KR19990063834A - Short Chemokine Beta-8 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 케모킨 베타-8(Ckβ-8)의 절단된 형태의 신규한 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 이용하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to novel polypeptides in truncated form of human chemokine beta-8 (Ckβ-8) and methods of using the polypeptides.

Description

단형 케모킨 베타-8Short Chemokine Beta-8

케모킨(인터크린 시토킨으로도 칭함)은 구조적으로 및 기능적으로 관련된 시토킨의 아과(亞科)이다. 이들 분자는 작고, 유도할 수 있는 전염증성(proinflammatory) 단백질이다. 일반적으로, 케모킨은 아미노산 수준에서 20 내지 75%의 상동성을 나타내며, 2개의 이황화 결합을 형성하는 4개의 보존된 시스테인 잔기를 특징으로 한다. 최초 2개의 시스테인 잔기의 배열에 기초하면, 케모킨은 알파와 베타라는 2개의 아과로 분류된다. 알파 아과에서, 최초 2개의 시스테인은 하나의 아미노산에 의해 분리되며, 따라서 "C-X-C" 아과로 표시된다. 베타 아과에서, 2개의 시스테인은 인접하여 위치하며, 따라서 "C-C" 아과로 표시된다. 제1 시스테인은 제3 시스테인과 이황화 결합을 형성하며, 제2 시스테인은 제4 시스테인과 이황화 결합을 형성하므로써 다수의 케모킨은 유사한 3차 구조를 형성한다. 구조적으로, 다수의 케모킨은 단백질 분해 과정을 거쳐 기능적인 "성숙" 단백질을 형성한다. 이는 통상 상기 단백질의 N-말단 부위상의 짧은 리더 서열의 절단을 포함한다. 14개 이상의 분명한 α-케모킨 및 12개 이상의 β-케모킨이 단백질 및/또는 DNA 수준에서 기술되어 왔다.Chemokines (also called interclean cytokines) are subfamily of structurally and functionally related cytokines. These molecules are small, inducible proinflammatory proteins. Generally, chemokines exhibit 20 to 75% homology at the amino acid level and are characterized by four conserved cysteine residues that form two disulfide bonds. Based on the arrangement of the first two cysteine residues, chemokines are classified into two subfamily, alpha and beta. In alpha agua, the first two cysteines are separated by one amino acid and are therefore represented by the "C-X-C" subfamily. In the beta subfamily, the two cysteines are located contiguously and are therefore designated as "C-C" subfamily. The first cysteine forms a disulfide bond with the third cysteine, and the second cysteine forms a disulfide bond with the fourth cysteine, whereby many chemokines form a similar tertiary structure. Structurally, many chemokines undergo proteolysis to form functional "mature" proteins. This usually involves cleavage of the short leader sequence on the N-terminal portion of the protein. More than 14 distinct α-chemokines and 12 or more β-chemokines have been described at the protein and / or DNA level.

인터크린 시토킨은 다양한 기능을 나타낸다. 한가지 중요한 특징은 단핵구, 호중구, T 림프구, 호염기구 및 섬유아세포와 같은 독특한 세포 형태의 주화성 이동을 자극할 수 있는 그들의 능력이다. 상기 알파 및 베타 아과는 그들의 세포 표적 선택성에서 다소 차이를 보인다. 대부분의 알파 케모킨은 호중구, T 세포 및 NK 세포를 유인한다. 베타-케모킨은 주로 단핵구와 T 림프구를 유인한다. 다수의 케모킨은 전염증 활성을 보유하며, 염증 반응의 다수 단계에 연루되어 있다. 이들 활성은 히스타민 방출 자극, 라이소좀 효소 및 루코트리엔 방출, 표적 면역 세포의 내피 세포에 대한 증가된 부착, 보체 단백질의 증강된 결합, 과립구 부착 분자 및 보체 수용체의 유도된 발현 및 호흡기 파열을 포함한다. 이들의 염증과의 관련성 이외에, 특정 케모킨은 다른 활성을 나타내는 것으로 확인되어 왔다. 예를 들어, 거식세포 염증 단백질(MIP-1)은 조혈 간상 세포 증식을 억제할 수 있고, 혈소판 인자-4(PF-4)는 내피 세포 성장의 유효한 억제제이며, 인터루킨-8(IL-8)은 각질세포의 증식을 촉진하며, GRO는 흑색종 세포의 오토크린(autocrine) 성장 인자이다. 케모킨은 다수의 생리학적 질환 및 질병, 특히 염증 성분을 보유하는 질환 및 질병에 연루되어 왔다. 이들의 예로는 림프구 트래픽킹, 상처 치료, 조혈 조절 및 면역학적 장애, 예를 들어 알러지, 천식 및 관절염을 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 다수의 케모킨은 염증성 반응의 생성물로서 최초 분리되었다. 예를 들어, MIP-1은 거식세포에 의해 생성된 내독소-유도된 전염증성 케모킨으로서 최초 분리되었다. 상기 아과의 다른 구성원들은 염증 유도뿐만 아니라 아미노산 서열 상동성에 기초하여 유사하게 동정할 수 있다. 이는 전장뿐만 아니라 본 발명의 단형 Ckβ-8 폴리펩티드를 포함한다.Interclean cytokines exhibit a variety of functions. One important feature is their ability to stimulate chemotactic migration of unique cell types such as monocytes, neutrophils, T lymphocytes, basophils and fibroblasts. The alpha and beta subfamily differ somewhat in their cell target selectivity. Most alpha chemokines attract neutrophils, T cells and NK cells. Beta-chemokines mainly attract monocytes and T lymphocytes. Many chemokines possess proinflammatory activity and are involved in many stages of the inflammatory response. These activities include histamine release stimulation, lysosomal enzyme and leukotriene release, increased attachment of target immune cells to endothelial cells, enhanced binding of complement proteins, induced expression of granulocyte adhesion molecules and complement receptors, and respiratory rupture. Include. In addition to their association with inflammation, certain chemokines have been shown to exhibit different activities. For example, macrophage inflammatory protein (MIP-1) can inhibit hematopoietic hepatic cell proliferation, platelet factor-4 (PF-4) is an effective inhibitor of endothelial cell growth, interleukin-8 (IL-8) Promotes proliferation of keratinocytes, and GRO is an autocrine growth factor for melanoma cells. Chemokines have been implicated in a number of physiological diseases and disorders, particularly those that carry inflammatory components. Examples of these include, but are not limited to, lymphocyte trafficking, wound healing, hematopoietic control and immunological disorders such as allergy, asthma and arthritis. Many chemokines were first isolated as the product of an inflammatory response. For example, MIP-1 was first isolated as endotoxin-induced proinflammatory chemokines produced by macrophages. Other members of the subfamily can similarly be identified based on amino acid sequence homology as well as inducing inflammation. This includes the full length as well as the short Ckβ-8 polypeptides of the invention.

본 발명은 단형(short form) 케모킨 베타-8(Ckβ-8)인 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 용도, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 생성 및 상기 폴리펩티드의 작용 억제에 관한 것이다.The present invention relates to a polypeptide which is a short form chemokine beta-8 (Ckβ-8) and a polynucleotide encoding the same. In particular, the present invention relates to the use of polynucleotide and polypeptide sequences, the generation of polynucleotide and polypeptide sequences, and the inhibition of the action of such polypeptides.

본원의 제 1 명에 따라, 절두형(截頭型; truncated form) 인간 Ckβ-8인 신규 폴리펩티드 뿐만 아니라 생물학적으로 활성이고, 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편, 유사체 및 유도체의 혼합물이 제공된다.According to a first person of the present application, there is provided a novel polypeptide that is truncated form human Ckβ-8 as well as a mixture of fragments, analogs and derivatives thereof that are biologically active, diagnostically or therapeutically useful. do.

본원의 제 2 발명에 따라, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공되는데, 이 핵산 서열은 mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA 뿐만 아니라 생물학적으로 활성인 이의 단편, 유사체 및 유도체를 포함한다.According to a second invention herein, an isolated nucleic acid sequence is provided that encodes the polypeptide, which includes mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA as well as biologically active fragments, analogs and derivatives thereof.

본원의 제 3 발명에 따라, 재조합 기법을 이용하여 상기 폴리펩티드를 생성하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 핵산 서열을 함유하는 재조합 원핵 숙주 세포 및/또는 진핵 숙주 세포를 상기 단백질의 발현과 후속 회수를 촉진하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다.In accordance with a third invention herein, a method is provided for producing said polypeptide using recombinant techniques, wherein the method provides for the expression and subsequent recovery of recombinant prokaryotic host cells and / or eukaryotic host cells containing a nucleic acid sequence. Culturing under promoting conditions.

본원의 제 4 발명에 따라, 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 치료용으로 사용하는 방법이 제공되는데, 여기서 치료용이라 함은 화학요법중 화학치료제로부터 골수 간상 세포의 보호 및 상처 치료의 자극을 들 수 있다.According to a fourth aspect of the invention, there is provided a method of treating the polypeptide or a polynucleotide encoding the polypeptide, wherein the treatment is for the protection of wound bone marrow cells from chemotherapy during chemotherapy and for the treatment of wounds. Stimulation.

본원의 제 5 발명에 따라, 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 제공된다.According to a fifth invention herein, an antibody against said polypeptide is provided.

본원의 제 6 발명에 따라, 상기 폴리펩티드의 작용, 예를 들어 재생불량성 빈혈, 골수이형성 증후군, 천식 및 관절염의 치료를 억제하는데 사용할 수 있는 상기 폴리펩티드에 대한 길항물질이 제공된다.According to a sixth invention of the present application, there is provided an antagonist to said polypeptide which can be used to inhibit the action of said polypeptide, for example the treatment of aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, asthma and arthritis.

본원의 제 7 발명에 따라, Ckβ-8 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브가 제공된다.In accordance with a seventh invention herein, nucleic acid probes are provided that comprise nucleic acid molecules of sufficient length that can specifically hybridize to a Ckβ-8 nucleic acid sequence.

본원의 제 8 발명에 따라, 상기 폴리펩티드의 미달발현 및 초과발현에 관련된 질병을 검출하는 진단 분석법 및 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열내의 돌연변이를 검출하는 진단 분석법이 제공된다.According to an eighth invention of the present application, a diagnostic assay for detecting a disease related to underexpression and overexpression of the polypeptide and a diagnostic assay for detecting a mutation in a nucleic acid sequence encoding the polypeptide is provided.

본원의 제 9 발명에 따라, 인간 질병의 치료를 위한 치료제 및 진단제의 개발을 목적으로 하는 과학적 연구, DNA의 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 시험관내 목적을 위한 연구 시약으로서 상기 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다.According to a ninth aspect of the present invention, the polypeptide or the polypeptide as a research reagent for in vitro purposes relating to scientific research, synthesis of DNA, and preparation of a DNA vector, aimed at the development of therapeutic and diagnostic agents for the treatment of human diseases. It provides a method of using a polynucleotide encoding the.

본원에서 교시한 상기 발명들 및 기타 발명들은 당업자에게 명백할 것이다.These and other inventions taught herein will be apparent to those skilled in the art.

전염증성 "인터크린" 케모킨 상과(上科)와 구조적으로 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 기술되어 왔다. 전장 Ckβ-8(120 아미노산)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 대동맥 내피 cDNA 라이브러리로부터 유도된다. 본 발명은 단지 장형(long form)폴리펩티드의 82, 76, 75 또는 74 C-말단 아미노산을 함유하는 신규한 단형 Ckβ-8에 관한 것이다. N-말단 아미노산뿐만 아니라 21개 잔기의 시그날 펩티드 서열이 절단된다. 장형 Ckβ-8에 있어서, 이들 클론 내의 최초 2개의 시스테인 잔기는 "C-C" 또는 케모킨의 베타 아과 내에 이들을 위치시키는 인접 위치 내에 존재한다. 이 모티프의 존재로 인해 이들은 최초 2개의 시스테인 잔기가 하나의 아미노산에 의해 분리된 케모킨의 아과("CXC")와 구별된다.DNA sequences encoding polypeptides structurally related to the pro-inflammatory “interclean” chemokine superfamily have been described. Polynucleotide sequences encoding full length Ckβ-8 (120 amino acids) are derived from the aortic endothelial cDNA library. The present invention relates to novel short Ckβ-8 containing only 82, 76, 75 or 74 C-terminal amino acids of long form polypeptides. Signal peptide sequences of 21 residues as well as the N-terminal amino acids are cleaved. For enteric Ckβ-8, the first two cysteine residues in these clones are in adjacent positions that place them in the beta subfamily of "C-C" or chemokines. The presence of these motifs distinguishes them from the subfamily of chemokines (“CXC”) in which the first two cysteine residues are separated by one amino acid.

성숙 폴리펩티드(서열 번호 1, 2, 3 및 4)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 폴리펩티드와 관련된 부가적인 암호 서열 및 비암호 서열을 포함하는 RNA, ssDNA, 게놈 DNA 등과 같은 임의의 핵산 형태로 나타낼 수 있다. 또한, 아미노산 코드의 퇴화성에 기인하여 동일한 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 DNA 암호 서열도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들 서열의 변종, 대립 유전자 또는 자연적으로 발생하지 않는 서열도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한, 본 발명은 임호 서열이 세포 내에서 상기 단백질을 동정하기 위한 마커(예를 들어, HA 태그)로서 사용되거나 상기 단백질의 발현 또는 분비에 조력하는 다른 DNA 서열에 대한 동일한 판톡 틀 내에 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.Polynucleotide sequences encoding mature polypeptides (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4) can be represented in any nucleic acid form, such as RNA, ssDNA, genomic DNA, etc., including additional coding and noncoding sequences associated with the polypeptide. have. Also included within the scope of this invention are any DNA coding sequences that encode the same mature polypeptide due to the degeneracy of the amino acid code. Variants, alleles or naturally occurring sequences of these sequences are also included within the scope of the present invention. In addition, the present invention relates to a polynucleotide in which a mutant sequence is used as a marker (eg, an HA tag) for identifying the protein in a cell or fused in the same pantok framework for other DNA sequences that aid in the expression or secretion of the protein. Nucleotides.

또한, 본 발명은 서열 동일성이 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상인 기술된 서열에 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드는 성숙 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 것이 바람직하다. 대안으로, 상기 서열은 바람직하게는 본 발명의 서열과 동일하거나 이 서열에 하이브리드를 형성하는 50개의 염기를 보유하나, 활성을 보유하지는 않는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 서열은 프로브 또는 PCR 프라이머로 사용할 수 있다.The invention also relates to polynucleotide sequences which form hybrids to the described sequences having at least 50%, preferably at least 70% sequence identity. These polynucleotides preferably encode polypeptides having the same biological function or activity as the mature polypeptide. Alternatively, the sequence may be a polynucleotide, preferably having the same base as the sequence of the present invention or having 50 bases which hybridize to this sequence, but which does not retain activity. Such sequences can be used as probes or PCR primers.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 이들 폴리펩티드의 유도체는 하나 이상의 아미노산이 치환된 것; 하나 이상의 아미노산이 치환기를 함유한 것; 성숙 단백질이 다른 화합물과 융합된 것; 또는 추가 아미노산이 성숙 단백질에 융합된 것일 수 있다.Polypeptides of the invention may be recombinant polypeptides, natural polypeptides or synthetic polypeptides. Derivatives of these polypeptides may be substituted with one or more amino acids; One or more amino acids contain substituents; The mature protein is fused with another compound; Or additional amino acids may be fused to mature proteins.

본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태, 더 바람직하게는 균질하게 정제된 형태로 제공되는 것이 바람직하다.The polypeptides of the invention are preferably provided in isolated form, more preferably in homogeneously purified form.

또한, 본 발명은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 이 벡터를 이용하여 유전적으로 조작한 숙주 세포 및 재조합 기법을 이용한 본 발명 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 발명의 벡터(클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 이용하여 유전적으로 조작된다. 프로모터를 활성화하거나, 형질전환체를 선택하거나, 절단된 Ckβ-8 유전자를 증폭시키기 위한 배양 조건은 당업자에게는 자명한 사실일 것이다.The present invention also relates to the production of a polypeptide comprising the vector comprising the polynucleotide of the present invention, a host cell genetically engineered using the vector and recombinant techniques. Host cells are genetically engineered using the vectors (cloning vectors or expression vectors) of the invention. Culture conditions for activating a promoter, selecting a transformant, or amplifying a cleaved Ckβ-8 gene will be apparent to those skilled in the art.

상기 폴리뉴클레오티드 서열은, 이들이 숙주 세포 내에서 복제가능하고, 생존할 수 있는 한 여러 가지 발현 벡터중 1종일 수 있다. 발현 벡터 내에 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열은 mRNA 합성을 유도하기에 적합한 프로모터(예를 들어, LTR 프로모터)의 조절 하에 있다. 또한, 발현 벡터는 해독 개시를 위한 리보좀 결합 위치, 전사 프로모터, 전사를 증가시키는 인헨서 요소(예를 들어, SV40 후기 인헨서) 및 숙주 내에서 상기 벡터의 유지를 보장하기 위해 적합한 선택성 마커를 포함한다. 숙주 세포는 포유류 세포 및 곤충 세포와 같은 고등 진핵 세포, 효모와 같은 하등 진핵 세포, 또는 박테리아와 같은 원핵세포를 들 수 있다. 이들 숙주 내로 상기 구성물의 도입은 다양한 방법으로 수행할 수 있다. 상기한 모든 과정은 당업자에게 공지되어 있다. 클로닝 단계 및 숙주와 벡터 선택도 당업자에게 공지되어 있다[참조: Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, 콜드 스프링 하버, 뉴욕(1989)].The polynucleotide sequence may be one of several expression vectors as long as they are replicable and viable in the host cell. The polynucleotide sequence inserted into the expression vector is under the control of a promoter (eg, LTR promoter) suitable for inducing mRNA synthesis. Expression vectors also include ribosomal binding sites for transcription initiation, transcriptional promoters, enhancer elements that increase transcription (eg, SV40 late enhancers) and selectable markers suitable to ensure maintenance of the vector in the host. do. Host cells include higher eukaryotic cells such as mammalian cells and insect cells, lower eukaryotic cells such as yeast, or prokaryotic cells such as bacteria. Introduction of the constructs into these hosts can be accomplished in a variety of ways. All of the above processes are known to those skilled in the art. Cloning steps and host and vector selection are also known to those skilled in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989)).

단백질은 숙주 세포 내에서 적합한 프로모터의 조절 하에 합성할 수 있다. 또한, 무세포 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 DNA 구성물로부터 유도된 RNA를 이용하여 상기 단백질을 합성할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 폴리펩티드는 통상의 펩티드 합성기를 이용하여 합성할 수도 있다.Proteins can be synthesized under the control of a suitable promoter in the host cell. In addition, the protein can be synthesized using RNA derived from the DNA construct of the present invention using a cell-free expression system. Alternatively, the polypeptides of the invention can also be synthesized using conventional peptide synthesizers.

적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키고, 적합한 세포 밀도로 상기 숙주를 성장시킨 후, 선택된 프로모터를 적합한 수단(예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)을 통해 도입하고, 세포는 더 배양시킨다. 전형적으로 세포는 원심분리에 의해 수집되며, 물리적 수단 또는 화학적 수단으로 분쇄되며, 여러 가지 방법(예를 들어, 크로마토크래피, HPLC)으로 균질한 상태로 정제한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 상기 폴리펩티드는 몇몇 방법(예를 들어, 글리코실화)으로 개질할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 초기 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다.After transforming or transfecting the appropriate host, growing the host to a suitable cell density, the selected promoter is introduced via a suitable means (eg, temperature shift or chemical induction) and the cells are further cultured. Cells are typically collected by centrifugation, milled by physical or chemical means, and purified homogeneously by various methods (eg, chromatography, HPLC). Depending on the host cell used, the polypeptide can be modified in several ways (eg, glycosylation). In addition, the polypeptides of the invention may comprise initial methionine residues.

장형 Ckβ-8은 백혈구를 유인하는 주화인자이며, 따라서 여러 가지 면역조절 및 염증 기능뿐만 아니라 다수의 질병에 사용할 수 있다. 이 단백질은 주로 조혈원 조직 내에서 발현된다. 백혈구에 대한 Ckβ-8의 한가지 중요한 생물학적 효과는 Ca⁺⁺예비물 동원(動員)의 자극이다. 이 동원은 상기 세포의 기능적 활성화를 유지시켜 준다. 4가지의 단형 Ckβ-8(서열 번호 1-4)을 함유하는 혼합물을 이용하는 분화된 EOL-3 세포의 자극은 투여량에 의존하는 세포내 Ca⁺⁺의 즉시 증가로 귀착되는 것으로 확인되어 왔다. 개별적으로 테스트하는 경우, 서열 번호 4를 보유하는 단형이 가장 활성이 있었다. 대조적으로, 장형 Ckβ-8은 Ca⁺⁺동원에 있어서 단형 Ckβ-8 보다 약 1000배 약한 능력을 나타냈다. 본 발명의 단형 Ckβ-8의 능력은 케모킨의 치료적 적용의 효과로부터 유추할 수 있는데, 그 적용예로는 화학요법중 화학치료제로부터 골수 간상 세포의 보호, 백혈병 세포의 제거, 면역 반응의 자극, 조혈과 림프구 트래픽킹의 조절, 건선과 고형 종양의 치료, 저항성인 만성 또는 급성 염증에 대한 숙주 보호의 증강 및 상처 치료의 자극을 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.Enteric Ckβ-8 is a chemotactic factor that attracts leukocytes and can therefore be used for many diseases as well as for various immunoregulatory and inflammatory functions. This protein is mainly expressed in hematopoietic tissue. One important biological effect of Ckβ-8 on leukocytes is the stimulation of Ca ⁺⁺ reserve mobilization. This recruitment maintains the functional activation of the cell. Stimulation of differentiated EOL-3 cells using a mixture containing four short Ckβ-8 (SEQ ID NOs: 1-4) has been shown to result in an immediate increase in dose-dependent intracellular Ca ⁺⁺ . When tested individually, the short form with SEQ ID NO: 4 was the most active. In contrast, long Ckβ-8 exhibited about 1000 times weaker capacity than short Ckβ-8 in Ca ⁺⁺ mobilization. The ability of the monoclonal Ckβ-8 of the present invention can be inferred from the effects of therapeutic application of chemokines, examples of which include the protection of myeloid rod cells from chemotherapeutic agents during chemotherapy, removal of leukemia cells, stimulation of immune responses. Regulating hematopoietic and lymphocyte trafficking, treating psoriasis and solid tumors, enhancing host protection against resistant chronic or acute inflammation, and stimulating wound healing.

본 발명의 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드는 DNA 합성 및 DNA 벡터의 제조 및 인간 질병(예를 들어, 미성숙 조혈 후대 세포의 팽창)의 치료를 위한 치료제와 진단제의 개발을 위한 연구 시약으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 절단된 Ckβ-8 폴리뉴클레오티드 서열의 단편은 높은 서열 유사성을 가진 기타 유전자를 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서 사용할 수도 있다. 이런 종류의 실험 기법은 당업자에게 공지되어 있다.The polynucleotides and polypeptides of the present invention can be used as research reagents for the manufacture of DNA synthesis and DNA vectors and for the development of therapeutics and diagnostics for the treatment of human diseases (eg, expansion of immature hematopoietic progenitor cells). In addition, fragments of the cleaved Ckβ-8 polynucleotide sequences can also be used as hybridization probes to separate other genes with high sequence similarity. Experimental techniques of this kind are known to those skilled in the art.

또한, 본 발명은 핵산 서열 내에 돌연변이의 존재와 관련된 질병을 검출하거나, 이 질병에 대한 민감성을 검출하기 위한 진단 분석법의 일부로서 이들 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 질병은 케모킨 폴리펩티드의 미달발현과 관련되어 있다. 예를 들어, Ckβ-8 유전자 내에 돌연변이를 보유하는 개체는 PCR과 같은 다양한 기법에 의해 DNA 수준에서 검출할 수 있다. DNA 서열 차이에 기초한 유전적 테스트는 변성제를 사용하거나 사용하지 않고, 겔 내에서 DNA 단편의 전기영동적 이동성의 변화를 검출하므로써 수행할 수 있다. 특이 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNase 보호, 화학적 절단, 직접적인 DNA 서열결정, RFLP 분석 및 게놈 DNA의 서던 블로팅과 같은 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 돌연변이는 동일계내 분석에 의해 분석할 수 있다.The invention also relates to methods of detecting diseases associated with the presence of mutations in nucleic acid sequences or using these sequences as part of a diagnostic assay for detecting sensitivity to these diseases. This disease is associated with underexpression of chemokine polypeptides. For example, individuals carrying mutations in the Ckβ-8 gene can be detected at the DNA level by various techniques such as PCR. Genetic tests based on DNA sequence differences can be performed by detecting changes in the electrophoretic mobility of the DNA fragments in the gel, with or without denaturing agents. Detection of specific DNA sequences can be performed by methods such as hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing, RFLP analysis, and southern blotting of genomic DNA. Mutations can also be analyzed by in situ analysis.

또한, 본 발명은 여러 가지 조직 내에서 Ckβ-8 단백질의 변경된 수준을 검출하기 위한 진단 분석법에 관한 것인데, 그 이유는 정상 조직 샘플과 비교한 단백질의 초과발현으로 질병의 존재 또는 이들 질병, 예를 들어 종양의 존재를 검출할 수 있기 때문이다. 숙주로부터 유도된 샘플 내의 Ckβ-8 단백질 수준을 검출하기 위해 사용된 분석법은 당업계에 공지되어 있으며, 그 예로는 경쟁적 결합 분석, 웨스턴 블롯 분석, ELISA 분석 및 "샌드위치" 분석을 들 수 있다.The present invention also relates to diagnostic assays for detecting altered levels of Ckβ-8 protein in various tissues, because of the overexpression of proteins compared to normal tissue samples and the presence of diseases or of these diseases, e.g. This is because the presence of a tumor can be detected. Assays used to detect Ckβ-8 protein levels in samples derived from a host are known in the art and include, for example, competitive binding assays, Western blot assays, ELISA assays, and “sandwich” assays.

본 발명은 케모킨 폴리펩티드를 위한 수용체를 동정하는 방법을 제공한다. 상기 수용체를 암호화하는 유전자는 리간드 패닝(Panning) 및 FACS 소팅(sorting)을 포함하는 당업계에 공지된 다수의 방법으로 수행할 수 있다.The present invention provides a method for identifying a receptor for a chemokine polypeptide. The gene encoding the receptor can be performed by a number of methods known in the art, including ligand panning and FACS sorting.

수용체 동정을 위한 별법으로서 상기 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물과 표지된 폴리펩티드를 광결합시키는 방법을 포함한다. 표지된 복합체는 분리하여 단백질 미세서열결정을 수행할 수 있다. 수득한 아미노산 서열은 추정 수용체를 암호화하는 유전자를 동정하는 cDNA 라이브러리를 스크린하기 위한 한 세트의 퇴화 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하는데 사용할 수 있다.Alternatives for receptor identification include methods for photolinking a labeled polypeptide with a cell membrane or extract that expresses the receptor molecule. The labeled complex can be separated to perform protein microsequencing. The obtained amino acid sequence can be used to design a set of degenerate oligonucleotide probes for screening cDNA libraries that identify genes encoding putative receptors.

본 발명은 본 발명의 케모킨 폴리펩티드에 대한 작용물질 및 길항물질을 동정하기 위해 화합물을 선별하는 방법을 제공한다. 화학주성은 세포를 통과시키기에 충분히 큰(5 mm) 세공을 가진 필터의 상단에 이들 폴리펩티드에 의해 주화인자에 유인된 세포를 위치시키므로써 분석할 수 있다. 잠재 길항물질 또는 작용물질의 용액은 하부 챔버에 위치시켜 세포가 일정 기간동안 상기 막을 통해 이동하거나 이동하지 못하도록 한다. 별법으로, Ckβ-8의 수용체는 임의 화합물의 존재 하에서 표지된 폴리펩티드와 함께 항온처리한다. 폴리펩티드 부재 하에서 이 상호작용을 차단하거나 상기 수용체와 상호작용할 수 있는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.The present invention provides methods for screening compounds to identify agonists and antagonists for the chemokine polypeptides of the invention. Chemotaxis can be analyzed by placing the cells attracted to the coin factor by these polypeptides on top of a filter with pores large enough (5 mm) to pass the cells. A solution of latent antagonist or agonist is placed in the lower chamber to prevent cells from moving or moving through the membrane for a period of time. Alternatively, the receptor of Ckβ-8 is incubated with the labeled polypeptide in the presence of any compound. The ability of a compound to block this interaction or interact with the receptor in the absence of a polypeptide can be measured.

절두형 Ckβ-8 잠재 길항물질의 예로는 항체, 폴리펩티드에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 야생형 폴리펩티드의 수용체에 결합하나, 생물학적 활성은 보유하지 않는 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, 유전자 발현을 조절하기 위해 사용된 안티센스 기술도 잠재 길항물질일 수 있다. 상기한 기술들의 유용성은 당업자에게 명백할 것이다.Examples of truncated Ckβ-8 latent antagonists include polypeptides that bind to an antibody, an oligonucleotide that binds to the polypeptide, or a receptor of a wild type polypeptide but do not retain biological activity. In addition, antisense techniques used to regulate gene expression may also be potential antagonists. The usefulness of the above techniques will be apparent to those skilled in the art.

길항물질은 규폐증, 유육종증, 특발성 폐 섬유증, 특발성 호산구증대 증후군 및 내독성 쇼크와 같은 감염성 질병의 치료에 사용할 수 있는데, 이는 모두 본 발명의 폴리펩티드의 생성을 예방하므로써 이루어지는 것이다. 또한, 길항물질은 동맥 벽의 단핵구 침윤을 예방하므로써 죽상 동맥 경화증 치료에 사용할 수 있다. 길항물질은 히스타민-매개된 알레르기 반응 및 진피와 관련된 여러 가지 면역학적 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.Antagonists can be used for the treatment of infectious diseases such as silicosis, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, idiopathic eosinophilia syndrome and endotoxin shock, all of which are achieved by preventing the production of polypeptides of the invention. Antagonists can also be used to treat atherosclerosis by preventing monocyte infiltration of arterial walls. Antagonists can be used to treat histamine-mediated allergic reactions and various immunological disorders associated with the dermis.

또한, 길항물질은 상처 부위에 대한 단핵구의 유인을 예방하므로써 만성 및 급성 염증을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 이들은 영향받은 부위에 대한 단핵구의 유입을 방지하므로써 염증성 폐 질환, 일반 염증 및 류마티스성 관절염을 치료하는데 사용할 수 있다.In addition, antagonists can be used to treat chronic and acute inflammation by preventing the induction of monocytes to the wound site. In addition, they can be used to treat inflammatory lung disease, general inflammation and rheumatoid arthritis by preventing the influx of monocytes to the affected area.

또한, 길항물질은 재생불량성 빈혈 또는 골수이형성 증후군에서 골수 장애를 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 이들은 천식, 알러지 및 천식성 폐의 특징인 상피하 섬유증을 치료하는데 사용할 수 있다.Antagonists can also be used to treat bone marrow disorders in aplastic anemia or myelodysplastic syndromes. They can also be used to treat subepithelial fibrosis, which is characteristic of asthma, allergies and asthmatic lungs.

케모킨 폴리펩티드 및 작용물질 및 길항물질은 염수, 완충처리된 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 혼합물과 함께 사용할 수 있다. 상기 제제는 투여 형태에 적합하여야 한다. 또한, 본 발명은 약학적 팩 또는 키트를 제공하는데, 이들은 본 발명의 약학적 조성물의 성분중 1종 이상의 성분으로 충전된 1개 이상의 용기를 포함한다.Chemokine polypeptides and agonists and antagonists can be used with saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol and mixtures thereof. The formulations should be suitable for the dosage form. The invention also provides pharmaceutical packs or kits, which comprise one or more containers filled with one or more of the components of the pharmaceutical compositions of the invention.

약학 조성물은 국소투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 종양내 투여, 피하투여, 비강내 투여 또는 피내투여와 같은 통상적인 방법으로 투여할 수 있으며, 특정 증상을 치료하기에 효과적인 양으로 투여한다. 이러한 사항은 당업자에게 공지되어 있다.The pharmaceutical composition may be administered by conventional methods such as topical administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, intratumoral administration, subcutaneous administration, intranasal administration, or intradermal administration, and are effective amounts for treating certain symptoms. To administer. Such matters are known to those skilled in the art.

케모킨 폴리펩티드, 이 폴리펩티드의 작용물질 또는 길항물질은 본 발명에 따라 사용할 있으며, 이는 생체 내에서 상기 폴리펩티드의 발현에 의해 이루어진다. 예를 들어, 환자의 세포는 생체 외에서 단형 Ckβ-8 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA로 조작되며, 이들 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 세포를 환자에게 투입한다. 유사하게, 세포는 생체 내에서 폴리펩티드의 발현을 위해 생체 내에서 조작할 수도 있다.Chemokine polypeptides, agonists or antagonists of these polypeptides can be used according to the invention, which is achieved by expression of the polypeptide in vivo. For example, a patient's cells are engineered ex vivo with DNA or RNA encoding a single Ckβ-8 polypeptide, and the engineered cells encoding these polypeptides are injected into the patient. Similarly, cells may be engineered in vivo for expression of polypeptides in vivo.

당업계에 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로비루스 입자를 사용할 수도 있다. 레트로비루스 플라즈미드 벡터는 여러 가지 방법(예를 들어, 전기적 천공법)으로 팩케이징 세포주(예를 들어, PE501)를 형질도입하여 생산자 세포주를 형성하는데 사용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 레트로비루스 발현 벡터는 LTR과 같은 프로모터의 조절하에 있으며, 선택가능한 약제 내성 마커(예를 들어, 네오)를 함유한다. 이들 벡터 및 생성 세포주는 당업자에게 친숙한 것이어야 하며, 그 기법들은 본 명세서에 기술하였다. 생산자 세포주는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로비루스 벡터 입자를 생성한다. 이러한 레트로비루스 벡터 입자는 진핵세포, 예를 들어 섬유아세포 또는 내피 세포를 시험관내 또는 생체 내에서 형질도입하는데 사용할 수 있다. 이어서, 형질도입된 진핵세포는 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열(들)을 발현한다.As is known in the art, retrovirus particles containing RNA encoding the polypeptides of the invention can also be used. Retrovirus plasmid vectors can be used to transduce packaging cell lines (eg, PE501) in various ways (eg, electroporation) to form producer cell lines. In a preferred embodiment, the retrovirus expression vector containing the polynucleotide sequence is under the control of a promoter such as LTR and contains a selectable drug resistance marker (eg, neo). These vectors and production cell lines should be familiar to those skilled in the art and the techniques are described herein. Producer cell lines produce infectious retroviral vector particles comprising nucleic acid sequence (s) encoding said polypeptide. Such retroviral vector particles can be used to transduce eukaryotic cells such as fibroblasts or endothelial cells in vitro or in vivo. The transduced eukaryotic cells then express the nucleic acid sequence (s) encoding the protein.

또한, 본 발명의 서열은 염색체 동정에 유용하다. 상기 서열은 개개의 염색체상의 특정 위치를 특이적으로 표적화하여 하이브리드를 형성할 수 있다. 염색체에 대한 DNA의 지도화는 질병과 관련된 유전자의 상관관계를 규명하는데 있어서 중요한 단계이다. 당업자에게 공지된 한 방법은 개개의 인간 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 선별에 사용되는 프라이머의 제조를 포함한다. 단지 상기 프라이머에 상응하는 인간 유전자를 함유하는 하이브리드는 증폭된 단편을 산출할 것이다. 당업계에 공지된 다른 지도화 방법의 예로는 동일계내 하이브리드화, 표지된 유동-분류된 염색체를 이용하는 예비 선별, 동일한 PCR 프라이머를 이용하는 특정 염색체의 단편에 대한 세부정위 및 염색체 특이성 cDNA 라이브러리를 구성하는 하이브리드화에 의한 예비 선별을 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 중기 염색체 방추사에 대한 cDNA 클론의 형광 동일계내 하이브리드화(FISH)를 이용하여 단일 단계로 정확한 염색체 위치를 결정할 수 있다.In addition, the sequences of the invention are useful for chromosome identification. The sequence can specifically target specific locations on individual chromosomes to form hybrids. The mapping of DNA to chromosomes is an important step in correlating genes associated with disease. One method known to those skilled in the art involves the preparation of primers used for PCR selection of somatic hybrids containing individual human chromosomes. Hybrids containing only human genes corresponding to the primers will yield amplified fragments. Examples of other mapping methods known in the art include in situ hybridization, preliminary screening using labeled flow-sorted chromosomes, detailing fragments of specific chromosomes using the same PCR primers and constructing a chromosome specific cDNA library. Preliminary screening by hybridization, but is not limited thereto. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of cDNA clones to mid-term chromosomal spindles can be used to determine the exact chromosome location in a single step.

일단 서열이 지도화되어 정확한 염색체 위치가 결정되면, 상기 서열의 물리적인 위치는 유전 지도 자료와 관계가 있을 수 있다. 유전자와 질병간의 관계는 결합 분석에 의해 수행할 수 있다. 영향받은 개체와 영향받지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 어떤 차이는 질병의 지표일 수 있다. 예를 들어, 영향받은 개체에서 단지 발견되는 DNA 내의 돌연변이는 질병의 원인일 수 있다.Once the sequence is mapped to determine the correct chromosome location, the physical location of the sequence can be related to genetic map material. The relationship between genes and disease can be accomplished by binding analysis. Any difference in cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals may be indicative of disease. For example, mutations in the DNA only found in the affected individual may be the cause of the disease.

폴리펩티드, 그들의 단편 또는 기타 유도체, 또는 이의 유사체 또는 이들을 발현하는 세포는 이들에 대한 항체를 제조하기 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 이들 항체는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 키메라 항체, 단쇄 항체 및 인간화 항체뿐만 아니라 Fab 단편 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당업계에 공지된 여러 가지 방법은 이러한 항체 및 단편을 제조하는데 사용할 수 있다. 표준 방법에 의해 제조된 다중클론 항체는 상기 폴리펩티드를 발현하는 조직으로부터 이 폴리펩티드를 분리하는데 사용할 수 있다. 단일클론 항체를 제조하기 위해, 연속 세포주 배양에 의해 제조되는 항체를 제동하는 임의의 기법을 사용할 수 있다. 단쇄 항체 제조를 위해 기술된 방법을 적용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩티드에 대한 단쇄 항체를 제조할 수 있다. 또한, 돌연변이 생쥐를 이용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩티드에 대한 인간화된 항체를 발현할 수 있다.Polypeptides, fragments or other derivatives thereof, or analogs thereof or cells expressing them can be used as immunogens for preparing antibodies to them. For example, these antibodies can be polyclonal or monoclonal antibodies. In addition, the present invention includes chimeric antibodies, single chain antibodies and humanized antibodies as well as products of Fab fragments or Fab expression libraries. Various methods known in the art can be used to prepare such antibodies and fragments. Polyclonal antibodies prepared by standard methods can be used to isolate this polypeptide from tissues expressing said polypeptide. To prepare monoclonal antibodies, any technique can be used to brake the antibodies produced by continuous cell line cultures. The methods described for the production of single chain antibodies can be applied to produce single chain antibodies against the immunogenic polypeptides of the invention. In addition, mutant mice can be used to express humanized antibodies against immunogenic polypeptides of the invention.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가 기술될 것이다: 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 하기 실시예를 용이하게 이해하기 위해서 빈번하게 사용되는 방법 및/또는 용어를 정리한다.The invention will be further described by the following examples: however, the invention is not limited by these examples. Frequently used methods and / or terms are summarized in order to facilitate understanding of the following examples.

본 명세서에 출발 플라즈미드는 시판되는 것들이며, 아무런 제한 없이 구입할 수 있으며, 이미 공지된 방법으로 제조할 수도 있다. 또한, 당업자에게 공지된 플라즈미드와 등가의 플라즈미드도 당업자에게는 자명한 것일 것이다. DNA를 "분해"하기 위해 본 명세서에서 사용한 여러 가지 제한 효소는 시판되며, 사용된 그들의 반응 조건, 보조인자 및 기타 필요 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 절단된 단편의 크기 분리는 8% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 수행하였다.Starting plasmids herein are those commercially available, can be purchased without any limitation, and may be prepared by known methods. In addition, plasmids equivalent to those known to those skilled in the art will be apparent to those skilled in the art. Various restriction enzymes used herein to “degrade” DNA are commercially available and their reaction conditions, cofactors and other requirements used are known to those skilled in the art. Size separation of the cleaved fragments was performed using an 8% polyacrylamide gel.

올리고뉴클레오티드는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 2개의 상보적인 폴리데옥시뉴클레오티드 쇄를 의미하며, 이들은 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 보유하지 않으며, 따라서 키나제 존재 하에서 ATP를 이용하여 포스페이트를 첨가하지 않으면 다른 올리고뉴클레오티드에 결합하지 않는다. 합성 올리고뉴클레오티드는 인산기가 제거되지 않은 단편에 결합할 것이다. 특별한 언급이 없으면, 형질전환은 문헌[참조: Graham, F. 및 Van der Eb, A., Virology, 52, 456-457 (1973)]에 기술된 바와 같이 수행하였다.Oligonucleotides refer to single-chain polydeoxynucleotides or two complementary polydeoxynucleotide chains, which can be synthesized chemically. Such synthetic oligonucleotides do not possess 5 'phosphate and therefore do not bind to other oligonucleotides unless phosphate is added using ATP in the presence of kinase. Synthetic oligonucleotides will bind to fragments in which the phosphate group has not been removed. Unless otherwise noted, transformation was performed as described in Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52, 456-457 (1973).

하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.The following examples are merely to illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the invention.

실시예 1: Ckβ-8의 박테리아 발현 및 정제Example 1 Bacterial Expression and Purification of Ckβ-8

Ckβ-8을 암호화하는 DNA 서열 ATCC #75676은 프로세싱된 Ckβ-8 단백질(시그날 펩티드 서열을 제외함)의 5' 및 3' 단부 서열 및 Ckβ-8 유전자에 대한 벡터 서열 3'에 상응하는 PCR 프라이머를 이용하여 초기 증폭시켰다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5' TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA 3'(서열 번호 5)이고, 3' 프라이머의 서열은 5' CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT 3'(서열 번호 6)이었다. 이들 프라이머는 각각 앰피실린 내성 박테리아 발현 벡터 PQE-9(미국, 캘리포니아, 캐츠워스에 소재하는 퀴아젠 인코오포레이티드에서 시판됨)의 폴리링커 영역 내로 클로닝하기 위해 사용되는 BamHI 및 XbaI 제한 위치를 보유하고 있었다. 상기 증폭된 서열은 히스티딘 태그와 리보좀 결합 위치(RBS)를 위한 암호 서열과 함께 프레임 내에서 PQE-9 내로 결합하였다. 이 결합은 플라즈미드 pREP4의 다수 사본을 함유하는 이. 콜리 균주 M15/rep 4(퀴아젠)를 형질전환시키는데 사용하였다. pREP4는 lacI 리프레서를 발현하며, 또한 카나마이신 내성을 부여하였다. 형질전환체는 앰피실린/카나마이신으로 보충된 LB 평판 상에서 증식할 수 있는 그들의 능력에 의해 선택하였다. 원하는 구성물을 함유하는 클론(분리하고, 제한 분석으로 확인함)은 앰피실린(100 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 둘 다 보충된 LB 배지 내에서 하룻밤 동안 액체 배양시켰다. 이 배양물은 1:100 내지 1:250의 비율로 다량의 배양물을 접종하기 위해 사용하였다. 상기 세포들은 600 nm에서의 광학 밀도가 0.4 내지 0.6이 되도록 증식시켰다. 이어서, IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토-피라노시드)를 최종 농도 1 mM로 하여 첨가하였다. 세포는 3 내지 4시간 동안 더 증식시키고, 원심분리로 수거하였다. 세포 펠렛은 케이오트로픽 제제인 6 M 구이니딘 HCl 내에 용해시키고, 투명하게 하고, 6-히스티딘 태그를 함유하는 단백질에 의한 강한 결합을 가능하게 하는 조건하에 니켈-킬레이트 칼럼 상에서 크로마토그래피를 수행하였다[참조: Hochuli, E. 등, J. Chromatography 41, 411, 177-184 (1984)]. 절두형 Ckβ-8(순도 95%)은 6 M 구아니딘 HCl(pH 5)내의 칼럼으로부터 용출하고, 재생을 목적으로 6 M 구아니딘 HCl, 100 mM 인산나트륨, 10 mM 글루티티온(환원됨) 및 2 mM 글루타티온(산화됨)으로 조정하였다. 이 용액 내에서 12 시간 동안 항온처리한 후, 상기 단백질은 10 mM 인산나트륨으로 투석하였다.DNA sequence ATCC # 75676 encoding Ckβ-8 shows PCR primers corresponding to the 5 'and 3' end sequences of the processed Ckβ-8 protein (except for the signal peptide sequence) and the vector sequence 3 'for the Ckβ-8 gene. Initially amplified using. The sequence of 5 'oligonucleotide primer was 5' TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA 3 '(SEQ ID NO: 5), and the sequence of 3' primer was 5 'CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT 3' (SEQ ID NO: 6). These primers each carry BamHI and XbaI restriction sites used for cloning into the polylinker region of the ampicillin resistant bacterial expression vector PQE-9 (available from Qiagen Inc., Catsworth, CA, USA). Was doing. The amplified sequences were bound into PQE-9 in frame with coding sequences for histidine tags and ribosomal binding sites (RBS). This binding results in E. coli containing multiple copies of plasmid pREP4. Coli strain M15 / rep 4 (Qiagen) was used to transform. pREP4 expresses lacI repressor and also confers kanamycin resistance. Transformants were selected by their ability to proliferate on LB plates supplemented with ampicillin / kanamycin. Clones containing the desired constructs (isolated and identified by restriction analysis) were liquid cultured overnight in LB medium supplemented with both ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml). This culture was used to inoculate a large amount of culture in a ratio of 1: 100 to 1: 250. The cells were grown to an optical density of 0.4 to 0.6 at 600 nm. IPTG (isopropyl-B-D-thiogalacto-pyranoside) was then added at a final concentration of 1 mM. Cells were further propagated for 3-4 hours and harvested by centrifugation. Cell pellets were dissolved in 6M Guinidine HCl, a caotropic preparation, chromatographed and chromatographed on a nickel-chelate column under conditions that allowed strong binding by proteins containing 6-histidine tags [ See Hochuli, E. et al., J. Chromatography 41, 411, 177-184 (1984). The truncated Ckβ-8 (purity 95%) elutes from the column in 6 M guanidine HCl, pH 5, 6 M guanidine HCl, 100 mM sodium phosphate, 10 mM glutathione (reduced) and 2 for regeneration purposes. Adjusted to mM glutathione (oxidized). After incubation for 12 hours in this solution, the protein was dialyzed with 10 mM sodium phosphate.

실시예 2: COS 세포내에서 재조합 Ckβ-8의 발현Example 2: Expression of Recombinant Ckβ-8 in COS Cells

플라즈미드 CMV-Ckβ-8 HA의 발현은 앰피실린 내성 유전자와 CMV 프로모터에 이어 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 위치를 함유하는 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐)로부터 유도하였다. 절두형 Ckβ-8 서열을 암호화하는 DNA 단편과 HA 태크는 3' 단부의 프레임 내에서 융합하여 상기 벡터의 폴리링커 영역내에 클로닝하였으며; 따라서, 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터 하에서 유도하였다. HA 태그는 문헌[참조: I. Wilsin 등, Cell 37: 767 (1984)]에 이미 기술되어 있는 바와 같이 인풀루엔자 해마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하였다. 표적 단백질에 대한 HA 태그의 도입은 HA 에피토프를 인식하는 항체와 재조합 단백질과의 용이한 검출을 가능하게 하였다.Expression of plasmid CMV-Ckβ-8 HA was derived from the vector pcDNAI / Amp (Invitrogen) containing the ampicillin resistance gene and the CMV promoter, followed by the polylinker region, SV40 intron and polyadenylation site. DNA fragments encoding the truncated Ckβ-8 sequence and HA tag were fused in the frame at the 3 'end and cloned into the polylinker region of the vector; Thus, recombinant protein expression was induced under the CMV promoter. HA tags corresponded to epitopes derived from influenza haemagglutinin protein as already described in I. Wilsin et al., Cell 37: 767 (1984). The introduction of an HA tag to the target protein allowed easy detection of recombinant proteins with antibodies recognizing HA epitopes.

재조합 단형 Ckβ-8의 발현을 위해, COS 세포는 DEAE-덱스트란법에 의해 발현 벡터를 이용하여 형질감염시켰다[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratiry Press (1989)]. 세포는, 형질감염을 수행하고 2일 후에, 35S-시스테인을 이용하여 8 시간 동안 표지하였다. 이어서, 배양 배지를 수집하고, 세포는 세정제(RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM 트리스, pH 7.5)를 이용하여 용균시켰다[참조: Wilson, I.등, ID. 1984, 37: 767]. 세포 용해물과 배양 배지 둘 다는 HA 특이성 단일클론 항체를 이용하여 침전시켰다. 침전된 단백질은 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다.For expression of recombinant monoclonal Ckβ-8, COS cells were transfected with an expression vector by DEAE-dextran method (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratiry Press (1989). Cells were labeled for 8 hours with 35S-cysteine two days after transfection. The culture medium was then collected and cells were lysed using a washing agent (RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris, pH 7.5). Wilson, I., et al., ID. 1984, 37: 767. Both cell lysates and culture media were precipitated using HA specific monoclonal antibodies The precipitated proteins were analyzed on a 15% SDS-PAGE gel. .

실시예 3: 바쿨로비루스 발현 시스템을 이용하는 단형 케모킨 Ckβ-8의 발현 및 정제Example 3 Expression and Purification of Monotype Chemokine Ckβ-8 Using Baculovirus Expression System

SF9 세포는 Ckβ-8 cDNA를 발현하기 위해 고안된 재조합 바쿨로비루스로 감염시켰다. 세포는 10 ℓ 배양물 내에서 MOI 2로 감염시켰으며, 28℃ 및 저 혈청 조건하에서 72 내지 96 시간 동안 배양하였다. 감염된 배양물로부터 취한 세포 파편은 저속 원심분리로 제거하였다. 프로테아제 억제제 혼합용액(1 ㎍/㎖ 루펩틴, 1 ㎍/㎖ E-64 및 1 mM EDTA)은 최종 농도를 20 ㎍/㎖로하여 상청액에 첨가하였다. 이들 특정 배양 조건(예를 들어, 저 혈청)은 Ckβ-8 폴리펩티드의 몇몇 NH₂-말단 절단된 형태를 생성하였다. 상청액내 상기 Ckβ-8의 수준은 15% SDS-PAGE 겔 상에 상청액 20-30 ㎕를 적용하여 검색하였다. 단형 Ckβ-8는 식별할 수 있는 밴드로 검출되었으며, 이는 1 ℓ 당 수 mg의 발현 수준과 상응하였다. 절단된 Ckβ-8는 3단계 정제 과정을 통해 더 정제하였다: 1) 헤파린 결합 친환성 크로마토그래피. 바쿨로비루스 배양물의 상청액은 100 mM HEPES/MEM/NaOAc를 함유하는 완충액(pH 6) 1/3 부피와 혼합하고, 0.22 ㎛ 막을 통해 여과하였다. 이어서, 상기 샘플은 헤파린 결합 칼럼에 적용하였다(HE1 포로스 20, 바이오-퍼셉티브 시스템 인코오포레이티드). 단형 Ckβ-8은 pH 6의 50 mM HEPES/MES/NaOac 내에서 50 내지 500 mM의 선형 구배의 약 300 mM NaCl에서 용출되었다; 2) 양이온 교환 크로마토그래피. 헤파린 크로마토그래피로 수득한 단백질은 pH 6의 50 mM HEPES/MES/NaOAc를 함유하는 완충액을 이용하여 5배 희석하였다. 이어서, 생성된 혼합물은 양이온 교환 칼럼(S/M 포로스 20, 바이오-퍼셉티브 시스템 인코오포레이티드)에 적용하였다. 절두형 Ckβ-8은 pH 6의 50 mM HEPES/MES/NaOac 내에서 25 내지 300 mM의 선형 구배의 250 mM NaCl에서 용출되었다; 3) 크기 배제 크로마토그래피. 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한후, 절두형 Ckβ-8은 크기 배제 칼럼(HW50, TOSO HAAS, 1.4 x 45 cm)에 적용하여 더 정제하였다. 정제된 샘플의 아미노산 서열 결정은 상기 단백질의 4개의 절단된 형태(서열 번호 1, 2, 3 및 4)에 상응하는 4개 이상의 주 서열의 혼합물로 나타냈다.SF9 cells were infected with recombinant baculoviruses designed to express Ckβ-8 cDNA. Cells were infected with MOI 2 in 10 L cultures and incubated for 72-96 hours at 28 ° C. and low serum conditions. Cell debris taken from the infected culture was removed by low speed centrifugation. A protease inhibitor mixed solution (1 μg / ml lupetin, 1 μg / ml E-64 and 1 mM EDTA) was added to the supernatant at a final concentration of 20 μg / ml. These specific culture conditions (eg low serum) resulted in several NH ₂ -terminal truncated forms of the Ckβ-8 polypeptide. The level of Ckβ-8 in the supernatant was retrieved by applying 20-30 μl of the supernatant on a 15% SDS-PAGE gel. Monotype Ckβ-8 was detected as an identifiable band, corresponding to expression levels of several mgs per liter. The cleaved Ckβ-8 was further purified through a three step purification process: 1) Heparin binding affinity chromatography. The supernatant of Baculovirus culture was mixed with 1/3 volume of buffer (pH 6) containing 100 mM HEPES / MEM / NaOAc and filtered through a 0.22 μm membrane. The sample was then subjected to a heparin binding column (HE1 Poros 20, Bio-Perceptive System Incorporated). Mono Ckβ-8 eluted in a linear gradient of 50-500 mM in about 300 mM NaCl in 50 mM HEPES / MES / NaOac at pH 6; 2) Cation Exchange Chromatography. Proteins obtained by heparin chromatography were diluted 5-fold using a buffer containing 50 mM HEPES / MES / NaOAc at pH 6. The resulting mixture was then subjected to a cation exchange column (S / M Poros 20, Bio-Perceptive System Incorporated). The truncated Ckβ-8 eluted in a linear gradient of 25 mM to 300 mM in 250 mM NaCl in 50 mM HEPES / MES / NaOac at pH 6; 3) size exclusion chromatography. After performing cation exchange chromatography, truncated Ckβ-8 was further purified by application to a size exclusion column (HW50, TOSO HAAS, 1.4 × 45 cm). Amino acid sequencing of the purified samples was represented by a mixture of four or more major sequences corresponding to four truncated forms of the protein (SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4).

실시예 4: 단형 Ckβ-8를 포함하는 혼합물을 이용하는 EOL-3 세포 및 PBL의 자극Example 4: Stimulation of POL and EOL-3 Cells Using a Mixture Containing Monotype Ckβ-8

EOL-3 세포는 표준 성장 조건하에서 성장시키고, 1 μM 부티르산나트륨을 이용하여 2주 동안 분화시켰다. PBL(말초 혈액 임파구)은 정맥 천자(穿刺)에 의해 인간 공여체로부터 획득하였다. 양(兩)세포 조제물에 FURA-2(1μM)를 45분 동안 각각 적용하였다. 세포 1 x 106/㎖(총 2 ㎖)는 플라스틱 큐벳으로 이전하였다. 단형 Ckβ-8(871a, 871b, 871c, 871RP) 또는 장형 Ckβ-8(889)를 0.33 내지 33 nM의 농도로 첨가하기 전에 형광 분광광도계는 기준선으로 조정하였다. 형광의 증가는 분광광도계로 검색하였다. 세포 내에 유리 Ca⁺⁺의 변화는 초과 Ca⁺⁺의 존재 하에서 트리톤 x100을 이용하여 세포를 용해시키고, 이어서 5 mM EGTA를 첨가하여 에프민(Fmin)을 수득하였다. 유리 Ca⁺⁺의 비는 최소값과 최대값으로 계산하였다. MCP-1(단핵구 화주성 단백질-1)은 공지된 케모킨이며, 양성 대조용으로 사용하였다.EOL-3 cells were grown under standard growth conditions and differentiated for 2 weeks with 1 μM sodium butyrate. PBL (Peripheral Blood Lymphocytes) was obtained from human donors by venipuncture. FURA-2 (1 μM) was applied to sheep cell preparations for 45 minutes each. Cells 1 × 10 6 / mL (2 mL total) were transferred to plastic cuvettes. The fluorescence spectrophotometer was adjusted to baseline before adding short Ckβ-8 (871a, 871b, 871c, 871RP) or long Ckβ-8 (889) at a concentration of 0.33 to 33 nM. The increase in fluorescence was detected by spectrophotometer. Changes in free Ca ⁺⁺ within the cells were lysed with Triton x100 in the presence of excess Ca ⁺⁺ followed by addition of 5 mM EGTA to give Fmin. The ratio of free Ca ⁺⁺ was calculated from the minimum and maximum values. MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1) is a known chemokine and used as a positive control.

서열목록Sequence Listing

(1) 일반정보:(1) General Information:

(i) 출원인: 존 화이트, 에드웨드 아펠바움, 다니엘 오'샤네시,(i) Applicants: John White, Edward Apelbaum, Daniel O'Shane's,

제임스 알란 폰월드 및 케빈 오'도넬James Alan Ponworld vs Kevin O'Donnell

(ii) 발명의 명칭: 단형 케모킨 베타-8(ii) Name of the Invention: Short Chemokine Beta-8

(iii) 서열의 수: 6(iii) number of sequences: 6

(iv) 서신 주소:(iv) Letter Address:

(A) 수신인:(A) To:

(b) 거리: 스웨들랜드 로드 706(b) Street: Suedland Road 706

(C) 도시: 킹 오브 프러시아(C) City: King of Prussia

(D) 주: 펜실베니아(D) State: Pennsylvania

(E) 국가: 미국(E) Country: United States

(F) 우편번호: 19406(F) Zip code: 19406

(v) 컴퓨터 판독 형태:(v) computer readable form:

(A) 매체 유형: 3.5" 디스켓, 용량 1.44 Mb(A) Media type: 3.5 "diskette, capacity 1.44 Mb

(B) 컴퓨터: IBM 486(B) Computer: IBM 486

(C) 운영 체계: 워크그룹용 윈도우즈(C) Operating System: Windows for Workgroups

(D) 소프트웨어: 워드퍼펙 5.1(D) Software: WordPerfect 5.1

(vi) 현 출원 자료(vi) current application data

(A) 출원 번호:(A) Application number:

(B) 출원인:(B) Applicant:

(C) 분류:(C) Classification:

(vii) 전 출원 자료:(vii) Former application data:

(A) 출원 번호:(A) Application number:

(B) 출원일:(B) filing date:

(viii) 대리인 정보:(viii) Agent Information:

(A) 성명: 윌리엄 티. 한(A) Statement: William T. One

(B) 등록 번호: 34,344(B) registration number: 34,344

(C) 참조 번호: P50381(C) Reference Number: P50381

(ix) 통신 정보:(ix) Communications Information:

(A) 전화: (610) 270-5219(A) Phone: (610) 270-5219

(B) 팩스: (610) 270-5090(B) Fax: (610) 270-5090

(2) 서열 번호 1에 대한 정보:(2) information for SEQ ID NO:

(i) 서열 특성:(i) sequence properties:

(A) 길이: 82(A) Length: 82

(B) 유형: 아미노산(B) Type: Amino Acid

(D) 형태: 직쇄상(D) mode: linear

(xi) 서열 번호 1:(xi) SEQ ID NO 1:

(2) 서열 번호 2에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특성:(i) sequence properties:

(A) 길이: 77(A) Length: 77

(B) 유형: 아미노산(B) Type: Amino Acid

(D) 형태: 직쇄상(D) mode: linear

(xi) 서열 번호 2:(xi) SEQ ID NO: 2:

(2) 서열 번호 3에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특성:(i) sequence properties:

(A) 길이: 76(A) Length: 76

(B) 유형: 아미노산(B) Type: Amino Acid

(D) 형태: 직쇄상(D) mode: linear

(xi) 서열 번호 3:(xi) SEQ ID NO: 3:

(2) 서열 번호 4에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특성:(i) sequence properties:

(A) 길이: 75(A) Length: 75

(B) 유형: 아미노산(B) Type: Amino Acid

(D) 형태: 직쇄상(D) mode: linear

(xi) 서열 번호 4:(xi) SEQ ID NO 4:

(2) 서열 번호 5에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특성:(i) sequence properties:

(A) 길이: 26(A) Length: 26

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 쇄의 수: 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태: 직쇄상(D) mode: linear

(iv) 앤티센스: 아니오(iv) Antisense: No

(xi) 서열 번호 5:(xi) SEQ ID NO: 5:

(2) 서열 번호 6에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특성:(i) sequence properties:

(A) 길이: 26(A) Length: 26

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 쇄의 수: 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태: 직쇄상(D) mode: linear

(iv) 앤티센스: 아니오(iv) Antisense: No

(xi) 서열 번호 6:(xi) SEQ ID NO 6:

Claims (15)

서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드.A polypeptide comprising SEQ ID NO: 1. 서열 번호 2를 포함하는 폴리펩티드.A polypeptide comprising SEQ ID NO: 2. 서열 번호 3을 포함하는 폴리펩티드.A polypeptide comprising SEQ ID NO: 3. 서열 번호 4를 포함하는 폴리펩티드.A polypeptide comprising SEQ ID NO: 4. 제 1 항 내지 제 4 항의 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 조성물.A composition comprising a mixture of the polypeptides of claims 1-4. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 벡터.A vector comprising the polypeptide of any one of claims 1-4. 제 6 항의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포.A host cell genetically engineered using the vector of claim 6. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제조하는 방법.The polypeptide of any one of claims 1 to 4 comprising expressing the polypeptide from a genetically engineered host cell using a vector comprising the polynucleotide encoding the polypeptide of any one of claims 1 to 4. How to manufacture. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드에 대한 작용물질.An agonist against the polypeptide of any one of claims 1 to 4. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드에 대한 길항물질.An antagonist to the polypeptide of any one of claims 1 to 4. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ckβ-8을 필요로하는 환자를 치료하는 방법.A method of treating a patient in need of Ckβ-8 comprising administering to the patient an effective amount of the polypeptide of any one of claims 1-4. 제 5 항의 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ckβ-8을 필요로하는 환자의 치료 방법.A method of treating a patient in need of Ckβ-8 comprising administering to the patient an effective amount of the composition of claim 5. 제 10 항의 길항물질의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ckβ-8의 억제를 필요로하는 환자의 치료 방법.A method of treating a patient in need of inhibition of Ckβ-8 comprising administering to the patient an effective amount of the antagonist of claim 10. 선택된 테스트 세포, 선별하려는 화합물 및 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드를 배합하는 단계; 및 상기 화합물이 상기 테스트 세포의 반응에 기초한 유효한 작용물질 또는 길항물질인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드의 길항물질 및 작용물질을 동정하는 방법.Combining the selected test cell, the compound to be selected and the polypeptide of any one of claims 1 to 4; And determining whether the compound is an effective agonist or antagonist based on the response of the test cell. 6. The method of identifying an antagonist and agonist of a polypeptide of claim 1. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 내에 돌연변이가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 폴리펩티드의 미달발현에 관련된 질병 또는 이 질병에 대한 민감성을 진단하는 방법.A disease related to or under-expression of a polypeptide of any one of claims 1 to 4 comprising determining whether a mutation is present in the nucleic acid sequence encoding the polypeptide of any one of claims 1 to 4. How to diagnose sensitivity to.