JP2001510042A - Ｔｒａｉｌ受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＴＲＡＩＬ受容体と称されるタンパク質は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）として知られるタンパク質を結合する。該ＴＲＡＩＬ受容体は、ＴＲＡＩＬを精製する場合にまたはその活性を阻害する場合に用いられる。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡ配列を、該ＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、およびこのような組換え体発現ベクターで形質転換された宿主細胞と一緒に提供する。ＴＲＡＩＬ−Ｒと免疫反応性である抗体も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）として知られるタンパク
質は、腫瘍壊死因子ファミリーリガンドのメンバーである（Ｗｉｌｅｙら，Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，３：６７３−６８２，１９９５）。ＴＲＡＩＬは、多数の異
なった種類の癌細胞並びにウイルスに感染した細胞を含めたいくつかの形質転換
された細胞のアポトーシスを誘導する能力が示されている（ＰＣＴ出願第ＷＯ９
７／０１６３３号およびＷｉｌｅｙら，上記）。ＴＲＡＩＬを結合する１種類ま
たは複数の受容体タンパク質の識別により、ＴＲＡＩＬの生物学的活性を更に研
究するのに有用であることが判明すると考えられる。

【０００２】 発明の概要 本発明は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）として知られ
るタンパク質に結合するＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）と称される新規タ
ンパク質に関する。ＴＲＡＩＬ−ＲをコードしているＤＮＡおよびこのようなＤ
ＮＡを含む発現ベクターを提供する。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを製造する方
法は、ＴＲＡＩＬ−Ｒをコードしている組換え体発現ベクターで形質転換された
宿主細胞をＴＲＡＩＬ−Ｒの発現を促進する条件下で培養した後、発現されたＴ
ＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをその培養物から回収することを含む。ＴＲＡＩＬ−
Ｒと免疫反応性である抗体も提供する。

【０００３】 発明の詳細な説明 本明細書中において、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）と称される新規タ
ンパク質を提供する。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド
（ＴＲＡＩＬ）と称されるサイトカインに結合する。ＴＲＡＩＬ−Ｒのいくつか
の使用は、以下で更に論評されるように、ＴＲＡＩＬを結合するこの能力に由来
する。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＲＡＩＬの生物学的活性を阻害する場合にまたはＴ
ＲＡＩＬを、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって精製する場合に
有用である。

【０００４】 ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質またはその免疫原性フラグメントは、それらと免疫
反応性である抗体を生じる免疫原として用いることができる。本発明の一つの実
施態様において、それら抗体はモノクローナル抗体である。

【０００５】 ヒトＴＲＡＩＬ受容体ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、そのｃＤＮＡによって
コードされるアミノ酸配列（配列番号：１および配列番号：２）と共に図１Ａ−
１Ｂで示す。図２Ａ−２Ｂ（配列番号：３および配列番号：４）は、もう一つの
ヒトＴＲＡＩＬ受容体ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列およびそれによって
コードされるアミノ酸配列を示す。図１および２のヌクレオチド配列は、２か所
で異なっている。１４５位のヌクレオチドは、図１の配列（配列番号：１）では
Ｃであるが、図２（配列番号：３）のヌクレオチド１４５はＴであり；図１（配
列番号：１）の９７１位のヌクレオチドはＣであるが、図２（配列番号：３）で
はＴである。アミノ酸配列もまた２か所で異なる。残基３５は、図１（配列番号
：２）でＰｒｏおよび図２（配列番号：４）でＳｅｒであり；残基３１０は、図
１（配列番号：２）でＳｅｒおよび図２（配列番号：４）でＬｅｕである。一つ
考えられる説明は、図１および２のＴＲＡＩＬ受容体が対立遺伝子変異型である
ということである。

【０００６】 図１および２で示される配列情報により、ＴＲＡＩＬ受容体タンパク質が腫瘍
壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーの受容体のメンバーとして同定される
（Ｓｍｉｔｈら，Ｃｅｌｌ ７６：９５９−９６２，１９９４で論及される）。
ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、以下で論評されるような細胞外ドメイン中のシス
テインの多い繰返し体を含めたこのファミリーの他のタンパク質のいくつかの特
徴を含む。しかしながら、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、若干の他の受容体タンパク質の細
胞質領域で見出されるいわゆる“細胞死ドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）
”を欠いている。このようなドメインは、アポトーシスのシグナル伝達に関係し
ている、すなわち、細胞内アポトーシスシグナルカスケードの開始においてある
役割を果たしていると報告されている。細胞質の細胞死ドメインは、Ｆａｓ抗原
（ＩｔｏｈおよびＮａｇａｔａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０９３２
，１９９３）、ＴＮＦ受容体Ｉ型（Ｔａｒｔａｇｌｉａら，Ｃｅｌｌ ７４：８
４５，１９９３）、ＤＲ３（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４
：９９０−９９２，１９９６）およびＣＡＲ−１（Ｂｒｏｊａｔｓｃｈら，Ｃｅ
ｌｌ ８７：８４５−８５５，１９９６）で同定されている。

【０００７】 図１（配列番号：２）および図２（配列番号：４）のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク
質は、シグナルペプチドとして働くＮ末端疎水性領域の後に、細胞外ドメイン、
アミノ酸２１２−２３２まで含む膜貫通領域、およびアミノ酸２３３−３８６ま
で含むＣ末端細胞質ドメインを含む。計算機分析により、そのシグナルペプチド
は、残基５５の後で切断されるらしいと予測される。したがって、そのシグナル
ペプチドの切断は、アミノ酸５６−３８６を含む成熟タンパク質を生じると考え
られる。

【０００８】 図１の残基５６−３８６のアミノ酸配列を有する成熟タンパク質の計算分子量
は、約３６キロダルトンである。等電点（ｐＩ）は、約５．２７であると予測さ
れる。当業者は、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の特定の調製品の分子量が、グリコ
シル化度のような因子によって異なることがありうることを理解するであろう。
ＴＲＡＩＬ−Ｒの特定の調製品のグリコシル化パターンは、例えば、そのタンパ
ク質が発現される細胞の種類によって異なることがありうるし、ある与えられた
調製品は、多数の異なってグリコシル化された種のタンパク質を含むことがあり
うる。関連のある天然パターングリコシル化を伴うまたは伴わないＴＲＡＩＬ−
Ｒタンパク質を本明細書中で提供する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌発現
系でのＴＲＡＩＬ−Ｒの発現は、非グリコシル化分子を提供する。更に、天然タ
ンパク質中のＮ−グリコシル化部位は、以下で論評されるように非活性化されて
いてもよい。

【０００９】 本発明は、天然に存在するまたは組換えＤＮＡ技術を含む手順などの種々の技
法によって生産されるものを含めた様々な型のＴＲＡＩＬ−Ｒを包含する。この
ような形のＴＲＡＩＬ−Ｒには、ＴＲＡＩＬ−Ｒのフラグメント、誘導体、変異
型およびオリゴマー、更には、ＴＲＡＩＬ−Ｒまたはそのフラグメントを含有す
る融合タンパク質が含まれるが、これらに制限されるわけではない。

【００１０】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、グリコシル基、脂質、リン酸基、アセチル基等のような他
の化学残基と共有結合体または凝集結合体を形成することによってその誘導体を
生じるように修飾されていてよい。ＴＲＡＩＬ−Ｒの共有結合誘導体は、ＴＲＡ
ＩＬ−Ｒアミノ酸側鎖上またはＴＲＡＩＬ−ＲポリペプチドのＮ末端若しくはＣ
末端の官能基にそれら化学残基を結合することによって製造することができる。
ＴＲＡＩＬ−Ｒに結合した診断（検出可能）薬または治療薬を含む結合体は、以
下に更に詳細に論評されるように、本明細書中に包含される。

【００１１】 本発明の範囲内のＴＲＡＩＬ−Ｒの他の誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合
のような組換え体培養での合成などによるＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドと他のタ
ンパク質またはポリペプチドとの共有結合体または凝集結合体が含まれる。融合
タンパク質の例は、ＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーに関連して以下で論評される。更
に、ＴＲＡＩＬ−Ｒ含有融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ−Ｒの精製および識別を
容易にするために加えられたペプチドを含むことができる。このようなペプチド
には、例えば、ポリＨｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐ
ｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８で記載された抗
原識別ペプチドが含まれる。一つのこのようなペプチドは、Ｆｌａｇ（登録商標
）ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
（配列番号：５）であり、これは、極めて抗原性であり、特定のモノクローナル
抗体によって可逆的に結合したエピトープを提供して、発現された組換えタンパ
ク質の迅速な検定および容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハ
イブリドーマは、本明細書中に援用される米国特許第５，０１１，９１２号で記
載のような、ある種の２価金属陽イオンの存在下でＦｌａｇ（登録商標）ペプチ
ドを結合するモノクローナル抗体を生じる。その４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞系
は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受
託番号ＨＢ９２５９として寄託されている。Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチドを結
合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ニュー
ヘブン，コネチカット州から入手可能である。

【００１２】 本明細書中では、細胞膜に結合した形のＴＲＡＩＬ−Ｒも可溶性の（分泌され
る）形のＴＲＡＩＬ−Ｒも提供する。可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ
ポリペプチドを発現するそのままの細胞を培地から、例えば、遠心分離によって
分離し、その培地（上清）を所望のタンパク質の存在について検定することによ
って同定する（および不溶性の膜結合対合物から区別する）ことができる。培地
中のＴＲＡＩＬ−Ｒの存在は、そのタンパク質が細胞から分泌されたことによっ
て、可溶性形の所望のタンパク質であることを示している。

【００１３】 可溶性形の受容体タンパク質は、典型的に、細胞表面上でタンパク質を保持さ
せると考えられる膜貫通領域を欠いている。本発明の一つの実施態様において、
可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、タンパク質の細胞外ドメインを含む。若
干の他の実施態様において、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、その細胞外
ドメインのフラグメントである。可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドには、その
ポリペプチドが生産される細胞からそれが分泌される限り、その細胞質ドメイン
またはその一部分が含まれうる。

【００１４】 可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒの例には、図１若しくは２のアミノ酸５６−２１１まで
（細胞外ドメイン）または図１若しくは２のアミノ酸５６−２０８まで（細胞外
ドメインのフラグメント）を含むポリペプチドが含まれるが、これらに制限され
るわけではない。抗体由来のＦｃポリペプチドに融合した図１または２のアミノ
酸１−２０８までを含む可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをコードしている発
現ベクターを以下の実施例３で記載する。更に別の例には、以下に記載のような
ＴＲＡＩＬ−Ｒのシステインの多い繰返し体を含む細胞外ドメインのフラグメン
トが含まれるが、これらに制限されるわけではない。

【００１５】 可溶性形のＴＲＡＩＬ−Ｒは、膜結合形のタンパク質にまさるいくつかの利点
を有する。組換え体宿主細胞からのタンパク質の精製は、それら可溶性タンパク
質が細胞から分泌されるので容易である。更に、可溶性タンパク質は、概して、
ある種の使用に、例えば、静脈内投与により適している。

【００１６】 本明細書中では、ＴＲＡＩＬ−Ｒフラグメントを提供する。このようなフラグ
メントは、多数の慣用的な技法のいずれかによって製造することができる。望ま
れるペプチドフラグメントは、化学的に合成することができる。それに代わる方
法は、酵素消化によって、例えば、特定のアミノ酸残基によって規定された部位
のタンパク質を切断することが知られている酵素でそのタンパク質を処理するこ
とによってＴＲＡＩＬ−Ｒフラグメントを生じることを行なう。ＴＲＡＩＬ−Ｒ
ＤＮＡを適当な制限酵素で消化して、望まれるポリペプチドフラグメントをコ
ードしているＤＮＡフラグメントを誘導することができる。もう一つの適当な技
法は、望まれるポリペプチドフラグメントをコードしているＤＮＡフラグメント
を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させることを行なう。
ＤＮＡフラグメントの所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５
′および３′プライマーとして用いられる。

【００１７】 ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドフラグメントは、抗体を生じさせる場合に免疫原
として用いることができる。具体的な実施態様は、ＴＲＡＩＬを結合する能力を
保持しているＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドフラグメントに関する。このようなフ
ラグメントは、上記のような可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドであってよい。

【００１８】 具体的な実施態様において、ＴＲＡＩＬ−Ｒフラグメントは、細胞外ドメイン
中で見られるシステインの多い繰返し体モチーフを含む。図１および２のヒトＴ
ＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、残基９８−１３９までを含む第一および残基１４０
−１８１までを含む第二である二つのこのようなシステインの多い繰返し体を含
有する。ＴＮＦ−Ｒファミリーの受容体は、それらの細胞外ドメイン中にこのよ
うなシステインの多い繰返し体を含有する（Ｍａｒｓｔｅｒｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７：５７４７−５７５０，１９９２；Ｓｍｉｔｈら，Ｃｅｌｌ
７６：９５９−９６２，１９９４）。これら繰返し体は、リガンド結合に重要
であると考えられる。説明すると、Ｍａｒｓｔｅｒｓら，上記は、それら繰返し
体の一つを欠いている可溶性ＴＮＦ−Ｒ１型ポリペプチドが、ＴＮＦαおよびＴ
ＮＦβへの結合親和性の１０倍低下を示し、第２の繰返し体の欠失が、それらリ
ガンドの検出可能な結合を完全に失わせたことを報告した。

【００１９】 図１および２の残基１８２−２１１までは、スペーサー領域を構成している。
このスペーサーは、システインの多い繰返し体と膜貫通領域との間に位置する細
胞外ドメインのＣ末端部分である。このようなスペーサー領域は、ＴＮＦ−Ｒフ
ァミリーのいくつかの他のタンパク質で同定されており、報告によれば、リガン
ド結合に重要ではない。スペーサー領域を欠いたＴＲＡＩＬ−Ｒフラグメントを
本明細書中で提供する。

【００２０】 図１および２のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の天然に存在する変異型を本明細書
中で提供する。このような変異型には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング
現象またはＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質のタンパク質分解切断に起因するタンパク
質が含まれる。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、例えば、天然に存在する可
溶性形タンパク質のような、切断されているが（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）生物学的
に活性なＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質を生じることができる。タンパク質分解に起
因する変異には、例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質からの１個またはそれ以上
の末端アミノ酸（概して、１−５個の末端アミノ酸）のタンパク質分解除去によ
る、異なった種類の宿主細胞中の発現でのＮ末端またはＣ末端の相違が含まれる
。アミノ酸配列の相違が遺伝的多形性（タンパク質を生産する個体間の対立遺伝
子変動）に起因するＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質も、本明細書中に包含される。

【００２１】 当業者は、シグナルペプチドが切断される１か所または複数の位置が計算機プ
ログラムによって予測される位置とは異なることがありうるし、組換え体ＴＲＡ
ＩＬ−Ｒポリペプチドを発現させる場合に用いられる宿主細胞の種類のような因
子によって変化しうることも理解するであろう。タンパク質調製品には、２か所
以上の部位のシグナルペプチドの切断に起因する異なったＮ末端アミノ酸を有す
るタンパク質分子の混合物が含まれうる。

【００２２】 ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の種々のドメインの本明細書中での考察に関して、
当業者は、そのタンパク質のこのような領域の上記境界が近似であることを理解
するであろう。詳しく説明すると、膜貫通領域の境界は（その目的に利用可能な
計算機プログラムを用いることによって予測されうる）、上記のものと異なるこ
とがありうる。したがって、細胞外ドメインのＣ末端がそのように上に規定され
た残基とは異なる可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドも、本明細書中に包含され
る。

【００２３】 他の天然に存在するＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡおよびポリペプチドには、非ヒト
種に由来するものが含まれる。例えば、図１または２のヒトＴＲＡＩＬ−Ｒの他
の哺乳動物種からの同族体は、本明細書中に包含される。図１または２のヒトＤ
ＮＡ配列に基づくプローブは、種間ハイブリダイゼーション技術を用いて他の哺
乳動物種に由来するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いること
ができる。

【００２４】 ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列は、本明細書中で開示される天然の配列と異なっ
ていてよい。二つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードしている遺伝コードの既
知の縮重のために、ＤＮＡ配列は、図１（配列番号：１）または図２（配列番号
：３）で示される配列と異なることがありうるが、それらの図で示されるアミノ
酸配列（それぞれ、配列番号：２または４）を有するＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質
をなおコードしている。このような変異ＤＮＡ配列は、サイレント突然変異（例
えば、ＰＣＲ増幅中に生じる）に起因しうるし、または天然の配列の意図的突然
変異誘発の産物でありうる。したがって、本明細書中で提供されるＤＮＡ配列の
中には、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ配列（例えば、図１または２で示されるヌクレオ
チド配列を含むｃＤＮＡ）および遺伝コードの結果として天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ
ＤＮＡ配列に縮重するＤＮＡがある。

【００２５】 本明細書中で提供されるＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの中には、天然のＴＲＡ
ＩＬ−Ｒの生物学的活性を保持している天然のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの変
異型がある。このような変異型には、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒに実質的に相同であ
るが、一つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のために天然のＴＲＡＩＬ−
Ｒの場合と異なったアミノ酸を有するポリペプチドが含まれる。具体的な実施態
様には、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ配列と比較した場合にアミノ酸残基の１−１０種
類の欠失、挿入または置換を含むＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが含まれるが、こ
れらに制限されるわけではない。本発明のＴＲＡＩＬ−ＲエンコーディングＤＮ
Ａには、一つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のために天然のＴＲＡＩＬ
−Ｒ ＤＮＡ配列とは異なっているが、生物学的に活性なＴＲＡＩＬ−Ｒポリペ
プチドをコードしている変異型が含まれる。ＴＲＡＩＬ−Ｒの一つの生物学的活
性は、ＴＲＡＩＬを結合する能力である。

【００２６】 中程度のストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下で図１または２の
ＤＮＡにハイブリッド形成でき、しかも生物学的に活性なＴＲＡＩＬ−Ｒをコー
ドしている核酸分子を本明細書中で提供する。このようなハイブリッド形成性核
酸には、変異ＤＮＡ配列および非ヒト種、例えば、非ヒト哺乳動物に由来するＤ
ＮＡが含まれるが、これらに制限されるわけではない。

【００２７】 中程度のストリンジェント条件には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２
版，１巻，１．１０１−１０４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９で記載された条件が含まれる。Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋらによって定義されたような中程度のストリンジェント条件には、
５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予洗液の
使用および約５５℃、５×ＳＳＣ、一晩中のハイブリダイゼーション条件が含ま
れる。高ストリンジェント条件には、より高いハイブリダイゼーションおよび洗
浄温度が含まれる。本発明の一つの実施態様は、高ストリンジェント条件であっ
て、６８℃でのハイブリダイゼーション後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中
において６３−６８℃で洗浄することを含む条件下で図１または２のＤＮＡにハ
イブリッド形成するＤＮＡ配列に関する。

【００２８】 本明細書中で提供される若干のＤＮＡおよびポリペプチドは、それぞれ、天然
のＴＲＡＩＬ−Ｒ配列と少なくとも８０％同一のヌクレオチドまたはアミノ酸配
列を含む。更に包含されるのは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡまたはポリペプチドが
、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ配列と少なくとも９０％同一の、少なくとも９５％同一
のまたは少なくとも９８％同一の配列を含む実施態様である。

【００２９】 その同一性パーセントは、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって記載され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰ計算機プログラム 第６版を用いて配
列情報を比較することによって決定することができる。ＧＡＰプログラムに好ま
しいデフォルトパラメーターには、（１）ヌクレオチドについてのユナリー比較
マトリックス（一致には１および不一致には０の値を含有する）、およびＳｃｈ
ｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３−３５８頁，
１９７９ によって記載されたようなＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリッ
クス；（２）それぞれのギャップに３．０のペナルティーおよびそれぞれのギャ
ップ中のそれぞれの記号に追加の０．１０ペナルティー；および（３）末端ギャ
ップにはペナルティーなしが含まれる。フラグメントについての同一性パーセン
トは、そのフラグメントの配列を天然のＴＲＡＩＬ−Ｒの該当部分と比較するこ
とによって計算される。

【００３０】 本発明の具体的な実施態様において、変異型ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、
アミノ酸配列が天然のＴＲＡＩＬ−Ｒと異なるが、生物学的活性は天然のＴＲＡ
ＩＬ−Ｒと実質的に等しい。一つの例は、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒの場合と本質的
に同様の結合親和性でＴＲＡＩＬを結合する変異型ＴＲＡＩＬ−Ｒである。結合
親和性は、例えば、米国特許第５，５１２，４５７号で記載のような慣用法によ
って測定することができる。

【００３１】 変異アミノ酸配列は、１種類または複数の保存的置換を含んでいてよく、これ
は天然のＴＲＡＩＬ−Ｒの１個またはそれ以上のアミノ酸残基が別の残基によっ
て置き換えられているが、保存的に置換されたＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、
天然のタンパク質の望まれる生物学的活性（例えば、ＴＲＡＩＬを結合する能力
）を保持している、ということを意味する。ある与えられたアミノ酸は、同様の
生理化学的特性を有する残基によって置き換えることができる。保存的置換の例
には、１個の脂肪族残基がＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａなどの別のもの
に代わる互いの置換、または１個の極性残基が別のものに代わる置換、例えばＬ
ｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎなどの間、が含まれる。
他の保存的置換、例えば、同様の疎水性を有する領域全部の置換を行なうことは
周知である。

【００３２】 変異体のもう一つの例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコー
ドしている配列を、そのＣｙｓ残基を欠失させるまたは他のアミノ酸で置き換え
るように変更して、再生時の誤った分子内ジスルフィド橋の形成を防止すること
ができる。上記のシステインの多い繰返し体ドメイン中のシステイン残基は、Ｔ
ＲＡＩＬ結合活性の保持が望まれる場合、好都合にＴＲＡＩＬ−Ｒ変異体中で未
変更のままである。

【００３３】 他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が示されている酵母系での発現を促
進するように、隣接する二塩基アミノ酸残基の修飾によって製造される。ＥＰ２
１２，９１４号は、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を失
活させる部位特異的突然変異誘発の使用を開示している。ＫＥＸ２プロテアーゼ
プロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ対、Ａｒｇ−Ｌｙｓ対およびＬｙｓ−Ａｒ
ｇ対を変更してこれら隣接する塩基性残基を生じさせないように残基を欠失させ
る、付加するまたは置換することによって失活する。ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒは、図
１および２のアミノ酸７５−７６、２３３−２３４、２６０−２６１、２６１−
２６２、３２８−３２９および３２９−３３０にこのような隣接する塩基性残基
対を含有する。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断をほとんど受けず、Ａｒｇ
−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位の失
活への保存的で且つ好ましいアプローチを示す。

【００３４】 また他の変異体では、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ中のＮ−グリコシル化部位を失活
させる。Ｎ−グリコシル化部位は、グリコシル化を妨げて、哺乳動物および酵母
発現系においてより相同で炭水化物を減じた類似体を発現させるように、修飾す
ることができる。真核性ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸ト
リプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙを特徴とし、ここにおいて、ＸはＰｒｏ以外の任意の
アミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。図１および２のＴＲＡＩＬ−
Ｒタンパク質は、３種類のこのようなトリプレットをアミノ酸１２７−１２９、
１７１−１７３および１８２−１８４に含んでいる。これらトリプレットをコー
ドしているヌクレオチド配列への適当な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖へ
の炭水化物残基の結合を防止するであろう。例えば、Ａｓｎが別のアミノ酸によ
って置き換えられるように選択される単一ヌクレオチドの変更は、Ｎ−グリコシ
ル化部位を失活させるのに充分である。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を
失活させるための既知の手順には、本明細書中に援用される米国特許第５，０７
１，９７２号およびＥＰ２７６，８４６号で記載されたものが含まれる。

【００３５】 変異体およびフラグメントも含めたＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、任意の適
当な検定で生物学的活性について調べることができる。ＴＲＡＩＬを結合するＴ
ＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの能力は、慣用的な結合検定で確認することができ、
それらの例を後述する。

【００３６】 発現系 本発明は、更に、ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡを含有する組換え体クローニングお
よび発現ベクター、並びにそれら組換え体ベクターを含有する宿主細胞を提供す
る。ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡを含む発現ベクターは、ＤＮＡによってコードされ
たＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを製造するのに用いることができる。ＴＲＡＩＬ
−Ｒポリペプチドを製造する方法は、ＴＲＡＩＬ−Ｒをコードしている組換え体
発現ベクターで形質転換された宿主細胞をＴＲＡＩＬ−Ｒの発現を促進する条件
下で培養した後、発現されたＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをその培養物から回収
することを含む。当業者は、発現されたＴＲＡＩＬ−Ｒを精製する手順が、用い
られる宿主細胞の種類などの因子によって、およびＴＲＡＩＬ−Ｒが膜に結合し
た形であるかまたは宿主細胞から分泌される可溶性形であるかどうかによって異
なることを理解するであろう。

【００３７】 いずれか適当な発現系を用いることができる。それらベクターには、哺乳動物
、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来するものなどの、適当な転写または
翻訳調節ヌクレオチド配列に機能的に結合したＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをコ
ードしているＤＮＡが含まれる。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレ
ーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻
訳の開始および終結を制御する適当な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、そ
の調節配列がＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列に機能的に関係している場合に、機能
的に結合している。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモ
ーターヌクレオチド配列がＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列の転写を制御しているな
らば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列に機能的に結合している。所望の宿主細胞中
で複製する能力を与える複製起点、および形質転換細胞を識別させる選択遺伝子
は、概して、発現ベクター中に包含される。

【００３８】 更に、（天然のまたは異型の）適当なシグナルペプチドをコードしている配列
は、発現ベクター中に包含することができる。シグナルペプチドのＤＮＡ配列（
分泌リーダー）は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ配列にフレーム内で融合させることができる
ので、そのＴＲＡＩＬ−Ｒは、そのシグナルペプチドを含む融合タンパク質とし
て最初に翻訳される。予定の宿主細胞中で機能性であるシグナルペプチドは、Ｔ
ＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの細胞外分泌を促進する。そのシグナルペプチドは、
細胞からのＴＲＡＩＬ−Ｒの分泌の際に、そのＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドから
切断される。

【００３９】 ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母ま
たは高等真核細胞が含まれる。哺乳動物または昆虫細胞は、概して、宿主細胞と
しての使用に好ましい。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主と一緒に用い
るのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
エルゼビル，ニューヨーク（１９８５）に記載されている。細胞不含翻訳系も、
本明細書中で開示されるＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてＴＲＡＩＬ−Ｒ
ポリペプチドを製造するのに用いられると考えられる。

【００４０】 原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌または
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）が含まれる。形質転換に適した原核生物宿主細胞
には、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズ
ミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびシュー
ドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属内の様
々な他の種が含まれる。大腸菌などの原核生物宿主細胞において、ＴＲＡＩＬ−
Ｒポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を含んで、その原核生物宿主細胞中で
の組換え体ポリペプチドの発現を容易にすることができる。そのＮ末端Ｍｅｔは
、発現された組換え体ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドから切断することができる。

【００４１】 原核生物宿主細胞中で用いるための発現ベクターは、概して、１種類またはそ
れ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子
は、例えば、抗生物質耐性を与えるまたは独立栄養要求を与えるタンパク質をコ
ードしている遺伝子である。原核生物宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、
クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）などの商業的に入
手可能なプラスミドに由来するものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン
およびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有するので、形質転換された細胞を識
別するための簡単な手段を提供する。適当なプロモーターおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ
ＤＮＡ配列は、ｐＢＲ３２２ベクター中に挿入される。他の商業的に入手可能
なベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ウプサラ，スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，マディソン，ＷＩ，米国）が含まれる。

【００４２】 組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに一般的に用いられるプロモーター配列
には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈ
ａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら
，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロ
モーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７
，１９８０；およびＥＰ−Ａ−３６７７６号）およびｔａｃプロモーター（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，４１２頁，１９８２）が含まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系
は、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー
配列を用いる。そのλＰＬプロモーターの誘導体を包含するＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なプラスミドベ
クターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９内在，ＡＴＣＣ ３７０
９２）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌株ＲＲ１内在，ＡＴＣＣ ５３０８２）が含
まれる。

【００４３】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、或いは、酵母宿主細胞中で、好ましくは、サッカロミセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から
発現させることができる。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロミセス属
（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母の他の属も用いることができる。酵
母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配
列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のた
めの配列および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。酵母ベクターに適
したプロモーター配列には、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，
１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、
ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅ
ｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）が含まれる。酵母発現で用いるための他
の適当なベクターおよびプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，ＥＰＡ−７３，６
５７号で更に記載されている。もう一つの選択肢は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）および Ｂｅｉｅｒら（Ｎａ
ｔｕｒｅ ３００：７２４，１９８２）によって記載されたグルコース抑制性Ａ
ＤＨ２プロモーターである。酵母でも大腸菌でも複製可能なシャトルベクターは
、大腸菌中での選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ
ｒ遺伝子および複製起点）を上記酵母ベクター中に挿入することによって構築す
ることができる。

【００４４】 酵母α因子リーダー配列は、ＴＲＡＩＬポリペプチドの分泌を支配するのに用
いることができる。そのα因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列と
構造遺伝子配列との間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，Ｃｅｌｌ ３０
：９３３，１９８２およびＢｉｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８１：５３３０，１９８４を参照されたい。酵母宿主からの組換
え体ポリペプチドの分泌を促進させるのに適した他のリーダー配列は、当業者に
知られている。リーダー配列は、１個またはそれ以上の制限部位を含有するよう
にその３′末端付近を修飾することができる。これは、構造遺伝子へのリーダー
配列の融合を容易にするであろう。

【００４５】 酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られている。一つのこのようなプロ
トコールは、Ｈｉｎｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７５：１９２９，１９７８によって記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロト
コールは、選択培地中でＴｒｐ⁺形質転換体を選択するが、ここにおいて、この 選択培地は、０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、
１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルから成る。

【００４６】 ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターによって形質転換された酵母宿
主細胞は、“リッチ”培地中で発現させるために成長させることができる。リッ
チ培地の例は、１％酵母抽出物、２％ペプトン、および８０μｇ／ｍｌアデニン
および８０μｇ／ｍｌウラシルを補足した１％グルコースから成るものである。
ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地からグルコースが消耗した時に起こる
。

【００４７】 哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系も、組換え体ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド
を発現させるのに用いることができる。昆虫細胞中での異型タンパク質の生産の
ためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によって総説されている。哺乳動物
起原の樹立細胞系も用いることができる。適当な哺乳動物宿主細胞系の例には、
サル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら
，Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（
ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈ
ｅＬａ細胞およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、およびＭｃＭａｈ
ａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１）によって記載のアフリカミ
ドリザル腎細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮ
Ａ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）が含まれる。

【００４８】 哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノム
から作成することができる。一般的に用いられるプロモーター配列およびエンハ
ンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲ
ノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初期および後期プロモ
ーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動
物宿主細胞での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝因子を与えることができ
る。ウイルス初期および後期プロモーターは、両方とも、ウイルス複製起点を含
有し得るフラグメントとしてウイルスゲノムから容易に得られるので、特に有用
である（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９７８）。より小さ
いまたはより大きいＳＶ４０フラグメントも、ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に
位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に向けて伸長する約２５０ｂｐ配
列が包含されるという条件ならば、用いることができる。

【００４９】 哺乳動物宿主細胞中で用いるための発現ベクターは、例えば、Ｏｋａｙａｍａ
およびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）によっ
て開示されたように構築することができる。Ｃ１２７ネズミ***上皮細胞中での
哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的に、Ｃｏｓｍａｎ
ら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）によって記載されたよ
うに構築することができる。Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８，
１９８４ によって記載された高発現ベクターＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴ
ＣＣ ３９８９０として寄託されている。更に別の哺乳動物発現ベクターは、Ｅ
Ｐ−Ａ−０３６７５６６号およびＷＯ９１／１８９８２号で記載されている。一
つの選択肢として、そのベクターはレトロウイルスに由来してもよい。

【００５０】 ＴＲＡＩＬ−Ｒを製造するのに用いることができるシグナルペプチドに関して
、ＴＲＡＩＬ−Ｒの天然のシグナルペプチドは、所望により、異型シグナルペプ
チドまたはリーダー配列によって置き換えることができる。シグナルペプチドま
たはリーダーの選択は、組換え体ＴＲＡＩＬ−Ｒが生産される宿主細胞の種類な
どの因子に依ることができる。説明すると、哺乳動物宿主細胞中で機能性である
異型シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号で記載された
インターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１２：７６８（１９８４）で記載されたインターロイキン−２受容体の
シグナル配列；ＥＰ３６７，５６６号で記載されたインターロイキン−４受容体
シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号で記載されたＩ型インター
ロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ４６０，８４６号で記載され
たＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。もう一つの
例は、本明細書中に援用されるＷＯ９７／０１６３３号で記載のサイトメガロウ
イルスに由来するリーダーペプチドである。精製タンパク質 本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、上記のような組換え体発現系によっ
て生産することができるし、または天然に存在する細胞から精製することができ
る。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、慣用的なタンパク質精製技術を用いることができる多数
の適当な方法のいずれかによって精製することができる。当業者に知られている
ように、ある与えられたタンパク質を精製する手順は、除去される混入物の種類
などの因子によって選択され、ＴＲＡＩＬ−Ｒを発現する特定の細胞によって変
更することができる。組換え体タンパク質についての他の要件には、用いられる
特定の発現系、および所望のタンパク質が培地中に分泌されるか否かが含まれる
。

【００５１】 一つの方法では、そのタンパク質を発現する細胞を、凍結−融解サイクル、音
波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含めた多数の既知の技法のいずれ
かによって破壊する。或いは、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒを発現させ、細胞から分泌
させることができる。引続きの精製法には、例えば、ＴＲＡＩＬを含有するクロ
マトグラフィーマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーが含ま
れうる。そのクロマトグラフィーマトリックスは、代わりに、ＴＲＡＩＬ−Ｒを
結合する抗体を含んでよい。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、慣用的な技法（例
えば、高塩緩衝液中への溶離）を用いてアフィニティークロマトグラフィーカラ
ムから回収した後、使用のために低塩緩衝液中に透析することができる。

【００５２】 適当なアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの一例は、Ｆｌａｇ（
登録商標）−ＴＲＡＩＬアフィゲル（ａｆｆｉ−ｇｅｌ）カラム（アフィゲルビ
ーズ１ｍｌに結合した１０ｍｇの組換え体タンパク質）である。アフィゲル支持
体は、誘導体化された架橋アガロースゲルビーズのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，リッチモンド，ＣＡか
ら入手可能）である。上で論評されたように、Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチドＡ
ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号：
５）は、特定のモノクローナル抗体によって可逆的に結合したエピトープを与え
、発現された組換え体タンパク質の迅速な検定および容易な精製を可能にする。
Ｆｌａｇ（登録商標）−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（可溶性ＴＲＡＩＬポリペプ
チドに融合したＦｌａｇ（登録商標）を含む）の精製は、本明細書中に援用され
るＰＣＴ出願ＷＯ９７／０１６３３号で更に記載されている。そのＦｌａｇ（登
録商標）−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質を、慣用的な技法によってアフィゲルビー
ズに結合させる。

【００５３】 もう一つのアプローチでは、組換え体タンパク質を分泌する発現系を用いる場
合、最初に、その培地を、商業的に入手可能な濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉ
ｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮
することができる。濃縮工程後、その濃縮物を、ゲル濾過マトリックスなどの精
製マトリックスに加えることができる。或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジ
エチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側基を有するマトリックスまたは基質を用いる
ことができる。それらマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキスト
ラン、セルロース、またはタンパク質精製で一般的に用いられる他の支持体材料
でありうる。或いは、陽イオン交換工程を用いることができる。適当な陽イオン
交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マ
トリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。更に、１回またはそれ以
上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を、疎水性ＲＰ
−ＨＰＬＣ基剤（例えば、メチルまたは他の脂肪族側基を有するシリカゲル）を
用いて行なうことができる。前述の精製工程のいくつかまたは全てを、様々な組
合せで行なうことができる。

【００５４】 細菌培養物中で生産される組換え体タンパク質は、最初の宿主細胞の破壊、遠
心分離、不溶性ポリペプチドならば細胞ペレットから、または可溶性ポリペプチ
ドならば上澄み液からの抽出、続いて、１回またはそれ以上の濃縮、塩析、イオ
ン交換、アフィニティー精製、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程によっ
て単離することができる。最後に、ＲＰ−ＨＰＬＣを最終精製工程に用いること
ができる。微生物細胞は、凍結−融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細
胞溶解剤の使用を含めたいずれか好都合な方法によって破壊することができる。

【００５５】 酵母宿主細胞中において、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、好ましくは、分泌ポリペプチド
として発現されて、精製を容易にする。酵母宿主細胞発酵から分泌される組換え
体ポリペプチドは、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，
１９８４）によって開示されたのと同様の方法によって精製することができる。
Ｕｒｄａｌらは、分離用ＨＰＬＣカラム上での組換え体ヒトＩＬ−２の精製のた
めに２回連続した逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。

【００５６】 所望の精製度は、予定のタンパク質使用に依る。比較的高い精製度は、例えば
、そのタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ投与する場合に望まれる。好都合には、ＴＲ
ＡＩＬ−Ｒポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）による分析で他の（非ＴＲＡＩＬ−Ｒ）タンパク質に該当するタン
パク質バンドが検出できないように精製する。当業者は、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパ
ク質に該当する多数のバンドを、示差的グリコシル化、示差的翻訳後プロセシン
グ等により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化することができることを理解する
であろう。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、最も好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で
単一タンパク質バンドによって示されるように実質的に均一になるまで精製され
る。そのタンパク質バンドは、銀染色、クーマシーブルー染色、または（そのタ
ンパク質が放射性標識されているならば）オートラジオグラフィーによって可視
化することができる。オリゴマー形のＴＲＡＩＬ−Ｒ 本発明によって包含されるのは、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含有するオリ
ゴマーである。ＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーは、共有結合または非共有結合した二
量体、三量体または高級オリゴマーの形であってよい。

【００５７】 本発明の一つの実施態様は、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに融合したペプチド
残基間の共有結合または非共有結合相互作用によって結合した多数のＴＲＡＩＬ
−Ｒポリペプチドを含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチド
リンカー（スペーサー）であってよいし、またはオリゴマー化を促進する性状を
有するペプチドであってよい。ロイシンジッパー、および抗体に由来する若干の
ポリペプチドは、下により詳細に記載されるように、それらに結合したＴＲＡＩ
Ｌ−Ｒポリペプチドのオリゴマー化を促進しうるペプチド中にある。

【００５８】 具体的な実施態様において、それらオリゴマーは、２−４個のＴＲＡＩＬ−Ｒ
ポリペプチドを含む。そのオリゴマーのＴＲＡＩＬ−Ｒ残基は、上記のような可
溶性ポリペプチドであってよい。

【００５９】 一つの選択肢として、ＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーは、免疫グロブリンに由来す
るポリペプチドを用いて製造される。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含
めた）の様々な部分に融合した若干の異型ポリペプチドを含む融合タンパク質の
製造は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５
，１９９１）；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）；Ｈｏ
ｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，補遺４，１０．１
９．１−１０．１９．１１頁，１９９２中）；Ｓｍｉｔｈら（Ｃｅｌｌ ７３：
１３４９−１３６０，１９９３）；およびＦａｎｓｌｏｗら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１４９：６５５−６６０，１９９２）によって記載されている。

【００６０】 本発明の一つの実施態様は、抗体のＦｃ領域にＴＲＡＩＬ−Ｒを融合すること
によって生じた２個の融合タンパク質を含むＴＲＡＩＬ−Ｒ二量体に関する。そ
のＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質をコードしている遺伝子融合は、適当な
発現ベクター中に挿入される。ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質は、組換え
体発現ベクターで形質転換された宿主細胞中で発現し、抗体分子のように集合し
、そこで、鎖間ジスルフィド結合がそれらＦｃ残基間に形成して、二価のＴＲＡ
ＩＬ−Ｒを生じる。

【００６１】 本明細書中で提供されるのは、抗体に由来するＦｃポリペプチドに融合したＴ
ＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含む融合タンパク質である。このような融合タンパ
ク質をコードしているＤＮＡ、更には、それら融合タンパク質のＦｃ残基間のジ
スルフィド結合によって結合した２個の融合タンパク質を含有する二量体も提供
する。本明細書中で用いられる“Ｆｃポリペプチド”という用語は、抗体のＦｃ
領域に由来するポリペプチドの天然の形およびムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）の形を
含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断
された形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）も含まれる。

【００６２】 ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１号（本明細書中に援用される）で記載された
一つの適当なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域からＦ
ｃ領域の天然のＣ末端まで伸長する単鎖ポリペプチドである。もう一つの有用な
Ｆｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭ
ＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１，１９９４）で記載されたＦｃムテインで
ある。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変更
され、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変更され、そしてアミノ酸２２がＧｌ
ｙからＡｌａに変更されていることを除き、ＷＯ９３／１０１５１号で示された
天然のＦｃ配列のそれと一致する。そのムテインは、Ｆｃ受容体への減少した親
和性を示す。

【００６３】 他の実施態様において、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、抗体重鎖または軽鎖の可変部に置
換することができる。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方と一緒に製造
されるならば、４個程度のＴＲＡＩＬ−Ｒ細胞外領域を含むＴＲＡＩＬ−Ｒオリ
ゴマーを形成することが可能である。

【００６４】 或いは、そのオリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を伴う
または伴わない多数のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含む融合タンパク質である
。適当なペプチドリンカーの中には、本明細書中に援用される米国特許第４，７
５１，１８０号および第４，９３５，２３３号で記載されたものがある。望まし
いペプチドリンカーをコードしているＤＮＡ配列は、いずれか適当な慣用的技法
を用いて、ＴＲＡＩＬ−ＲをコードしているＤＮＡ配列の間に、およびそれらと
同様の読み枠中に挿入することができる。例えば、そのリンカーをコードしてい
る化学合成オリゴヌクレオチドは、ＴＲＡＩＬ−Ｒをコードしている配列間に連
結することができる。具体的な実施態様において、融合タンパク質は、ペプチド
リンカーによって隔てられた２−４個の可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含
む。

【００６５】 オリゴマーＴＲＡＩＬ−Ｒを製造するもう一つの方法は、ロイシンジッパーの
使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオ
リゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、いくつかのＤＮＡ
結合タンパク質中で最初に同定されたが（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１７５９，１９８８）、以来、種々様々なタンパク質中で見出さ
れている。既知のロイシンジッパーの中には、天然に存在するペプチドおよび二
量体化するまたは三量体化するそれらの誘導体がある。可溶性オリゴマータンパ
ク質を製造するのに適したロイシンジッパードメインの例は、本明細書中に援用
されるＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８号で記載され、肺サーファクタントタン
パク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，１９９４）で記載されている。ロイシンジッ
パーに融合した異型タンパク質の安定な三量体化を可能にする修飾ロイシンジッ
パーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら（Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−
２７８，１９９４）で記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合した可
溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含む組換え体融合タンパク質は、適当な宿主
細胞中で発現し、形成される可溶性オリゴマーＴＲＡＩＬ−Ｒは、その培養物上
清から回収される。

【００６６】 オリゴマーＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＲＡＩＬへの２価、３価等結合部位の性状を
有する。Ｆｃ残基（およびそれらから形成されるオリゴマー）を含む上記融合タ
ンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマ
トグラフィーによる容易な精製の利点を与える。オリゴマーＴＲＡＩＬ−Ｒをコ
ードしている、またはＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーを製造する場合に有用な融合タ
ンパク質をコードしているＤＮＡ配列を本明細書中で提供する。検定 ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質（ＴＲＡＩＬ−Ｒのフラグメント、変異型、オリゴ
マーおよび他の形を含めた）は、いずれか適当な検定でＴＲＡＩＬを結合する能
力について調べることができる。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、検出可能な試薬（例えば、
放射性核種、発色団、比色定量または蛍光定量反応を触媒する酵素等）で標識す
ることができる。標識されたＴＲＡＩＬ−Ｒを、ＴＲＡＩＬを発現する細胞と接
触させる。次に、それら細胞を洗浄して、結合していない標識ＴＲＡＩＬ−Ｒを
除去し、細胞に結合した標識の存在を、標識の性質によって選択される適当な技
法によって確認する。

【００６７】 結合検定法の一例は、次の通りである。ＴＲＡＩＬ ｃＤＮＡを含有する組換
え体発現ベクターを、例えば、本明細書中に援用されるＰＣＴ出願ＷＯ９７／０
１６３３号で記載されたように構築する。ヒトおよびマウスのＴＲＡＩＬについ
てのＤＮＡおよびアミノ酸配列情報は、ＷＯ９７／０１６３３号で示されている
。ＴＲＡＩＬは、Ｎ末端細胞質ドメイン、膜貫通領域およびＣ末端細胞外ドメイ
ンを含む。１０ｃｍ²皿中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を、その組換え体発現ベ クターでトランスフェクションする。ＣＶ１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １０４７８）は、ＣＭＶ即時型エンハンサー／プロモーターから作動する
ＥＢＶ核抗原−１を構成性発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎ
ら（ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１）によって記載されたように、ア
フリカミドリザル腎細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来した。

【００６８】 それらトランスフェクションされた細胞を２４時間培養した後、各皿中の細胞
を２４ウェルプレート中に分割する。更に４８時間培養後、それらトランスフェ
クションされた細胞（細胞約４×１０⁴個／ウェル）を、５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉 乳を加えた結合用培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌアジ
化ナトリウム、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２を含有するＲＰＭＩ １６４
０）であるＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。次に、それら細胞を、種々の濃度の可溶
性ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質と一緒に３７℃で１時間インキュベート
する。次に、細胞を洗浄し、結合用培地中で一定飽和濃度の¹²⁵Ｉ−マウス抗ヒ トＩｇＧと一緒に３７℃で静かに撹拌しながら１時間インキュベートする。充分
な洗浄後、細胞はトリプシン化によって放出される。

【００６９】 上で用いられるマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けら
れ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，ウェスト・グローブ，ＰＡから入手できる。その抗体を、標準的
なクロラミン−Ｔ法を用いて放射性ヨウ素化する。その抗体は、細胞に結合した
いずれのＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分にも結合するであろう。全
ての検定において、¹²⁵Ｉ−抗体の非特異的結合を、ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃの不 存在下で、更には、ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃおよび２００倍モル過剰の未標識マウ
ス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下で検定する。

【００７０】 細胞に結合した¹²⁵Ｉ−抗体を、Ｐａｃｋａｒｄ Ａｕｔｏｇａｍｍａカウン ターで定量する。親和性計算値（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）は、Ｍｉｃｒｏｖａｘ計算機で行なわれ
るＲＳ／１（ＢＢＮ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ボストン，ＭＡ）で生じる。

【００７１】 適当な結合検定のもう一つの種類は、競合的結合検定である。説明すると、Ｔ
ＲＡＩＬ−Ｒ変異型の生物学的活性は、ＴＲＡＩＬへの結合に関して天然のＴＲ
ＡＩＬ−Ｒと競合するそれら変異型の能力について検定することによって測定す
ることができる。

【００７２】 競合的結合検定は、慣用法によって行なうことができる。競合的結合検定で用
いることができる試薬には、放射性標識されたＴＲＡＩＬ−Ｒ、および細胞表面
上でＴＲＡＩＬ（内因性または組換え体）を発現する無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細
胞が含まれる。例えば、放射性標識された可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒフラグメントは
、細胞表面ＴＲＡＩＬへの結合に関して可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ変異型と競合させ
るのに用いることができる。無傷の細胞の代わりに、Ｆｃ残基とプロテインＡま
たはプロテインＧ（固相上）の相互作用によって固相に結合した可溶性ＴＲＡＩ
Ｌ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質を代用しうると考えられる。プロテインＡおよびプ
ロテインＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ピスカタウェイ，ＮＪから入手可能なものが含まれる
。競合的結合検定のもう一つの種類は、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパ
ク質、およびＴＲＡＩＬ−Ｒを発現する無傷の細胞などの放射性標識された可溶
性ＴＲＡＩＬを利用する。定性結果は、競合的オートラジオグラフプレート結合
検定によって得ることができるが、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット（Ｓｃａｔｃｈ
ａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）は、定
量結果を生じるのに利用できる。

【００７３】 生物学的活性の検定のもう一つの種類は、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを、例
えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞として知られるヒト白血病Ｔ細胞系などの標的細胞のＴ
ＲＡＩＬ媒介アポトーシスを阻止する能力について調べることを行なう。Ｊｕｒ
ｋａｔクローンＥ６−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １５２）と称される細胞系のＴＲ
ＡＩＬ媒介アポトーシスは、本明細書中に援用されるＰＣＴ出願ＷＯ９７／０１
６３３号で記載された検定法で示される。ＴＲＡＩＬ−Ｒの使用 ＴＲＡＩＬ−Ｒの使用には、次が含まれるが、これらに制限されるわけではな
い。ＴＲＡＩＬ−Ｒのこれら使用のいくつかは、ＴＲＡＩＬを結合するその能力
に由来する。

【００７４】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、タンパク質精製試薬として用いられる。ＴＲＡＩＬ−Ｒポ
リペプチドは、固体支持体材料に結合しうるし、アフィニティークロマトグラフ
ィーによってＴＲＡＩＬタンパク質を精製するのに用いることができる。具体的
な実施態様において、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド（ＴＲＡＩＬを結合できる本
明細書中で記載された全ての形の）を、慣用法によって固体支持体に結合させる
。一例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反応する官能基を含有す
るクロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ピスカタウェイ，ＮＪ）。他の選択肢として、ＴＲＡＩＬ−
Ｒ／Ｆｃタンパク質を、プロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィ
ーカラムにそのＦＣ残基との相互作用によって結合させる。

【００７５】 ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質も、ＴＲＡＩＬタンパク質のＴＲＡＩＬ−Ｒへの結
合親和性に関してそれらの生物学的活性を測定する場合に用いられる。したがっ
て、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、例えば、種々の条件下でＴＲＡＩＬタンパク
質の保存寿命および安定性を監視する“品質保証”実験を行なう人々によって用
いられ得る。詳しく説明すると、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、種々の温度で貯蔵されたま
たは種々の細胞種類で生産されたＴＲＡＩＬタンパク質の生物学的活性を測定す
る結合親和性実験で用いることができる。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＲＡＩＬタンパ
ク質の修飾（例えば、化学修飾、切断、突然変異等）後に生物学的活性が保持さ
れるかどうか確認するのに用いることもできる。修飾ＴＲＡＩＬタンパク質のＴ
ＲＡＩＬ−Ｒへの結合親和性を、未修飾ＴＲＡＩＬタンパク質のそれと比較して
、ＴＲＡＩＬの生物学的活性へのそれら修飾の何等かの悪影響を検出する。した
がって、ＴＲＡＩＬタンパク質の生物学的活性は、例えば、検査研究でそれを用
いる前に確認することができる。

【００７６】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、細胞表面上でＴＲＡＩＬを発現する細胞を精製するまたは
識別する場合にも用いられる。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを、カラムクロマト
グラフィーマトリックスまたは類似の適当な基質などの固相に結合させる。例え
ば、磁性微小球をＴＲＡＩＬ−Ｒで被覆し、インキュベーション容器中で磁場に
よって保持することができる。ＴＲＡＩＬ発現性細胞を含有する細胞混合物の懸
濁液を、固相上にＴＲＡＩＬ−Ｒを有するその固相と接触させる。細胞表面上で
ＴＲＡＩＬを発現する細胞は、固定されたＴＲＡＩＬ−Ｒに結合し、続いて、非
結合細胞を洗浄除去する。

【００７７】 或いは、ＴＲＡＩＬ−Ｒを検出可能な残基に結合させた後、ＴＲＡＩＬ発現に
ついて調べるための細胞と一緒にインキュベートすることができる。インキュベ
ーション後、結合していない標識ＴＲＡＩＬ−Ｒを除去し、それら細胞上の検出
可能残基の存在または不存在を確認する。

【００７８】 更に別の場合、ＴＲＡＩＬ⁺細胞を含有すると思われる細胞の混合物を、ビオ チニル化ＴＲＡＩＬ−Ｒと一緒にインキュベートする。インキュベーション時間
は、典型的に、確実に充分に結合させるように継続して少なくとも１時間である
。次に、得られた混合物を、アビジン被覆ビーズを充填したカラムに通過させる
ことによって、ビオチンのアビジンへの高い親和性により、所望の細胞がビーズ
に結合する。アビジン被覆ビーズを用いる手順は知られている（Ｂｅｒｅｎｓｏ
ｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９，１９８６を参照され
たい）。非結合物質を除去する洗浄および結合細胞の放出は、慣用法を用いて行
なわれる。

【００７９】 ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、それらに結合した薬剤を、ＴＲＡＩＬを含有
する細胞に送達するための担体としても用いられる。ＴＲＡＩＬを発現する細胞
には、Ｗｉｌｅｙら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：６７３−６８２，１９９５）で同
定されたものが含まれる。したがって、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、このよう
な細胞に（または細胞表面上でＴＲＡＩＬを発現することが判っている他の細胞
種類に）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ手順で診断薬または治療薬を送
達するのに用いることができる。

【００８０】 ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに結合しうる検出可能（診断）薬および治療薬に
は、毒素、他の細胞障害薬、薬物、放射性核種、発色団、比色定量または蛍光定
量反応を触媒する酵素等が含まれるが、これらに制限されるわけではなく、具体
的な薬剤は、予定の使用によって選択される。毒素の中には、リシン、アブリン
、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
外毒素Ａ、リボソーム失活タンパク質、トリコセセンなどのマイコトキシン、お
よびそれらの誘導体およびフラグメント（例えば、単鎖）がある。診断用途に適
した放射性核種には、¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎおよび⁷⁶Ｂｒが含まれる
が、これらに制限されるわけではない。治療用途に適した放射性核種の例は、^{13 1} Ｉ、²¹¹Ａｔ、⁷⁷Ｂｒ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹²Ｐｂ、²¹²Ｂｉ、¹⁰⁹Ｐｄ、⁶⁴Ｃ ｕおよび⁶⁷Ｃｕである。

【００８１】 このような薬剤は、いずれか適当な慣用法によってＴＲＡＩＬ−Ｒに結合させ
ることができる。タンパク質であるＴＲＡＩＬ−Ｒは、望ましい薬剤上の官能基
と反応して、例えば、共有結合を形成できる官能基をアミノ酸側鎖上に含む。或
いは、そのタンパク質または薬剤は、望ましい反応性官能基を生じるようにまた
は結合するように誘導体化することができる。その誘導体化は、種々の分子をタ
ンパク質に結合するのに利用可能な二官能性カップリング試薬の一つの結合を含
んでよい（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ロックフォード
，イリノイ州）。タンパク質を放射性標識する多数の技法が知られている。放射
性核種金属は、例えば、適当な二官能性キレート剤を用いることによってＴＲＡ
ＩＬ−Ｒに結合させることができる。

【００８２】 したがって、ＴＲＡＩＬ−Ｒおよび適当な診断薬または治療薬を含む（好まし
くは、共有結合した）結合体が製造される。それら結合体を、具体的な使用に適
当な量で投与するかまたはそれ以外に用いる。

【００８３】 本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡおよびポリペプチドは、不完全なまたは不十
分な量のＴＲＡＩＬ−Ｒによって（直接的にまたは間接的に）媒介される何等か
の疾患の治療法を開発する場合に用いることができる。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプ
チドは、このような疾患に苦しむ哺乳動物に投与することができる。或いは、遺
伝子治療アプローチを採用することができる。天然のＴＲＡＩＬ−Ｒヌクレオチ
ド配列の本明細書中での開示により、不完全なＴＲＡＩＬ−Ｒ遺伝子の検出、お
よび正常なＴＲＡＩＬ−Ｒエンコーディング遺伝子でのそれらの置換が可能にな
る。不完全な遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断検定で、および本明細書中で開示
された天然のＴＲＡＩＬ−Ｒヌクレオチド配列と、この遺伝子に欠陥があると思
われる人に由来するＴＲＡＩＬ−Ｒ遺伝子の配列とを比較することによって検出
することができる。

【００８４】 本発明のタンパク質のもう一つの使用は、異なった細胞種類でのＴＲＡＩＬ／
ＴＲＡＩＬ−Ｒ相互作用の阻害に起因する生物学的作用を研究する検査手段とし
てである。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、ＴＲＡＩＬ若しくはＴＲＡＩＬ−Ｒ
またはそれらの相互作用を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定でも用いること
ができる。

【００８５】 精製ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、ＴＲＡＩＬを結合するのに用いることが
できるので、内因性細胞表面ＴＲＡＩＬ受容体へのＴＲＡＩＬの結合を阻止する
ことができる。このようなＴＲＡＩＬ受容体には、本明細書中で開示されたＴＲ
ＡＩＬ−Ｒ、更には、本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒとは異なるＴＲＡＩＬ結合タンパ
ク質が含まれる。ＴＮＦファミリー（ＴＲＡＩＬがそのメンバーである）のいく
つかのリガンドは、２種類以上の異なった細胞表面受容体タンパク質に結合する
ことが報告されている。ＴＲＡＩＬも同様に、多数の細胞表面タンパク質に結合
しうる。報告によればＴＲＡＩＬを結合するが、本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒとは異
なっているＤＲ４と称される受容体タンパク質は、Ｐａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７６：１１１−１１３，１９９７；本明細書中に援用される）で記載されてい
る。

【００８６】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ手順でＴＲＡＩＬ
の生物学的活性を阻害するのに用いることができる。ＴＲＡＩＬの細胞表面受容
体への結合を阻害することにより、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、結果として、内因性受容
体へのＴＲＡＩＬの結合に起因する生物学的作用を阻害する。種々の形の、例え
ば、上記のＴＲＡＩＬ−Ｒフラグメント、オリゴマー、誘導体、およびＴＲＡＩ
Ｌを結合できる変異型を含めたＴＲＡＩＬ−Ｒを用いることができる。好ましい
実施態様において、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＲＡＩＬの生物学的活性を阻害
するのに、例えば、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを受けやすい細胞のこのような
アポトーシスを阻止するのに用いられる。

【００８７】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＲＡＩＬ媒介疾患を治療するために哺乳動物に投与する
ことができる。このようなＴＲＡＩＬ媒介疾患には、ＴＲＡＩＬによって（直接
的にまたは間接的に）引起こされるまたは悪化する状態が含まれる。

【００８８】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、血栓性微小血管症を治療するのに有用でありうる。一つの
このような疾患は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）である（Ｋｗａａｎ，
Ｈ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２４：７１，１９８７；Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎら，Ｂｌｏｏｄ，８０：１８９０，１９９２）。ＴＴＰに関係した死亡率
の増加は、Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ
（Ｔｏｒｏｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５０：８４，１９９５）によって
報告されている。

【００８９】 ＴＴＰに苦しむ患者（ＨＩＶ⁺およびＨＩＶ^-の患者を含めた）からの血漿は、
皮膚微小血管起原のヒト内皮細胞のアポトーシスを誘導するが、大血管起原では
誘導しない（Ｌａｕｒｅｎｃｅら，Ｂｌｏｏｄ，８７：３２４５，１９９６年４
月１５日）。したがって、ＴＴＰ患者の血漿は、アポトーシスを直接的にまたは
間接的に誘導する１種類またはそれ以上の因子を含有する考えられる。ＰＣＴ出
願ＷＯ９７／０１６３３号（本明細書中に援用される）で記載されたように、Ｔ
ＲＡＩＬは、ＴＴＰ患者の血清中に存在し、微小血管内皮細胞のアポトーシスの
誘導においてある役割を果たしうる。

【００９０】 もう一つの血栓性微小血管症は、溶血性***症候群（ＨＵＳ）である（Ｍｏ
ａｋｅ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４３：３９３，１９９４；Ｍｅｌｎｙｋら
（Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５５：２０７７，１９９５）；Ｔｈｏ
ｍｐｓｏｎら，上記）。本発明の一つの実施態様は、（子供を襲うこともありう
るとしても）しばしば“成人ＨＵＳ”と称される状態を治療するためのＴＲＡＩ
Ｌ−Ｒの使用に関する。小児期／下痢関連ＨＵＳとして知られる疾患は、成人Ｈ
ＵＳとは病因が異なる。

【００９１】 小血管の血栓形成を特徴とする他の状態は、ＴＲＡＩＬ−Ｒを用いて治療する
ことができる。このような状態には次が含まれるが、これらに制限されるわけで
はない。小児ＡＩＤＳ患者の約５−１０％で見られる心臓の問題は、小血管の血
栓形成を伴うと考えられる。心臓内の微小血管の破損は、多発性硬化症患者で報
告されている。もう一つの例として、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療
が考えられる。

【００９２】 一つの実施態様において、患者の血液または血漿を、ｅｘ ｖｉｖｏでＴＲＡ
ＩＬ−Ｒと接触させる。そのＴＲＡＩＬ−Ｒは、慣用法によって適当なクロマト
グラフィーマトリックスに結合させることができる。患者の血液または血漿を、
患者に戻す前に、そのマトリックスに結合したＴＲＡＩＬ−Ｒを含有するクロマ
トグラフィーカラムに通過させる。固定された受容体はＴＲＡＩＬを結合するの
で、ＴＲＡＩＬタンパク質が患者血液から除去される。

【００９３】 或いは、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、血栓性微小血管症に苦しむ患者にｉｎ ｖｉｖｏ
で投与することができる。一つの実施態様において、可溶性形のＴＲＡＩＬ−Ｒ
を患者に投与する。

【００９４】 したがって、本発明は、血栓性微小血管症を治療する方法であって、有効量の
ＴＲＡＩＬ−Ｒの使用を含む方法を提供する。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、
微小血管内皮細胞へのＴＲＡＩＬ媒介傷害（例えば、アポトーシス）を阻止する
ために、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ手順で用いることができる。

【００９５】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、特定の疾患を治療する場合に有用な他の薬剤と一緒に用い
ることができる。Ｌａｕｒｅｎｃｅら（Ｂｌｏｏｄ ８７：３２４５，１９９６
）によって報告されたｉｎ ｖｉｔｒｏ研究において、微小血管内皮細胞のＴＴ
Ｐ血漿媒介アポトーシスのある程度の減少が、抗Ｆａｓ遮断抗体、オーリントリ
カルボン酸、または寒冷沈降物が除かれた正常血漿を用いることによって達成さ
れた。

【００９６】 したがって、患者は、内皮細胞のＦａｓ−リカンド媒介アポトーシスを阻害す
る薬剤と、内皮細胞のＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを疎開する薬剤とを組合せて
用いて治療されうる。一つの実施態様において、ＴＲＡＩＬ−Ｒおよび抗Ｆａｓ
遮断抗体を両方とも、ＴＴＰまたはＨＵＳなどの血栓性微小血管症を特徴とする
疾患に苦しむ患者に投与する。Ｆａｓ抗原（ＣＤ９５）に対して向けられた遮断
モノクローナル抗体の例は、本明細書中に援用されるＰＣＴ出願公開第ＷＯ９５
／１０５４０号で記載されている。

【００９７】 本発明のもう一つの実施態様は、ＨＩＶ感染患者でＴ細胞のＴＲＡＩＬ媒介細
胞死を減少させるためのＴＲＡＩＬ−Ｒの使用に関する。ＡＩＤＳの発症におけ
るＴ細胞アポトーシスの役割は、多数の研究の課題とされている（例えば、Ｍｅ
ｙａａｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：２１７−２１９，１９９２；Ｇｒｏｕ
ｘら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：３３１，１９９２；およびＯｙａｉｚｕ
ら，Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｈ
ＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ＡｎｄｒｉｅｕおよびＬｕ監修，Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク，１９９５，１０１−１１４頁中を参照されたい）
。いくつかの研究は、Ｆａｓ媒介アポトーシスの役割を研究しており、インター
ロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）の関与も調べられている（Ｅｓｔａｑｕｉｅ
ｒら，Ｂｌｏｏｄ ８７：４９５９−４９６６，１９９６；Ｍｉｔｒａら，Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ ８７：５８１−５８５，１９９６；Ｋａｔｓｉｋｉｓら，Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２０２９−２０３６，１９９５）。Ｔ細胞アポトー
シスは、多数の機序によって起こりうると考えられる。

【００９８】 ＨＩＶ⁺患者で見られるＴ細胞死の少なくともいくつかは、ＴＲＡＩＬによっ て媒介されていると考えられる。理論に拘束されたくはないが、このようなＴＲ
ＡＩＬ媒介Ｔ細胞死は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）として知られる機序によ
って起こると考えられる。

【００９９】 活性ヒトＴ細胞は、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体複合体による引き金によってプログ
ラムされた細胞死（アポトーシス）が行なわれるように誘導されるが、これは、
活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）と称される過程である。ＨＩＶに感染した無症候
個体から単離されたＣＤ４⁺Ｔ細胞のＡＩＣＤが報告されている（Ｇｒｏｕｘら ，上記）。したがって、ＡＩＣＤは、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の減少、およびＨＩＶ感染 個体でのＡＩＤＳの進行においてある役割を果たしうる。

【０１００】 本発明は、ＨＩＶ⁺患者でのＴＲＡＩＬ媒介Ｔ細胞死を阻害する方法であって 、ＴＲＡＩＬ−Ｒ（好ましくは、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド）をそれら
患者に投与することを含む方法を提供する。一つの実施態様において、患者は、
ＴＲＡＩＬ−Ｒでの治療を始める時点で無症候である。所望ならば、治療前に、
末梢血Ｔ細胞をＨＩＶ⁺患者から抽出し、ＴＲＡＩＬ媒介細胞死への感受性につ いて慣用法によって調べることができる。

【０１０１】 一つの実施態様において、患者の血液または血漿を、ｅｘ ｖｉｖｏでＴＲＡ
ＩＬ−Ｒと接触させる。そのＴＲＡＩＬ−Ｒは、慣用法によって適当なクロマト
グラフィーマトリックスに結合させることができる。患者の血液または血漿を、
患者に戻す前に、そのマトリックスに結合したＴＲＡＩＬ−Ｒを含有するクロマ
トグラフィーカラムに通過させる。固定されたＴＲＡＩＬ−ＲはＴＲＡＩＬを結
合するので、ＴＲＡＩＬタンパク質が患者血液から除去される。

【０１０２】 ＨＩＶ⁺患者を治療する場合、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、Ｔ細胞アポトーシスの他の 阻害剤と組合せて用いることができる。Ｆａｓ媒介アポトーシスは、ＨＩＶ⁺個 体でのＴ細胞の減少にも関与している（Ｋａｔｓｉｋｉｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１８１：２０２９−２０３６，１９９５））。したがって、Ｆａｓリガンド
（Ｆａｓ−Ｌ）媒介およびＴＲＡＩＬ媒介のＴ細胞死を両方とも受けやすい患者
は、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ受容体相互作用を阻止する薬剤およびＦａｓ−Ｌ／
Ｆａｓ相互作用を阻止する薬剤両方で治療されうる。Ｆａｓ−ＬのＦａｓへの結
合を阻止するのに適当な薬剤には、可溶性Ｆａｓポリペプチド；オリゴマーの形
の可溶性Ｆａｓポリペプチド（例えば、ｓＦａｓ／Ｆｃの二量体）；アポトーシ
スを引起こす生物学的シグナルを伝達することなくＦａｓを結合する抗Ｆａｓ抗
体；Ｆａｓ−ＬのＦａｓへの結合を阻止する抗Ｆａｓ−Ｌ抗体；およびＦａｓを
結合するが、アポトーシスを引起こす生物学的シグナルを伝達しないＦａｓ−Ｌ
のムテインが含まれるが、これらに制限されるわけではない。好ましくは、その
方法で用いられる抗体は、モノクローナル抗体である。抗Ｆａｓモノクローナル
抗体の遮断を含めたＦａｓ−Ｌ／Ｆａｓ相互作用の遮断に適当な薬剤の例は、本
明細書中に援用されるＷＯ９５／１０５４０号で記載されている。

【０１０３】 有効量の本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドと、生理学的に許容しうる希釈
剤、担体または賦形剤などの他の成分とを組合せて含む組成物を本明細書中で提
供する。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、薬学的に有用な組成物を製造するのに用いられる既
知の方法によって製剤化することができる。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、単独の活性物質
としてかまたはある与えられる指標に適した他の既知の活性物質と一緒に、薬学
的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、および
リン酸緩衝化溶液）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パ
ラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／または担体と混合物中で組
合せることができる。医薬組成物に適した製剤には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，１９８０，Ｍａｃ
ｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，イーストン，ＰＡで記載されたも
のが含まれる。

【０１０４】 更に、このような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオン
と一緒に錯体形成した、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキ
ストラン等のようなポリマー化合物中に包含された、またはリポソーム、マイク
ロエマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴーストまたはスフェロ
ブラスト中に包含されたＴＲＡＩＬ−Ｒを含有できる。このような組成物は、Ｔ
ＲＡＩＬ−Ｒの物理的状態、溶解性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、および
ｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるので、予定の使用によって選択
される。細胞の表面上で発現されるＴＲＡＩＬ−Ｒも用いることができる。

【０１０５】 本発明の組成物は、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを、天然タンパク質、変異型
、誘導体、オリゴマーおよび生物学的に活性なフラグメントなどの本明細書中で
開示されたいずれの形でも含有しうる。具体的な実施態様において、その組成物
は、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド、または可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプ
チドを含むオリゴマーを含む。

【０１０６】 ＴＲＡＩＬ−Ｒは、いずれか適当な方法で、例えば、局所、非経口または吸入
によって投与することができる。“非経口”という用語は、例えば、局所投与も
含めた皮下、静脈内または筋内経路による注射を含む。移植体からの徐放も考え
られる。当業者は、適当な投薬が、治療される疾患の性状、患者の体重、年齢お
よび全身状態、および投与経路などの因子によって異なることを理解するであろ
う。予備試験用量は、動物試験によって決定することができ、ヒトへの投与用量
の増減は、医薬技術慣例によって行なわれる。

【０１０７】 生理学的に許容しうる製剤中にＴＲＡＩＬ−Ｒ核酸を含む組成物も考えられる
。ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡは、例えば、注射用に製剤化することができる。抗体 ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを結合する抗体を本明細書中で提供する。図１ま
たは２のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質（配列番号：２または４）は、それと免疫反
応性の抗体を生産する場合に免疫原として用いることができる。或いは、フラグ
メントまたは融合タンパク質などの別の形のＴＲＡＩＬ−Ｒを免疫原として用い
る。

【０１０８】 本発明は、したがって、図１または２のＴＲＡＩＬ−Ｒ、またはその免疫原性
フラグメントで動物を免疫感作することによって得られる抗体を提供する。抗体
を生産する方法は、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドで動物を免疫感作し、それによ
ってそのＴＲＡＩＬ−Ｒに対して向けられた抗体をその動物中で生じさせること
を含む。所望の抗体は、例えば、その動物の血清から慣用的な技法によって精製
することができる。

【０１０９】 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する手順の中には、Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ
Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅ
ｎｎｅｔら（監修），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８０）；
およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａ
ｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，コールド・スプリング・ハーバー，ＮＹ（１
９８８）で記載されたものがある。ＴＲＡＩＬ−Ｒに対して向けられたモノクロ
ーナル抗体の生産は、実施例４で更に詳しく説明する。

【０１１０】 慣用的な技法によって生産することができるこのような抗体の抗原結合フラグ
メントも、本発明によって包含される。このようなフラグメントの例には、Ｆａ
ｂおよびＦ（ａｂ’）²フラグメントが含まれるが、これらに制限されるわけで はない。遺伝子工学技術によって生産される抗体フラグメントおよび誘導体も提
供する。

【０１１１】 本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ヒト化型のネズミモ
ノクローナル抗体が含まれる。このようなヒト化抗体は、既知の技法によって製
造することができ、それら抗体をヒトに投与した場合、低免疫原性の利点を与え
る。一つの実施態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変
領域（またはそのちょうど抗原結合部位）およびヒト抗体に由来する定常領域を
含む。或いは、ヒト化抗体フラグメントは、ネズミモノクローナル抗体の抗原結
合部位およびヒト抗体に由来する可変領域フラグメント（抗原結合部位を欠いた
）を含んでよい。キメラのおよび更に遺伝子操作されたモノクローナル抗体の生
産手順には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，１９８８
）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９，１９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，１９８９）、およびＷｉｎｔｅｒお
よびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９，１９９３年５月）で記載されたも
のが含まれる。

【０１１２】 一つの実施態様において、それら抗体は、本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒに特異的で
あり、他の（非ＴＲＡＩＬ−Ｒ）タンパク質と交差反応しない。このような抗体
を識別しうるスクリーニング手順は周知であり、例えば、イムノアフィニティー
クロマトグラフィーを含んでよい。

【０１１３】 ＴＲＡＩＬ−Ｒに特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞
系も本明細書中で考えられる。このようなハイフリドーマは、慣用的な技法によ
って生産し且つ識別することができる。このようなハイブリドーマ細胞系を生産
する一つの方法は、ＴＲＡＩＬ−Ｒで動物を免疫感作し；免疫感作された動物か
ら脾臓細胞を採取し；それら脾臓細胞を骨髄腫細胞系に融合させることによって
ハイブリドーマ細胞を生じさせ；そしてＴＲＡＩＬ−Ｒを結合するモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を識別することを含む。それらモノクロ
ーナル抗体は、慣用的な技法によって回収することができる。

【０１１４】 それら抗体の使用に中には、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの存在をｉｎ ｖｉ
ｔｒｏかまたはｉｎ ｖｉｖｏで検出する検定での使用がある。それら抗体は、
ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質をイムノアフィニティークロマトグラフィーによって
精製する場合にも用いることができる。

【０１１５】 一つの実施態様において、それら抗体は、更に、ＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬ−Ｒ
への結合を阻止できる。このような抗体は、例えば、ＴＲＡＩＬの細胞表面ＴＲ
ＡＩＬ−Ｒへの結合を阻止するのに用いることができる。遮断抗体（Ｂｌｏｃｋ
ｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、慣用的な検定法を用いて識別することがで
きる。

【０１１６】 このような抗体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒに媒介される生物学的活性を阻害するのに
ｉｎ ｖｉｔｒｏ手順で用いてよいしまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与してよい。した
がって、ＴＲＡＩＬと細胞表面ＴＲＡＩＬ−Ｒとの相互作用によって（直接的に
または間接的に）引起こされるまたは悪化する疾患を治療することができる。治
療法は、ＴＲＡＩＬ−Ｒに媒介される生物学的活性を阻害する場合に有効な量で
遮断抗体を哺乳動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与することを含む。したがって、ＴＲＡ
ＩＬによって直接的にまたは間接的に引起こされるまたは悪化する疾患が治療さ
れる。モノクローナル抗体は、概して、このような治療法で用いるのに好ましい
。一つの実施態様では、抗原結合抗体フラグメントを用いる。

【０１１７】 ＴＲＡＩＬ−Ｒに対して向けられている抗体、および生理学的に許容しうる希
釈剤、賦形剤または担体を含む組成物を本明細書中で提供する。このような組成
物の適当な成分は、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質を含有する組成物について上に記
載された通りである。

【０１１８】 本明細書中で更に提供されるのは、ＴＲＡＩＬ−Ｒに対して向けられた抗体に
結合した検出可能（診断）薬または治療薬を含む結合体である。このような薬剤
の例は、上に示されている。それら結合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖ
ｉｖｏ手順で用いられる。核酸 本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ核酸を提供する。このような核酸には、図１および
２のヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ（配列番号：１および３）が含まれるが、これ
らに制限されるわけではない。本発明の核酸分子には、一本鎖および二本鎖両方
の形のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ、更には、そのＲＮＡ補体が含まれる。ＴＲＡＩ
Ｌ−Ｒ ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣ
Ｒによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組合せが含まれる。ゲノムＤＮＡ
は、慣用的な技法によって、例えば、図１または２のｃＤＮＡ、またはその適当
なフラグメントをプローブとして用いて単離することができる。

【０１１９】 具体的な実施態様において、それら核酸は、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの生
産において、例えば、上で論評された組換え体発現系において有用である。本明
細書中で考えられる形のいずれかのＴＲＡＩＬ−Ｒ（例えば、完全長さＴＲＡＩ
Ｌ−Ｒまたはそのフラグメント）をコードしているＤＮＡを提供する。ＴＲＡＩ
Ｌ−ＲエンコーディングＤＮＡの具体的な実施態様は、図１または２の完全長さ
ヒトＴＲＡＩＬ−ＲをコードしているＤＮＡ（Ｎ末端シグナルペプチドを含めた
）および完全長さ成熟ヒトＴＲＡＩＬ−ＲをコードしているＤＮＡを含む。他の
実施態様は、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒをコードしている（例えば、シグナルペプチ
ドを含むかまたは含まないそのタンパク質の細胞外ドメインをコードしている）
ＤＮＡを含む。

【０１２０】 本明細書中で提供されるＴＲＡＩＬ−Ｒ核酸フラグメントには、プローブまた
はプライマーとしての使用が含まれるが、これらに制限されるわけではない使用
がある。本明細書中で開示される核酸配列に由来するオリゴヌクレオチドは、例
えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で３′および５′プライマーとして用い
ることができ、それによってＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡフラグメントが単離され且
つ増幅される。

【０１２１】 ＴＲＡＩＬ−Ｒヌクレオチド配列の具体的なフラグメントは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ
ＤＮＡ配列の少なくとも３０個または少なくとも６０個連続したヌクレオチド
を含む。本明細書中で提供される核酸は、それらフラグメントのＤＮＡおよびＲ
ＮＡ補体を、一本鎖および二本鎖両方の形のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡと一緒に含
む。

【０１２２】 ＴＲＡＩＬ−Ｒ核酸の他の有用なフラグメントには、標的ＴＲＡＩＬ−Ｒ ｍ
ＲＮＡ（センス）またはＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し
うる一本鎖核酸配列（ＲＮＡかまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンス
オリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によるアンチセンスまたはセンスオリゴ
ヌクレオチドは、図１または２のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡのコーディング領域の
フラグメントを含んでよい。このようなフラグメントは、概して、少なくも約１
４ヌクレオチド、好ましくは、約１４−約３０ヌクレオチドを含む。ある与えら
れたタンパク質をコードしているｃＤＮＡ配列に基づくアンチセンスまたはセン
スオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ
（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：２６５９，１９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ
Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８，１９８８）で記載さ
れている。

【０１２３】 標的核酸配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、増
大した二重らせん分解、転写または翻訳の未成熟終結を含めたいくつかの手段の
一つによってまたは他の手段によって標的配列の転写または翻訳を阻止する二重
らせんの形成をもたらす。したがって、それらアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の発現を阻止するのに用いることができる。アン
チセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾された糖−リン酸ジエ
ステル主鎖（またはＷＯ９１／０６６２９号で記載されたものなどの他の糖連鎖
）を有するオリゴヌクレオチドを含み、この場合、このような糖連鎖は、内因性
ヌクレアーゼに耐性である。糖連鎖耐性のこのようなオリゴヌクレオチドは、ｉ
ｎ ｖｉｖｏで安定である（すなわち、酵素分解に耐えうる）が、標的ヌクレオ
チド配列に結合できる配列特異性を保持している。

【０１２４】 センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１０
４４８号で記載されたものなどの有機残基、およびポリ（Ｌ−リシン）などの標
的核酸配列へのオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の残基に共有結合し
ているオリゴヌクレオチドが含まれる。また更に、エリプチシンなどの挿入剤お
よびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドに結合させて、標的ヌクレオチド配列へのそのアンチセンスまたはセンスオリ
ゴヌクレオチドの結合特異性を変更することができる。

【０１２５】 アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ₄媒介Ｄ ＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含めたいずれかの遺伝子
転移によって、またはエプスタイン・バールウイルスなどの遺伝子転移ベクター
を用いることによって標的核酸配列を含有する細胞中に導入することができる。
好ましい手順では、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを適当なレト
ロウイルスベクター中に挿入する。標的核酸配列を含有する細胞をその組換え体
レトロウイルスベクターと、ｉｎ ｖｉｖｏかまたはｅｘ ｖｉｖｏで接触させ
る。適当なレトロウイルスベクターには、ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、
Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウイルス）に由来するもの、またはＤＣＴ
５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと称される二重コピーベクター（ＷＯ９０／
１３６４１号を参照されたい）が含まれるが、これらに制限されるわけではない
。

【０１２６】 センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３号で
記載のように、リガンド結合分子との結合体の形成によって標的ヌクレオチド配
列を含有する細胞中に導入することができる。適当なリガンド結合分子には、細
胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する
他のリガンドが含まれるが、これらに制限されるわけではない。好ましくは、リ
ガンド結合分子の結合は、そのリガンド結合分子が対応する分子または受容体に
結合する能力、またはセンス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそ
の結合型の細胞中への侵入を阻止する能力をほとんど妨げない。

【０１２７】 或いは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４
４８号で記載のように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって標的核
酸配列を含有する細胞中に導入することができる。そのセンスまたはアンチセン
スオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細
胞内で解離する。

【０１２８】 次の実施例は、本発明の具体的な実施態様を更に詳しく説明するために与えら
れ、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。実施例１：ＴＲＡＩＬ−Ｒ ｃＤＮＡクローン ＴＲＡＩＬ−Ｒクローンを、２種類のｃＤＮＡライブラリーから単離した。最
初のｃＤＮＡライブラリーはヒト***線維芽細胞に由来し、二番目はヒト末梢血
リンパ球（ＰＢＬ）に由来した。

【０１２９】 ＰＢＬから単離されたＴＲＡＩＬ−Ｒ ｃＤＮＡは、図２で示されるヌクレオ
チド配列（配列番号：３）を含むことが判明した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ（図１または
図２で示される配列）のどちらの形も、ヒト***線維芽細胞ライブラリーから単
離されたクローン中で示された。

【０１３０】 図１（配列番号：１）および図２（配列番号：３）のヌクレオチド配列は２か
所で異なる。図１で、１４５位のヌクレオチドはＣであるが、図２でのヌクレオ
チド１４５はＴであり；図１の９７１位のヌクレオチドはＣであるが、図２では
Ｔである。アミノ酸配列も同様に、２か所で異なる。残基３５は、図１（配列番
号：２）でＰｒｏおよび図２（配列番号：４）でＳｅｒであり；残基３１０は、
図１でＳｅｒおよび図２でＬｅｕである。一つ考えられる説明は、図１および２
のＴＲＡＩＬ受容体が対立遺伝子変異型であるということである。

【０１３１】 図１（配列番号：２）および図２（配列番号：４）のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク
質は、シグナルペプチドとして働くＮ末端疎水性領域を含む。計算機分析によっ
て予想される１個のシグナルペプチド切断部位が、図１および２のアミノ酸５５
の次に来る。したがって、そのシグナルペプチド（アミノ酸１−５５）の切断は
、アミノ酸５６−３８６まで含む成熟タンパク質を生じると考えられる。そのタ
ンパク質は、細胞外ドメイン（アミノ酸５６−２１１）、膜貫通領域（アミノ酸
２１２−２３２まで）、およびＣ末端細胞質ドメイン（アミノ酸２３３−３８６
まで）を更に含む。

【０１３２】 図１および２のタンパク質が異なる二つのアミノ酸は、シグナルペプチド（３
５位）および細胞質ドメイン（３１０位）で見出される。したがって、図１およ
び２のタンパク質の細胞外ドメインは一致する。実施例２：結合検定 ＴＲＡＩＬ−ＲのＴＲＡＩＬを結合する能力についてスライド結合検定で調べ
た。図１の完全長さＴＲＡＩＬ−ＲをコードしているＤＮＡを、ｐＤＣ４０９と
称される哺乳動物発現ベクター中に挿入した。ｐＤＣ４０９は、ＭｃＭａｈａｎ
ら（ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１−２８３２，１９９１；本明細書中に援用さ
れる）で記載されたｐＤＣ４０６ベクターに由来した。ｐＤＣ４０９に加えられ
る特徴（ｐＤＣ４０６と比較して）には、多数のクローニング部位（ｍｃｓ）中
の追加の独特の制限部位；ｍｃｓの下流に位置する３個の停止コドン（各読み枠
中に１個）；およびｍｃｓ中に挿入されるＤＮＡの配列決定を容易にする、ｍｃ
ｓの下流のＴ７ポリメラーゼプロモーターを含む。

【０１３３】 ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞を、その組換え体発現ベクターでトランスフェクション
し、スライドガラス上で培養してＴＲＡＩＬ−Ｒを発現させた。スライド結合検
定は、概して、本明細書中に援用される Ｇｅａｒｉｎｇら（ＥＭＢＯ Ｊ．８
：３６６７，１９８９）；ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，
１９９１）およびＧｏｏｄｗｉｎら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２６
３１，１９９３）で記載されたように行なわれた。簡単にいうと、それらトラン
スフェクションされた細胞を結合用培地中でＬＺ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（
下記）と一緒にインキュベートした。次に、スライドを洗浄し、その融合タンパ
ク質のロイシンジッパー（ＬＺ）残基に特異的な¹²⁵Ｉ標識抗体を加えた。抗体 と一緒にインキュベーション後、それらスライドを洗浄し、固定し、写真用エマ
ルジョン中に浸漬した。その検定は、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質がＴＲＡＩＬを
結合することを示した。

【０１３４】 その検定で用いられるＬＺ−ＴＲＡＩＬは、検定で用いられた可溶性ＴＲＡＩ
ＬポリペプチドのＮ末端に融合したロイシンジッパーを含む融合タンパク質（Ｌ
Ｚ−ＴＲＡＩＬ）である。発現構築物は、Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチドをコー
ドしているＤＮＡを、三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーをコードして
いる配列で置き換えたことを除き、本質的には、Ｗｉｌｅｙら（Ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ，３：６７３−６８２，１９９５；本明細書中に援用される）でＦｌａｇ（登
録商標）−ＴＲＡＩＬ発現構築物の製造について記載のように製造された。その
構築物は、発現ベクターｐＤＣ４０９中において、ヒトサイトメガロウイルスに
由来するリーダー配列、続いて可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドのＮ末端に融合し
たロイシンジッパーをコードしていた。そのＴＲＡＩＬポリペプチドは、Ｗｉｌ
ｅｙら（上記）で記載のように、ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸９５−２８１（細胞
外ドメインのフラグメント）を含んでいた。そのＬＺ−ＴＲＡＩＬをＣＨＯ細胞
中で発現させ、培養物上澄みから精製した。実施例３：可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒの製造 可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ融合タンパク質をコードしている発現ベクターを次のよ
うに構築した。その融合タンパク質は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドムテイ
ンのＮ末端に融合した可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ融合タンパク質を含んでいた。

【０１３５】 図１のアミノ酸１−２０８（配列番号：２）をコードしているＤＮＡフラグメ
ントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離した。そのＤＮＡフラグメ
ントの所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおいて３’および
５’プライマーとして用い、図１で示されたｃＤＮＡクローン（配列番号：１）
を鋳型として用いた。

【０１３６】 その融合タンパク質のＦｃ残基は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドのム
テインであった。このＦｃムテインに関するＤＮＡおよびアミノ酸配列情報は、
本明細書中に援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１，１９９４）で記載されている。

【０１３７】 ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ遺伝子融合を含有する発現ベクターを製造する手順は、
概して、本明細書中に援用されるＳｍｉｔｈら（Ｃｅｌｌ ７３：１３４９−１
３６０，１９９３）およびＦａｎｓｌｏｗら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：６
５５−６６０，１９９２）で記載の通りであった。実施例２で記載された発現ベ
クターｐＤＣ４０９を用いた。得られた組換え体発現ベクターでＣＶ１／ＥＢＮ
Ａ細胞をトランスフェクションし、培養して、ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃをそれら細
胞から発現させ且つ分泌させた。実施例４：ＴＲＡＩＬ−Ｒを結合するモノクローナル抗体 この実施例は、ＴＲＡＩＬ−Ｒを結合するモノクローナル抗体を製造する方法
を詳しく説明する。このような抗体を生じさせる場合に用いることができる適当
な免疫原には、精製ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質または細胞外ドメインなどのその
免疫原性フラグメント、またはＴＲＡＩＬ−Ｒを含有する融合タンパク質（例え
ば、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質）が含まれるが、これらに制限
されるわけではない。

【０１３８】 精製ＴＲＡＩＬ−Ｒは、米国特許第４，４１１，９９３号で記載されたような
慣用的な技法を用いて、それと免疫反応性のモノクローナル抗体を生じさせるの
に用いることができる。簡単にいうと、フロイント完全アジュバント中に乳化し
たＴＲＡＩＬ−Ｒ免疫原でマウスを免疫感作し、１０−１００μｇの量で皮下ま
たは腹腔内注射する。１０−１２日後、それら免疫感作された動物を、フロイン
ト不完全アジュバント中に乳化した追加のＴＲＡＩＬ−Ｒで追加免疫する。以後
、週１回−週２回の免疫感作計画でマウスを定期的に追加免疫する。血清試料を
眼窩後出血または尾端切除によって定期的に採取して、ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体につ
いてドットブロット検定、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）またはＴＲＡＩＬ
結合の阻害によって調べる。

【０１３９】 適当な抗体力価の検出後、陽性の動物に、生理食塩水中のＴＲＡＩＬ−Ｒを最
後に１回静脈内注射する。３−４日後、それら動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し
、脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞系、例えば、ＮＳ１または好ましくはＰ３ｘ６３
Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）に融合させる。融合はハイブリ
ドーマ細胞を生じ、これらを多数の微量滴定プレート中のＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中にプレーティングして、非融合
細胞、骨髄腫雑種および脾臓細胞雑種の増殖を阻止する。

【０１４０】 それらハイブリドーマ細胞を、Ｅｎｇｖａｌｌら，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８
：８７１，１９７１ および米国特許第４，７０３，００４号で開示された技法
の応用により、精製ＴＲＡＩＬ−Ｒに対する反応性についてＥＬＩＳＡによって
スクリーニングする。好ましいスクリーニング法は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２１２，１９９０）で記載された抗体捕捉技術であ
る。陽性ハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃
度の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒモノクローナル抗体を含有する腹水を生じさせることがで
きる。或いは、ハイブリドーマ細胞を、様々な技法によってフラスコまたはロー
ラーボトル中でｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖させることができる。マウス腹水中に生じ
たモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈降後、ゲル排除クロマトグラフィ
ーによって精製することができる。或いは、抗体のプロテインＡまたはプロテイ
ンＧへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを、ＴＲＡＩＬ−Ｒへ
の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーと同様に用いることもできる
。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＴＲＡＩＬ受容体ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、並
びにそれによってコードされるアミノ酸配列を示す。

【図２】 図２Ａおよび２Ｂは、別のヒトＴＲＡＩＬ受容体ｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図２Ａ−２Ｂのアミノ酸配列
は、図１Ａ−１Ｂで示された配列と２か所で異なる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/715 16/46 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/46 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA44 BA63 CA04 CA07 DA02 DA06 DA12 EA04 FA15 GA03 GA11 HA01 HA15 4B064 AG20 AG27 CA02 CA06 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 4C084 AA01 AA07 AA13 BA01 BA22 BA41 BA44 CA53 DA39 DA45 ZA362 ZA532 ZB212 4C085 AA13 AA14 BB11 DD63 DD88 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 DA51 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＴＲＡＩＬ受容体ポリペプチド（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）をコード
   しているヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡであって、該ＴＲＡＩＬ−Ｒが、 （ａ）図１のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド； （ｂ）図２のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドのフラグメントであって、ＴＲＡＩ
   Ｌを結合できる該フラグメント から成る群より選択される上記ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 前記フラグメントが可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドであ
   る請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 前記可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが、図１または図２
   のＴＲＡＩＬ−Ｒの細胞外ドメインを含む請求項２に記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 前記ＴＲＡＩＬ−Ｒが、膜貫通領域を欠いている請求項１に
   記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 前記ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが、図１または図２の残基
   ｘ−ｙのアミノ酸配列を含み、ここにおいて、ｘは１−９８の整数であり、ｙは
   １８１−３８６の整数である請求項１に記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 ｘが、１および５６から成る群より選択される整数であり、
   ｙが、１８１、２０８、２１１および３８６から成る群より選択される整数であ
   る請求項５に記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡで
   あって、前記ポリペプチドが、 （ａ）図１の残基１−３８６； （ｂ）図２の残基１−３８６； （ｃ）図１の残基５６−３８６； （ｄ）図２の残基５６−３８６； （ｅ）図１の残基１−２１１； （ｆ）図２の残基１−２１１；および （ｇ）図１の残基５６−２１１ から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸
   配列を含む上記単離ＤＮＡ。
8. 【請求項８】 前記ポリペプチドが、 （ａ）図１の残基１−３８６； （ｂ）図２の残基１−３８６； （ｃ）図１の残基５６−３８６； （ｄ）図２の残基５６−３８６； （ｅ）図１の残基１−２１１； （ｆ）図２の残基１−２１１；および （ｇ）図１の残基５６−２１１ から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項７に記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 図１または図２のヌクレオチド配列の少なくとも６０個隣接
   したヌクレオチドを含む単離ＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 請求項１、請求項２、請求項３、請求項５、請求項７また
    は請求項８に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
11. 【請求項１１】 ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを製造する方法であって、請
    求項１０に記載のベクターを含有する宿主細胞をＴＲＡＩＬ−Ｒの発現を促進す
    る条件下で培養し、該ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを回収することを含む上記方
    法。
12. 【請求項１２】 精製ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドであって、 （ａ）成熟型の図１のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド； （ｂ）成熟型の図２のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドのフラグメントであって、ＴＲＡＩ
    Ｌを結合できる該フラグメント から成る群より選択される上記精製ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
13. 【請求項１３】 前記フラグメントが可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドで
    ある請求項１２に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ。
14. 【請求項１４】 前記可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが、図１または図
    ２のＴＲＡＩＬ−Ｒの細胞外ドメインを含む請求項１３に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ
    。
15. 【請求項１５】 前記ＴＲＡＩＬ−Ｒが、膜貫通領域を欠いている請求項１
    ２に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ。
16. 【請求項１６】 前記ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが、図１または図２の残
    基ｘ−ｙのアミノ酸配列を含み、ここにおいて、ｘは１−９８の整数であり、ｙ
    は１８１−３８６の整数である請求項１２に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ。
17. 【請求項１７】 ｘが、１および５６から成る群より選択される整数であり
    、ｙが、１８１、２０８、２１１および３８６から成る群より選択される整数で
    ある請求項１６に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ。
18. 【請求項１８】 精製ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドであって、 （ａ）図１の残基５６−３８６； （ｂ）図２の残基５６−３８６；および （ｃ）図１の残基５６−２１１ から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
    を含む上記精製ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
19. 【請求項１９】 前記ポリペプチドが、 （ａ）図１の残基５６−３８６； （ｂ）図２の残基５６−３８６；および （ｃ）図１の残基５６−２１１ から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１８に記載のＴＲＡＩＬ−
    Ｒ。
20. 【請求項２０】 請求項１２、請求項１３、請求項１８または請求項１９に
    記載の少なくとも２個のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含むオリゴマー。
21. 【請求項２１】 前記オリゴマーが、２−４個の可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリ
    ペプチドを含む請求項２０に記載のオリゴマー。
22. 【請求項２２】 ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドおよび抗体由来Ｆｃポリペプ
    チドを含む融合タンパク質であって、該ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが、図１ま
    たは図２のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の可溶性フラグメントであり、該フラグメ
    ントがＴＲＡＩＬを結合できる上記融合タンパク質。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の２個の融合タンパク質を含む二量体。
24. 【請求項２４】 請求項１２に記載のポリペプチドおよび生理学的に許容し
    うる希釈剤、賦形剤または担体を含む組成物。
25. 【請求項２５】 請求項２０に記載のオリゴマーおよび生理学的に許容しう
    る希釈剤、賦形剤または担体を含む組成物。
26. 【請求項２６】 請求項１２に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに対して
    向けられる抗体または該抗体の抗原結合フラグメント。
27. 【請求項２７】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２６に記載の
    抗体。