DE19805371A1 - Humanes Semaphorin L (H-Sema-L) und korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies - Google Patents
Humanes Semaphorin L (H-Sema-L) und korrespondierende Semaphorine in anderen SpeziesInfo
- Publication number
- DE19805371A1 DE19805371A1 DE1998105371 DE19805371A DE19805371A1 DE 19805371 A1 DE19805371 A1 DE 19805371A1 DE 1998105371 DE1998105371 DE 1998105371 DE 19805371 A DE19805371 A DE 19805371A DE 19805371 A1 DE19805371 A1 DE 19805371A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- sema
- semaphorin
- type
- nucleic acid
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Gegenstand der Erfindung sind neue Semaphorine, die sich durch eine besondere
Domänenstruktur auszeichnen und deren Derivate, Nukleinsäuren (DNA, RNA,
cDNA), die für diese Semaphorine kodieren und deren Derivate sowie die
Verwendung derselben.
Semaphorine wurden erstmals von Koldokin {Kolodkin et al. (1993) Cell 75: 1389-
1399} als Mitglieder einer konservierten Genfamilie beschrieben.
Inzwischen wurden die Gene bzw. Teile der Gene weiterer Semaphorine kloniert
und teilweise charakterisiert. Bisher waren insgesamt 5 humane (H-Sema-III,
H-Sema-V, H-Sema-IV, H-Sema-B und H-Sema-E) {Kolodkin et al. (1993); Roche et al.
(1996) Onkogene 12: 1289-1297; Sekido et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93: 4120-4125; Xiang et al. (1996) Genomics 32: 39-48; Hall et al. (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 39: 11780-11785; Yamada et al. (1997) (GenBank Zuordnungs-Nr.
AB000220)}, 8 murine (Gene der Maus; M-Sema A bis M-Sema-H) {Püschel et al.
(1995) Neuron 14: 941-948; Messerschmidt et al. (1995) Neuron 14: 949-959; Inigaki
et al. (1995) FEBS Letters 370: 269-272; Adams et al. (1996) Mech. Dev. 57: 33-45;
Christensen et al. (1996) (Genbank Zuordnungs-Nr. Z80941, Z93948)}, 5 gallide
(Huhn) (Collapsin-1 bis -5) {Luo et al. (1993); Luo et al. (1995) Neuron 14: 1131-
1140}, und Gene von Ratte (R-Sema-III) {Giger et al. (1996) J. Comp. Neurol.
375: 378-392}, Zebrafisch, Insekten (Fruchtfliege (Drosophila melanogaster:
D-Sema-I und D-Sema-II), Käfer (Tribolium confusum: T-Sema-I), Grasshüpfer
(Schistocerca americana: G-Sema-I)) {Kolodkin et al. (1993)}, und Nematoden
(C.elegans: Ce-Sema) {Roy et al. (1994) (GenBank Zuordnungs-Nr. U15667)}
bekannt. Weiterhin besitzen zwei Poxviren (Vaccinia (ORF-A39) und Variola
(ORFA39-homolog)) {Kolodkin et al. (1993)} sowie der Aleclaphine Herpesvirus Typ
1 (AHV-1) (AHV-Sema) {Ensser und Fleckenstein (1995) Gen. Virol. 76: 1067}
zu Semaphorinen homologe Gene.
Einen Überblick über die bisher identifizierten Semaphorine in verschiedenen
Spezies gibt Tabelle 1. In Tabelle 1 sind die Namen der Semaphorine, die
verwendeten Synonyme, die Spezies aus dem das jeweilige Semaphorin isoliert
wurde sowie, soweit bekannt, Daten zur Domänenstruktur des kodierten Proteins
und zur chromosomalen Lokalisation (Spalte 4 in Tabelle 1), die
Zuordnungsnummer unter der die Sequenz des Gens in Gendatenbanken, z. B. in
einer EST (expressed sequence tags) Datenbank, EMBL (European Molecular
Biology Laboratory, Heidelberg) oder NCBI (National Center for Biotechnology
Information, Maryland, USA) gespeichert ist und die entsprechende Referenz unter
der diese Daten publiziert wurden (Spalte 5 in Tabelle 1), angegeben.
Alle Genprodukte der bisher bekannten Semaphorin Gene weisen ein N-terminales
Signalpeptid auf, an dessen C-terminalem Ende sich eine charakteristische Sema-
Domäne mit einer Länge von etwa 450 bis 500 Aminosäuren befindet. Innerhalb der
Sema-Domäne finden sich stark konservierte Aminosäuremotive und eine Anzahl
hochkonservierter Cysteinreste. Die Genprodukte unterscheiden sich in den auf die
Sema-Domäne folgenden C-terminalen Sequenzen, die aus einer oder mehreren
Domänen aufgebaut sind. Sie weisen beispielsweise in diesen C-terminalen
Aminosäuresequenzen Transmembrandomänen (TM), Immunoglobulin-ähnliche
Domänen (Ig) (konstanter Teil des Immunoglobulins), zytoplasmatische Sequenzen
(CP), Prozessierungssignale (P) beispielsweise mit der Konsesussequenz (RXR),
wobei R für die Aminosäure Arginin und X für eine beliebige Aminosäure steht
und/oder hydrophile C-Termini (HPC) auf. Auf der Basis der unterschiedlichen
Domänenstruktur im C-Terminus lassen sich die Semaphorine in 5 verschiedene
Untergruppen einteilen (I bis V):
I Sezerniert, ohne weitere Domäne (z. B. ORF-A49)
II Ig Sezerniert (ohne Transmembrandomäne) (z. B. AHV-Sema)
III Ig, TM, CP Membranverankert mit zytoplasmatischer Sequenz (z. B. CD100)
IV Ig, (P), HPC Sezerniert mit hydrophilem C-Terminus (z. B. H-Sema-III, M-Sema-D, Collapsin-1)
V Ig, TM, CP Membranverankert mit C-terminalem 7 Thrombospondin-Motiv (z. B. M-Sema-F und -G).
II Ig Sezerniert (ohne Transmembrandomäne) (z. B. AHV-Sema)
III Ig, TM, CP Membranverankert mit zytoplasmatischer Sequenz (z. B. CD100)
IV Ig, (P), HPC Sezerniert mit hydrophilem C-Terminus (z. B. H-Sema-III, M-Sema-D, Collapsin-1)
V Ig, TM, CP Membranverankert mit C-terminalem 7 Thrombospondin-Motiv (z. B. M-Sema-F und -G).
Ein Rezeptor oder extrazellulärer Ligand für Semaphorine wurde bisher nicht
beschrieben. Im Zusammenhang mit Semaphorin-vermittelten Effekten wurden
intrazelluläre, heterotrimere GTP-bindende Proteinkomplexe beschrieben. Als ein
Bestandteil dieser Proteinkomplexe wurden bei Hühnern sogenannte CRMP-
Proteine (Collapsin response mediator protein) identifiziert, welche vermutlich
Bestandteil der Semaphorin-induzierten intrazellulären Signalkaskade sind
{Goshima et al. (1995) Nature 376: 509-514}. Das CRMP62 beispielsweise besitzt
Homologie zu unc-33, einem für das gerichtete Axonwachstum essentiellen
Nematoden-Protein. Ein humanes Protein mit 98% Aminosäure-Identität zu
CRMP62 ist ebenfalls bekannt {Hamajima et al. (1996) Gene 180: 157-163}. In
Ratten wurden ebenfalls mehrere CRMP-verwandte Gene beschrieben {Wang et al.
(1996) Neurosci. 16: 6197-6207}.
Die sezernierten oder transmembralen Semaphorine vermitteln repulsive Signale für
wachsende Nervenknospen. Sie spielen eine Rolle bei der Entwicklung des
zentralen Nervensystems (ZNS) und werden vor allem in Muskel- und
Nervengewebe exprimiert {Kolodkin et al. (1993); Luo et al. (1993) Cell 75: 217-227}.
Außer im ZNS konnte eine deutliche Expression von M-Sema-G auch auf Zellen des
lymphatischen und hämatopoetischen Systems beobachtet werden, im Gegensatz
zum nahe verwandten M-Sema-F {Furuyima et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 33376-
33381}.
Kürzlich wurden zwei weitere humane Semaphorine identifiziert, H-Sema-IV und H-
Sema-V und zwar in einer Region auf Chromosom 3p21.3, deren Deletion mit
verschiedenen Formen von Bronchialkarzinomen assoziiert ist. H-Sema-IV {Roche
et al. (1996), Xiang et al. (1996), Sekido et al. (1996)} ist auf Aminosäureebene
etwa zu 50% identisch mit M-Sema-E, während H-Sema-V {Sekido et al. (1996)} das
direkte Homolog zu M-Sema-A ist (86% Aminosäureidentität). Da diese Gene (H-
Sema-IV und -V) im Rahmen von DNA-Sequenzierungs-Projekten der deletierten
3p21.3 Loci gefunden wurden, ist die komplexe Intron-Exon-Struktur dieser beiden
Gene bekannt. Die beiden Gene werden in verschiedenen neuronalen und nicht
neuronalen Geweben exprimiert.
Ebenfalls erst vor kurzem wurde das zelluläre Oberflächenmolekül CD100 (human),
exprimiert und induziert auf aktivierten T-Zellen, als Semaphorin identifiziert
(ebenfalls in Tabelle 1 aufgeführt). Es unterstützt die Interaktion mit B-Zellen über
den Rezeptor CD40 und den entsprechenden Liganden CD40L. CD100 ist ein
membranverankertes Glykoprotein-Dimer von 150kd (Kilodalton). Es wurde eine
Assoziation des intrazytoplasmatischen C-Terminus von CD100 mit einer noch
unbekannten Kinase beschrieben {Hall et al. (1996)}. Damit war CD100 ist erste und
bisher einzige Semaphorin, dessen Expression in Zellen des Immunsystems
nachgewiesen werden konnte.
Unter der Fragestellung "Transformierende Gene von Rhadinoviren" wurde das
komplette Genom des Alcelaphinen Herpesvirus Typ 1 (AHV-1) kloniert und
sequenziert {Ensser et al. (1995)}. AHV-1 ist der Erreger des bösartigen
Katarrhalfiebers, einer mit einem lymphoproliferativen Syndrom einhergehenden,
meist fatalen Erkrankung verschiedener Wiederkäuer. Bei der Analyse wurde an
einem Ende des viralen Genoms ein offener Leserahmen mit entfernter, aber
signifikanter Homologie zu einem Gen von Vacciniavirus (ORF-A39 ≘ VAC-A39 in
Ensser et al. (1995)) J. Gen. Virol: 76: 1063-1067), welches der Genfamilie der
Semaphorine zugerechnet wurde, gefunden. Während das AHV-1 Semaphorin
(AHV-Sema) eine gut konservierte Semaphorin-Struktur besitzt, sind die Poxvirus-
Gene (ORF-A39 und ORF-A39-homolog, siehe Tabelle 1) C-terminal verkürzt, d. h.
bei ihnen ist die konservierte Sema-Domäne nur unvollständig vorhanden.
Ein Datenbankvergleich des gefundenen AHV-Sema mit dbEST (EST (expressed
sequence tags)-Datenbank (db)) lieferte jeweils 2 EST-Sequenzen von 2
unabhängigen cDNA-Klonen aus humaner Plazenta (Zuordnungsnummern H02902,
H03806 (Klon 151129), Zuordnungsnummern R33439 und R33537 (Klon 135941)).
Diese wiesen deutlich höhere Homologie zum AHV-1 Semaphorin auf, als zu den
bis dahin beschriebenen neuronalen Semaphorinen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Semaphorine mit einer neuen, bisher
nicht bekannten und nicht zu erwartenden Domänenstruktur, denen eine
biochemische Funktion im Immunsystem zukommt (immunmodulierende
Semaphorine). Die erfindungsgemäßen Semaphorine werden als Semaphorine vom
Typ L (Sema-L) bezeichnet. Sie enthalten ein N-terminales Signalpeptid, eine
charakteristische Sema-Domäne und im C-terminalen Bereich des Proteins eine
Immunglobulin-ähnliche Domäne und eine hydrophobe Domäne, die eine potentielle
Transmembrandomäne darstellt.
Die Aminosäure-Sequenz des Signalpeptids kann weniger als 70, vorzugsweise
weniger als 60 Aminosäuren und mehr als 20, vorzugsweise mehr als 30
Aminosäuren aufweisen, besonders bevorzugt ist eine Länge von etwa 40 bis 50
Aminosäuren. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung hat das
Signalpeptid eine Länge von 44 Aminosäuren, d. h. zwischen den Aminosäuren 44
und 45 befindet sich eine Spaltstelle für eine Signalpeptidase.
Die Sema-Domäne kann eine Länge von 300 bis 700 oder mehr, vorzugsweise von
etwa 400 bis 600 Aminosäuren aufweisen. Bevorzugt sind Sema-Domänen mit einer
Länge von 450 bis 550 Aminosäuren, vorzugsweise von etwa 500 Aminosäuren. In
einer besonderen Ausführungsform der Erfindung schließt sich die Sema-Domäne
an das Signalpeptid an, wobei sich die Sema-Domäne vorzugsweise bis zur
Aminosäure 545 erstreckt.
Die Immunglobulin-ähnliche Domäne kann eine Länge von etwa 30 bis 110 oder
mehr Aminosäuren aufweisen, bevorzugt sind Längen zwischen 50 und 90,
besonders bevorzugt etwa 70 Aminosäuren.
Die Transmembrandomäne kann eine Länge von etwa 10 bis 35, vorzugsweise von
etwa 15 bis 30, besonders bevorzugt von etwa 20 bis 25 Aminosäuren aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind Semaphorine vom Typ L aus verschieden Spezies,
insbesondere aus Wirbeltieren, beispielsweise aus Vögeln und/oder Fischen,
vorzugsweise aus Säugetieren, beispielsweise aus Primaten, Ratte, Kanninchen,
Hund, Katze, Schaf, Ziege, Kuh, Pferd, Schwein, besonders bevorzugt aus Mensch
und Maus. Gegenstand der Erfindung sind auch entsprechende Semaphorine aus
Mikroorganismen, insbesondere aus pathogenen Mikroorganismen, beispielsweise
aus Bakterien, Hefen und/oder Viren, z. B. aus Retroviren, insbesondere aus
humanpathogenen Mikroorganismen.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein entsprechendes humanes Semaphorin
(H-Sema-L), das ein Signalpeptid, eine Sema-Domäne, eine Immunglobulin
ähnliche Domäne und eine Transmembrandomäne aufweist. Eine spezielle
Ausführungsform ist das Semaphorin, das durch die Aminosäuresequenz gemäß
Tabelle 4 gegeben ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind korrespondierende Semaphorine
in anderen Spezies, die im Bereich der Sema-Domäne eine Aminosäureidentität
größer als 40%, vorzugsweise größer 50%, besonders bevorzugt größer 60% im
Bezug auf die Sema-Domäne von H-Sema-L (Aminosäuren 45 bis 545 der Sequenz
in Tabelle 4) aufweisen. Aus näher verwandten Spezies (z. B. Primaten, Maus)
können die korrespondierenden Semphorine durchaus Aminosäureidentitäten
größer als 70%, vorzugsweise größer als 80%, besonders bevorzugt größer als
90% aufweisen.
Eine derartige Ausführungsform der Erfindung ist ein korrespondierendes
Semaphorin der Maus (murines Semaphorin (M-Sema-L)). Beispielsweise enthält
dieses die partielle Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 5 (murines Semaphorin
(M-Sema-L)).
Die Erfindung betrifft auch korrespondierende Semaphorine, die eine
Aminosäureidentität (über die Gesamtlänge der Aminosäuresequenz des Protein
betrachtet) von nur etwa 15 bis 20% bei wenig verwandten Spezies (phylogenetisch
weit voneinander entfernt), vorzugsweise 25 bis 30%, besonders bevorzugt 35 bis
40% oder eine höhere Identität im Bezug auf die gesamte Aminosäuresequenz von
H-Sema-L gemäß Tabelle 4 aufweisen.
Die Gene, die für Semaphorine von Typ L kodieren, weisen eine komplexe Exon-
Intron-Struktur auf. Diese Gene können beispielsweise zwischen 10 und 20 Exons,
vorzugsweise etwa 11 bis 18, besonders bevorzugt 12 bis 16 Exons und eine
entsprechende Anzahl von Introns aufweisen. Sie können aber auch die gleiche
Anzahl Exons und Introns aufweisen wie das Gen von H-Sema-L (13 oder 15 Exons,
vorzugsweise 14 Exons). Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft
das Gen von H-Sema L. Dieses Gen hat vorzugsweise eine Länge von 8888 bis
10000 oder mehr Nukleotiden. Das humane Semaphorin-Gen enthält vorzugsweise
die Nukleotid-Sequenz, die in Tabelle 14 gegeben ist oder die Nukleotidsequenz,
die in der Datenbank GenBank unter der Zugangsnummer AF030697 hinterlegt
wurde. Diese Nukleotidsequenzen enthalten mindestens 13 Introns. Darüber hinaus
weist das humane Semaphorin-Gen am 5'-Ende einen zusätzlichen
Sequenzbereich auf. Dieser Bereich enthält gegebenenfalls weitere kodierende
Sequenzen, z. B. ein oder zwei weitere Introns.
Die Versuche zur chromosomalen Lokalisation des humanen Semaphorins vom Typ
L ergaben, daß das entsprechende Gen an Position 15q22.3-23 lokalisiert ist.
Entsprechend wurde das Gen für M-Sema L an Position 9A3.3-B lokalisiert.
Als Folge der komplexen Intron-Exon Struktur kann das Primärtranskript der
Semaphorin mRNA unterschiedlich gespliced werden, wodurch unterschiedliche
Splicevarianten der Semaphorine entstehen. Die aus diesen Splicevarianten
translatierten Proteine sind Derivate der erfindungsgemäßen Semaphorine. Sie
entsprechen in ihrer Aminosäuresequenz und auch weitgehend in ihrer
Domänenstruktur den beschriebenen, erfindungsgemäßen Semaphorinen vom Typ
L, sind jedoch gegenüber diesen verkürzt. Beispielsweise können Splicevarianten,
denen die Transmembrandomäne ganz oder teilweise fehlt, gebildet werden. Ein
Semaphorin-Derivat, welches keine oder keine vollständige Transmembrandomäne,
aber ein Signalpeptid enthält, kann sezerniert werden und auf diese Weise
außerhalb der Zelle lokal oder auch über größere Entfernungen wirken,
beispielsweise auf andere Zellen. Eine andere Splicevariante kann beispielsweise
keine Sequenz mehr enthalten, die für ein Signalpeptid kodiert und gegebenenfalls
auch keine Sequenz, die für eine für hydrophobe Aminosäuresequenz kodiert, die
eine potentielle Transmembrandomäne darstellt. Eine Folge wäre, daß dieses
Semaphorin-Derivat weder in die Membran eingebaut, noch sezerniert wird (es sei
denn über sekretorische Vesikel). Ein solches Semaphorin-Derivat kann an
intrazellulären Prozessen, beispielsweise an Signaltransduktionsprozessen beteiligt
sein. Auf diese Weise können mit dem gleichen Grundmoleküle (beanspruchte
Semaphorine) und den davon abgeleiteten Derivaten (beispielsweise
Splicevarianten) vielfältige intra- und extrazelluläre Prozesse reguliert und/oder
aufeinander abgestimmt werden.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Semaphorin-Derivate,
die sich von den erfindungsgemäßen Semaphorinen vom Typ L ableiten, die aber
keine oder keine vollständige Transmembrandomäne enthalten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Semaphorin-Derivate, die sich
von den erfindungsgemäßen Semaphorinen vom Typ L ableiten, die aber kein
Signalpeptid enthalten.
Das Signalpeptid kann auch posttranslational abgespalten werden. Dadurch wird
ein membranständiges (mit TM-Domäne) oder ein sezerniertes (Splicevariante ohne
TM-Domäne) Semaphorin-Derivat mit verkürzter Domänenstruktur gebildet. Ein auf
diese Weise posttranslational prozessiertes Semaphorin-Derivat enthält nur noch
Sema-Domäne, Ig-Domäne und gegebenfalls Transmembrandomäne. Eine
Signalpeptidschnittstelle kann beispielsweise direkt am Ende des Signalpeptids
liegen, z. B. 40 bis 50 Aminosäuren oder weiter vom Aminoterminus entfernt
lokalisiert sein.
Ein "verkürztes" (d. h. weniger Domänen enthaltendes) Semaphorin L-Derivat ist von
anderen Semaphorinen, die sich nicht von den Semaphorinen vom Typ L ableiten,
dadurch zu unterscheiden, daß es eine sehr große (< 90%) Aminosäureidentität
oder eine identische Aminosäuresequenz mit den Semaphorinen vom Typ L in den
vorhandenen Domänen aufweist.
Die erfindungsgemäßen Semaphorine können auch in anderer Weise
posttranslational modifiziert sein. Beispielsweise können sie ein-, zwei-, drei-, vier
fünf-, sechs-, sieben-, acht-, neun- zehn- oder mehrfach glykosyliert (N- und/oder
O-glykosyliert) vorliegen. Die Aminosäuresequenzen der Semaphorine können dann
ebenso viele oder mehr Konsensussequenzen für potentielle Glykosylierungsstellen
aufweisen, vorzugsweise fünf derartige Stellen. Eine Ausführungsform der Erfindung
betrifft Semaphorine, bei denen die Glykosylierungsstellen an Positionen lokalisiert
sind, die den Positionen 105,157, 258, 330 und 602 der H-Sema-L
Aminosäuresequenz entsprechen (Tabelle 4).
Darüber hinaus können die Semaphorine in Form ihrer phosphorylierten Derivate
vorliegen. Semaphorine können die Substrate unterschiedlicher Kinasen sein,
beispielsweise können die Aminosäuresequenzen Konsensussequenzen für Protein
Kinase C, Tyrosin Kinase und/oder Kreatin Kinasen aufweisen. Weiterhin können
die Aminosäuresequenzen der Semaphorine Konsensussequenzen für potentielle
Myristilierungsstellen aufweisen. An diesen Stellen können entsprechende
Semaphorin-Derivate mit Myristinsäure verestert sein.
Die erfindungsgemäßen Semaphorine vom Typ L und deren Derivate können in
Form von Monomeren, Dimeren und/oder Multimeren vorliegen, beispielsweise
können zwei oder mehr Semaphorine bzw. deren Derivate über intermolekulare
Disulfidbrücken miteinander verbunden sein. Darüber hinaus können sich
intramolekulare Disulfidbrücken ausbilden.
Derivate der erfindungsgemäßen Semaphorine sind weiterhin Fusionsproteine. Ein
solches Fusionsprotein enthält einerseits ein Semaphorin vom Typ L oder Teile
desselben und darüber hinaus ein weiteres Peptid oder Protein bzw. ein Teil
desselben. Peptide oder Proteine bzw. Teile derselben können z. B. Epitope-Tags
(z. B. His-Tag (6xHistidin), Myc-Tag, flu-Tag), die z. B. zur Aufreinigung der
Fusionsproteine verwendet werden können, oder solche, die zur Markierung der
Fusionsproteine verwendet werden können, z. B. GFP (green fluorescent protein),
sein.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA- und RNA-Sequenzen, die für die
erfindungsgemäßen Semaphorine vom Typ L und/oder deren Derivate kodieren,
beispielsweise die entsprechenden Gene, die unterschiedlichen Splicevarianten der
mRNA, die dazu korrespondierenden cDNAs sowie deren Derivate, z. B. Salze der
DNA bzw. RNA. Derivate im Sinne der Erfindungen sind Sequenzen oder Teile
davon, die z. B. mit molekularbiologischen Methoden verändert und an die jeweiligen
Anforderungen angepaßt werden, beispielsweise verkürzte Gene, cDNAs oder
Chimäre derselben, Konstrukte für Expressionen und Klonierungen und deren
Salze.
Eine Ausführungsform betrifft die genomischen Sequenzen (Gene) der
Semaphorine vom Typ L. Die Erfindung betrifft die Intron- und Exon-Sequenzen und
genregulatorische Sequenzen, beispielsweise Promotor-, Enhancer- und Silencer-
Sequenzen.
Ein Gegenstand dieser Ausführungsform ist das Gen von H-Sema-L bzw. dessen
Derivate. Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Gen, das die Nukleotidsequenz, die
in Tabelle 14 gegeben ist, enthält. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das
Gen, das die Nukleotidsequenz, die in der Datenbank GenBank unter der
Zugangsnummer AF030697 hinterlegt ist, enthält.
Ein weiterer Gegenstand dieser Ausführungsform ist das Gen von M-Sema-L bzw.
dessen Derivate.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die cDNA von H-Sema-L oder deren
Derivate. Eine besondere Ausführungsform ist die cDNA von H-Sema-L gemäß der
Aminosäuresequenz in Tabelle 2. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die
cDNA von H-Sema L, die in der Datenbank GenBank unter der Zugangsnummer
AF030698 hinterlegt ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die cDNA von M-Sema-L oder deren
Derivate. Eine besondere Ausführungsform ist die partielle cDNA-Sequenz von
M-Sema-L gemäß Tabelle 3 sowie cDNA-Sequenzen, die diese partielle cDNA-
Sequenz enthalten. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die cDNA
von M-Sema L, die in der Datenbank GenBank unter der Zugangsnummer
AF030699 hinterlegt ist.
Die Erfindung beinhaltet auch Allele und/oder individuelle Ausprägungsformen der
Gene/mRNAs/cDNAs, die sich nur geringfügig von den hier beschriebenen
Semaphorin-Sequenzen unterscheiden und für ein identisches oder nur geringfügig
verändertes Protein (Abweichung in der Aminosäure-Sequenz kleiner oder gleich 10%)
kodieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Plasmide, die DNA, die für die
Semaphorine des Typs L bzw. deren Derivate kodiert, enthalten. Solche Plasmide
können beispielsweise Plasmide mit hohen Replikationsraten sein, die für eine
Amplifikation der DNA, z. B. in E. coli geeignet sind.
Eine spezielle Ausführungsform sind Expressionsplasmide, mit denen die
Semaphorine bzw. Teile davon oder deren Derivate in prokaryoten und/oder
eukaryoten Expressions-Systemen exprimiert werden können. Es sind sowohl
Expressionsplasmide die konstitutive als auch solche, die induzierbare Promotoren
enthalten, geeignet.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Semaphorine vom Typ L,
wobei eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Semaphorin vom Typ L kodiert in
einen Expressionsvektor kloniert und exprimiert wird. Die Expression kann
vorzugsweise in prokaryoten oder eukaryoten Zellen erfolgen. Die Semaphorine
vom Typ L können gegebenenfalls auch auf chemischem Weg hergestellt werden.
Darüber hinaus können die Semaphorine bzw. deren Derivate als Fusionsproteine
exprimiert werden, beispielsweise mit Proteinen oder Peptiden, die einen Nachweis
des exprimierten Fusionsproteins erlauben, z. B. als Fusionsprotein mit GFP (green
fluorescent protein). Die Semaphorine können auch als Fusionsproteine mit einem,
zwei, drei oder mehreren Epitop-Tags, beispielsweise mit Myc- und/oder His-
(6xHistidin) und/oder flu-Tags exprimiert werden. Entsprechend können Plasmide
verwendet oder hergestellt werden, die DNA-Sequenzen enthalten, die für diese
Fusionsproteine kodieren. Beispielsweise können Semaphorin kodierende
Sequenzen in Plasmide kloniert werden, die DNA-Sequenzen enthalten, die für GFP
und/oder Epitop-Tags, z. B. Myc-Tag, His-Tag, flu-Tag kodieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Antikörper, die spezifisch die
Semaphorine vom Typ L, deren Derivate oder Teile davon binden bzw. erkennen.
Dies können beispielsweise polyklonale oder monoklonale Antikörper, die z. B. in
Maus, Kanninchen, Ziege, Schaf, Huhn usw. hergestellt werden können, sein.
Eine besondere Ausführungsform dieses Gegenstandes der Erfindung sind
Antikörper, die gegen die Epitope die den Aminosäuresequenzen von Position 179
bis 378 bzw. 480 bis 666 der H-Sema-L Sequenz gemäß Tabelle 4 entsprechen,
gerichtet sind. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von
spezifischen Anti-Semaphorin L Antikörpern, wobei für die Herstellung Antigene
verwendet werden, die genannten Epitope enthalten.
Diese Antikörper können beispielsweise zur Aufreinigung der entsprechenden
Semaphorine, z. B. von H-Sema-L und dessen Derivaten z. B. über Affinitätssäulen
oder zum immunologischen Nachweis der Proteine, z. B. im ELISA, im Western-Blot
und/oder in der Immunhistochemie verwendet werden.
Die cDNA von H-Sema L hat eine Länge von 2636 Nukleotiden (Tabelle 2). Das
Genprodukt der H-Sema L-cDNA hat eine Länge von etwa 666 Aminosäuren
(Tabelle 4) und weist die typische Domänenstruktur eines Semaphorins vom Typ L
auf. Das Genprodukt weist ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren 1 bis 44),
Sema-Domäne (Aminosäure 45 bis ungefähr Aminosäure 545) und Ig
(Immunglobulin)-Domäne (etwa Aminosäuren 550 bis 620) sowie am C-terminalen
Ende eine hydrophobe Aminosäuresequenz auf, die eine potentielle
Transmembrandomäne darstellt. Diese Domänen-Struktur wurde bisher für
Semaphorine noch nie beschrieben. Es handelt sich um ein membranassoziiertes,
wahrscheinlich an der Zelloberfläche lokalisiertes Glykoprotein einer neuen
Untergruppe. Aufgrund dieser bisher nicht bekannten Domänenstruktur können die
Semaphorine nun in VI Untergruppen eingeteilt werden:
I Sezerniert, ohne weitere Domäne (z. B. ORF-A49)
II Ig Sezerniert (ohne Transmembrandomäne) (z. B. AHV-Sema)
III Ig, TM, CP Membranverankert mit zytoplasmatischer Sequenz (z. B. CD100)
IV Ig, (P), HPC Sezerniert mit hydrophilem C-Terminus (z. B. H-Sema-III, M- Sema-D, Collapsin-1)
V Ig, TM, CP Membranverankert mit C-terminalem 7 Thrombospondin-Motiv (z. B. M-Sema-F und -G)
VI Ig, TM Membranverankert (z. B. H-Sema-L).
II Ig Sezerniert (ohne Transmembrandomäne) (z. B. AHV-Sema)
III Ig, TM, CP Membranverankert mit zytoplasmatischer Sequenz (z. B. CD100)
IV Ig, (P), HPC Sezerniert mit hydrophilem C-Terminus (z. B. H-Sema-III, M- Sema-D, Collapsin-1)
V Ig, TM, CP Membranverankert mit C-terminalem 7 Thrombospondin-Motiv (z. B. M-Sema-F und -G)
VI Ig, TM Membranverankert (z. B. H-Sema-L).
Die nichtglykosylierte, nichtprozessierte Form des H-Sema-L hat ein errechnetes
Molekulargwicht von etwa 74,8 kD (74823 Dalton) (berechnet mit PeptideSort,
GCG-Programm-Paket). Der Isoelektrische Punkt berechnet sich zu pH= 7.56.
Eine mögliche Signalpeptid-Schnittstelle liegt zwischen den Aminosäuren 44 und 45
(Tabelle 3; berechnet mit Signal P (http.//www.cbs.dtu.dk/services/Signal P), einem
auf neuronalen Netzwerken basierenden Programm zur Analyse von
Signalsequenzen {Nielsen H. et. al. (1997) Protein Engineering 10: 1-6)). Dies ergibt
für das prozessierte Protein (ohne Signalpeptid) ein Molekulargewicht (MW) von
70,3 kD (70323 Dalton) und einen Isoelektrischen Punkt von pH=7.01.
Die genomische Struktur ist ebenfalls weitgehend geklärt. Das H-Sema-L-Gen weist
13 oder 15 oder mehr Exons, vorzugsweise 14 Exons und 12 oder 14 Introns,
vorzugsweise 13 Introns auf. Aufgrund dieser komplexen Exon-Intron-Struktur sind
unterschiedliche Splice-Varianten möglich. Die mRNA des trankribierten H-Sema-L-
Gens findet sich im Northern-Blot vor allem in Placenta, Keimdrüsen, Thymus und
Milz. Es wurde keine mRNA in neuronalem Gewebe oder in Muskelgewebe
nachgewiesen. Ein Hinweis auf eine spezifisch regulierte Expression in
Endothelzellen liegt vor.
Durch alternatives Splicing können auch Formen von H-Sema-L mit
intrazytoplasmatischen Sequenzen entstehen, die eine Rolle in der intrazellulären
Signaltransduktion spielen, ähnlich wie z. B. bei CD100. Ebenfalls möglich wären
durch alternatives Splicing entstehende, sezernierte Formen von H-Sema-L, analog
zum viralen AHV-Sema.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzanalysen wurden mit Hilfe des GCG Programm-
Pakets (Genetics Computer Group (1991) Program manual for the GCG package,
version 7, 575 Science Drive, Wisconsin, USA 53711), FASTA (Pearson und
Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 2444-2448) und BLAST-Program (Gish und
States (1993) Nat. Genet.3, 266-272; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-
410) verwendet. Diese Programme wurden auch für Sequenzvergleiche mit
GenBank (Version 102.0) und Swiss Prot (Version 34.0) verwendet.
Postranslationale Modifikationen wie Glykosylierung und Myristilierung von
H-Sema-L sind ebenfalls möglich. Konsensus-Sequenzen für N-Glykosylierungsstellen
wurden mit Hilfe des Programms Prosite (GCG Programm-Paket) an den Positionen
105,157, 258, 330, 602 der Aminosäuresequenz von H-Sema-L (gemäß Tabelle 4)
gefunden, solche für Myristilierung an den Positionen 114, 139, 271, 498, 499, 502,
654 (Konsensus-Sequenz: G ∼ (E, D, R, K, H, P, F, Y, W) x (S, T, A,G, C, N) ∼ (P)).
Darüber hinaus enthält die Aminosäuresequenz von H-Sema-L mehrere Konsensus-
Sequenzen für potentielle Phosphorylierungsstellen durch unterschiedliche
Kinasen. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß H-Sema-L das Substrat
unterschiedlicher Kinase sein kann, z. B. Phosphorylierungsstellen für Kreatin-
Kinase 2, Protein-Kinase C und Tyrosin-Kinase.
Vorausgesagte Kreatin-Kinase 2-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz
Ck2: (S,T)x2(D,E)) (Prosite, GCG) an den Position 119, 131, 173, 338, 419, 481 der
Aminosäuresequenz.
Vorausgesagte Protein-Kinase-C-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz
PkC: (S,T)x(R,K)) (Prosite, GCG) an den Position 107, 115, 190, 296, 350, 431,
524, 576 der Aminosäuresequenz.
Vorausgesagte Tyrosin-Kinase-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz:
(R,K)x{2,3}(D,E)x{2,3}Y) (Prosite, GCG) an Position 205 der Aminosäuresequenz.
Die Konsensusequenzen sind im Einbuchstabencode für Aminosäuren angegeben.
Ein für Integrine charakteristisches "RGD"-Motiv (Arginin-Glycin-Asparaginsäure)
findet sich an Position 267.
Die Glykosylierungsstellen sind gut konserviert zwischen viralem AHV-Sema,
H-Sema-L und (soweit bekannt) M-Sema-L.
Eine Di- oder Multimerisierung von H-Sema-L ist möglich und wurde bei anderen
Semaphorinen wie CD100 beschrieben {Hall et al. (1996)}. Das CD100 Molekül ist
ebenfalls ein membranverankertes Glykoprotein-Dimer von 150kd. CD100 ist jedoch
nicht nahe verwandt mit dem erfindungsgemäßen humanen Semaphorin (H-Sema-
L).
Die partielle cDNA-Sequenz von M-Sema-L hat eine Länge von 1195 Nukleotiden.
Diese Sequenz kodiert für ein Protein mit 394 Aminosäuren. Diese 394
Aminosäuren entsprechen den Aminosäuren 1 bis 396 von H-Sema-L. Das
Signalpeptid im M-Sema-L ersteckt sich über die Aminosäuren 1 bis 44 (genau wie
im H-Sema-L). Die Sema-Domäne beginnt bei der Aminosäure 45 und erstreckt sich
bis zum Ende bzw. wahrscheinlich über das Ende der Sequenz gemäß Tabelle 4
hinaus.
Multiple Alignments wurden mit Hilfe des Programms Clustal W (Thompson et al.
(1994)) durchgeführt. Diese Alignments wurden manuell weiterbearbeitet mit Hilfe
von SEAVIEW (Galtier et al. (1996) Comput. Appl. Biosci 12, 543-548). Die
phylogenetischen Entfernungen wurden mit Clustal W (Thompson et al. (1994))
bestimmt.
Ein Vergleich der Proteinsequenzen der bekannten und der neuen Semaphorine
und eine phylogenetische Analyse dieser Sequenzen zeigt, daß sich die Gene
entsprechend ihrer phylogenetischen Verwandtschaft einteilen lassen. Hier fließt
natürlich die C-terminale Domänenstruktur der entsprechenden Semaphorin-
Subtypen als entscheidender Faktor mit ein, weshalb Semaphorine der gleichen
Untergruppen in der Regel auch phylogenetisch näher verwandt sind, als
Semaphorine unterschiedlicher Untergruppen. Einfluß hat auch, aus welcher
Spezies das Semaphorin isoliert wurde, d. h. ob die entsprechenden Spezies
phylogenetisch nahe miteinander verwandt sind oder nicht.
Eine phylogenetische Analyse (vergl. Fig. 3) der bekannten Semaphorin
Aminosäuresequenzen (vollständige Sequenzen und/oder Teilsequenzen, wobei die
Aminosäuresequenzen für H-sema-L und M-Sema-L gemäß den Tabellen 4 und 5
verwendet wurden, für alle anderen Sequenzen, die unter den Zugangsnummern
gespeicherten Sequenzen bzw. die von diesen Sequenzen abgeleiteten
kodierenden Aminosäuresequenzen)) mittels des Programms CLUSTALW
{Thompson J.D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680} zeigt, daß die
Aminosäuresequenzen von H-Sema-L und M-Sema-L phylogenetisch nahe
miteinander verwandt sind und eine eigene phylogenetische Gruppe bilden.
H-Sema L und M-SemaL wiederum sind phylogenetisch am nächsten verwandt mit
AHV-Sema und Vac-A39. Sie sind untereinander deutlich näher verwandt, als mit
irgendeinem anderen bisher bekannten Semaphorin. Die Analyse zeigt weiterhin,
daß auch andere Semaphorine phylogenetisch nahe miteinander verwandt sind und
eigene Gruppen innerhalb der Semaphorine bilden. Beispielsweise fallen die
Semaphorine, die sezerniert werden, z. B. H-Sema-III-IV, -V, und -E in eine
phylogenetische Gruppe. Zu dieser Subfamilie gehören auch deren Homologe in
anderen Spezies, während das humane (transmembrane) CD100 mit dem
entsprechenden Maus-Homologen (M-Sema G2) und mit Collapsin-4 in eine
phylogenetische Gruppe fällt.
Im Bezug auf die gesamten Aminosäuresequenzen liegen die beobachteten
Homologien innerhalb der phylogenetischen Gruppen zwischen etwa 90% und 80%
Aminosäureidentität im Bezug auf sehr nahe verwandte Gene wie z. B. H- und
M-Sema-E oder -III/D und etwas weniger als 40% bei wenig verwandten Genen der
Semaphorine. Innerhalb der Sema-Domäne liegt die beobachtete
Aminosäureidentität um einige Prozent höher, und durch ihren großen Anteil am
Gesamtprotein (50-80% des Proteins gehören zur Sema-Domäne) der
Aminosäuresequenz beeinflußt diese wesentlich die Gesamtidentität.
H-Sema-L ist, über das Gesamtprotein berechnet, zu 46% identisch mit AHV-Sema,
wird dagegen die Sema-Domäne allein betrachtet, dann beträgt die
Aminosäureidentität 53%. Dies ist höher als z. B. zwischen den verwandten
M-Sema-B und -C (37% Identität im Bezug auf das Gesamtprotein, 43% Identität im
Bezug auf die Sema-Domäne), ähnlich wie M-Sema-A und -E (43% Gesamtprotein,
53% Sema-Domäne). Die Aminosäureidentität zwischen der partiellen M-Sema-L
Sequenz (Tabelle 6) und H-Sema-L (Tabelle 5) liegt im Bereich der Sema-Domäne
bei 93%, so daß davon ausgegangen werden kann, daß es sich um das
entsprechend homologe Gen der Maus handelt.
Korrespondierende Semaphorine zu H-Sema-L und M-Sema-L in anderen Spezies
können innerhalb der Sema-Domäne eine Aminosäureidentität größer als 40% im
Bezug auf H-Sema-L aufweisen. Bei den nahe verwandten Wirbeltieren (Säuger,
Vögel) können sogar Aminosäureidentitäten über 70% angetroffen werden.
Es handelt sich um eine neue Subfamilie von Semaphorinen mit größerer
Aminosäureidentität zu dem viralen AHV-Sema als zu den bisher bekannten
humanen bzw. murinen Semaphorinen, und mit einer für humane Semaphorine
bisher nicht bekannten C-terminalen Struktur. Diese neuen Semaphorine (Mitglieder
der Subfamilie) zeichnen sich dadurch aus, daß sie aufgrund ihrer Domänen
struktur in die Untergruppe IV fallen und/oder die gleiche phylogenetische Gruppe
fallen wie H-Sema-L und M-Sema-L und/oder im Bezug auf die gesamte
Aminosäuresequenz zu H-Sema-L eine Aminosäureidentität von mindestens 30 bis
40%, vorzugsweise 50 bis 60%, besonders bevorzugt 70 bis 80% oder eine
größere Identität aufweisen und/oder im Bezug auf die Sema-Domäne eine
Aminsäureidentität mit H-Sema-L von mindestens 70%, vorzugsweise größer 80%,
besonders bevorzugt größer 90% aufweisen.
Den Semaphorinen vom Typ L kommt auch eine andersartige biochemische
Funktion zu. Eine neue Funktion dieser Semaphorine liegt in der Modulation des
Immunsystems.
Das nächste Verwandte von H-Sema L ist das virale AHV-Semaphorin (AHV-Sema).
Dieses ist von ähnlicher Größe, besitzt aber im Gegensatz zum H-Sema L keine
Transmembrandomäne. Das AHV-Sema wird vermutlich von virusinfizierten Zellen
sezerniert, um den H-Sema L äquivalenten Rezeptor (Semaphorin von Typ L im
Streifengnu) im natürlichen Wirt (Streifengnu) zu blockieren, und so dem Angriff des
Immunsystems zu entgehen. Ferner ist eine Funktion als repulsives Agens
(Chemorepellent) für Zellen des Immunsystems denkbar.
Die biochemische Funktion der neuen Semaphorine vom Typ L und deren Derivate
ist als generell immunmodulierend und/oder entzündungsmodulierend anzusehen.
Einerseits können sie
- A) als die Immunantwort hemmende Moleküle entweder lokal, z. B. als Transmembranprotein an der Oberfläche von Zellen oder auch über größere Entfernungen, z. B. wenn sie durch Prozessierung (z. B. Proteasen) oder alternatives Splicing sezerniert werden, z. B. durch Diffusion im Gewebe, ihre Wirkung als Chemorepellent und/oder Immunsuppressivum entfalten. Beispielsweise kann die Expression dieser neuen Semaphorine vom Typ L z. B. an der Oberfläche der Zellen der Gefäßendothelien das Leukozyten- Attachment und deren Migration durch die Gefäßwand verhindern. Den neuen Semaphorinen kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung von Schrankenwirkungen, z. B. zur Verhindung von Infektionen in besonders "wichtigen" oder exponierten Organen, beispielsweise zur Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke, des Plazentarkreislaufs und/oder anderen immunologisch priviligierten Orten (z. B. Pancreas-lnseln) und/oder beim Schutz vor Autoimmunerkrankungen zukommen. Darüber hinaus können die neuen Semaphorine und/oder ihre Derivate in verschiedenen Geweben auch an repulsiven Signalen, beispielsweise für Zellen des Immunsystems (z. B. Leukozyten) als Schutz gegen versehentliche Aktivierung von Abwehrmechanismen beteiligt sein.
- B) Weiterhin können den neuen Semaphorinen und/oder deren Derivaten Funktionen als akzessorische Moleküle zukommen. An der Zelloberfläche exprimiert können sie beispielsweise an der Interaktion mit Zellen des Immunsystems im Rahmen der Aktivierung von Abwehrmechanismen beteiligt sein.
Dadurch ergeben sich mehrere Verwendungsmöglichkeiten für die neuen
Sempahorine vom Typ L und deren Derivaten sowie den für diese Proteine
kodierenden Nukleinsäuren.
Funktion A): Es handelt sich um ein immunsuppressives und/oder
entzündungshemmendes Prinzip: Zahlreiche potentielle Anwendungsmöglichkeiten
liegen in den Bereichen Organtransplantation, Entzündungstherapie, Immuntherapie
und Gentherapie.
Beispielsweise können mit Hilfe der Semaphorin-kodierenden DNA oder Derivaten
derselben nicht-humane, transgene Tiere hergestellt werden.
Eine Anwendungsmöglichkeit dieser Tiere liegt in der Hemmung der
Transplantatabstoßung in transgenen Modellen für Organtransplantationen.
Beispielsweise können transgene, gegen Abstoßung geschützte tierische Organe
für Xenotransplantationen hergestellt werden. Dies sollte z. B. auch zusammen mit
anderen Transgenen (z. B. Komplementregulatoren wie DAF oder CD59) möglich
sein.
Eine weitere Anwendung liegt in der Herstellung von nicht-humanen Knock-out
Tieren, beispielsweise von Knock-out Mäusen: Durch Knock-out des Mausgens
M-Sema-L können z. B. weitere Funktionen des Gens aufgefunden werden. Sie stellen
auch potentielle Modellsysteme für entzündliche Erkrankungen dar, falls die Mäuse
ohne Semaphorin-Gen lebensfähig sind. Sollte M-Sema-L für die Immunmodulation
wichtig sein, so sind vermehrt solche Mäuse zu erwarten.
Weiterhin können nicht-humane Knock-in-Tiere, beispielsweise Mäuse, hergestellt
werden. Dabei wird z. B. M-Sema-L durch normales/verändertes H-Sema-L oder
verändertes M-Sema-L (z. B. Integration der neuen Semaphorin-Subtypen unter der
Kontrolle von konstitutiven und/oder induzierbaren Promotoren) ersetzt. Solche
Tiere können z. B. für die Suche nach weiteren Funktionen der neuen Semaphorine,
z. B. Funktionen des humanen Gens oder Derivaten dieser Gene dienen oder zur
Identifizierung und Charakterisierung von immunmodulierenden Wirkstoffen benutzt
werden.
Verwendung zur Herstellung von z. B. rekombinanten Immunsuppressiven, anderen
löslichen Proteinen oder Peptiden die sich von der Aminosäuresequenz der
Semaphorine vom Typ L, z. B. von H-Sema-L oder den entsprechenden
Nukleinsäuren, z. B. Genen ableiten; auch Agonisten mit struktureller Ahnlichkeit
sind möglich. Diese immunsuppressiven Wirkstoffe/Agonisten können bei
Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen und/oder
Organtransplantationen eingesetzt werden.
Gentherapie mit Semaphorinen vom Typ L, z. B. mit Sequenzen, die für H-Sema-L
oder deren Derivate kodieren mittels viraler oder nichtviraler Methoden. Einsatz bei
Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen, der Transduktion von
Organen sowie vor/während/nach Transplantationen zur Verhinderung der
Transplantatabstoßung.
Eine Ausführungsform ist ein Verfahren, bei dem die neuen Semaphorine und/oder
die für diese Semaphorine kodierende DNA und Derivate derselben, insbesondere
H-Sema-L, für H-Sema-L kodierende DNA und Derivate derselben in einem
Verfahren zum Screening von Wirkstoffen, insbesondere zur Identifizierung und
Charakterisierung von immunmodulierenden Wirkstoffen, eingesetzt werden.
Funktion B): H-Sema-L ist ein akzessorisches Molekül, das an der Zelloberfläche
exprimiert wird und an der Interaktion mit Zellen, z. B. des Immunsystems, z. B. als
akzessorisches Molekül in der Aktivierung von Signalwegen, beteiligt ist. Ein virales
Gen bzw. das Genprodukt eines viralen oder anderen pathogenen Gens z. B.
mikrobilogischen Ursprunges könnte z. B. als kompetitiver Inhibitor dieses
akzessorischen Moleküls wirken. Eine Anwendung für die neuen Semaphorine liegt
bei dieser Funktion ebenfalls im Bereich der Organtransplantation,
Entzündungstherapie, Immuntherapie und/oder Gentherapie.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Semaphorine in einem Verfahren
zum Screening von antagonistischen Wirkstoffen/Inhibitoren verwendet werden, die
dann z. B. zur Blockade des Semaphorin-Rezeptors eingesetzt werden können.
Lösliche und/oder sezernierte H-Sema-L Antagonisten/Inhibitoren können
beispielsweise chemische Substanzen sein oder die neuen Semaphorine bzw.
Derivate derselben (z. B. Teile/verkürzte Formen derselben, beispielsweise ohne
Membrandomäne oder als Ig-Fusionsproteine oder von diesen abgeleitete Peptide,
die geeignet sind, den korrespondierenden Rezeptor zu blockieren). Auf diese
Weise identifizierte, spezifische Antagonisten und/oder Inhibitoren können
beispielsweise kompetitiv wirken und bei der Hemmung der Abstoßung z. B. in
transgenen Modellen für Organtransplantationen und bei Autoimmunerkrankungen,
entzündlichen Erkrankungen und Organtransplantationen eingesetzt werden.
DNA, die für die erfindungsgemäßen Semaphorine kodiert bzw. deren mit Hilfe von
molekularbiologischen Methoden erzeugten Derivate können beispielsweise für die
Herstellung nicht-humaner, transgener Tiere verwendet werden. Eine
Überexpression von H-Sema-L kann in diesen transgenen Tieren zu vermehrter
Anfälligkeit für Autoimmunerkrankungen und/oder entzündlichen Erkrankungen
führen. Die transgenen Tiere eignen sich damit zum Screening von neuen,
spezifischen, immunmodulierenden Wirkstoffe.
Diese DNA kann ebenso für die Herstellung von nicht-humanen Knock-out Tieren,
beispielsweise Knock-out Mäusen, bei denen das Mausgen M-Sema-L
ausgeschaltet wird, verwendet werden. Solche Knock-out Tiere können für die
Suche nach weiteren biochemischen Funktionen des Gens eingesetzt werden. Sie
stellen auch potentielle Modellsysteme für entzündliche Erkrankungen dar, falls die
Mäuse ohne das M-Sema-L Gen lebensfähig sind.
Diese DNA kann ebenso zur Herstellung von nicht-humanen Knock-in Tieren,
beispielsweise Mäusen verwendet werden. Dabei wird das M-Sema-L-Gen durch
ein verändertes M-Sema-L Gen/cDNA oder ein gegebenfalls verändertes, z. B.
mutiertes Semaphorin Typ L Gen/cDNA einer anderen Spezies, z. B. von H-Sema-L
ersetzt. Solche transgenen Tiere können für die Suche nach weiteren Funktionen
der erfindungsgemäßen Semaphorine verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Semaphorine vom Typ L und deren
Derivate, sowie der für diese Proteine kodierenden Gene/cDNAs und deren
Derivate und/oder mit Hilfe dieser Semaphorine identifizierter Wirkstoffe zur
Herstellung von Arzneimitteln. Beispielsweise können Arzneimittel hergestellt
werden, die in der Gentherapie angewendet werden können und die Agonisten
und/oder Antagonisten der Expression der Semaphorine vom Typ L, beispielsweise
von H-Sema-L, enthalten. Dazu können virale und/oder nichtvirale Methoden
verwendet werden. Diese Arzneimittel können z. B. bei Autoimmunerkrankungen und
entzündliche Erkrankungen, Organtransplantationen vor und/oder während
und/oder nach der Transplantation zur Verhinderung der Abstoßung eingesetzt
werden.
Verwendung der neuen Semaphorine, insbesondere von H-Sema-L und von
Genen/cDNAs derselben in Verfahren zum Screening von neuen Wirkstoffen.
Modifizierte Proteine und/oder Peptide, die sich von H-Sema-L und/oder M-Sema-L
ableiten, können zur Suche nach dem entsprechenden Rezeptor und/oder dessen
Antagonisten bzw. Agonist in funktionellen Tests, beispielsweise mittels
Expressionskonstrukten von H-Sema-L und Homologen eingesetzt werden.
Die für die neuen Semaphorine kodierenden Gene, cDNAs und deren Derivate
können auch als Hilfsmittel in der Molekularbiologie eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Semaphorins vom Typ L oder einer
Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Semaphorin vom Typ L kodiert in einem
Verfahren zur Identifizierung von immunmodulierenden Wirkstoffen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen, wobei ein
Semaphorin vom Typ L oder ein Derivat derselben bzw. eine Nukleinsäure-Sequenz,
die für ein Semaphorin vom Typ L kodiert oder ein Derivat derselben eingesetzt
wird, um immunmodulierende Wirkstoffe zu identifizieren. Beispielsweise betrifft die
Erfindung ein Verfahren, bei dem ein Semaphorin vom Typ L unter definierten
Bedingungen mit einem zu untersuchenden Wirkstoff inkubiert wird und parallel ein
zweiter Ansatz ohne den zu untersuchenden Wirkstoff, aber unter ansonsten
gleichen Bedingungen durchgeführt wird und dann die inhibierende bzw.
aktivierende Wirkung des zu untersuchenden Wirkstoffs bestimmt wird.
Beispielsweise betrifft die Erfindung auch Verfahren zur Identifizierung von
Wirkstoffen, wobei eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Semaphorin vom Typ L
kodiert oder ein Derivat derselben unter definierten Bedingungen in Gegenwart
eines zu untersuchenden Wirkstoffs exprimiert wird und das Ausmaß der
Expression bestimmt wird. Gegebenenfalls können auch in einem solchen Verfahren
zwei oder mehrere Ansätze parallel unter gleichen Bedingungen durchgeführt
werden, wobei die Ansätze aber unterschiedliche Mengen des zu untersuchenden
Wirkstoffs enthalten.
Beispielsweise kann der zu untersuchende Wirkstoff die Transkription und/oder die
Translation inhibieren oder aktivieren.
Versuchsbedingungen, die in den Beispielen Anwendung finden:
Verwendete PCR-Programme:
Taq52-60 (mit Ampli-TaqR-Polymerase, Perkin Elmer, Weil der Stadt, Deutschland)
96°C/60s: 1 Zyklus
96°C/15s-52°C/20s-70°C/60s: 40 Zyklen
70°C/60s: 1 Zyklus
96°C/60s: 1 Zyklus
96°C/15s-52°C/20s-70°C/60s: 40 Zyklen
70°C/60s: 1 Zyklus
Taq60-30
96°C/60s: 1 Zyklus
96°C/15s-60°C/20s-70°C/30s: 35 Zyklen
70°C/60s: 1 Zyklus
96°C/60s: 1 Zyklus
96°C/15s-60°C/20s-70°C/30s: 35 Zyklen
70°C/60s: 1 Zyklus
Taq60-60
96°C/60s: 1 Zyklus
96°C/15s-60°C/20s-70°C/60s: 35 Zyklen
70°C/60s: 1 Zyklus
96°C/60s: 1 Zyklus
96°C/15s-60°C/20s-70°C/60s: 35 Zyklen
70°C/60s: 1 Zyklus
Taq62-40
96°C/60s: 1 Zyklus
96°C/15s-62°C/20s-70°C/40s: 35 Zyklen
70°C/60s: 1 Zyklus.
96°C/60s: 1 Zyklus
96°C/15s-62°C/20s-70°C/40s: 35 Zyklen
70°C/60s: 1 Zyklus.
Verwendete Reaktionsbedingungen für PCR mit Taq-Polymerase:
50µl Reaktionsansätze mit 100-200ng Template, 200µM dNTP, 0,2-0,4 µM je Primer, 2.5U Ampli-TaqR, 5µl des mitgelieferten 10x Reaktionspuffers.
50µl Reaktionsansätze mit 100-200ng Template, 200µM dNTP, 0,2-0,4 µM je Primer, 2.5U Ampli-TaqR, 5µl des mitgelieferten 10x Reaktionspuffers.
Verwendete Programme für:
- 1. XL62-6 (mit Expand-Long Template PCR SystemR, Boehringer Mannheim,
Deutschland)
94°C/60s: 1 Zyklus
94°C/15s-62°C/30s-68°C/6min: 10 Zyklen
94°C/15s-62°C/30s-68°C/(6min+15s/Zyklus): 25 Zyklen
68°C/7min: 1 Zyklus - 2. XL62-12 (mit Expand-Long Template PCR SystemR, Boehringer Mannheim,
Deutschland)
94°C/60s: 1 Zyklus
94°C/15s-62°C/30s-68°C/12min: 10 Zyklen
94°C/15s-62°C/30s-68°C/(12min+15s/Zyklus): 25 Zyklen
68°C/7min: 1 Zyklus.
Reaktionsbedingungen für PCR mit Expand-Long Template PCR System
50µl Reaktionsansätze mit 100-200ng Template, 500µM dNTP, 0,2-0,4 µM je
Primer, 0,75µl Enzym-Mix, 5µl des mitgelieferten 10x Reaktionspuffers Nr. 2.
Ausgehend von Sequenzen des AHV-Sema (Ensser u. Fleckenstein (1995), J.
General Virol. 76: 1063-1067) wurden PCRs und RACE-PCRs durchgeführt. Als
Ausgangsmaterial hierfür diente humane cDNA aus Plazenta-Gewebe, an welche
Adapter zur RACE-Amplifikation ligiert wurden (Marathon™-cDNA Amplification Kit,
Clontech Laboratories GmbH, Tullastraße 4, 69126 Heidelberg, Deutschland).
Zunächst wurde mittels spezifischer Primer (Nr. 121234 + Nr. 121236, Tabelle 6) ein
PCR-Fragment mit einer Länge von etwa 800bp (Basenpaaren) amplifiziert (PCR-
Programm: (Taq60-60)). Dieses wurde kloniert und sequenziert (Taq-Dye-Deoxy-
Terminator Sequenzierungs-Kit, Applied Biosystems, Forster: City, CA, USA)
Brunnenweg 13, Weilderstadt). Die Sequenzierung des PCR-Produkts ergab eine
Sequenz, die eine hohe Homologie zu der DNA-Sequenz von AHV-Sema aufweist,
identisch zu der Sequenz der beiden ESTs.
Ein PCR-Fragment von 600bp wurde mit dem Primerpaar (Nr. 121237 + Nr. 121239,
Tabelle 6) identifiziert. Es zeigte sich, das es sich um Klone mit DNA-Sequenzen
des selben Gens handelte.
Das 800bp PCR-Fragment aus Beispiel 1 wurde radioaktiv markiert (Random-
Priming nach der Methode von {Feinberg (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13}, mit 32P-
α-dCTP) und als Sonde für einen Multi-Tissue Northern-Blot (Human Multiple
Tissue Northern Blot II, Clontech, Heidelberg, Germany), der mRNA-Proben aus
den Geweben Milz, Thymus, Prostata, Testis, Ovarien, Dünndarm, Dickdarm und
Leukozyten (PBL) enthält, verwendet. Dabei zeigte sich deutlich die Expression
einer mRNA mit einer Länge von etwa 3.3kb in Milz und Keimdrüsen (Hoden,
Eierstöcken), sowie schwächer in Thymus und Darm. Eine Hybridisierung eines
Master-Blots (Dotblot mit RNA aus zahlreichen Geweben (Human RNA Master
Blot™, Clontech) bestätigte dieses Ergebnis und zeigte auch eine starke
Expression in Plazenta-Gewebe.
Die Hybridisierung wurde für 16 Stunden unter stringenten Bedingungen (5xSSC,
50 mM Na-Phosphat pH 6.8, 50% Formamid, 100 pg/ml Hefe-RNA) bei 42°C
durchgeführt. Die Blots wurden stringent gewaschen (65°C, 0,2XSSC, 0.1% SDS)
und einem Fuji BAS2000 Phosphoimager™ exponiert.
Eine cDNA-Bibliothek aus humaner Milz, kloniert in dem Bakteriophagen Lambda
gt10 (Human Spleen 5' STRETCH PLUS cDNA, Clontech) wurde mit dieser Sonde
durchsucht und ein Lambda-Klon identifiziert. Die in diesem Klon inserierte cDNA
mit einer Länge von 1.6kb wurde mittels PCR (Expand™ Long Template PCR
System, Boehringer Mannheim GmbH, Sandhofer Straße 116, 68305 Mannheim)
amplifiziert wobei die vektorspezifischen Primer Nr. 207608 + Nr. 207609 (Tabelle
6) verwendet wurden (flankierend der EcoRI-Klonierungsstelle) und das erhaltene
PCR-Fragment sequenziert. Dieser Klon enthielt das 5' Ende der cDNA und
erweiterte die bekannte cDNA Sequenz auch nach 3'. Ausgehend von den neuen
Teilsequenzen der cDNA wurden neue Primer für die RACE-PCR entwickelt (Nr.
232643, Nr. 232644, Nr. 233084, Tabelle 6). Zusammen mit einer verbesserten
Thermocyclertechnik (PTC-200 von MJ-Research, Biozym Diagnostik GmbH, 31833
Hess. Oldendorf) mit deutlich besseren Leistungsdaten (Heiz- und Kühlrate) wurde
ein 3'-RACE PCR-Produkt amplifiziert wobei die Primer Nr. 232644 bzw. Nr. 232643
und AP1 verwendet wurden und in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen, De Schelp 12,
9351 NV Leek, Niederlande) kloniert. Das 3'-RACE PCR-Produkt wurde Sequenziert
und auf diese Weise das 3'Ende der cDNA identifiziert. Eine RACE-Amplifikation
nach 5' (Primer Nr. 131990 bzw. Nr. 233084 und AP1) erweiterte das 5' Ende der
cDNA um wenige Nukleotide und bestätigte den im identifizierten Lambda-Klon
gefundenen Aminoterminus des H-Sema-L.
Ausgehend von einem kurzen murinen EST (Zuordnungs-Nr. AA260340) und einem
daraus abgeleiteten Primer Nr. 260813 (Tabelle 6) und dem H-Sema-L spezifischen
Primern Nr. 121234 (Tabelle 6) wurde mittels PCR (Bedingungen: Taq52-60) ein
DNA-Fragment mit einer Länge von ca. 840 bp muriner cDNA amplifiziert und in den
Vektor pCR2.1 kloniert. Das dieses DNA-Fragment enthaltende Gen wurde
M-Sema-L genannt. Mit dem erhaltenen M-Sema-L DNA-Fragment eine cDNA-Bank
aus Mäuse-Milz (Mouse Spleen 5' STRETCH cDNA, Clontech) untersucht, wobei
bereits mehrere Klone identifiziert werden konnten.
PCR (Taq60-30) mit den Primern Nr. 260812, Nr.260813 aus muriner, endothelialer
cDNA lieferte ein PCR-Fragment mit einer Länge von 244 Basenpaaren. Die PCR-
Ergebnisse zeigten, daß eine deutliche basale Expression in murinen
Endothelzellen vorhanden ist, welche nach Stimulation mit dem Zytokin Interferon-y
und Lipopolysacchariden zurückgeht.
Untersuchungen zur Chromosomalen Lokalisation wurden mittels Fluoreszenz
in-situ Hybridisierung (FISH) durchgeführt. Dazu wurden Metaphase Chromosomen
von Mensch und Maus, ausgehend von einer humanen Blutprobe bzw. der
Mauszellinie BINE 4.8 (Keyna et al. (1995) J. Immunol. 155, 5536-5542), hergestellt
(Kraus et al. (1994) Genomics 23, 272-274). Die Objektträger wurden mit RNase
und Pepsin behandelt (Liehr et al. (1995) Appl. Cytogenetics 21,185-188). Für die
Hybridisierung wurden 120 mg humane Nick-translatierte Semaphorin-Probe bzw.
200 mg einer entsprechenden Mausprobe verwendet. Die Hybridisierung wurde
jeweils in Gegenwart von 4.0 µg COT1-DNA und 20 µg STD bei 37°C (3 Tage) in
einer befeuchteten Kammer durchgeführt.
Die Objektträger wurden mit 50% Formamid/2×SSC (3 mal je 5 min bei 45°C) und
dann mit 2×SSC (3 mal je 5 min bei 37°C) gewaschen und die biotinylierte Probe
mit dem FITC-Avidin-System (Liehr et al. (1995)), detektiert. Die Objektträger
wurden mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops ausgewertet. Es wurden 25
Metaphasen/Probe ausgewertet, wobei jedes Experiment doppelt durchgeführt
wurde.
Es zeigt sich, daß H-Sema L auf Chromosom 15q23 lokalisiert ist. Chromosomal
benachbart liegen der Locus für das Bardet-Biedl-Sydrom und Tay-Sachs
Erkrankung (Hexosaminidase A).
Die genomische Intron-Exon Struktur des H-Sema L Gens ist zum größten Teil
aufgeklärt.
Genomische DNA Fragmente wurden ausgehend von 250 mg humaner
genomischer DNA, die aus PHA stimmulierten pheripheren Lymphozyten (Blut)
isoliert worden waren, amplifiziert: Kürzere Fragmente wurden mit Ampli TaqR
(Perkin Elmer), längere Fragmente mit dem Expanded Long Templat PCR SystemR
(Boehringer Mannheim) amplifiziert.
Durch PCR-Amplifikation konnte bisher fast der vollständige genomische Locus des
H-Sema-L kloniert und charakterisiert werden. Insgesamt konnten bereits mehr als
8888 bp der genomischen Sequenz bestimmt werden und so die intron-Exon-
Struktur des Gens weitgehend aufgeklärt werden.
Da kein kompletter Klon des Semaphoringens aus der Lambda-gt10 cDNA-Bank
isoliert werden konnte, und auch mittels PCR ein vollständiger Klon nicht zu
erhalten war, wurde der kodierende Bereich der cDNA in 2 überlappenen
Subfragmenten mittels PCR (XL62-6) mit Hilfe der Primer Nr. 240655 und Nr.
121339 für das N-terminale DNA-Fragment, sowie den Primern Nr. 240656 (enthält
HindIII und Pmel Schnittstellen) und Nr. 121234 für das C-terminale DNA-Fragment
amplifiziert. Die erhaltenen DNA-Fragmente (Subfragmente) wurden in den Vektor
pCR21 kloniert. Die beiden Subfragmente wurden komplett sequenziert und
schließlich die vollständige H-Sema-L CDNA durch Insertion eines 0.6kb
C-terminalen SstI-HindIII Restriktions-Fragments in das mit den Restriktionsenzymen
SstI und HindIII geschnittene, das N-terminale DNA-Fragment enthaltende Plasmid,
hergestellt. Aus diesem Plasmid pCR2.1-H-Sema-L (gemäß Sequenz in Tabelle 7)
wurde das komplette Gen mittels der EcoRI-Schnittstelle (in pCR2.1) und HindIII-
Schnittstelle (in Primer Nr. 240656, Tabelle 6) herausgeschnitten und in einen
entsprechend geschnittenen, konstitutiven Expressionsvektor pCDNA3. 1 (-)MycHisA
(Invitrogen) ligiert. Aus dem resultierenden rekombinanten Plasmid pCDNA3. 1(-)H-
Sema-L-MycHisA (gemäß Sequenz in Tabelle 8) wurde das EcoRI-Apal Fragment
(ohne Myc-His-Tag) herausgeschnitten und in den induzierbaren Vektor pIND ligiert
(Ecdyson-Inducible Mammalian Expression System, Invitrogen), der zuvor ebenfalls
mit EcoRI-Apal geschnitten worden war. Das rekombinante Plasmid wurde mit
pIND-H-Sema-L-EA (Sequenz gemäß Tabelle 9) bezeichnet. Ein EcoRI-Pmel-
Fragment (mit Myc-His-Tag) aus pCDNA3.1 (-)H-Sema-L-Myc-HisA (Sequenz
gemäß Tabelle 9) wurde in einen mit EcoRI-EcoRV geschnittenen Vektor pIND
eingesetzt. Das rekombinante Plasmid wurde mit pIND-H-Sema-L-EE (Sequenz
gemäß Tabelle 10) bezeichnet.
Ein Fusionsgen von H-Sema-L mit Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)
wurde hergestellt durch Ligation des mit PCR amplifizierten EGFP-Leserahmens
(aus dem Vektor pEGFP-C1 (Clontech), mit Hilfe der Primer Nr. 243068 + Nr.
243069, Taq52-60) in die Pmel-Schnittstelle des Plasmids pCDNA3.1(-)H-Sema-L-
MycHisA wodurch das Plasmid pCDNA3. 1 (-)H-Sema-L-GFP-MycHisA (Sequenz
gemäß Tabelle 11) erhalten wurde.
Zur Herstellung von H-Sema-L spezifischen Antikörpern wurden cDNA-Fragmente
von H-Sema-L in prokaryotische Expressionsvektoren integriert, in E. coli exrimiert
und die Semaphorin-Derivate aufgereinigt. Die Semaphorin-Derivate wurden als
Fusionsproteine mit einem His-Taq exprimiert. Dementsprechend wurden Vektoren
verwendet, die die Sequenz für ein His-Taq enthalten und eine Integration des
Semaphorin cDNA-Fragments im Leserahmen ermöglichten. Ein N-terminales
6xHistidin-Tag ermöglicht z:B. eine Aufreinigung mittels Nickel-Chelat-
Affinitätschromatographie (Qiagen GmbH, Max-Volmer Straße 4, 40724 Hilden):
- 1. Der für die Aminosäuren 179-378 kodierende Teil der H-Sema-L cDNA wurde mittels PCR mit den Primern Nr. 150788 und Nr. 150789 amplifiziert und dieses DNA-Fragment in den Vektor pQE30 (Qiagen), der zuvor mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII geschnitten worden war, ligiert (Konstrukt pQE30-H-Sema-L-BH (Sequenz gemäß Tabelle 12)).
- 2. Der für die C-terminalen Aminosäuren 480-666 kodierende Abschnitt der H-Semal-L cDNA wurde mit den Restriktionsenzymen SstI und HindIII aus dem Plasmid pCR 2.1 geschnitten und in den Vektor pQE31 (Qiagen), der zuvor mit SstI und HindIII geschnitten worden war ligiert (Konstrukt pQE31-H- Sema-L-SH (Sequenz gemäß Tabelle 13)).
Die korrekte Integration der Sequenzen im richtigen Leserahmen wurde durch DNA-
Sequenzierung überprüft. Die Fusionsproteine, bestehend aus einem N-terminalen
6xHistidin-Taq und einem Teil des Semaphorins H-Sema-L wurden mittels Ni2+-
Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die aufgereinigten Fusionsproteine wurden
zur Immunisierung von verschiedenen Tieren (Hase, Huhn, Maus) benutzt.
- A) Mehrfach-Gewebe Northern Blot (Clontech, Heidelberg, Deutschland). Von links nach rechts sind aufgetragen: Je 2 µg Poly-A-RNA pro Spur aus Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstöcken, Dünndarm, Dickdarm Mukosa, pheripheren (Blut-) Leukozyten. Größenstandards sind markiert.
Die Blots wurden unter stringenten Bedingungen mit einer 800 Basenpaaren langen
H-Sema L Probe hybridisiert.
Schematische Darstellung der Klonierung der H-Sema L cDNA und der
genomischen Organisation der H-Sema L kodierenden Sequenzen (H-Sema L Gen)
Oben: Lokalisation der EST-Sequenzen (Zugangsnummern; Lage der EST-
Sequenzen ist relativ zur AHV-Sema Sequenz dargestellt).
Darunter: Amplifizierte PCR- und RACE-Produkte sowie die Position der cDNA
Klone im Bezug auf die Lokalisation in der vollständigen H-Sema L cDNA und dem
offenen Leserahmen (ORF) für das kodierte Protein.
Unten: Relative Position der Exons im H-Sema L Gen im Bezug auf die genomische
Sequenz.
Die Position der verwendeten Oligonukleotid Primer ist durch Pfeile angezeigt.
Phylogenetischer Baum: Erhalten durch mehrfaches Alignment der aufgeführten
Semaphorin Sequenzen. Aufgrund der Gruppierung der Semaphorine in dem
phylogenetischen Baum kann auf deren phylogenetische Verwandtschaft
geschlossen werden.
Claims (16)
1. Semaphorin enthaltend eine charakteristische Sema-Domäne, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein ein N-terminales Signalpeptid und im C-terminalen
Bereich eine Immunglobulin-ähnliche Domäne und eine Transmembrandomäne
aufweist, wobei das Semaphorin als Semaphorin vom Typ L (Sema L) bezeichnet
wird und Derivate des Semaphorins vom Typ L.
2. Semaphorin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein
(humanes Semaphorin (H-Sema L)) die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 3 hat.
3. Semaphorin nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 und 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein im Bereich der Sema-Domäne eine
Aminosäureidentität von mindestens 40% im Bezug auf die Sema-Domäne von
H-Sema L aufweist.
4. Semaphorin nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein die partielle Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 4
enthält (murines Semaphorin (M-Sema L)).
5. Nukleinsäure enthaltend eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Semaphorin
vom Typ L gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 kodiert sowie
Derivate derselben.
6. Nukleinsäure nach Anspruch 5, wobei besagte Nukleinsäure-Sequenz ein
Semaphorin L Gen ist.
7. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 und 6, wobei
besagte Nukleinsäure-Sequenz das Gen von H-Sema L enthält.
8. Nukleinsäure nach Anspruch 5, wobei besagte Nukleinsäure-Sequenz die
cDNA eines Semaphorins vom Typ L enthält.
9. Nukleinsäure nach Anspruch 8, wobei die cDNA die cDNA von M-Sema L ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines Semaphorins vom Typ L gemäß einem oder
mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure-
Sequenz, die für ein Semaphorin vom Typ L kodiert, in einen Expressionsvektor
kloniert und exprimiert wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß für die
Expression eine eukaryotische Zelle verwendet wird.
12. Verwendung eines Semaphorins vom Typ L oder eines Derivats desselben
oder einer Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Semaphorin vom Typ L kodiert oder
eines Derivats derselben zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung
oder Prävention von immunologischen Erkrankungen verwendet werden kann.
13. Verwendung einer Nukleinsäure-Sequenz oder eines Derivats derselben
nach Anspruch 12 in der Gentherapie.
14. Verwendung eines Semaphorins vom Typ L oder einer Nukleinsäure-
Sequenz, die für ein Semaphorin vom Typ L kodiert in einem Verfahren zur
Identifizierung von immunmodulierenden Wirkstoffen.
15. Verfahren zur Identifizierung von immunmodulierenden Wirkstoffen, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Semaphorin vom Typ L unter definierten Bedingungen mit
einem zu untersuchenden Wirkstoff inkubiert wird, parallel ein zweiter Ansatz ohne
den zu untersuchenden Wirkstoff, aber unter ansonsten gleichen Bedingungen
durchgeführt wird und dann die inhibierende bzw. aktivierende Wirkung des zu
untersuchenden Wirkstoffs bestimmt wird.
16. Verfahren zur Identifizierung von immunmodulierenden Wirkstoffen, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Semaphorin vom Typ
L kodiert unter definierten Bedingungen und in Gegenwart eines zu untersuchenden
Wirkstoffs exprimiert wird und das Ausmaß der Expression bestimmt wird.
Priority Applications (17)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998105371 DE19805371A1 (de) | 1998-02-11 | 1998-02-11 | Humanes Semaphorin L (H-Sema-L) und korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies |
EP98112470A EP0892047A3 (de) | 1997-07-09 | 1998-07-06 | Humanes und murines Semaphorin L |
TR1998/01301A TR199801301A3 (tr) | 1997-07-09 | 1998-07-07 | Insan semaforin L(H-sema-L) ve diger türlerdeki mütekabil semaforinler. |
IDP980957A ID20819A (id) | 1997-07-09 | 1998-07-07 | Semaforin l manusia (h-sema l) dan semaforin yang sesuai dalam spesies lainnya |
CZ982149A CZ214998A3 (cs) | 1997-07-09 | 1998-07-07 | Lidský semaforin typu L (H-sema-L) a příbuzné semaforiny jiných druhů |
HU9801511A HUP9801511A3 (en) | 1997-07-09 | 1998-07-07 | Human semaphorin-l (h-sema-l) and corresponding semaphorine in other species |
ARP980103298A AR013190A1 (es) | 1997-07-09 | 1998-07-07 | Semaforina l humana (h-sema-l) que contiene un dominio de sema caracteristico, un acido nucleico que la codifica, procedimiento para lapreparacion de semaforinas, utilizacion de la semaforina tipo l y utilizacion de la secuencia de acido nucleico para la fabricacion de un medicamento, |
BR9802360-8A BR9802360A (pt) | 1997-07-09 | 1998-07-08 | "semaforina l (h-semal) humana e semaforinas correspondentes em outras espécies". |
AU75076/98A AU744447B2 (en) | 1997-07-09 | 1998-07-08 | Human semaphorin L (H-semal) and corresponding semaphorins in other species |
RU98112759/15A RU2218181C2 (ru) | 1997-07-09 | 1998-07-08 | ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ СЕМАФОРИН L(H-Sema-L) И СООТВЕТСТВУЮЩИЕ СЕМАФОРИНЫ В ДРУГИХ ВИДАХ |
KR1019980028074A KR19990013797A (ko) | 1997-07-09 | 1998-07-09 | 사람의 세마포린 L(H-SemaL) 및 다른 종의 상응하는 세마포린 |
JP10355463A JPH11235189A (ja) | 1997-07-09 | 1998-07-09 | ヒトセマホリンL(H−SemaL)および他の種における相当するセマホリン |
CA002237158A CA2237158A1 (en) | 1997-07-09 | 1998-07-09 | Human semaphorin l (h-semal) and corresponding semaphorins in other species |
CN98103356A CN1209436A (zh) | 1997-07-09 | 1998-07-09 | 人类信息素L(H-SemaL)和其它物种中相应的信息素 |
PL98327385A PL327385A1 (en) | 1997-07-09 | 1998-07-09 | Novel semaphorines, novel nucleic acids, method of obtaining such semaphorines and their application, application of sequences of nucleic acids, method of identifying immunomodulating active substances, method of obtaining nucleic acids, antibodies agains semaphorine and method of producing them as well as method of obtaining a pharmaceutic agent pharmaceutic agent as such |
US09/836,077 US20020037851A1 (en) | 1997-07-09 | 2001-04-16 | Human semaphorin L (H-SemaL) and corresponding semaphorins in other species |
US10/933,746 US7339030B2 (en) | 1997-07-09 | 2004-09-03 | Human semaphorin L (H-SemaL) and corresponding semaphorins in other species |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998105371 DE19805371A1 (de) | 1998-02-11 | 1998-02-11 | Humanes Semaphorin L (H-Sema-L) und korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19805371A1 true DE19805371A1 (de) | 1999-08-12 |
Family
ID=7857256
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1998105371 Ceased DE19805371A1 (de) | 1997-07-09 | 1998-02-11 | Humanes Semaphorin L (H-Sema-L) und korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19805371A1 (de) |
-
1998
- 1998-02-11 DE DE1998105371 patent/DE19805371A1/de not_active Ceased
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Nuell et al. | Prohibitin, an evolutionarily conserved intracellular protein that blocks DNA synthesis in normal fibroblasts and HeLa cells | |
EP1027440B1 (de) | Inhibitor-protein des wnt-signalwegs | |
DE69926764T2 (de) | Methoden zur bestimmung von komponenten zur modulation des körpergewichts | |
EP0892047A2 (de) | Humanes und murines Semaphorin L | |
EP0827537A2 (de) | Chromatin-regulatorgene | |
DE60128830T2 (de) | Regulierung der expression von eer-7, ein mitglied der lysyl oxidase genfamilie, durch oestrogenrezeptoren | |
DE69934239T2 (de) | Ly6h-gen | |
US6583277B2 (en) | Semaphorin K1 | |
US6465200B2 (en) | Transcription factor regulatory protein | |
JP4108755B2 (ja) | 新規セマフォリン遺伝子:セマフォリンy | |
EP0805204B1 (de) | Nebenhoden-spezifisches Rezeptorprotein und dessen Verwendung | |
DE69734199T2 (de) | Menschliches netrin-1 | |
JP4011629B2 (ja) | 新規セマフォリン遺伝子(i) | |
DE19729211C2 (de) | Humanes Semaphorin L (H-Sema-L) und korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies | |
EP1237910B1 (de) | Mit trp-proteinen verwandtes protein mtr1 und dieses codierende dna-sequenz | |
Natzle et al. | Sequence and expression of IMP‐L1, an ecdysone‐inducible gene expressed during Drosophila imaginal disc morphogenesis | |
DE19805371A1 (de) | Humanes Semaphorin L (H-Sema-L) und korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies | |
DE69616288T2 (de) | Nukleotid sequenzen und daraus abgleitete aminosäuresequenzen vom tumorgen int 6 | |
DE69832447T2 (de) | Gen kodierend für Afadin-1 | |
EP1015583B1 (de) | Srcr domäne-enthaltendes protein | |
CA2330179A1 (en) | Human homologue of unc-53 protein of c. elegans | |
DE10001377A1 (de) | bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 und diesen enthaltendes Arzneimittel | |
DE60024862T2 (de) | "insulinabhängiges sequenz dna bindendes protein-1" (irsdbp-1), dafür kodierendes gen und ihre verwendungen | |
JP2002503466A (ja) | 網膜芽細胞腫タンパク質複合体および網膜芽細胞腫相互作用タンパク質 | |
DE60122684T2 (de) | Akuter neuronal-induzierter liganden des calcium-bindenden protein-1 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH, 65929 FRANKFURT, |
|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH, 65929 FRANKFURT, |
|
8131 | Rejection |