KR19990066672A - 히스톤을 함유하는 류마티스 관절염 치료제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히스톤의 새로운 용도에 관한 것으로, 진행성, 염증성 자가면역 관절염의 제반 증상을 완료할 수 있는, 히스톤을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 발명이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분으로 히스톤, 특히 히스톤 H1을 함유하며, 필요한 경우 약리학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있으며, 류마티스 관절염에 대하여 스테로이드성 제제 덱사메타손보다 효과적으로 관절염 발생과 관절염 지수를 감소시켰으며, 뛰어난 예방효과를 나타낸다.

Description

히드톤을 함유하는 류마티스 관절염 치료제 조성물

본 발명은 진행성, 염증성, 자가면역성 관절염 증상을 개선할 수 있는 생물학적 활성 조성물에 관한 것이다.

관절명믄 여러 치료제의 개발에도 불구하고 인구의 노령화에 따라 국내를 포함하여 여러 선진국들에서 여전히 심각한 질환으로 남아있다. 관절염은 치사율은 낮지만, 운동성을 저해하여 생산성을 낮추는 등 삶의 질을 낮추는 주요 원인이 되고 있다.

관절염의 종료에는 여러 가지가 있지만 그 중 가장 중요한 것은 류마티스 관절염이다. 류마티스 관절염은 자가반응성 T 임파구의 작용에 의한 자가면역성 질환으로 알려져 왔다. T 임파구는 속발성 과민반응에 의하여 병을 일으킨다. 체내의 어떠한 항원을 T 임파구가 인지하여 발병하게 되는지 정확히 알 수 없지만 콜라겐 II가 가장 유력한 것으로 알려져 있으나 다른 항원이 발병원인이 될 가능성도 배제할 수 없다. 항히스톤 자가 항체도 발견되었으나, 이 항체가 발병의 원인이 되는지의 여부는 확실치 않다.

류마티스 관절염의 치료제로 여러 가지 약물이 사용되었으나 완전한 증상 개선을 이루지 못하였다. 종래의 치료제로는 비스테로이드성 항염증제(아스피린, 이부프로펜), 금제제, 페니실아민, 스테로이드성 호르몬제 등이 있다. 이중 가장 개선 효과가 뛰어난 스테로이드성 호르몬제는 장기간 복용시 부작용이 따르는 문제점이 있다. 근래에는 염증 기전의 중신 역할을 하는 TNF(tumor necrosis factor)의 수용성 수용체를 유전자 재조합 기술로 생산하여 치료제로 개발하려는 노력도 있으며, 류마티스 관절염의 제반 증상인 염증, 부종, 비정상적인 신혈관 생성, 골 및 연골조직 침식 등을 개선할 보다 진보된 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

콜라겐 유발 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)은 T 임파구성 류마티스 관절염의 동물 모델로 사용되어 왔다(Autoimmunity to Type II collagen:Experimental model of arthritis, J. Exp. Med. 146; 857-868(1977)). 콜라겐 II를 관절염에 걸리기 쉬운 실험용 쥐에 주사하면 2주기내에 파누스 형성, 뼈, 연골의 침식과 함께 관절염이 유발된다. 류마티스 관절염과 마찬가지로 콜라겐 유발 관절염도 콜라겐에 대한 체액성, 세포성 면역 반응을 일으킨다.

히스톤은 세포 핵의 중요한 구성 물질로서 핵산과 함께 염색체를 형성하는 물질로 알려져 있다. 사람을 비롯한 포유 동물에서서도 여러 다른 형의 히스톤 H1이 분리되었으며 히스톤 H1의 다양한 생리적 작용에 대하여 보고되었다.

Biochem. J. vol 244, 675-682, 1987에서는 소 혈장과 우유에서 수용성 히스톤 H1의 발견과 분리를 보고하였다. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 82, 4871-4875, 1985에서는 homeostatic thymus hormone(HTH)의 주요 구성 물질이 히스톤 H1이며 이는 림프계와 혈관을 자유롭게 순환하여 다른 호르몬의 분비를 조절하는 등 호르몬 유사 작용을 함을 보고하였다.

또한 Ann. J. Med. Sci. vol 250, 79-85, 1965에서는 흉선 절제후에 HTH를 투여하면 면역을 증강시켜 흉선 절제로 생기는 면역적 문제를 해소한다고 보고하였다. WO 8503003A에서는 흉선 흐르몬의 특성을 가지는 히스톤 H1 단편을 흉선 절제후나 흉선의 방사선 치료후 백혈병 예방 등 면역학적 치료제로 사용할 것을 제안하고 있다.

미국특허 5,182,257에서는 히스톤 H1, H2A, H2B, H3, H4을 임파선암 및 백혈병 치료제로 보고하였다.

Chemical abstracts 74, 85743(1971)에서는 히스톤 H1 분획은 T2 박테리오파지와 함께 투여했을 때 T2 박테리오파지에 대한 항체 형성을 억제한다고 보고하였다. Chemical abstracts 73, 96837(1970)에서는 피부이식 수술에서 히스톤 H1을 면역억제제로서 사용하고 있다.

Nature, vol 360, 33-39, 1992에서는 히스톤 H1이 섬게 편모의 미세도관(microtubule) 구조를 안정화한다는 보고가 있었다. J. Biol. Chem. vol 259, 15523-15531, 1984에서는 소 흉선에서 분리한 히스톤 H1이 쥐 뇌에서 분리한 도관과 작용하여 미세도관의 고리구조와 유사한 응집 구조를 유도한다고 보고하였다.

그러나, 어떤 종래기술도 히스톤 H1을 류마티스 관절염의 치료제로 사용할 것을 제외하지 않고 있다.

본 발명은 기존의 약물보다 더 효과적으로 진행성, 염증성, 자가면역성 관절염 증상을 개선할 수 있는 약학 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 히스톤은 함유하는 진행성, 염증성, 자가면역성, 관절염 증상을 개선할 수 있는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 히스톤을 함유하는 진행성, 염증성, 자가면역성 관절염을 발병을 억제할 수 있는 약학 조성물을 제공한다.

도 1은 히스톤 H1 투여하였을 때의 류마티스 관절염 발생율의 변화를 나타낸다(:콜라겐 항원 접종 후 아무런 처리하지 않은 군(대조군),:콜라겐 항원 접종 후 덱사메타손을 예방효과로 처리한 군,:콜라겐 항원 접종 후 덱사메타손을 치료효과로 처리한 군,콜라겐 항원 접종 후 히스톤을 예방효과로 처리한 군,

:콜라겐 항원 접종 후 히스톤을 치료효과로 처리한 군).

도 2A는 히스톤 H1의 류마티스 관절염 예방효과를, 도 2B는 히스톤 H1의 류마티스 관절염 치료효과를 시간의 경과에 따른 관절염 지수변화로 나타낸다(:콜라겐 항원 접종 후 아무런 처리하지 않은 군(대조군),: 콜라겐 항원 접종 후 덱사메타손을 처리한 군,:콜라겐 항원 접종 후 히스톤을 처리한 군)

도 3A는 콜라겐항원 접종 6주 후 부종을 보이는 대조군의 앞발 사진이며, 도 3B는 콜라겐항원 접종 6주 후 히스톤 H1 을 투여한 군의 앞발 사진이다.

도 4A와 도 4B는 콜라겐항원 접종 10주 후 파누스 형성과 뼈, 연골조직의 침식, 염증세포의 발현이 관찰되는 데조군이 관절 단면(section)이며, 도 4C는 히스톤 H1을 투여한 군의 콜라겐 항원 접종 10주 후의 단면이다.(P=pannus, C=cartilage, J=joint space)

본 발명은 히스톤의 새로운 용도에 관한 것으로, 진행성, 염증성 자가면역 관절염의 제반 증상을 완화할 수 있는, 히스톤을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 발명이다. 여기에서 증상 완화는 (1) 현존하는 증상의 개선; (2) 진행성 질환에서 진행의 방지; (3) 관절염 유발 가능한 개체에서의 발병 방지 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분으로 히스톤, 특히 히스톤 H1을 함유하며, 필요한 경우 약리학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 단독으로 또는 기존의 관절염 치료제와 함께 사용될 수 있을 것이다.

본 발명의 효과 즉, 히스톤 H1을 투여함으로써 자가면역 류마티스 관절염의 제증상을 완화할 수 있음을 확인하기 위하여, 관절염에 걸린 혹은 걸리기 쉬운 포유 동물에 히스톤 H1 분획을 투여하였다. 포유동물은 실험용 생쥐를 사용하였으며, 관절염은 류마티스 관절염의 잘 알려진 동물 모델인 콜라겐 유발 관절염을 사용하였다(실시예 1).

본 발명은 포유동물은 사람, 관절염은 류마티스 관절염으로 확대 적용할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 히스톤을 분리하는 기원에는 어떠한 제한도 없다.

또한 히스톤 H1은 히스톤 H2A, H2B, H3, H4 또는 이들의 혼합물로 확대 적용할 수 있다.

관절염의 증상을 억제하기에 충분한 히스톤 H1의 양은 약 1mg/체중 kg이다.

본 발명의 경우 투여간격은 3-4일 간격이었으나, 간격을 1, 2, 4 주로 늘릴 수 있을 것이며, 투여 방법은 정맥 주사나 복강내 주사가 이상적이지만, 다른 투여 방법도 사용될 수 있다.

가장 효과적인 투여 방법이나 양, 간격은 환자의 증상 진행 정도와 투여 후 반응 등에 따라 의사의 진단과 처방에 따라 어려움 없이 조절될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로 이들 실시예에 의하여 발명의 범위가 한정되지 않는다.

본 명세서의 실시예에서 각 실험군의 평균을 산출하기 위하여 Student's t-test가 사용되었다. Chi square test를 사용하여 표준편차치를 산출하였다. P<0.05일 때 결과는 유의성이 있다고 판정하였다.

실시예 1

실험용 생쥐에서 류마티스 관절염의 유도

관절염 유도

5주령의 DBA/1J 생쥐 암컷을 일본 Charles River에서 수입하여 2주간 실험 동물 사육실에서 적용하도록 한 후 7주령부터 (20-25g) 실험에 사용하였다.

분리 정량된 닭 콜라겐 II(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 0.1N 아세트산에 용해시키고(2mg/ml), complete Freund's adjuvant와 동량 섞어 4℃에서 현탁액으로 만들었다. 이를 100μl씩 생쥐꼬리의 기시 부근에 정맥주사한 후 처음 주사한 지3주와 6주 후 동일한 방법으로 추가접종하였다(D. E. Trentham et al., "Autoimmunity to Thpe II collagen:An Experimental Model of Arthritis," J. Exp. Med. 146; 857-868(1977)).

최초 콜라겐 투여 4주후부터 관절염이 발생되었다.

관절염 측정

관절염 발병률(Clinical Incidence of Arthritis%) 및 관절염 지수(Arthritis Index)를 모두 평가하였다. 관절염 발생율(C.I.A.)은 실험기간동안 관절 염증 증세를 보이는 생쥐수와 전체생쥐수의 백분율(%)로 나타내었다. 관절염 지수로 표현되는 각 관절의 염증 정조는 매주 2명의 같은 실험자에 의하여, 다음과 같이 0부터 3까지 측정되었으며, 콜레간투여 6주후의 생쥐 중에서 선택하여 발을 촬영하였다.

0:정상상태;

1:한두개의 발가락이 종창을 동반한 홍조를 띄거나 최소한이 종창이 유발된 상태;

2:확실한 홍조를 띄거나 극소적 상지종창, 그리고 이러한 것들이 여러 발가락에서 관찰되는 상태;

3:무릎까지의 상당한 부종과 종창이 관찰되며 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태.

네발을 합하여 관절염 지수를 산출하였으며 따라서 12가 최대치이다. 일반적으로 콜라겐 유도 관절염은 뒷발에만 유도되므로 지수 6~8은 증상의 정도가 극심한 것으로 이해된다(Korea J. Immunol 18, 437, 1996; J. Immunol 151, 6546, 1993).

실시예 2

히스톤 H1의 추출 및 분리

히스톤 H1은 Boehringer Mannheim사의 카탈로그 번호 223549(lyophilizate, from calf thymus, electrophoretically homogeneous) 사용하였다.

실시예 3

히스톤 H1의 관절염 예방 효과

히스톤 투여

예방효과 검증군으로 10마리의 생쥐에 관절염이 유발되기 전인 최초 콜라겐 접종 3주 후부터 10주 후까지, 히스톤 H1을 1mg/체중 kg씩 1주 2회 복강내 투여하였다. 히스톤 H1은 PSB 용액에 5mg/ml 농도로 희석하였다. 비교군으로 10마리의 생쥐에 관절염이 유발되기 전인 최초 콜라겐 접종 3주 후부터 10주 후까지, 시판되는 류마티스 관절염 치료제인 덱사메타손을 1mg/체중 kg씩 1주 2회 복강내 투여하였다. 대조군은 20마리의 생쥐에 최초 콜라겐 접종 3주 후부터 10주 후까지 PBS 용만을 300μl씩 투여하였다.

관절염 발생 및 관절염 지수 측정

항원 접종 4주후에서부터 모든 군에서 관절염 발생이 발견되기 시작하였다. 아무런 처치없이 콜라겐만을 투여한 대조군에서는 접종 후 4주에서부터 관절염이 발생하여(30%), 5주와 6주에는 64.3%, 7주에는 100%의 관절염 발생율을 보였다. 이에 비하여 항원접종 3주 후부터 히스톤 H1을 투여한 예방효과 검증군에서는 항원접종 6주 후까지도 관절염 발생이 완전히 방지되었으며, 관절염 발생뮬이 7주, 8주후에는 60%, 10주 후에는 80%로 관절염 발생 예방효과를 보였다. 관절연 치료제로 사용되는 덱사메타손을 콜라겐 투여 3주후부터 투여한 예방군이 경우 4주부터 10주에 이르기까지 발생율이 20%에서 30%를 보였다.

관절염 지수는 대조군이 경우 관절염이 발생된 항원접종 4주 후에 1.50±0.55, 5주 후에 3.00±1.00를 보였으며 8주 후에는 최고치인 6.00±2.05를 보여 증상의 정도가 심하였다(도 2A, 도 2B). 이에 비하여 예방효과 검증군의 경우 관절염이 처음 발생된 7주에 대조군의 60%의 관절염 발생율을 보였으며, 관절염이 발생된 생쥐에서도 2.33±1.53으로 4.67±1.23을 나타낸 대조군에 비하여 낮은 지수를 보였다. 예방효과 검증군의 관절염 지수는 8주에 2.67±1.15, 10주에 2.25±1.26으로 실험완료시기까지도 대조군에 비하여 반정도에 그쳐 히스톤 H1의 관절염 예방효과가 10주후까지도 지속되고 있음을 보였다. 덱사메타손의 경우 5주, 6주에 2.00, 1.50을 보여 관절염이 발생되지 않은 히스톤 예방효과 검증군에 비하여 6주까지 낮은 예방 효과를 보였다.

면역반응평가-항콜라겐 항체치

실험 10주 째에 심장천자로 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 측정시까지 검체는 영하 80℃에서 보관하였으며 실험직전에 해동하여 항콜라겐 항테를 ELISA 방법으로 측정하였다(D. E. Trentham & R. A. Dynesius-Trentham, J. Immunol, 130; 2689-2692(1983)). 96 웰 폴리스타이렌 마이크로플레이트(Nunc, Denmark)의 각 웰에 0.1M PBS에 녹인 콜라겐 II 25μg/ml을 가하여 4℃에서 8시간 동안 둔 후 PBS-0.05% Tween 20로 웰을 여러번 세척하였다. 비특이전 결합을 방지하기 위해 각 웰에 PBS-0.5% 오브알부민을 가하여 실온에서 한시간 동안 반응시킨 후 다시 PBS-0.05% Tween 20로 세척하였다. 혈청을 완충액로 500배 희석하여 각 웰에 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS-0.05% Tween 20로 세척하였다. 그후 각 웰에 알칼리 포스파테이즈 컨쥬게이터인 염소 항-마우스 항체(alkaline phosphatase conjugated goat ant-mouse Ig A, M)를 넣어 2시간 동안 반응시킨 후, 10% 디에탄올아민에 녹인 1mg/ml p-니트로페닐 포스페이트를 넣고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 검체의 항 콜라겐 항체치 측정은 2차례 시행하여 평균값을 얻었다.

예방효과 검증군에서의 콜라겐에 대한 항체이는 0.588±0.214(P<0.00005)로 대조군의 0.925±0.075에 비하여 유의적으로 감소하였다. 그러나 모든 군에서 항 콜라겐 항체치가 상당히 높기 때문에 그 생물학적 의미는 명확하지 않다.

실시예 4

히스톤 H1의 관절염 치료 효과

히스톤 투여

치료효과 검증군으로 10마리의 생쥐에 관절염이 유발된 후인 최초 콜라겐 접종 6주 후부터 10주 후까지 히스톤 H1을 1mg/체중 kg씩 1주 2회 투여하였다. 히스톤 H1은 PBS 용액에 5mg/ml 농도로 희석하였다. 비교군으로 10마리의 생쥐에 관절염이 유발된 후인 최초 콜라겐 접종 6주 후부터 10주 후가지, 시판되는 류마티스 관절염 치료제인 덱사메타손을 1mg/체중 kg씩 1주 2회 복강내 투여하였다. 대조군은 실시예 2에서 사용한 대주군을 그대로 사용하였다.

관절염 발생 및 관절염 지수

관절염 발생 후인 항원접종 6주 후부터 히스톤 H1을 투여한 치료효과 검증군에서는 항원접종 6주 후에 37.5%였던 관절염 발생율을 7주후에 12.5%로 감소되었다. 이 치료 효과는 시험종료시기인 10주후까지도 지속되어 8주와 10주에도 관절염 발생율 14.3%를 유지하였다. 덱사메타손을 투여한 비교군은 7주, 8주, 9주에 22.2%, 33.3%, 22.2%를 보여 전체적으로 히스톤 H1이 더 좋은 치료 효과를 보였다(도 1).

히스톤의 치료효과 검증군의 경우 항원접종 5주에는 관절염 지수 3.33±0.58이었으나 6주부터 히스톤 H1을 투여하였더니 6주에는 발생율은 5주때와 같았으나 관절염 지수는 2.67±0.58로 감소하였다. 7주 이후에는 발생된 관절염중 2/3가 완전히 치료되었으며 관절염 잔존 생쥐에서의 증상도 7주, 8주, 10주에는 각각 1.00, 2.00, 1.00으로 지수가 감소하여 이미 유발된 류마티스 관절염에도 현저한 치료 효과가 있음을 확인하였다. 덱사메타손을 투여한 비교군은 7주, 8주, 10주후에 2.67, 1.67, 3.00의 지수를 보였다(도 2A, 도 2B). 콜라겐 투여 6주 후인 생쥐 중에서 선택하여 앞발을 촬영하였다(도 3). 대조군의 앞발은 관절염의 증상인 부종을 보이며 관절염 치료효과 검증군에서는 히스톤 H1을 투여하여 부종의 개선을 보인다.

면역반응평가-항코라겐 항체치

실시예 3의 방법에 따라 면역반응평가-항콜라겐 항체치를 측정하였다. 히스톤 치료효과 검증군에서 콜라겐에 대한 항체치는 0.540±0.170(P<0.00005)로, 대조군의 0.925±0.075에 비하여 유의적으로 감소하였다. 그러나 모든 군에서 항 콜라겐 항체치가 상당히 높기 때문에 그 생물학적 의미는 명확하지 않다.

H-E 염색에 의한 병리실험

마우스를 심장에서 채혈하여 희생시킨 후 즉시 다리를 잘라서 포르말린에 고정하였다. 탈회작용을 거친 후 Hematoxylin-Eosin 염색을 시행하였다.

H-E 염색에 의한 병리실험 결과, 대조군의 관절 단면에서는 항원접종 10주 후에 파누스의 형성과 더불어 뼈와 연골조직의 침식(도 4A,B; P=pannus, C=cartilage, J=joint space), 염증세포의 발현이 관찰되었다. 이와 대조적으로 히스톤 H1을 처리한 군은 항원접종 10주후에 파누스의 형성, 뼈와 연골조직의 손상, 염증 세포의 발현 등이 관찰되지 않았으며 정상적인 관절조직 소견이 관찰되었다(도 4C).

본 발명은 핵 단백질인 히스톤을 이용하여 여러가지 가능한 기전에 의하여 관절염의 염증성 증상을 현저히 개선하였다. 류마티스 관절염에 대하여 히스톤은 스테로이드성 제제 덱사메타손보다 효과적을 관절염 발생과 관절염 지수를 감소시켰으며, 뛰어난 예방효과도 보였다.

Claims (4)

1. 히스톤을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 히스톤이 히스톤 H1인 조성물.
3. 히스톤을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 예방용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 히스톤이 히스톤 H1인 조성물.