KR19990075254A - 천연 추출물을 첨가하여 중국 햄스터 난소유래 세포에서 에리스로포이에틴의 생산 증대 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동물세포 배양 배지에 생약재 또는 천연 추출물을 첨가하여 재조합 단백질의 생산을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 재조합 당단백질인 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO)을 생산하는 중국 햄스터 난소유래 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포를 기존 무혈청 배지에 일정량의 천연 추출물을 첨가하여 배양함으로 에리스로포이에틴의 생산을 증대시키는 방법에 관한 것으로서, 이는 단순 무혈청 배지를 사용한 경우보다 적게는 2배 이상 많게는 10배 정도 단백질 생산량을 증가시킨다.

Description

천연 추출물을 첨가하여 중국 햄스터 난소유래 세포에서 에리스로포이에틴의 생산 증대 방법
본 발명은 동물세포 배양 배지에 생약 또는 천연 추출물을 첨가하여 재조합 단백질의 생산을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 재조합 당단백질인 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO)을 생산하는 중국 햄스터 난소유래 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포를 기존 무혈청 배지에 일정량의 천연 추출물을 첨가하여 배양함으로 에리스로포이에틴의 생산을 증대시키는 방법에 관한 것으로서, 이는 단순 무혈청 배지를 사용한 경우보다 적게는 2배 이상 많게는 10배 정도 단백질 생산량을 증가시킨다.
일반적으로 동물세포는 배양 배지에 5-10 % 의 우태아 혈청을 첨가하여 생체 내와 유사한 환경을 조성하는 방법으로 배양한다. 이러한 배양 방법은 혈청 내에 포함된 각종 유기물 및 필수 영양원을 이용하여 세포가 성장하게 함으로 생체 내 (in vivo)가 아닌 배양기 내 (in vitro)에서 세포가 성장하는데 요구되는 최적의 조건을 충족시켜 준다.
그러나 동물세포를 외부로부터 혈청을 가하여 배양하는 경우 이 과정에 수반되는 여러가지 문제점도 함께 존재하게 된다. 구체적으로 세포 배양 배지 내에는 약 5-10 % 의 혈청이 포함되므로 동물세포를 이용하여 단백질 의약품을 생산하는 경우, 배지 내로 분비된 단백질과 혈청 단백질을 분리하는 과정이 필요하고 이는 단백질의 정제 과정을 어렵게 한다. 또한 혈청의 가격이 매우 고가이므로 혈청 배지를 이용하여 단백질을 대량 생산하는 경우 생산 비용이 증가한다. 따라서 재조합 단백질의 생산을 동물세포를 이용하여 산업화하는 과정에서 혈청의 사용이 큰 문제가 되어왔고, 이를 개선하기 위하여 무혈청 배지를 사용하는 것이 고려되었다. 무혈청 배지는 혈청이 첨가되지 않아 여러가지 측면에서 기존의 혈청 배지를 사용하는 경우의 문제점을 보완할 수가 있으나, 이를 사용하는 경우 동물세포에서 유전자 재조합 방법으로 특정 단백질을 생산하고, 바람직하게는 고수율로 생산하려는 것이 어렵다. 일반적으로 무혈청 배지를 사용하는 경우 세포의 성장 측면에서 혈청 배지를 사용하는 것에 비하여 바람직하지 않다.
상기의 단점을 극복하는 배양 배지를 얻기 위하여 많은 연구자들에 의하여 계속적인 연구가 시도되었다. 구체적으로 기브코 (Gibco)사에서는 CHO 세포를 배양하는데 있어서 필요한 각종 영양요소를 포함시킨 무혈청 배지를 개발하여 현재 CHO-s- SFM-II 라는 상품명으로 판매하고 있으며, 이는 CHO 세포를 이용하여 재조합 단백질 등을 생산하는데 있어서 널리 이용되고 있다.
한편 동물세포를 이용한 재조합 단백질의 생산에 있어서 소듐 부틸레이트 (sodium butyrate)라는 화학물질을 세포 배양 배지에 첨가하면 단백질의 생산량이 증가하는 것이 보고되었다 (J. Biotechnology, 19: 35, 1991). 소듐 부틸레이트는 세포 주기에 관여하는 물질로 알려져 있는데, 이를 배지에 첨가하면 일종의 세포증식 억제제로서 기능하여 세포가 분할되는 전 단계 (단백질 생산 단계)에서 세포 주기를 멈추게 하고 더 많은 수의 세포가 계속 단백질을 생산하도록 한다.
또한, 이러한 연구 결과들과 관련하여 토포아이소머라제 Ⅱ (topoisomerase Ⅱ)의 저해제로 알려진 노보바이오신 (novobiocin)을 동물세포 배양 배지에 첨가하는 경우 EPO 의 생산량이 증대됨을 확인하여 본 발명자들이 대한민국 특허출원 제 97-66475호로 출원한 바 있다. 토포아이소머라제는 DNA 복제시 이중나선 구조를 풀었다가 다시 결합시켜 주는 과정에 관여하는 효소로서, 이 효소가 저해를 받으면 결과적으로 세포 분열이 일어나지 않게 되는 특성을 가지므로 노보바이오신은 암세포 증식 억제제로서 연구 대상이 되어왔다 (Cancer Research, 49: 4752, 1989; Cancer Research, 50: 2577, 1990; Cancer Research, 52: 3515, 1992). 이들 노보바이오신과 소듐 부틸레이트는 일종의 세포주기 억제제로 작용하는 공통점을 가지므로, 이들을 세포 배양 시에 첨가하면 세포 증식이 억제되는 대신 다른 신진대사가 활발하게 촉진되어 단백질의 생산성을 기존의 세포 배양 방법과 비교하여 2-3 배 높일 수 있다. 이외에도 기존의 배양 배지에 사용되는 삼투압보다 더 높은 삼투압을 가지는 배지에 항삼투압 물질인 글리신 베타인을 첨가함으로 단백질의 생산량을 3배 이상 증대시킨 연구를 수행하여 본 발명자들이 대한민국 특허출원 제 97-66476호로 출원한 바 있다.
이에 본 발명자들은 동물세포에서 재조합 단백질의 생산량을 증대시키기 위하여 계속 연구한 결과, 중국 햄스터 난소유래 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포를 기존 무혈청 배지에 일정량의 천연 추출물을 첨가하여 배양하면 이로부터 생산되는 에리스로포이에틴의 양이 단순 무혈청 배지를 사용한 경우보다 탁월하게 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 생약재 또는 천연 추출물을 이용하여 동물세포로부터 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
도 1 은 중국 햄스터 난소유래 세포를 무혈청 배지인 CHO-s-SFM-II (Gibco사)에 일정량의 천연 추출물 (Ⅰ)을 첨가하여 배양하는 경우, 이로부터 생산되는 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO)의 양이 48시간 동안 변화되는 양상을 나타낸 것이다.
도 2 는 중국 햄스터 난소유래 세포를 무혈청 배지인 CHO-s-SFM-II 에 일정량의 천연 추출물 (Ⅱ)을 첨가하여 배양하는 경우, 이로부터 생산되는 에리스로포이에틴 (EPO)의 양이 48시간 동안 변화되는 양상을 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 동물세포를 생약재 또는 천연 추출물을 첨가한 배지를 사용하여 배양함으로 재조합 단백질의 생산을 증대시키는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 무혈청 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산을 증대시킨다.
본 발명은 상기 과정으로 중국 햄스터 난소유래 (CHO) 세포에서 에리스로포이에틴의 생산량을 증대시킨다.
본 발명의 방법에 사용하는 생약재 또는 천연물로는 양송이버섯, 교미, 팽이, 케일, 대파, 토마토, 진피, 호마인, 황정, 숙지황, 익지인, 산약, 양파, 맥문동, 호로파, 케롯, 현삼, 백출, 구기자, 송엽 및 느타리가 포함되며, 바람직하게는 양송이, 진피, 익지인, 양파, 호로파, 케롯 및 송엽이 포함된다.
이외에도, 본 발명의 방법에 사용하는 생약 및 천연물로는 육계, 인삼, 표고버섯, 상심, 파극천, 녹각교, 봉말, 오미자, 보골지, 감초, 천문동, 육종용, 두충, 천궁, 백합, 백하수오, 백작약 및 산수유가 포함되며, 바람직하게는 육계, 상심 및 산수유가 포함된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 동물세포의 배양 배지에 생약재 또는 천연 추출물을 첨가하여 재조합 단백질의 생산을 증대시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 재조합 단백질의 정제 과정을 간편하게 하고, 비용이 적게 드는 무혈청 배지를 사용하여 동물세포에서 재조합 단백질을 대량 생산하게 한다.
본 발명은 생약재 또는 천연물로 양송이버섯, 교미, 팽이, 케일, 대파, 토마토, 진피, 호마인, 황정, 숙지황, 익지인, 산약, 양파, 맥문동, 호로파, 케롯, 현삼, 백출, 구기자, 송엽, 느타리, 육계, 인삼, 표고버섯, 상심, 파극천, 녹각교, 봉말, 오미자, 보골지, 감초, 천문동, 육종용, 두충, 천궁, 백합, 백하수오, 백작약, 산수유 등을 사용한다. 이외의 모든 생약재 또는 천연물은 배양 배지에 첨가되어 상기 방법에 이용될 수 있다.
본 발명은 상기 생약재 또는 천연물을 저급 알코올을 가하여 상온에서 냉침법으로 활성성분을 추출한 다음 그 추출물을 물중탕법 등으로 자연 건조시키고 인산완충용액으로 다시 재추출하여 필터로 여과한다. 이와 같은 과정으로 멸균 추출된 상기 추출물을 세포 배양 배지에 적당량 첨가하여 동물세포를 배양한다.
본 발명은 이미 출원된 바 있는 재조합 에리트로포이에틴 (recombinant erythropoietin, EPO)을 생산하는 유전자 재조합 CHO 세포주 (수탁번호 : KCTC 0220 BP)를 생약재 또는 천연 추출물이 포함된 무혈청 배지에 배양함으로써 에리트로포이에틴의 생산량을 탁월하게 증대시켰다.
구체적으로, 상기 생약재 및 천연 추출물을 배지에 첨가하면 모든 시료에서 에리트로포이에틴의 분비량이 모든 시료에 있어서 2배 이상 증가되고, 특히 양송이, 진피, 익지인, 양파, 호로파, 케롯, 송엽육계, 상심 또는 산수유의 추출물 등은 분비량을 4배 이상 증가시킨다.
본 발명의 방법에서 무혈청 배지로는 CHO-s SFM Ⅱ 무혈청 배지를 포함하여 이미 상업적으로 공지된 무혈청 배지는 모두 사용할 수 있고, 동물세포로는 CHO 세포를 포함하여 재조합 단백질의 생산을 위하여 유전자 조작된 동물세포는 모두 사용할 수 있으며, 부착 배양 세포 또는 현탁 배양 세포에 상관없이 모두 적용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 참조예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것으로, 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> EPO 생산 자극을 위한 천연 추출물 시료의 제조 Ⅰ
중국 햄스터 난소유래 세포에서 EPO 분비자극 실험을 수행하기 위하여, 양송이버섯, 교미, 팽이, 케일, 대파, 토마토, 진피, 호마인, 황정, 숙지황, 익지인, 산약, 양파, 맥문동, 호로파, 케롯, 현삼, 백출, 구기자, 송엽, 느타리와 같은 약재를 각각 100g 씩 정량하여 준비하였다. 이들의 자연물에 메탄올을 300ml씩 가하여 상온에서 냉침법으로 활성성분을 추출하였다. 메탄올 추출물 용액을 60-70℃ 온도에서 물중탕법으로 자연 건조시키고 얻어진 침전물은 인산완충용액으로 다시 재추출하였다. 이 때 얻은 인산완충용액 추출물을 0.2μm 주사기 필터로 여과하여 무균의 추출물 용액을 얻었다.
<실시예 2> EPO 생산 자극을 위한 천연 추출물 시료의 제조 Ⅱ
중국 햄스터 난소유래 세포에서 EPO 분비자극 실험을 수행하기 위하여, 육계, 인삼, 표고버섯, 상심, 파극천, 녹각교, 봉밀, 오미자, 보골지, 감초, 천문동, 육종용, 두충, 천궁, 백합, 백하수오, 백작약, 산수유와 같은 약재를 각각 100g 씩 정량하여 준비하였다. 이들의 자연물에 메탄올을 300ml씩 가하여 상온에서 냉침법으로 활성성분을 추출하였다. 메탄올 추출물 용액을 60-70℃ 온도에서 물중탕법으로 자연 건조시키고 얻어진 침전물은 인산완충용액으로 다시 재추출하였다. 이 때 얻은 인산완충용액 추출물을 0.2μm 주사기 필터로 여과하여 무균의 추출물 용액을 얻었다.
<참조예> 배지 내의 EPO 정량방법
본 발명은 배지 내로 분비된 EPO 양을 정량하기 위하여, 항원포획법 (antigen capture assay)을 다음과 같은 과정으로 수행하였다. 실험실에서 제조한 EPO 에 대한 단일항체 (monoclonal antibody)를 1X 인산완충용액 (phosphate buffered saline, PBS)로 적절히 희석하여 96-웰 플레이트의 각 공에 50μl 씩 흡착시킨 다음 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 내용물을 제거하고 블로킹 용액 (30% 우태아 혈청 (FBS), 0.06% 트윈 20, 0.02% 티머로살을 인산완충용액에 녹임)을 각 공에 200μl 씩 가하여 이를 2시간 동안 방치하였다. 다음 블로킹 용액을 제거하고 각 공에 측정하고자 하는 시료를 50μl 씩 주입하여 37℃ 에서 2시간 동안 반응시켰다. 이를 TPBS 완충용액 (트윈 20 (0.05%) + 인산완충용액)으로 충분히 세척하고 토끼에서 정제된 폴리클론 항체 (polyclonal antibody)를 적절히 희석하여 각 공에 50μl씩 주입함으로 포획된 EPO 와 결합시켰다. 이를 37℃에서 1시간 경과한 다음 TPBS 완충용액으로 세척하고 염소 혈청에서 정제한 토끼 IgG 에 대한 항체에 호스 래디쉬 퍼옥시다제 (horse radish peroxidase, HRP)를 결합시킨 것을 적절히 희석하여 각 공에 50μl씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 TPBS 완충용액으로 다시 세척하고 TMB (tetra methyl benzidine) 기질을 100μl씩 각 공에 넣어 발색시킨 다음 흡광도를 측정하였다. 이 때 흡광도는 450nm 의 흡광도에서 650nm 의 흡광도를 뺀어 차이로 결정하고, 그 수치를 표준 EPO 곡선에 대입하여 최종 EPO 양을 정량한다.
<실시예 3> 천연 추출물을 이용한 중국 햄스터 난소유래 세포의 자극 실험
상기에서 얻은 천연 추출물의 동물세포 배양에서의 효과를 조사하기 위하여, 중국 햄스터 난소유래 세포는 6-웰 플레이트 (Falcon사)를 이용하여 배양하였다. 각 공당 면적은 9.6cm2로서 각 공에 세포 2 x 105개를 주입하는데 이 때 배양액으로는 10% 우태아 혈청 (FBS)이 첨가된 혈청 배지를 사용하였다. 24시간이 경과하면 세포가 바닥에 부착되었음을 확인하고 배지를 제거한 다음 인산완충용액으로 세척하고 다시 무혈청 배지를 각 공당 2.5ml씩 주입하였다. 각 시료의 반복수는 2 로 하였으며 대조군은 인산완충용액을 0.5ml씩 추가로 가하여 최종 3ml이 되도록 맞추고, 시료군은 상기 추출물이 포함된 인산완충용액을 0.5ml 씩 가하여 대조군과 부피가 동일하게 조정하였다. 이 때 각 세포에 첨가된 추출물의 함량은 정량적으로 결정되지 않았으며 실험의 성격상 EPO 분비자극 효과를 확인하는 정도의 정성적인 실험에 부합되는 범위 내에서 실시하였다. 배지를 교체하여 48시간이 경과한 다음 배지를 회수하고 원심분리하여 상등액을 취하였다. 이를 이용하여 참조예의 방법으로 배지 내에 분비된 EPO 를 정량하였다.
다음 정량 결과를 다음의 표 1 및 표 2 에 나타내어 도 1 및 도 2 에 표시하였고, 증가비는 대조군 대비 각 처리군에서 얻어진 정량값을 환산한 것이다. 하기에 표기된 여러 시료이외의 시료들을 이용하여 동일한 조건에서 실험도 실시할 수 있으며 상기에서 세포 파괴 또는 괴사를 유발하는 시료의 정량값은 제외하였다. 다음의 수치들은 현미경 하에서 세포의 외형적 변화 또는 파쇄를 유발하지 않는 기준으로 선정하였다.
시료명 EPO 정량값(μg/ml) 증가비
대조군 0.51 0.55 1
양송이버섯 3.34 3.38 6.339623
교미 0.3 0.27 0.537736
팽이 1.84 1.48 3.132075
케일 0 0 0
대파 1.49 1.84 3.141509
토마토 1.98 1.82 3.584906
진피 2.61 2.52 4.839623
호마인 1.15 0.67 1.716981
황정 0 0 0
숙지황 1.18 1.03 2.084906
익지인 3.6 4.27 7.424528
산약 1.5 1.64 2.962264
양파 2.6 1.78 4.132075
맥문동 1.48 1.43 2.745283
호로파 2.27 2.42 4.424528
케롯 6.2 5.21 10.76415
현삼 0 0 0
백출 0 0 0
구기자 1.58 1.55 2.95283
송엽 3.79 4.08 7.424528
느타리 1.13 1.44 2.424528
상기 결과를 보면 대조군에 비하여 상기 15개의 시료 모두가 EPO 의 분비량을 2배 이상 증가시킴을 알 수 있었다. 특히 양송이, 진피, 익지인, 양파, 호로파, 케롯, 송엽 등은 4배 이상 분비량을 증가시켰다.
시료번호 정량값 시료번호 정량값
육계 4.54 3.27 천문동 0.88 0.97
인삼 3.46 2.46 육종용 0.29 0.15
표고버섯 3.73 2.19 두충 3.47 3.26
상심 4.23 5.61 천궁 2.57 2.76
파극천 2.45 2.04 백합 0.94 0.73
녹각교 0.31 0.3 백하수오 0.94 1.04
봉밀 0 0 백작약 2.12 1.98
감초 1.14 1.46 산수유 3.75 3.81
대조군 1.05 0.82
상기 결과를 보면 대조군에 비하여 상기 9개의 시료 모두가 EPO 의 분비량을 2배 이상 증가시킴을 알 수 있었다. 특히 육계, 상심, 산수유 등은 4배 이상 분비량을 증가시켰다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법은 CHO 세포를 포함한 동물세포의 배양 배지에 생약 또는 천연 추출물을 첨가함으로 재조합 단백질의 생산량을 10배 정도 증가시킬 수 있고, 특히 무혈청 배지를 사용하므로 재조합 단백질을 보다 경제적으로 생산하여 간편하게 정제할 수 있게 한다.

Claims (6)

  1. 동물세포를 생약재 또는 천연 추출물을 첨가한 배지를 사용하여 배양함으로 재조합 단백질의 생산을 증대시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 배양 배지로는 무혈청 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 동물 세포로는 중국 햄스터 난소유래 세포를 이용하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 재조합 단백질은 에리스로포이에틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 생약재 및 천연물로는 양송이버섯, 교미, 팽이, 케일, 대파, 토마토, 진피, 호마인, 황정, 숙지황, 익지인, 산약, 양파, 맥문동, 호로파, 케롯, 현삼, 백출, 구기자, 송엽 및 느타리가 포함되며, 바람직하게는 양송이, 진피, 익지인, 양파, 호로파, 케롯 및 송엽이 포함되는 방법
  6. 제 1항에 있어서, 생약재 및 천연물로는 육계, 인삼, 표고버섯, 상심, 파극천, 녹각교, 봉말, 오미자, 보골지, 감초, 천문동, 육종용, 두충, 천궁, 백합, 백하수오, 백작약 및 산수유가 포함되며, 바람직하게는 육계, 상심 및 산수유가 포함되는 방법.
KR1019980009337A 1998-03-18 1998-03-18 천연 추출물을 첨가하여 중국햄스터 난소 유래세포에서 에리스로포이에틴의 생산 증대방법 KR100434729B1 (ko)

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