JPH10513355A - Human chemokine β-11 and human chemokine α-1 - Google Patents
Human chemokine β-11 and human chemokine α-1Info
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Abstract
(57)【要約】 ヒトケモカインポリペプチド、およびそのようなケモカインポリペプチドをコードするDNA(RNA)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を開示する。そのようなケモカインポリペプチドを、白血病、腫瘍、慢性感染、自己免疫疾患、線維症障害、創傷治癒および乾癬の処置に利用する方法もまた開示する。そのようなケモカインポリペプチドに対するアンタゴニスト、および慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、および慢性並びに急性の炎症性並びに感染症、アレルギー反応、プロスタグランジンとは無関係の発熱、骨髄不全を処置するための治療法としての、それらの使用もまた開示する。核酸配列における変異、およびポリペプチドの濃度変化に関係がある疾患を検出するための診断アッセイもまた開示する。ケモカインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおける変異を検出するための、および宿主におけるポリペプチドのレベル変化を検出するための診断アッセイもまた開示する。 (57) [Summary] Disclosed are human chemokine polypeptides, and DNA (RNA) encoding such chemokine polypeptides, and methods for producing such polypeptides by recombinant techniques. Also disclosed are methods of utilizing such chemokine polypeptides for the treatment of leukemia, tumors, chronic infections, autoimmune diseases, fibrotic disorders, wound healing and psoriasis. Antagonists to such chemokine polypeptides and methods of treating rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, and chronic and acute inflammatory and infectious diseases, allergic reactions, prostaglandin independent fever, bone marrow failure Also disclosed are their uses. Also disclosed are diagnostic assays for detecting mutations in nucleic acid sequences and diseases associated with altered concentrations of the polypeptide. Also disclosed are diagnostic assays for detecting mutations in a polynucleotide encoding a chemokine polypeptide and for detecting altered levels of the polypeptide in a host.
Description
【発明の詳細な説明】 ヒトケモカインβ−11およびヒトケモカインα−1 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの 製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下でヒトケモカ インβ−11(Ckβ−11)およびヒトケモカインα−1(Ckα−1)と呼ぶ、ヒ トケモカインポリペプチドである。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作 用を阻害することにも関する。 インタークリン(intercrine)サイトカインとも呼ばれるケモカインは、構造上 および機能上関係のあるサイトカインのサブファミリーである。これらの分子は 、大きさが8−10kdである。一般に、ケモカインは、アミノ酸レベルで20〜 75%の相同性を示し、また2つのジスルフィド結合を形成する、4つの保存さ れたシステイン残基により特徴付けられる。最初の2つのシステイン残基の配置 に基づいて、ケモカインは、2つのサブファミリー、αおよびβに分類されてい る。αサブファミリーでは、最初の2つのシステインが1つのアミノ酸により分 けられていることから、「C−X−C」サブファミリーと呼ばれる。βサブファ ミリーでは、2つのシステインが隣接した位置にあることから、「C−C」サブ ファミリーと呼ばれる。これまで、このファミリーの少なくとも8つの異なった メンバーがヒトにおいて同定されている。 インタークリンサイトカインは、広範囲にわたる様々な機能を示す。特質的な (hallmark)特徴は、単球、好中球、Tリンパ球、好塩基球、および線維芽細胞を 含め、別の細胞種の走化性移動を誘引する、それらの能力である。多くのサイト カインは、前炎症活性を有しており、また炎症性反応の間の多数の過程に関与す る。これらの活性には、ヒスタミン放出、リソソーム酵素並びにロイコトリエン 放出の刺激、標的免疫細胞の内皮細胞への付着の増加、補体タンパク質の結合の 向上、顆粒球付着分子並びに補体受容体の発現の誘発、およびレスピラトリーバ ーストが含まれる。炎症におけるそれらの関与に加えて、あるケモカインは他の 活性を示すことが示されている。例えば、マクロファージ炎症性タンパク質1( MIP−1)は造血幹細胞の増殖を抑制することができ、血小板因子(PF−4) は内皮細胞増殖の有効な阻害剤であり、インターロイキン−3(IL−8)はケラ チノサイトの増殖を促進し、またGROはメラノーマ細胞に対するオートクリン 増殖因子である。 様々な生物学的活性から考えて、ケモカインが、リンパ球のトラフィッキング (trafficking)、創傷治癒、造血調節、およびアレルギー、喘息、並びに関節炎 といったような免疫学的障害を含め、多くの生理学的状態および疾患状態に関係 していることは驚くべきことではない。 「C−C」分枝のメンバーは、それらの効果を次の細胞に対して発揮する:寄 生生物を死滅させて、寄生生物感染を減少させ、また呼吸器系の気道における慢 性炎症を引き起こす好酸球;脊椎動物における腫瘍形成を抑制するマクロファー ジ;およびアレルギー性炎症における役割を担うヒスタミンを放出する好塩基球 。しかし、1つの分枝のメンバーは、普通、他の分岐のケモカインに応答する細 胞に対して効果を発揮し得ることから、その分岐のメンバーに正確な役割を結び 付けることはできない。 C−C分枝のメンバーは主に単核細胞に対して作用し、またC−X−C分枝の メンバーは主に好中球に対して作用するが、別の化学誘引物質の特性は、このガ イドラインに基づいてケモカインに属し得ない。あるファミリーに由来する幾つ かのケモカインは、他の特色を示す。 本発明のポリペプチドは、保存されたシステイン残基を有する、つまり、Ck β−11は「C−C」を有し、Ckα−1は「C−X−C」領域を有し、またそ れらは、既知のケモカインに対して高いアミノ酸配列の相同性を有することから 、ヒトケモカインとして推定的に特徴付けられている。 本発明の一態様により、ヒトCkβ−11およびCkα−1である新規ポリペプ チド、さらにはまた、生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そ のフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。 本発明の別の態様により、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含め、 そのようなポリペプチドをコードする、単離された核酸分子、さらにはまた、生 物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメント、アナロ グおよび誘導体を提供する。 本発明の別の態様により、Ckβ−11およびCkα−1配列へ特異的にハイブ リダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブを提供する。 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドを組換え技術によ り製造する方法であって、当該タンパク質の発現、およびその後の当該タンパク 質の回収を促進する条件下、Ckβ−11またはCkα−1核酸配列を含む組換え 原核および/または真核宿主細胞を培養することを含んでなる方法を提供する。 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、固体(s olid)腫瘍、慢性感染、白血病、T細胞により媒介される自己免疫疾患、寄生生 物感染、乾癬、喘息、アレルギーを処置するために、造血を調節するために、増 殖因子活性を刺激するために、脈管形成を阻害するために、また創傷治癒を促進 するために利用する方法を提供する。 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提 供する。 本発明のまた別の態様により、例えば、ある自己免疫疾患、アテローム性動脈 硬化症、慢性炎症並びに感染症、ヒスタミン並びにIgEにより媒介されるアレ ルギー反応、プロスタグランジンとは無関係の発熱、骨髄不全、癌、珪肺症、サ ルコイドーシス、慢性関節リウマチ、ショック、過エオシン好性症候群、および 喘息の肺における線維症の処置において、そのようなポリペプチドの作用を阻害 するために使用することができる、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニ ストを提供する。 本発明の別の態様により、Ckβ−11またはCkα−1核酸配列、およびその ような核酸配列によりコードされるタンパク質における変異に関係がある疾患、 または疾患に対する感受性を診断する方法を提供する。 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNAの合成、 およびDNAベクターの製造に関係があるインビトロにおける目的に利用する方 法を提供する。 本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明ら かであろう。 次の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含さ れる本発明の範囲を限定しようとするものではない。 第1図は、Ckβ−11のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す 。最初の17個のアミノ酸はリーダー配列を示すことから、推定される成熟ポリ ペプチドは81個のアミノ酸を含んでなる。アミノ酸に関する標準的な1文字略 号を使用する。配列決定は、373 自動化DNAシークエンサー(Applied Bi osystems,Inc.)を使用して行った。配列決定の正確さは、97%以上正確であ ると予想される。 第2図は、Ckα−1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。 最初の22個のアミノ酸はリーダー配列を示すことから、推定される成熟ポリペ プチドは87個のアミノ酸を含んでなる。アミノ酸に関する標準的な1文字略号 を使用する。 第3図は、Ckβ−11(上段)とラットRANTESポリペプチド(下段)との 間のアミノ酸配列の相同性を示す。 第4図は、Ckα−1とOvis Ariesインターロイキン−8(下段)との間のア ミノ酸配列の相同性を示す。 本発明の一態様により、第1図(配列番号2)および第2図(配列番号4)の推定 アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または1994年11月11日にAT CC寄託番号第75948号(Ckβ−11)および同第75947号(Ckα−1) として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコ ードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。 Ckβ−11をコードするポリヌクレオチドは、多数のヒト成人および胎児cD NAライブラリー、例えば、ヒト胎児脾臓cDNAライブラリーから単離するこ とができる。Ckβ−11は、C−C分枝のケモカインのメンバーである。それ は、98個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレ ームを含み、このうち、最初の約17個のアミノ酸残基は推定されるリーダー配 列であることから、成熟タンパク質は81個のアミノ酸を含んでなる。そのタン パク質は、ラットRANTESポリペプチドに対し、89個のアミノ酸範囲にわ たり、31%の同一性および47%の類似性をもって、最も高い程度の相同性を 示す。ケモカインにおける4つの空間的に保存されたシステイン残基が、そのポ リペプチドにおいて見い出されることもまた重要である。 Ckα−1をコードするポリヌクレオチドは、多数のヒト成人および胎児cDN Aライブラリー、例えば、ヒト扁桃腺cDNAライブラリーから単離することが できる。Ckα−1は、C−X−C分枝のケモカインのメンバーである。それは 、109個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレ ームを含み、このうち、最初の約22個のアミノ酸残基は推定されるリーダー配 列であることから、成熟タンパク質は87個のアミノ酸を含んでなる。そのタン パク質は、ヒツジ(Ovis Aries)由来のインターロイキン−8に対し、97個の アミノ酸範囲にわたり、31%の同一性および80%の類似性をもって、最も高 い程度の相同性を示す。ケモカインにおける4つの空間的に保存されたシステイ ン残基が、そのポリペプチドにおいて見い出されることもまた重要である。 本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形で、またはDNAの形であり得、こ のDNAには、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAが含まれる。該DN Aは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非 コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配 列は、第1図(配列番号1)および第2図(配列番号3)に示すコード配列もしくは 寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、または遺伝コードの重複 または縮重の結果として、第1図(配列番号1)および第2図(配列番号3)のDN Aもしくは寄託されたcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコ ード配列であってもよい。 第1図(配列番号2)および第2図(配列番号4)の成熟ポリペプチドまたは寄託 されたcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドには、以下のものが含まれ得る:成熟ポリペプチドのコード配列のみ;成熟 ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパ ク質配列といったような付加的コード配列;成熟ポリペプチドのコード配列(ま た場合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイ ントロンまたは非コード配列5'および/または3'といったような非コード配列 。 従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリ ペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的 コードおよび/または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、第1図(配列番号2)および第2図(配列番号4)の推定アミノ 酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcDNAによりコード されるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記 のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌク レオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在 しない変異体であり得る。 従って、本発明には、第1図(配列番号2)および第2図(配列番号4)に示すの と同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcDNAによりコードされ る同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのよ うなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第1図(配列番号 2)および第2図(配列番号4)のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcDN Aによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコ ードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体、およ び付加または挿入変異体が含まれる。 先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第1図(配列番号1)および第2図 (配列番号3)に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託された クローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得 る。当業界で知られているように、アレル変異体は、1つまたはそれ以上のヌク レオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であ り、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。 本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプ チドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリ ペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ 読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリ ペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型のポ リペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドは また、付加的5'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質も コードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また 不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タンパク 質が残る。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ 配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方 を有するタンパク質をコードし得る。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とする マーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そ のマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するため の、pQE−9ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であって よく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、COS−7細胞を使用する場合 には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(HA)タグであってよい。HAタグは 、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトーブに対応する( Wilson,I.ら、Cell、37:767(1984))。 本発明はさらに、配列間に少なくとも50%、また好ましくは70%の同一性 がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本 発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイ ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ ント条件」という用語は、配列間に少なくとも95%、また好ましくは少なくと も97%の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろう ことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズ するポリヌクレオチドは、第1図(配列番号1)および第2図(配列番号3)のcD NAまたは寄託されたcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物 学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチドをコードする。 本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダ ペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への 便宜として与えられるものであって、寄託が35 U.S.C.§112下に要求 されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオ チドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配 列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾す る際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売す るには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与され ない。 本発明はさらに、第1図(配列番号2)および第2図(配列番号4)の推定アミノ 酸配列を有する、または寄託されたcDNAによりコードされるアミノ酸配列を 有するポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、 アナログおよび誘導体に関する。 第1図(配列番号2)および第2図(配列番号4)のポリペプチドまたは寄託され たcDNAによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「 誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に 同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、アナ ログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポ リペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成 ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。 第1図(配列番号2)および第2図(配列番号4)のポリペプチドまたは寄託され たcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナ ログは、(i)1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸 残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換ア ミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコード されたものでなくてもよいもの、(ii)1つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置 換基が含まれるもの、または(iii)成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半 減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合 物と融合しているもの、または(iv)リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポ リペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような 、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのよう なフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲 内であると思われる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供される のが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。 「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存 在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きて いる動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離され ていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同 じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌク レオチドはベクターの部分となり得、および/またはそのようなポリヌクレオチ ドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは 組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベク ターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術 による製造にも関する。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本 発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランス フォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラ スミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プ ロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはCkβ−11ま たはCkα−1遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培 養することができる。温度、pH等といったような培養条件は、発現用に選択さ れた宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。 本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用 することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発 現するための様々な発現ベクターのいずれか1つに含ませることができる。その ようなベクターには、染色体、非染色体および合成DNA配列、例えば、SV4 0の誘導体;細菌プラスミド;ファージDNA;バキュロウイルス;酵母プラス ミド;プラスミドとファージDNAとの組合せから得られるベクター;ワクシニ ア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスDNA が含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であっ て、生存可能である限り、使用することができる。 適当なDNA配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般 には、DNA配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部 位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思わ れる。 発現ベクターのDNA配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能 に結合し、mRNA合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、 以下のものが挙げられる:LTRまたはSV40プロモーター、E.coli. lacま たはtrp、ファージラムダPLプロモーター、および原核もしくは真核細胞または それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモー ター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終 結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。 さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダク ターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはE.coliではテトラサイ クリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細 胞の選択のための表現型特性を与えるために、1つまたはそれ以上の選択可能な マーカー遺伝子を含むのが好ましい。 上記のような適当なDNA配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制 御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、 その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。 適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる:E.coli、Streptomyc es 、Salmonella typhimuriumといったような細菌細胞;酵母のような真菌細胞 ;Drosophila S2およびSpodoptera Sf9といったような昆虫細胞:CHO 、COSまたはBowesメラノーマといったような動物細胞;アデノウイルス;植 物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると 思われる。 とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を1つまたはそれ以上含ん でなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向 で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクター を含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、 該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当 なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている 。次のベクターを例として挙げる。細菌用: pQE70、pQE60、pQE−9( Qiagen)、pBS、pD10、ファージスクリプト(phagescript)、psiX174、 pBluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH 46A(Stratagene);pTRC99a、pKK223−3、pKK233−3、pD R540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物用: pWLNEO、pSV2CAT 、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、p SVL(Pharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それ らが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。 プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝 子から選択することができる。2つの適当なベクターは、PKK232−8およ びPCM7である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacI、lacZ、 T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには 、CMV即時初期(immediate early)、HSVチミジンキナーゼ、初期および後 期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスのメタロチオネイン− Iが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレ ベルの範囲内である。 さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿 主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞 であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物 の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デ キストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行う ことができる。(Davis,L.、Dibner,M.、Battey,L.、Basic Methods in Molecular Biology(1986))。 宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる 遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、 従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。 成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌 、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発 明のDNA構築物から得られるRNAを用いて製造するために、無細胞翻訳系も また使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ ングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laborato ry Manual,第2版、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、(1989)によ り記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、エン ハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロ モーターに作用してその転写を増加させる、通常、約10〜300bpの、DNA のシス作用性要素である。例には、bp 100〜270の、複製開始点の後期側 にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル スエンハンサーが含まれる。 通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォ ーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、E.coliのアンピシリ ン耐性遺伝子並びにS.cerevisiae TRP1遺伝子、および下流の構造配列の転 写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、3−ホスホグリセリン酸キ ナーゼ(PGK)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱シ ョックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構 造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の 細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共 に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所 望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与え るN−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。 細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構 造DNA配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモー ターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。その ベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主 内での増幅を与えるために、1つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカー および複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原 核宿主には、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、および Pseudomonas属、Streptomyces属、並びにStaphylococcus属の範囲内の様々な 種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。 代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは 、周知のクローニングベクター pBR322(ATCC37017)の遺伝要素を 含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複 製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pKK2 23−3(Pharmacia Fine Chemicals、Uppsala、スウェーデン)およびpGE M1(Promega Biotec、Madison、WI、米国)が含まれる。これらのpBR3 22「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わ せる。 適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度 まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフト または化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。 細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により 破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。 タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理 、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊 でき、そのような方法は、当業者に周知である。 組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用 することができる。哺乳動物発現系の例には、Gluzman、Cell、23:175 (1981)により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のCOS−7系、お よび適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、C12 7、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベク ターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの 必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアク セプター部位、転写終結配列、および5'に隣接する非転写配列もまた含んでな るであろう。SV40のスプライシングから得られるDNA配列、およびポリア デニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。 該ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオ ンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ ー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、 ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィ ーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができ る。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成 するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(HP LC)を最終精製工程に使用することができる。 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物 であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵 母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造するこ とができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、 グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチ ドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒト疾患に対する処置およ び診断の発見のための研究試薬および物質として使用することができる。 ヒトケモカインポリペプチドは、癌の化学療法の間の、また白血病に対する補 助的保護処置として、骨髄幹細胞のコロニー形成を阻害するために使用すること ができる。 該ヒトケモカインポリペプチドはまた、ケラチノサイトの過増殖により特徴付 けられる乾癬の処置として、表皮ケラチノサイト増殖を阻害するために使用する こともできる。 該ヒトケモカインポリペプチドはまた、宿主防御細胞、例えば、細胞障害性T 細胞およびマクロファージの侵入および活性化を刺激することにより、また腫瘍 の脈管形成を阻害することにより、固形腫瘍を処置するために使用することもで きる。それらはまた、耐性の慢性および急性感染、例えば、殺菌性白血球の誘引 および活性化によるミコバクテリア感染に対する宿主防御を高めるために使用す ることもできる。 該ヒトケモカインポリペプチドはまた、T細胞により媒介される自己免疫疾患 およびリンパ性白血病の処置のためのIL−2生合成の阻害により、T細胞増殖 を阻害するために使用することもできる。 Ckβ−11およびCkα−1はまた、デブリ(debris)をクリアリングする、ま た結合組織を促進する炎症性細胞の漸増によって、また過剰のTGFβにより媒 介される線維症の制御によっても、創傷治癒を刺激するために使用することもで きる。これと同じ方法で、Ckβ−11およびCkα−1をまた、肝硬変、変形性 関節症および肺線維症が含まれる、他の線維症障害を処置するために使用するこ ともできる。 該ヒトケモカインポリペプチドはまた、住血吸虫症、旋毛虫症および回虫症で のように、組織に侵入する寄生生物の幼虫を殺すという、特徴のある機能を有す る好酸球の存在も増加させる。 それらはまた、様々な造血始原細胞の活性化および分化を調節することにより 、造血を調節するために、例えば、化学療法後に成熟白血球を骨髄から放出させ る ために使用することもできる。 該ポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドによりコードされる ポリペプチドはまた、科学的研究、DNAの合成、およびDNAベクターの製造 に関係があるインビトロにおける目的に、またヒト疾患の処置に対する治療およ び診断を設計するために利用することもできる。 完全な長さのCkβ−11またはCkα−1遺伝子のフラグメントは、完全な長 さの遺伝子を単離するために、また該遺伝子に対する高い配列類似性、または類 似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cDNAライブラリー に対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。この種 類のプローブは、通例、少なくとも20塩基を有する。好ましくは、しかし、該 プローブは、少なくとも塩基を有しており、また通例、50塩基を越えないが、 それらは、より多数の塩基を有していてもよい。該プローブはまた、完全な長さ の転写物、およびゲノムクローン、または調節並びにプロモーター領域、エキソ ン、およびイントロンが含まれる、完全な遺伝子を含むクローンに対応するcD NAクローンを同定するのに使用することもできる。スクリーニングの例は、既 知のDNA配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、 遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補 的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトのcDNA、ゲノムDNA またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするために使用して、ライブラ リーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。 本発明はまた、Ckβ−11またはCkα−1核酸配列における変異の存在に関 係がある疾患、または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部 としての、Ckβ−11またはCkα−1遺伝子の使用にも関する。そのような疾 患、例えば、腫瘍および癌は、ヒトケモカインポリペプチドの発現不足に関係が ある。 Ckβ−11またはCkα−1遺伝子において変異が起こっている個体は、様々 な技術により、DNAレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の 細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることがで きる。ゲノムDNAは、検出のために直接使用することができ、または分析前に PCR(Saikiら、Nature、324:163−166(1986))を利用する ことにより、酵素的に増幅することができる。RNAまたはcDNAもまた、同 じ目的に使用することができる。例としては、Ckβ−11またはCkα−1をコ ードする核酸に相捕的なPCRプライマーを使用して、Ckβ−11またはCkα −1変異を同定して分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常な 遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検出することができ る。点変異は、増幅されたDNAが、放射能標識化Ckβ−11またはCkα−1 のRNA、あるいはまた、放射能標識化Ckβ−11またはCkα−1のアンチセ ンスDNA配列にハイブリダイズすることにより同定することができる。完全に 対合している配列は、RNアーゼA消化により、または融解温度の相違により、 対合していない複式物(duplexes)と区別することができる。 DNA配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲル でのDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げる ことができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視 覚化することができる。DNAフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジング ラジエントゲルを変性することで区別することができ、ここでは、様々なDNA フラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により 、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、Myersら、Science、230 :1242(1985)を参照)。 特定の位置での配列変化もまた、RNアーゼおよびS1保護といったようなヌ クレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、 Cottonら、PNAS、USA、85:4397−4401(1985))。 従って、特異的なDNA配列の検出は、ゲノムDNAのハイブリダイゼーショ ン、RNアーゼ保護、化学切断、直接DNA配列決定、または制限酵素の使用( 例えば、制限酵素断片長多型(RFLP))、およびサザンブロッティングとい ったような方法により成し遂げることができる。 さらに従来的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、in situ 分析により検出することもできる。 本発明はまた、正常な対照の組織試料と比較しての該タンパク質の過剰発現に より、疾患、または疾患に対する感受性、例えば、腫瘍の存在を検出することが できることから、様々な組織におけるCkβ−11またはCkα−1タンパク質レ ベルの変化を検出するための診断アッセイにも関する。宿主から得られた試料中 のCkβ−11またはCkα−1タンパク質レベルを検出するために利用されるア ッセイは当業者に周知であって、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウ ェスタンブロット分析、ELISAアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイ が含まれる。ELISAアッセイ(Coliganら、Current Protocols in Immun ology、1(2)、第6章、(1991))は、まず最初に、Ckβ−11または Ckα−1抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製すること を含んでなる。さらに、リポーター抗体を、そのモノクローナル抗体に対して調 製する。そのリポーター抗体に、放射能、蛍光、または本実施例では、ワサビペ ルオキシダーゼ酵素といったような、検出可能な試薬を結合させる。試料を宿主 から取り除いて、試料中のタンパク質を結合する固形保持体、例えば、ポリスチ レン皿の上でインキュベートする。次いで、BSAのような、非特異的なタンパ ク質と共にインキュベートすることにより、その皿の上の空いているタンパク質 結合部位を全て覆う。次に、モノクローナル抗体を皿においてインキュベートす るが、その間に、そのモノクローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合した全ての Ckβ−11またはCkα−1タンパク質に結合する。結合しなかったモノクロー ナル抗体を全て、緩衝液で洗い流す。ワサビペルオキシダーゼに結合したリポー ター抗体を直ちに皿に置くと、リポーター抗体の、Ckβ−11またはCkα−1 に結合した全てのモノクローナル抗体への結合が起こる。次いで、結合しなかっ たリポーター抗体を洗い流す。次いで、ペルオキシダーゼ基質を皿に加えて、一 定時間に発生した色の量は、標準曲線に対して比較する場合、患者の試料の一定 体積中に存在するCkβ−11またはCkα−1タンパク質の量の測定値である。 競合アッセイを利用することができ、ここでは、Ckβ−11またはCkα−1 に特異的な抗体を固形保持体に結合させて、標識化Ckβ−11またはCkα−1 および宿主から得られた試料を固形保持体上に通過させて、例えば、液体シンチ レーションクロマトグラフィーにより検出される標識の量を、試料中のCkβ− 11またはCkα−1の量に関連づけることができる。 「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに似ている。「サンドイッ チ」アッセイでは、Ckβ−11またはCkα−1を固形保持体上に通過させて、 固形保持体に結合した抗体に結合させる。次いで、第二抗体をCkβ−11また はCkα−1に結合させる。標識化され、また第二抗体に特異的な第三抗体を固 形保持体上に通過させて、第二抗体に結合させた後、量を定量することができる 。 本発明は、ヒトケモカインポリペプチドに対する受容体の同定方法を提供する 。該受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られている多数の方法、例えば、 リガンドパンニングおよびFACS選別により同定することができる(Coligan ら、Current Protocols in Immun.、1(2)、第5章、(1991))。好ま しくは、発現クローニングを使用し、ここでは、ポリアデニル化RNAを該ポリ ペプチドに応答する細胞から調製して、このRNAから作られるcDNAライブ ラリーをプールに分けて、COS細胞または該ポリペプチドに応答しない他の細 胞をトランスフェクトするために使用する。ガラススライド上で増殖させた、ト ランスフェクトされた細胞を、標識化ポリペプチドにさらす。該ポリペプチドは 、ヨウ素化または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位の包含を含め 、様々な方法により標識化することができる。固定およびインキュベーションに 続いて、そのスライドをオートラジオグラフ分析にかける。陽性のプールを同定 して、サブプールを調製し、反復サブプーリングおよび再スクリーニング方法を 利用して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定される受容体をコードす る単一クローンを得る。 受容体を同定するための他の方法として、標識化ポリペプチドを細胞膜と光親 和性により結合させるか、または受容体分子を発現する調製物を抽出することが できる。橋かけ(cross-linked)物質をPAGE分析により分けて、X線フィルム にさらす。該ポリペプチドの受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラ グメントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけることができる。ミクロ配 列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、一組の縮重オリゴヌクレオチドプ ローブを設計し、cDNAライブラリーをスクリーニングして、推定される受容 体をコードする遺伝子が同定されるであろう。 本発明は、本発明のヒトケモカインポリペプチドに対するアゴニストおよびア ンタゴニストを同定するために、化合物をスクリーニングする方法を提供する。 アゴニストは、該ポリペプチドと同様の生物学的機能を有する化合物であるが、 アンタゴニストは、そのような機能をブロックする。本発明のポリペプチドのい ずれかにより化学誘引される細胞を、細胞を通すのに十分な直径(約5μm)の細 孔を有するフィルターの上部に置くことにより、走化性をアッセイすることがで きる。可能性のあるアゴニストの溶液を、上方のコンパートメント(compartment )に適当な対照媒体の入ったチャンバーの底部に置くことから、アゴニストの濃 度グラジエントを、時間中に多孔膜の中へ、または多孔膜を通って移動する細胞 を計数することにより測定する。 アンタゴニストに関してアッセイする場合、本発明のヒトケモカインポリペプ チドをチャンバーの底部に置いて、可能性のあるアンタゴニストを加えて、その 細胞の走化性が妨げられるかどうかを測定する。 あるいはまた、化合物の存在下、該ポリペプチドの受容体を発現する哺乳動物 細胞または膜調製物を標識化ヒトケモカインポリペプチド、例えば、放射能と共 にインキュベートする。次いで、この相互反応をブロックする化合物の能力を測 定することができる。この方法でアゴニストに関してアッセイする場合、ヒトケ モカインポリペプチドは存在せず、また受容体と相互作用するアゴニスト自体の 能力を測定することができる。 可能性のあるCkβ−11およびCkα−1アンタゴニストの例には、抗体、ま た幾つかの場合には、ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドが含まれる。 可能性のあるアンタゴニストの別の例は、ポリペプチドの負の(negative)優性突 然変異体である。負の優性突然変異体は、野生型のポリペプチドの受容体に結合 するが、生物学的活性を保有していないポリペプチドである。 アンチセンス技術を利用して製造されたアンチセンス構築物もまた、可能性の あるアンタゴニストである。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成また はアンチセンスDNAもしくはRNAによって遺伝子発現を制御することができ 、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのDNAまたはRNAへの結合に基づ く。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の 5’コード部分を使用して、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリ ゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝 子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Leeら、Nucl.Acids R es.、6:3073(1979);Cooneyら、Science、241:456(19 88);およびDervanら、Science、251:1360(1991)を参照)、 そのことによって、転写およびヒトケモカインポリペプチドの産生を妨げる。ア ンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmRNAにハイブリ ダイズして、mRNA分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス −Okano、J.Neurochem.、56:560(1991);Oligodeoxynucleotid es as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、FL(1988))。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込 むことから、アンチセンスRNAまたはDNAをインビボにおいて発現させて、 ヒトケモカインポリペプチドの産生を阻害することができる。 別の可能性のあるヒトケモカインアンタゴニストは、生物学的機能を失ってし まってはいるが、それにもかかわらず、ポリペプチドの受容体を認識して結合し 、それによって、その受容体を有効にブロックするポリペプチドの、自然に、ま たは合成的に修飾されたアナログである、ポリペプチドのペプチド誘導体である 。ペプチド誘導体の例には、これらに限定されるものではないが、小さなペプチ ドまたはペプチド様分子が含まれる。 該アンタゴニストは、ある自己免疫疾患および慢性の炎症性疾患および感染症 において、マクロファージ並びにそれらの前駆体の、および好中球、好塩基球、 Bリンパ球並びに幾つかのT細胞サブセット、例えば、活性化並びにCD8細胞 障害性T細胞、および天然のキラー細胞の走化性並びに活性化を阻害するために 使用することができる。自己免疫疾患の例には、多発性硬化症、およびインスリ ン依存性糖尿病が含まれる。 該アンタゴニストはまた、単核食細胞の漸増および活性化を妨げることにより 、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症が含まれる感染症を処置するため に使用することもできる。それらはまた、好酸球産生および移動を妨げることに より、特発性過エオシン好性症候群を処置するために使用することもできる。内 毒素性ショックもまた、マクロファージの移動および本発明のヒトケモカインポ リペプチドの産生を妨げることにより、該アンタゴニストによって処置すること ができる。 該アンタゴニストはまた、動脈壁における単球浸潤を妨げることにより、アテ ローム性動脈硬化症を処置するために使用することもできる。 該アンタゴニストはまた、ケモカインにより誘発されるマスト細胞並びに好塩 基球の脱顆粒、およびヒスタミンの放出を阻害することにより、ヒスタミンによ り媒介されるアレルギー反応、および後期(late phase)アレルギー反応、慢性じ んま疹、並びにアトピー性皮膚炎が含まれる免疫学的障害を処置するために使用 することもできる。アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹といったような、Ig Eにより媒介されるアレルギー反応もまた処置することができる。 該アンタゴニストはまた、単球の創傷領域への誘引を妨げることにより、慢性 および急性の炎症を処置するために使用することもできる。それらはまた、慢性 および急性の炎症性肺疾患が、肺における単核食細胞の腐骨形成と関連があるこ とから、正常な肺のマクロファージ数を調節するために使用することもできる。 アンタゴニストはまた、患者の関節において単球の滑液中への誘引を妨げるこ とにより、慢性関節リウマチを処置するために使用することもできる。単球の流 入および活性化は、変性および炎症性関節炎の両方の病因において重要な役割を 担う。 該アンタゴニストはまた、他の炎症性サイトカインの生合成を妨げる、主とし てIL−1およびTNFが原因となる有害なカスケードを妨げるために使用する こともできる。この方法では、該アンタゴニストはまた、炎症を妨げるために使 用することもできる。該アンタゴニストはまた、ケモカインにより誘発される、 プロスタグランジンとは無関係の発熱を阻止するために使用することもできる。 該アンタゴニストはまた、骨髄不全の病症、例えば、再生不良性貧血および脊 髄形成異常症候群を処置するために使用することもできる。 該アンタゴニストはまた、肺における好酸球蓄積を妨げることにより、喘息お よびアレルギーを処置するために使用することもできる。該アンタゴニストはま た、喘息肺の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を処置するために使用するこ ともできる。 該アンタゴニストはまた、薬学上許容され得る担体、例えば、以下に記載する ような担体と共に、組成物中で使用することもできる。 該ヒトケモカインポリペプチドおよびアゴニストおよびアンタゴニストは、適 当な薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治 療上有効な量のポリペプチド、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を含 んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水 、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および それらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。 本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を1つまたはそれ以上充填した、1 つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ のような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を 規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト への投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに 、該ポリペプチドおよびアゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療化合物と 共に使用することができる。 該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内また は皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物 は、具体的な徴候を処置および/または予防するのに有効な量で投与される。一 般に、該ポリペプチドは、少なくとも約10μg/kg(体重)の量で投与され、最 も多くの場合、それらは、1日当り約8mg/kg(体重)を超えない量で投与される であろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、 毎 日約10μg/kg〜約1mg/kg(体重)である。 該ヒトケモカインポリペプチド、およびポリペプチドであるアゴニストまたは アンタゴニストは、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプ チドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる。 従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)で操作した後、操作した細胞を該 ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。 例えば、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子の 使用によって、細胞を当業界で既知の方法により操作することができる。 同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおけ る発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知ら れているように、細胞をインビボにおいて処理して、ポリペプチドをインビボに おいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレト ロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。その ような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他 の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作する ための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒク ルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することがで きるアデノウイルスであってもよい。 本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色 体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで きる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配 列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色***置を マークするのにはほとんど利用できない。本発明によるDNAの染色体へのマッ ピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階で ある。 簡単に言えば、cDNA由来のPCRプライマー(好ましくは、15−25bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。3'非翻訳領 域のコンピューター分析を使用して、ゲノムDNA中の1つ以上のエクソンをス パン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なもの とする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブ リッドのPCRスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を 含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう 。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に帰 属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて の本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい ゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成 することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他 のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソー ティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特 異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ セレクションが含まれる。 cDNAクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼ ーション(FISH)を利用して、正確な染色***置を一工程で与えることができ る。この技術は、500または600塩基という短いcDNAで利用することが できる;しかし、それより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度 を有する独自の染色***置へ結合する可能性が高い。FISHは、ESTが得ら れるクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、2,00 0bpが良好であり、4,000はより良好であって、4,000以上は、恐らく、 良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Verma ら、Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques、Pergamon Pre ss、ニューヨーク(1988)を参照。 ある配列が正確な染色***置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的 位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例え ば、V.McKusick、Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins Univ ersity Welch Medical Libraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を 結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する 。 次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcDNAまたはゲノ ム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全 てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、そ の変異は疾患の原因となるものであるらしい。 現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する 染色体領域に正確に局在化したcDNAは、50〜500の可能な原因となる遺 伝子の1つとなり得るであろう。(これは、1メガベースのマッピング分析およ び20kb当り1つの遺伝子を仮定する)。 ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらの アナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対す る抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまた はモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト 化抗体、さらにはまた、Fabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの生成 物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメン トの製造に使用することができる。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチ ドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒ トでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして 得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポ リペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプ チドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような 抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離する ことができる。 モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗 体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ko hlerおよびMilstein、1975、Nature、256:495−497)、トリオ ー マ(trioma)技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983、Immun ology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのEB V−ハイブリドーマ技術(Coleら、1985、Monoclonal Antibodies and C ancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、77−96頁において)が含まれる。 単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第4,946,778号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し 得る。それにまた、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポ リペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることができる。 本発明をさらに、次の実施例に関して記載する;しかし、本発明は、そのよう な実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にこと わらない限り、重量単位である。 次の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および/ または用語を記載する。 「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび/または続けて大文字および /または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限 定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手 可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。 DNAの「消化」は、DNAのある配列にのみ作用する制限酵素でDNAを触 媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており 、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているよう に使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約20μl中、1μgのプラスミ ドまたはDNAフラグメントを約2単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築 のためのDNAフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中 、DNA5〜50μgを20〜250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に 適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。37℃で約1時間 のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えるこ とができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して 、所望 のフラグメントを単離する。 切断したフラグメントのサイズ分離は、Goeddel,Dら、Nucleic Acids Re s.、8:4057(1980)により記載されている8% ポリアクリルアミド ゲルを用いて行う。 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオ キシヌクレオチド、または2つの相捕的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような 合成オリゴヌクレオチドは5'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存 在下、ATPでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドに ライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていな いフラグメントにライゲートするであろう。 「ライゲーション」は、2つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステ ル結合を形成する過程をいう(Maniatis,T.ら、同上、146頁)。特にことわ らない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきDNAフラグメントのほ ぼ等モル量の0.5μg当り10単位のT4DNAリガーゼ(「リガーゼ」)と共に 、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。 特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Graham,F.およびVa n der Eb,A.、Virology、52:456−457(1973)の方法に記載さ れているようにして行った。 実施例1 Ckβ−11の細菌発現および精製 最初に、Ckβ−11をコードするDNA配列、ATCC第75948号を、 プロセシングされたCkβ−11核酸配列の5'および3'末端配列(推定されるシ グナルペプチド配列なし)に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを利 用して増幅する。Ckβ−11遺伝子に対応する付加的ヌクレオチドを各々、5' および3'末端配列に付加する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列: を有し、SphI制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、成熟タンパク質をコードす る配列の第2ヌクレオチドから始まる18ヌクレオチドのCkβ−11コード配 列(下線を引いた活字)を含む。ATGコドンは、SphI部位に含まれる。ATG に続く次のコドンでは、1つ目の塩基がSphI部位に由来し、また残りの2つの 塩基は、推定される成熟タンパク質の最初のコドン(残基18)の2つ目および3 つ目の塩基に対応する。3'配列: は、BamH1部位に対する相補的配列(肉太の活字)、続いて、終止コドンより前 に、18ヌクレオチドの遺伝子特異的配列を含む。その制限酵素部位は、細菌発 現ベクター pQE−9(Qiagen,Inc.Chatsworth、CA)上の制限酵素部位に 対応する。pQE−9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製開始点(ori)、IP TG−調節可能なプロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(R BS)、6−Hisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、pQE−9をS phIおよびBamH1で消化する。増幅された配列をpQE−9にライゲートして 、ヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列と共に枠内に挿入する。次いで 、そのライゲーション混合物を使用して、Sambrook,J.ら、Molecular Clo ning:A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press(1989 )に記載されている手順により、E.coli.株 M15/rep4(Qiagen,Inc.)を トランスフォームする。M15/rep4はプラスミドpREP4の多重コピーを含 み、これは、lacIリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Kanr)も与 える。 トランスフォーマントを、それらがLBプレートで増殖する能力により同定して 、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単 離して、制限分析により確認する。所望の構築物を含むコロニーを、Amp(10 0ug/ml)とKan(25ug/ml)の両方を補ったLB培地中での液体培養で一晩増 殖させる(O/N)。そのO/N培養物を使用して、大きな培養系に1:100〜 1:250の割合で播種する。細胞が、0.4〜0.6の光学密度600(O.D.6 00 )まで増殖する。次いで、IPTG(「イソプロピル−B−D−チオガラクトピ ラノシド」)を、最終濃度が1mMとなるまで加える。IPTGは、lacIリプレ ッサーを不活性化することにより、P/Oのクリアリングを誘導し、遺伝子発現 を増加させる。細胞をさらに3〜4時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離に より収集する。細胞ペレットをカオトロピック剤である6モルのグアニジンHC lpH 5.0中で可溶化する。清澄後、この溶液から、6−ヒスチジンタグを含む タンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムで のクロマトグラフィーにより、可溶化したCkβ−11を精製する(Hochuli,E .ら、J.Chromatography 411:177−184(1984))。6Mのグ アニジンHCl中、Ckβ−11(純度>98%)をカラムから溶出する。GnHCl からのタンパク質の再生は、幾つかのプロトコルにより成し遂げることができる (Jaenicke,R.およびRudolph,R.、Protein Structure−A Practical Ap proach、IRL Press、ニューヨーク(1990))。まず最初に、段階透析を 利用して、GnHCLを除去する。あるいはまた、Ni−キレートカラムから単離 される精製タンパク質を、減少型リニアGnHCLグラジエントを通す第2カラ ムに結合させることができる。そのタンパク質をカラムに結合している間に再生 させた後、250mMのイミダゾール、150mMのNaCl、25mMのトリス− HCl(pH 7.5)および10%のグリセロールを含む緩衝液で溶出する。最後に 、可溶性タンパク質を、5mMの重炭酸アンモニウムを含む貯蔵緩衝液に対して 透析する。 実施例 2 Ckα−1の細菌発現および精製 最初に、Ckα−1をコードするDNA配列、ATCC第75947号を、プ ロセシングされたCkα−1核酸配列(推定されるシグナルペプチド配列なし)の 5'および3'末端配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを利用し て増幅する。Ckα−1に対応する付加的ヌクレオチドを各々、5'および3'末 端配列に付加する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列: を有し、SphI制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、成熟タンパク質をコードす る配列の第2ヌクレオチドから始まる21ヌクレオチドのCkα−1コード配列 を含む。ATGコドンは、SphI部位に含まれる。ATGに続く次のコドンでは 、1つ目の塩基がSphI部位に由来し、また残りの2つの塩基は、推定される成 熟タンパク質の最初のコドン(残基23)の2つ目および3つ目の塩基に対応する 。結果として、このコドンにおける1つ目の塩基は、もとの配列と比較して、V alからLeuに変わり、結果的には、組換えタンパク質においてEがQに置き換わ る。 3'配列: は、BamH1部位に対する相補的配列(肉太の活字)、続いて、終止コドンより前 に、19ヌクレオチドの遺伝子特異的配列を含む。その制限酵素部位は、細菌発 現ベクターpQE−9(Qiagen,Inc.Chatsworth、CA)上の制限酵素部位に 対応する。pQE−9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製開始点(ori)、IP TG−調節可能なプロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(R BS)、6−Hisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、pQE−9をS phIおよびBamH1で消化する。増幅された配列をpQE−9にライゲートして 、ヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列と共に枠内に挿入する。次いで 、そのライゲーション混合物を使用して、Sambrook,J.ら、Molecular Cloni ng:A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press(1989) に記載されている手順により、E.coli. M15/rep4(Qiagen,Inc.)をトラ ン スフォームする。M15/rep4はプラスミドpREP4の多重コピーを含み、こ れは、lacIリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Kanr)も与える。 トランスフォーマントを、それらがLBプレートで増殖する能力により同定して 、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単 離して、制限分析により確認する。所望の構築物を含むコロニーを、Amp(10 0ug/ml)とKan(25ug/ml)の両方を補ったLB培地中での液体培養で一晩増 殖させる(O/N)。そのO/N培養物を使用して、大きな培養系に1:100〜 1:250の割合で播種する。細胞が、0.4〜0.6の光学密度600(O.D.6 00 )まで増殖する。次いで、IPTG(「イソプロピル−B−D−チオガラクトピ ラノシド」)を、最終濃度が1mMとなるまで加える。IPTGは、lacIリプレ ッサーを不活性化することにより、P/Oのクリアリングを誘導し、遺伝子発現 を増加させる。細胞をさらに3〜4時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離に より収集する。細胞ペレットをカオトロピック剤である6モルのグアニジンHC lpH 5.0中で可溶化する。清澄後、この溶液から、6−ヒスチジンタグを含む タンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムで のクロマトグラフィーにより、可溶化したCkα−1を精製する(Hochuli,E.ら 、J.Chromatography 411:177−184(1984))。6Mのグアニジ ンHCl中、Ckα−1(純度>98%)をカラムから溶出する。GnHClからのタ ンパク質の再生は、幾つかのプロトコルにより成し遂げることができる(Jaenic ke,R.およびRudolph,R.、Protein Structure−A Practical Approach、 IRL Press、ニューヨーク(1990))。まず最初に、段階透析を利用して 、GnHCLを除去する。あるいはまた、Ni−キレートカラムから単離される精 製タンパク質を、減少型リニアGnHCLグラジエントを通す第2カラムに結合 させることができる。そのタンパク質をカラムに結合している間に再生させた後 、250mMのイミダゾール、150mMのNaCl、25mMのトリス−HCl(pH 7.5)および10%のグリセロールを含む緩衝液で溶出する。最後に、可溶性タ ンパク質を、5mMの重炭酸アンモニウムを含む貯蔵緩衝液に対して透析する。 実施例 3 COS細胞における組換えCkβ−11の発現 プラスミド、Ckβ−11 HAの発現は、1)SV40複製開始点、2)アン ピリシン耐性遺伝子、3)E.coli 複製開始点、4)ポリリンカー領域、SV4 0イントロンおよびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーターを含む、ベク ター pcDNAI/Amp(Invitrogen)から得られる。完全なCkβ−11前駆体 およびその3'末端に枠内で融合したHAタグ(tag)をコードするDNAフラグメ ントを、そのベクターのポリリンカー領域にクローン化することから、組換えタ ンパク質発現は、CMVプロモーターの下に指示される。HAタグは、前記のよ うなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する (I.Wilson、H.Niman、R.Heighten、A.Cherenson、M.Connolly、およ びR.Lerner、1984、Cell 37、767)。HAタグを標的タンパク質へ 融合させることにより、組換えタンパク質を、HAエピトープを認識する抗体で 容易に検出することが可能となる。 プラスミド構築方法を次のように記載する: Ckβ−11をコードするDNA配列、ATCC第75948号を、2つのプ ライマーを用いてのPCRにより構築する: 5'プライマー は、HindIII部位、続いて、開始コドンに比べて3つの位置がないものから始ま る18ヌクレオチドのCkβ−11コード配列を含む; 3'配列 は、XbaI部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、HAタグ、およびCkβ −11コード配列の最後の18ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含 む。従って、PCR産物は、HindIII部位、Ckβ−11コード配列、続いて、 枠内で融合したHAタグ、そのHAタグの隣の翻訳終了終止コドン、およびXba I部位を含む。PCRにより増幅されたDNAフラグメントおよびベクター、pc DNAI/Ampを、HindIIIおよびXbaI制限酵素で消化して、ライゲートさせ る。そのライゲーション混合物をE.coli株 SURE(Stratagene Cloning S ystems、La Jolla、CA)にトランスフォームし、そのトランスフォームされ た培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プ ラスミドDNAをトランスフォーマントから単離して、正しいフラグメントの存 在に関して制限分析により試験する。組換えCkβ−11の発現には、DEAE −DEXTRAN方法により、COS細胞を発現ベクターでトランスフェクトす る(J.Sambrook、E.Fritsch、T.Maniatis、Molecular Cloning:A Lab oratory Manual、Cold Spring Laboratory Press、(1989))。Ckβ −11 HAタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出する( E.Harlow、D.Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press、(1988))。トランスフェクションから2日後、細胞 を35S−システインで8時間標識化する。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界 面活性剤(RIPA緩衝液(150mM NaCl、1% NP−40、0.1%SDS 、1% NP−40、0.5% DOC、50mM トリス、pH 7.5))で溶菌す る。(Wilson,I.ら、同上37:767(1984))。細胞溶菌液および培養 培地は両方とも、HAに特異的なモノクローナル抗体で沈降する。沈降したタン パク質をSDS−PAGEにより分析する。 実施例 4 COS細胞における組換えCkα−1の発現 プラスミド、Ckα−1 HAの発現は、1)SV40 複製開始点、2)アン ピリシン耐性遺伝子、3)E.coli複製開始点、4)ポリリンカー領域、SV4 0 イントロンおよびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーターを含む、ベ クター pcDNAI/Amp(Invitrogen)から得られる。完全なCkα−1前駆体 およびその3'末端に枠内で融合したHAタグ(tag)をコードするDNAフラグメ ントを、そのベクターのポリリンカー領域にクローン化することから、組換えタ ンパク質発現は、CMVプロモーターの下に指示される。HAタグは、前記のよ うなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する (I.Wilson、H.Niman、R.Heighten、A.Cherenson、M.Connolly、およ びR.Lerner、1984、Cell 37、767)。HAタグを標的タンパク質へ 融合させることにより、組換えタンパク質を、HAエピトープを認識する抗体で 容易に検出することが可能となる。 プラスミド構築方法を次のように記載する: Ckα−1をコードするDNA配列、ATCC第75947号を、2つのプラ イマーを用いてのPCRにより構築する: 5'プライマー は、HindIII部位、続いて、開始コドンに比べて3つの位置がないものから始ま る18ヌクレオチドのCkα−1コード配列を含む; 3'配列 は、XbaI部位に対する相捕的配列、翻訳終止コドン、HAタグ、およびCkα −1コード配列の最後の18ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む 。従って、PCR産物は、HindIII部位、Ckα−1コード配列、続いて、枠内 で融合したHAタグ、そのHAタグの隣の翻訳終了終止コドン、およびXbaI部 位を含む。PCRにより増幅されたDNAフラグメントおよびベクター、pcDN AI/Ampを、HindIIIおよびXbaI制限酵素で消化して、ライゲートさせる。 そのライゲーション混合物をE.coli株 SURE(Stratagene Cloning Syste ms、La Jolla、CA)にトランスフォームし、そのトランスフォームされた培 養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プラス ミド DNAをトランスフォーマントから単離して、正しいフラグメントの存在 に関して制限分析により試験する。組換えCkα−1の発現には、DEAE−D EXTRAN方法により、COS細胞を発現ベクターでトランスフェクトする( J.Sambrook、E.Fritsch、T.Maniatis、Molecular Cloning:A Labora tory Manual、Cold Spring Laboratory Press、(1989))。Ckα−1 HA タンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出する(E.Harlow 、D.Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Laborato ry Press、(1988))。トランスフェクションから2日後、細胞を35S−シ ステインで8時間標識化する。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤( RIPA緩衝液(150mM NaCl、1% NP−40、0.1% SDS、1% NP−40、0.5% DOC、50mM トリス、pH 7.5))で溶菌する。(Wil son,I.ら、同上37:767(1984))。細胞溶菌液および培養培地は両方 とも、HAに特異的なモノクローナル抗体で沈降する。沈降したタンパク質をS DS−PAGEにより分析する。 実施例 5 バキュロウイルス発現システムを用いての Ckβ−11のクローニングおよび発現 完全な長さのCkβ−11タンパク質をコードするDNA配列、ATCC第7 5948号を、遺伝子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチド プライマーを利用して増幅する。 その5'プライマーは、配列: を有し、またBamHI制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、真核細胞における翻 訳の開始に有効なシグナルに似ている6ヌクレオチドを含み(Kozak,M.、J.M ol.Biol.、196:947−950(1987))、このすぐ後ろは、Ckβ− 11遺伝子の最初の20ヌクレオチドである(翻訳開始コドン「ATG」に下線 を引く)。 その3'プライマーは、配列: を有し、また制限エンドヌクレアーゼ Asp781の切断部位、およびCkβ−1 1遺伝子の3'非翻訳配列に対して相補的な19ヌクレオチドを含む。増幅され た配列を、市販のキット(「Geneclean」、BIO 101 Inc.、La Jolla 、 Ca.)を使用して、1% アガロースゲルから単離する。次いで、そのフラグメン トをエンドヌクレアーゼ BamHIおよびAsp781で消化した後、1% アガロ ースゲル上で次に精製する。このフラグメントをF2と名付ける。 ベクター pRG1(pVL941ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロ ウイルス発現システムを用いてのCkβ−11タンパク質の発現に使用した(レビ ューには、Summers,M.D.およびSmith,G.E.1987、A manual of meth ods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures、Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555を参照)。この 発現ベクターは、オートグラファ(Autographa)カリフォルニア核多角体病ウイ ルス群(AcMNPV)の強多角体(strong polyhedrin)プロモーター、続いて、制 限エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp781の認識部位を含む。シミアンウ イルス(SV)40のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。 組換えウイルスを容易に選択するには、E.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺 伝子を、多角体(polyhedrin)遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く多角体プロ モーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfected)野 生型ウイルスDNAの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列 を多角体配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、p Ac373、pVL941、およびpAcIM1といったようなpRG1の代わりに 使用することができるであろう(Luckow,V.A.およびSummers,M.D.、Virol ogy、170:31−39)。 プラスミドを制限酵素BamHIおよびAsp78Lで消化した後、当業界で既知 の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、DN Aを、市販のキット(「Geneclean」、BIO 101 Inc.、La Jolla、Ca .)を使用して、1%アガロースゲルから単離する。このベクター DNAをV2 と名付ける。 フラグメント F2および脱リン酸化プラスミド V2をT4 DNAリガーゼ でライゲートさせる。次いで、E.coli HB101細胞をトランスフォームして 、Ckβ−11遺伝子を有するプラスミド(pBac−Ckβ−11)を含む細菌を、 酵 素 BamHIおよびAsp781を用いて同定する。クローン化されたフラグメン トの配列を、DNA配列決定により確認する。 リポフェクション法を利用して、プラスミド pBac−Ckβ−11 5μgを市 販の線形化バキュロウイルス(「BaculoGoldTMバキュロウイルス DNA」、P harmingen、San Diego、CA)1.0μgと共に同時トランスフェクトする(Fel gnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7413−7417(198 7))。 BaculoGoldTMウイルス DNA 1μgおよびプラスミド pBac−Ckβ−11 5μgを、無血清グレイス(Grace's)培地(Life Technologies Inc.、Gaith ersburg、MD)50μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合 する。その後、リポフェクチン(Lipofectin)10μlとグレイス培地90μlを 加え、混合して、室温で15分間インキュベートする。次いで、トランスフェク ション混合物を、無血清グレイス培地1mlを含む、35mmの組織培養プレートに 播種したSf9昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴加する。そのプレート を前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを 27℃で5時間インキュベートする。5時間後、そのトランスフェクション溶液 をプレートから除去して、10% ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地1ml を加える。そのプレートをインキュベーターに戻して、27℃で4日間培養し続 ける。 4日後、上清を集めて、SummersおよびSmith(上記)により記載されたように して、プラークアッセイを行う。変更として、「Blue Gal(Life Technologi es Inc.、Gaithersburg)を含むアガロースゲルを使用するが、このことにより 、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラーク アッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、および Life Technologies Inc.、Gaithersburgにより配布されたバキュロウイルス 学、9−10頁にも見い出すことができる)。 連続希釈してから4日後に、ウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラ ークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含 む寒天を、グレイス培地200μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させる 。 その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上 清を、35mmの皿に播種した昆虫Sf9細胞を感染させるのに使用する。4日後 、これらの培養皿の上清を収集した後、4℃で保存する。 Sf9細胞を、10% 熱不活性化FBSを補ったグレイス培地で増殖させる。 その細胞に、感染多重度(MOI)2で組換えバキュロウイルス V−Ckβ−11 を感染させる。6時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを 含まないSF900 II 培地(Life Technologies Inc.、Gaithersburg)に替 える。42時間後、5μCiの35S−メチオニンおよび5μCiの35S システイ ン5μCi(Amersham)を加える。その細胞をさらに16時間インキュベートした 後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、SDS−PAGE およびオートラジオグラフィーにより視覚化する。 実施例 6 バキュロウイルス発現システムを用いての Ckα−1のクローニングおよび発現 完全な長さのCkα−1タンパク質をコードするDNA配列、ATCC第75 947号を、遺伝子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプ ライマーを利用して増幅する。 その5'プライマーは、配列: を有し、またBamHI制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、真核細胞における翻 訳の開始に有効なシグナルに似ている6ヌクレオチドを含み(Kozak,M.、J.M ol.Biol.、196:947−950(1987))、このすぐ後ろは、Ckα− 1遺伝子の最初の20ヌクレオチドである(翻訳開始コドン「ATG」に下線を 引く)。 その3'プライマーは、配列: を有し、また制限エンドヌクレアーゼ Asp781の切断部位(肉太の活字)、お よびCkα−1遺伝子の3'非翻訳配列に対して相補的な17ヌクレオチドを含む 。増幅された配列を、市販のキット(「Geneclean」、BIO 101 Inc.、 LaJolla、Ca.)を使用して、1% アガロースゲルから単離する。次いで、そ のフラグメントをエンドヌクレアーゼ BamHIおよびAsp781で消化した後 、1% アガロースゲル上で次に精製する。このフラグメントをF2と名付ける 。 ベクター pRG1(pVL941ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロウ イルス発現システムを用いてのCkα−1タンパク質の発現に使用した(レビュー には、Summers,M.D.およびSmith,G.E.1987、A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures、Texas Agri cultural Experimental Station Bulletin No.1555を参照)。この発現 ベクターは、オートグラファ(Autographa)カリフォルニア核多角体病ウイルス 群(AcMNPV)の強多角体(strong polyhedrin)プロモーター、続いて、制限エ ンドヌクレアーゼ BamHIおよびAsp781の認識部位を含む。シミアンウイ ルス(SV)40のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組 換えウイルスを容易に選択するには、E.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝 子を、多角体(polyhedrin)遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く多角体プロモ ーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfected)野生 型ウイルスDNAの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列を 多角体配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、pAc 373、pVL941、およびpAcIM1といったようなpRG1の代わりに使用 することができるであろう(Luckow,V.A.およびSummers,M.D.、Virology 、170:31−39)。 プラスミドを制限酵素BamHIおよびAsp781で消化した後、当業界で既知 の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、DN Aを、市販のキット(「Geneclean」、BIO 101 Inc.、La Jolla、Ca .)を使用して、1% アガロースゲルから単離する。このベクター DNAをV2 と名付ける。 フラグメント F2および脱リン酸化プラスミドV2をT4 DNAリガーゼ でライゲートさせる。次いで、E.coli HB101細胞をトランスフォームして 、Ckα−1遺伝子を有するプラスミド(pBac-Ckα−1)を含む細菌を、酵素 BamHIおよびAsp781を用いて同定する。クローン化されたフラグメントの 配列を、DNA配列決定により確認する。 リポフェクション法を利用して、プラスミド pBac-Ckα−1 5μgを市販の 線形化バキュロウイルス(「BaculoGoldTMバキュロウイルス DNA」、Pharm ingen、 San Diego、CA)1.0μgと共に同時トランスフェクトする(Felgne rら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7413−7417(1987 ))。 BaculoGoldTMウイルス DNA 1μgおよびプラスミド pBac−Ckα−15 μgを、無血清グレイス(Grace's)培地(Life Technologies Inc.、Gaithers burg、MD)50μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する 。その後、リポフェクチン(Lipofectin)10μlとグレイス培地90μlを加え 、混合して、室温で15分間インキュベートする。次いで、トランスフェクショ ン混合物を、無血清グレイス培地1mlを含む、35mmの組織培養プレートに播種 したSf9昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴加する。そのプレートを前 後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを27 ℃で5時間インキュベートする。5時間後、そのトランスフェクション溶液をプ レートから除去して、10% ウシ胎児血清を捕ったグレイス昆虫培地1mlを加 える。そのプレートをインキュベーターに戻して、27℃で4日間培養し続ける 。 4日後、上清を集めて、SummersおよびSmith(上記)により記載されたように して、プラークアッセイを行う。変更として、「Blue Gal」(Life Technolo gies Inc.、Gaithersburg)を含むアガロースゲルを使用するが、このことによ り、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラー クアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、およ びLife Technologies Inc.、Gaithersburgにより配布されたバキュロウイル ス学、9−10頁にも見い出すことができる)。 連続希釈してから4日後に、ウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラ ークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含 む寒天を、グレイス培地200μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させる 。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む 上清を、35mmの皿に播種した昆虫Sf9細胞を感染させるのに使用する。4日 後、これらの培養皿の上清を収集した後、4℃で保存する。 Sf9細胞を、10% 熱不活性化FBSを捕ったグレイス培地で増殖させる。 その細胞に、感染多重度(MOI)2で組換えバキュロウイルス V−Ckα−1を 感染させる。6時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含 まないSF900 II 培地(Life Technologies Inc.、Gaithersburg、MD) に替える。42時間後、5μCiの35S−メチオニンおよび5μCiの35Sシステ イン5μCi(Amersham)を加える。その細胞をさらに16時間インキュベートし た後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、SDS−PAG Eおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する。 上記の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、 後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができ る。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human chemokine β-11 and human chemokine α-1 The present invention relates to newly identified polynucleotides, such polynucleotides Polypeptides, such polynucleotides and polypeptides The use of tides, and also the use of such polynucleotides and polypeptides Related to manufacturing. In particular, the polypeptides of the present invention may sometimes be Human β, which is referred to as human β-11 (Ckβ-11) and human chemokine α-1 (Ckα-1). It is a chemokine polypeptide. The present invention also relates to the production of such polypeptides. It also relates to inhibiting use. Chemokines, also called intercrine cytokines, are structurally And a functionally related subfamily of cytokines. These molecules are And the size is 8-10 kd. Generally, chemokines are 20- The four conserved domains show 75% homology and form two disulfide bonds Cysteine residues. Arrangement of the first two cysteine residues Chemokines have been classified into two subfamilies, α and β, based on You. In the alpha subfamily, the first two cysteines are separated by one amino acid. Therefore, it is called "C-X-C" subfamily. Beta subfa In Millie, since the two cysteines are in adjacent positions, the "CC" sub- Called family. So far, at least eight different members of this family Members have been identified in humans. Intercrine cytokines exhibit a wide variety of functions. Characteristic (hallmark) Characterizes monocytes, neutrophils, T lymphocytes, basophils, and fibroblasts. Including their ability to induce chemotactic migration of another cell type. Many sites Cain has pro-inflammatory activity and is involved in many processes during the inflammatory response You. These activities include histamine release, lysosomal enzymes and leukotrienes. Stimulates release, increases attachment of target immune cells to endothelial cells, increases complement protein binding Enhancement, induction of expression of granulocyte adhesion molecules and complement receptors, and respiratory retriever Included. In addition to their involvement in inflammation, some chemokines are It has been shown to exhibit activity. For example, macrophage inflammatory protein 1 ( MIP-1) can suppress the proliferation of hematopoietic stem cells, and platelet factor (PF-4) Is an effective inhibitor of endothelial cell proliferation and interleukin-3 (IL-8) Promotes Tinocytic proliferation and GRO promotes autocrine on melanoma cells It is a growth factor. In view of various biological activities, chemokines can be used to traffic lymphocytes. (trafficking), wound healing, hematopoietic regulation, and allergies, asthma, and arthritis Related to many physiological and disease states, including immunological disorders such as What you do is not surprising. Members of the "CC" branch exert their effects on the following cells: Kills living organisms, reduces parasite infections and reduces respiratory tract airways. Eosinophils that cause inflammatory inflammation; macrophages suppress tumorigenesis in vertebrates Basophils that release histamine that play a role in allergic inflammation . However, members of one branch are usually cells that respond to chemokines of the other branch. Vesicles can exert their exact role on members of the branch It cannot be attached. Members of the CC branch act primarily on mononuclear cells and also act on the CXC branch. Members act primarily on neutrophils, but the properties of another chemoattractant make this gas Cannot belong to chemokines based on idlines. How many come from a family The chemokine exhibits other features. The polypeptides of the present invention have conserved cysteine residues, ie, Ck β-11 has a “CC”, Ckα-1 has a “CXC” region, and They have high amino acid sequence homology to known chemokines. , Putatively characterized as human chemokines. According to one aspect of the present invention, novel polypeptides that are human Ckβ-11 and Ckα-1 Pide, and also biologically active, diagnostically or therapeutically useful And fragments, analogs and derivatives of According to another aspect of the present invention, including mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA, An isolated nucleic acid molecule encoding such a polypeptide, or even a native nucleic acid molecule. Fragments, analogs thereof that are physically active and diagnostically or therapeutically useful And derivatives. According to another aspect of the present invention, hybridizing specifically to Ckβ-11 and Ckα-1 sequences There is provided a nucleic acid probe comprising a nucleic acid molecule of sufficient length to redisy. According to yet a further aspect of the present invention, such polypeptides are produced by recombinant techniques. The expression of the protein and the subsequent Recombinant containing a Ckβ-11 or Ckα-1 nucleic acid sequence under conditions that promote quality recovery A method comprising culturing a prokaryotic and / or eukaryotic host cell is provided. According to a still further aspect of the invention, such a polypeptide, or such Polynucleotides encoding novel polypeptides can be used for therapeutic purposes, e.g., solid (s olid) tumors, chronic infections, leukemias, T cell mediated autoimmune diseases, parasites To control hematopoiesis to treat animal infections, psoriasis, asthma, and allergies. To stimulate growth factor activity, to inhibit angiogenesis, and to promote wound healing Provide a method to use for In accordance with yet a further aspect of the present invention, there are provided antibodies against such polypeptides. Offer. According to yet another aspect of the invention, for example, certain autoimmune diseases, atherosclerotic artery Sclerosis, chronic inflammation and infection, histamine and IgE-mediated Lugy reaction, fever unrelated to prostaglandin, bone marrow failure, cancer, silicosis, Lucoidosis, rheumatoid arthritis, shock, hypereosinphilic syndrome, and Inhibits the action of such polypeptides in the treatment of fibrosis in the asthmatic lung Antagonists to such polypeptides that can be used to Offer a strike. According to another aspect of the present invention, a Ckβ-11 or Ckα-1 nucleic acid sequence, and Diseases related to mutations in the protein encoded by the nucleic acid sequence, Alternatively, a method for diagnosing susceptibility to a disease is provided. According to a still further aspect of the invention, such a polypeptide, or such Polynucleotides encoding novel polypeptides can be used for scientific research, DNA synthesis, For in vitro purposes related to DNA and DNA vector production Provide the law. These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. Or maybe. The following drawings illustrate aspects of the present invention and are encompassed by the following claims. It is not intended to limit the scope of the invention. FIG. 1 shows the cDNA sequence of Ckβ-11 and the corresponding deduced amino acid sequence. . Since the first 17 amino acids represent the leader sequence, the predicted mature poly The peptide comprises 81 amino acids. Standard one-letter abbreviations for amino acids Use a number. Sequencing is performed using a 373 automated DNA sequencer (Applied Bi). osystems, Inc.). Sequencing accuracy is over 97% accurate Is expected. FIG. 2 shows the cDNA sequence of Ckα-1 and the corresponding deduced amino acid sequence. Since the first 22 amino acids represent the leader sequence, the predicted mature polypeptide The peptide comprises 87 amino acids. Standard one-letter abbreviations for amino acids Use FIG. 3 shows the relationship between Ckβ-11 (top) and rat RANTES polypeptide (bottom). The amino acid sequence homology between them is shown. FIG. 4 shows the interaction between Ckα-1 and Ovis Aries interleukin-8 (lower). The homology of the amino acid sequence is shown. According to one aspect of the present invention, the deduction of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Mature polypeptide having an amino acid sequence, or AT on November 11, 1994. CC Deposit No. 75948 (Ckβ-11) and 75947 (Ckα-1) The mature polypeptide encoded by the cDNA of the clone deposited as And providing an isolated nucleic acid (polynucleotide). Polynucleotides encoding Ckβ-11 are available in a number of human adult and fetal cDNAs. NA libraries, for example, from human fetal spleen cDNA libraries. Can be. Ckβ-11 is a member of the CC branched chemokine. It Is an open reading frame that encodes a 98 amino acid residue protein. Of which the first 17 amino acid residues represent the predicted leader sequence. Being a sequence, the mature protein comprises 81 amino acids. That tongue The protein spans an 89 amino acid range relative to the rat RANTES polypeptide. Or the highest degree of homology with 31% identity and 47% similarity. Show. Four spatially conserved cysteine residues in chemokines indicate that It is also important to be found in the polypeptide. Polynucleotides encoding Ckα-1 are available from a number of human adult and fetal cDNs. A library, for example, isolated from a human tonsil cDNA library. it can. Ckα-1 is a member of the C—X—C branch of chemokines. that is , An open reading frame encoding a protein of 109 amino acid residues Of which the first approximately 22 amino acid residues are the predicted leader sequence. Being a sequence, the mature protein comprises 87 amino acids. That tongue The protein was 97 transcripts relative to interleukin-8 from sheep (Ovis Aries). Highest with 31% identity and 80% similarity over the amino acid range Shows a high degree of homology. Four spatially preserved cysteines in chemokines It is also important that amino acid residues are found in the polypeptide. The polynucleotide of the invention may be in the form of RNA or in the form of DNA. DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. The DN A can be double-stranded or single-stranded, and if single-stranded, can be the coding strand or non-stranded. It can be the coding (anti-sense) strand. Coding sequence encoding the mature polypeptide The columns are the coding sequences shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and FIG. It may be the same as the coding sequence of the deposited clone, or duplicate genetic code Alternatively, as a result of the degeneracy, the DN in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and FIG. A or a different cDNA encoding the same mature polypeptide as the deposited cDNA. It may be a card arrangement. The mature polypeptide or deposit of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Encoding a mature polypeptide encoded by the encoded cDNA Pide may include: mature polypeptide coding sequence only; mature Polypeptide coding sequence and leader or secretory sequence or proprotein Additional coding sequences, such as protein sequences; coding sequences for mature polypeptides (or Additional coding sequences, if applicable), and coding sequences for the mature polypeptide. Non-coding sequences, such as nontrons or non-coding sequences 5 'and / or 3' . Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" A polynucleotide containing only the coding sequence of the peptide, and also additional Includes polynucleotides that include coding and / or non-coding sequences. The present invention further relates to the predicted amino acids of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). Encoded by a polypeptide having an acid sequence or cDNA of a deposited clone Encoding fragments, analogs and derivatives of the polypeptides described above. Of the present invention. The polynucleotide variant is a polynucleic acid. Naturally occurring allelic variants of leotide or naturally occurring alleles of polynucleotides Not a mutant. Accordingly, the present invention provides a method as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). Encoded by the same mature polypeptide or cDNA of the deposited clone A polynucleotide encoding the same mature polypeptide, and Polynucleotide variants such as those shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and cDN of the polypeptide of FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) or the deposited clone A fragment, derivative or analog of the polypeptide encoded by A To load. Such nucleotide variants include deletion variants, substitution variants, and And addition or insertion variants. As indicated above, the polynucleotides are shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and FIG. A naturally occurring allelic variant of the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or Can have a coding sequence that is a naturally occurring allelic variant of the coding sequence of the clone You. As is known in the art, an allelic variant can have one or more Another type of polynucleotide sequence that may have a leotide substitution, deletion or addition. This does not substantially alter the function of the encoded polypeptide. The invention also provides that the coding sequence for the mature polypeptide is derived from a polypeptide derived from a host cell. Polynucleotide sequences that aid in the expression and secretion of tides, such as polynucleotides from cells Same as leader sequence, which acts as a secretory sequence to control peptide trafficking Also included are polynucleotides that can be fused in reading frame. Poly with leader sequence The peptide is a preprotein and is cleaved by the host cell to form the mature form of the polypeptide. May have a leader sequence that forms a repeptide. The polynucleotide is Proproteins, which are mature proteins with additional 5 'amino acid residues, are also Can code. A mature protein having a prosequence is a proprotein; and Inactive form of the protein. Once the prosequence is cleaved, the active mature protein Quality remains. Thus, for example, a polynucleotide of the invention may comprise a mature protein, Protein with sequence, or both prosequence and presequence (leader sequence) Can be encoded. The polynucleotide of the present invention also allows for purification of the polypeptide of the present invention. It may also have the coding sequence fused in frame to the marker sequence. In the case of a bacterial host, Marker sequence to provide for purification of the mature polypeptide fused to the marker The hexa-histidine tag provided by the pQE-9 vector Well, or when using, for example, a mammalian host, eg, COS-7 cells Alternatively, the marker sequence may be a hemagglutinin (HA) tag. HA tag Corresponds to an epitob obtained from influenza hemagglutinin protein ( Wilson, I. et al., Cell, 37: 767 (1984)). The invention further provides at least 50%, and preferably 70%, identity between the sequences. A polynucleotide that hybridizes to the above sequence, if any. Book The invention particularly hybridizes to the above polynucleotides under stringent conditions. Related polynucleotides. As used herein, "stringers" The term "ant conditions" refers to at least 95%, and preferably at least Hybridization will only occur if there is also 97% identity Means that. In a preferred embodiment, the polynucleotide hybridizes to the above-described polynucleotide. The polynucleotides shown in FIGS. 1 (SEQ ID NO: 1) and 2 (SEQ ID NO: 3) The same organism as the mature polypeptide encoded by NA or the deposited cDNA Encodes a polypeptide that substantially retains a biological function or activity. The deposit referred to herein relates to the international recognition of the deposit of microorganisms in patent proceedings. Will be kept under the terms of the Plague Treaty. These deposits are simply It is provided as a convenience and is deposited with 35 USC. Required under §112 Does not acknowledge that Polynucleotides contained in the deposited material The sequence of the peptide, and also the amino acid sequence of the polypeptide encoded thereby. The columns form part of the present specification and are inconsistent with the description of any of the sequences herein. Whenever we check, we check. Manufacture, use, or sell the deposited material License may be required, and such a license is granted here. Absent. The present invention further relates to the predicted amino acids of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). An amino acid sequence having an acid sequence or encoded by the deposited cDNA Polypeptides, and also fragments of such polypeptides, For analogs and derivatives. The polypeptides of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) or deposited When referring to a polypeptide encoded by a cDNA, "fragments", " The terms "derivative" and "analog" refer substantially to such polypeptides. Polypeptides that retain the same biological function or activity are meant. Therefore, Ana The log contains information on the activation of the mature protein by activating it by cleaving the protein part. Includes protein that can produce the lipopeptide. The polypeptide of the present invention may be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide. It may be a polypeptide, preferably a recombinant polypeptide. The polypeptides of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) or deposited Fragments, derivatives or analogs of the polypeptide encoded by the cDNA The log shows that (i) one or more amino acid residues are homologous or non-homologous amino acids. Residue (preferably the same type of amino acid residue), and The amino acid residue may be one encoded by the genetic code, or (Ii) substitution at one or more amino acid residues Or (iii) the mature polypeptide is one half of the polypeptide. Other compounds, such as compounds that increase life (e.g., polyethylene glycol) Or (iv) leader or secretory sequence, or mature Such as the sequence used to purify the polypeptide, or the protein sequence Alternatively, additional amino acids may be fused to the mature polypeptide. Like that Fragments, derivatives and analogs are within the scope of those skilled in the art from the teachings herein. Seems to be within. The polypeptides and polynucleotides of the invention are provided in an isolated form Preferably, it is purified to homogeneity. The term "isolated" refers to the substance that is in its original environment (e.g., If present, it has been removed from the natural environment). For example, living A naturally occurring polynucleotide or polypeptide in an animal is isolated But not isolated from some or all of the co-existing substances in the natural system The same polynucleotide or polypeptide has been isolated. Such a polynucus The leotide can be part of a vector and / or such a polynucleotide Or polypeptide can be part of the composition, and such vectors or The composition is still isolated in that it is not part of its natural environment. The present invention also relates to a vector containing the polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention. Genetically engineered host cells and recombinant techniques for polypeptides of the invention It also relates to manufacturing by. The host cell may be, for example, a cloning vector or an expression vector. Genetically engineered (transduced or transduced) with the vectors of the invention Formed or transfected). The vector is, for example, a plasmid. It can be in the form of a sumid, virus particle, phage, and the like. The engineered host cells Activating the promoter, selecting a transformant, or Ckβ-11 or Or in a conventional nutrient medium modified to be suitable for amplifying the Ckα-1 gene. Can be nourished. Culture conditions such as temperature, pH, etc. are selected for expression. The culture conditions previously used for the selected host cells and will be apparent to those skilled in the art. The polynucleotides of the present invention can be used to produce peptides by recombinant techniques. can do. Thus, for example, the polynucleotide can be expressed as a polypeptide. The expression vector can be included in any one of a variety of expression vectors. That Such vectors include chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences, eg, SV4 0 derivative; bacterial plasmid; phage DNA; baculovirus; yeast plus Mid; a vector obtained from the combination of a plasmid and phage DNA; Virus DNA such as a, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies Is included. However, any other vector is not capable of replicating in the host. And can be used as long as it is viable. The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various methods. General The DNA sequence may be converted to a suitable restriction endonuclease moiety by methods known in the art. Insert in place. Such and other methods are deemed to be within the purview of those skilled in the art. It is. The DNA sequence of the expression vector can be operated with an appropriate expression control sequence (promoter) To cause mRNA synthesis. As a representative example of such a promoter, These include: LTR or SV40 promoter,E. coli. lacMa Ortrp, Phage lambda PLPromoters and prokaryotic or eukaryotic cells or Other promoters known to control gene expression in those viruses Tar. Expression vectors also provide a ribosome binding site for translation initiation and transcription termination. Including concessions. The vector may also include appropriate sequences for amplifying expression. In addition, the expression vector may be a dihydrofolate reductor for eukaryotic cell culture Such as resistance to tase or neomycin, orE.coliThen Tetra Rhino Transformed host cells, such as culin or ampicillin resistance One or more selectable to provide a phenotypic trait for cell selection It preferably contains a marker gene. Suitable DNA sequences as described above, and also suitable promoters or Using the vector containing the control sequence to transform a suitable host, It can allow the host to express the protein. Representative examples of suitable hosts include the following:E.coli,Streptomyc es ,Salmonella typhimuriumBacterial cells such as; fungal cells such as yeast ;Drosophila S2andSpodoptera Sf9Insect cells such as: CHO Animal cells, such as COS or Bowes melanoma; adenovirus; Object cells, etc. Selection of an appropriate host is within the skill of the art in light of the teachings herein. Seem. In particular, the present invention also includes one or more of the sequences broadly described above. Also included are recombinant constructs consisting of The construct may have the sequence of the invention forward or reverse. A vector, such as a plasmid or viral vector, inserted at Comprising. In a preferred aspect of this embodiment, the construct further comprises, for example, It comprises control sequences, including a promoter operably linked to the sequence. suitable Many different vectors and promoters are known to those of skill in the art and are commercially available . The following vectors are given as examples. For bacteria: pQE70, pQE60, pQE-9 ( Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH 46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pD R540, pRIT5 (Pharmacia). For eukaryotes: pWLNEO, pSV2CAT , POG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, p SVL (Pharmacia). However, no other plasmid or vector As long as they are replicable and viable in the host, they can be used. The promoter region is a CAT (chloramphenicol transferase) vector. Using any vector with a vector or a selection marker, You can choose from children. Two suitable vectors are PKK232-8 and And PCM7. Individually named bacterial promoters include lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PLAnd trp. Eukaryotic promoters , CMV immediate early, HSV thymidine kinase, early and later SV40, LTR from retrovirus, and mouse metallothionein- I. Selection of appropriate vectors and promoters is well within the skill of the artisan. Within the range of the bell. In a further aspect, the present invention relates to a host cell comprising the above-described construct. The inn Primary cells are higher eukaryotic cells such as mammalian cells, lower eukaryotic cells such as yeast cells Or the host cell can be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell. Building Transfection of host cells with calcium phosphate transfection, DEAE-de By kisstran-mediated transfection or electroporation be able to. (Davis, L., Dibner, M., Battey, L., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). Encoded by the recombinant sequence using the construct in the host cell in the usual manner Gene products can be produced. Alternatively, the polypeptide of the invention may be It can be produced synthetically by a conventional peptide synthesizer. Mature proteins can be obtained from mammalian cells, yeast, or bacteria under the control of appropriate promoters. , Or in other cells. Such proteins A cell-free translation system is also required for production using RNA obtained from the light DNA construct. Also can be used. Cloni suitable for use in prokaryotic and eukaryotic hosts And expression vectors are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborato. ry Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, New York, (1989). And this disclosure forms a part of the present specification. Transcription of a DNA encoding a polypeptide of the present invention by higher eukaryotes may be It is increased by inserting a Hanser sequence into the vector. Enhancers are professional DNA, usually about 10 to 300 bp, that acts on the motor to increase its transcription Is a cis-acting element. Examples include the late side of the replication origin of bp 100-270. SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer Sir, polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus Suenhansa included. Typically, recombinant expression vectors contain an origin of replication, and a host cell Selectable markers that allow for animation, such asE.coliThe Ampicily Resistance gene andS. cerevisiae Inversion of the TRP1 gene and downstream structural sequences Includes promoters derived from highly expressed genes to drive transcription Will be. Such promoters are, inter alia, 3-phosphoglycerate Glycolytic enzymes such as PGK, α-factor, acid phosphatase, It can be obtained from an operon that encodes a protein. Heterologous structure The construction sequence may include translation initiation and termination sequences, and preferably Cooperates with a leader sequence capable of directing secretion into the periplasmic space or extracellular medium Then, it is constructed in an appropriate phase. Optionally, the heterologous sequence is Providing desired properties, such as stabilization of the expressed recombinant product or simplified purification. A fusion protein containing the N-terminal identification peptide can be encoded. Expression vectors useful for use in bacteria include those encoding the desired protein. The synthetic DNA sequence, along with the appropriate translation initiation and termination signals, is combined with a functional promoter. Constructed by insertion into an operable reading phase having a That The vector may be used to ensure the maintenance of the vector and, if desired, the host. One or more phenotypic selectable markers to confer amplification within And a replication origin. Source suitable for transformation Nuclear hosts include:E.coli,Bacillus subtilis,Salmonella typhimurium,and Various species within the genus Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus Although species are included, others can also be used as selection agents. As a representative, but non-limiting example, vectors useful for use in bacteria are Genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC37017) Selectable markers and bacterial clones derived from commercially available plasmids A manufacturing start point. Such commercially available vectors include, for example, pKK2 23-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and pGE M1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) is included. These pBR3 Combining 22 "bone nuclei" with an appropriate promoter and the structural sequence to be expressed Let Transform an appropriate host strain and set the host strain at the appropriate cell density. After growth, the selected promoter is replaced by an appropriate method (e.g., temperature shift). Or chemical induction) and the cells are cultured for an additional period. Cells are generally harvested by centrifugation and by physical or chemical methods Break down and retain the resulting crude extract for further purification. Microbial cells used for protein expression may be subjected to freeze-thaw cycles, sonication Destroyed by any conventional method, including mechanical disruption or use of cell lysing agents Yes, such methods are well known to those skilled in the art. Various mammalian cell culture systems are also used to express recombinant proteins can do. Examples of mammalian expression systems include Gluzman, Cell, 23: 175. (1981), COS-7 line of monkey kidney fibroblasts, And other cell lines capable of expressing compatible vectors, such as C12 7, 3T3, CHO, HeLa and BHK cell lines are included. Mammalian expression vectors The promoter is the origin of replication, the appropriate promoter and enhancer, and any Necessary ribosome binding sites, polyadenylation sites, splice donors and It should also not contain sceptor sites, transcription termination sequences, and non-transcribed sequences 5 'adjacent. Will be. DNA sequence obtained from SV40 splicing, Denenylation sites can be used to provide the required non-transcribed genetic elements. The polypeptide is prepared by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, Or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography -, Hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, Hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography Can be harvested from recombinant cell culture and purified. You. Complete the protein regeneration step and the mature protein configuration, if necessary Can be used to Finally, high performance liquid chromatography (HP LC) can be used for final purification steps. The polypeptide of the present invention may be a naturally purified product or a product of a chemical synthesis method. Or from prokaryotic or eukaryotic hosts (e.g., bacteria, (By mother, higher plant, insect and mammalian cells) Can be. Depending on the host used in the recombinant production method, the polypeptide of the present invention, Can be glycosylated or not glucosylated. Polypeptide of the invention Can also include the first methionine amino acid residue. The polynucleotides and polypeptides of the present invention are useful for treating and treating human diseases. And can be used as research reagents and substances for discovery of diagnostics. Human chemokine polypeptides are complementary during cancer chemotherapy and for leukemia. As a protective treatment, used to inhibit bone marrow stem cell colony formation Can be. The human chemokine polypeptide is also characterized by keratinocyte hyperproliferation. Used to inhibit epidermal keratinocyte proliferation as a treatment for psoriasis You can also. The human chemokine polypeptide can also be a host defense cell, eg, a cytotoxic T cell. By stimulating the invasion and activation of cells and macrophages, It can also be used to treat solid tumors by inhibiting the angiogenesis of Wear. They are also resistant to chronic and acute infections, such as the attraction of bactericidal leukocytes. And to increase host defense against mycobacterial infection by activation You can also. The human chemokine polypeptide is also a T cell-mediated autoimmune disease And T cell proliferation by inhibiting IL-2 biosynthesis for the treatment of lymphocytic leukemia Can also be used to inhibit Ckβ-11 and Ckα-1 also clear debris, Medium due to the recruitment of inflammatory cells that promotes lost connective tissue and excess TGFβ. It can also be used to stimulate wound healing by controlling mediated fibrosis. Wear. In the same way, Ckβ-11 and Ckα-1 can also be used for cirrhosis, It can be used to treat other fibrotic disorders, including arthrosis and pulmonary fibrosis. Can also be. The human chemokine polypeptide may also be used in schistosomiasis, trichinosis and ascariasis. Has the distinctive function of killing parasite larvae that invade tissues Also increases the presence of eosinophils. They also regulate the activation and differentiation of various hematopoietic progenitors. Release mature leukocytes from the bone marrow after chemotherapy to regulate hematopoiesis, for example To Can also be used for The polynucleotide, and encoded by such a polynucleotide Polypeptides can also be used in scientific research, in the synthesis of DNA, and in the production of DNA vectors. For in vitro purposes and for the treatment of human diseases. It can also be used to design diagnostics and diagnostics. A full-length Ckβ-11 or Ckα-1 gene fragment is a full-length fragment. High sequence similarity or similarity to CDNA library to isolate other genes with similar biological activity Can be used as a hybridization probe for This species Class probes typically have at least 20 bases. Preferably, however, the The probe has at least bases and typically does not exceed 50 bases, They may have a larger number of bases. The probe is also full length Transcripts and genomic clones, or regulatory and promoter regions, exo Corresponding to the clone containing the complete gene, including the clones and introns It can also be used to identify NA clones. An example of screening is By synthesizing an oligonucleotide probe using a known DNA sequence, Isolating the coding region of the gene. Complementary to the sequence of the gene of the present invention Labeled oligonucleotide having a specific sequence can be used for human cDNA and genomic DNA. Or use it to screen libraries of mRNA Determine to which member of the tree the probe hybridizes. The present invention also relates to the presence of mutations in the Ckβ-11 or Ckα-1 nucleic acid sequence. Part of a diagnostic assay to detect related diseases or susceptibility to the disease The use of the Ckβ-11 or Ckα-1 gene as Such a disease Diseases, such as tumors and cancers, are associated with under-expression of human chemokine polypeptides. is there. Individuals with mutations in the Ckβ-11 or Ckα-1 gene vary. It can be detected at the DNA level by various techniques. Diagnostic nucleic acids are It can be obtained from cells, for example, from blood, urine, saliva, tissue biopsy and autopsy material. Wear. Genomic DNA can be used directly for detection or prior to analysis Utilizing PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)) Thereby, amplification can be performed enzymatically. RNA or cDNA also Can be used for the same purpose. For example, Ckβ-11 or Ckα-1 Using PCR primers complementary to the nucleic acid to be loaded, Ckβ-11 or Ckα -1 mutations can be identified and analyzed. For example, deletions and insertions are normal Can be detected by a change in the size of the amplified product relative to the genotype You. Point mutations indicate that the amplified DNA is radioactively labeled Ckβ-11 or Ckα-1. RNA or, alternatively, the radiolabeled Ckβ-11 or Ckα-1 Can be identified by hybridizing to the DNA sequence. completely The mating sequences are due to RNase A digestion or due to differences in melting temperatures. It can be distinguished from unpaired duplexes. Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed on gels with or without denaturing agents. Achieved by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments at room temperature be able to. Small sequence deletions and insertions can be visualized by high-resolution gel electrophoresis. Wake up. The various sequences of the DNA fragment are It can be distinguished by denaturing the radiant gel. The mobility of the fragments depends on their specific or partial melting temperature Are delayed at various positions in the gel (see, eg, Myers et al., Science, 230 : 1242 (1985)). Sequence changes at specific positions may also affect nucleic acids such as RNase and S1 protection. It can be demonstrated by a creatase protection assay, or a chemical cleavage method (e.g. Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401 (1985)). Therefore, the detection of a specific DNA sequence is based on the hybridization of genomic DNA. RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing, or the use of restriction enzymes ( For example, restriction fragment length polymorphism (RFLP)) and Southern blotting. It can be accomplished in such a way. In addition to more traditional gel electrophoresis and DNA sequencing, the mutations also It can also be detected by situ analysis. The present invention also provides for overexpression of the protein relative to a normal control tissue sample. To detect a disease, or susceptibility to a disease, for example, the presence of a tumor As a result, Ckβ-11 or Ckα-1 protein levels in various tissues It also relates to diagnostic assays for detecting bell changes. In samples obtained from the host Used to detect Ckβ-11 or Ckα-1 protein levels in Assays are well known to those skilled in the art and include radioimmunoassays, competitive binding assays, Western blot analysis, ELISA assays, and "sandwich" assays Is included. ELISA assays (Coligan et al., Current Protocols in Immun) ology, 1 (2), Chapter 6, (1991)), firstly, Ckβ-11 or Preparation of an antibody specific to Ckα-1 antigen, preferably a monoclonal antibody Comprising. In addition, reporter antibodies were prepared against that monoclonal antibody. To make. Radioactivity, fluorescence, or, in this example, horseradish Attach a detectable reagent, such as a luoxidase enzyme. Host sample Solid support that binds proteins in the sample, e.g., polystyrene. Incubate on a ren dish. Then a non-specific tamper, such as BSA Free protein on the plate by incubating with Cover all binding sites. Next, the monoclonal antibody is incubated in the dish. In the meantime, the monoclonal antibody is Binds to Ckβ-11 or Ckα-1 protein. Monochrome not combined Wash out all null antibodies with buffer. Reporter bound to horseradish peroxidase When the reporter antibody is immediately placed on the dish, the reporter antibody, Ckβ-11 or Ckα-1 Binding to all the monoclonal antibodies bound to. Then do not join Wash off the reporter antibody. The peroxidase substrate is then added to the dish and The amount of color generated at a fixed time, when compared to a standard curve, is It is a measure of the amount of Ckβ-11 or Ckα-1 protein present in the volume. Competition assays can be used, where Ckβ-11 or Ckα-1 Is bound to a solid support and labeled with Ckβ-11 or Ckα-1. And the sample obtained from the host is passed over a solid support, for example, by liquid scintillation. The amount of label detected by filtration chromatography is determined by the amount of Ckβ- 11 or Ckα-1. "Sandwich" assays are similar to ELISA assays. "Sandwich In the "h" assay, Ckβ-11 or Ckα-1 is passed over a solid support, The antibody is bound to the solid support. Then, the second antibody was added to Ckβ-11 or Binds to Ckα-1. Immobilize a third antibody that is labeled and specific for the second antibody. After passing over the shape carrier and binding to the second antibody, the amount can be quantified . The present invention provides a method for identifying a receptor for a human chemokine polypeptide. . The gene encoding the receptor can be prepared by a number of methods known to those of skill in the art, for example, Can be identified by ligand panning and FACS sorting (Coligan Et al., Current Protocols in Immun., 1 (2), Chapter 5, (1991)). Like Alternatively, expression cloning is used, in which polyadenylated RNA is Live cDNA prepared from this RNA, prepared from cells that respond to the peptide The rally is divided into pools and COS cells or other cells that do not respond to the polypeptide. Used to transfect vesicles. Grown on glass slides, The transfected cells are exposed to a labeled polypeptide. The polypeptide is Includes recognition sites for iodinated or site-specific protein kinases Can be labeled by various methods. For fixation and incubation Subsequently, the slide is subjected to autoradiographic analysis. Identify positive pools To prepare subpools and use iterative subpooling and rescreening methods. Transfected again and ultimately encodes a putative receptor. To obtain a single clone. Another method for identifying receptors is to attach the labeled polypeptide to the cell membrane Extracting preparations that bind by affinity or that express the receptor molecule it can. X-ray film of cross-linked substances separated by PAGE analysis Expose to The labeled complex containing the polypeptide receptor is excised and the peptide fragment And subjected to protein microsequencing. Micro distribution Using the amino acid sequence obtained from the sequencing, a set of degenerate oligonucleotide Design lobes, screen cDNA libraries and estimate putative acceptance Genes encoding the body will be identified. The present invention provides agonists and agonists for the human chemokine polypeptides of the present invention. Methods are provided for screening compounds to identify antagonists. An agonist is a compound having a biological function similar to that of the polypeptide, Antagonists block such functions. Polypeptides of the invention The cells that are chemoattracted by the slip are transferred to a thin enough diameter (about 5 μm) to allow the cells to pass through. By placing it on top of a perforated filter, chemotaxis can be assayed. Wear. Add the solution of the potential agonist to the upper compartment ) Is placed at the bottom of the chamber containing the appropriate control medium. Cells moving into or through a porous membrane over time It is measured by counting. When assaying for antagonists, the human chemokine polypeptides of the invention Place the tide at the bottom of the chamber and add a potential antagonist to Determine whether the chemotaxis of the cells is impaired. Alternatively, a mammal expressing a receptor for the polypeptide in the presence of the compound The cell or membrane preparation is combined with a labeled human chemokine polypeptide, e.g., radioactivity. Incubate. The ability of the compound to block this interaction is then measured. Can be specified. When assaying for agonists in this manner, human There is no mokine polypeptide and the agonist itself interacts with the receptor. Capability can be measured. Examples of potential Ckβ-11 and Ckα-1 antagonists include antibodies, In some cases, oligonucleotides that bind to the polypeptide are included. Another example of a potential antagonist is the negative dominant burst of a polypeptide. It is a mutant. Negative dominant mutant binds to receptor for wild-type polypeptide But does not possess biological activity. Antisense constructs made using antisense technology are also potential Certain antagonists. Using antisense technology, triple helix formation or Can regulate gene expression by antisense DNA or RNA , Both methods rely on the binding of a polynucleotide to DNA or RNA. Good. For example, a polynucleotide sequence encoding a mature polypeptide of the invention. Using the 5 'coding portion, an antisense RNA oligonucleotide of about 10-40 base pairs in length is used. Design gonucleotides. DNA oligonucleotides are Designed to be complementary to the child region (triple helix-Lee et al., Nucl. es., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (19). 88); and Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)). That prevents transcription and production of the human chemokine polypeptide. A Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo. Soybean to block translation of mRNA molecule into polypeptide (antisense -Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotid. es as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). The above oligonucleotides can also be delivered to cells. Therefore, expressing antisense RNA or DNA in vivo, It can inhibit the production of a human chemokine polypeptide. Another potential human chemokine antagonist loses biological function Nevertheless, it nevertheless recognizes and binds to the receptor for the polypeptide. The polypeptide that effectively blocks its receptor. Or a peptide derivative of a polypeptide that is a synthetically modified analog . Examples of peptide derivatives include, but are not limited to, small peptides Or peptide-like molecules. The antagonists are useful for certain autoimmune diseases and chronic inflammatory diseases and infectious diseases , Macrophages and their precursors, and neutrophils, basophils, B lymphocytes and some T cell subsets, such as activated and CD8 cells To inhibit chemotaxis and activation of cytotoxic T cells and natural killer cells Can be used. Examples of autoimmune diseases include multiple sclerosis and insulin. Independent diabetes mellitus is included. The antagonist may also inhibit mononuclear phagocyte recruitment and activation by To treat infections, including, silicosis, sarcoidosis, and idiopathic pulmonary fibrosis It can also be used for They also interfere with eosinophil production and migration. It can also be used to treat idiopathic hypereosinphilic syndrome. Inside Toxic shock is also associated with macrophage migration and the human chemokine import of the present invention. Treating with the antagonist by preventing the production of the repeptide Can be. The antagonists may also prevent monocyte infiltration in the arterial wall, thereby It can also be used to treat loam atherosclerosis. The antagonists also include chemokine-induced mast cells as well as By inhibiting degranulation of base spheres and release of histamine, histamine Allergic reactions mediated and late phase allergic reactions Used to treat immunological disorders, including measles and atopic dermatitis You can also. Ig, such as allergic asthma, rhinitis, and eczema E-mediated allergic reactions can also be treated. The antagonist also inhibits the attraction of monocytes to the wound area, thereby And can also be used to treat acute inflammation. They are also chronic And acute inflammatory lung disease are associated with mononuclear phagocytic bone formation in the lung Thus, it can also be used to regulate the number of macrophages in normal lung. Antagonists may also prevent the attraction of monocytes into synovial fluid in patient joints. And can also be used to treat rheumatoid arthritis. Monocyte flow Entry and activation play important roles in the pathogenesis of both degenerative and inflammatory arthritis Carry. The antagonists may also interfere with the biosynthesis of other inflammatory cytokines, primarily Used to prevent deleterious cascades caused by IL-1 and TNF You can also. In this way, the antagonist is also used to prevent inflammation. Can also be used. The antagonist is also induced by a chemokine, It can also be used to block fever independent of prostaglandins. The antagonists are also useful in diseases of bone marrow failure, such as aplastic anemia and spinal cord. It can also be used to treat myelodysplastic syndrome. The antagonists also prevent eosinophil accumulation in the lungs, thereby reducing asthma and And can also be used to treat allergies. The antagonist is It can also be used to treat subepithelial basement membrane fibrosis, a hallmark of asthmatic lungs. Can also be. The antagonist may also be a pharmaceutically acceptable carrier, such as those described below. With such carriers, they can also be used in compositions. The human chemokine polypeptides and agonists and antagonists are suitable. It can be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier. Such compositions are cured A therapeutically effective amount of the polypeptide, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. I mean. Such carriers include, but are not limited to, saline , Buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and These combinations are included. The formulation should suit the mode of administration. The present invention also relates to one or more of the components of the pharmaceutical composition of the present invention, Pharmaceutical packs or kits comprising one or more containers are also provided. So Manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products in connection with containers such as Notifications may be given in the form prescribed by the regulatory authorities, which may Represents the approval of the appropriate department for manufacture, use or sale for administration to a healthcare professional. further , The polypeptides and agonists and antagonists can be combined with other therapeutic compounds. Can be used together. The pharmaceutical composition may be topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, subcutaneous, intranasal or Can be administered in any convenient way, such as by the intradermal route. The pharmaceutical composition Is administered in an amount effective to treat and / or prevent the particular indication. one Generally, the polypeptide is administered in an amount of at least about 10 μg / kg (body weight), Often they are administered in an amount not to exceed about 8 mg / kg (body weight) per day Will. Most often, taking into account the route of administration and the symptoms, etc., the dosage is every It is about 10 μg / kg to about 1 mg / kg (body weight) per day. The human chemokine polypeptide, and an agonist that is a polypeptide or Antagonists are such polypeptids, often referred to as “gene therapy”. The in vivo expression of the tides can be used according to the present invention. Thus, for example, a patient-derived cell can be used to encode a polypeptide ex vivo. After the manipulation with the polynucleotide (DNA or RNA) to be Give to the patient to be treated with the peptide. Such methods are well-known in the art. For example, a retroviral particle containing RNA encoding the polypeptide of the present invention. Through use, cells can be manipulated by methods known in the art. Similarly, polypeptides can be used in vivo, for example, by methods known in the art. The cells can be manipulated in vivo for different expression. Known in the industry As has been described, cells are treated in vivo to convert the polypeptide in vivo. Containing RNA encoding the polypeptide of the present invention for expression in Producer cells for producing rovirus particles can be administered to a patient. That These and other methods for administering the polypeptides of the invention by such methods and others Will be apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention. For example, manipulate cells Expression vehicles for use include those other than retroviruses, for example, a suitable delivery vehicle. Once combined with the cells, they can be used to manipulate cells in vivo. Adenovirus that can be used. The sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. Individual sequencing of the sequence Specifically targeted to specific locations on the body and allowed to hybridize. Wear. Moreover, there is currently a need to identify specific sites on the chromosome. Actual distribution Chromosome marking reagents based on column data (repeated polymorphisms) currently Hardly available to mark. The mapping of DNA to chromosomes according to the invention Ping is an important first step in relating those sequences to genes associated with the disease. is there. Briefly, PCR primers derived from cDNA (preferably 15-25 bp) Can be mapped to a chromosome. 3 'untranslated territory Computerized analysis of one or more exons in genomic DNA Complicates the amplification process by quickly selecting primers that do not span And These primers are then transferred to somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Used for PCR screening of lid. The human gene corresponding to the primer Only those hybrids that will give the amplified fragment . PCR mapping of somatic cell hybrids returns specific DNA to specific chromosomes. A quick way to belong. Using the same oligonucleotide primer Utilizing the present invention, sublocalization can be performed on specific chromosomes or large Achieved in a similar manner using a panel of fragments from a pool of genomic clones can do. Others that can be similarly used to map to that chromosome Methods include in situ hybridization and labeled flow-sourcing. Pre-screening using chromosomes (flow-sorted) Hybridization to construct a heterologous cDNA library Includes selection. Fluorescence of cDNA clones to metaphase chromosomal spreads in situ hybridization Chromosome location (FISH) can provide accurate chromosome locations in one step You. This technique can be used with cDNAs as short as 500 or 600 bases. Yes, but larger clones have sufficient signal intensity for easy detection It is likely to bind to a unique chromosomal location with FISH, EST obtained Requires the use of a clone, and the longer the better. For example, 2,000 0 bp is good, 4,000 is better, and more than 4,000 is probably Not necessary to get good results at a reasonable time rate. A review of this technique includes Verma Et al, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Pre ss, New York (1988). Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical Locations can be associated with genetic map data. Such data, for example, For example, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins Univ (available online via ersity Welch Medical Library) It is. Next, the relationship between a gene mapped to the same chromosomal region and a disease is determined. Confirmed by binding analysis (coinheritance of physically adjacent genes) . Next, the cDNA or genotype between affected and unaffected individuals is determined. It is necessary to determine the differences in the sequence. The mutation is in some or all of the affected individuals If not found in any normal individual, Mutations appear to cause disease. Currently, analysis of physical and genetic mapping suggests that CDNAs localized correctly in chromosomal regions represent 50-500 possible causative sources. It could be one of the genes. (This is a 1-megabase mapping analysis and And one gene per 20 kb). Polypeptides, their fragments or other derivatives, or their Use analogs, or cells that express them, as immunogens to treat them Antibodies can be produced. These antibodies are, for example, polyclonal or Can be a monoclonal antibody. The invention also includes chimeric, single chain, and human Of Activated Antibodies, and also Fab Fragments, or Fab Expression Libraries Things are also included. Various methods known in the art may be used to identify such antibodies and fragments. Can be used in the manufacture of Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention are polypeptides The polypeptide directly into the animal, or the polypeptide into the animal, preferably a human. It can be obtained by administering to non-animal animals. Then, like that The resulting antibody will bind to the polypeptide itself. In this way, Even sequences that encode only fragments of the polypeptides can be completely native polypeptides. It can be used to produce antibodies that bind tide. Then such Using antibodies to isolate a polypeptide from a tissue that expresses the polypeptide be able to. Monoclonal antibodies are prepared using anti-cells produced by continuous cell line culture. All body giving techniques can be used. Examples include hybridoma technology (Ko hler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), trio ー Trioma technology, human B-cell hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immun ology Today 4:72), and EB for producing human monoclonal antibodies V-Hybridoma technology (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and C ancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Techniques described for the production of single chain antibodies (U.S. Pat. No. 4,946,778) Is suitable for producing single chain antibodies against the immunogenic polypeptide products of the invention. obtain. In addition, the transgenic mice can be used to transform the immunogenic polypeptides of the invention. Humanized antibodies to the repeptide product can be expressed. The present invention is further described with reference to the following examples; however, the present invention It should be understood that the present invention is not limited to a specific embodiment. All parts or quantities are special Units are by weight unless otherwise noted. In order to facilitate understanding of the following examples, some frequently occurring methods and / or Or describe the term. “Plasmids” are preceded by a lower case p and / or And / or indicated by numbers. The starting plasmids herein are commercially available, limited Publicly available on an unspecified basis or obtained by published methods Can be constructed from possible plasmids. Plus, equivalent to the described plasmid Mids are known in the art and will be apparent to those skilled in the art. “Digestion” of DNA involves touching it with a restriction enzyme that acts only on certain sequences in the DNA. Indicates that the medium is cut. Various restriction enzymes used herein are commercially available. , Their reaction conditions, cofactors and other requirements are known to those skilled in the art. Used for For analytical purposes, typically 1 μg of plasmid in about 20 μl of buffer solution is used. Or a DNA fragment is used with about 2 units of enzyme. Plasmid construction For the purpose of isolating DNA fragments for 5 to 50 μg of DNA are digested with 20 to 250 units of enzyme. For certain restriction enzymes Appropriate buffers and substrate weights are specified by the manufacturer. About 1 hour at 37 ° C Incubation times are usually used, but may vary according to the supplier's instructions. Can be. After digestion, the reaction is directly electrophoresed on a polyacrylamide gel. , Desired Is isolated. Size separation of the cleaved fragments is described by Goeddel, D et al., Nucleic Acids Re. s., 8: 4057 (1980). Perform using a gel. An “oligonucleotide” is a single-stranded polydeoxy that can be chemically synthesized. 2 shows a xynucleotide, or two complementary polynucleotide chains. like that Since synthetic oligonucleotides do not have a 5 'phosphate, the presence of kinases In the presence, without adding a phosphate with ATP, to another oligonucleotide Will not ligate. Synthetic oligonucleotides are not dephosphorylated Will ligate to the new fragment. "Ligation" refers to the phosphodiester between two double-stranded nucleic acid fragments. (Maniatis, T. et al., Ibid., P. 146). Especially saying Unless otherwise described, ligation should be performed on most of the DNA fragments to be ligated. With 10 units of T4 DNA ligase ("ligase") per 0.5 μg of equimolar amount Can be accomplished using known buffers and conditions. Unless otherwise stated, transformations were performed by Graham, F. and Va. n der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973). I went as it was. Example 1 Bacterial expression and purification of Ckβ-11 First, the DNA sequence encoding Ckβ-11, ATCC No. 75948, The 5 'and 3' end sequences of the processed Ckβ-11 nucleic acid sequence ( PCR oligonucleotide primers corresponding to And amplify. Each additional nucleotide corresponding to the Ckβ-11 gene was 5 ′ And 3 ′ terminal sequence. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence: And encodes the SphI restriction enzyme site (printed in bold), followed by the mature protein Nucleotide Ckβ-11 coding sequence starting from the second nucleotide of the sequence Includes columns (underlined type). The ATG codon is included in the SphI site. ATG In the next codon following the first base is from the SphI site and the remaining two The bases are the second and third of the first codon (residue 18) of the putative mature protein. Corresponds to the first base. 3 'sequence: Is the sequence complementary to the BamH1 site (bold print) followed by the stop codon Contains a gene-specific sequence of 18 nucleotides. The restriction enzyme site is At the restriction site on the current vector pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). Corresponding. pQE-9 is resistant to antibiotics (Ampr), Bacterial origin of replication (ori), IP TG-regulatable promoter operator (P / O), ribosome binding site (R BS), a 6-His tag and a restriction enzyme site. Next, pQE-9 is converted to S Digest with phI and BamH1. Ligating the amplified sequence to pQE-9 , Together with the sequence encoding the histidine tag and RBS. Then Using the ligation mixture, Sambrook, J. et al. Et al., Molecular Clo ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989) )E. coli.Strain M15 / rep4 (Qiagen, Inc.) Transform. M15 / rep4 contains multiple copies of plasmid pREP4 This expresses the lacI repressor and is also resistant to kanamycin (Kanr) I can. Transformants were identified by their ability to grow on LB plates , Select ampicillin / kanamycin resistant colonies. Plasmid DNA Separate and confirm by restriction analysis. Colonies containing the desired construct are selected for Amp (10 Overnight in liquid culture in LB medium supplemented with both 0 ug / ml and Kan (25 ug / ml) (O / N). Using the O / N culture, a large culture system can be used at 1: 100- Seeding at a ratio of 1: 250. Cells were grown at an optical density of 600 between 0.4 and 0.6 (OD6 00 ). Next, IPTG ("isopropyl-BD-thiogalactopi Lanosides ") are added to a final concentration of 1 mM. IPTG is lacI Induction of P / O is induced by inactivation of Increase. The cells are grown for an additional 3-4 hours. The cells are then centrifuged. Collect more. The cell pellet is treated with the chaotropic agent 6 mol of guanidine HC. Solubilize in lpH 5.0. After clarification, the solution contains a 6-histidine tag Under conditions that allow strong binding by the protein, a nickel-chelate column Purified solubilized Ckβ-11 by chromatography (Hochuli, E. . J. et al. Chromatography 411: 177-184 (1984)). 6M Ckβ-11 (purity> 98%) in anidine HCl is eluted from the column. GnHCl Regeneration of proteins from can be achieved by several protocols (Jaenicke, R. and Rudolph, R., Protein Structure-A Practical Ap. proach, IRL Press, New York (1990)). First of all, stage dialysis Utilizing to remove GnHCL. Alternatively, isolated from a Ni-chelate column The purified protein to be purified is reduced to a second color through a reduced linear GnHCL gradient. System. Regeneration while binding the protein to the column After running, 250 mM imidazole, 150 mM NaCl, 25 mM Tris- Elute with a buffer containing HCl (pH 7.5) and 10% glycerol. Finally Soluble protein against a storage buffer containing 5 mM ammonium bicarbonate. Dialyze. Example 2 Bacterial expression and purification of Ckα-1 First, the DNA sequence encoding Ckα-1, ATCC No. 75947, was Of the processed Ckα-1 nucleic acid sequence (no putative signal peptide sequence) Utilizing PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' terminal sequences And amplify. Additional nucleotides corresponding to Ckα-1 were replaced at the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively. Append to the end sequence. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence: And encodes the SphI restriction enzyme site (printed in bold), followed by the mature protein 21 nucleotide Ckα-1 coding sequence starting from the second nucleotide of the sequence including. The ATG codon is included in the SphI site. In the next codon following ATG The first base is from the SphI site and the remaining two bases Corresponds to the second and third bases of the first codon (residue 23) of the mature protein . As a result, the first base at this codon will have a V al to Leu, resulting in E replacing Q in the recombinant protein. You. 3 'sequence: Is the sequence complementary to the BamH1 site (bold print) followed by the stop codon Contains a 19 nucleotide gene-specific sequence. The restriction enzyme site is At the restriction site on the current vector pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). Corresponding. pQE-9 is resistant to antibiotics (Ampr), Bacterial origin of replication (ori), IP TG-regulatable promoter operator (P / O), ribosome binding site (R BS), a 6-His tag and a restriction enzyme site. Next, pQE-9 is converted to S Digest with phI and BamH1. Ligating the amplified sequence to pQE-9 , Together with the sequence encoding the histidine tag and RBS. Then Using the ligation mixture, Sambrook, J. et al., Molecular Cloni. ng: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989) By following the steps described inE. coli. M15 / rep4 (Qiagen, Inc.) N To perform. M15 / rep4 contains multiple copies of plasmid pREP4, It expresses the lacI repressor and also has kanamycin resistance (Kanr) Also give. Transformants were identified by their ability to grow on LB plates , Select ampicillin / kanamycin resistant colonies. Plasmid DNA Separate and confirm by restriction analysis. Colonies containing the desired construct are selected for Amp (10 Overnight in liquid culture in LB medium supplemented with both 0 ug / ml and Kan (25 ug / ml) (O / N). Using the O / N culture, a large culture system can be used at 1: 100- Seeding at a ratio of 1: 250. Cells were grown at an optical density of 600 between 0.4 and 0.6 (OD6 00 ). Next, IPTG ("isopropyl-BD-thiogalactopi Lanosides ") are added to a final concentration of 1 mM. IPTG is lacI Induction of P / O is induced by inactivation of Increase. The cells are grown for an additional 3-4 hours. The cells are then centrifuged. Collect more. The cell pellet is treated with the chaotropic agent 6 mol of guanidine HC. Solubilize in lpH 5.0. After clarification, the solution contains a 6-histidine tag Under conditions that allow strong binding by the protein, a nickel-chelate column The solubilized Ckα-1 is purified by chromatography (Hochuli, E. et al.). J. Chromatography 411: 177-184 (1984)). 6M Guanidi Ckα-1 (purity> 98%) in HCl is eluted from the column. From GnHCl Protein regeneration can be accomplished by several protocols (Jaenic ke, R. and Rudolph, R., Protein Structure-A Practical Approach, IRL Press, New York (1990)). First of all, using stage dialysis , GnHCL. Alternatively, the precision isolated from the Ni-chelate column Protein to a second column through a reduced linear GnHCL gradient Can be done. After regenerating the protein while it is bound to the column , 250 mM imidazole, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl (pH Elute with buffer containing 7.5) and 10% glycerol. Finally, the soluble The protein is dialyzed against a storage buffer containing 5 mM ammonium bicarbonate. Example 3 Expression of recombinant Ckβ-11 in COS cells Expression of the plasmid, Ckβ-11 HA, is based on 1) the SV40 replication origin, Pyricin resistance gene, 3) E. coli origin of replication, 4) Polylinker region, SV4 Vector containing the CMV promoter followed by a zero intron and a polyadenylation site. Obtained from pcDNAI / Amp (Invitrogen). Complete Ckβ-11 precursor And a DNA fragment encoding an HA tag fused in frame to its 3 'end. Cloned into the polylinker region of the vector, Protein expression is directed under the CMV promoter. The HA tag is Corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly, and And R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). HA tag to target protein The fusion allows the recombinant protein to be treated with an antibody that recognizes the HA epitope. It is possible to easily detect. The plasmid construction method is described as follows: The DNA sequence encoding Ckβ-11, ATCC No. 75948, was Constructed by PCR using primers: 5 'primer Starts at the HindIII site, followed by three missing positions relative to the start codon. An 18 nucleotide Ckβ-11 coding sequence; 3 'sequence Is the sequence complementary to the XbaI site, the translation stop codon, the HA tag, and Ckβ -11 containing the last 18 nucleotides of the coding sequence (not including the stop codon) No. Thus, the PCR product has a HindIII site, a Ckβ-11 coding sequence, followed by HA tag fused in frame, translation termination stop codon next to the HA tag, and Xba I site. DNA fragment and vector amplified by PCR, pc DNAI / Amp was digested with HindIII and XbaI restriction enzymes and ligated. You. The ligation mixture was transferred to E. coli strain SURE (Stratagene Cloning S. ystems, La Jolla, CA). The resulting culture is placed on ampicillin medium plates to select for resistant colonies. Step Rasmid DNA is isolated from transformants and the presence of the correct fragment Test for restriction by restriction analysis. For expression of recombinant Ckβ-11, DEAE -Transfect COS cells with the expression vector by the DEXTRAN method (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Lab oratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Ckβ -11 HA protein expression is detected by radiolabeling and immunoprecipitation ( E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1988)). 2 days after transfection, cells To35Label with S-cysteine for 8 hours. The cell culture medium is then collected and the cells bound. Surfactant (RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS Lysis with 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris, pH 7.5)) You. (Wilson, I. et al., Supra at 37: 767 (1984)). Cell lysate and culture Both media sediment with a monoclonal antibody specific for HA. Settled tongue The protein is analyzed by SDS-PAGE. Example 4 Expression of recombinant Ckα-1 in COS cells Expression of the plasmid, Ckα-1 HA, is based on 1) the SV40 replication origin, Pyricin resistance gene, 3) E. coli origin of replication, 4) Polylinker region, SV4 0 containing the CMV promoter followed by an intron and a polyadenylation site. Obtained from the vector pcDNAI / Amp (Invitrogen). Complete Ckα-1 precursor And a DNA fragment encoding an HA tag fused in frame to its 3 'end. Cloned into the polylinker region of the vector, Protein expression is directed under the CMV promoter. The HA tag is Corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly, and And R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). HA tag to target protein The fusion allows the recombinant protein to be treated with an antibody that recognizes the HA epitope. It is possible to easily detect. The plasmid construction method is described as follows: The DNA sequence encoding Ckα-1, ATCC No. 75947, was Constructed by PCR with imer: 5 'primer Starts at the HindIII site, followed by three missing positions relative to the start codon. An 18 nucleotide Ckα-1 coding sequence; 3 'sequence Is the complementary sequence for the XbaI site, the translation stop codon, the HA tag, and Ckα. -1 contains the last 18 nucleotides of the coding sequence (not including the stop codon) . Thus, the PCR product has a HindIII site, the Ckα-1 coding sequence, followed by a box. Tag, translation termination stop codon next to the HA tag, and an XbaI site Including rank. DNA fragment and vector amplified by PCR, pcDN AI / Amp is digested with HindIII and XbaI restriction enzymes and ligated. The ligation mixture was transferred to E. coli strain SURE (Stratagene Cloning System). ms, La Jolla, CA). The nutrients are placed on ampicillin media plates to select for resistant colonies. plus Isolate the mid DNA from the transformant and ensure that the correct fragment is present. Is tested by restriction analysis. For expression of recombinant Ckα-1, DEAE-D Transfect COS cells with the expression vector by the EXTRAN method ( J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Labora tory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Ckα-1 HA Protein expression is detected by radiolabeling and immunoprecipitation (E. Harlow). , D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laborato ry Press, (1988)). Two days after transfection, remove cells35S-Sh Label for 8 hours with stain. The cell culture medium is then collected and the cells are treated with a detergent ( RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% Lyse with NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris, pH 7.5)). (Wil Son, I. et al., Ibid., 37: 767 (1984)). Both cell lysate and culture medium Both precipitate with a monoclonal antibody specific for HA. The precipitated protein is Analyze by DS-PAGE. Example 5 Using the baculovirus expression system Cloning and expression of Ckβ-11 DNA sequence encoding full-length Ckβ-11 protein, ATCC VII No. 5948, PCR oligonucleotides corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of the gene Amplify using primers. The 5 'primer has the sequence: And a BamHI restriction enzyme site (printed in bold), followed by translation in eukaryotic cells. Includes 6 nucleotides similar to the signal available to initiate translation (Kozak, M., J.M. ol. Biol., 196: 947-950 (1987)), and immediately behind this is Ckβ- The first 20 nucleotides of the 11 genes (the translation initiation codon "ATG" is underlined pull). The 3 'primer has the sequence: And a cleavage site for the restriction endonuclease Asp781, and Ckβ-1 Contains 19 nucleotides complementary to the 3 'untranslated sequence of one gene. Amplified The sequence was compared to a commercially available kit ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla). , Isolate from 1% agarose gel using Ca.). Then, the fragment After digestion with endonucleases BamHI and Asp781, 1% agaro It is then purified on a gel. This fragment is named F2. The vector pRG1 (a modification of the pVL941 vector, discussed below) was transformed into a baculo Used for expression of Ckβ-11 protein using a viral expression system (Revi Reviews include Summers, MD and Smith, GE. 1987, A manual of meth ods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555). this The expression vector is Autographa California Nuclear Polyhedrosis Russ group (AcMNPV) strong polyhedrin promoter followed by control Includes recognition sites for the restriction endonucleases BamHI and Asp781. Simianu The polyadenylation site of ls (SV) 40 is used for efficient polyadenylation. For easy selection of recombinant viruses, β-galactosidase from E. coli was used. The gene is a polyhedrin promoter followed by a polyadenylation signal of the polyhedrin gene. Insert in the same direction as the motor. Cotransfected fields Viral sequences for cell-mediated homologous recombination of live viral DNA Are adjacent on both sides of the polyhedron array. Many other baculovirus vectors, p Instead of pRG1 such as Ac373, pVL941, and pAcIM1 Could be used (Luckow, VA and Summers, MD, Virol ogy, 170: 31-39). After digesting the plasmid with the restriction enzymes BamHI and Asp78L, it is known in the art. Is dephosphorylated using calf intestinal phosphatase according to the method described above. Then, DN A was prepared using a commercially available kit ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, CA). .) To isolate from a 1% agarose gel. This vector DNA was Name it. Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were converted to T4 DNA ligase To ligate. Next, E. coli HB101 cells were transformed. , A bacterium containing a plasmid having the Ckβ-11 gene (pBac-Ckβ-11), Yeast Identification is performed using BamHI and Asp781. Cloned fragment Sequence is confirmed by DNA sequencing. Using the lipofection method, 5 μg of the plasmid pBac-Ckβ-11 was marketed. Linearized baculovirus ("BaculoGold")TMBaculovirus DNA ", P harmingen, San Diego, CA) co-transfected with 1.0 μg (Fel Gner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA, 84: 7413-7417 (198 7)). BaculoGoldTM1 μg of viral DNA and plasmid pBac-Ckβ-11 5 μg of serum-free Grace's medium (Life Technologies Inc., Gaithe) ersburg, MD) mixed in sterile wells of a microtiter plate containing 50 μl I do. Then, 10 μl of Lipofectin and 90 μl of Grace's medium were added. Add, mix and incubate at room temperature for 15 minutes. Then, transfect Transfer the mixture to a 35 mm tissue culture plate containing 1 ml of serum-free Grace's medium. Add dropwise to seeded Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711). That plate Rock back and forth to mix the newly added solution. Then, the plate Incubate at 27 ° C. for 5 hours. 5 hours later, the transfection solution Was removed from the plate and 1 ml of Grace's insect medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Add. Return the plate to the incubator and continue culturing at 27 ° C for 4 days. I can. Four days later, the supernatants were collected and as described by Summers and Smith (supra). And perform a plaque assay. As a change, "Blue Gal (Life Technologi es Inc., Gaithersburg). Thus, plaques stained blue can be easily isolated. ("Plaque A detailed description of Assays also provides a user's guide to insect cell culture, and Baculovirus distributed by Life Technologies Inc., Gaithersburg Science, pages 9-10). Four days after serial dilution, virus was added to the cells and the blue stained plate was added. The sample is taken with the tip of an Eppendorf pipette. Next, the recombinant virus The agar is resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl of Grace's medium. . The agar is removed by brief centrifugation and contains the recombinant baculovirus. The supernatant is used to infect insect Sf9 cells seeded on 35 mm dishes. 4 days later After collecting the supernatant of these culture dishes, store at 4 ° C. Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. The cells were treated with the recombinant baculovirus V-Ckβ-11 at a multiplicity of infection (MOI) of 2. Infect. Six hours later, the medium was removed and methionine and cysteine were removed. Replace with SF900 II medium without media (Life Technologies Inc., Gaithersburg) I can. 42 hours later, 5 μCi35S-methionine and 5 μCi35S Sistay 5 μCi (Amersham). The cells were incubated for a further 16 hours Later, they were collected by centrifugation and the labeled protein was purified by SDS-PAGE. And visualization by autoradiography. Example 6 Using the baculovirus expression system Cloning and expression of Ckα-1 DNA sequence encoding full length Ckα-1 protein, ATCC No. 75 No. 947, the PCR oligonucleotide probes corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene. Amplify using a primer. The 5 'primer has the sequence: And a BamHI restriction enzyme site (printed in bold), followed by translation in eukaryotic cells. Includes 6 nucleotides similar to the signal available to initiate translation (Kozak, M., J.M. ol. Biol., 196: 947-950 (1987)), and immediately behind this is Ckα- The first 20 nucleotides of one gene (the translation initiation codon "ATG" is underlined Pull). The 3 'primer has the sequence: And the restriction endonuclease Asp781 cleavage site (bold print) And 17 nucleotides complementary to the 3 'untranslated sequence of the Ckα-1 gene . The amplified sequence was converted to a commercially available kit (“Geneclean”, BIO 101 Inc., (LaJolla, Ca.) using a 1% agarose gel. Then, After digestion with the endonucleases BamHI and Asp781 Next, purify on a 1% agarose gel. Name this fragment F2 . The vector pRG1 (a modification of the pVL941 vector, discussed below) is Used for expression of Ckα-1 protein using the Ils expression system (review) Include Summers, MD and Smith, GE. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agri cultural Experimental Station Bulletin No. 1555). This expression The vector is Autographa California nuclear polyhedrosis virus Group (AcMNPV) strong polyhedrin promoter, followed by restriction Includes recognition sites for nucleases BamHI and Asp781. Simianui The polyadenylation site of Rus (SV) 40 is used for efficient polyadenylation. set To easily select the recombinant virus, the β-galactosidase gene derived from E. coli was used. The polyhedron promoter is followed by the polyhedrin gene polyadenylation signal. Insert in the same direction as the motor. Cotransfected wild Virus sequences for cell-mediated homologous recombination of type I viral DNA Adjacent to both sides of the polyhedron array. Many other baculovirus vectors are constructed using pAc Used in place of pRG1 such as 373, pVL941, and pAcIM1 (Luckow, VA and Summers, MD, Virology 170: 31-39). After digesting the plasmid with the restriction enzymes BamHI and Asp781, it is known in the art. Is dephosphorylated using calf intestinal phosphatase according to the method described above. Then, DN A was prepared using a commercially available kit ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, CA). .) To isolate from a 1% agarose gel. This vector DNA was Name it. Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were ligated with T4 DNA ligase To ligate. Next, E. coli HB101 cells were transformed. A bacterium containing a plasmid having the Ckα-1 gene (pBac-Ckα-1), Identify using BamHI and Asp781. Of the cloned fragment The sequence is confirmed by DNA sequencing. Using the lipofection method, 5 μg of plasmid pBac-Ckα-1 was commercially available. Linearized baculovirus ("BaculoGold"TMBaculovirus DNA ", Pharm ingen, San Diego, CA) with 1.0 μg (Felgne Natl. Acad. Sci. ScL USA, 84: 7413-7417 (1987). )). BaculoGoldTM1 μg of viral DNA and plasmid pBac-Ckα-15 μg of serum-free Grace's medium (Life Technologies Inc., Gaithers) burg, MD) Mix in sterile wells of a microtiter plate containing 50 μl . Then, 10 μl of Lipofectin and 90 μl of Grace's medium were added. Mix, incubate for 15 minutes at room temperature. Then, transfection Seeded in a 35 mm tissue culture plate containing 1 ml of serum-free Grace's medium To Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711). In front of that plate Shake later to mix the newly added solution. The plate is then Incubate at 5 ° C for 5 hours. Five hours later, the transfection solution was 1 ml of Grace's insect medium containing 10% fetal calf serum. I can. Return the plate to the incubator and continue culturing at 27 ° C for 4 days . Four days later, the supernatants were collected and as described by Summers and Smith (supra). And perform a plaque assay. As a change, "Blue Gal" (Life Technolo gies Inc., Gaithersburg). As a result, plaques stained blue can be easily isolated. ("Puller A detailed description of the assay can also be found in the user's guide to insect cell culture, and And Baculoyl distributed by Life Technologies Inc., Gaithersburg Science, pages 9-10). Four days after serial dilution, virus was added to the cells and the blue stained plate was added. The sample is taken with the tip of an Eppendorf pipette. Next, the recombinant virus The agar is resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl of Grace's medium. . The agar is removed by brief centrifugation and contains the recombinant baculovirus The supernatant is used to infect insect Sf9 cells seeded on 35 mm dishes. 4th Later, the supernatants of these culture dishes are collected and stored at 4 ° C. Sf9 cells are grown in Grace's medium with 10% heat-inactivated FBS. The recombinant baculovirus V-Ckα-1 was added to the cells at a multiplicity of infection (MOI) of 2. Infect. After 6 hours, the medium was removed and containing methionine and cysteine. SF900 II medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) Replace with 42 hours later, 5 μCi35S-methionine and 5 μCi35S system Add 5 μCi (Amersham). Incubate the cells for another 16 hours After that, they are collected by centrifugation and the labeled protein is purified by SDS-PAG. Visualize by E and autoradiography. In view of the above teachings, many modifications and variations of the present invention are possible, The invention may be practiced otherwise than as specifically described, within the scope of the following claims. You.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61K 48/00 AED C07K 14/52 C07K 14/52 16/24 16/24 C12N 1/21 C12N 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/68 A C12P 21/02 C12N 5/00 B C12Q 1/68 A61K 37/02 AEA //(C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:91) ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 48/00 AED C07K 14/52 C07K 14/52 16/24 16/24 C12N 1/21 C12N 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/68 A C12P 21/02 C12N 5/00 B C12Q 1/68 A61K 37/02 AEA // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12N 1/21 C12R 1:19) ( C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:91)
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