KR19990042713A - Method for preparing CDNA and recombinant LKN-1 of C 6 beta-chemokine LKN-1 isolated from human - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람의 단핵세포주(monocytic cell line)에서 분리한, C6 β-케모카인에 속하는 신규의 단백질(leukotactin-1: Lkn-1)을 암호화하는 cDNA, 그를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터를 이용하여 말초혈액 백혈구(peripheral b1ood leukocytes)의 세브셋(subsets)을 유인하는 전기 단백질의 제조방법에 관한 것이다. Lkn-1 cDNA 개방해독틀은 21개의 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드를 포함하여 총 113개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 그 중 92개의 아미노산으로 구성된 성숙 단백질의 분자량은 10,162달톤으로 추정되었다. 전기 Lkn-1 cDNA를 재조합 대장균 또는 곤충세포에서 발현시켜 순수분리한 재조합 Lkn-1은 콜로니 형성을 유의적으로 억제하고, 림프구, 단핵구, 호중구을 유인하는 화학주성을 가지며, CCR1 및 CCR3의 수용체에 결합하는 것으로 확인되었다. 이 재조합 Lkn-1 단백질은 항체 제조, HIV-1 감염시의 치료, 화학요법이나 방사선치료시의 골수 간세포 보호 및 백혈병 억제자 등에 이용할 수 있다.The present invention utilizes a cDNA encoding a novel protein (leukotactin-1: Lkn-1) belonging to C6 β-chemokine, isolated from a human mononuclear cell line (monocytic cell line), an expression vector comprising the same, an electric expression vector The present invention relates to a method for producing an electrical protein for attracting subsets of peripheral blood leukocytes. The Lkn-1 cDNA open reading frame encodes a total of 113 amino acids, including a signal peptide consisting of 21 amino acids, of which the molecular weight of the mature protein consisting of 92 amino acids is estimated to be 10,162 Daltons. Recombinant Lkn-1 purified by expressing the aforementioned Lkn-1 cDNA in recombinant E. coli or insect cells significantly inhibits colony formation, has chemotaxis that attracts lymphocytes, monocytes and neutrophils, and binds to receptors of CCR1 and CCR3. It was confirmed that. The recombinant Lkn-1 protein can be used for antibody production, treatment during HIV-1 infection, bone marrow hepatocyte protection during chemotherapy or radiation therapy, leukemia inhibitor, and the like.

Description

사람에서 분리한 C6 베타-케모카인 Lkn-1(Leukotactin-1)의 cDNA 및 재조합 Lkn-1의 제조방법.Method for producing cDNA and recombinant Lkn-1 of C6 beta-chemokine Lkn-1 (Leukotactin-1) isolated from humans.

본 발명은 사람에서 분리한 신규 C6 β-케모카인의 cDNA 및 전기 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 사람의 단핵세포주(monocytic cell line)에서 분리한, C6 β-케모카인에 속하는 신규의 단백질을 암호화하는 cDNA, 그를 포함하는 발현벡터, 전기발현벡터를 이용하여 말초혈액 백혈구(peripheral blood leukocytes)의 세브셋(subsets)을 유인하는 전기 단백질의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing cDNA and electric protein of novel C6 β-chemokine isolated from humans. More specifically, the present invention provides a peripheral blood leukocyte using a cDNA encoding a novel protein belonging to C6 β-chemokine isolated from a human mononuclear cell line, an expression vector comprising the same, and an electroexpression vector. The present invention relates to a method for producing an electrical protein that attracts subsets of peripheral blood leukocytes.

케모카인은 분자량이 작은 염기성 단백질들로 이루어진 사이토카인류에 속하는 물질로서, 공통적으로 네개의 시스테인을 가지고 있으며, 처음 두개의 시스테인이 서로 인접해 있는가 혹은 아미노산이 중간에 위치하는가의 여부에 따라, CXC(α), CC(β), C(γ) 및 CX3C의 4가지 부계열(subfamily)로 분류된다(참조: Baggiolini, M. and Dahinden, C.A., Immunol. Today, 15:127(1994); Kelner, S.G. et al., Science, 266:1395(1994); Bazan, J.F. et al., Nature, 385:640(1997)). 케모카인 부계열의 유전자들은 같은 염색체상에 무리지어 존재하는데, 예를들면,α-케모카인 유전자들은 사람의 4q12-21 염색체상에, β-케모카인 유전자들은 사람의 17q11-32 염색체 및 마우스 11 염색체상에 위치한다.Chemokines belong to a class of cytokines made up of basic proteins of low molecular weight, which have four cysteines in common, depending on whether the first two cysteines are adjacent to each other or amino acids are intermediate. α), CC (β), C (γ) and CX 3 C, which are classified into four subfamily (Baggiolini, M. and Dahinden, CA, Immunol. Today, 15: 127 (1994); Kelner, SG et al., Science, 266: 1395 (1994); Bazan, JF et al., Nature, 385: 640 (1997)). The genes of the chemokine subfamily are clustered on the same chromosome, for example, α-chemokine genes on the human 4q12-21 chromosome and β-chemokine genes on the human 17q11-32 chromosome and mouse 11 chromosome. Located.

이들 케모카인류는 HIV-억제 작용, 면역 조절 작용, 백혈구 이동, 조혈 간세포(幹細胞))의 분열 억제능 등의 생물학적 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다(참조: Cocchi, F. et a1., Science, 270:1811(1995); Wolpe, S. D. et al., J. Exp. Med., 167:570(1988); Graham, G. J. et al., Nature, 344:442(1990); Broxmeyer, H. E. et al., Blood, 76:1110(1990); Youn, B.-S. et al., J. Immunol., 155: 2661-2667(1995)).These chemokines have been reported to exhibit biological activities such as HIV-inhibiting, immunomodulatory, leukocyte migration, and inhibiting the division of hematopoietic stem cells (Cocchi, F. et a1., Science, 270: 1811 (1995); Wolpe, SD et al., J. Exp. Med., 167: 570 (1988); Graham, GJ et al., Nature, 344: 442 (1990); Broxmeyer, HE et al., Blood , 76: 1110 (1990); Youn, B.-S. et al., J. Immunol., 155: 2661-2667 (1995)).

또한, 케모카인은 막통과부위 G 단백질이 연관된 수용체(transmembrane domain G protein-coupled receptors)에 결합하여 백혈구를 활성화시키며, 그 중의 일부 수용체는 HIV-1 감염시의 보조수용체(coreceptor)로도 이용되는 것으로 보고되고 있다(참조: Oh, K.-O. et al., J. Immunol., 147:2978(1991); Alkbatih, G. et al., Science, 272:1955(1996)). 예를 들면, β -케모카인(CC 케모카인 )의 수용체 아형에는 8가지 즉, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8이 있는데, 이중에서 CCR1, CCR2, CCR3 및 CCR5는 다양한 물질에 대해서 결합능을 나타내지만, CCR4, CCR6, CCR7 및 CCR8는 한가지 물질에 대해서 고친화성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.In addition, chemokines bind to transmembrane domain G protein-coupled receptors to activate leukocytes, some of which are reported to be used as coreceptors in HIV-1 infection. Oh, K.-O. et al., J. Immunol., 147: 2978 (1991); Alkbatih, G. et al., Science, 272: 1955 (1996). For example, there are eight receptor subtypes of β-chemokine (CC chemokine), namely CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, and CCR8, among which CCR1, CCR2, CCR3 and CCR5 are found in various substances. CCR4, CCR6, CCR7 and CCR8 have been shown to exhibit high affinity for one substance, although they exhibit binding ability.

β-케모카인 부계열에 속하는 9가지 케모카인이 발견되었고(참조: Wilson, S. D. et al., J. Exp. Med., 171:1301(1990); Modi, W. S. et al., Hum. Genet., 84:185(1990)), 그들 중 뮤린(murine) MRP-1(MIP(macrophage inflammatory protein)-re1ated protein-1)(참조: Orlofsky, A. et al., Cell Regu1., 2:403(1991)) 및 뮤린MRP-2(murine MRP-2)(참조: Yㅇun, B.-S. et al., J. Immunol., 155:2661(1995))는 두개의 시스테인 잔기를 더 가지고 있어서 제 3의 이황화결합이 가능하고, N-말단 부위가 상당히 길다는 점에서 나머지 7가지 케모카인과 구별된다. 따라서, 이들 MRPs는 C6 β-케모카인으로 분류되었다.Nine chemokines belonging to the β-chemokine subfamily have been identified (Wild, SD et al., J. Exp. Med., 171: 1301 (1990); Modi, WS et al., Hum. Genet., 84 : 185 (1990)), among them murine MRP-1 (macrophage inflammatory protein (MIP) -re1ated protein-1) (Orlofsky, A. et al., Cell Regu 1., 2: 403 (1991) ) And murine MRP-2 (Yun, B.-S. et al., J. Immunol., 155: 2661 (1995)) have two more cysteine residues. Disulfide bonds of 3 are possible and the N-terminal sites are quite long, distinguishing them from the remaining seven chemokines. Thus, these MRPs were classified as C6 β-chemokines.

현재로서는 mMRP-1 및 mMRP-2만이 보고되어 있을 뿐이나, HIV-1 감염시의 치료 혹은 화학요법이나 방사선치료시의 골수 간세포 보호 등의 목적으로 응용될 수 있는 MRP류의 잠재적 효용성 때문에, 사람 MRP에 대한 분리 및 성질 규명이 절실히 요구되어 왔다.Currently only mMRP-1 and mMRP-2 have been reported, but due to the potential utility of MRPs that can be applied for the treatment of HIV-1 infection or for the protection of bone marrow hepatocytes during chemotherapy or radiation therapy, Separation and characterization of MRP is urgently needed.

이에, 본 발명자들은 각종 사람 세포주로부터 신규의 MRP 유전자를 분리하고자 예의 연구노력한 결과, 사람의 단핵세포주로부터 C6 β-케모카인에 속하는 MRP cDNA를 분리하였으며, 그의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하여 신규한 것임을 확인하고, 나아가 전기 MRP cDNA를 재조합 대장균 또는 곤충세포에서 발현시켰으며, 발현된 재조합 단백질이 말초혈액 백혈구의 세브셋(림프구, 단핵구, 호중구)을 유인하는 화학주성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 이에, 이하에서는 사람에서 분리된 전기 MRP cDNA를 "Lkn-1(leukotactin-1) cDNA"으로, 재조합 MRP를 "재조합 Lkn-1"으로 명명하였다.Thus, the inventors of the present invention sought to isolate a novel MRP gene from various human cell lines. As a result, we isolated MRP cDNA belonging to C6 β-chemokine from human mononuclear cell lines, and determined the base sequence and amino acid sequence inferred therefrom. Confirmed that it is novel, and furthermore, the electric MRP cDNA was expressed in recombinant E. coli or insect cells, and confirmed that the expressed recombinant protein has a chemotaxis that attracts the sebset (lymphocyte, monocyte, neutrophil) of peripheral blood leukocytes, The present invention has been completed. Thus, hereinafter, the electric MRP cDNA isolated from human was named "Lkn-1 (leukotactin-1) cDNA", and recombinant MRP was named "recombinant Lkn-1".

결국, 본 발명의 첫번째 목적은 신규한 C6 β-케모카인(Lkn-1)의 cDNA 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.After all, the first object of the present invention is to provide cDNA of novel C6 β-chemokine (Lkn-1) and amino acid sequences inferred therefrom.

본 발명의 두번째 목적은 전기 Lkn-1 cDNA를 포함하는 발현벡터 및 그로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.It is a second object of the present invention to provide an expression vector comprising the Lkn-1 cDNA and a microorganism transformed therewith.

본 발명의 세번째 목적은 전기 형질전환된 미생물로부터 재조합 Lkn-1의 제조방법을 제공하는 것이다.It is a third object of the present invention to provide a method for preparing recombinant Lkn-1 from an electrotransformed microorganism.

제 1(A)도는 202bp DNA 단편의 염기서열을 결정하고 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 나타낸다.Figure 1 (A) shows the amino acid sequence that determines the nucleotide sequence of the 202 bp DNA fragment and infers therefrom.

제 1(B)도는 Lkn-1 엑손부위와 mMRP-2의 87번부터 110번까지의 아미노산 서열을 비교한 그림이다.Figure 1 (B) is a figure comparing the amino acid sequence of No. 87 to 110 of the Lkn-1 exon region and mMRP-2.

제 2도는 여러가지 사람 세포주에서 분리한 총세포 RNA를 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)한 결과를 나타내는 사진이다.2 is a photograph showing the results of reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) of total cell RNA isolated from various human cell lines.

제 3도는 Lkn-1의 cDNA 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 나타낸다.3 shows the cDNA nucleotide sequence of Lkn-1 and the amino acid sequence inferred therefrom.

제 4도는 Lkn-1, mMRP-1, mMRP-2, hMIP-1α, mMIP-1α 및 hMIP-1β의 아미노산 서열을 비교한 그림이다.4 is a diagram comparing the amino acid sequence of Lkn-1, mMRP-1, mMRP-2, hMIP-1α, mMIP-1α and hMIP-1β.

제 5(A)도는 림프구에 대한 재조합 Lkn-1 및 RANTES의 화학주성을 나타내는 그래프이다.Figure 5 (A) is a graph showing the chemotaxis of recombinant Lkn-1 and RANTES on lymphocytes.

제 5(B)도는 단핵구에 대한 재조합 Lkn-1 및 hMIP-1α의 화학주성을 나타내는 그래프이다.5 (B) is a graph showing the chemotaxis of recombinant Lkn-1 and hMIP-1α against monocytes.

제 5(C)도는 호중구에 대한 재조합 Lkn-1 및 IL-8의 화학주성을 나타내는 그래프이다.5C is a graph showing the chemotaxis of recombinant Lkn-1 and IL-8 against neutrophils.

제 6(A)도는 림프구에 가해진 RANTES와 재조합 Lkn-1의 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타낸다.Figure 6 (A) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli of RANTES and recombinant Lkn-1 applied to lymphocytes.

제 6(B)도는 림프구에 가해진 재조합 Lkn-1과 RANTES의 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타낸다.Figure 6 (B) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli of recombinant Lkn-1 and RANTES applied to lymphocytes.

제 6(C)도는 단핵구에 가해진 hMIP-1α와 재조합 Lkn-1의 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타낸다.Figure 6 (C) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli of hMIP-1α and recombinant Lkn-1 applied to monocytes.

제 6(D)도는 단핵구에 가해진 재조합 Lkn-1과 hMIP-1α의 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타낸다.Figure 6 (D) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli of recombinant Lkn-1 and hMIP-1α applied to monocytes.

제 6(E)도는 호중구에 가해진 IL-8과 재조합 Lkn-1의 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타낸다.Figure 6 (E) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli of IL-8 and recombinant Lkn-1 applied to neutrophils.

제 6(F)도는 호중구에 가해진 재조합 Lkn-1과 IL-8의 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타낸다.Figure 6 (F) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli of recombinant Lkn-1 and IL-8 applied to neutrophils.

제 7(A)도는 CCR1을 발현하는 HOS 세포주에 가해진 각종 작용물질에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타낸다.7 (A) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli by various agonists applied to HCR cell lines expressing CCR1.

제 7(B)도는 CCR3을 발현하는 HOS 세포주에 가해진 각종 작용물질에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타내는 그래프이다.FIG. 7 (B) is a graph showing the relative fluorescence measured for a series of stimuli by various agonists applied to HCR cell lines expressing CCR3.

제 7(C)도는 Lkn-1 및 hMIP-1α의 농도에 따른 반응 결과를 나타내는 그래프이다.7 (C) is a graph showing the results of the reaction according to the concentrations of Lkn-1 and hMIP-1α.

제 7(D)도는 Lkn-1, 에오탁신(Eotaxin) 및 RANTES 농도에 따른 반응 결과를 나타내는 그래프이다.7 (D) is a graph showing the results of the reaction according to the concentration of Lkn-1, Eotaxin and RANTES.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명자들은 사람 세포주로부터 신규의 Lkn-1 유전자를 분리하기 위하여, 우선 프로브의 제공에 이용될 Lkn-1 gDNA의 엑손(exon)부위를 클로닝하였다. 즉, 사람의 전체 유전자 게놈 DNA를 HindIII 제한효소로 절단한 다음, 아가로스 젤상에서 분획화하고,32-P로 표지된 mMRP-2 cDNA(참조: Youn, B.S. et al., J. Immunol., 155:2661(1995))를 프로브로 사용하여 서던블럿분석하여, mMRP-2와 혼성화되는 7.0kb의 DNA 단편을 얻었다. 이어, 7.0kb의 HindIII DNA 단편으로부터 Lkn-1 gDNA의 엑손 서열을 분리하기 위하여, 사람의 게놈 DNA를 HindIII으로 완전히 절단하고 아가로스 젤상에서 분획하여, 7.0kb의 DNA 단편을 분리한 다음, 그 단편을 벡터에 삽입하고 숙주세포로의 도입 및 배양하여, 상기 mMRP-2 cDNA 프로브와 혼성화 반응을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 그런 다음, 그 콜로니로부터 7.0kb의 DNA 단편을 분리하고, Alu I으로 절단하여, mMRP-2 cDNA와 혼성화되는 202bp의 DNA 단편을 클로닝하였다. 이 단편의 염기서열을 결정하여, 인트론과 아미노산으로 번역되는 엑손 부분을 확인하였다.In order to isolate a novel Lkn-1 gene from human cell lines, we first cloned the exon region of Lkn-1 gDNA to be used for the provision of probes. That is, the entire human genome genomic DNA was digested with HindIII restriction enzymes, fractionated on agarose gels, and labeled with mMRP-2 cDNA labeled with 32- P (Youn, BS et al., J. Immunol., Southern blot analysis using 155: 2661 (1995)) as a probe yielded a 7.0 kb DNA fragment hybridized with mMRP-2. Then, to separate the exon sequence of Lkn-1 gDNA from the 7.0 kb HindIII DNA fragment, the human genomic DNA was completely cleaved with HindIII and fractionated on agarose gel to separate the 7.0 kb DNA fragment and then the fragment. Was inserted into the vector, introduced into the host cell, and cultured to select colonies exhibiting hybridization with the mMRP-2 cDNA probe. Then, a 7.0 kb DNA fragment was isolated from the colony, digested with Alu I, and cloned a 202 bp DNA fragment hybridized with mMRP-2 cDNA. The nucleotide sequence of this fragment was determined, and the exon part translated into intron and amino acid was confirmed.

그런 다음, 사람의 세포주로부터 신규의 Lkn-1 cDNA를 클로닝하기 위하여, 상기에서 확인된 Lkn-1 엑손 서열로부터 100bp를 증폭시킬 수 있는 Lkn-1 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머를 고안하고, 여러가지 사람 세포주에서 분리한 총세포 RNA를 주형으로 RT-PCR하여(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), Lkn-1의 mRNA가 탐지되는 세포주를 선별하였다. 이렇게 선별된 세포주 중의 하나인, IL-4(interleukin-4)로 자극된 사람 단핵세포 THP-1 세포주의 cDNA 라이브러리를 제조하는 한편, 다른 한편으로는 전기 THP-1 세포주의 총세포 RNA를 주형으로 하고, 상기 Lkn-1 PCR 프라이머를 이용하여 RT-PCR함으로써, Lkn-1 엑손의 100bp DNA 단편을 제조하였다. 상기에서 제조된 THP-1 세포주의 cDNA 라이브러리와 Lkn-1 엑손의 100bp DNA 단편을 프로브로 사용하여 혼성화시킨 결과, 양성반응을 나타내는 Lkn-1 cDNA를 발견하였다.Then, to clone the novel Lkn-1 cDNA from human cell lines, we devised an Lkn-1 polymerase chain reaction (PCR) primer capable of amplifying 100 bp from the Lkn-1 exon sequence identified above, RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) of total cell RNA isolated from the cell line was used as a template to select a cell line in which mRNA of Lkn-1 was detected. One of these selected cell lines, a cDNA library of human mononuclear THP-1 cell line stimulated with interleukin-4 (IL-4), was prepared, while total cell RNA of the electric THP-1 cell line was used as a template. Then, 100-bp DNA fragment of Lkn-1 exon was prepared by RT-PCR using the Lkn-1 PCR primer. As a result of hybridization using the cDNA library of the THP-1 cell line prepared above and a 100 bp DNA fragment of Lkn-1 exon as a probe, Lkn-1 cDNA showing a positive reaction was found.

상기 Lkn-1 cDNA의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정한 결과, Lkn-1 cDNA는 지금까지 보고된 적이 없는 신규한 것으로서, Lkn-1 cDNA 개방해독틀(open reading frame)은 21개의 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드를 포함하여 총 113개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 그 중 92개의 아미노산으로 구성된 성숙 단백질의 분자량은 10,162달톤으로 추정되었다. 또한, Lkn-1 cDNA는 N-글리코실화(N-glycosylation) 부위를 갖지 않으며, β-케모카인 계열이 공통적으로 갖고 있는 네개의 시스테인 잔기외에, mMRP-1 및 mMRP-2에서 발견되는 두개의 시스테인 잔기를 추가로 가지는 C6 β-케모카인 계열에 속함을 알 수 있었다.As a result of determining the nucleotide sequence of the Lkn-1 cDNA and the amino acid sequence inferred therefrom, Lkn-1 cDNA is a novel one that has not been reported so far, and the Lkn-1 cDNA open reading frame is 21 amino acids. A total of 113 amino acids were encoded, including the signal peptide. Among them, the molecular weight of the mature protein consisting of 92 amino acids was estimated to be 10,162 Daltons. In addition, Lkn-1 cDNA has no N-glycosylation sites and two cysteine residues found in mMRP-1 and mMRP-2, in addition to the four cysteine residues common to the β-chemokine family. It can be seen that belongs to the C6 β-chemokine family having additional.

이렇게 클로닝된 신규의 Lkn-1 cDNA을 발현벡터에 삽입하고, 그를 대장균 또는 곤충세포 등의 숙주세포내에 도입시켜 발현시킨 다음, 발현된 Lkn-1을 순수분리하였다.The cloned novel Lkn-1 cDNA was inserted into an expression vector, introduced into a host cell such as Escherichia coli or insect cells, and then expressed, followed by pure separation of the expressed Lkn-1.

정제된 재조합 Lkn-1은 농도 의존적으로 과립구-대식세포 등에 의한 콜로니 형성을 유의적으로 억제하고, 사람의 말초혈액 호중구, 단핵구 및 림프구에 대한 강력한 화학주성을 나타내며, 이들 세포에서의 칼슘 유출을 유도한다. 특히, 재조합 Lkn-1은 RANTES(regulated activated normal T cell expressed sequence) 및 hMIP(macrophage inflammatory protein)-1 α와 수용체를 공유하지만, IL-8의 수용체에는 결합하지 않는 것(IL-8에 비교될 정도로 호중구에 대한 강력한 화학주성을 나타내지만)으로 나타났다.Purified recombinant Lkn-1 significantly inhibits colony formation by granulocyte-macrophages and the like in a concentration-dependent manner, exhibits strong chemotaxis against human peripheral blood neutrophils, monocytes and lymphocytes, and induces calcium efflux from these cells do. In particular, recombinant Lkn-1 shares receptors with regulated activated normal T cell expressed sequence (RANTES) and macrophage inflammatory protein (hMIP) -1 but does not bind to receptors of IL-8 (compared to IL-8). To a strong chemical chemotaxis to neutrophils).

또한, 재조합 Lkn-1의 수용체는 CCR1 및 CCR3인 것으로 확인되었다. 재조합 Lkn-1은 CCR1 수용체에 결합하는 것으로 이미 공지된 hMIP-1α 또는 RANTES보다 더 강력한 CCR1 수용체의 작용물질(agonist)이고, CCR3 수용체에 대해서는 에오탁신(Eotaxin)보다 못하나 RANTES보다는 훨씬 강력한 작용물질인 것으로 밝혀졌다.In addition, the receptors of recombinant Lkn-1 were found to be CCR1 and CCR3. Recombinant Lkn-1 is an agonist of CCR1 receptors that is more potent than hMIP-1α or RANTES, which is known to bind to CCR1 receptors, and is less potent than Eotaxin but more potent than RANTES for CCR3 receptors. It turned out.

상술한 특징을 가지는 본 발명의 재조합 Lkn-1을 항체 제조, HIV-1 감염시의 치료, 화학요법이나 방사선치료시의 골수 간세포 보호 및 백혈병 억제자 등에 이용할 수 있다.The recombinant Lkn-1 of the present invention having the above-mentioned characteristics can be used for antibody production, treatment during HIV-1 infection, bone marrow hepatocyte protection during chemotherapy or radiation therapy, leukemia inhibitor, and the like.

한편, 본 발명의 아미노산 서열에 있어서, '기능적으로 동등한' 이란 Lkn-1 단백질의 아미노산 서열 중에서 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명의 염기서열에 있어서, '기능적 등가물'이라 함은 Lkn-1 cDNA 유전자의 염기서열 중에서 전기 조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.Meanwhile, in the amino acid sequence of the present invention, "functionally equivalent" means Gly, Ala in the amino acid sequence of Lkn-1 protein; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; And all proteins substituted with a combination such as Phe and Tyr. In addition, in the nucleotide sequence of the present invention, the term "functional equivalent" means all genes having a nucleotide sequence capable of providing the amino acid of the above-mentioned combination in the nucleotide sequence of the Lkn-1 cDNA gene.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예 1: Lkn-1 게놈 DNA의 엑손 클로닝Example 1 Exon Cloning of Lkn-1 Genomic DNA

mMRP-2와 염기서열 상동성이 있는 게놈 유전자를 사람에게서 클로닝하기 위하여, 먼저 사람의 전체 유전자 게놈 DNA를 BamH I, EcoR I, HindIII, Pst I, Xba I 및 Xho I 으로 절단한 다음, 1.0% 아가로스 젤상에서 분획화하고,32-P로 표지된 mMRP-2 cDNA를 프로브로 사용하여 서던블럿 분석함으로써, 양성반응을 나타내는 7.0kb의 HindIII 단편을 얻었다.To clone genomic genes that have sequence homology with mMRP-2 in humans, the entire human genome DNA is first cleaved with BamH I, EcoR I, HindIII, Pst I, Xba I and Xho I, and then 1.0%. Fractionation on agarose gel and Southern blot analysis using a 32- P labeled mMRP-2 cDNA as a probe yielded a 7.0 kb HindIII fragment which showed positive reaction.

상기 HindIII 단편의 서브라이브러리를 제조하기 위하여, 100㎍의 사람 게놈 DNA를 먼저 HindIII로 완전히 절단하고, 1% 아가로스 젤상에서 20V 전압으로 16시간 동안 분획화한 다음, 7.0kb 부근의 DNA를 Gene-c1ean 키트(Bio 101, USA)로 정제하여, HindIII로 절단된 탈인산화 pBluescript SK+벡터(Stratagene, USA)에 삽입하였다. 이렇게 제조된 재조합 벡터를 일렉트로-맥스(GIBCO-BRL, USA) 형질전환가능 세포(competent cell)에 일렉트로포레이션 방법으로 도입하고 고체배지에서 배양한 다음, 생장한 약 2×105의 콜로니를 mMRP-2 프로브와 혼성확시킨 결과, 단 하나의 콜로니만이 혼성화 양성반응을 나타내었고, 그 콜로니는 7.0kb의 삽입체 DNA를 포함하고 있었다.To prepare a sublibrary of the HindIII fragment, 100 μg of human genomic DNA was first completely cleaved with HindIII, fractionated at 20V voltage on a 1% agarose gel for 16 hours, and then the DNA near 7.0 kb was gene-generated. Purified with c1ean kit (Bio 101, USA) and inserted into dephosphorylated pBluescript SK + vector (Stratagene, USA) digested with HindIII. The recombinant vector thus prepared was introduced into a GIBCO-BRL, USA transformable cell by the electroporation method, cultured in a solid medium, and then grown to about 2 × 10 5 colonies by mMRP. Hybridization with the -2 probe revealed that only one colony showed a hybridization positive reaction, which contained 7.0 kb of insert DNA.

상기 7.0kb의 게놈 DNA 단편으로부터 엑손 서열을 분리하기 위하여, 혼성화 양성반응을 나타낸 상기 콜로니로부터 7.0kb의 삽입체 DNA를 포함하는 pBluescript SK+벡터를 분리하고, Alu I으로 절단하여 1.5% 아가로스 젤상에서 분획화한 다음, 서던블럿분석하여 mMRP-2 cDNA와 혼성화되는 202bp의 DNA 단편을 클로닝하였다.To separate the exon sequence from the 7.0 kb genomic DNA fragment, pBluescript SK + vector containing 7.0 kb of insert DNA was isolated from the colonies that showed hybridization positive reaction, cut with Alu I and digested with 1.5% agarose gel. Fractionation on phase was followed by Southern blot analysis to clone a 202 bp DNA fragment that hybridized with mMRP-2 cDNA.

상기 202bp DNA 단편의 염기서열을 결정하여, 인트론과 아미노산으로 번역되는 엑손 부분을 확인하였다(참조: 제 1(A)도). 이 엑손부위는 mMRP-2 87번부터 110번까지의 아미노산 서열과 50%의 상동성을 나타내고, 또한 mMRP-1과 mMRP-2의 공통적 특징인 두개의 부가적인 시스테인 중 두번째 시스테인("*"로 표시)이 Lkn-1에서 보존되고 있음을 확인하였다(참조: 제 1(B)도). 제 1(B)에서, 네모부분은 Lkn-1과 mMRP-2사이에서 보존된 아미노산을 각각 나타낸다.The base sequence of the 202 bp DNA fragment was determined to identify an exon moiety that is translated into introns and amino acids (see Figure 1 (A)). This exon region shows 50% homology with the amino acid sequences of mMRP-2 87-110 and is also the second of two additional cysteines ("*") that are common to both mMRP-1 and mMRP-2. It was confirmed that the mark) is preserved in Lkn-1 (see also Figure 1 (B)). In the first (B), square parts represent amino acids conserved between Lkn-1 and mMRP-2, respectively.

실시예 2: Lkn-1 cDNA의 클로닝Example 2: Cloning of Lkn-1 cDNA

사람의 세포주로부터 Lkn-1 cDNA를 클로닝하기 위하여, 우선 제1(B)도에 개시된 아미노산 서열로부터 Lkn-1 엑손의 100bp를 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머 즉, 정방향 프라이머 5'-TTCCTCACCAAGAAGGGG-3' 및 역방향 프라이머 5'-CTTTTTCATGCAATCCTG-3'를 고안한 다음, 실시예 1에서 제조된 202bp DNA 단편, 100㎍/㎖의 IL-4(interleukin-4)로 24시간 동안 자극된 사람의 단핵세포 THP-1 세포주(ATCC TIB202)의 총세포 RNA, 대식세포의 세포주 U937(ATCC CRL1593)의 총세포 RNA 및 HL-60 세포주(ATCC CCL240)의 총세포 RNA를 주형으로 하고 PCR하였다(참조: 제 2도 ).To clone Lkn-1 cDNA from human cell lines, first, a PCR primer capable of amplifying 100 bp of Lkn-1 exon from the amino acid sequence shown in FIG. 1 (B), namely forward primer 5'-TTCCTCACCAAGAAGGGG-3 'and Reverse primer 5'-CTTTTTCATGCAATCCTG-3 'was devised, and then mononuclear THP-1 in humans stimulated for 24 hours with the 202 bp DNA fragment prepared in Example 1, 100 µg / ml IL-4 (interleukin-4) Total cell RNA of the cell line (ATCC TIB202), total cell RNA of the macrophage cell line U937 (ATCC CRL1593) and total cell RNA of the HL-60 cell line (ATCC CCL240) were used as templates (see FIG. 2).

제 2도에서, 제 1레인은 양성대조구로 사용된 202bp DNA 단편, 제 2레인은 THP-1 세포주의 총세포 RNA, 제 3레인은 U937 세포주의 총세포 RNA, 제 4레인은 HL-60 세포주의 총세포 RNA 및 제 M레인은 DNA 크기마커로서 100bp 래더(ladder)를 각각 나타낸다. 제 2도에서 보듯이, IL-4로 자극된 THP-1 세포주가 Lkn-1 mRNA를 생산함을 알 수 있었다.In FIG. 2, lane 1 is a 202 bp DNA fragment used as a positive control, lane 2 is total cell RNA of THP-1 cell line, lane 3 is total cell RNA of U937 cell line, and lane 4 is HL-60 cell line. Total cell RNA and M-lane of each represent 100bp ladder as DNA size markers. As shown in FIG. 2, it was found that THP-1 cell line stimulated with IL-4 produced Lkn-1 mRNA.

이와 관련하여, THP-1 cDNA 라이브러리를 제조하기 위하여, IL-4로 자극된 THP-1 세포주에서 사람의 mRNA를 분리하고, 그로부터 Time Saver cDNA 키트(Pharmacia Biotech, USA)를 이용하여 이중사슬의 cDNA로 역전사한 다음, 여기에 BstX I 어댑터(Invitrogen, USA)를 부착하였다. 이어, 아가로스 젤상에서 분획하여 0.5kb 이상의 cDNA를 분리하고, BstX I로 절단된 PRc/CMV(Invitrogen, USA) 벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제조한 다음, 상기에서 PCR로 증폭된 Lkn-1 엑손의 100bp DNA 단편을 프로브로하여 혼성화 반응시켰다. 그 결과, 양성반응을 나타내는 1가지 cDNA 즉, Lkn-1 cDNA를 분리하였다.In this regard, to prepare a THP-1 cDNA library, human mRNA was isolated from an IL-4 stimulated THP-1 cell line, from which a double-chain cDNA was generated using a Time Saver cDNA kit (Pharmacia Biotech, USA). Reverse transcription was followed by attachment of a BstX I adapter (Invitrogen, USA). Subsequently, cDNAs separated by 0.5 kb or more from agarose gels were isolated, and inserted into PRc / CMV (Invitrogen, USA) vector digested with BstX I to prepare a cDNA library, which was then amplified by Lkn-1 exon PCR Hybridization reaction was performed using a 100 bp DNA fragment as a probe. As a result, one cDNA, that is, positive Lkn-1 cDNA, was isolated.

실시예 3: Lkn-1 cDNA의 염기서열 분석Example 3: Sequence analysis of Lkn-1 cDNA

실시예 2에서 클로닝된 Lkn-1 cDNA의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제 3도에 나타내었다. 제 3도에서, 밑줄친 부분은 신호 펩타이드; 네모부분은 THP-1 cDNA 라이브러리의 스크리닝시 프로브로서 사용된 부분으로서 제 1(B)도의 Lkn-1 아미노산 서열; 및, (***) 표시는 번역종결부위를 나타낸다.The base sequence of the cloned Lkn-1 cDNA in Example 2 and the amino acid sequence inferred therefrom are shown in FIG. In FIG. 3, the underlined portion is a signal peptide; The square is the portion used as a probe in the screening of the THP-1 cDNA library and the Lkn-1 amino acid sequence of FIG. 1 (B); And (***) indicates a translation termination site.

제 3도에서 보듯이, Lkn-1 cDNA의 개방해독틀은 21개 아미노산의 신호 펩타이드 및 분자량 10,162달톤으로 추정되는 92개 아미노산의 성숙 단백질로 구성된 총 113개의 아미노산으로 이루어져 있음을 알 수 있었다. 또한, 유추되는 Lkn-1 아미노산 서열은 N-글리코실화 부위를 갖지 않았다.As shown in FIG. 3, the open reading frame of Lkn-1 cDNA was composed of a total of 113 amino acids consisting of a signal peptide of 21 amino acids and a mature protein of 92 amino acids estimated to have a molecular weight of 10,162 Daltons. In addition, the inferred Lkn-1 amino acid sequence did not have an N-glycosylation site.

제 4도는 Lkn-1, mMRP-1, mMRP-2, hMIP-1α(참조: Youn, B.S. et al., J. Immunol., 155:2661(1995)), mMIP-1α(참조: Kwon, B.S. and Weissman, S.M., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:1963(1989)) 및 hMIP-1β(참조: Sherry, B. et al., J. Exp. Med., 168:2251(1988))의 아미노산 서열을 비교한 그림이다. 제 4도에서, 네모부분은 보존된 4개의 시스테인 잔기, (·)는 2개의 추가 시스테인 잔기를 나타낸다.4 shows Lkn-1, mMRP-1, mMRP-2, hMIP-1α (Youn, BS et al., J. Immunol., 155: 2661 (1995)), mMIP-1α (Kwon, BS and Weissman, SM, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 1963 (1989) and hMIP-1β (Sherry, B. et al., J. Exp. Med., 168: 2251 (1988) This is a comparison of amino acid sequence of)). In FIG. 4, the square part represents four conserved cysteine residues, and (.) Represents two additional cysteine residues.

제 4도에서 보듯이, Lkn-1은 ① 공통적으로 존재하는 4개 시스테인 잔기 중의 처음 두개 시스테인 잔기의 N- 방향에 긴 N-말단을 가지고, ②β-케모카인 계열이 공통적으로 갖고 있는 네개의 시스테인 잔기외에, mMRP-1 및 mMRP-2에서 발견되는 두개의 시스테인 잔기를 추가로 가지는 C6 β-케모카인 계열에 속함을 알 수 있었다.As shown in FIG. 4, Lkn-1 has a long N-terminus in the N-direction of the first two cysteine residues among four common cysteine residues, and the four cysteine residues common to the β-chemokine family. In addition, it can be seen that it belongs to the C6 β-chemokine family having additional two cysteine residues found in mMRP-1 and mMRP-2.

아울러, Lkn-1은 mMRP-2와 염기서열 상동성을 갖는 대응물로서 사람(human counterpart of mMRP-2)에게서 분리되었을 지라도, mMRP-1 또는 mMRP-2와는 약 43% 정도의 아미노산 상동성만을 가지고, hMIP-1α와는 40%의 아미노산 상동성을 가지는 것으로 밝혀졌다.In addition, although Lkn-1 was isolated from human counterpart of mMRP-2 as a counterpart having homology with mMRP-2, only about 43% of amino acid homology with mMRP-1 or mMRP-2 was observed. And 40% amino acid homology with hMIP-1α.

실시예 4: 재조합 Lkn-1의 발현Example 4: Expression of Recombinant Lkn-1

실시예 4-1: 대장균내에서의 재조합 Lkn-1의 발현 및 정제Example 4-1 Expression and Purification of Recombinant Lkn-1 in Escherichia Coli

신호 펩타이드로 추정되는 부분을 제외한 성숙 Lkn-1만을 재조합 단백질로서 발현시키기 위하여, 우선 실시예 2에서 클로닝된 Lkn-1 cDNA를 주형으로 하고, 하기의 PCR 프라이머 및 Pfu 중합효소(Stratagene, USA)를 이용하여 성숙 Lkn-1의 개방해독틀을 PCR 증폭시켰다:In order to express only mature Lkn-1 except as a signal peptide as a recombinant protein, Lkn-1 cDNA cloned in Example 2 was used as a template, and the following PCR primers and Pfu polymerase (Stratagene, USA) were used. PCR amplification of the open reading frame of mature Lkn-1 using:

정방향 프라이머 5' -CGAATTCCATATGCAGTTCACAAATGATGCAGAG-3';Forward primer 5'-CGAATTCCATATGCAGTTCACAAATGATGCAGAG-3 ';

역 방향 프라이머 5' -CGCCGCTCGAGTTGAGTAGGGCTTCAGC-3 '.Reverse primer 5'-CGCCGCTCGAGTTGAGTAGGGCTTCAGC-3 '.

상기에서 증폭된 DNA 단편을 NdeI/XhoI 제한효소로 절단하여, 플라스미드 pET21a(Novagen, USA)에 클로닝한 다음, 그 재조합 플라스미드를 pET21a-Lkn-1이라 명명하고, 대장균 XL-1 Blue에 도입하였다. 상기와 같이 제조된 재조합 플라스미드 pET21a-Lkn-1은 성숙 Lkn-1의 N-말단에 하나의 메티오닌 잔기가, C-말단에 6개의 히스티딘이 첨가된 재조합 Lkn-1을 발현하게 된다.The amplified DNA fragment was digested with NdeI / XhoI restriction enzyme, cloned into plasmid pET21a (Novagen, USA), and the recombinant plasmid was named pET21a-Lkn-1 and introduced into E. coli XL-1 Blue. The recombinant plasmid pET21a-Lkn-1 prepared as described above expresses recombinant Lkn-1 having one methionine residue at the N-terminus of mature Lkn-1 and six histidines added at the C-terminus.

이렇게 제조된 형질전환체는 'Escherichia coli(XL-1 Blue) hMRP-2'라 명명되어, 1996년 9월 10일 국제기탁기관인 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 ATCC 98166으로 기탁되었다.The transformant thus prepared was named 'Escherichia coli (XL-1 Blue) hMRP-2' and was deposited on September 10, 1996 under the accession number ATCC 98166 to the American Type Culture Collection (ATCC).

전기 형질전환체를 배양하여 Lkn-1을 발현시킨 다음, 봉입체를 얻어 20ml 변성용 완충용액(6M guanidine-HC1, 20mM Tris-HC1, pH 7.9, 500mM NaCl, 4mM n-octylglucopyranoside)에 용해시키고, 원심분리하여 얻은 상등액을 활성화된 Ni-컬럼( Novagen, USA) 크로마토그래피 및 헤파린 아가로스 컬럼(Pharmacia Fine Chemicals, USA) 크로마토그래피하여, 히스티딘-태그 재조합 Lkn-1(His-tagged recombinant Lkn-1)을 분리·정제하였다. 재조합 Lkn-1의 분자량은 전기영동 결과로부터 약 12kD인 것으로 예측되었다.After culturing the transformants to express Lkn-1, the inclusion bodies were obtained and dissolved in 20 ml denatured buffer (6M guanidine-HC1, 20 mM Tris-HC1, pH 7.9, 500 mM NaCl, 4 mM n-octylglucopyranoside), and centrifuged. The separated supernatant was subjected to activated Ni-column (Novagen, USA) chromatography and heparin agarose column (Pharmacia Fine Chemicals, USA) chromatography to obtain histidine-tagged recombinant Lkn-1. Isolate and purify. The molecular weight of recombinant Lkn-1 was predicted to be about 12 kD from the electrophoresis results.

실시예 4-2: :곤충세포 내에서의 재조합 Lkn-1의 발현 및 정제Example 4-2: Expression and Purification of Recombinant Lkn-1 in Insect Cells

신호 펩타이드를 포함하는 완전한 Lkn-1을 재조합 단백질로서 발현시키기 위하여, 그를 암호화하는 Lkn-1 cDNA의 N-말단에 PstI 제한효소 인식부위, C-말단에 XbaI 제한효소 인식부위가 삽입된 Lkn-1 cDNA를 PCR 증폭시켰다. 이어, 증폭된 PCR 산물을 분리하고, PstI/XbaI 제한효소로 절단된 벡터 PVL 1392(Invitrogen, USA)에 삽입시켜 재조합 플라스미드 PVL 1392-Lkn-1을 제조하였다. 그런 다음, 전기 재조합 플라스미드와 AcNPV(Autographa california nuclear polyhedrosis baculovirus) 둘다를 Sf-21 곤충세포에 트랜스펙션시킴으로써, 전기 재조합 플라스미드에 삽입된 Lkn-1 cDNA를 AcNPV로 옮겼다.In order to express a complete Lkn-1 including a signal peptide as a recombinant protein, Lkn-1 having a PstI restriction enzyme recognition site at the N-terminus and an XbaI restriction enzyme recognition site at the C-terminus of the Lkn-1 cDNA encoding it cDNA was PCR amplified. The amplified PCR product was then isolated and inserted into vector PVL 1392 (Invitrogen, USA) digested with PstI / XbaI restriction enzymes to prepare recombinant plasmid PVL 1392-Lkn-1. Then, the Lkn-1 cDNA inserted in the recombinant recombinant plasmid was transferred to AcNPV by transfecting both the recombinant recombinant plasmid and AcNPV (Autographa california nuclear polyhedrosis baculovirus) into Sf-21 insect cells.

AcNPV-Lkn-1 바이러스 플라크는 비리온이 포획된 세포내 결정성 단백질을 형성하지 않는다(occlusion-negative)는 특성을 기준으로 분리하고, 무혈청의 Ex-Cell 400 배지(JRH Biosciences, USA)에서 Sf-21 곤충세포내에 감염된 상태로 성장시켜 스톡(stock)으로 이용하였다.AcNPV-Lkn-1 virus plaques are isolated on the basis of their ability to form virion-captured intracellular crystalline proteins (occlusion-negative) and in serum-free Ex-Cell 400 medium (JRH Biosciences, USA). Sf-21 insect cells were grown as infected and used as stock.

재조합 Lkn-1은 Ex-Cell 400 배지에서 배양한 High five 세포주(Invitrogen, USA)에서 발현시켰으며, 발현된 Lkn-1은 HiTrap-Heparin 컬럼(Phamacia Biotech., USA) 및 HiTrap-SP 컬럼(Pharmacia Biotech., USA)으로 정제하였다. 정제 즉시 분석한 재조합 Lkn-1의 분자량은 웨스턴 블럿 결과로부터 약 12kD인 것으로 예측되었다.Recombinant Lkn-1 was expressed in High five cell line (Invitrogen, USA) cultured in Ex-Cell 400 medium, and expressed Lkn-1 was HiTrap-Heparin column (Phamacia Biotech., USA) and HiTrap-SP column (Pharmacia Biotech., USA). The molecular weight of recombinant Lkn-1 analyzed immediately after purification was predicted to be about 12 kD from Western blot results.

실시예 5: 재조합 Lkn-1에 의한 골수세포의 콜로니 형성의 억제Example 5: Inhibition of Colony Formation of Bone Marrow Cells by Recombinant Lkn-1

일부 β-케모카인은 실험실적 조건에서 골수억제성(myelosuppressive)의 효과를 가지는 것으로 알려져 있으므로, 인간의 골수에 존재하는 골수양 모세포(myeloid progenitor cell)에 의한 콜로니 형성에, 실시예 4-1에서 정제한 재조합 Lkn-1이 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.Since some β-chemokines are known to have myelosuppressive effects in laboratory conditions, the colony formation by myeloid progenitor cells present in human bone marrow is purified in Example 4-1. The purpose of this study was to investigate the effect of a recombinant Lkn-1.

즉, 골수세포의 콜로니를 CFU-GM(colony forming unit-granulocyte-macrophage)에 의해 형성시키고자, Ficoll-Hypaque 구배(1.070gm/㎤, Sigma Chemical Co., USA)하에서 원심분리하여 수득한 저밀도의 인간 골수세포를 10% FBS가 포함된 0.3% 아가 배양배지에 5 x 104세포/ml로 도말하고, rhGM-CSF(recombinant human granulocyte-macrophage-colony stimulating factor, 100 U/ml, Immunex Corporation, USA) + rhSLF(recombinant human steel factor, 50ng/ml, Immunex Corporation, USA)로 자극시켰다. 다른 한편으로는, 골수세포의 콜로니를 CFU-GM, BFU-E(burstforming unit-erythroid) 및 CFU-GEMM( colony forming unit-granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryocyte)에 의해 형성시키고자, 전기 골수 세포를 30% FBS가 포함된 1% 메틸셀룰로스 배양배지에 5 x 104세포/ml로 도말하고, rhEPO(recombinant human erythropoietin, 1U/ml, Amgen Corporation, USA), rhIL-3(recombinant human interleukin-3, 100U/ml, Immunex Corporation, USA) 또는 rhSLF로 자극시켰다.That is, low density obtained by centrifugation under Ficoll-Hypaque gradient (1.070gm / cm 3, Sigma Chemical Co., USA) to form colonies of bone marrow cells by colony forming unit-granulocyte-macrophage (CFU-GM) Smear human bone marrow cells at 5 x 10 4 cells / ml in 0.3% agar culture medium containing 10% FBS, and recombinant human granulocyte-macrophage-colony stimulating factor, 100 U / ml, Immunex Corporation, USA ) + rhSLF (recombinant human steel factor, 50ng / ml, Immunex Corporation, USA). On the other hand, in order to form colonies of bone marrow cells by CFU-GM, burstforming unit-erythroid (BFU-E) and colony forming unit-granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryocytes (CFU-GEMM), Smear 5 x 10 4 cells / ml in 1% methylcellulose culture medium containing 30% FBS, rhEPO (recombinant human erythropoietin, 1U / ml, Amgen Corporation, USA), rhIL-3 (recombinant human interleukin-3, 100 U / ml, Immunex Corporation, USA) or rhSLF.

상기의 자극이 가해진 후에 BNP-210 배양기(Tabai ESPEC Corp., USA)에서 5% CO2및 5% O2분위기로 배양하고, 14일 경과후에 콜로니수를 산정하였다(참조: 표 1). 이때, 재조합 Lkn-1은 플레이트당 3∼50ng/ml로 첨가하였다.After the above stimulus was applied, the cells were cultured in a 5% CO 2 and 5% O 2 atmosphere in a BNP-210 incubator (Tabai ESPEC Corp., USA), and colonies were counted after 14 days (see Table 1). At this time, recombinant Lkn-1 was added at 3-50ng / ml per plate.

[표 1]TABLE 1

상기 표 1에서 보듯이, 재조합 Lkn-1은 농도 의존적으로 CFU-GM, BFU-E 및 CFU-GEMM에 의한 콜로니 형성을 유의적으로 억제함을 알 수 있었다. 억제 정도는 대조군의 22∼63%에 해당하는 양이었다.As shown in Table 1, the recombinant Lkn-1 was found to significantly inhibit colony formation by CFU-GM, BFU-E and CFU-GEMM in a concentration-dependent manner. The degree of inhibition was 22-63% of the control.

한편, 재조합 Lkn-1은 GM-CSF 단독으로 자극된 CFU-GM이나, EPO 단독으로 자극된 BFU-E에 의해서 형성되는 콜로니를 억제하지 못하는 것으로 나타났는 바, 이로부터 재조합 Lkn-1은 여러가지 성장인자에 의한 자극에 반응하는 미성숙 모세포에 억제효과를 나타낼 것으로 예측되었다.On the other hand, recombinant Lkn-1 did not appear to inhibit the colony formed by CFU-GM stimulated with GM-CSF alone or BFU-E stimulated with EPO alone. It was predicted to have an inhibitory effect on immature blasts in response to factor-induced stimulation.

실시예 6: 재조합 Lkn-1의 주화인자로서의 작용능 조사Example 6: Investigation of the function of recombinant Lkn-1 as a coin factor

재조합 Lkn-1의 화학주성을 알아보기 위하여, 우선 건강한 사람의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)를 Ficoll-Hypaque 구배(1,077gm/㎤)하에서의 원심분리에 의해 수득하였다. 그런 다음, PBMC로부터의 단핵구(monocytes) 분리는 플라스틱 표면에의 부착능으로서 수행하고, 이와 같은 단핵구 분리를 2번 반복한 후에 남은 세포는 림프구로서 수득하였다. 전술한 바와 같이 수득한 단핵구 및 림프구의 순도는 Diff-Ouick(Baxter Scientific, USA)으로 염색된 시토스핀(cytospin)의 현미경 관찰에 의해 측정하였으며, 그 결과 각각 90% 및 88%이었다.To determine the chemotaxis of recombinant Lkn-1, first, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy humans were obtained by centrifugation under a Ficoll-Hypaque gradient (1,077 gm / cm 3). Then, monocytes isolation from PBMC was performed as an ability to adhere to the plastic surface, and the cells remaining after such two monocyte separations were obtained as lymphocytes. Purity of the monocytes and lymphocytes obtained as described above was measured by microscopic observation of cytospin stained with Diff-Ouick (Baxter Scientific, USA), resulting in 90% and 88%, respectively.

또한, 사람의 호중구(neutrophil)는 3% Dextran T 500(Pharmacia Fine Chemicals, USA)로 적혈구를 침전시킨 다음, 그를 Ficoll-Hypaque 구배하에서 원심분리하여 수득하고, 수득한 적혈구를 저장액(hypotonic solution)에서 용해시킴으로써 제조하였다. 이렇게 얻은 호중구의 순도는 형태(morphology)로 결정하였는데 95%로 나타났다.In addition, human neutrophils are obtained by precipitating red blood cells with 3% Dextran T 500 (Pharmacia Fine Chemicals, USA), and then centrifuging them under a Ficoll-Hypaque gradient, and the obtained red blood cells are stored in a hypothetical solution. Prepared by dissolving at. The purity of neutrophils thus obtained was determined by morphology, which was 95%.

상기에서 분리한 단핵구와 림프구는 0.5% 저 엔도톡신 BSA(Sigma Chemical Co., USA) 및 20mM Hepes가 부가된 RPMI 1640(Gibco, USA)에 각각 2 x 106세포/ml과 8 x 106세포/ml의 농도로 현탁시키고, 호중구는 HBSS에 1 x 106세포/ml의 농도로 현탁시켰다.The monocytes and lymphocytes isolated from the above were 2 × 10 6 cells / ml and 8 × 10 6 cells / ml in 0.5% low endotoxin BSA (Sigma Chemical Co., USA) and RPMI 1640 (Gibco, USA) added 20 mM Hepes, respectively. Suspensions in ml and neutrophils were suspended in HBSS at a concentration of 1 x 10 6 cells / ml.

이어, 48-웰(well) 마이크로챔버(Neuroprobe, USA)에서의 세포이동 정도를 다음과 같이 측정하였다. 마이크로챔버의 하층 웰에는 완충용액만이(대조구), 혹은 재조합 Lkn-1, hMIP-1α(PeproTech., USA), RANTES(PeproTech., USA), IL-8(PeproTech., USA) 또는 에오탁신(Eotaxin, PeproTech., USA)을 포함한 완충용액이 채워져 있고, 상층의 웰에는 전술한 세포 현탁액 50μ1가 채워져 있으며, 이들 두 층은 적절한 공경의 필터(폴리비닐피롤리돈이 없는)로 분획되어 있다. 측정하고자 하는 세포가 호중구와 림프구인 경우에 사용하는 필터의 공경 직경은 3㎛이고, 단핵구인 경우에 사용하는 필터의 공경 직경은 5㎛이었다. 37℃에서 1시간(호중구의 경우), 2시간(단핵구의 경우), 4시간(림프구의 경우) 상기 마이크로챔버를 방치한 다음, 필터를 챔버로부터 제거하여 세척하고, 이어 세포 고정화시키고 Diff-Quick으로 염색하여 세포수를 산정하였다(참조: 제 5(A)∼5(C)도).Then, the degree of cell migration in the 48-well microchamber (Neuroprobe, USA) was measured as follows. The lower wells of the microchambers contain buffer only (control) or recombinant Lkn-1, hMIP-1α (PeproTech., USA), RANTES (PeproTech., USA), IL-8 (PeproTech., USA) or eotaxin (Eotaxin, PeproTech., USA) is filled with a buffer solution, the upper wells are filled with the above cell suspension 50μ1, these two layers are fractionated with an appropriate pore filter (without polyvinylpyrrolidone). . The pore diameter of the filter used when the cells to be measured were neutrophils and lymphocytes was 3 μm, and the filter diameter used when the monocytes were monocytes was 5 μm. At 37 ° C. for 1 hour (for neutrophils), 2 hours (for monocytes), 4 hours (for lymphocytes), the microchamber is left, then the filter is removed from the chamber and washed, followed by cell immobilization and Diff-Quick. The cell number was calculated by staining with (Figs. 5 (A) to 5 (C)).

제 5(A)∼5(C)도에서는 시험구인 케모카인으로 이동한 세포 수를 대조구로 이동한 세포 수로 나눈 수치를 주화인자의 지표(chemotacticindex)로 하였다.In Figs. 5 (A) to 5 (C), the number obtained by dividing the number of cells transferred to chemokine, which is the test group, by the number of cells moved to the control group, was used as a chemoactic index.

제 5(A)도는 림프구에 대한 재조합 Lkn-1 및 RANTES의 화학주성을 나타내는 그래프이고, 제 5(B)도는 단핵구에 대한 재조합 Lkn-1 및 hMIP-1α의 화학주성을 나타내는 그래프이며, 제 5(C)도는 호중구에 대한 재조합 Lkn-1 및 IL-8의 화학주성을 나타내는 그래프이다.Figure 5 (A) is a graph showing the chemotaxis of recombinant Lkn-1 and RANTES for lymphocytes, Figure 5 (B) is a graph showing the chemotaxis of recombinant Lkn-1 and hMIP-1α for monocytes, (C) is a graph showing the chemotaxis of recombinant Lkn-1 and IL-8 against neutrophils.

제 5(A)∼5(C)도에서 보듯이, 재조합 Lkn-1은 사람의 말초혈액 호중구, 단핵구 및 림프구에 대한 강력한 주화인자임을 알 수 있었다.As shown in Figs. 5 (A) to 5 (C), recombinant Lkn-1 was found to be a potent chemotactic factor for human peripheral blood neutrophils, monocytes and lymphocytes.

또한, 재조합 Lkn-1은 호중구에 대해서 IL-8과 유사한 정도의 화학주성(참조: 제 5(C)도), 단핵구에 대해서 hMIP-1α와 유사한 정도의 화학주성을 나타내고(참조: 제 5(B)도); 림프구에 대해서는 RANTES보다 낮은 화학주성을 나타내지만, 10㎍/ml의 Lkn-1 농도까지는 농도의존적으로 향상된 화학주성을 나타냄을 알 수 있었다(참조: 제 5(A)도).In addition, recombinant Lkn-1 exhibits a similar chemotaxis to IL-8 for neutrophils (Fig. 5 (C)), and a chemotaxis similar to hMIP-1α for monocytes. B) degrees); The chemotaxis of lymphocytes was lower than that of RANTES, but up to 10 μg / ml of Lkn-1 concentrations were found to show improved chemotaxis (see Figure 5 (A)).

실시예 7: 재조합 Lkn-1에 의한 칼슘 유출(calcium flux) 정도의 분석Example 7 Analysis of Calcium Flux by Recombinant Lkn-1

실시예 7-1: 림프구, 단핵구, 호중구에서의 칼슘 유출 분석Example 7-1 Analysis of Calcium Leakage in Lymphocytes, Monocytes, and Neutrophils

재조합 Lkn-1이 수용체에 결합하여 림프구, 단핵구, 호중구를 활성화시켜 이들에서의 칼슘 유출을 유도하는지, 그리고 그 수용체에 대해 다른 작용인자(agonist)와는 어떠한 경쟁 관계에 있는지를 알아보고자 하였다.The aim of this study was to determine whether recombinant Lkn-1 binds to receptors, activates lymphocytes, monocytes and neutrophils to induce calcium efflux from them and how they compete with other agonists for that receptor.

수용체의 활성화는 정제된 말초혈액 백혈구 서브셋(림프구, 단핵구, 호중구)에서의 [Ca2+] 변화를 MSIII 형광분석기(fluorimeter, Photon Technology International, USA)로 측정하였다. 즉, 세포와 2μM fura-2AM(Sigma Chemical Co., USA)을 37℃ 에서 45분간 반응시키고, 2번 세척하여 0.05% BSA가 포함된 HBSS(pH 7.4)에 1 x 107세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 이 세포 현탁액 2ml를 37℃ 물로 둘러싸여 교반되는 큐벳(a stirred, water-jacketed cuvette)에 넣고, 340nm와 380nm에서 연속적으로 여기시켰다. 이때 방출되는 형광은 25nM 작용물질(agonist)(재조합 Lkn-1, hMIP-1α, RANTES, IL-8 또는 에오탁신)의 첨가 전,후에 510nm에서 측정하였다(참조: 제 6(A)∼6(F)도).Activation of the receptor was measured by [Ca 2+ ] changes in purified peripheral blood leukocyte subsets (lymphocytes, monocytes, neutrophils) with an MSIII fluorimeter (Photon Technology International, USA). That is, the cells were reacted with 2 μM fura-2AM (Sigma Chemical Co., USA) for 45 minutes at 37 ° C. and washed twice to give a concentration of 1 × 10 7 cells / ml in HBSS (pH 7.4) containing 0.05% BSA. Suspended. 2 ml of this cell suspension was placed in a stirred, water-jacketed cuvette surrounded by water at 37 ° C. and continuously excited at 340 nm and 380 nm. The emitted fluorescence was measured at 510 nm before and after the addition of 25 nM agonist (recombinant Lkn-1, hMIP-1α, RANTES, IL-8 or eotaxin) (see 6 (A) to 6 ( F) degrees).

제 6(A)∼6(F)도에서의 상대적 형광은 340nm와 380nm에서 여기된 형광의 상대적 비율로서 표시하였다.The relative fluorescence in FIGS. 6 (A) to 6 (F) is expressed as the relative ratio of the fluorescence excited at 340 nm and 380 nm.

제 6(A)도는 림프구에 가해진 RANTES과 재조합 Lkn-1에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 제 6(B)도는 림프구에 가해진 재조합 Lkn-1과 RANTES에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 제 6(C)도는 단핵구에 가해진 hMIP-1α와 재조합 Lkn-1에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 제 6(D)도는 단핵구에 가해진 재조합 Lkn-1과 hMIP-1α에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 제 6(E)도는 림프구에 가해진 IL-8과 재조합 Lkn-1에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 제 6(F)도는 림프구에 가해진 재조합 Lkn-1과 IL-8에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 각각 나타낸다.Figure 6 (A) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli by RANTES and recombinant Lkn-1 applied to lymphocytes; Figure 6 (B) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli by recombinant Lkn-1 and RANTES applied to lymphocytes; Figure 6 (C) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli by hMIP-1α and recombinant Lkn-1 applied to monocytes; Figure 6 (D) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli by recombinant Lkn-1 and hMIP-1α applied to monocytes; Figure 6 (E) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli by IL-8 and recombinant Lkn-1 applied to lymphocytes; Figure 6 (F) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli by recombinant Lkn-1 and IL-8 applied to lymphocytes, respectively.

제 6(A)∼6(F)도에서 보듯이, 재조합 Lkn-1은 림프구, 단핵구 및 호중구에서의 칼슘 유출을 유도함을 알 수 있었다.As shown in Figs. 6 (A) to 6 (F), recombinant Lkn-1 induced calcium outflow in lymphocytes, monocytes and neutrophils.

한편, G 단백질 연관의 수용체(G prㅇtein-coupled receptors)가 수용체 시그날의 동일한 흐름 경로를 갖는 리간드에 짧은 시간내에 연속적으로 노출되면, 전기 수용체의 시그날 감지능이 탈감작(desensitization)되는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상은 전술한 수용체 발현 세포에 가한 재조합 Lkn-1의 잇따른 자극에 대해서도 나타났다.On the other hand, when G protein-coupled receptors are continuously exposed to a ligand having the same flow path of a receptor signal in a short time, it is known that the signal sensing ability of the electric receptor is desensitized. . This phenomenon has also been shown for subsequent stimulation of recombinant Lkn-1 applied to the receptor expressing cells described above.

또한, 제 6(A)∼6(F)도에서 보듯이, RANTES 및 hMIP-1α에 의한 추후 자극이 있는 경우, 재조합 Lkn-1은 림프구 및 단핵구를 완전히 탈감작시키나(참조: 제 6(B)도, 제 6(D)도), 재조합 Lkn-1에 의한 추후자극이 있는 경우에 RANTES 및 hMIP-1α 각각은 림프구 및 단핵구를 완전히 탈감작시키지 못함(참조: 제 6(A)도, 제 6(C)도)을 알 수 있었다. 이는 재조합 Lkn-1이 RANTES 및 hMIP-1α와 수용체를 공유하고, RANTES나 hMIP-1α보다 칼슘 유출을 더 잘 유도한다는 것을 나타낸다. 또한, 재조합 Lkn-1이 호중구에서 칼슘 유출을 유도할지라도, 호중구는 IL-8에 의한 추후 자극에 의해 탈감작되지 않으며(참조: 제 6(F)도), 또한 IL-8은 재조합 Lkn-1에 의한 추후 자극이 있는 경우 호중구를 탈감작시키지 못함(참조: 제 6(E)도)을 알 수 있는 바, 이는 재조합 Lkn-1이 IL-8과 마찬가지로 호중구에서의 칼슘 유출을 유도하는 하나의 강력한 인자일지라도, IL-8과 수용체를 공유하지 않는다는 것을 나타낸다.In addition, as shown in Figs. 6 (A) to 6 (F), in the event of subsequent stimulation by RANTES and hMIP-1α, recombinant Lkn-1 completely desensitized lymphocytes and monocytes (see No. 6 (B)). 6 (D)), RANTES and hMIP-1α do not completely desensitize lymphocytes and monocytes in the event of subsequent stimulation by recombinant Lkn-1 (see FIG. 6 (A) and 6 ( C) could also be seen). This indicates that recombinant Lkn-1 shares receptors with RANTES and hMIP-1α and induces calcium efflux better than RANTES or hMIP-1α. In addition, although recombinant Lkn-1 induces calcium efflux from neutrophils, neutrophils are not desensitized by subsequent stimulation by IL-8 (see also Figure 6 (F)), and IL-8 is also recombinant Lkn-1 The subsequent stimulation of neutrophils does not desensitize neutrophils (see also Figure 6 (E)), suggesting that recombinant Lkn-1, like IL-8, is a potent inducer of calcium outflow from neutrophils. Even factor, it does not share receptor with IL-8.

실시예 7-2: CC 케모카인 수용체를 발현하는 세포주에서의 칼슘 유출분석Example 7-2 Calcium Leakage Analysis in Cell Lines Expressing CC Chemokine Receptor

상기 실시예 7-1에서 재조합 Lkn-1은 RANTES 및 hMIP-1α에 의해 활성화되는 바로 그 수용체를 활성화시키는 것으로 나타났는 바, 이를 시험하기 위하여, 재조합 Lkn-1이 CC 또는 CXC 케모카인 수용체를 발현하는 세포주를 활성화시키는지 조사하였다. 여기서는 정제된 백혈구 서브셋을 사용하는 대신에, 재조합 CCR1, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5 및 CXCR4를 발현하는 HOS 세포주(참조: AIDS Research and Reference Reagent Program of NIH, USA)를 사용하는 점을 제외하고는 실시예 7-1과 동일하게 실험하였다. hMIP-1α는 CCR1과 CCR5 둘다에 결합하고, RANTES는 CCR1, CCR3, CCR5 모두에 결합하는 것으로 알려져 있다.In Example 7-1, recombinant Lkn-1 was shown to activate the same receptor activated by RANTES and hMIP-1α. To test this, recombinant Lkn-1 expresses a CC or CXC chemokine receptor. The cell line was examined for activation. Here, instead of using a purified leukocyte subset, except for using HOS cell lines expressing recombinant CCR1, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5 and CXCR4 (AIDS Research and Reference Reagent Program of NIH, USA). The experiment was performed in the same manner as in Example 7-1. hMIP-1α binds to both CCR1 and CCR5 and RANTES is known to bind to both CCR1, CCR3, CCR5.

제 7(A)도는 CCR1을 발현하는 HOS 세포주에 가해진 각종 작용물질에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도, 제 7(B)도는 CCR3을 발현하는 HOS 세포주에 가해진 각종 작용물질에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타내는 그래프이다.Figure 7 (A) shows the relative fluorescence measured for a series of stimuli by various agents applied to CCR1 expressing CCR1, and Figure 7 (B) shows the series of various agents applied to HOS cell lines expressing CCR3. A graph showing the relative fluorescence measured for the stimulus.

제 7(A) 및 7(B)도에서 보듯이, 재조합 Lkn-1은 CCR1 및 CCR3를 발현하는 HOS 세포에서의 칼슘 유출을 강하게 유도함을 알 수 있었다.As shown in Figures 7 (A) and 7 (B), it was found that recombinant Lkn-1 strongly induced calcium outflow in HOS cells expressing CCR1 and CCR3.

그러나, CCR1 및 CCR3 이외의 수용체를 발현하는 HOS 세포에서는 칼슘유출이 관찰되지 앓았다.However, calcium leakage was not observed in HOS cells expressing receptors other than CCR1 and CCR3.

또한, 제 7(A)에서 보듯이, CCR1-HOS 세포가 먼저 재조합 Lkn-1으로 자극되는 경우, 추후의 hMIP-1α 또는 RANTES 자극에 대해서는 반응이 없는 반면에, CCR1-HOS 세포가 먼저 hMIP-1α 또는 RANTES로 자극되는 경우, 추후의 재조합 Lkn-1 자극에 대한 반응은 영향을 받지 않는 것을 알 수 있었다.In addition, as shown in 7 (A), when CCR1-HOS cells are first stimulated with recombinant Lkn-1, there is no response to subsequent hMIP-1α or RANTES stimulation, whereas CCR1-HOS cells first receive hMIP-. When stimulated with 1α or RANTES, the response to subsequent recombinant Lkn-1 stimulation was found to be unaffected.

제 7(A)도의 결과로부터, 재조합 Lkn-1은 hMIP-1α 또는 RANTES보다 CCR1에 대한 강력한 작용물질임을 알 수 있는 바, 이는 재조합 Lkn-1 및 hMIP-1α의 농도에 따른 반응을 조사한 제 7(C)도의 결과에서도 명백히 입증되고 있다.From the results of FIG. 7 (A), it can be seen that recombinant Lkn-1 is a stronger agonist for CCR1 than hMIP-1α or RANTES, which is a seventh investigation of the reaction according to the concentration of recombinant Lkn-1 and hMIP-1α. The results in (C) are also clearly demonstrated.

아울러, 제 7(B)에서 보듯이, CCR3-HOS 세포가 먼저 에오탁신으로 자극되는 경우, 추후의 에오탁신 또는 재조합 Lkn-1 자극에 대해서 거의 완전한 탈감작 반응이 나타나고; CCR3-HOS 세포가 먼저 재조합 Lkn-1으로 자극되는 경우, 추후의 RANTES 자극에 대해서는 거의 완전한 탈감작 반응이 나타나는 반면에; CCR3-HOS 세포가 먼저 재조합 Lkn-1 또는 RANTES로 자극되는 경우, 추후의 에오탁신 자극에 대한 반응은 영향을 받지 않는 것을 알 수 있었다. 또한, 에오탁신, 재조합 Lkn-1, RANTES의 농도에 따른 반응을 조사한 결과(참조: 제 7(D)도), 재조합 Lkn-1은 에오탁신보다 강력하지 못하나, RANTES보다는 CCR3에 대한 강력한 작용물질임을 알 수 있었다.In addition, as shown in 7 (B), when CCR3-HOS cells are first stimulated with eotaxin, a nearly complete desensitization response to subsequent eotaxin or recombinant Lkn-1 stimulation occurs; When CCR3-HOS cells are first stimulated with recombinant Lkn-1, an almost complete desensitization response to subsequent RANTES stimulation occurs; When CCR3-HOS cells were first stimulated with recombinant Lkn-1 or RANTES, it was found that subsequent responses to eotaxin stimulation were not affected. In addition, as a result of examining the reaction according to the concentrations of eotaxin, recombinant Lkn-1, and RANTES (see also FIG. 7 (D)), recombinant Lkn-1 is not as strong as eotaxin, but is a stronger agonist for CCR3 than RANTES. I could see that.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 사람의 단핵 세포주에서 분리한 신규의 C6 β-케모카인 Lkn-1 cDNA 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공한다. Lkn-1 cDNA 개방해독틀은 21개의 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드를 포함하여 총 113개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 그 중 92개의 아미노산으로 구성된 성숙 단백질의 분자량은 10,162달톤으로 추정되었다. 전기 Lkn-1 cDNA를 재조합 대장균 또는 곤충세포에서 발현시켜 순수분리한 재조합 Lkn-1은 콜로니 형성을 유의적으로 억제하고, 림프구, 단핵구, 호중구을 유인하는 화학주성을 가지며, CCR1 및 CCR3의 수용체에 결합하는 것으로 확인되었다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a novel C6 β-chemokine Lkn-1 cDNA isolated from human mononuclear cell lines and amino acid sequences inferred therefrom. The Lkn-1 cDNA open reading frame encodes a total of 113 amino acids, including a signal peptide consisting of 21 amino acids, of which the molecular weight of the mature protein consisting of 92 amino acids is estimated to be 10,162 Daltons. Recombinant Lkn-1 purified by expressing the aforementioned Lkn-1 cDNA in recombinant E. coli or insect cells significantly inhibits colony formation, has chemotaxis that attracts lymphocytes, monocytes and neutrophils, and binds to receptors of CCR1 and CCR3. It was confirmed that.

이 재조합 Lkn-1 단백질은 항체 제조, HIV-1 감염시의 치료, 화학요법이나 방사선치료시의 골수 간세포 보호 및 백혈병 억제자 등에 이용할 수 있다.The recombinant Lkn-1 protein can be used for antibody production, treatment during HIV-1 infection, bone marrow hepatocyte protection during chemotherapy or radiation therapy, leukemia inhibitor, and the like.

Claims (11)

하기와 같은 염기서열을 가지는 사람의 C6 β-케모카인 Lkn-1(leukotactin-1)의 cDNA 또는 이 염기서열에서 1번부터 63번까지의 염기가 제거된 cDNA를 포함하는 발현벡터.An expression vector comprising a cDNA of human C6 β-chemokine Lkn-1 (leukotactin-1) having the following nucleotide sequence, or a cDNA from which the bases 1 to 63 are removed from the nucleotide sequence. 제 1항에 있어서, 발현벡터는 pET21a-Lkn-1인 것을 특징으로 하는 발현벡터.The expression vector of claim 1, wherein the expression vector is pET21a-Lkn-1. 제 1항에 있어서, 발현벡터는 PVL 1392-Lkn-1인 것을 특징으로 하는 발현벡터.The expression vector according to claim 1, wherein the expression vector is PVL 1392-Lkn-1. 제 2항의 발현벡터로 형질전환된 대장균(Escherichia coli(XL-1 Blue) hMRP-2)(ATCC 98166).E. coli (Escherichia coli (XL-1 Blue) hMRP-2) transformed with the expression vector of claim 2 (ATCC 98166). 제 1항의 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 다음, 형질전환체를 배양하여 재조합 Lkn-1(leukotactin-1)을 수득하는 공정을 포함하는 재조합 Lkn-1의 제조방법.A method for producing recombinant Lkn-1 comprising the step of transforming a host cell with the expression vector of claim 1 and then culturing the transformant to obtain recombinant Lkn-1 (leukotactin-1). 제 5항에 있어서, 숙주세포는 대장균 또는 곤충세포인 것을 특징으로 하는 재조합 Lkn-1의 제조방법.The method of claim 5, wherein the host cell is Escherichia coli or insect cell production method of recombinant Lkn-1. 제 1항의 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 다음, 형질전환체를 배양하여 재조합 Lkn-1(leukotactin-1)을 수득하는 공정에 의해 제조된 재조합 Lkn-1.The recombinant Lkn-1 prepared by the process of transforming the host cell with the expression vector of claim 1, and then culturing the transformant to obtain recombinant Lkn-1 (leukotactin-1). 제 7항에 있어서, 콜로니 형성 억제능을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 Lkn-1(leukotactin-1).8. Recombinant Lkn-1 (leukotactin-1) according to claim 7, which has an ability to inhibit colony formation. 제 7항에 있어서, 사람의 말초혈액 호중구, 단핵구 및 림프구에 대해서 강력한 화학주성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 Lkn-1(leukotactin-1).8. Recombinant Lkn-1 (leukotactin-1) according to claim 7, characterized by strong chemotaxis against human peripheral blood neutrophils, monocytes and lymphocytes. 제 7항에 있어서, 수용체 CCR1 및 CCR3에 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 Lkn-1(1eukotactin-1).8. Recombinant Lkn-1 (1eukotactin-1) according to claim 7, characterized in that it binds to receptors CCR1 and CCR3. 제 10항에 있어서, RANTES(regulated activated normal T cell expressed sequence) 및 hMIP-1α (huamn macrophage inflammatory protein-1 α)와는 수용체를 공유하지만, IL-8(interleukin-8)와는 수용체를 공유하지 않는 것을 특징으로 하는 재조합 Lkn-1(leukotactin-1).The method according to claim 10, wherein the receptor is shared with the regulated activated normal T cell expressed sequence (RANTES) and the huamn macrophage inflammatory protein-1 α (hMIP-1α), but not with IL-8 (interleukin-8). Characterized by recombinant Lkn-1 (leukotactin-1).
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