KR102682066B1 - 항체 집단의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항체 집단의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 항체를 발현시키는 재조합 세포의 배양 시, pH 및 배양 온도 등의 배양 조건을 정교하게 조절하여 목적하는 품질의 항체 집단, 생물학적 활성이 우수한 고품질의 항체 집단을 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 pH, 배양 온도 및/또는 젖산(Lactic acid) 공급을 조절하여 목적하는 주활성 항체 및 이성질 항체 비율을 갖는 항체 집단, 목적하는 글리칸(glycan) 구조를 갖는 항체 집단을 효과적으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하여 치료용 단일클론항체의 제조 시 목적하는 치료 효능에 도달할 수 있는 우수한 생물학적 활성을 갖는 고품질의 항체를 제조할 수 있으며, 특히 바이오시밀러 의약품의 제조에 있어서 배양 조건을 정교하게 조절하여 오리지널 의약품과 동일하거나 매우 유사한 품질의 항체를 효과적으로 제조할 수 있다.
본 발명은 pH, 배양 온도 및/또는 젖산(Lactic acid) 공급을 조절하여 목적하는 주활성 항체 및 이성질 항체 비율을 갖는 항체 집단, 목적하는 글리칸(glycan) 구조를 갖는 항체 집단을 효과적으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하여 치료용 단일클론항체의 제조 시 목적하는 치료 효능에 도달할 수 있는 우수한 생물학적 활성을 갖는 고품질의 항체를 제조할 수 있으며, 특히 바이오시밀러 의약품의 제조에 있어서 배양 조건을 정교하게 조절하여 오리지널 의약품과 동일하거나 매우 유사한 품질의 항체를 효과적으로 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 항체 집단의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 항체를 발현시키는 재조합 세포의 배양 시, 배양 조건을 정교하게 조절하여 목적하는 품질의 항체 집단을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.
한국바이오의약품협회에서 2020년 12월에 발표한 『바이오의약품 산업동향보고서』에 따르면, 글로벌 바이오 의약품 시장은 2012년부터 2019년까지 연평균 약 8.6%로 성장해왔으며, 향후 연평균 약 10.1% 씩 성장해 2026년에는 약 5,050억달러에 달할 것으로 전망되고 있다.
우리나라 역시 인구 고령화와 만성질환이 증가함에 따라 바이오 의약품 산업 확대는 지속될 것으로 전망되고 있으며, 바이오 의약품 시장 규모가 2018년 2조 2,309억에서 2019년 2조 6,002억원으로 16.6%가 증가했다는 점을 고려하면 성장 규모는 더욱 확대될 것으로 전망되고 있다. 그러나, 국내 바이오 의약품 시장 규모의 증가에 반해, 국내 바이오 의약품의 생산 실적 및 수출 실적은 2018년 대비 2019년에 각각 2.8 % 및 12.8 % 감소한 것으로 보고되고 있으며, 이에 글로벌 바이오 의약품 시장 성장에 대응하여 바이오 의약품의 생산성 향상 및 품질 개선을 위한 적극적인 연구 개발이 요구되고 있다.
2019년 매출 기준, 글로벌 바이오 의약품 가운데 51.1%의 점유율을 차지하는 의약품인 항체 치료제는 포유동물 등의 세포, 예컨대 CHO (Chinese hamster ovary) 세포 등을 재조합하여 이에 적합화된 생물반응기에서 배양하는 바이오 공정에 의해 생산된다. 이러한 공정은 배지, 온도, pH 등의 배양 조건에 가해지는 작은 수치 변화에도 민감하게 반응하여, 항체의 생산성뿐만 아니라 이를 이용한 의약품의 품질에까지 영향을 미치게 된다. 이에 고품질의 항체를 최대 수율로 수득하기 위하여, 배양 조건의 여러 공정 파라미터들을 조절하고자 하는 연구가 오랫동안 지속되어 왔으나, 작은 수치 변경에도 그 변화가 크고 특정 항체마다 특정 조건에서의 생산성 및 항체 품질(N-글리칸 분석 등)에 큰 차이를 보여, 이에 대한 만족할 만한 결과를 획득하기에 어려움이 있었다.
또한, 바이오시밀러 의약품의 경우에는 오리지널 의약품과 최대한 유사한 품질의 생성물을 수득하는 것이 관건이며, 이에 수득되는 항체 집단에서의 주활성 항체와 이성질 항체의 비율 조절 및 글리칸(glycan) 구조 또한 중요한 요소가 되므로, 이러한 조건까지 고려하여 최적화된 배양 조건을 수립하는 것은 여전히 기술적 난제로 남아 있는 상황이다.
재조합 세포의 배양 조건을 조절하여 생성물의 생산성, 품질 등을 개선하고자 하는 연구에 관한 특허문헌으로 대한민국공개특허 KR10-2021-0043618호(공개일: 2021.04.21), 대한민국등록특허 KR10-1724405호(등록일: 2017.04.03) 등이 있으나, 항체의 생산성 및 품질을 최대화하면서 항체 집단의 주활성 항체와 이성질 항체의 비율 및 글리칸 구조까지 적합하게 조절하는 방법에 관하여는 전혀 알려진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 항체를 발현시키는 재조합 세포의 배양 시, 배양 조건을 정교하게 조절하여 목적하는 품질의 항체 집단, 생물학적 활성이 우수한 고품질의 항체 집단을 제조하는 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
구체적으로 본 발명은 항체를 발현시키는 재조합 세포의 배양 시, pH, 배양 온도 및/또는 젖산(Lactic acid) 공급을 조절하여 목적하는 주활성 항체 및 이성질 항체 비율을 갖는 항체 집단을 제조하는 방법을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 항체를 발현시키는 재조합 세포의 배양 시, pH, 배양 온도 및/또는 젖산 공급을 조절하여 목적하는 글리칸(glycan) 구조를 갖는 항체 집단을 제조하는 방법을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 상기의 기재에 국한되지 않으며 본 발명을 활용하여 적절한 효과를 얻을 수 있는 모든 경우를 목적으로 하여 제공된다.
본 발명자들은 목적하는 품질의 항체 집단을 제조하기 위하여, 재조합 세포 배양 시의 pH, 배양 온도 및 젖산 공급의 정교한 조절을 통해, 항체 집단의 주활성 항체 및 이성질 항체 비율을 조절하고 글리칸 구조를 조절할 수 있음을 최초로 규명하고 이에 대한 발명을 완성하였다.
구체적으로 본 발명은, (a) 항체를 발현시키는 재조합 세포를 36℃ 내지 38℃의 제1 배양온도에서 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 4일 내지 6일 동안 배지에서 배양하는 제1 온도 배양단계; 및
(b) 상기 배양된 재조합 세포를, 상기 (a) 단계의 제1 배양온도 보다 2℃ 내지 4℃ 낮되, 34℃ 이상으로 설정한 제2 배양온도에서 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 6일 내지 8일 동안 배지에서 배양하는 제2 온도 배양단계; 를 포함하는 항체 집단의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 (b) 단계에서 상기 제2 배양온도에서의 배양 1일차 내지 3일차부터 매일 배지 10 ㎖ 당 0.1 내지 2M의 젖산(lactic acid)을 80 내지 120 ㎕ 씩 첨가하여 배양하는 조건을 추가한, 항체 집단의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 림프와 혈액 내에 존재하며 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 의미한다. 본 발명에서 항체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 분야에서 통상적으로 알려진 항체, 통상적으로 사용되는 치료용 항체 등을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 일 목적상 상기 항체는 단일클론항체일 수 있으며, 보다 구체적인 일 예로 아달리무맙(adalimumab)일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "단일클론항체(monoclonal antibody)"는 하나의 항원 결정기(epitope)에만 반응하는 항체로서, 단일의 항체 생성 세포로부터 만들어진 항체를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "아달리무맙(adalimumab)"은 TNF-α에 대한 단일클론항체로서, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 소아 특발성 관절염 등의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 아달리무맙은 미국의 애브비(AbbVie) 社에서 개발한 의약품 휴미라(Humira®)의 성분으로서 자가면역질환 등의 치료제로 유통되고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항체를 발현시키는 재조합 세포"는 형질전환에 의하여 특정 항체를 생산할 수 있도록 재조합된 세포를 의미하며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 재조합 세포의 비제한적인 예로 포유동물세포일 수 있으며, 보다 구체적으로 중국 햄스터 난소 세포(CHO; Chinese hamster ovary cell)일 수 있다.
본 발명의 상기 "항체를 발현하는 재조합 세포"는 본 발명의 일 목적상 단일클론항체를 발현하는 재조합 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로는 아달리무맙(adalimumab)을 발현하는 재조합 세포일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 아달리무맙을 발현하는 재조합 중국 햄스터 난소 세포(CHO; Chinese hamster ovary cell)를 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "배지"는 증식성 세포에 영양을 공급하는 영양소 함유 용액을 폭넓게 의미하며, 이러한 용액은 일반적으로 세포가 증식 및/또는 생존하는데 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 탄소원, 지질 및 미량원소 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 배지는 배양하고자 하는 세포 종류에 따라 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염농도로 제조되는 것이 바람직하며, 호르몬 및 성장인자를 비롯하여 증식 및/또는 생존을 증가시키는 성분으로 당업계에서 널리 사용되는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 항체 집단을 제조하는 방법은 항체를 발현시키는 재조합 세포를 배양하는 배양 온도 조건에 따라 제1 온도 배양단계 및 제2 온도 배양단계로 구분되는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제1 온도 배양단계는 항체를 발현시키는 재조합 세포를 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 배양 배지에서 4일 내지 6일 동안 36℃ 내지 38℃의 제1 배양온도에서 배양하는 방식으로 수행될 수 있다. 상기 제1 온도 배양단계는 본 발명의 일 목적상, 우수한 생물학적 활성을 갖는 단일클론항체, 예컨대 고품질의 아달리무맙 항체 집단을 제조하기 위하여 pH 범위를 pH 7.0 내지 7.1, 더욱 상세하게 pH 7.0 내외, 더욱 상세하게 pH 7.0으로 설정할 수 있고, 제1 배양 온도 범위를 36℃ 내지 38℃, 더욱 상세하게 36.5℃ 내지 37.5℃, 더욱 상세하게 37℃ 내외로 설정할 수 있으며, 배양 기간을 4일 내지 6일, 더욱 상세하게 5일로 설정할 수 있다.
상기 제2 온도 배양단계는 상기 제1 온도 배양단계에 의해 배양된 상기 재조합 세포를, 상기 제1 온도 배양단계의 제1 배양온도 보다 2℃ 내지 4℃ 낮되, 34℃ 이상으로 설정한 제2 배양온도에서 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 6일 내지 8일 동안 배지에서 배양하는 방식으로 수행될 수 있다. 상기 제2 온도 배양단계는 본 발명의 일 목적상, 우수한 생물학적 활성을 갖는 단일클론항체, 예컨대 고품질의 아달리무맙 항체 집단을 제조하기 위하여 pH 범위를 pH 7.0 내지 7.1, 더욱 상세하게 pH 7.0 내외, 더욱 상세하게 pH 7.0으로 설정할 수 있고, 제2 배양 온도 범위를 34℃ 내지 36℃, 더욱 상세하게 34.5℃ 내지 35.5℃, 더욱 상세하게 35℃ 내외로 설정할 수 있으며, 배양 기간을 6일 내지 8일, 더욱 상세하게 7일로 설정할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제2 온도 배양단계에 있어서, 상기 제2 온도에서의 배양 1일차 내지 3일차부터 매일 배지 10 ㎖ 당 0.1 내지 2M의 젖산(lactic acid)을 80 내지 120 ㎕ 씩 첨가하는 조건을 추가하여 배양하는 방식으로 수행될 수 있다. 상기 제2 온도 배양단계에 있어서 젖산을 첨가하는 조건을 추가하여 수행하는 경우, 본 발명의 일 목적상, 우수한 생물학적 활성을 갖는 단일클론항체, 예컨대 고품질의 아달리무맙 항체 집단을 제조하기 위하여 상기 젖산 첨가 시기를 상기 제2 온도에서의 배양 1일차 내지 3일차부터, 더욱 상세하게는 배양 2일차부터, 더욱 상세하게는 제1 온도 배양단계에서 5일 배양한 후, 제2 온도 배양단계에서의 배양 2일차로서 총 배양 7일차부터로 설정할 수 있으며, 첨가되는 젖산의 양은 매일 80 내지 120 ㎕, 더욱 상세하게는 90 내지 110 ㎕, 더욱 상세하게는 100 ㎕ 내외로 첨가되도록 설정할 수 있다.
상기 젖산 첨가에 있어서, "배지 10 ㎖ 당"의 의미는, 상기 제2 온도 배양단계에서의 배양 1일차 내지 3일차의 배양 용기 내의 배지 및 배양액을 포함한 작업 부피(working volume; WV) 10 ㎖ 당을 의미하며, "작업 부피(working volume; WV)"의 의미는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 이해할 수 있는 사항이다.
상기 첨가되는 젖산의 형태 등은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 형태의 젖산을 사용할 수 있다. 그 비제한적인 예로, 본 발명의 일 목적상 젖산은 젖산 용액의 형태로 사용될 수 있으며, 더욱 상세하게는 L-젖산 용액 형태로 사용될 수 있고, 농도는 0.1 내지 2M, 더욱 상세하게는 0.5 내지 2M, 더욱 상세하게는 1M 내외일 수 있다.
본 발명의 일 목적상, 우수한 생물학적 활성을 갖는 단일클론항체, 예컨대 고품질의 아달리무맙 항체 집단을 제조하기 위하여 일 실시예에서,
(a) 아달리무맙 항체를 발현시키는 재조합 세포를 배양 배지에서 37℃ 및 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 5일 동안 배양하는 제1 온도 배양단계; 및
(b) 상기 5일간 배양된 재조합 세포를 35℃의 배양온도에서 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 7일 동안 배양하되, 배양 3일차부터 배지에 1M 농도의 L-젖산 용액 100 ㎕를매일 첨가하여 배양하는 제2 온도 배양단계; 를 포함하여 수행하는 방식으로 항체 집단을 제조하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기의 방식으로 아달리무맙 항체 집단을 제조하여, 주활성 항체를 55% 이상, 더욱 상세하게는 60% 이상 포함하고, 이성질 항체를 45% 이하, 더욱 상세하게는 40% 이하로 포함하는 고품질의 항체 집단, 구체적으로 아달리무맙의 대조약인 휴미라와 매우 유사한 품질의 항체 집단을 제조하였다(실시예 3). 또한, 상기의 방식으로 아달리무맙 항체 집단을 제조하여, 65% 내지 80%의 G0F 형태, 3% 내지 6%의 G0F+GN 형태 및 3% 내지 6%의 G0F-N 형태를 포함하는 글리칸(glycan) 구조를 갖는 고품질의 항체 집단, 구체적으로 아달리무맙의 대조약인 휴미라와 매우 유사한 품질의 항체 집단을 제조하였다(실시예 4).
본 발명에서 사용되는 용어, "항체 집단(a population of antibodies)"은 주활성 항체, 이성질 항체 또는 주활성 항체와 이성질 항체를 모두 포함하는 항체군을 의미한다. 본 발명의 일 목적상 상기 항체 집단은 주활성 항체 및 이성질 항체를 모두 포함할 수 있으며, 상기 이성질 항체는 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "주활성 항체"는 항체 집단의 항체 중, 생물학적 활성이 가장 높은 항체로서, 항체 내 아미노산이 탈아민 또는 산화 등에 의해 변형(modification)되지 않은 상태의 항체를 의미한다. 주활성 항체의 비율은 특히 항체 치료제의 품질에 있어서 중요한 요소가 된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "이성질 항체"는 항체 집단의 항체 중, 항체 내 일부 아미노산이 탈아민 또는 산화 등에 의해 변형되어 생물학적 활성이 낮아진 항체를 의미한다. 이성질 항체에는 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체가 있으며, 주활성 항체, 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체 간에는 전하(charge)의 미세한 차이가 있어 전하 변이체(charge variant)라고도 불린다. 이성질 항체들은 이러한 전하 차이를 이용하여 분리할 수 있다. 상기 이성질 항체의 비제한적인 예로, 아미노산 중 아스파라긴(Asparagine)이 탈아민되어 아스파테이트(Aspatate)가 된 이성질 항체, 아미노산 중 메티오닌(methionine)이 산화되어 메티오닌설페이트(Methionine sulfate)가 된 이성질 항체 등이 있다. 또한, 중쇄의 N 말단에 글루타메이트(glutamate)가 존재하는 경우, 상기 글루타메이트가 오각형 링 구조를 형성하여 파이루글루타메이트(Pyruglutamate)로 변형된 이성질 항체를 포함한다.
상기 이성질 항체들은 CHO 세포와 같은 숙주세포에서 항체를 생성하는 경우에 높은 비율로 숙주세포 배양액에 포함되어 있어, 크로마토그래피와 같은 과정을 통하여 제거되어 목적하는 비율로 항체 집단에 포함될 수 있다. 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 숙주세포에서 고품질의 항체 집단을 제조하기 위해서는 상기와 같은 주활성 항체 및 이성질 항체가 원하는 함량으로 포함되어야 할 필요성이 있다.
상기 이성질 항체들은 항체에서 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형된 것으로서, 이성질 항체마다 생물학적 활성이 차이가 있다고 알려져 있어, 상기 이성질 항체들의 함량 분포를 일정하게 유지하는 것이 일관된 품질을 유지하기 위해 중요하다. 특히 항체 바이오시밀러 의약품 제조에 있어서, 오리지널 의약품(대조약)과 대응되거나 유사한 조성으로 주활성 항체 및 이성질 항체의 비율이 조절되어 포함되도록 제조하는 것이 중요하며, 대조약과의 품질 비교 및 동질성 입증 등에 있어서 주활성 항체 및 이성질 항체의 비율이 중요한 하나의 판단 기준이 될 수 있다.
본 발명의 항체 집단 제조 방법에 의하여 제조된 항체 집단은 주활성 항체 및 이성질 항체를 모두 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 목적상 상기 항체 집단은 주활성 항체를 50% 이상 포함하고, 이성질 항체를 50% 이하로 포함할 수 있다. 또한 보다 우수한 생물학적 활성을 갖는 항체 집단을 제조하기 위하여, 본 발명의 항체 집단 제조 방법을 통해 주활성 항체를 55% 이상 포함하고 이성질 항체를 45% 이하로 포함하는 항체 집단을 제조할 수 있으며, 또한 주활성 항체를 60% 이상 포함하고 이성질 항체를 40% 이하로 포함하는 항체 집단을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 목적상 아달리무맙 항체 집단을 제조할 수 있으며, 아달리무맙의 오리지널 의약품인 휴미라(Humira®)를 대조약으로 하여, 상기 대조약과 유사한 주활성 항체 및 이성질 항체 비율을 갖는 항체 집단을 제조할 수 있다. 상기 항체 집단은 대조약과 더욱 유사한 품질의 바이오시밀러 의약품 제조를 위하여, 주활성 항체 55% 이상 및 이성질 항체 45% 이하인 항체 집단; 주활성 항체 55% 이상, 산성 이성질 항체 15% 이하 및 염기성 이성질 항체 30% 이하인 항체 집단; 주활성 항체 55% 이상, 산성 이성질 항체 20% 이하 및 염기성 이성질 항체 25% 이하인 항체 집단; 주활성 항체 60% 이상 및 이성질 항체 40% 이하인 항체 집단; 주활성 항체 60% 이상, 산성 이성질 항체 20% 이하 및 염기성 이성질 항체 20% 이하인 항체 집단일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 주활성 항체 60% 이상, 산성 이성질 항체 20% 이하 및 염기성 이성질 항체 25% 이하인 항체 집단일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 집단 제조 방법은 보다 고순도의 항체 집단을 수득하기 위하여, 배양을 통해 항체 집단을 포함하는 혼합 시료를 수득한 후, 숙주세포 단백질(HCP), 숙주세포 유래 DNA (HCD), 세포 생장을 위한 인자 등과 같은 불순물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 불순물을 제거하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 집단 제조 방법에 의하여 항체 집단을 제조하는 경우, 상기 불순물 제거 후에 별도의 여과 및 정제 공정을 수행하여 목적하는 비율의 주활성 항체 및 이성질 항체가 포함되도록 더욱 정교하게 조절할 수도 있으나, 본 발명의 항체 집단 제조 방법에 따라 제조하는 경우, 당해 기술분야에서 일반적으로 수행되는 상기 불순물 제거 이외의 별도의 여과 및 정제 공정을 거치지 않더라도 pH, 배양 온도 및 젖산 첨가에 따른 배양 조건 조절 및 시너지 효과로 목적하는 항체, 예를 들어 단일클론항체, 보다 구체적인 예로 아달리무맙의 생물학적 활성이 최대로 발휘될 수 있는 비율에 가깝도록 주활성 항체 및 이성질 항체가 포함된 항체 집단을 제조할 수 있다. 또한, 아달리무맙의 대조약와 비교하여 동일하거나 매우 유사한 비율의 주활성 항체 및 이성질 항체가 포함된 항체 집단을 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 항체 집단 내의 주활성 항체 및 이성질 항체의 비율을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 그 비제한적인 예로, 본 발명의 일실시예에서는 랩칩(LapChip®) 및 액체 크로마토그래피(CE-HPLC) 방법으로 주활성 항체 및 이성질 항체의 비율을 측정하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "글리칸(glycan) 구조"는 항체의 Fc 영역의 푸코실화(fucosylation), 비푸코실화(afucosylation) 및 갈락토실화(galactosylation) 등에 의한 당사슬 구조를 의미하며, 글리칸 구조를 이루는 주요 형태로 G0, G0F, G0F-N, G0F+GN, G1F, G1F+GN, G1, G2, G2F 등이 있다(도 7b).
상기 글리칸 구조에 따라 항체의 생물학적 활성이 차이가 있다고 알려져 있어, 치료용 항체의 경우 적절한 글리칸 구조를 갖는 것이 의약품의 품질에 중요한 요소가 된다. 특히 항체 바이오시밀러 의약품 제조에 있어서, 오리지널 의약품(대조약)과 대응되거나 유사한 글리칸 구조를 갖도록 조절되어 제조하는 것이 중요하며, 대조약과의 품질 비교 및 동질성 입증 등에 있어서 글리칸 구조가 중요한 하나의 판단 기준이 될 수 있다.
본 발명의 항체 집단 제조 방법은 목적하는 바에 따라, 구체적으로 수득하고자 하는 항체 집단의 품질에 따라 다양한 글리칸 구조를 갖는 항체 집단을 제조할 수 있다. 본 발명은 일 목적 상, pH, 배양 온도 및 젖산 공급을 정교하게 조절하여 65% 내지 80%의 G0F 형태를 포함하는 글리칸 구조를 갖는 항체 집단, 3% 내지 6%의 G0F+GN 형태를 포함하는 글리칸 구조를 갖는 항체 집단, 3% 내지 6%의 G0F-N 형태를 포함하는 글리칸 구조를 갖는 항체 집단을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 목적상 아달리무맙 항체 집단을 제조할 수 있으며, 아달리무맙의 오리지널 의약품인 휴미라(Humira®)를 대조약으로 하여, 상기 대조약과 유사한 글리칸 구조를 갖는 항체 집단을 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "푸코실화(fucosylation)"는 N-글리칸, O-글리칸 및 당지질에 푸코오스(fucose)의 잔기가 부착되는 것을 의미한다. 푸코실화 또는 비푸코실화(afucosylation)의 조절은 단일클론항체의 기능에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 글리코실화 (glycosylation) 패턴에서 감소된 푸코오스 즉, 비푸코실화된 단일클론항체가 푸코실화된 항체에 비해 더 높은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC; Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "비푸코실화(afucosylation)"는 상기 푸코실화와 반대되는 의미로서, 푸코오스의 잔기가 떨어져 나가는 것을 의미한다. 이는 디푸코실레이션(defucosylation)과 같은 의미로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 푸코실화의 정도가 감소됨을 의미한다.
본 발명에서 항체의 글리칸 구조를 분석하기 위한 방법, N-글리칸 분석을 수행하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 그 비제한적인 예로, 4중극 비행시간(Quadrupole Time of Flight, Qtof) 질량 분광계 분석 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 달리 정의되지 않은 용어들은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 해석한다. 또한, 본 발명에 기재된 “또는” 이라는 표현은 별도의 언급이 없는 경우, “및"을 포함하는 개념으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 개시되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한되지 않으며, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시되는 다양한 요소들의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범주에 속하는 것으로 해석된다. 또한, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험을 통하여 본 발명의 특정 실시예에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있으며, 이러한 등가물은 본 발명의 범주에 속하는 것으로 해석된다.
본 발명의 항체 집단을 제조하는 방법은 재조합 세포의 배양 시, pH 및 배양 온도 등의 배양 조건을 정교하게 조절하여 목적하는 품질의 항체 집단, 생물학적 활성이 우수한 고품질의 항체 집단을 효과적으로 제조할 수 있다.
구체적으로 본 발명은 항체를 발현시키는 재조합 세포의 배양 시, pH, 배양 온도 및/또는 젖산(Lactic acid) 공급을 조절하여 목적하는 주활성 항체 및 이성질 항체 비율을 갖는 항체 집단을 효과적으로 제조할 수 있다
또한, 본 발명은 항체를 발현시키는 재조합 세포의 배양 시, pH, 배양 온도 및/또는 젖산 공급을 조절하여 목적하는 글리칸(glycan) 구조를 갖는 항체 집단을 효과적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의하여 단일클론항체, 특히 치료용 단일클론항체의 제조 시 목적하는 치료 효능에 도달할 수 있는 우수한 생물학적 활성을 갖는 고품질의 항체를 제조할 수 있으며, 특히 바이오시밀러 의약품의 제조에 있어서 pH, 배양 온도 및/또는 젖산 공급 조건을 정교하게 조절하여 오리지널 의약품과 동일하거나 매우 유사한 품질의 항체를 효과적으로 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 배양 조건을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 IgG 역가 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 실시예 3-1에 따른 주활성 항체 비율에 대한 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 3a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 3b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 3c는 pH 및 온도에 따른 주활성 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 3a 및 도 3b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하다.
도 4a 내지 4c는 본 발명의 실시예 3-2에 따른 산성 이성질 항체 비율에 대한 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 4a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 4b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 4c는 pH 및 온도에 따른 산성 이성질 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 4a 및 도 4b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하다.
도 5a 내지 5c는 본 발명의 실시예 3-3에 따른 염기성 이성질 항체 비율에 대한 charge variant 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 5a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 5c는 pH 및 온도에 따른 염기성 이성질 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 5a 및 도 5b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하다.
도 6a 내지 6c는 본 발명의 실시예 3-4에 따른 젖산 공급에 의한 주활성 항체 및 이성질 항체의 비율 변화에 대한 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 6a는 주활성 항체의 비율 변화에 대한 그래프이고, 도 6b는 산성 이성질 항체의 비율 변화에 대한 그래프이며, 도 6c는 염기성 항체의 비율 변화에 대한 그래프이다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 실시예 4에 따른 N-글리칸(glycan) 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 7a는 수득된 항체 집단의 N-글리칸 분석 결과 및 대조약(휴미라)과의 유사성 분석 결과를 나타낸 표이고, 도 7b는 글리칸 분석에 활용되는 글리칸 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 IgG 역가 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 실시예 3-1에 따른 주활성 항체 비율에 대한 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 3a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 3b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 3c는 pH 및 온도에 따른 주활성 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 3a 및 도 3b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하다.
도 4a 내지 4c는 본 발명의 실시예 3-2에 따른 산성 이성질 항체 비율에 대한 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 4a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 4b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 4c는 pH 및 온도에 따른 산성 이성질 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 4a 및 도 4b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하다.
도 5a 내지 5c는 본 발명의 실시예 3-3에 따른 염기성 이성질 항체 비율에 대한 charge variant 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 5a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 5c는 pH 및 온도에 따른 염기성 이성질 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 5a 및 도 5b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하다.
도 6a 내지 6c는 본 발명의 실시예 3-4에 따른 젖산 공급에 의한 주활성 항체 및 이성질 항체의 비율 변화에 대한 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 6a는 주활성 항체의 비율 변화에 대한 그래프이고, 도 6b는 산성 이성질 항체의 비율 변화에 대한 그래프이며, 도 6c는 염기성 항체의 비율 변화에 대한 그래프이다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 실시예 4에 따른 N-글리칸(glycan) 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 7a는 수득된 항체 집단의 N-글리칸 분석 결과 및 대조약(휴미라)과의 유사성 분석 결과를 나타낸 표이고, 도 7b는 글리칸 분석에 활용되는 글리칸 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시에 불과하며, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 어떠한 의미로든 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1: pH, 온도 및 젖산 공급 조절에 따른 항체 집단의 제조
아달리무맙(adalimumab) 항체를 발현시키는 재조합 중국 햄스터 난소 세포(CHO; Chinese hamster ovary cell)를 배지에서 배양한 배양액을 15 mL의 일회용 배양 용기(vessel) 24개에 각각 1.1 mL 씩 접종하고, 이를 하기 표 1과 같은 배양 조건으로 Sartorius 社의 Ambr®15 생물반응기에서 총 12일 간 배양하였다.
| 배양 용기 | 온도(℃) | pH | 젖산 공급 여부 | |
| CS1 | 1, 2, 7 | 37.0 → 35.0 (배양 5일차에 온도 변경) |
6.9 | X |
| 8 | O | |||
| 3, 4, 9 | 7.0 | X | ||
| 10 | O | |||
| 5, 6, 11 | 7.1 | X | ||
| 12 | O | |||
| CS2 | 1, 2, 7 | 37.0 | 6.9 | X |
| 8 | O | |||
| 3, 4, 9 | 7.0 | X | ||
| 10 | O | |||
| 5, 6, 11 | 7.1 | X | ||
| 12 | O | |||
구체적으로, 배양 용기 24개 중 12개의 배양 용기는 배양 중 온도 변화를 주는 그룹(CS1-1 ~ CS1-12)으로, 다른 12개의 배양 용기는 온도 변화를 주지 않는 그룹(CS2-1 ~ CS2-12)으로 나누고, 각 그룹은 다시 세개의 하위 그룹으로 나누어 각각 pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1의 조건 하에 배양하였다. 또한, 각 pH 조건의 하위 그룹 당 1개의 배양 용기에는 배양 7일차부터 11일차까지 매일 작업부피(working volume; WV) 10 ㎖ 당 1M의 L-젖산 용액을 100 ㎕씩 주입하여 배양하였다. 상기 배양 조건에 따른 각 배양 용기를 도 1에 도식화하였다.
배양 종료 후, 배양액을 단백질 A 컬럼을 이용해 정제한 다음, IgG 역가(titer), 랩칩(LapChip®), 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CE-HPLC) 및 N-글리칸(N-glycan) 분석을 수행하였다.
실시예 2: IgG 역가(titer) 측정
실시예 1에서 수득한 항체 집단의 IgG 역가를 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
측정 결과, 상기 배양액의 IgG 역가는 배양 온도 및 pH 조건 모두에 상당한 영향을 받는 것으로 확인되었으며, 특히 pH 보다 온도에 더 큰 영향을 받는 것으로 확인되었다. 또한, 일정 범위 내에서 온도가 낮을수록, pH가 높을수록 IgG 역가가 상승하는 경향을 보였으며, 이에 비교적 높은 pH인 7.0 내지 7.1의 조건 및, 배양 온도를 초기 온도 37℃에서 35℃로 낮추는 온도 변화를 주는 조건이 재조합 세포의 항체 생산성을 높이는 데에 유리한 것으로 확인되었다(도 2).
실시예 3: 랩칩(LapChip®) 및 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CE-HPLC) 분석
실시예 1에서 수득한 항체 집단의 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석을 수행하고, 그 결과를 도 3 내지 5에 나타내었다.
실시예 3-1: 주활성 항체 분석 결과
LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과는 도 3에 나타내었다. 구체적으로 도 3a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 3b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 3c는 pH 및 온도에 따른 주활성 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 3a 및 도 3b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 상기 실시예 1 및 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하다. 구체적으로, 도 3a 및 3b 각각의 상단 그래프는 배양 1 ~ 4일차까지 37℃의 온도에서 배양 후, 배양 5일차부터 35℃로 온도 변화를 준 CS1 그룹에 대한 그래프이고, 하단 그래프는 배양 온도 변화 없이 37℃로 유지한 CS2 그룹에 대한 그래프이다. 그래프 상의 주황색 컬럼은 pH 6.9 조건; 녹색 컬럼은 pH 7.0 조건; 파란색 컬럼은 pH 7.1 조건에 대한 그래프이며, 노란선으로 테두리 표시된 컬럼 세 개는 배양 7일차부터 11일차까지 젖산을 공급한 조건에 대한 그래프이다.
상기 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과, 같은 pH 조건별로 비교해 볼 때, 배양 5일차에 37℃에서 35℃로 온도를 낮추는 변화를 준 CS1 그룹이 온도 변화를 주지 않은 CS2 그룹에 비해 전체적으로 주활성 항체의 비율이 높은 것으로 확인되었다. 또한, 일정 범위 내에서 pH가 낮을수록 주활성 항체의 비율이 높아지는 것으로 확인되었으며, 같은 pH 조건하에서는 배양 7일차부터 젖산을 배지에 첨가한 경우에 주활성 항체의 비율이 높게 나타나는 것으로 확인되었다(도 3a 및 3b).
pH 및 온도 조건이 주활성 항체 비율에 미치는 전반적인 영향에 대한 결과를 도 3c에 나타내었으며, 구체적으로 주활성 항체 비율에 있어서 pH 및 온도 변화는 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 특히 pH 조건이 온도 조건보다 더 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 또한, 일정 범위 내에서 pH가 낮을수록, 온도가 낮을수록 주활성 항체의 비율이 높게 나타나는 경향을 보이는 것으로 확인되었다(도 3c).
실시예 3-2: 산성 이성질 항체 분석 결과
LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과는 도 4에 나타내었다. 구체적으로 도 4a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 4b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 4c는 pH 및 온도에 따른 산성 이성질 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 4a 및 도 4b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하며, 구체적인 사항은 상기 실시예 3-1에서 설명한 내용과 동일하다.
상기 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과, 같은 pH 조건별로 비교해 볼 때, 배양 5일차에 37℃에서 35℃로 온도를 낮추는 변화를 준 CS1 그룹이 온도 변화를 주지 않은 CS2 그룹에 비해 전체적으로 산성 이성질 항체의 비율이 낮은 것으로 확인되었다(도 4a 및 4b).
pH 및 온도 조건이 산성 이성질 항체 비율에 미치는 전반적인 영향에 대한 결과는 도 4c에 나타내었다. 구체적으로 산성 이성질 항체 비율에 있어서 pH 보다 온도 변화가 더 큰 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 일정 범위 내에서 온도가 낮을수록 산성 이성질 항체의 비율이 낮게 나타나는 경향을 보이는 것으로 확인되었다(도 4c).
실시예 3-3: 염기성 이성질 항체 분석 결과
LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과는 도 5에 나타내었다. 구체적으로 도 5a는 LapChip® 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 5c는 pH 및 온도에 따른 염기성 이성질 항체 비율에 대한 분석 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 도 5a 및 도 5b의 그래프 상의 각 컬럼의 명칭 및 색깔은 도 1에서 배양 조건을 도식화한 표시 사항과 동일하며, 구체적인 사항은 상기 실시예 3-1에서 설명한 내용과 동일하다.
상기 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과, 같은 pH 조건별로 비교해 볼 때, 배양 5일차에 37℃에서 35℃로 온도를 낮추는 변화를 준 CS1 그룹 보다 온도 변화를 주지 않은 CS2 그룹이 전체적으로 염기성 이성질 항체의 비율이 낮은 것으로 확인되었다. 또한, 일정 범위 내에서 pH가 낮을수록 염기성 이성질 항체의 비율이 낮아지는 것으로 확인되었으며, 같은 pH 조건하에서는 배양 7일차부터 젖산을 배지에 첨가한 경우에 염기성 이성질 항체의 비율이 낮게 나타나는 것으로 확인되었다(도 5a 및 5b).
pH 및 온도 조건이 염기성 이성질 항체 비율에 미치는 전반적인 영향에 대한 결과를 도 5c에 나타내었으며, 구체적으로 염기성 이성질 항체 비율에 있어서 pH 및 온도 변화는 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 특히 pH 조건이 온도 조건보다 더 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 또한, 일정 범위 내에서 pH가 낮을수록, 그리고 온도가 높을수록 염기성 이성질 항체의 비율이 낮게 나타나는 경향을 보이는 것으로 확인되었다(도 5c).
실시예 3-4: 젖산 첨가에 따른 주활성 항체 및 이성질 항체 비율의 변화 분석
상기 실시예 1에서 배양 7일차부터 11일차까지 매일 1M의 L-젖산 용액을 100 ㎕씩 주입한 경우의 주활성 항체 및 이성질 항체 비율 변화에 대하여, LapChip®을 통해 보다 상세히 분석하였으며, 그 결과를 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다.
구체적으로, 주활성 항체의 경우에는 젖산을 첨가하는 경우, 배양 온도 변화를 준 CS1 그룹과 온도 변화를 주지 않은 CS2 그룹 모두에서 항체 비율이 증가하는 것으로 관찰되었으며, pH 조건에 따라 약 1.5 내지 6.6% 정도 증가하는 것으로 나타났다(도 6a).
산성 이성질체 항체의 경우에는 젖산을 첨가하는 경우, 배양 온도 변화를 준 CS1 그룹에서는 pH 조건에 따라 약 0.6 내지 3.1%의 항체 비율 증가가 관찰되었으며, 배양 온도 변화를 주지 않은 CS2 그룹에서는 pH 조건에 따라 항체 비율이 약 0.9% 증가하거나 혹은 오히려 약 0.8 내지 2.1% 감소하는 것으로 관찰되었다(도 6b).
염기성 이성질 항체의 경우에는 젖산을 첨가하는 경우, 배양 온도 변화를 준 CS1 그룹과 온도 변화를 주지 않은 CS2 그룹 모두에서 항체 비율이 감소하는 것으로 관찰되었으며, pH 조건에 따라 약 2.1 내지 4.7% 정도 감소하는 것으로 나타났다(도 6c).
실시예 3-5: 주활성 항체 및 이성질 항체 비율 종합 분석 결과
상기 실시예 3-1 내지 3-4에 따른 LapChip® 및 CE-HPLC 장비를 이용한 charge variant 분석 결과를 종합해 볼 때, 대조약과 품질(주활성 항체 및 이성질 항체의 비율)이 유사한 항체 집단을 수득하기 위한 유리한 조건은 pH 7.0 내외의 조건, 배양 온도를 초기 온도 37℃에서 35℃로 낮추는 온도 변화를 주는 조건 및 젖산을 첨가하는 조건인 것으로 확인되었다.
실시예 4: N-글리칸(N-glycan) 분석
상기 실시예 1에서 수득한 항체 집단 중, 배양 5일차에 온도 변화를 준 CS1 그룹에 대한 N-글리칸(N-glycan) 분석을 실시하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 구체적으로 도 7a는 N-글리칸 분석 결과 및 대조약(휴미라)과의 유사성 분석 결과를 나타낸 표이고, 도 7b는 글리칸 분석에 활용되는 글리칸 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
상기 N-글리칸 분석 결과, 글리칸 구조 중 G0F, G0F-N 및 G0F+GN 형태를 중심으로 살펴보면, pH 6.9인 조건에서 젖산을 첨가하지 않은 경우에는 60.87%의 G0F, 6.71%의 G0F-N 및 9.13%의 G0F+GN 형태를 포함하고, 젖산을 첨가한 경우에는 63.05%의 G0F, 6.73%의 G0F-N 및 8.38%의 G0F+GN 형태를 포함하는 것으로 분석되었다. 비푸코실화(afucosylation) 결과는 각각 7.04% 및 6.71%인 것으로 분석되었으며, 갈락토실화(galactosylation) 결과는 각각 80.70% 및 82.31%인 것으로 분석되었다.
pH 7.0인 조건에서 젖산을 첨가하지 않은 경우에는 72.41%의 G0F, 4.51%의 G0F-N 및 4.37%의 G0F+GN 형태를 포함하고, 젖산을 첨가한 경우에는 70.23%의 G0F, 5.71%의 G0F-N 및 4.39%의 G0F+GN 형태를 포함하는 것으로 분석되었다. 비푸코실화 결과는 각각 4.72% 및 4.87%인 것으로 분석되었으며, 갈락토실화 결과는 각각 84.52% 및 85.47%인 것으로 분석되었다.
pH 7.1인 조건에서 젖산을 첨가하지 않은 경우에는 71.25%의 G0F, 4.35%의 G0F-N 및 4.39%의 G0F+GN 형태를 포함하고, 젖산을 첨가한 경우에는 76.07%의 G0F, 3.76%의 G0F-N 및 3.31%의 G0F+GN 형태를 포함하는 것으로 분석되었다. 비푸코실화 결과는 각각 5.12% 및 4.88%인 것으로 분석되었으며, 갈락토실화 결과는 각각 83.39% 및 86.60%인 것으로 분석되었다.
상기 결과를 대조약인 휴미라(도 7a의 "HE-4")의 글리칸 구조와 비교한 결과, pH 7.0 및 7.1의 조건에서 G0F, G0F-N 및 G0F+GN 형태가 대조약과 매우 유사하거나 약간의 차이가 있는 것으로 분석되었으며, 비푸코실화 및 갈락토실화 결과 역시 유사한 것으로 분석되었다.
상기 실시예 1 내지 4의 결과를 종합하여 살펴보면, 수득된 아달리무맙 항체 집단의 IgG 역가, charge variant 및 N-글리칸 분석 결과를 종합하여 볼 때, pH 7.0 내지 7.1인 조건, 특히 pH 7.0인 조건, 배양 온도를 초기 온도 37℃에서 35℃로 낮추는 온도 변화를 주는 조건 및 젖산을 첨가하는 조건이 대조약과 유사한 품질의 항체 집단을 수득하는 데에 유리한 것으로 분석되었다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
Claims (10)
- (a) 항체를 발현시키는 재조합 세포를 36℃ 내지 38℃의 제1 배양온도에서 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 4일 내지 6일 동안 배지에서 배양하는 제1 온도 배양단계; 및
(b) 상기 배양된 재조합 세포를, 상기 (a) 단계의 제1 배양온도 보다 2℃ 내지 4℃ 낮되, 34℃ 이상으로 설정한 제2 배양온도에서 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 6일 내지 8일 동안 배지에서 배양하는 제2 온도 배양단계; 를 포함하는, 항체 집단의 제조 방법으로서,
상기 (b) 단계는 상기 제2 배양온도에서의 배양 1일차 내지 3일차부터 매일 배지 10 ㎖ 당 0.1 내지 2M의 젖산(lactic acid)을 80 내지 120 ㎕ 씩 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하며,
상기 항체는 아달리무맙(adalimumab)이고,
상기 항체 집단은 주활성 항체 55~70%, 산성 이성질 항체 10~20% 및 염기성 이성질 항체 20~30%를 포함하는 것인, 항체 집단의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 항체 집단의 항체는 65% 내지 80%의 G0F 형태를 포함하는 글리칸(glycan) 구조를 갖는 것인, 항체 집단의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 집단의 항체는 3% 내지 6%의 G0F+GN 형태를 포함하는 글리칸(glycan) 구조를 갖는 것인, 항체 집단의 제조 방법.
- (a) 항체를 발현시키는 재조합 세포를 배양 배지에서 36.5℃ 내지 37.5℃ 및 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 5일 동안 배양하는 제1 온도 배양단계; 및
(b) 상기 5일간 배양된 재조합 세포를 34.5℃ 내지 35.5℃의 배양온도에서 pH 7.0 내지 7.1의 조건하에 7일 동안 배양하되, 배양 3일차부터 매일 배지 10 ㎖ 당 0.5 내지 2M의 젖산(lactic acid)을 95 내지 105 ㎕ 씩 첨가하여 배양하는 제2 온도 배양단계; 를 포함하는, 항체 집단의 제조 방법으로서,
상기 항체는 아달리무맙(adalimumab)이고,
상기 항체 집단은 주활성 항체 55~70%, 산성 이성질 항체 10~20% 및 염기성 이성질 항체 20~30%를 포함하는 것인, 항체 집단의 제조방법. - 삭제
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