 가하여 30℃에서 반응시킨 바, 보조 펩타이드가 부가된 GLP-1(7-36)NH2는 특이적으로 절단되어 GLP-1(7-36)NH2가 생성된다.
본 실시예에서는 절단 부위영역2를 환원 상태로 실시하지만 양전하를 갖도록 하는 수식을 실시하여 Kex2 프로테아제에 대한 반응성을 변화시킬 수 있는 것은 말할 필요도 없다.
본원 발명에 따라 생리활성 펩타이드를 공업적 스케일로 효율적이면서 염가로 제조하는 방법이 제공된다. 구체적으로는 본원 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이 지금까지, 공업적 스케일 스케일로 생산이 곤란하던 GLP­l 유도체가 고순도 이면서 고수입량으로 생산할 수 있는 것으로 나타난다. 본원 발명에 따른 제법은 GLP-1유도체 이외의 생리활성 펩타이드의 효과적인 제조에 사용할 수 있으며 산업상의 유용성은 매우 높다.

Claims (27)

  1. 하기의 공정을 포함하여, 목적하는 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 제조하는 방법:
    공정(1); 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드 또는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 다시 보호 펩타이드가 부가된 융합 단백질을 암호화하는 염기 서열을 함유하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하여 당해 배양물로부터 상기한 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드 또는 상기한 융합 단백질을 채취하는 공정;
    공정(2); 공정(1)에서 융합 단백질을 수득하는 경우, 당해 융합 단백질로부터 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드와 보호 펩타이드를 절단 분리하고, 경우에 따라 다시 정제하는 공정;
    공정(3); 목적하는 펩타이드에 수식이 필요한 경우, 공정(1) 또는 공정(2)에서 수득되는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 수식반응을 실시하는 공정;
    공정(4); 공정(1), 공정(2) 또는 공정(3)에서 수득되는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드로부터 보조 펩타이드와 목적하는 펩타이드를 절단 분리하고, 경우에 따라 다시 정제하는 공정; 및
    공정(5); 공정(4)에서 수득된 목적하는 펩타이드를 정제하는 공정.
  2. 제1항에 있어서, 보조 펩타이드가 5 내지 50개 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드의 등전점이 8 내지 l2인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 펩타이드가 200개 이하의 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 보호 펩타이드가 30 내지 200개 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 정제공정에서 이온교환 수지를 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 이온교환 수지가 양이온교환 수지인 것을 특징으로하는 제조방법.
  8. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 정제공정에서 역상 또는 소수성 크로마토그래피를 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 펩타이드의 용해성을 유지하기 위해 공정 (1) 내지 (5)중 1개 이상의 공정에서 계면활성제 및/또는 염을 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 숙주세포가 원핵세포 또는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 숙주세포가 대장균인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드의 등전점이 8 내지 12인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 펩타이드가 아미드화 펩타이드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 펩타이드가 인슐린 방출 촉진 활성을 갖는 GLP-1 유도체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 보조 펩타이드가 부가된 인슐린 방출 촉진 활성을 갖는 GLP-1 유도체의 등전점이 8 내지 l2인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 인슐린 방출 촉진 활성을 갖는 GLP-1 유도체의 등전점이 4.5 내지 9.0인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 인슐린 방출 촉진 활성을 갖는 GLP-1 유도체의 등전점이 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제12항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 정제공정에서 이온교환 수지를 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 이온교환 수지가 양이온 교환수지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제12항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 정제공정에서 역상 또는 소수성 크로마토그래피를 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제12항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 펩타이드의 용해성을 유지하기 위해 계면활성제 및/또는 염을 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  22. 제14항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서, 수득되는 인슐린 방출 촉진 활성을 갖는 GLP-1 유도체의 순도가 98% 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  23. 제1항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서, 최종정제물중 내독소의 함유량이 0.03 단위/mg이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  24. 제14항 내지 제23항중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 수득되는 인슐린 방출 촉진 활성을 갖는 GLP-1 유도체를 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 약제학적조성물.
  25. 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드 또는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 또한 보호 펩타이드가 부가된 융합 단백질을 암호화하는 염기 서열을 함유하는 발현 벡터.
  26. 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드 또는 보조 펩타이드가 부가된 목적하는 펩타이드에 또한 보호 펩타이드가 부가된 융합 단백질을 암호화하는 염기 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 원핵 또는 진핵 숙주세포.
  27. 제26항에 있어서, 숙주세포가 대장균인 것을 특징으로 하는 세포.
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