KR19990013797A - 사람의 세마포린 L(H-SemaL) 및 다른 종의 상응하는 세마포린 - Google Patents

사람의 세마포린 L(H-SemaL) 및 다른 종의 상응하는 세마포린 Download PDF

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로제르트
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Abstract

본 발명은 특별한 도메인 구조에 의해 구별되는 신규한 세마포린과 이의 유도체, 이들 세마포린을 암호화하는 핵산(DNA, RNA, cDNA)과 이들의 유도체, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 아직까지 기술되지 않았고, 예상치 못했던 도메인 구조로서 신규하고, 면역 시스템에서 생화학적 작용을 갖는 세마포린(면역조절 세마포린)에 관한 것이다. 신규한 세마포린은 L형 세마포린(Sema-L)로서 칭한다. 이들은 N-말단 시그날 펩티드, 독특한 Sema 도메인, 및 단백질의 C-말단 영역중에 면역글로불린-유사 도메인과 잠재적인 경막 도메인을 나타내는 소수성 도메인을 포함한다.

Description

사람의 세마포린 Ｌ(Ｈ-ＳｅｍａＬ) 및 다른 종의 상응하는 세마포린
본 발명은 특별한 도메인 구조에 의해 구별되는 신규한 세마포린과 이의 유도체, 이들 세마포린을 암호화하는 핵산(DNA, RNA, cDNA)과 이들의 유도체, 및 이들의 제조 방법과 용도에 관한 것이다.
세마포린은 보존 유전자 그룹의 일원으로서 콜로드킨에 의해 처음으로 기술되었다(참조: Kolodkin et al. (1993) Cell 75:1389-1399).
유전자 또는 다른 세마포린 유전자의 일부는 오늘날 클로닝되었고, 어떤 경우에는 특성화되었다. 현재까지, 총 5개의 사람(H-SemaIII, H-SemaV, H-SemaIV, H-SemaB 및 H-SemaE){참조: Kolodkin et al. (1993); Roche et al. (1996) Onkogene 12:1289-1297; Sekido et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4120-4125; Xiang et al. (1996) Genomics 32:39-48; Hall et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39:11780-11785; Yamada et al. (1997)[젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 제AB000220호]}, 8개의 쥐(마우스 유전자; M-Sema A 내지 M-Sema H){참조: Puschel et al. (1995) Neuron 14:941-948; Messerschmidt et al. (1995) Neuron 14:949-959; Inigaki et al. (1995) FEBS Letters 370:269-272; Adamas et al. (1996) Mech. Dev. 57:33-45; Christensen et al. (1996)(젠뱅크 수탁 번호 제Z80941호, 제Z93948호)}, 5개의 메추라기(닭)(콜랩신-1 내지 콜랩신-5){참조: Luo et al. (1993); Luo et al. (1995) Neuron 14:1131-1140} 및 래트(R-Sema-III){참조: Giger et al. (1996) J. Comp. Neurol. 375:378-392}, 줄무늬 물고기(zebra fish), 곤충[과실 파리(드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster; D-Sema I 및 D-Sema II), 딱정벌레(트리볼리움 컨퓨줌(Tribolium confusum: T-Sema-I), 메뚜기(쉬스토세르카 아메리카나(Schistocerca americana: G-Sema-I)]{참조: Kolodkin et al. (1993)} 및 선충(씨. 엘레간스(C. elegans): Ce-Sema){참조: Roy et al. (1994)(젠뱅크 수탁 번호 제U15667호)}으로 부터 수득한 유전자가 기술되어 있다. 또한, 두 개의 두진 비루스(poxvirus)[종두(ORF-A39) 및 두창(ORFA39-동종)]{참조: Kolodkin et al. (1993)} 및 알셀라핀 헤르페스 비루스(alcelaphine herpesvirus) 제1형(AHV-1)(AHV-Sema){참조: Ensser and Fleckenstein (1995) Gen. Virol. 76:1063-1067}도 세마포린과 상동성인 유전자를 갖는다.
표 1에는 지금까지 다양한 종류로 확인된 세마포린을 요약하고 있다. 표 1에는 세마포린의 명칭(칼럼 1), 사용된 다른 명칭(칼럼 2), 특별한 세마포린이 분리되는 종(칼럼 3) 및 공지된 경우에, 암호화된 단백질의 도메인 구조 및 염색체 위치에 대한 데이터(표 1의 칼럼 4), 유전자 서열이 유전자 데이터뱅크[예: EST(발현된 서열 택; expressed sequence tag) 데이터뱅크, EMBL(유럽 분자 생물학 실험실; European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg) 또는 NCBI(National Center for Biotechnology Inforamtion, Maryland, USA)] 내에 저장된 수탁 번호 및 이들 데이터가 발행된 상응하는 문헌(표 1의 칼럼 5)이 제시되어 있다.
지금까지 기술된 세마포린 유전자의 모든 유전자 생성물(암호화된 세마포린)은 이의 C-말단에 약 450 내지 500개 아미노산 길이의 독특한 Sema 도메인을 갖는 N-말단 시그날 펩티드를 갖는다. 고도로 보존된 아미노산 모티프 및 수많은 고도로 보존된 시스테인 잔기가 Sema 도메인 내에 위치한다. 유전자 생성물(세마포린)은 Sema 도메인 뒤에 이어지는, 하나 이상의 도메인으로 구성된 C-말단 서열에 있어서 상이하다. 이들은, 예를 들면, 이들의 C-말단 아미노산 서열에 경막(transmembrane) 도메인(TM), 면역글로불린-유사 도메인(Ig)(면역 글로불린의 불변 부분), 세포질 서열(CP), 프로세싱 시그날(P)[예: 컨센서스 서열(RXR)(여기서, R은 아미노산 아르기닌이고, X는 특정 아미노산이다)] 및/또는 친수성 C 말단(HPC)을 갖는다. 지금까지 기술된 세마포린은 C-말단의 도메인 구조의 차를 기준으로 하여 5개의 상이한 서브 그룹(I 내지 V)으로 나눌 수 있다:
I: 다른 도메인이 없으며, 분비됨(예: ORF-A49)
II Ig: 분비됨(경막 도메인이 없음)(예: AHV-Sema)
III Ig, TM, CP: 세포질 서열이 있으며, 막에 고정됨(예: CD 100)
IV Ig, (P), HPC: 친수성 C 말단이 있으며, 분비됨(예: H-Sema III, M-SemaD, 콜랩신-1)
V Ig, TM, CP: C-말단 7개의 트롬보스폰딘 모티프를 가지며, 막에 고정됨(예: M-SemaF 및 G)
세마포린에 대한 수용체 또는 세포외 리간드는 지금까지 기술되고 있지 않다. 세포내 이종 삼량체성 GTP-결합 단백질 복합체는 세마포린 매개된 효과와 관련하여 기술되어 왔다. 닭에서 확인된 이들 단백질 복합체의 한 성분은 CRMP(콜랩신 반응 매개체 단백질)로 불리우며, 세마포린-유도된 세포내 시그날 캐스케이드의 한 성분인 것으로 예상된다(참조: Goshima et al. (1995) Nature 376:509-514). 예를 들면, CRMP62는 축삭돌기의 직접적인 성장에 필수적인 unc-33, 선충 단백질과 상동성이다. CRMP62와 98%의 아미노산 동일성을 갖는 사람의 단백질이 마찬가지로 공지되어 있다(참조: Hamajima et al. (1996) Gene 180:157-163). 수개의 CRMP-관련 유전자가 래트에서도 마찬가지로 기술되어 왔다(참조: Wang et al. (1996) Neurosci, 16:6197-6207).
분비된 또는 경막 세마포린은 신경 버드의 성장에 대한 반발 시그날을 전달한다. 이들은 중추신경계(CNS)의 성장시 일정 역할을 하며, 특히 근육 및 신경 조직에서 발현된다(참조: Kolodkin et al. (1993); Luo et al. (1993) Cell 75:217-227).
M-SemaG의 두드러진 발현은 밀접하게 관련된 M-SemaF와는 대조적으로, CNS에서 뿐만 아니라, 림프 및 조혈 시스템의 세포에서도 관찰되어 왔다(참조: Furuyima et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:33376-33381).
최근에, 특히 염색체 3p21.3상의 영역에서 두 개의 다른 사람 세마포린, H-Sema IV 및 H-Sema V이 동정되었는데, 이의 결실은 다양한 유형의 기관지 암종과 관련이 있다. H-Sema IV{참조: Roche et al. (1996), Xiang et al. (1996), Sekido et al. (1996)}는 아미노산 수준이 M-SemaE와 약 50% 동일한 반면에, H-Sema V{참조: Sekido et al. (1996)}는 M-SemaA의 직접적인 상동체이다(아미노산 86% 동일). 이들 유전자(H-Sema IV 및 V)는 결실된 3p21.3 좌에 대한 DNA 서열화 과정 중에 발견되었으로, 이들 두 개의 유전자의 복잡한 인트론-엑손 구조는 공지되어 있다. 두 개의 유전자는 모두 다양한 뉴런 및 비 뉴런 조직에서 발현된다.
마찬가지로 단지 최근에, 활성화된 T 세포에서 발현되고 유도되는 세포성 표면 분자 CD100(사람)이 세마포린(마찬가지로, 표 1에 제시됨)으로서 확인되었다. 이는 CD40 수용체 및 상응하는 리간드 CD40L을 통하여 B 세포와의 상호작용을 돕는다. CD100은 150 kd(kilodalton)의 막-고정된 당단백질 이량체이다. CD100의 세포질내 C-말단과 아직까지 공지되지 않은 키나제와의 결합이 기술되어 왔다{참조: Hall et al. (1996)}. 이는 CD100이 면역 시스템의 세포내의 발현이 알려진 첫 번째이자, 지금까지 유일한 세마포린임을 의미하는 것이다.
라디노비루스(rhadinoviruse)의 형질전환 유전자 프로젝트에서, 알셀라핀 헤르페스 비루스 제1형(AHV-1)의 완전한 게놈은 클로닝되었고, 서열화되었다{참조: Ensser et al. (1995)}. AHV-1은 림프세포 증식성 증후군과 관련이 있으며, 대개는 다양한 반추류의 치명적인 질환인, 악성 카타르성 열병의 원인성 제제이다. 분석시, 멀지만 세마포린 유전자 그룹으로 지정된 종두 비루스[ORF-A39는 문헌(참조: Ensser et al. (1995) J. Gen. Virol. 76:1063-1067)에서 VAC-A39에 상응한다]의 유전자와 상당히 상동인 비루스 게놈의 한 말단에서 개방 판독 프레임이 발견되었다. AHV-1 세마포린(AHV-Sema)은 잘 보존된 세마포린 구조를 가지는 반면에, 두진 비루스 유전자(ORF-A39 및 ORF-A39-상동체, 표 1 참조)는 C-말단이 절단된다, 즉 보존된 Sema 도메인이 단지 불완전하게 그들 내에 존재한다.
발견된 AHV-Sema와 dbEST[EST(발현된 서열 택) 데이터뱅크(db)]의 데이터뱅크 비교는 각각의 경우에 사람의 태반으로 부터 수득한 2개의 독립된 cDNA 클론으로 부터 2개의 EST 서열을 제공한다[수탁 번호 제H02902호, 제H03806호(클론 151129), 수탁 번호 제R33439호 및 제R33537호(클론 135941)]. 이들은 지금까지 기술된 뉴런 세마포린 보다는 AHV-1 세마포린에 훨씬 더 상동성인 것으로 나타난다.
본 발명은 아직까지 기술되지 않았고, 예상치 못했던 도메인 구조로서 신규하고, 면역 시스템에서 생화학적 작용을 갖는 세마포린(면역조절 세마포린)에 관한 것이다. 신규한 세마포린을 L형 세마포린(SemaL)으로서 칭한다. 이들은 N-말단 시그날 펩티드, 독특한 Sema 도메인, 및 단백질의 C-말단 영역중에 면역글로불린-유사 도메인과 잠재적인 경막 도메인을 나타내는 소수성 도메인을 포함한다.
시그날 펩티드의 아미노산 서열은 70개 보다 작은, 바람직하게는 60개 보다 작은 수의 아미노산 및 20개 보다 많은, 바람직하게는 30개 보다 많은 수의 아미노산을 가질 수 있고, 특히 바람직한 길이는 약 40 내지 50개의 아미노산이다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 시그날 펩티드의 길이는 44개의 아미노산이다, 즉 시그날 펩티다제의 절단 부위는 아미노산 44번 및 45번 사이에 위치한다.
Sema 도메인은 300 내지 700개 또는 그 이상, 바람직하게는 약 400 내지 600개의 아미노산 길이를 가질 수 있다. 바람직한 Sema 도메인은 450 내지 550개의 아미노산, 바람직하게는 약 500개의 아미노산 길이를 갖는다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, Sema 도메인은 시그날 펩티드에 결합되며, 이 경우에 Sema 도메인은 바람직하게는 545번의 아미노산까지 연장된다.
면역글로불린-유사 도메인은 약 30 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 가질 수 있고, 바람직한 길이는 50 내지 90개, 특히 바람직하게는 약 70개의 아미노산이다.
경막 도메인은 약 10 내지 35개, 바람직하게는 약 15 내지 30개, 특히 바람직하게는 약 20 내지 25개의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
도 1: H-Sema-L의 조직 특이적 발현.
A) 다중 조직 노던 블롯(Clontech, Heidelberg, Germany). 좌측에서 우측으로 로딩: 비장, 흉선, 전립선, 정소, 난소, 소장, 대장 점막, 말초(혈액) 백혈구로 부터 수득한 폴리-A-RNA를 각각의 레인에 2㎍ 로딩. 크기 표준을 표시한다.
블롯은 염기쌍 길이가 800인 H-SemaL 프로브와 엄격한 조건하에서 혼성화된다.
도 2: H-SemaL cDNA의 클로닝 및 H-SemaL 암호화 서열(H-SemaL 유전자)의 게놈 구성을 도시한 것임.
상부: EST 서열의 위치(수탁 번호; EST 서열의 위치는 AHV-Sema 서열에 대해 제시된다).
하부: 증폭시킨 PCR 및 RACE 생성물과, 완전한 H-SemaL cDNA 및 암호화된 단백질에 대한 개방 판독 프레임(ORF)에서의 위치에 대한 cDNA 클론의 위치.
기저: 게놈 서열에 대한 H-SemaL 유전자에서의 엑손의 상대적인 위치. 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 위치가 화살표로 제시되어 있다.
도 3: 계통수: 제시된 세마포린 서열의 다중 배열에 의해 수득함. 세마포린의 계통학적 관계는 계통수에서 이들의 그룹화로 부터 유추할 수 있다.
도 4: 다양한 세포주 및 다양한 세포 유형에서의 H-SemaL 발현의 FACS 분석(실시예 8 비교).
도 5: CD100 및 H-SemaL 발현의 비교 분석(실시예 9 비교).
도 6: HiFive 및 Sfg 세포에서의 분비성 사람의 SEMA-L(H-SemaL)의 발현(실시예 10 비교).
바쿨로비루스 시스템에서의 pMeIBac-A(인비트로겐)의 Aa 42 내지 649(Bac-N-Blue, 인비트로겐).
특이적 닭의 항혈청(1:100) 및 항-IgY-HRP 콘쥬게이트(1:3000, 토끼로 부터 수득, Jackson Lab.)를 사용하여 검출함.
1,4,6 감염되지 않은 HiFive 세포(혈청없음),
재조합 바쿨로비루스로 감염된 2,3,5,7,8 HiFive 세포(혈청없음),
M 레인보우 분자량 마커(Amersham RPN756),
9,10 감염된 Sf9 세포(혈청 함유 매질).
도 7: 항혈청의 특이성.
레인 1 내지 3: 닭 1; 레인 4 내지 6: 닭 2,
레인 1 및 4: 예비면역 혈청(Preimmune serum),
레인 2 및 5: 면역화 60일째,
레인 4 및 6: 면역화 105일째,
면역화는 H-SemaL의 아미노산 179 내지 378번(아미노-말단 His tag을 가짐)을 사용하여 수행한다(실시예 8, 섹션 1 비교).
도 8: pMeIBacA-H-SEMAL의 플라스미드 맵의 도시.
재조합 플라스미드는 실시예 11에 기술된 바와 같이 제조한다.
본 발명은 다양한 종, 특히 척추동물(예: 새 및/또는 어류), 바람직하게는 포유동물(예: 영장류, 래트, 토끼, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 돼지), 특히 바람직하게는 사람 및 마우스로 부터 수득한 L형 세마포린에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미생물, 특히 병원성 미생물, 예를 들면, 박테리아, 효모 및/또는 비루스(예: 레트로비루스), 특히 사람-병원성 미생물로 부터 수득한 상응하는 세마포린에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는 시그날 펩티드, Sema 도메인, 면역글로불린-유사 도메인 및 경막 도메인을 갖는 상응하는 사람 세마포린(H-SemaL)이다. 특정 양태는 표 4에 제시된 아미노산 서열에 의해 제공되는 세마포린이다.
본 발명의 다른 양태는 H-SemaL의 Sema 도메인(표 4의 서열의 아미노산 45번 내지 545번)에 대하여, Sema 도메인 영역의 아미노산 동일성이 40% 이상, 바람직하게는 50% 이상이고, 특히 바람직하게는 60% 이상인 다른 종의 상응하는 세마포린을 포함한다. 밀접하게 관련있는 종(예: 영장류, 마우스)의 상응하는 세마포린은 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상 및 특히 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성을 완전히 잘 가질 수 있다. 상동성%는, 예를 들면, GAP 프로그램(GCG 프로그램 패키지; Genetic Computer Group(1991))을 사용하여 측정하거나 계산할 수 있다.
이러한 본 발명의 양태는 상응하는 마우스 세마포린[쥐의 세마포린(M-SemaL)]이다. 이는, 예를 들면, 표 5에 제시된 부분적인 아미노산 서열을 함유한다[쥐의 세마포린(M-SemaL)].
본 발명은 또한 표 4에 제시된 H-SemaL의 완전한 아미노산 서열에 대하여, 덜 관련있는 종(계통 발생적으로 서로 매우 먼 종)의 경우에는 단지 약 15 내지 20%, 바람직하게는 25 내지 30%, 특히 바람직하게는 35 내지 40% 또는 그 이상의 아미노산 동일성(단백질의 아미노산 서열의 총 길이에 대해 고려됨)을 갖는 상응하는 세마포린에 관한 것이다.
L형 세마포린을 암호화하는 유전자는 복잡한 엑손-인트론 구조를 갖는다. 이들 유전자는, 예를 들면, 10 내지 20개의 엑손, 바람직하게는 약 11 내지 18개, 특히 바람직하게는 12 내지 16개의 엑손 및 상응하는 수의 인트론을 가질 수 있다. 그러나, 이들은 또한 H-SemaL 유전자와 동일한 수의 엑손 및 인트론(13 또는 15개의 엑손, 바람직하게는 14개의 엑손)을 가질 수 있다. 본 발명의 특별한 양태는 H-SemaL의 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 바람직하게는 8888 내지 10,000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 사람의 세마포린 유전자는 바람직하게는 표 14에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 젠뱅크R데이터뱅크에 기탁된 뉴클레오티드 서열(수탁 번호 제AF030697호)을 포함한다. 이들 뉴클레오티드 서열은 13개 이상의 인트론을 포함한다. 또한, 사람 세마포린 유전자는 5' 말단에 부가의 서열 영역을 갖는다. 이 영역은, 경우에 따라, 추가로 암호화 및 암호화되지 않은 서열, 예를 들면, 하나 또는 두 개의 인트론 또는 엑손을 추가로 포함한다.
염색체에 사람의 L형 세마포린을 위치시키기 위한 시도로 부터 상응하는 유전자는 위치 15q22.3-23에 존재함을 알 수 있다. M-SemaL에 대한 유전자는 상응하게 9A3.3-B의 위치에 존재한다.
복잡한 인트론-엑손 구조의 결과로서, 세마포린 mRNA의 1차 전사체의 스플라이싱이 변할 수 있고, 따라서 세마포린의 상이한 스플라이싱 변이체(splicing variant)가 생성될 수 있다. 이들 스플라이싱 변이체로 부터 해독된 단백질이 본 발명에 따르는 세마포린의 유도체이다. 이들은 이들의 아미노산 서열 및 또한 실질적으로 이들의 도메인 구조가 본 발명에 따르는 상기 L형 세마포린에 상응하지만, 경우에 따라, 후자에 비해 말단-절단형이다. 예를 들면, 전체적으로 또는 부분적으로 경막 도메인이 결여된 스플라이싱 변이체가 형성될 수 있다. 불완전한 경막 도메인을 포함하거나 이를 전혀 포함하지 않으면서, 시그날 펩티드는 포함하는 세마포린 유도체가 분비될 수 있고, 이러한 방법으로 세포 밖으로, 국부적으로 또는 그 밖의 비교적 먼 거리에 대하여, 예를 들면, 다른 세포에 대하여 효과를 갖는다. 다른 스플라이싱 변이체는, 예를 들면, 시그날 펩티드를 암호화하는 서열 및, 경우에 따라, 잠재적인 경막 도메인을 나타내는 소수성 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 더 이상 포함할 수 없다. 한 결과는 이러한 세마포린 유도체가 막으로 혼입되거나 분비되지 않는다는 것이다(분비낭을 통하지 않는 경우). 이러한 세마포린 유도체는 세포내 과정, 예를 들면, 시그날 형질 도입 과정에 관여할 수 있다. 이러한 방법으로 광범위하고 다양한 세포내 및 세포외 과정을 동일한 염기성 분자(L형 세마포린) 및 이로 부터 유도된 유도체(예: 스플라이싱 변이체)를 사용하여 조절하고/하거나, 일치시킬 수 있다.
본 발명의 특별한 양태는 본 발명에 따르는 L형 세마포린으로 부터 유도되지만, 불완전한 경막 도메인을 포함하거나 이를 전혀 포함하지 않는 세마포린 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따르는 L형 세마포린으로 부터 유도되지만, 시그날 펩티드를 포함하지 않는 세마포린 유도체에 관한 것이다.
시그날 펩티드에는 또한 해독후 제거가 일어날 수 있다. 이는 말단-절단된 도메인 구조를 갖는 막-결합되거나(TM 도메인이 있음) 분비된(TM 도메인이 없는 스플라이싱 변이체) 세마포린 유도체를 형성한다. 이러한 방법으로 해독후 프로세싱이 이루어진 세마포린 유도체는 단지 Sema 도메인, Ig 도메인 및, 경우에 따라, 경막 도메인만을 포함한다. 시그날 펩티드 절단 부위는, 예를 들면, 시그날 펩티드의 말단에 바로 위치할 수 있지만, 예를 들면, 아미노 말단으로 부터 40 내지 50개의 아미노산 또는 그 이상이 떨어진 거리에 위치할 수 있다.
말단-절단된(truncated)(즉, 수개의 도메인을 함유하는) 세마포린 L 유도체는 존재하는 도메인에서 L형 세마포린과 매우 큰( 90%) 아미노산 동일성 또는 동일한 아미노산 서열이 존재한다는 점에서 L형 세마포린으로 부터 유도되지 않은 다른 세마포린과 구별될 수 있다.
본 발명에 따르는 세마포린은 또한 다른 방법으로 해독후 개질될 수 있다. 예를 들면, 이들은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 이상으로 글리코실화(N- 및/또는 O-글리코실화)시킬 수 있다. 또한, 세마포린의 아미노산 서열은 잠재적인 글리코실화 부위, 바람직하게는 5개의 이러한 부위에 대하여 동일한 수 또는 그 이상의 컨센서스 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 한 양태는 글리코실화 부위가 H-SemaL 아미노산 서열의 105, 157, 258, 330 및 602번 위치에 대응하는 위치에 존재하는 세마포린에 관한 것이다(표 4).
또한, 세마포린은 이들의 포스포릴화 유도체의 형태일 수 있다. 세마포린은 다양한 키나제의 기질일 수 있는데, 예를 들면, 아미노산 서열은 단백질 키나제 C, 티로신 키나제 및/또는 크레아틴 키나제에 대한 컨센서스 서열을 가질 수 있다. 또한, 세마포린의 아미노산 서열은 잠재적인 미리스틸화 부위에 대한 컨센서스 서열을 가질 수 있다. 상응하는 세마포린 유도체는 이 부위에서 미리스트산으로 에스테르화될 수 있다.
본 발명에 따르는 L형 세마포린 및 이들의 유도체는 단량체, 이량체 및/또는 다량체의 형태일 수 있는데, 예를 들면, 둘 이상의 세마포린 또는 이들의 유도체는 분자간 디설파이드 브릿지에 의해 함께 결합될 수 있다. 또한, 분자내 디설파이드 브릿지도 형성될 수 있다.
본 발명에 따르는 세마포린의 다른 유도체는 융합 단백질이다. 이러한 형태의 융합 단백질은 한편, L형 세마포린 또는 이의 일부 및 또한, 다른 펩티드 또는 단백질이나 이의 일부를 함유한다. 펩티드 또는 단백질이나, 이의 일부는, 예를 들면, 융합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있는 에피토프 택(epitope tag)(예: His 택(6x히스티딘), Myc 택, flu 택) 또는 융합 단백질[예: GFP(Green fluorescent protein); 녹색 형광 단백질]을 표지화하는데 사용될 수 있는 에피토프 택일 수 있다. L형 세마포린 유도체의 예로는, 예를 들면, 실시예에 기술된 작제물이 제공된다. 이들 작제물의 서열은, 경우에 따라, 플라스미드에 관한 주를 참조로, 표 7 내지 표 15에서 발견할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 L형 세마포린 및/또는 이들의 유도체, 예를 들면, 상응하는 유전자, mRNA의 다양한 스플라이싱 변이체, 이에 상응하는 cDNA 및 이의 유도체(예: DNA 또는 RNA의 염)를 암호화하는 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 및 RNA 서열에 관한 것이다. 본 발명의 목적을 위한 유도체는, 예를 들면, 분자 생물학 방법에 의해 개질되고, 특별한 요건에 대해 채택된 서열 또는 이의 일부, 예를 들면, 말단-절단된 유전자 또는 유전자의 일부(예: 프로모터 서열, 종결자 서열) 이의 cDNA 또는 키메라, 발현 및 클로닝을 위한 작제물, 및 이의 염이다.
한 양태는 L형 세마포린의 게놈 서열(유전자)에 관한 것이다. 본 발명은 인트론 및 엑손 서열, 및 유전자 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 사일렌서(silencer) 서열에 관한 것이다.
이 양태는 한편, H-SemaL 또는 이의 유도체의 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 한편으로는, 표 14에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 젠뱅크R데이터뱅크에 기탁된 뉴클레오티드 서열(수탁 번호 제AF030697호)을 포함하는 유전자에 관한 것이다.
이 양태는 또한 M-SemaL 및 이의 유도체의 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 H-SemaL의 cDNA 또는 이의 유도체(예: cDNA의 일부)에 관한 것이다. 특별한 양태는 표 2의 뉴클레오티드 서열에 따르는 H-SemaL의 cDNA이다. 본 발명은 또한 젠뱅크R데이터뱅크에 기탁된 H-SemaL의 cDNA(수탁 번호 제AF030698호)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 cDNA에 대응하는 mRNA 또는 이의 일부에 관한 것이다.
본 발명은 또한 M-SemaL의 cDNA 또는 이의 유도체(예: cDNA의 일부)에 관한 것이다. 특별한 양태는 표 3에 제시된 M-SemaL의 부분적인 cDNA 및 이러한 부분적인 cDNA 서열을 포함하는 cDNA 서열이다. 본 발명의 다른 양태는 젠뱅크 데이터뱅크에 기탁된 M-SemaL의 cDNA(수탁 번호 제AF030699호)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 cDNA에 대응하는 mRNA 또는 이의 일부에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 기술된 세마포린 서열과는 단지 다소 상이하고, 동일하거나 단지 다소 개질된 단백질(아미노산 서열이 10% 이하로 상이함)(유도체의 다른 예)을 암호화하는 유전자/mRNA/cDNA의 대립 형질 및/또는 개개의 발현 형태를 포함한다. 유도체의 다른 예는 실시예에 제시되는 작제물로 제공된다. 이들 작제물의 서열은 표 7 내지 표 14에 도시되어 있고, 플라스미드의 주를 참고로 해석할 수 있다.
본 발명은 또한 L형 세마포린 또는 이의 유도체를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 이러한 형태의 플라스미드는, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)에서 DNA의 증폭에 적절한 높은 복제 속도를 갖는 플라스미드일 수 있다.
특정 양태는 세마포린 또는 이의 일부나 이들의 유도체가 원핵 및/또는 진핵 발현 시스템에서 발현될 수 있도록 하는 발현 플라스미드를 포함한다. 구성적(constitutive) 발현 플라스미드 및 유도성 프로모터를 함유하는 것이 모두 적절하다.
본 발명은 또한 L형 세마포린 또는 이의 유도체를 암호화하는 핵산의 제조 방법에 관한 것이다. 이들 핵산(예: DNA 또는 RNA)은, 예를 들면, 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 특히, 이들 핵산, 예를 들면, 상응하는 유전자 또는 cDNA나 이의 일부를 특정 프라이머 및 주형으로서 적절한 출발 물질(예: 적절한 조직 또는 게놈성 DNA로 부터 수득한 cDNA)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시킬 수 있다. 세마포린 L cDNA 및 H-SemaL 유전자의 구체적인 제조 방법이 실시예에 기술되어 있다.
또한, 본 발명은 L형 세마포린의 제조 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 세마포린 L 또는 이의 유도체는 L형 세마포린 또는 이의 유도체를 암호화하는 상응하는 핵산을 발현 벡터내로 클로닝하고, 후자의 재조합 벡터를 사용하여 적절한 세포를 형질 전환시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 원핵 또는 진핵 세포를 사용할 수 있다. L형 세마포린 또는 이의 유도체는 또한, 경우에 따라, 화학적 방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, L형 세마포린 및 이의 유도체는, 예를 들면, 발현된 융합 단백질의 검출을 가능케하는 단백질 또는 펩티드와의 융합 단백질로서 예를 들면, GFP(녹색 형광 단백질)와의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 세마포린은 또한 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 에피토프 택, 예를 들면, Myc 및/또는 His(6x히스티딘) 및/또는 flu 택을 갖는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 상응하게, 이들 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 사용하거나 제조할 수 있다. 예를 들면, 세마포린 암호화 서열은 GFP 및/또는 에피토프 택(예: Myc 택, His 택, flu 택)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드내로 클로닝될 수 있다. 이의 특정 예는 표에 제시된 예 및 서열에 의해 제공되는데, 경우에 따라, 플라스미드에 관한 주를 참조한다.
본 발명은 또한, L형 세마포린, 이의 유도체 또는 이의 일부를 인지하거나 이에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 이의 가능한 예로는, 예를 들면, 마우스, 토끼, 염소, 양, 닭 등에서 제조될 수 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체가 있다.
본 발명의 이러한 목적의 특별한 양태는 표 4에 제시된 H-SemaL 서열의 179 내지 378번 또는 480 내지 666번 위치의 아미노산 서열에 대응되는 에피토프에 대한 항체를 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 에피토프를 포함하는 제제 항원을 사용하는, 특이적 항-세마포린 L 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 재조합 융합 단백질의 후속 정제에 사용될 수 있는 독특한 세마포린 에피토프 및 에피토프 택으로 이루어진 융합 단백질을 사용하는, 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 정제된 융합 단백질은 이어서 면역화에 사용될 수 있다. 재조합 융합 단백질을 제조하기 위하여, 상응하는 재조합 발현 벡터를 제조하여, 적절한 세포를 형질 전환시키는데 사용한다. 재조합 융합 단백질은 이 세포로 부터 분리될 수 있다. 본 방법은, 예를 들면, 실시예 8에 기술된 것과 유사할 수 있다.
이들 항체는, 예를 들면, 상응하는 세마포린(예: H-SemaL) 및 이의 유도체는, 예를 들면, 친화성 칼럼상에서 정제하는데 사용되거나, 또는 단백질의 면역학적 검출, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot) 및/또는 면역조직화학에서 사용될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들면, 다양한 세포 유형 또는 세포주에서 H-SemaL의 발현을 분석하는데 사용될 수 있다.
H-SemaL의 cDNA는 2636개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다(표 2). H-SemaL cDNA의 유전자 생성물은 약 666개의 아미노산 길이를 가지며(표 4), L형 세마포린의 통상적인 도메인 구조를 나타낸다. 유전자 생성물은 N-말단 시그날 펩티드(아미노산 1 내지 44번), Sema 도메인(아미노산 45번 내지 약 아미노산 545번) 및 Ig(면역글로불린) 도메인(약 아미노산 550 내지 620번), 및 C-말단중에, 잠재적인 경막 도메인을 나타내는 소수성 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 도메인 구조는 세마포린에 대해 이전에 결코 기술된 적이 없다. 이는 아마도 세포 표면에 위치하고, 새로운 서브 그룹에 속하는 막-결합된 당단백질에 관한 것이다. 이러한 이전에 공지되지 않은 도메인 구조를 기초로 하여, 세마포린은 오늘날 VI개의 서브 그룹으로 나뉠 수 있다:
I: 다른 도메인이 없으며, 분비됨(예: ORF-A49)
II Ig: 분비됨(경막 도메인이 없음)(예: AHV-Sema)
III Ig, TM, CP: 세포질 서열이 있으며, 막에 고정됨(예: CD 100)
IV Ig, (P), HPC: 친수성 C 말단이 있으며, 분비됨(예: H-Sema-III, M-SemaD, 콜랩신-1)
V Ig, TM, CP: C-말단 7개의 트롬보스폰딘 모티프를 가지며, 막에 고정됨(예: M-SemaF 및 G)
VI Ig, TM: 막에 고정됨(예: H-SemaL, M-SemaL)
H-SemaL의 글리코실화되지 않고 프로세싱되지 않은 형태는 계산치 분자량 약 74.8 kd(74823 dalton)을 갖는다. (펩티드-소트, GCG 프로그램 패키지를 사용하여 계산함). 등전점은 pH가 7.56인 것으로 계산된다.
가능한 시그날 펩티드 절단 부위는 아미노산 44번 및 45번 사이에 위치한다(표 3; 시그날P(http.//www.cbs.dtu.dk/services/시그날 P), 시그날 서열을 분석하기 위한 신경 조직망을 기본으로 하는 프로그램{참조: Nielsen H. et al. (1997) Protein Engineering 10:1-6}). 이는 프로세싱된 단백질(시그날 펩티드 없음)에 대해 70.3 kd(7023 dalton)의 분자량(MW) 및 pH=7.01의 등전점을 제공한다.
게놈 구조도 마찬가지로, 실질적으로 밝혀졌다. H-SemaL 유전자는 13 또는 15개 이상의 엑손, 바람직하게는 14개의 엑손 및 12 또는 14개의 인트론, 바람직하게는 13개의 인트론을 갖는다. 이러한 복잡한 엑손-인트론 구조로 인하여, 다양한 스플라이싱 변이체가 가능하다. 전사된 H-SemaL 유전자의 mRNA는 특히, 태반, 생식샘, 흉선 및 비장에서 노던 블롯(Northern blot)에 의해 밝혀졌다. 뉴런 조직 또는 근조직에서는 mRNA가 검출되지 않는다. 특히, 내피 세포에서 조절된 발현이 입증되고 있다.
또 다른 스플라이싱에 의해, 예를 들면, CD100과 유사한, 세포내 시그날 형질 도입에 관여하는 세포질내 서열을 갖는 H-SemaL의 형태가 생성될 수 있다. 마찬가지로, 다른 스플라이싱에 의해 비루스성 AHV-Sema와 유사한, H-SemaL의 분비 형태가 생성될 수 있다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 분석은 GCG 프로그램 패키지(GCG 패키지에 대한 Genetic Computer Group (1991) Program 매뉴얼, Version 7, 575 Science Drive, Wisconsin, USA 53711), FASTA(Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 2444-2448) 및 BLAST 프로그램(Gish and States (1993) Nat. Genet. 3, 266-272; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410)을 사용하여 수행한다. 이들 프로그램은 또한 젠뱅크(Version 102.0) 및 스위스 프로트(Swiss Prot)(Version 34.0)와 서열 비교를 위하여 사용된다.
해독후 개질(예: H-SemaL의 글리코실화 및 미리스틸화)이 마찬가지로 가능하다. N-글리코실화 부위에 대한 컨센서스 서열은 프로사이트 프로그램(Prosite program)(GCG 프로그램 패키지)을 사용하여 H-SemaL의 아미노산 서열의 105, 157, 258, 330 및 602번의 위치(표 4에 제시됨)로 밝혀졌고, 미리스틸화의 경우는 114, 139, 271, 498, 499, 502 및 654번의 위치(컨센서스 서열: G∼(E, D, R, K, H, P, F, Y, W) x (S, T, A, G, C, N)∼(P))로 밝혀졌다. 또한, H-SemaL의 아미노산 서열은 다양한 키나제를 위한 잠재적인 포스포릴화 부위에 대한 수개의 컨센서스 서열을 포함한다. 따라서, H-SemaL은 다양한 키나제의 기질, 예를 들면, 크레아틴 키나제 2, 단백질 키나제 C 및 티로신 키나제에 대한 포스포릴화 부위일 수 있음을 예상할 수 있다.
아미노산 서열의 119, 131, 173, 338, 419 및 481번 위치인 예상되는 크레아틴 키나제의 2개의 포스포릴화 부위(컨센서스 서열 Ck2: (S,T)x2(D,E))(프로사이트, GCG).
아미노산 서열의 107, 115, 190, 296, 350, 431, 524 및 576번 위치인 예상되는 단백질 키나제 C의 포스포릴화 부위(컨센서스 서열 PkC: (S,T)x(R,K))(프로사이트, GCG).
아미노산 서열의 205번 위치인 예상되는 티로신 키나제의 포스포릴화 부위(컨센서스 서열: (R,K)x{2,3}(D,E)x{2,3}Y)(프로사이트, GCG).
컨센서스 서열은 아미노산에 대해 단일 문자 코드로 제시되어 있다.
인테그린의 RGD 모티프(아르기닌-글리신-아스파르트산) 특징이 267번에 위치한다. 글리코실화 부위는 비루스성 AHV-Sema, H-SemaL 및 (공지되어 있는 한)M-SemaL 사이에서 고도로 보존된다.
H-SemaL의 이량체화 또는 다량체화가 가능하고, 다른 세마포린(예: CD100)에 대해 기술되어 있다{참조: Hall et al. (1996)}. CD100 분자도 또한, 150 kd의 막 고정된 당단백질 이량체이다. 그러나, CD100은 본 발명에 따르는 사람의 세마포린(H-SemaL)과 밀접하게 관련되지 않는다.
M-SemaL의 부분적인 cDNA 서열은 1195개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 이 서열은 394개의 아미노산을 갖는 단백질을 암호화한다. 이들 394개의 아미노산은 H-SemaL의 아미노산 1 내지 396번에 대응한다. M-SemaL의 시그날 펩티드는 아미노산 1 내지 44번으로 연장된다(정확히, H-SemaL에서와 같이). Sema 도메인은 45번의 아미노산에서 출발되며, 표 4에 제시된 서열의 말단 또는 아마도 말단을 넘어서서 까지 연장된다.
다중 배열은 클러스탈 W 프로그램(Clustal W program)(참조: Thompson et al. (1994))을 사용하여 수행한다. 이들 배열은 SEAVIEW를 사용하여 수동으로 다시 처리한다(참조: Galtier et al. (1996) Comput. Appl. Biosci 12, 543-548). 계통학적 거리는 클러스탈 W를 사용하여 측정한다(참조: Thompson et al. (1994)).
공지 및 신규 세마포린의 단백질 서열의 비교 및 이들 서열의 계통학적 분석으로 부터, 유전자는 이들의 계통학적 관계에 따라 분류될 수 있음을 알 수 있다. 상응하는 세마포린 아형태의 C-말단 도메인 구조도 물론, 동일한 서브 그룹의 세마포린이 대개 상이한 서브 그룹의 세마포린 보다 계통학적으로 보다 밀접하게 관련이 있는지의 이유를 결정하는 요인으로서 여기에 관여된다. 세마포린이 분리되는 종은 또한 상응하는 종이 계통학적으로 서로 밀접하게 관련이 있던지 또는 없던지 간에 영향을 준다.
공지된 세마포린 아미노산 서열(표 4 및 표 5에 제시된 H-SemaL 및 M-SemaL에 대한 아미노산 서열 및 모든 다른 서열의 경우에는, 수탁 번호로 저장된 서열 또는 이들 서열로 부터 유도되는 암호화된 아미노산 서열을 사용하는, 완전한 서열 및/또는 일부 서열)의 CLUSTAL W 프로그램을 사용한 계통학적 분석(도 3 비교){참조: Thompson J. D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680}으로 부터 H-SemaL 및 M-SemaL의 아미노산 서열은 계통학적으로 서로 밀접하게 관련이 있고, 별개의 계통학적 그룹을 형성함을 알 수 있다. H-SemaL 및 M-SemaL은 또한, AHV-Sema 및 Vac-A39와 가장 밀접하게 계통학적으로 관련이 있다. 이들은 이전에 기술된 다른 세마포린 보다 서로가 특히 더욱 더 밀접하게 관련이 있다. 또한, 분석으로 부터 다른 세마포린도 또한 서로가 계통학적으로 밀접하게 관련이 있으며, 세마포린 내에서 별도의 그룹을 형성함을 알 수 있다. 예를 들면, 분비된 세마포린(예: H-Sema III, H-Sema IV, H-Sema V 및 H-Sema E)은 계통학적으로 한 그룹에 속한다. 다른 종 중에서의 이들의 동족체는 또한 이러한 아과에 속하는 반면에, 사람의 (경막) CD100은 상응하는 마우스 동족체(M-SemaG2) 및 콜랩신-4와 함께 하나의 계통학적 그룹에 속한다.
완전한 아미노산 서열과 관련하여, 계통학적 그룹 내에서 관찰된 상동체는 매우 밀접하게 관련이 있는 유전자(예: H-SemaE 및 M-SemaE 또는 -III/D)에 대해서는 약 90 내지 80%의 아미노산 동일성을 가지며, 덜 관련이 있는 세마포린의 유전자인 경우에는 40% 미만의 동일성을 갖는다. Sema 도메인에서, 관찰된 아미노산 동일성은 몇 % 더 높으며, 아미노산 서열의 전체 단백질에 대한 이의 큰 기여(단백질의 50 내지 80%가 Sema 도메인에 속함)로 인하여, 이는 상당히 전반적인 동일성에 영향을 준다. H-SemaL은 완전 단백질의 경우에, AHV-Sema와 46%가 동일한 것으로 계산되었지만, Sema 도메인 자체를 고려한다면, 아미노산 동일성은 54%이다. 이는, 예를 들면, M-SemaA 및 M-SemaE(43% 완전 단백질, 53% Sema 도메인)와 유사하게, 관련된 M-Sema-B 및 M-Sema-C(완전 단백질에 대하여 37%의 동일성, Sema 도메인에 대하여 43%의 동일성) 보다 높다. Sema 도메인 영역의 부분적인 M-SemaL 서열(표 6) 및 H-SemaL 서열(표 5) 사이의 아미노산 동일성은 93%가 됨으로써, 상응하게 상동성인 마우스 유전자가 포함됨을 예상할 수 있다. 다른 종에서 H-SemaL 및 M-SemaL에 상응하는 세마포린은 Sema 도메인 내에서 H-SemaL에 대하여 40% 이상의 아미노산 동일성을 가질 수 있다. 밀접하게 관련이 있는 척추 동물(포유류, 조류)에서는, 심지어 70% 초과의 아미노산 동일성이 발견될 수 있다.
세마포린은 비루스성 AHV-Sema에 대한 아미노산 동일성이 이전에 기술된 사람 및 쥐의 세마포린 보다 더 크고, 사람의 세마포린에 대해 이전에는 기술되지 않은 C-말단을 갖는 신규한 서브 그룹에 속한다. 이들 신규한 세마포린(서브 그룹의 일원)은 이들의 도메인 구조로 인하여, 서브 그룹 IV 및/또는 H-SemaL 및 M-SemaL과 동일한 계통학적 그룹에 속함으로써 구별되고/되거나, 완전한 아미노산 서열과 관련하여, H-SemaL에 대한 적어도 30 내지 40%, 바람직하게는 50 내지 60%, 특히 바람직하게는 70 내지 80% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 갖고/갖거나, Sema 도메인과 관련하여, H-SemaL에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 초과, 특히 바람직하게는 90% 초과의 아미노산 동일성을 갖는다.
L형 세마포린은 또한 상이한 형태의 생화학적 작용을 갖는다. 이들 세마포린의 한 신규한 기능은 면역 시스템의 조절이다.
H-SemaL은 비루스성 AHV 세마포린(AHV-Sema)과 가장 밀접하게 관련이 있다. 후자는 크기가 작지만, H-SemaL과는 대조적으로, 경막 도메인이 없다. AHV-Sema는 천연 숙주(블루 와일드비스트: blue wildbeest)에서 H-SemaL 등가 수용체(블루 와일드비스트에서의 L형 세마포린)를 차단하기 위하여, 아마도 비루스 감염된 세포에 의해 분비됨으로써, 면역 시스템의 공격을 피할 수 있다. 또한, 면역 시스템의 세포에 대한 반발제(화학 구산제: chemorepellant)로서 작용함을 알 수 있다.
신규한 L형 세마포린 및 이의 유도체의 생화학적 작용은 일반적으로 면역 조절 및/또는 염증 조절인 것으로서 여겨진다. 이들은 한편,
A) 면역 반응을 억제하는 분자로서, 예를 들면, 세포 표면 위의 경막 단백질의 경우에 국부적으로; 또는 예를 들면, 이들이 프로세싱(예: 프로테아제) 또는 또다른 스플라이싱으로 인하여, 예를 들면, 조직에서 확산에 의해 분비되는 경우에 보다 먼 거리에 대하여 화학 구산제 및/또는 면역 억제제로서의 이들의 효과를 나타낼 수 있다.
예를 들면, 혈관 내피의 세포 표면에서의 이들 신규한 L형 세마포린의 발현은 백혈구의 부착 및 혈관벽을 통한 이의 이동을 방지할 수 있다. 신규한 세마포린은 예를 들면, 혈액 뇌 관문, 태반 순환 및/또는 다른 면역학적으로 특이적인 위치(예: 이자섬)를 유지하기 위하여 특히, 중요하거나 노출된 기관의 감염을 방지하는 차단 효과를 유지하고/하거나, 자가면역 질환을 예방하는데 작용할 수 있다. 또한, 신규한 세마포린 및/또는 이들의 유도체는 다양한 조직에서, 예를 들면, 면역 시스템의 세포(예: 백혈구)에 대한 반발 시그날에 관여하여 방어 기전의 우발적인 활성화를 방지할 수 있다.
B) 또한, 신규한 세마포린 및/또는 이의 유도체는 보조 분자로서 작용할 수 있다. 세포 표면 위의 발현시, 이들은, 예를 들면, 비루스 감염의 경우에, 방어 기전의 활성화 부분으로서 면역 시스템의 세포와의 상호작용에 관여할 수 있다.
이는 신규한 L형 세마포린 및 이의 유도체와, 이들 단백질을 암호화하는 핵산의 수개의 가능한 용도를 나타내는 것이다.
작용 A): 이는 면역 억제제 및/또는 소염제를 주로 포함한다; 기관 이식 부분, 염증의 치료, 면역 치료 및 유전자 치료시에 수많은 잠재적인 사용 가능성이 존재한다.
예를 들면, 사람이 아닌 유전자 전이(transgenic) 동물은 세마포린 암호화 DNA 또는 이의 유도체를 사용하여 제조할 수 있다. 이들 동물의 가능한 한 용도는 기관 이식의 유전자 전이 모델에서 이식물의 거부 반응을 억제하는 것이다. 예를 들면, 거부 반응에 대해 보호된 유전자 전이 동물의 기관은 이물 이식(xenotransplantation)을 위하여 제조될 수 있다. 이는, 예를 들면, 다른 전이 유전자(transgene)(예: DAF 또는 CD59와 같은 보족 조절자)와 함께 가능해야만 한다. 다른 용도는 사람이 아닌 녹아웃된(knock-out) 동물, 예를 들면, 녹아웃된 마우스의 제조에 있으며(참조: Laboratory Protocols for Gene-Targeting, Torres and Kuhn (1997) Oxford University Press, ISBN 0-19-963677-X); 마우스 M-SemaL 유전자를 녹아웃시킴으로써, 예를 들면, 유전자의 다른 기능을 발견할 수 있다. 이들은 또한 마우스가 세마포린 유전자없이 생존할 수 있는 경우에, 염증성 질환에 대한 잠재적인 모델 시스템을 나타낸다. M-SemaL이 면역 조절에 중요한 경우에, 다수의 이러한 마우스가 기대된다. 또한, 사람이 아닌 녹인된(knock-in) 동물(예: 마우스)을 제조할 수 있다. 이는, 예를 들면, M-SemaL을 정상/개질된 H-SemaL 또는 개질된 M-SemaL에 의해 대체함을 수반한다(예: 구성적 및/또는 유도성 프로모터의 조절하에 신규한 세마포린 아형태의 통합). 이러한 형태의 동물은, 예를 들면, 신규 세마포린의 추가 기능, 예를 들면, 사람의 유전자 또는 이들 유전자의 유도체의 기능을 찾기 위하여 사용되거나, 면역 조절제를 확인하고 특성화하기 위하여 사용될 수 있다.
예를 들면, 재조합 면역 억제제, L형 세마포린의 아미노산 서열로 부터 유도된 다른 가용성 단백질 또는 펩티드(예: H-SemaL) 또는 상응하는 핵산(예: 유전자)을 제조하기 위하여 L형 세마포린 또는 이의 유도체를 암호화하는 핵산이 사용된다. 유사한 방법으로 구조적 유사성을 갖는 효능제(agonist)를 또한 제조할 수 있다. 이들 면역 억제제 또는 효능제는 자가면역 질환 및 염증성 질환 및/또는 기관 이식에 또한 사용될 수 있다.
L형 세마포린, 예를 들면, H-SemaL을 암호화하는 핵산 또는 이의 유도체에 의한 유전자 치료는 예를 들면, 비루스 방법 또는 비비루스 방법(nonviral method)을 사용한다. L형 세마포린은 자가면역 질환 및 염증성 질환, 기관의 형질도입 및 이식 전/도중/후 이식 거부 반응의 방지에 있어서의 용도를 갖는다.
신규한 세마포린 및/또는 이들 세마포린을 암호화하는 핵산 및 이의 유도체, 특히, H-SemaL, H-SemaL을 암호화하는 DNA 및 이의 유도체는 제제의 스크리닝 방법에, 예를 들면, 면역 조절제를 동정하고 특성화하는 방법에 사용될 수 있다.
작용 B): H-SemaL은 세포 표면에서 발현되는 보조 분자이고, 예를 들면, 시그날 경로의 활성화시 보조 분자로서, 예를 들면, 면역 시스템의 세포와의 상호작용에 관여한다. 비루스 유전자 또는 비루스의 유전자 생성물이나, 예를 들면, 미생물 근원의 다른 병원성 유전자는, 예를 들면, 이러한 보조 분자의 경쟁적 억제제로서 작용한다. 이러한 작용을 갖는 신규 세마포린의 한 용도는 마찬가지로, 기관 이식, 염증의 치료, 면역 치료 및/또는 유전자 치료에 있다.
예를 들면, 신규 세마포린은 길항제 또는 억제제의 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법으로 동정된 제제는, 예를 들면, 세마포린 수용체를 차단하는데 사용될 수 있다. 가용성 및/또는 분비된 H-SemaL 길항제 또는 억제제는, 예를 들면, 화학 물질이나, 신규 세마포린 또는 이들의 유도체일 수 있다(예: 막 도메인이 없는 이의 일부/말단-절단된 형태 또는 상응하는 수용체를 차단하는데 적합한 후자로 부터 유도된 Ig 융합 단백질 또는 펩티드). 이러한 방법으로 확인된 특이적 길항제 및/또는 억제제는, 예를 들면, 경쟁적 효과를 가질 수 있고, 예를 들면, 기관 이식의 유전자 전이 모델에서 거부 반응을 억제하고, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 기관 이식을 위하여 사용될 수 있다. 분자 생물학 방법을 사용하여 제조된 신규 세마포린을 암호화하는 핵산(예: DNA) 또는 이의 유도체는, 예를 들면, 사람이 아닌 유전자 전이 동물을 제조하는데 사용될 수 있다. 이들 유전자 전이 동물에서 H-SemaL의 과잉 발현으로 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환에 대한 감수성이 증가될 수 있다. 따라서, 이러한 유전자 전이 동물은 신규한 특이적 면역 조절제를 스크리닝하는데 적합하다.
이러한 핵산은 마찬가지로, 마우스 M-SemaL 유전자가 작동되지 않는 사람이 아닌 녹아웃된 동물(예: 녹아웃된 마우스)을 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 녹아웃된 동물은 유전자의 추가 생화학적 작용을 발견하는데 사용될 수 있다. 이들은 또한 마우스가 M-SemaL 유전자없이 생존할 수 있는 경우에, 염증성 질환에 대한 잠재적인 모델 시스템을 나타낸다.
DNA도 마찬가지로, 사람이 아닌 녹인된 동물(예: 마우스)을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 M-SemaL 유전자를 개질된 M-SemaL 유전자/cDNA 또는 임의로 개질된, 예를 들면, 돌연변이된, 다른 종(예: H-SemaL)의 L형 세마포린 유전자/cDNA에 의해 대체시키는 과정을 수반한다. 이러한 유전자 전이된 동물은 본 발명에 따르는 세마포린의 추가 기능을 발견하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 약제를 제조하는데 있어서, L형 세마포린 및 이의 유도체와, 이들 단백질을 암호화하는 핵산, 예를 들면, 유전자/cDNA 및 이들 세마포린을 사용하여 동정된 이의 유도체 및/또는 제제의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 유전자 치료시 사용될 수 있고, L형 세마포린(예: H-SemaL)의 발현의 효능제 및/또는 길항제를 포함하는 약제를 제조할 수 있다. 이를 위하여, 예를 들면, 비루스 및/또는 비비루스 방법을 사용할 수 있다. 이들 약제는, 예를 들면, 자가면역 질환 및 염증성 질환, 거부 반응을 방지하기 위하여 기관 이식 전 및/또는 이식 도중 및/또는 이식 후에 사용될 수 있다. 신규 세마포린, 예를 들면, 유전자, cDNA 및 이의 유도체를 암호화하는 핵산은 분자 생물학에서 보조제로서 또한 사용될 수 있다.
또한, 신규한 세마포린, 특히 H-SemaL 및 이의 핵산(예: 유전자/cDNA)은 신규 제제를 스크리닝 하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, H-SemaL 및/또는 M-SemaL로 부터 유도되는 개질된 단백질 및/또는 펩티드는, 예를 들면, H-SemaL 및 동족체의 발현 작제물을 사용하여 작용성 검정시 상응하는 수용체 및/또는 이의 길항제 또는 효능제를 발견하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 약물학적 제제, 특히 면역 조절제를 동정하는 방법에서의 L형 세마포린 또는 L형 세마포린을 암호화하는 핵산 서열의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약물학적 제제, 예를 들면, 면역 조절제를 확인하기 위하여 L형 세마포린 또는 이의 유도체나, L형 세마포린을 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 유도체를 사용하는 제제의 동정 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 예를 들면, L형 세마포린을 연구할 제제와 함께 한정된 조건하에서 배양시키고, 병행하여, 연구할 제제는 사용하지 않지만, 그 밖의 것은 동일한 조건하에서 제2 배치를 수행한 다음, 연구할 제제의 억제 또는 활성화 효과를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 예를 들면, L형 세마포린 또는 이의 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 한정된 조건하에서 연구할 제제의 존재하에 발현시키고, 발현 정도를 측정하는 제제의 동정 방법에 관한 것이다. 경우에 따라, 당해 방법에서 동일한 조건하에서, 연구할 제제의 양을 상이하게 함유하는 배치를 사용하여 두 개 이상의 배치를 동시에 수행할 수 있다. 예를 들면, 연구할 제제는 전사 및/또는 해독을 억제하거나 활성화시킬 수 있다.
L형 세마포린은 이의 비루스 동족체와 같이, 새로이 기술된 수용체 분자 VESPR에 결합될 수 있고(참조: Comeau et al. (1998) Immunity, Vol. 8, 473-482), 단핵 세포에서는, 아마도 세포 유착 분자(예: ICAM-1) 및 사이토킨(예: 인터루킨-6 및 인터루킨-8)의 유도를 유발할 수 있다. 이는 이의 활성화 및 세포 응집을 유도할 수 있다. VESPR 수용체의 발현 패턴은 H-SemaL과 유사하게 다소 흥미로운데, 예를 들면, 태반에서는 강한 발현 및 비장 조직에서는 두드러진 발현을 나타낸다. 플렉신 그룹의 아직까지 공지되지 않은 수용체 또는 다른 수용체와 같은 다른 것과의 상호작용이 가능하다. 자체 또는 다른 세마포린 형 분자와 또한 상호작용할 수 있다. L형 세마포린의 상호작용은 특히, Sema 도메인의 C-말단 영역에서 보존된 도메인을 통하여 일어날 수 있다.
플라스미드에 대한 주에 관하여:
pMeIBacA(인비트로겐, De Schelp, NL) 중의 pMeIBacA-H-SemaL(6622 bp)(서열 42). 뉴클레오티드 96 내지 98 ATG - 개시 코돈, 뉴클레오티드 96 내지 168 멜리틴 시그날 서열, 뉴클레오티드 168 내지 173 BamHI 절단 부위(PCR/클로닝), 뉴클레오티드 171 내지 1998 판독 프레임 SEMA-L 아미노산 42 내지 649번(자신의 시그날 서열이 존재하지 않고, 경막 서열이 존재하지 않음), 뉴클레오티드 1993 내지 1998 EcoRI 절단 부위(PCR/클로닝) 및 뉴클레오티드 1992 내지 1994 정지 코돈.
플라스미드 pCDNA3.1-H-SemaL-MychisA(7475 bp)(서열 35): 뉴클레오티드 954 내지 959 BamHI 절단 부위(클로닝), 뉴클레오티드 968 내지 970 ATG SEMAL, 뉴클레오티드 968 내지 2965 판독 프레임 SEMAL, 뉴클레오티드 2963 내지 2968 PmI I 절단 부위, 뉴클레오티드 2969 내지 2974 HindIII 절단 부위, 뉴클레오티드 2981 내지 3013 Myc tag, 뉴클레오티드 3026 내지 3033 6xHis tag, 뉴클레오티드 3034-3036 정지 코돈.
플라스미드 pCDNA3.1-H-SemaL-EGFP-MychisA(8192 bp):(서열 36): 뉴클레오티드 954 내지 959 BamHI 절단 부위(클로닝), 뉴클레오티드 968 내지 970 ATG SEMA-L, 뉴클레오티드 968 내지 2965 판독 프레임 SEMA-L, 뉴클레오티드 2963 내지 2965 half PmI I 절단 부위, 뉴클레오티드 2966 내지 3682 판독 프레임 EGFP(PmI I에서 클로닝됨), 뉴클레오티드 3683 내지 3685 half PmI I 절단 부위, 뉴클레오티드 3685 내지 3691 HindIII, 뉴클레오티드 3698 내지 3730 Myc tag, 뉴클레오티드 3743 내지 3760 6xHis tag 및 뉴클레오티드 3761-3763 정지 코돈.
벡터 pIND(인비트로겐, De Schelp, NL) 중의 플라스미드 pIND-H-SemaL-EA(7108 bp):(서열 38): 뉴클레오티드 533 내지 538 BamHI 절단 부위(클로닝), 뉴클레오티드 546 내지 548 ATG SEMA-L, 뉴클레오티드 546-판독 프레임 SEMA-L, 뉴클레오티드 2542 내지 2547 PmI I 절단 부위, 뉴클레오티드 2548 내지 2553 HindIII 절단 부위 및 뉴클레오티드 2563 내지 2565 정지 코돈.
벡터 pIND(인비트로겐, De Schelp, NL) 중의 플라스미드 pIND-H-SemaL-EE(총길이 7102 bp):(서열 37): 뉴클레오티드 533 내지 538 BamHI 절단 부위(클로닝), 뉴클레오티드 546 내지 548 ATG SEMA-L, 뉴클레오티드 546-판독 프레임 SEMA-L, 뉴클레오티드 2542 내지 2547 PmI I 절단 부위, 뉴클레오티드 2548 내지 2553 HindIII 절단 부위 및 뉴클레오티드 2560 내지 2595 Myc tag, 뉴클레오티드 2605 내지 2622 6xHis tag 및 뉴클레오티드 2623 내지 2625 정지 코돈.
벡터 pQE30(Qiagen, Hilden) 중의 플라스미드 pQE30-H-SemaL-179-378. seq(4019 bp)는 pQE30-H-SemaLBH(서열 39)에 대응한다: 뉴클레오티드 115 내지 117 ATG, 뉴클레오티드 127 내지 144 6xHis tag, 뉴클레오티드 145 내지 750 BamHI-HindIII PCR 단편 SEMA-L 아미노산(aa) 179 내지 378 및 뉴클레오티드 758 내지 760 정지 코돈.
벡터 pQE31(Qiagen, Hilden) 중의 플라스미드 pQE31-H-SemaL- (SH (3999 bp)(서열 40): 뉴클레오티드 115 내지 117 ATG, 뉴클레오티드 127 내지 144 6xHis tag, 뉴클레오티드(147 내지 152 BamHI), 뉴클레오티드 159 내지 729 SacI-HindIII 단편 SEMA-L(C-말단) aa480 내지 666 및 뉴클레오티드 734 내지 736 정지 코돈.
실시예:
실시예에 사용된 실험 조건:
사용된 PCR 프로그램:
Taq52-60(Ampli-TaqR폴리머라제 사용, Perkin Elmer, Weil der Stadt, Germany)
96℃/60s 1 사이클
96℃/15s-52℃/20s-70℃/60s 40 사이클
70℃/60s 1 사이클
Taq60-30
96℃/60s 1 사이클
96℃/15s-60℃/20s-70℃/30s 35 사이클
70℃/60s 1 사이클
Taq60-60
96℃/60s 1 사이클
96℃/15s-60℃/20s-70℃/60s 35 사이클
70℃/60s 1 사이클
Taq62-40
96℃/60s 1 사이클
96℃/15s-62℃/20s-70℃/40s 35 사이클
70℃/60s 1 사이클
Taq 폴리머라제를 사용한 PCR에 사용하기 위한 반응 조건:
주형 100 내지 200ng, dNTP 200μM, 각각의 프라이머 0.2 내지 0.4μM, Ampli-TaqR2.5U, 공급된 반응 완충액x10 5㎕를 포함하는 반응 혼합물 50㎕
사용 프로그램:
1. XL62-6(연장된 긴 주형 PCR 시스템R, Boehringer Mannheim, Germany)
94℃/60s 1 사이클
94℃/15s-62℃/30s-68℃/6min 10 사이클
94℃/15s-62℃/30s-68℃/(6min+15s/사이클) 25 사이클
68℃/7min 1 사이클
2. XL62-12(연장된 긴 주형 PCR 시스템R, Boehringer Mannheim, Germany)
94℃/60s 1 사이클
94℃/15s-62℃/30s-68℃/12min 10 사이클
94℃/15s-62℃/30s-68℃/(12min+15s/사이클) 25 사이클
68℃/7min 1 사이클
연장된 긴 주형 PCR 시스템을 사용하는 PCR에 대한 반응 조건:
주형 100 내지 200ng, dNTP 500μM, 각각의 프라이머 0.2 내지 0.4μM, 효소 혼합물 0.75㎕, 공급된 반응 완충액 제2호x10 5㎕를 포함하는 반응 혼합물 50㎕
실시예 1:
AHV-Sema 서열(Ensser Fleckenstein (1995), J. General Virol. 76:1063-1067)로 부터 개시하여, PCR 및 RACE-PCR을 수행한다. 여기에 사용된 출발 물질은 어댑터가 RACE 증폭을 위하여 그 위에 결합된 태반 조직으로 부터 수득한 사람의 cDNA이다(참조: MarathonTM-cDNA 증폭 키트, Clontech Laboratories GmbH Tullastrasse 4, 69126 Heidelberg, Germany). 먼저, 특이적 프라이머(No. 121234 + No. 121236, 표 6)를 길이가 약 800bp(염기쌍)인 PCR 단편을 증폭시키기 위하여 사용한다(PCR 프로그램: (Taq60-60)). 이를 클로닝시키고, 서열화한다(Taq 염료-데옥시 터미네이터 서열화 키트, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA/Brunnenweg 13, Weil der Stadt). PCR 생성물의 서열화로 두 개의 EST 서열과 동일한, AHV-Sema의 DNA 서열과 상당히 상동성인 서열이 나타난다.
600bp인 PCR 단편은 프라이머 쌍(No. 121237 + No. 121239)을 사용하여 확인한다. 이들은 동일한 유전자로 부터의 DNA 서열로 클로닝됨을 알 수 있다.
실시예 2:
실시예 1로 부터 수득한 800bp의 PCR 단편을 방사선 표지시키고(32P-α-dCTP를 사용하여 문헌{참조: Feinberg (1983) Anal. Biochem. 132:6-13}의 방법에 의해 랜덤 프라이밍시킴), 조직인 비장, 흉선, 전립선, 정소, 난소, 소장, 대장 및 백혈구(PBL)로 부터 수득한 mRNA 샘플을 함유하는 다중 조직 노던 블롯(참조: Human Multiple Tissue Northern Blot II, Clontech, Heidelberg, Germany)을 위한 프로브로서 사용한다. 이로 부터 비장 및 생식선(정소, 난소)에서는 길이가 약 3.3kb인 mRNA의 발현이 나타나고, 흉선 및 장에서는 덜 강하게 나타남을 명확히 알 수 있다. 매스터 블롯[수많은 조직으로 부터 수득한 RNA를 사용하는 도트-블롯(dot-blot)(Human RNA Master BlotTM, Clontech)]의 혼성화로 부터 이 결과가 확인되며, 태반 조직에서 또한 강한 발현을 나타낸다.
혼성화는 유력한 조건(5xSSC, 50mM Na 포스페이트 pH 6.8, 50% 포름아미드, 효모 RNA 100㎍/㎖)하에서 42℃에서 16시간 동안 수행한다. 블롯을 철저히 세척(65℃, 0.2XSSC, 0.1% SDS)하고, Fuji BAS2000 포스포이메이저(phosphoimager)TM에 노출시킨다.
실시예 3:
박테리오파아지 람다 gt10에서 클로닝시킨 사람의 비장으로 부터 수득한 cDNA 라이브러리(사람의 비장 5' STRETCH PLUS cDNA, Clontech)를 이 프로브로 스크리닝하고, 람다 클론을 동정한다. 이 클론내에 삽입된 길이가 1.6kb인 cDNA는 벡터-특이성 프라이머 No. 207608 + No. 207609(표 6)를 사용하여 PCR(ExpandTMLong Template PCR System, Boehringer Mannheim GmbH, Sandhofer Strasse 116, 68305 Mannheim)에 의해 증폭시키고(EcoRI 클로닝 부위를 플랭킹함), 생성된 PCR 단편을 서열화한다. 이 클론은 cDNA의 5' 말단을 함유하며, 3' 방향으로 공지된 cDNA 서열을 또한 연장시킨다. cDNA의 새로운 일부-서열로 부터 시작하여, RACE-PCR에 대한 새로운 프라이머를 생성한다(No. 232643, No. 232644, No. 233084, 표 6). 확실히 보다 우수한 성능 데이터(가열 및 냉각 속도)를 갖는 개선된 써모사이클러 기술(MJ-Research, Biozym Diagnostik GmbH, 31833 Hess, Oldendorf로 부터의 PTC-200)과 함께, 프라이머 No. 232644 및 No. 232643과 AP1을 사용하여 3'RACE-PCR 생성물을 증폭시키고, 벡터 pCR2.1(인비트로겐, De Schelp 12, 9351 NV Leek, The Netherlands)내로 클로닝시킨다. 3'RACE-PCR 생성물을 서열화하고, cDNA의 3' 말단을 이 방법으로 동정한다. 5' 방향으로의 RACE 증폭(프라이머 No. 131990 및 No. 233084와 AP1)으로 수개의 뉴클레오티드에 의해 cDNA의 5' 말단이 연장되고, 동정된 람다 클론에서 발견된 H-SemaL의 아미노 말단이 확인된다.
실시예 4:
짧은 쥐의 EST(수탁 번호 제AA260340호) 및 이로 부터 유도되는 프라이머 No. 260813(표 6)와 H-SemaL 특이적 프라이머 No. 121234(표 6)로 부터 시작하여, PCR(조건: Taq52-60)을 사용하여 길이가 약 840 bp인 쥐의 cDNA의 DNA 단편을 증폭시킨 다음, 벡터 pCR2.1로 클로닝시킨다. 이 DNA 단편을 포함하는 유전자는 M-SemaL로 불리운다. 생성된 M-SemaL DNA 단편은 마우스 비장으로 부터 수득한 cDNA 뱅크(마우스 비장 5'STRETCH cDNA, Clontech)를 시험하기 위하여 사용되며, 수개의 클론이 동정될 수 있다.
쥐의 내피 cDNA로 부터 수득된 프라이머 No. 260812 및 No. 260813을 사용하는 PCR(Taq 60-30)은 염기쌍의 길이가 244인 PCR 단편을 제공한다. PCR의 결과로 부터, 사이토킨 인터페론-γ 및 지방다당류로 자극시킨 후에 감소되는 쥐의 내피 세포에서의 독특한 기준 발현이 존재함을 알 수 있다.
실시예 5:
염색체에서 위치의 연구는 형광 윈 위치 혼성화(fluorescence in situ hybridization; FISH)에 의해 수행된다. 이를 위하여, 사람 및 쥐의 메타 상 염색체를 사람의 혈액 샘플 및 마우스의 세포주 BINE 4.8(Keyna et al. (1995) J. Immunol. 155, 5536-5542)로 부터 시작하여 각각 준비한다(참조: Kraus et al. (1994) Genomics 23, 272-274). 슬라이드를 리보뉴클레아제 및 펩신으로 처리한다(참조: Liehr et al. (1995) Appl. Cytogenetics 21, 185-188). 혼성화를 위하여, 사람 틈(nick)-해독된 세마포린 샘플 120㎎ 및 상응하는 마우스 샘플 200㎎을 사용한다. 혼성화는 각각의 경우에, 습윤된 챔버에서 COT1-DNA 4.0㎍ 및 STD 20㎍의 존재하에 37℃(3일)에서 수행한다.
슬라이드를 50% 포름아미드/2 x SSC(매회 45℃에서 5분 동안 3회)에 이어서, 2 x SSC(매회 37℃에서 5분 동안 3회)로 세척한 다음, 비오틴화 샘플을 FITC-아비딘 시스템을 사용하여 검출한다(참조: Liehr et al. (1995)). 슬라이드는 형광 현미경을 사용하여 분석한다. 각각의 실험에서 2중으로 수행하여 샘플당 25개의 메타 상을 평가한다. H-SemaL이 염색체 15q23에 위치하는 것으로 나타났다. 염색체에 인접하여 위치하는 것은 바르뎃-비들스 증후군(Bardet-Biedls syndrome) 및 테이-작스 병(Tay-Sachs disease)에 대한 좌이다(헥속사미니다제 A).
실시예 6:
H-SemaL 유전자의 게놈성 인트론-엑손 구조의 대부분이 밝혀졌다.
게놈성 DNA 단편을, PHA-자극된 말초 림프구(혈액)로 부터 분리된 사람의 게놈성 DNA 250㎎으로 부터 시작하여 증폭시킨다. 보다 짧은 단편은 Ampli TaqR(Perkin Elmer)을 사용하여 증폭시키고, 보다 긴 단편은 연장된 긴 주형 PCR 시스템R(Boehringer Mannheim)을 사용하여 증폭시킨다.
지금까지는, PCR 증폭에 의해 H-SemaL의 완전한 게놈 좌를 거의 클로닝시키고 특성화시킬 수 있었다. 8888 bp 보다 긴 게놈 서열을 이미 전체적으로 결정할 수 있으므로, 실질적으로 유전자의 인트론-엑손 구조를 설명할 수 있었다.
실시예 7:
발현 클로닝:
세마포린 유전자의 완전한 클론은 람다-gt10 cDNA 뱅크로 부터 분리될 수 없고, 완전한 클론은 PCR에 의해 수득될 수 없으므로, cDNA의 암호화 영역은 N-말단 DNA 단편인 경우에는, 프라이머 No. 240655 및 No. 121339를 사용하고, C-말단 DNA 단편인 경우에는, 프라이머 No. 240656(HindIII 및 Pmel 절단 부위를 포함함) 및 No. 121234를 사용하여 PCR(XL62-6)에 의해 2개의 중첩된 아단편으로 증폭시킨다. 생성된 DNA 단편(아단편)은 벡터 pCR21로 클로닝시킨다. 두 개의 아단편을 완전히 서열화시키고, 마지막으로 완전한 H-SemaL cDNA는 0.6kb의 C-말단 Sstl-HindIII 제한 단편을 N-말단 DNA 단편을 포함하고, 제한 효소 Sstl 및 HindIII으로 절단된 플라스미드내로 삽입시켜 제조한다. 이 플라스미드 pCR2.1-H-SemaL(표 7에 제시된 서열, 서열 34)로 부터, 완전한 유전자는 EcoRI 절단 부위(pCR2.1에서) 및 HindIII 절단 부위(프라이머 No. 240656에서, 표 6)를 사용하여 절단하고, 상응하게 절단된 구성적 발현 벡터 pCDNA3.1(-)MycHisA(인비트로겐)내로 결합시킨다. EcoRI-Apal 단편(Myc-His tag없음)을 생성된 재조합 플라스미드 pCDNA3.1(-)H-SemaL-MycHisA(표 8에 제시된 서열)로 부터 절단하고, 마찬가지로 이미 EcoRI-Apal로 절단시킨 유도될 수 있는 벡터 pIND(엑디손-유도성 포유동물 발현 시스템, 인비트로겐)로 결합시킨다. 재조합 플라스미드는 pIND-H-SemaLEA로 불리운다(표 11에 제시된 서열). pCDNA3.1(-)H-SemaL-MycHisA로 부터 수득한 EcoRI-Pmel 단편(Myc-His tag을 포함함)(표 9에 제시된 서열)을 EcoRI-EcoRV-절단 벡터 pIND내로 삽입시킨다. 재조합 플라스미드는 pIND-H-SemaL-EE로 불리운다(표 10에 제시된 서열).
개선된 녹색 형광 단백질(EGFP)과 H-SemaL의 융합 유전자는 PCR-증폭된 EGFP 판독 프레임(벡터 pEGFP-C1(Clontech)로 부터 수득함, 프라이머 No. 243068 + No. 243069를 사용함, Taq52-60)을 플라스미드 pCDNA3.1(-)H-SemaL-MycHisA의 Pmel 절단 부위내로 결합시켜 제조하며, 플라스미드 pCDNA3.1(-)H-SemaL-EGFP-MycHisA(표 9에 제시된 서열)가 생성된다.
표 7 내지 표 13의 소문자는 H-SemaL, 이의 일부 또는 이의 유도체의 서열을 나타내고, 큰 문자는 플라스미드의 서열을 나타낸다.
실시예 8:
H-SemaL 특이적 항체를 제조하기 위하여, H-SemaL의 cDNA 단편을 원핵 발현 벡터내로 통합시키고, 이. 콜라이에서 발현시켜, 세마포린 유도체를 정제한다. 세마포린 유도체는 His 택과의 융합 단백질로서 발현된다. 따라서, His 택에 대한 서열을 포함하고, 판독 프레임으로의 세마포린 cDNA 단편의 통합을 허용하는 벡터가 사용된다. N-말단 6x히스티딘 택은, 예를 들면, 닉켈 킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있도록 한다(참조: Qiagen GmbH, Max-Volmer Strasse 4, 40724 Hilden):
1. 아미노산 179 내지 378번을 암호화하는 H-SemaL cDNA의 일부는 프라이머 No. 150788 및 No. 150789를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 이 DNA 단편은 앞서 제한 효소 BamHI 및 HindIII으로 절단시킨 벡터 pQE30(Qiagen)으로 결합시킨다(작제물 pQE30-H-SemaL-BH(표 12에 제시된 서열)).
2. C-말단 아미노산 480 내지 666번을 암호화하는 H-SemaL cDNA의 부분은 플라스미드 pCR2.1로 부터의 제한 효소 Sstl 및 HindIII으로 절단하고, 앞서 Sstl 및 HindIII으로 절단시킨 벡터 pQE31(Qiagen)내로 결합시킨다(작제물 pQE31-H-SemaL-SH(표 13에 제시된 서열)).
정확한 판독 프레임에서 서열의 정확한 통합을 DNA 서열화로 체크한다. N-말단 6x히스티딘 택 및 H-SemaL의 세마포린의 일부로 이루어진 융합 단백질은 Ni2+친화성 크로마토그래피로 정제한다. 정제된 융합 단백질은 다양한 동물(토끼, 닭, 마우스)을 면역화시키는데 사용된다.
실시예 9:
다양한 세포 형태의 FACS 분석(도 4 및 도 5)
세포(약 0.2 내지 0.5 x 106)를 FACS 완충액(5% 태아 소 혈청(FCS) 및 0.1% Na 아지드를 함유하는 인산염 완충된 염수(PBS))으로 세척한 다음, 각각의 경우에 1시간 동안 항혈청(얼음 위에서)과 함께 배양시킨다. 대조용((오버레이 닭의 예비 면역 혈청(1:50)) 및 특이적 검출(특이적 염색)에 사용되는 주요 항체는 H-SemaL-특이적 닭의 항혈청(1:50)을 포함한다. H-SemaL의 아미노산(Aa) 179 내지 378번(N-말단 His tag을 포함)에 대한 항체를 갖는 특이적 항혈청은 Ni 킬레이트 친화성 크로마토그래피로 정제한 단백질로 닭을 면역화시켜 생성한다(실시예 8에 기술된 바와 같음). 사용된 제2 항체는 토끼로 부터 수득한 FITC-표지시킨 항-닭 F(ab') 항체이다(Dianova Jackson Laboratories, Order No. 303-095-006, Hamburg, Germany)(1㎎/㎖). FITC-표지시킨 토끼 항-마우스 IgG는 CD100 염색을 위하여 사용된다. 제2 항체는 각각의 경우에 FACS 완충액 중의 1:50 희석액으로 사용된다.
그 다음에, 세포를 세척하고, PBS에 재현탁시킨 다음, FACS에서 분석한다. FACS 분석은 FACS-트랙 장치(Becton-Dickinson)를 사용하여 수행한다. 기본 성분:단일 세포 현탁액을, 세포가 488㎚의 레이저 광으로 조사됨으로써, 형광 염료(FITC)가 여기되는 측정 채널을 통하여 통과시킨다. 광 산란된 전방(전방 산란기, FSC: 세포 크기와 상호 관련있음) 및 측면(측면 산란기, SSC: 입자 성분과 상호 관련있음: 상이한 세포 형태에서는 상이함)과 채널 1의 형광(FL 1)을 측정한다(FITC 방출 범위의 파장은 최대 530㎚임). 10,000개의 사상(event)(세포)을 매회 이러한 방법으로 측정한다.
도트 플롯(도 4a 내지 도 4k)(각각의 경우에 좌측의 도):범위 내에 유사한 크기 및 입자 성분의(균일한) 세포 집단을 갖는, SSC에 대한 FSC(입자 성분에 대한 크기/산란기)는 우측 윈도우에서 분석한다(각각의 경우에 관련있는 우측 도). 우측 윈도우는 사상의 수(Y 축)에 대한 FL 1의 강도(X 축), 즉 빈도 분포를 나타낸다.
이들 각각에 있어서, 대조용 혈청을 사용한 결과(충전되지 않은 커브)를 특이적 염색의 결과(충전된 커브) 위에 겹쳐 놓는다. 대조용에 비하여, 우측으로의 특이적 염색에 대한 커브의 이동은 상응하는 세포에서의 H-SemaL의 발현에 상응한다. 보다 큰 이동은 보다 강한 발현을 의미한다.
FACS 분석에 사용되는 세포주:
a) U937 세포주
ATCC(American Type Culture Collection); ATCC 번호: CRL-1593
명칭: U-937
조직: 림프종; 조직구; 세포; 단핵 세포-형
종: 사람
기탁자: 에이치. 코렌(H. Koren)
b) THP-1 세포주
ATCC 번호: TIB-202
조직: 단핵 세포; 급성 단구성 백혈병
종: 사람
기탁자: 에스. 쓰키야(S. Tsuchiya)
c) K-562 세포주
ATCC 번호: CCL-243
조직: 만성 골수성 백혈병
종: 사람
기탁자: 에이치. 티이. 홀덴(H. T. Holden)
d) L-428 세포주
DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)
GmbH, DSMZ No.: ACC 197
세포 형태: 사람의 호지킨 림프종
e) 유르캇(Jurkat) 세포주
DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)
GmbH, DSMZ No.: ACC 282
세포 유형: 사람의 T 세포 백혈병
f) 다우디(Daudi) 세포주
ATCC 번호: CCL-213
조직: 버키트 림프종; B 림프아세포; B 세포
종: 사람
기탁자: 지이. 클레인(G. Klein)
g) LCL 세포주
EBV-형질전환된 림프 아세포증 B 세포주
h) 지요예(Jiyoye)(P-2003) 세포주
ATCC 번호: CCL-87
조직: 버키트 림프종; B 세포, B 림프구
종: 사람
기탁자: 더블유. 헨레(W. Henle)
i) CBL-Mix57
재조합 에이치. 사이미리(H. Saimiri)(결실이 없는 야생형)로 형질전환된 사람의 T 세포주(혈액으로 부터 분리됨)
j) CBL-Mix59
에이치. 사이미리(ORF71의 결실)로 형질전환된 사람의 T 세포주(혈액으로 부터 분리됨).
실시예 10: 단백질 겔 및 웨스턴 블롯
분비될 수 있는 사람의 SEMA-L(표 4의 아미노산 42 내지 649번(시그날 펩티드 및 경막 도메인이 없음))을 플라스미드 pMelBac-A로 클로닝시키고(인비트로겐, De Schelp, Leck, The Netherlands, Cv 1950-20), 이러한 방법으로, 플라스미드 pMelBac-A-H-SemaL(길이 6622bp)을 제조한다(도 8). H-SemaL 유도체를 바쿨로비루스 시스템(Bac-N-Blue, 인비트로겐)에서 발현시킨다. 발현은 재조합, 플라크-정제된 바쿨로비루스로 감염시켜 곤충 알 세포 Sf9[스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로 부터] 및 High FiveTM[트리콜플루시아 ni(Trichoplusia ni)로 부터, 미합중국 특허 제5,300,435호, 인비트로겐으로 부터 입수]로 부터 유도된 세포주에서 수행한다.
발현은 제조자의 지시에 따라 수행한다.
그 다음에, 단백질을 겔에서 분별화시키고, H-SemaL 유도체를 웨스턴 블롯으로 검출한다. 검출은 H-SemaL-특이적 닭의 항혈청을 사용하여 수행한다(실시예 8 및 도 7 비교 바람)(희석 1:100). 특이적 닭의 항체는 제조자의 지시에 따라 항-IgY-HRP 콘쥬게이트(희석 1:3000, 당나귀로 부터 수득; Dianova Jackson Laboratories)를 사용하여 검출한다.
실시예 11: pMelBacA-H-SEMAL의 제조
재조합 벡터(pMelBacA-H-SEMAL, 6622bp)는 H-SemaL의 아미노산 42 내지 649번을 암호화하는 적절한 DNA 단편을 벡터 pMelBacA(4.8kb, 인비트로겐)내로 클로닝시켜 제조한다(pMelBacA-H-SEMAL에 대한 주 비교). 클로닝은 벡터에 존재하는 시그날 서열(꿀벌의 멜리틴 시그날 서열) 뒤의 프레임의 BamHI 및 EcoRI를 통하여 일어난다. 대응하는 H-SemaL DNA 단편은 프라이머 쌍 h-sema-1 baculo 5' 및 h-sema-1 baculo 3'를 사용하여 증폭시킨다.
증폭(TaKaRaEx Ta9 폴리머라제) 및 클로닝을 위한 프라이머:
시그날 서열 없이 증폭시키고, BamHI 절단 부위를 도입시키기 위한 h-sema-1 baculo 5'
5'-CCGGATCCGCCCAGGGCCACCTAAGGAGCGG-3'(서열 43)
경막 도메인 없이 증폭시키고, EcoRI 절단 부위를 도입시키기 위한 h-sema-1 baculo 3'
5'-CTGAATTCAGGAGCCAGGGCACAGGCATG-3'(서열 44).
다양한 종으로 부터 수득한 세마포린의 다양한 아형태
명칭 별칭 종 참조
H-Sema III (H-semaD) 사람 Sec. (Kolodkin et al. 1993)
CD100 사람 TM, IC; CD45 결합됨,T 세포에서 발현 (Hall et al. 1996)
H-SemaV (H-SemaA) 사람 Sec; 위치 3p21.3 (Sekido et al. 1996; Roche et al. 1996)
H-SemaIV (H-Sema3F) 사람 Sec; 위치 3p21.3 (Xiang et al. 1996;Sekido et al. 1996)
H-SemaE 사람 Sec.; 3' 말단에서 M-Sema E로 부터 이산됨 AB000220(Yamada 1997 공개되지 않음)
H-SemaK KIAA0331 사람 Sec. (Nagase et al. 1997)
H-SemaL SEMAL 사람 TM, IC없음 본 출원
M-SemaA 마우스 Sec. (Puschel et al. 1995)
M-SemaB 마우스 TM, IC (Puschel et al. 1995)
M-SemaC 마우스 TM, IC (Puschel et al. 1995)
M-SemaD M-Sema III 마우스 Sec. (Messersmith et al. 1995; Puschel et al. 1995)
M-SemaE 마우스 Sec., 5' 부분 서열 (Puschel et al. 1995)
M-SemaF1 M-SemaF 마우스 TM, IC (Inagaki et al. 1995)
M-SemaG2 M-SemaG 마우스 TM, IC; 림프샘 세포에서 발현, CD100의 마우스 상동체 (Furuyama et al. 1996)
M-SemaF2 M-SemaF 마우스 TM, IC; 트롬보스폰딘 모티프 (Adams et al. 1996)
M-SemaG1 M-SemaG 마우스 TM, IC; 트롬보스폰딘 모티프 (Adams et al. 1996)
M-SemaH 마우스 Sec. (Christensen 1996, 미공개됨) Z80941
M-Sema VIa 마우스 TM, IC (Zhou et al. 1997)
M-SemaL Semal 마우스 부분 서열 본 출원
콜랩신-1 닭 Sec. (Luo et al. 1993)
콜랩신-2 닭 Sec. (Luo et al. 1995)
콜랩신-3 닭 Sec. (Luo et al. 1995)
콜랩신-4 닭 부분 서열 (Luo et al. 1995)
콜랩신-5 닭 Sec. (Luo et al. 1995)
명칭 별칭 종 참조
R-Sema III 래트 Sec. (Giger et al. 1996)
T-Sema I 트리볼륨 컨퓨섬(Tribolium confusum) TM, IC (Kolodkin et al. 1993)
Ce-Sema I 씨. 엘레간스(C. elegans) TM, IC U15667(Roy 1994 미공개됨)
G-Sema I Fasciclin-IV 메뚜기 TM, IC (Kolodkin et al. 1992)
D-Sema I 초파리 TM, IC (Kolodkin et al. 1993)
D-Sema II 초파리 Sec. (Kolodkin et al. 1993)
AHV-Sema AHV-1 Sec. (Ensser und Fleckenstein, 1995)
ORF-A39 종두 Sec. (Kolodkin et al. 1993)
ORF-A39상동체 두창 Sec. (Kolodkin et al. 1993)
TM: 경막 도메인
Sec.: 분비됨
IC: 아마도 세포내 세포질 서열 모티프
H-SemaL의 cDNA 서열(2636 뉴클레오티드)(서열 1)
M-SemaL의 cDNA의 뉴클레오티드(부분적, 1195 뉴클레오티드)(서열 2)
H-SemaL의 아미노산 서열(666 아미노산)(서열 3)
M-SemaL의 (부분적) 아미노산 서열(394 아미노산, H-SemaL의 위치 1-396에 상응)(서열 4)
합성 올리고뉴클레오티드(공급원: 벨기에 세라닝 유로겐텍)
재조합 플라스미드 pCR2.1-H-SemaL의 뉴클레오티드 서열(서열 34)
재조합 발현 플라스미드 pCDNA3.1 (-)H-SemaL-MycHisA의 뉴클레오티드 서열(서열 35)
재조합 플라스미드 pcDNA3.1-H-SemaL-EGFP-MychisA의 뉴클레오티드 서열(서열 36)
재조합 플라스미드 pIND-H-SemaL-EE의 뉴클레오티드 서열(서열 37)
재조합 플라스미드 pIND-H-SemaL-EA의 뉴클레오티드 서열(서열 38)
재조합 플라스미드 pQE30-H-SemaL-BH의 서열(서열 39)
재조합 플라스미드 pQE31-H-SemaL-SH의 서열(서열 40)
사람 세마포린 L 유전자의 (부분적인)뉴클레오티드 서열(8888 뉴클레오티드)(서열 41)
pMelBacA-H-SEMAL의 뉴클레오티드 서열(6622 염기쌍)(서열 42)
본 발명은 특별한 도메인 구조에 의해 구별되는 신규한 세마포린에 관한 것으로서, 면역 시스템에서 생화학적 작용을 하여 면역 조절 및 염증 조절에 관여한다.
서열 목록
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 훽스트 마리온 러쎌 도이칠란트 게엠베하
(B) 거리: -
(C) 도시: 프랑크푸르트
(D) 주: -
(E)국가: 독일
(F) 우편번호: 69926
(G) 전화번호: 069-305-7175
(H) 팩스번호: 069-35-7175
(I) 텔랙스: -
(ii) 발명의 명칭: 사람 세마포린 L(H-SemaL) 및 다른 종의 상응하는 세마포린
(iii) 서열 수: 14
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PS 호환용
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: Patentin Release #1.0, 버전 #1.25(EPO)
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 2636 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..2636
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1195 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..1195
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 666 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 단백질
(B) 위치: 1..666
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 단백질
(B) 위치: 1..666
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 394 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 단백질
(B) 위치: 1..394
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 23 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..23
(xi) 서열 기술:
23
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 11 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 12 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..27
(xi) 서열 기술:
27
(2) 서열 13 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 14 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 23 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..23
(xi) 서열 기술:
23
(2) 서열 15 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 16 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 17 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..28
(xi) 서열 기술:
28
(2) 서열 18 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..25
(xi) 서열 기술:
25
(2) 서열 19 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 50 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..50
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..50
(xi) 서열 기술:
50
(2) 서열 20 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..27
(xi) 서열 기술:
27
(2) 서열 21 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..26
(xi) 서열 기술:
26
(2) 서열 22 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..22
(xi) 서열 기술:
22
(2) 서열 23 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..21
(xi) 서열 기술:
21
(2) 서열 24 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..26
(xi) 서열 기술:
26
(2) 서열 25 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..25
(xi) 서열 기술:
25
(2) 서열 26 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술:
20
(2) 서열 27 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 23 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..23
(xi) 서열 기술:
23
(2) 서열 28 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..31
(xi) 서열 기술:
31
(2) 서열 29 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..25
(xi) 서열 기술:
25
(2) 서열 30 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..24
(xi) 서열 기술:
24
(2) 서열 31 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..24
(xi) 서열 기술:
24
(2) 서열 32 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..25
(xi) 서열 기술:
25
(2) 서열 33 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..25
(xi) 서열 기술:
25
(2) 서열 34 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 5856 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..5856
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 35 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 7475 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..7475
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 36 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 8192 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..8192
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 37 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 700 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..7000
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 38 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 7108 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 39 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 4019 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..4019
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 40 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 3999 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..3999
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 41 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 8888 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..8888
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 42 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 6622 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..6622
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 43 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭/특징: 엑손
(B) 위치: 1..31
(xi) 서열 기술:
31
(2) 서열 44 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술:
29

Claims (20)

  1. N-말단 시그날 펩티드 및, C-말단 영역중에, 면역글로불린-유사 도메인과 경막 도메인을 포함하여 독특한 Sema 도메인을 갖는 단백질인 L형 세마포린(Sema-L) 및 L형 세마포린의 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 단백질(사람의 L형 세마포린(H-SemaL))이 아미노산 서열인 서열 3을 갖는 세마포린.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질의 Sema 도메인 영역이 H-SemaL의 Sema 도메인에 대해서 40% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 세마포린.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질이 부분 아미노산 서열인 서열 4(쥐의 세마포린(M-SemaL))를 포함하는 세마포린.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 L형 세마포린을 암호화하는 핵산 서열 및 이의 유도체를 포함하는 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 핵산 서열이 세마포린 L 유전자인 핵산.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 핵산 서열이 H-SemaL의 유전자를 포함하는 핵산.
  8. 제5항에 있어서, 핵산 서열이 L형 세마포린의 cDNA를 포함하는 핵산.
  9. 제8항에 있어서, cDNA가 H-SemaL의 cDNA인 핵산.
  10. 제8항에 있어서, cDNA가 M-SemaL의 cDNA인 핵산.
  11. L형 세마포린 또는 이의 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 발현 벡터내로 클로닝 하여 발현시킴을 포함하는, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 L형 세마포린의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 진핵 세포를 사용하여 발현시키는 방법.
  13. 면역학적 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 약제의 제조를 위한, L형 세마포린 또는 이의 유도체, L형 세마포린을 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 유도체의 용도.
  14. 유전자 치료에 있어서, 제13항에서 청구한 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 유도체의 용도.
  15. 면역 조절제를 동정하는 방법에 있어서, L형 세마포린 또는 L형 세마포린을 암호화하는 핵산 서열의 용도
  16. L형 세마포린을 시험할 제제와 함께 규정 조건하에서 항온 처리하고, 이와 병행하여 시험할 제제가 없는 것을 제외하고는 다른 모든 것은 동일한 조건하에서 제2 배치를 수행한 다음, 시험할 제제의 억제 또는 활성화 효과를 측정함을 포함하는, 면역 조절제의 동정 방법.
  17. L형 세마포린을 암호화하는 핵산 서열을 규정 조건하에서 시험할 제제의 존재하에 발현시키고, 발현 정도를 측정함을 포함하는, 면역 조절제의 동정 방법.
  18. 핵산을 특정 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭시키는, L형 세마포린을 암호화하는 핵산의 제조 방법.
  19. 서열 4의 아미노산 179 내지 378번에 대응하는 H-SemaL의 에피토프를 인지하거나, 서열 4의 아미노산 480 내지 666번에 대응하는 H-SemaL의 에피토프를 인지하는 세마포린 항체.
  20. 에피토프를 에피토프 택(tag)과의 융합 단백질로서 발현시키고, 이러한 에피토프 택을 통하여 정제시킨 다음, 정제된 융합 단백질을 면역화에 사용하는, 제19항에서 청구한 바와 같은 세마포린 항체의 제조 방법.
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