DE3783511T2

DE3783511T2 - Verfahren zur zuechtung tierischer zellen und geeignete medien.

Info

Publication number: DE3783511T2
Application number: DE8787304745T
Authority: DE
Inventors: Takashi Koyano; Kazuka Shinohara
Original assignee: Toa Nenryo Kogyyo KK
Current assignee: Tonen General Sekiyu KK
Priority date: 1986-05-28
Filing date: 1987-05-28
Publication date: 1993-07-29
Anticipated expiration: 2007-05-29
Also published as: JPS62278979A; DE3783511D1; EP0247881B1; EP0247881A3; EP0247881A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Tierzellen.
In letzter Zeit können verschiedene Arten physiologisch aktiver Verbindungen wie Interferone, fibrinolytische Enzymaktivatoren und Lymphokine, die ursprünglich in vivo erzeugt werden und ihre Wirkung in situ entfalten, durch Züchten von Tierzellen wie Hybridomzellen in vitro und Gewinnen des Produkts aus einem Überstand der Kultur erzeugt werden, und solche Produkte sind vielversprechende Pharmazeutika. Um diesen Zweck zu erfüllen, müssen die Erzeugertierzellen jedoch unveränderlich in einem Medium kultiviert werden.
In vielen Fällen ist ein ein Serum enthaltendes Medium zum Züchten von Tierzellen erforderlich. Da Serum jedoch verschiedene Arten von Substanzen wie Vitamine, Hormone, Aminosäuren und Proteine enthält und die Gehalte an derartigen Substanzen von Partie zu Partie variieren, ist es schwierig, Serumpräparate mit übereinstimmenden Eigenschaften zu erhalten, was zu nicht übereinstimmenden Zuchtergebnissen führt. Darüber hinaus ist die Isolierung des gereinigten Produktes von dem Medium schwierig, wenn die in einem Serum enthaltenen Bestandteile ähnliche Eigenschaften wie ein Zielprodukt haben. Auch ist, da es schwierig ist, eine große Menge an Serum bei niedrigen Kosten zu erhalten, die kommerzielle Erzeugung der nutzbaren Zielsubstanz in einem Serum enthaltenden Medium vom wirtschaftlichen Gesichtspunkt her schwierig.
Dementsprechend werden serumfreie Verfahren zum Züchten von Tierzellen, insbesondere das Ersetzen von Serum als einem Zusatzstoff zu einem Medium zum Züchten von Tierzellen, gesucht. In letzter Zeit wurden Wachstumsfaktoren für Tierzellen umfassend erforscht, und für solche Zwecke sind z. B. Insulin, Transferin, Ethanolamin bekannt.
Die jetzigen Erfinder fanden, daß ein Extrakt von Synechococcus-Zellen als ein Ersatz für Serum nützlich ist (Japanische Patentanmeldung No. 59-41997). Von Pflanzen stammende Verbindungen jedoch sind noch nicht als ein Ersatz für Serum bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Züchten von Tierzellen zur Verfügung, das die Schritte aufweist:
Impfen eines Mediums, das ein Basalmedium und 20 bis 300 ug/ml Phycocyanin enthält, mit Ziel-Tierzellen; und
Inkubieren des Mediums, um die Ziel-Tierzellen wachsen zu lassen.
In der Zeichnung:
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung zum Vergleichen eines Kontrollmediums, das kein Phycocyanin enthält, und Medien, die Phycocyanin in verschiedenen Konzentrationen enthalten, bei der eine Proteinkonzentration für eine Menge an Zellwachstum steht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird als ein Medium zum Züchten von Tierzellen ein mit Phycocyanin ergänztes Basalmedium verwendet. Als das Basalmedium kann irgendein übliches Medium zum Züchten von Tierzellen verwendet werden. Zu solchen Basalmedien gehören z. B. PRM1 1640, Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DME), Ham-F12, 199, Eagle's MEM und BGJ6 und eine Mischung daraus. Diese Basalmedien sind in der Technik gut bekannt. Diese Basalmedien können mit einer kleinen Menge an Serum ergänzt werden.
Phycocyanin ist ein blaues Chromoprotein, das in Zellen von Algen gefunden wird, d. h. Cyanophyta, Rodophyta und Cryptophyta, und ist in der Technik gut bekannt. Bei der vorliegenden Erfindung kann jede Art von Phycocyanin verwendet werden, das aus den oben erwähnten Algen hergestellt wurde. Das Herstellungsverfahren und die Reinheit des Phycocyanins sind für den vorliegenden Zweck nicht kritisch. Zum Beispiel wird eine Phycocyanin erzeugende Alge gemäß dem üblichen Verfahren gezüchtet, und die gezüchteten Algenzellen werden abgetrennt und die Zellen durch Beschallung zertrennt. Das Zertrennte wird dann der Extraktion unterworfen, um einen Dialyserückstand zu erhalten. Der Rückstand wird der Gelfiltration und Ionenaustausch-Chromatographie unterworfen, um das Phycocyanin zu reinigen. Alternativ sind Phycocyanin-Präparate im Handel erhältlich. Die Konzentration an Phycocyanin in einem Medium hängt ab von dem einzelnen Basalmedium, den einzelnen zu züchtenden Tierzellen, dem Zweck der Züchtung und dergleichen, und ist üblicherweise 20 bis 300 ug/ml.
Das vorliegende Verfahren kann angewendet werden auf das Züchten von verschiedenen Arten von Tierzellen, einschließlich Zellen von etablierten Zell-Linien und von Hybridom-Zell-Linien. Zu nicht etablierten Tierzellen gehören z. B. aus peripherem Blut isolierte Leukozyten, aus lymphoidem Gewebe isolierte Lymphozyten und dergleichen, menschlichen oder anderen tierischen Ursprungs. Zu etablierten Zell-Linien gehören Myelom-Zell-Linien wie die menschliche Myelom-Zell-Linie RPM1 8226, T-lymphoide Zell-Linien wie die menschliche T-lymphoide Zell-Linie Molt-4, B-lymphoide Zell-Linien wie die menschliche B-lymphoide Zell-Linie HO-323 und dergleichen. Zu Hybridom-Zell-Linien gehören Mensch- Mensch-Hybridom-Zell-Linien, Mensch-Maus-Hybridom- Zell-Linien, Maus-Maus-Hybridom-Zell-Linien und dergleichen.
Obwohl das Züchten gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Mutterkultur von Tierzellen begonnen werden kann, wird bevorzugt vor dem Züchten gemäß der vorliegenden Erfindung eine Vorkultur durchgeführt, um Impfmaterialzellen herzustellen. Die Vorkultur kann ausgeführt werden in irgendeinem üblichen Medium, wie einem der oben erwähnten Basalmedien, bevorzugt mit etwa 10% Serum ergänzt, unter der Kulturbedingung, wie sie unten zum Züchten der vorliegenden Erfindung beschrieben ist. Die gezüchteten Zellen werden gesammelt und wahlweise in einer üblichen Art gewaschen, um ein Impfmaterial herzustellen.
Das Züchten gemäß der vorliegenden Erfindung wird begonnen durch Hinzufügen einer Mutterkultur oder des oben hergestellten Impfmaterials in ein oben beschriebenes Medium der vorliegenden Erfindung. Das Züchten kann gemäß einem üblichen Verfahren durchgeführt werden. Eine Temperatur zum Züchten ist etwa von 20ºC bis 45ºC, bevorzugt 30ºC bis 40ºC, z. B. 37ºC. Das Züchten wird bevorzugt unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid durchgeführt.
Nach dem Züchten wird das gezüchtete Produkt entsprechend dem Zweck der Züchtung behandelt. Wenn z. B. eine nutzbare Verbindung wie ein monoklonaler Antikörper aus einem Überstand gewonnen werden soll, wird der Überstand nach einem üblichen Verfahren wie der Zentrifugierung gesammelt. Alternativ werden, wenn gezüchtete Zellen an sich ein Zielprodukt sind oder eine Zielverbindung von den gezüchteten Zellen isoliert werden soll, die gezüchteten Zellen nach einer üblichen Verfahrensweise wie der Zentrifugierung gesammelt.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren können Tierzellen, die nicht in einem serumfreien Medium gezüchtet werden können, in einem Medium gezüchtet werden, in dem das ganze oder ein Hauptteil des Serums durch Phycocyanin ersetzt wurde. Da solche verbesserten Medien keine Bestandteile enthalten, deren Mengen sich von Partie zu Partie unterscheiden, können die verbesserten Medien mit einer guten Reproduzierbarkeit hergestellt werden. Darüber hinaus kann, wenn Tierzellen in dem verbesserten Medium der vorliegenden Erfindung gezüchtet werden, um eine Zielverbindung zu erzeugen, die Zielverbindung leicht aus der gezüchteten Bouillon gewonnen und mit einer hohen Reinheit gereinigt werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiterhin erläutert werden, aber ist keinesfalls auf sie beschränkt.

Beispiel 1

In einem Medium, das eine Mischung aus RPM1 1640, DME (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium) und Ham F-12 im Volumenverhältnis von 2:1:1 (RDF-Medium), ergänzt mit 10% FCS (fetales Kälberserum), enthielt, wurden Zellen der menschlichen Myelom-Zell- Linie RPM1 8226 bei einer Temperatur von 37ºC in Anwesenheit von 5% Kohlendioxid vier Tage lang gezüchtet, und die gezüchteten Zellen wurden mit dem RDF-Medium gewaschen, um das Serum zu eliminieren.
2 ml eines Mediums, das das RDF aufwies, ergänzt mit 26 bis 260 ug/ml von im Handel erhältlichem Phycocyanin, wurden in eine 2 ml Kultur-Petrischale gebracht, und das Medium wurde mit den oben erwähnten, gewaschenen Zellen geimpft, bei einer Endkonzentration von etwa 5·10&sup4; Zellen/ml. Das Ganze wurde dann bei 37ºC für vier Tage in Gegenwart von 5% Kohlendioxid inkubiert, und nach dem Züchten wurde die Anzahl an Zellen mit einem Zellzähler gemessen. Als eine Kontrolle wurden Zellen in dem RDF gezüchtet, das nicht mit Phycocyanin ergänzt war. Das Ergebnis ist in Fig. 1 durch das Verhältnis der Anzahl von Zellen in dem Testmedium bezogen auf die Anzahl an Zellen direkt nach der Impfung der Zellen gezeigt.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich, stieg bei einer Konzentration von Phycocyanin im Bereich von 26 ug/ml bis 260 ug/ml die Anzahl an gezüchteten Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration an hinzugefügtem Phycocyanin um das etwa 2- bis 4-fache an im Vergleich zur Anzahl von geimpften Zellen. Andererseits wurde in dem Kontrollmedium, das kein Phycocyanin enthielt, kein Ansteigen der Zellenanzahl beobachtet.

Beispiel 2

Zellen der blaugrünen Alge Synechococcus elongatus wurden gemäß einem üblichen Verfahren gezüchtet, und die gezüchteten Zellen wurden gesammelt. Die Zellen wurden durch eine Ultraschallbehandlung zertrennt, und das behandelte Produkt wurde zentrifugiert, um einen Extrakt zu erhalten. Der Extrakt wurde gegen eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert, und die Dialyse-Rückstandfraktion wurde durch Gelfiltration (Sepharose B4 bei Raumtemperatur) und dann durch Ionenaustausch-Chromatographie (DEAE-Sepharose CL-6B, bei Raumtemperatur) fraktioniert, um eine Phycocyanin-Fraktion zu erhalten.
Unter Verwendung der so erhaltenen Phycocyanin- Fraktion wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben, wiederholt. Eine Konzentration an Protein stammend von der hinzugefügten Phycocyanin-Fraktion im Testmedium reichte von 22,5 ug/ml bis 90,0 ug/ml. Wie in Fig. 1 gezeigt, stieg in diesem Konzentrationsbereich in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration die Zahl an gezüchteten Zellen etwa um das 3- bis 4-fache relativ zur Anzahl an geimpften Zellen.

Beispiel 3

Die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde wiederholt, außer daß entweder Zellen der menschlichen T-lymphoiden Zell-Linie Molt-4 oder Zellen der menschlichen B-lymphoiden Zell-Linie HO-323 gezüchtet wurden, und es wurde im wesentlichen das gleiche Ergebnis erhalten wie in Beispiel 1.

Claims

1. Ein Verfahren zum Züchten von Tierzellen, das die Schritte aufweist:

Impfen eines Mediums, das ein Basalmedium und 20 bis 300 ug/ml Phykocyanin enthält, mit Ziel-Tierzellen; und

Inkubieren des Mediums, um die Ziel-Tierzellen wachsen zu lassen.

2. Ein Verfahren zum Züchten von Tierzellen nach Anspruch 1, bei dem das Basalmedium ein übliches, zum Züchten von Tierzellen verwendetes Medium ist.

3. Ein Verfahren zum Züchten von Tierzellen nach Anspruch 1, bei dem das Medium RPM1 1640, DME, Ham-F12, 199, Eagle's MEM, BGJ6 oder eine Mischung davon, aufweist.

4. Ein Verfahren zum Züchten von Tierzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Phykocyanin abstammt aus Zellen von Algen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Cyanophyta, Rodophyta und Cryptophyta.

5. Die Verwendung von Phykocyanin als ein Mediums-Bestandteil beim Züchten von Tierzellen.

6. Ein Tierzellen-Kulturmedium, das übliche Zutaten dafür und Phykocyanin enthält.