KR19980041692A - 신규한 에스트로겐 수용체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 에스트로겐 수용체를 암호화하는 분리된 DNA, 상기 DNA 에 의해 암호화되는 단백질, 상기 신규한 수용체의 일부를 포함하는 키메릭 수용체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 핵 호르몬 수용체의 슈퍼패밀리에 속하는 수용체 분야, 구체적으로는 스테로이드 수용체에 관한 것이다. 본 발명은 신규한 스테로이드 수용체를 암호화하는 DNA, 상기 수용체의 제조, 수용체 단백질, 및 그 용도에 관한 것이다.
핵 호르몬 수용체의 슈퍼패밀리에 속하는 스테로이드 호르몬 수용체는 유전자 발현의 리간드-의존성 전사 조절에 관여한다. 부가적으로, 이 슈퍼패밀리는 비타민 D, 갑상선 호르몬 및 레티노이드와 같은 비-스테로이드 호르몬의 수용체를 구성한다(지게르 외 다수, Nature 330, 624-629, 1987; 에반스, 알.엠. Science 240, 889-895, 1988). 더구나 소위 오르판(orphan) 수용체를 암호화하는 핵 수용체와 유사한 서열 범위는 확인되었다. 아직 추정 리간드가 확인되지는 않았지만, 이들 수용체는 구조적으로 관련되어 있으며, 따라서 핵 수용체로 분류된다(비.더블유. 오말리, 내분비학 125, 1119-1170, 1989; 디.제이. 만겔스도르프 및 알.엠. 에반스, 세포, 83, 841-850, 1995).
핵 호르몬 수용체의 슈퍼패밀리는 6개의 별개 구조 및 기능 도메인, 즉 A 내지 F가 나타나는 모듈 구조를 공유하고 있다(에반스, Science 240, 889-895, 1988). 핵 호르몬 수용체는 가변성 N-말단 영역(도메인 A/B), 중앙에 위치한 보존이 잘된 DNA-결합 도메인(하기에서는 DBD로 언급함; 도메인 C), 가변성 힌지 영역(도메인 D), 보존된 리간드-결합 도메인(하기에서는 LBD로 언급함; 도메인 E) 및 가변성 C-말단 영역(도메인 F)를 지니는 것을 특징으로 하고 있다.
크기 및 서열에 있어 매우 다양한 N-말단 영역은 슈퍼패밀리의 다른 멤버중에서 가장 보존율이 떨어진다. 수용체의 N-말단 영역은 전사 활성화의 조정에 관련하고 있다(복켈 외 다수, Nucl. Acid Res., 17, 2581-2595, 1989; 토라 외 다수, 세포 59, 477-487,1989).
DBD는 약 66 내지 70개의 아미노산으로 구성되어 있으며 DNA에 결합하는 활성이 있다. 염색질상의 특이적 표적 유전자들의 전사 조절 단위내에서 DBD는 호르몬 반응성 요소(이하에서는 HRE라고 언급함)라고 불리는 특정한 DNA 서열의 수용체를 표적으로 한다(마르티네즈 및 왈리, 핵 호르몬 수용체, 아카데미 프레스, 125-153,1991).
LBD는 수용체의 C-말단 부분에 위치하며 주로 리간드 결합 활성을 지닌다. 이렇게 하여 LBD는 호르몬 리간드의 인식 및 결합에 필수적이며, 부가적으로 전사 활성화 기능을 지녀서 이로인해 수용체의 호르몬 반응의 특이성 및 선택성을 결정한다. 비록 구조적으로는 중간 정도로 보존되었지만, LBD는 핵 호르몬 수용체 슈퍼패밀리의 개별적인 멤버간의 상동성을 상당히 변화시키는 것으로 공지되어 있다(에반스, Science 240, 889-895, 1988; 피.제이. 풀러, FASEB J., 5, 3092-3099, 1991; 만겔스도르프 외 다수, 세포, 제 83권, 835-839,1995).
N-말단 영역에 존재하는 기능인 LBD 및 DBD는 서로 독립적으로 작동하며, 이들 도메인이 핵 수용체 사이에서 호환될 수 있다는 것을 알 수 있다(그린 외 다수, Nature, 제 325권, 75-78, 1987). 이로 인해 예를 들면 국제 공개 제 WO-A-8905355 호에 기재된 바와 같은 키메릭 핵 수용체가 생긴다.
핵 수용체를 위한 호르몬 리간드가 확산에 의해 세포내로 들어오고 LBD에 의해 인식되면, 호르몬 리간드는 특이적인 수용체 단백질에 결합하여 수용체 단백질의 알로스테릭(allosteric) 변화를 야기시킨다. 이러한 변화의 결과로 인해 리간드/수용체 복합체는 전사적으로 활성인 형태로 변화되고, 친화성이 높은 DBD의 존재를 통해 염색질 DNA상에서 대응하는 HRE에 결합할 수 있다(마르티네즈 및 왈리, 핵 호르몬 수용체, 아카데미 프레스, 125-153,1991). 이런 방식으로 리간드/수용체 복합체는 특이적인 표적 유전자의 발현을 조절한다. 수용체의 이 패밀리에 의해 다양성이 생기는 이유는, 이것이 서로 다른 리간드에 반응할 수 있기 때문이다.
스테로이드 호르몬 수용체는 별개의 분류의 핵 수용체 슈퍼패밀리인데, 리간드가 스테로이드 호르몬인 것을 특징으로 한다. 글루코코르티코이드(GR), 미네랄코르티코이드(MR), 프로게스틴(PR), 안드로겐(AR) 및 에스트로겐(ER)의 수용체는 대표적인 스테로이드 수용체이다. 또한 스테로이드 수용체는 활성화되면 호모이량체로서 회귀성 DNA 서열, 소위 HRE 에 결합할 수 있는 특유한 능력을 지닌다. GR, MR, PR 및 AR은 동일한 DNA 서열을 인식하나, ER은 다른 DNA 서열을 인식한다(베아토 외 다수, 세포, 제 83권, 851-857, 1995). DNA에 결합한 후에, 스테로이드 수용체는 기초적인 전사 기계의 성분, 및 서열-특이적인 전사 요인과 함께 상호작용하는 것으로 생각되며, 이로인해 특이적인 표적 유전자의 발현을 조절한다.
호르몬/수용체 복합체에 반응하는 여러 HRE가 확인되었다. 이들 HRE는 다양한 표적 유전자의 전사 조절 단위내에 위치하는데, 표적 유전자의 예로는 포유류 성장 호르몬 유전자(글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론에 반응함), 포유류 프로락틴 유전자 및 프로게스테론 수용체 유전자(에스트로겐에 반응함), 조류 난백 유전자(프로게스테론에 반응함), 포유류 메탈로티오넨 유전자(글루코코르티코이드에 반응함) 및 포유류 간 α2μ-글로불린 유전자(에스트로겐, 테스토스테론, 글루코코르티코이드에 반응함)가 있다.
스테로이드 호르몬 수용체는 태아(embryo) 성장, 성인 생체항상성 및 장기 생리에 관여하는 것으로 알려져 있다. 많은 질병 및 질환들의 원인은 스테로이드 호르몬 생성경로가 저해되기 때문이다. 스테로이드 수용체가 호르몬-활성화된 전사 조절제로서 영향을 발휘하기 때문에, 이들 수용체의 과도자극 또는 차단 뿐 아니라 수용체의 돌연변이 및 결함이 패턴을 변화시키는 근본적인 원인일 것이라고 예견될 수 있다. 이들 수용체, 작용 기전 및 이 수용체에 결합하는 리간드를 더 잘 알게되면, 호르몬 신호 형질도입 경로의 근본적인 기전을 아는데 도움이 될 것이고, 결국 변화된 호르몬/수용체 기능에 관련된 질병 및 질환들을 더 잘 치료할 수 있을 것이다.
이런 이유로 사람을 포함한 여러 포유류의 스테로이드 및 다른 여러 핵 수용체들의 cDNA가 분리되었고, 상응하는 아미노산 서열이 추론되었는데, 예를 들면 사람 스테로이드 수용체 PR, ER, GR, MR 및 AR, 비타민 D, 갑상선 호르몬 및 레티로이드(예, 레티놀 A 및 레티논산)를 위한 사람 비-스테로이드 수용체가 있다. 게다가 100 개이상의 포유류 오르판 수용체를 암호화하는 cDNA가 분리되었는데, 아직 추정 리간드는 공지되지 않았다(만겔스도르프 외 다수, 세포, 제 83권, 835-839,1995). 그러나, 이들 수용체가 정상 생리 및 병리상태에서 작동하는 다양한 역할을 설명하기 위하여 다른 핵 수용체를 설명할 필요도 크다.
본 발명은 신규한 핵 수용체를 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 에스트로겐-매개된 활성을 지니는 신규한 스테로이드 수용체를 제공한다. 상기 신규한 스테로이드 수용체는, 예를 들면 에스트라디올, 에스트론 및 에스트리올에 결합하고 이에 의해 활성화될 수 있는 신규한 에스트로겐 수용체이다.
본 발명에 따라서, 신규한 에스트로겐 수용체는 사람 흉선, 비장, 말초 혈관 임파구(PBLs), 난소 및 고환내에서 8 kb 전사체로서 발현된다. 또한 부가적인 전사체가 확인되었다. 약 10 kb 의 다른 전사체가 난소, 흉선 및 비장에서 확인되었다. 고환에서, 추가의 1.3 kb 의 전사체가 검출되었다. 이들 전사체는, 본 발명의 신규한 에스트로겐 수용체를 암호화하는 유전자의 대안적인 스플라이스에 의해 생성된다.
본 발명의 신규한 에스트로겐 수용체를 암호화하는 cDNA를 클로닝하면, 상기 수용체의 여러 스플라이스 변형물이 구별될 수 있다는 것을 알 수 있다. 단백질 수준에서, 이들 변형물들은 단지 C-말단 부분만 다르다.
ER을 암호화하는 cDNA가 분리되었고(그린 외 다수, Nature, 320, 134-139, 1986 ; 그린 외 다수, Science 231, 1150-1154, 1986), 상응하는 아미노산 서열이 추론되었다. 그러나 이 수용체와 본 발명의 수용체는 다르며, 서로 다른 핵산 서열을 지닌 다른 유전자에 의해 암호화된다. 선행기술의 ER(이하에서는 종래의 ER로 언급함)과 본 발명의 ER은 아미노산 서열이 다를 뿐 만 아니라, 서로 다른 염색체 상에 위치한다. 종래의 ER을 암호화하는 유전자는 염색체 6 상에 위치하는 반면에, 본 발명의 ER을 암호화하는 유전자는 염색체 14상에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 ER은 조직 분포가 달라서 종래의 수용체와 구별되며, 이는 에스트로겐 신호 수준에 있어서 이들 수용체 사이에 중요한 차이가 있을 수 있음을 나타내는 것이다.
또한 에스트로겐 수용체와 관련된 구조를 지닌 2개의 오르판 수용체 ERRα 및 ERRβ가 개시되었다(지게르 외 다수, Nature 331, 91-94, 1988). 그러나 이들 오르판 수용체가 에스트로디알 또는 종래의 ER에 결합하는 다른 호르몬에 결합할 수 있다는 것은 보고되지 않았으며, 이들 수용체에 결합하는 다른 리간드도 발견되지 않았다. 본 발명의 신규한 에스트로겐 수용체는 에스트로겐에 결합한다는 것이 밝혀졌으므로, 이들 수용체와 명백히 구별된다.
추가적인 에스트로겐 수용체의 존재에 대한 어떠한 암시도 과학문헌에 없었으므로, 본 발명에 따라 신규한 ER이 발견되었다는 사실이 가장 놀랍다. 종래의 ER의 분리 또는 오르판 수용체 ERRα 및 ERRβ도 본 발명의 수용체와 같은 추가적인 에스트로겐 수용체의 존재에 대해 전혀 암시하거나 기재하지 않았다. 추가적인 ER의 확인은, 기존의 임상 요법을 개발하는 주요한 단계인데, 이 요법은 하나의 ER의 존재를 기초로 하고 있으며, 모든 에스트로겐 매개된 질병 및/또는 질환이 상기 하나의 수용체로 인해 생기기 때문인 것이다. 본 발명의 수용체는 본 발명의 신규한 에스트로겐 수용체 또는 종래의 ER을 선택적으로 활성화시키는 호르몬 유사체(homologue)의 개발에 유용할 것이다. 이것은 본 발명의 주된 장점의 하나로 여겨져야 한다.
도 1은 신규한 에스트로겐 수용체(ERβ)의 노던 분석을 나타낸 것이다. 2개의 상이한 다중 조직 노던 블롯 (Clontech)은 ERβ에 대한 특이적인 프로브로 하이브리드화 되었다(실시예 참고). 표시된 것은, RNA가 기원한 사람 조직 및 킬로베이스(kb) 단위의 치수 표지의 위치이다.
도 2의 막대그래프는 ERβ에 의해 매개되는 루시퍼라아제 활성에 대한 17β-에스트라디올, 에스트리올 및 에스트론의 3배 또는 4배 자극효과를 나타낸 것이다. ERβ를 암호화하는 발현 벡터는, 파이어플라이 루시퍼아라아제 암호 서열의 앞에서 랫트 옥시토신 프로모터를 함유하는 리포터 구조물과 함께 CHO 세포내로 일시적으로 형질감염되었다(실시예 참고).
도 3은 ERα 및 ERβ에 대한 17β-에스트라디올 (E2) 단독의 영향 또는 항-에스트로겐 ICI-164384 (ICI)와 혼합된 영향을 나타낸 것이다. ERα (종래의 ER) 및 ERβ을 위한 발현 구조물은 실시예에 기재된 랫트 옥시토신 프로모터-루시퍼라아제 리포터 구조물과 함께 CHO 세포내로 일시적으로 형질감염되었다. 루시퍼라아제 활성은 트리플리케이트내에서 결정되었고, 동일한 융해물 (lysate)내에서 β-갈락토시다아제를 측정함으로써 형질감염 효율을 정상화하였다.
도 4는 RT-PCR 분석법에 의해 결정된 여러 세포주내에서 ERα 및 ERβ의 발현을 나타낸 것이다(실시예 참고). 사용된 세포주는 서로 다른 조직/세포 유형으로부터 유도되었다: 자궁내막(ECC1,이시가와, HEC-1A, RL95-2); 골육종(SAOS-2, U2-OS, HOS, MG63); 유방종양(MCF-7, T47D), 내피(HUV-EC-C, BAEC-1); 평활근(HISM, PAC-1, A7R5, A10, RASMC, CavaSMC); 간(HepG2); 결장(CaCo2); 및 질(Hs-760T, SW-954). PAC-1, A7R5, A10 및 RASMC은 랫트가 기원이었고, BAEC-1 은 소가 기원이었으며 CavaSMC는 기니아피그 기원이었고, 이것을 제외한 모든 세포주는 사람이었다.
도 5는 랫트 옥시토신-루시퍼라아제 에스트로겐-반응성 리포터와 함께 ERα 또는 ERβ를 발현하는 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 사용한 트랜스활성화를 나타낸 것이다(실시예 참고). 호르몬-의존성 트랜스활성화 곡선은 17β-에스트라디올 및 Org4094 에 대해 결정되었다. ER 길항제 랄옥시펜에 대해, 랄옥시펜의 농도를 증가시키면서 2 x 10-10 mol/L의 17β-에스트라디올로 세포를 처리하였다. 반응의 최대 수치를 100% 로 임의로 고정하였다.
그러므로 하나의 면에서, 본 발명은 신규한 스테로이드 수용체를 암호화하는 분리된 cDNA를 제공한다. 특히, 본 발명은 신규한 에스트로겐 수용체를 암호화하는 분리된 cDNA를 제공한다.
본 발명의 이러한 면에 따라, N-말단 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 지니는 스테로이드 수용체 단백질을 암호화하는 분리된 DNA 가 제공된다. 상기 수용체 단백질의 DNA-결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3에서 나타난 아미노산 서열과 80% 이상 상동성이며, 상기 수용체 단백질의 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4에서 나타난 아미노산 서열과 70% 이상 상동성이다.
구체적으로 분리된 DNA는, N-말단 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 지니는 스테로이드 수용체 단백질을 암호화하며, 상기 수용체 단백질의 DNA-결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3에서 나타난 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 100% 상동성이다.
더 구체적으로 분리된 DNA는, N-말단 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 지니는 스테로이드 수용체 단백질을 암호화하며, 상기 수용체 단백질의 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4에서 나타난 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100% 상동성이다.
본 발명의 분리된 DNA중 바람직한 것은, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 21 또는 서열번호 25 에 나타난 아미노산 서열을 지니는 스테로이드 수용체 단백질을 암호화한다.
본 발명의 분리된 DNA 중 더 바람직한 것은, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 20 또는 서열번호 24 에 나타난 누클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 DNA 이다.
본 발명의 DNA는 cDNA로부터 수득할 수 있을 것이다. 대안적으로, 암호 서열은 게놈 DNA 이거나 DNA 합성기법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 DNA는, 본 발명의 신규한 수용체 단백질이 생체내에서 충분한 양으로 거의 순수한 형태로 발현하는데 매우 유용할 것이다.
본 발명의 다른 면에서, 전술한 DNA 분자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 스테로이드 수용체가 제공된다.
본 발명의 스테로이드 수용체는 N-말단 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 가지며, 상기 수용체의 DNA-결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3에서 나타난 아미노산 서열과 80% 이상 상동성이며, 상기 수용체의 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4에서 나타난 아미노산 서열과 70% 이상 상동성이다.
구체적으로 본 발명의 스테로이드 수용체는, N-말단 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 가지며, 상기 수용체의 DNA-결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3에서 나타난 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 100% 상동성이다.
더 구체적으로 본 발명의 스테로이드 수용체는 N-말단 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 지니며, 상기 수용체의 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4에서 나타난 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100% 상동성이다.
바람직한 DBD 및 LBD 가 결합된 스테로이드 수용체 단백질 및 이런 수용체를 암호화하는 DNA가 본 발명의 주제라는 것이 당업자에게는 명확할 것이다.
본 발명의 스테로이드 수용체는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 21 또는 서열번호 25 에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
또한 각각의 DNA-결합 및 리간드-결합 활성을 유지하면서 DBD 및 LBD 의 아미노산 서열을 변화시킨 스테로이드 수용체 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다. 이들 아미노산 서열내에서 일어날 수 있는 변형은 상기 서열내 아미노산(들)의 결손, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가를 포함하며, 이들 변형으로 인해 전체 서열에 있어서 아미노산의 차이를 만든다. 이들 아미노산의 차이로 인해 아미노산 서열이 서로 달라지긴 하지만, 이들이 기원하는 천연 아미노산 서열과 상동성이라는 것이 단백질 및 펩타이드 분야에 공지되어 있다.
생물학적 및 면역학적 활성을 본질적으로 변화시키지 않는 것으로 예견된 아미노산 치환은, 예를 들면 데이호프의 문헌[Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., 워싱턴 디.씨., 1978, 제 5권, suppl. 3]에 기재되어 있다. 관련된 아미노산 사이의 아미노산 대체 또는 진화과정중 종종 일어난 대체의 예로는 Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Arg/Lys, Asp/Asn, Ile/Val 이다. 이러한 정보에 기초하여 립맨 및 피어슨은 신속하고 민감한 단백질 비교 방법을 개발하였으며(Science 227, 1435-1441, 1985), 상동성인 폴리펩타이드 사이에 기능적 유사성을 결정하는 방법을 개발하였다.
본 발명에 따른 DBD의 아미노산 서열을 변화시켜도 서열 번호 3의 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 생성하면, 충분한 DNA 결합 활성을 유지하는 수용체가 될 것이다. 본 발명에 따른 LBD의 아미노산 서열을 변화시켜도 서열 번호 4의 서열과 70% 이상 상동성인 아미노산 서열을 생성하면, 충분한 리간드 결합 활성을 유지하는 수용체가 될 것이다.
상기 정의된 상동성은, PCGENE를 통해 결정되며 %로 표현된다. 상동성은 본 발명의 서열과 정렬되는 동일한 잔기의 %로 계산된다. 최대한의 정렬을 수득하기 위해 간극(gap)이 허용된다.
종래의 ER과 본 발명의 ER의 아미노산 서열을 비교하면, 각각의 DBD 가 매우 유사하다는 것을 알 수 있다. 종래의 ER과 표적 DNA 요소의 실질적인 상호작용에 역할을 하는 P-박스(아미노산 E-G-X-X-A)가 보존된다는 것은(질리아커스 외 다수, Mol. Endo. 9, 389, 1995; 글라스, End.Rev. 15, 391, 1994), 본 발명의 ER이 에스트로겐 반응성 요소(ERE)를 인식한다는 것을 나타내는 것이다. 본 발명의 수용체는 ERE-함유 수용체 구조물 상에 리간드에 좌우되는 트랜스활성화를 나타냈다. 그러므로 종래의 ER과 본 발명의 신규한 ER이 중복되는 표적 유전자 특이성을 가질 수도 있다. 이것은 상기 2 개의 ER을 공-발현시키는 조직내에서는 이들 수용체가 ERE에 대해 경쟁한다는 것을 나타낼 수 있다. 본 발명의 ER은 종래의 ER 조절과 다르게 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있거나, 에스트로겐 반응성 요소를 차지함으로써 종래의 ER 기능을 단순히 차단할 수도 있다. 대안적으로, 전사는 다른 수용체의 헤테로이량체화에 의해 영향을 받을 수도 있다.
그러므로, 본 발명의 바람직한 스테로이드 수용체는 DNA 결합 도메인의 P박스내에 아미노산 서열 E-G-X-X-A 을 포함하며, X 는 임의의 아미노산을 나타낸다. 또한 상기 수용체를 암호화하는 분리된 DNA 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 수용체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(샘브룩 외 다수, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 래버로토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 1989). 가장 실제적인 접근법은, 바람직한 단백질을 암호화하는 DNA의 발현에 의해 이들 수용체를 생산하는 것이다.
숙주 세포 및 클로닝 비이클 조합의 다양성은 본 발명의 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면 유용한 클로닝 비이클은 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있는데, 그 예로서는 공지된 여러 박테리아 플라스미드, 및 플라스미드와 파아지 또는 바이러스 DNA의 조합으로부터 유도된 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드 및 벡터가 있다. 유용한 숙주로는 박테리아 숙주, 이이스트 및 다른 곰팡이, 식물 또는 동물 숙주가 있는데 그 예로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 원숭이 세포 및 다른 숙주 등이다.
본 발명의 리간드-결합 도메인의 발현에 유용한 비이클은, 리간드-결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열을 추가로 포함할 것이다. 이러한 조절 서열은 일반적으로 발현수치를 조절 및/또는 증가시키는 서열 및 프로모터 서열을 포함한다. 더구나 복제 원천 및/또는 우성 선택 표지가 이러한 비이클에 종종 존재한다. 물론 조절 서열 및 다른 서열은 선택되는 숙주 세포에 따라 좌우될 수 있다.
숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 기법은 당해 분야에 공지되어 있다(문헌: 샘브룩 외 다수, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 래버로토리, 1989 참고).
본 발명의 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 DNA 나 발현 벡터로 형질전환된 세포도 본 발명의 일부를 형성한다.
본 발명의 다른 면에서, N-말단 도메인, DNA-결합 도메인, 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 키메릭 수용체 단백질이 제공되며, 상기 키메릭 수용체 단백질의 DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인이 서로 다른 단백질로부터 기원하는 경우, 도메인의 하나 이상은 본 발명의 수용체 단백질로부터 기원하고 상기 키메릭 단백질의 다른 도메인의 하나 이상은 핵 수용체 슈퍼패밀리의 다른 수용체 단백질로부터 기원하는 것을 특징으로 한다.
특히, 본 발명의 키메릭 수용체는 본 발명의 LBD를 포함하며, 상기 LBD는 서열번호 4 에 나타난 아미노산 서열과 70% 이상 상동성인 아미노산 서열을 지닌다. 이 경우에 N-말단 도메인 및 DBD는 다른 핵 수용체(예, PR)로부터 유도되어야 한다. 이러한 방법으로, 본 발명의 ER의 리간드에 의해 활성화되면서 프로게스테론 반응성 요소의 조절하에 있는 유전자를 표적으로 하는 키메릭 수용체가 구성된다. 본 발명의 LBD를 갖는 키메릭 수용체는, 본 발명의 ER을 활성화시킬 수 있는 신규한 리간드 또는 호르몬 유사체를 확인하기 위해 화합물을 검색하는데 유용하다.
부가적으로, 키메릭 수용체는 본 발명의 DBD를 포함하며 상기 DBD는 서열번호 3 에 나타난 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 지니고, LBD 및 임의로, 다른 핵 수용체로부터 유도된 N-말단 도메인은 상기 핵 수용체에 대한 신규한 리간드 또는 호르몬 유사체를 확인하는데 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 키메릭 수용체는 오르판 수용체의 각각의 리간드를 확인하는데 특히 유용하다.
스테로이드 수용체가, 다소간 독립적이며 서로 다른 기능을 지닌 3개의 도메인을 포함하므로, 3개의 기능성 도메인 모두가 스테로이드 수용체 슈퍼패밀리의 다른 멤버들로부터 유도되는 것도 가능하다.
서로 다른 기원을 지닌 부분을 함유하는 분자는 키메릭으로 호칭된다. 본 발명의 리간드-결합 도메인 및/또는 DNA-결합 도메인을 포함하는 키메릭 수용체는 화학 결합에 의해 생성될 수 있으나, 필수적인 스테로이드 수용체 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 융합하는 표준 분자 생물학적 방법으로 DNA 수준에서 커플링시키는 것이 가장 바람직하다. 그러므로 본 발명의 키메릭 수용체 단백질을 암호화하는 DNA도 본 발명의 주제에 포함된다.
상기 키메릭 단백질은, 이들 키메릭 수용체 단백질을 암호화하는 DNA를 적합한 숙주 세포에 형질감염시키고 이들 세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 제조될 수 있다.
스테로이드 수용체 발현을 위한 정보 다음에, 리포터 분자를 위한 정보를 지니는 벡터로 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시키면 매우 실용적이 될 것이다. 리포터 분자를 암호화하는 벡터는, 작동성 리포터 유전자에 기능적으로 연결된 호르몬 반응성 요소(HRE)를 하나 이상 함유하는 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이러한 HRE는 활성화된 스테로이드 수용체의 DNA 표적이고, 그 결과 리포터 분자를 암호화하는 DNA 의 전사를 증가시킨다. 스테로이드 수용체의 생체내 셋팅에서 리포터 분자는 리간드의 자극에 대한 세포 반응을 포함한다. 그러나, 시험관내(in vitro)에서도 수용체의 리간드-결합 도메인을 다른 스테로이드 수용체의 전사 활성화 도메인 및 DNA 결합 도메인과 결합시키는 것이 가능하며, 이로 인해 다른 HRE 및 리포터 분자 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 시스템의 하나는, MMTV-LTR(클로르암페니콜 전이효소(CAT)의 박테리아 유전자 또는 파이어플라이(firefly) 루시퍼라아제 유전자와 같은 리포터 분자와 연결된 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복 서열)내에서 나타난 HRE 에 의해 만들어진다. 사용될 수 있는 다른 HRE 로는, 랫트 옥시토신 프로모터, 레티논산 반응성 요소, 갑상선 호르몬 반응성 요소, 에스트로겐 반응성 요소, 및 합성 반응성 요소들이 있다(풀러, FASEB J., 5, 3096, 1991의 문헌 참고). 리포터 분자로서 CAT 및 루시퍼라아제 옆에 β-갈락토시다아제가 사용될 수 있다.
본 발명의 스테로이드 호르몬 수용체 및 키메릭 수용체는, 신규한 리간드 또는 호르몬 유사체의 시험관내 확인에 사용될 수 있다. 이런 목적으로, 본 발명의 DNA 또는 본원 발명의 DNA를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 가지고 결합 연구를 할 수 있는데, 상기 세포는 본 발명의 스테로이드 수용체 또는 키메릭 수용체를 발현한다.
본 발명의 리간드-결합 도메인 뿐만 아니라 본 발명의 신규한 스테로이드 호르몬 수용체 및 키메릭 수용체는, 핵 수용체의 기능적 리간드 또는 호르몬 유사체의 확인을 위한 분석법에 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 본 발명의 스테로이드 수용체 및 키메릭 수용체에 대한 기능적 리간드를 확인하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 a) 내지 c) 단계를 포함한다:
a) 1) 본 발명의 DNA 또는 발현 벡터, 및 2) 작동성 호르몬 반응성 요소에 기능적으로 연결된 적합한 리포터 유전자를 적합한 숙주 세포로 도입하는 단계로서, 상기 호르몬 반응성 요소(HRE)는 상기 DNA에 의해 암호화되는 수용체 단백질의 DNA-결합 도메인에 의해 활성화될 수 있고,
b) 상기 a)단계의 DNA 에 의해 암호화된 수용체 단백질의 리간드-결합 도메인에 결합하는 잠재적인 리간드와 a) 단계의 숙주세포를 접촉시키는 단계, 및
c) 상기 a)단계의 리포터 유전자에 의해 암호화된 수용체 단백질의 발현을 조절하는 단계.
리포터 유전자의 발현이 기초적 발현(리간드 부재시)에 비해 증가되었다면, 기능적 리간드는 항진제로 여겨질 것이다. 만일 리포터 유전자의 발현이 기초적 발현에 비해 감소되거나 변화되지 않았다면, 기능적 리간드는 적합한 (부분적) 길항제일 수 있다.
상기와 같은 연구를 수행함에 있어서 기능적 스테로이드 수용체를 암호화하는 벡터, 및 호르몬 반응성 요소 및 관련된 리포터 분자에 대한 정보를 지니는 벡터 둘 다에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 적절한 배지에서 배양했다. 수용체를 활성화시키는 적합한 리간드를 첨가한 후에 리포터 분자의 생산이 증가될 것이며, 그 생산 증가는 리포터 분자에 대한 민감성을 지닌 분석법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면 국제 공개 제 8803168호 참고. 공지된 스테로이드 수용체로 분석하는 방법이 기재되어 있다(문헌 에스.차이 외 다수, 세포 57, 443, 1989; 엠. 메이어외 다수, 세포 57, 433, 1989).
실시예 A. 신규한 에스트로겐 수용체의 분자 클로닝
이노신(I)을 함유하는 2개의 축퇴성(degenerate) 올리고누클레오타이드는, 사람 스테로이드 호르몬 수용체의 리간드-결합 도메인 및 DNA-결합 도메인의 보존된 영역을 주성분으로 하고 있다.
프라이머 #1:
5'-GGIGA(C/T)GA(A/G)GC(A/T)TCIGGITG(C/T)CA(C/T)TA(C/T)GG-3'(서열번호 7)
프라이머 #2:
5'-AAGCCTGG(C/G)A(C/T)IC(G/T)(C/T)TTIGCCCAI(C/T)TIAT-3'(서열번호 8)
주형으로서, 사람 EBV-자극된 PBLs(말초 혈관 백혈구)로부터의 cDNA가 사용되었다. 50 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl (pH 8.3), 4 mM MgCl2, 1 mM dNTPs (파마시아사 제품), 100 pmol 랜덤 헥사누클레오타이드(파마시아사 제품), 30 단위의 RNAse 저해제(파마시아사 제품) 및 200 단위의 M-MLV 역전사효소(기브코 BRL사 제품)을 함유하는 20 μl 반응물에서 전체 RNA의 1 μg을 역전사하였다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 30분동안 항온배양한 후 100 ℃에서 5분동안 열-불활성화시켰다. 수득된 cDNA를, 10 mM 트리스-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001% 젤라틴 (중량/부피), 3% DMSO, 1 μg의 프라이머 #1 및 프라이머 #2, 및 2.5 단위의 암플리탁 DNA 폴리머라아제(퍼킨 엘머사 제품)을 함유하는 100 μl PCR 반응물에 사용하였다. 퍼킨 엘머 9600 열 사이클러내에서 PCR 반응을 수행하였다. 초기의 변성(94℃ 에서 4분) 후에, 94 ℃에서 30초, 45 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분의 조건을 35회 수행하였고, 72 ℃에서 7분 방치후에 반응물을 4 ℃로 저장하였다. 이들 반응물의 일부를 1.5% 아가로즈 겔상에서 분석했다. 원하는 단편을 겔로부터 절단하고 동일한 PCR 조건을 사용하여 다시 증폭시킨 후 Qiaex II (퀴아겐사 제품)를 사용하여 정제하였다. 단편을 pCRII 벡터내에서 클로닝하고 TA-클로닝 킷트(인비트로겐)를 사용하여 박테리아내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA는 퀴아겐 플라스미드 미디 프록토콜(퀴아겐사 제품)을 사용하여 누클레오타이드 서열 분석으로부터 분리되었다. 벡터-특이적 또는 단편-특이적인 프라이머와 함께 T7 DNA 서열 킷트(파마시아사 제품)를 사용하여 ALF 자동 서열분석기(파마시아사 제품)내에서 누클레오타이드 서열을 분석하였다.
하나의 클론된 단편은, 종래의 에스트로겐 수용체와 밀접하게 연관된 신규한 에스트로겐 수용체(ER)에 상응했다. 클론된 신규한 에스트로겐 수용체 단편의 일부(서열번호 1의 누클레오타이드 466 내지 797)는 올리고누클레오타이드 #3 TGTTACGAAGTGGGAATGGTGA (서열번호 9) 및 올리고누클레오타이드 #2를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고, λgt 11 (Clontech #HL1010b) 내에서 사람 고환 cDNA 라이브러리를 검색하기 위한 프로브로 사용된다. 재조합 파아지를 135 mm 디쉬당 40.000 pfu (플라아크-형성 단위)의 밀도로 플레이트하였고(0.2% 말토오스로 보충된 LB 배지 내에서 성장한 Y1090 박테리아를 사용함), 시판자가 개시한 바에 따라서 레플리카 필터(Hybond-N, 암머샴사 제품)를 제조하였다. 0.5 M 인산염 완충액 (pH 7.5) 및 7% SDS를 함유하는 용액내에 넣어 65 ℃ 에서 30분이상 필터를 예비하이브리드화하였다. DNA 프로브를 Qiaex II (퀴아겐사 제품)로 정제하였고 데카프라임 킷트(암비온사 제품)로32P-표지화한 후 예비하이브리드화된 용액에 첨가하였다. 필터를 65 ℃에서 하룻밤동안 하이브리드화한 후에 65 ℃의 0.5 X SSC/0.1% SDS로 세척하였다. 2개의 양성 플라아크를 확인하였고, 동일한 것으로 나타났다. 한 번 더 재검색하여 이들 클론을 정제하였다. 파아지 용출물상에서 λgt11-특이적인 프라이머 #4 : 5'-TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3' (서열번호 10) 및 #5: 5'-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3' (서열번호 11)로 PCR 반응시키면 양 클론상에 1700 염기쌍의 단편을 생성했다. λgt11 프라이머 #4와 유전자-특이적인 프라이머 #6: 5'-GTACACTGATTTGTAGCTGGAC-3' (서열번호 12) 및 λgt11 프라이머 #5와 유전자-특이적인 프라이머 #7: 5'-CCATGATGATGTCCCTGACC-3' (서열번호 13)의 조합을 사용하여 차후에 PCR 반응시키면 각각 약 450 및 1000 염기쌍의 단편이 생겼고, 이것은 pCRII 벡터내에서 클론되었으며 누클레오타이드 서열 분석에 사용되었다. 이러한 PCR 반응 조건은, 프라이머 농도(각각의 프라이머 200 ng) 및 어니일링 온도(60 ℃)를 제외하고는 전술한 바와 같다. cDNA 클론내에서 ER (서열번호 1의 누클레오타이드 1247과 1248 사이)내 엑손 7/엑손 8 경계에 상응하는 부위에서 ER과의 상동성이 갑자기 손실되었기 때문에, 이 서열이 신규한 ER 유전자의 인트론 7에 해당한다고 제안되었다. 이 cDNA 클론의 누클레오타이드 서열의 검증을 위해, 교정 Pfu 폴리머라아제(Stratagene)를 사용하여 엑손 7 : 5'-TCGCATGCCTGACGTGGGAC-3'(서열번호 14) 의 3'-말단에 상응하는 유전자-특이적 프라이머 #8 과 함께 λgt11 프라이머 #4로 cDNA 클론상에서 1200 염기쌍의 단편을 생성하였다. 이 단편을 pCRII 벡터내에서 클론하고, 완전히 서열화하였는데, 전에 수득된 서열과 동일한 것으로 나타났다.
엑손 7 하부에 신규한 ER 의 누클레오타이드 서열을 얻기 위해 , 주형으로서 고환 cDNA (마라톤 레디 고환 cDNA, Clontech Cat #7414-1 )을 사용하는 유전자-특이적인 올리고누클레오타이드 #10: 5'-GGAAGCTGGCTCACTTGCTG-3' (서열번호 16)과 함께, 종래의 ER (#9: 5'-GGC(C/G)TCCAGCATCTCCAG(C/G)A(A/G)CAG-3'; 서열번호 15)의 AF-2 영역을 주성분으로 하는 축퇴성 올리고누클레오타이드를 사용하였다. 서열번호 1의 누클레오타이드 1112 내지 1332에 상응하는 특이적인 220 염기쌍의 단편을 클론 및 서열화하였다. 누클레오타이드 1112 내지 1247은 cDNA 클론의 상응하는 서열과 동일하였다. 이 하부 서열은 종래의 ER 의 상응하는 영역과 상동성이 높았다. AF-2 영역의 하부에 신규한 ER 의 서열을 얻기 위해서, 주형으로서 마라톤 레디 고환 cDNA (Clontech)을 사용하여 RACE (cDNA 말단의 급속한 증폭) PCR 반응을 수행하였다. 킷트내 제공된 AP1 프라이머와 조합하여 올리고누클레오타이드 #11 : 5'-TCTTGTTCTGGACAGGGATG-3' (서열번호 17)을 사용하여 초기 PCR 반응을 수행하였다. 킷트내 제공된 올리고 dT 프라이머와 조합하여 올리고누클레오타이드 #10 (서열번호 16)을 사용하여, 이 반응물의 일부상에서 네스트(nest)된 PCR 반응을 수행하였다. 차후에 올리고 dT 프라이머와 조합하여 올리고누클레오타이드 #12: 5'-GCATGGAACATCTGCTCAAC-3' (서열번호 18)을 사용하는 네스트된 PCR 내에서 이 반응물의 일부를 사용하였다. 수득된 특이적인 단편의 누클레오타이드 서열(서열번호 1의 누클레오타이드 1256 내지 1431에 상응함)을 분석하면, F-도메인 및 서열번호 1에 함유되지 않은 3' 비해독된 서열 부분과 해독 정지 코돈을 포함하여, 신규한 ER 리간드-결합 도메인의 카르복시말단을 암호화하는 서열을 얻었다. 추론된 아미노산 서열은 서열번호 5에 나타난다.
신규한 에스트로겐 수용체가 상부에 해독-개시 코돈을 추가로 포함했을 가능성을 조사하기 위해서, 마라톤-레디 고환 cDNA (Clontech Cat. #7414-1)을 사용하여 RACE-PCR 실험을 수행하였다. 우선 올리고누클레오타이드 서열번호 12 (서열번호 1의 누클레오타이드 416-395 에 상응하는 안티센스) 및 AP-1 (킷트내 제공됨)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그후 AP-2 (킷트내 제공됨)와 함께 서열번호 27 (서열번호 1의 누클레오타이드 254-231 에 상응하는 안티센스)을 지닌 올리고누클레오타이드를 사용하여 네스트된 PCR 실험을 수행하였다. 수득된 얼룩으로부터 300 염기쌍보다 큰 단편에 상응하는 영역을 절단하고, 진클린(Geneclean) II 킷트(Bio101)를 사용하여 정제한 후 TA-클로닝 킷트(Clontech)를 사용하여 클론했다. 유전자-특이적인 프라이머 서열번호 22 및 서열번호 28을 사용하여 PCR에 의해 군집을 검색했다. 가장 큰 삽입체를 함유하는 클론을 서열분석하였다. 누클레오타이드 서열은 서열번호 24의 누클레오타이드 1 내지 490에 상응했다. 이 서열로부터, 첫 번째 프레임내 상부 해독 개시 코돈은 서열번호 24의 77-79 위치에 존재한다는 것이 명백해진다. 프레임내 정지코돈은 이 해독 개시코돈의 상부에 존재한다(서열번호 24의 11-13). 따라서, 신규한 에스트로겐 수용체의 판독 프레임은 530 개 아미노산(서열번호 25에서 나타남)이며, 59.234 kD 의 계산 분자량을 가진다.
5' RACE에 의해 수득된 누클레오타이드 서열을 확인하기 위해서 사람 게놈성 클론을 수득하여 분석했다. 서열번호 1의 누클레오타이드 1 내지 416 에 상응하는 프로브로 λEMBL3 (Clontech HL 1067J)내 사람 게놈성 라이브러리를 검색하였다. 강한 하이브리드화 클론은 플라크-정제되었고, DNA는 표준 프록토콜(샘브룩 외 다수, 1989)을 사용하여 분리하였다. DNA를 여러 제한 효소로 분해하고 아가로즈 겔상에서 전기영동한 후 나일론 필터상에서 블롯팅하였다. 전술한 RACE단편(서열번호 24의 누클레오타이드 1-490)에 상응하는 프로브로 블롯을 하이브리드화하여, 대략 800 염기쌍의 하이브리드화 Sau3A 단편을 밝혀냈다. 이 단편을 pGEM3Z 의 BamH1 부위로 클론한 후 서열분석하였다. 누클레오타이드 서열은, RACE 단편내 PCR-유도된 포인트 돌연변이인 다른 염기를 하나 함유했다. 누클레오타이드 172는 5' RACE 단편내의 G 잔기였으나, 여러 독립적인 게놈성 서브클론내 A 잔기였다.
실시예 B. 신규한 에스트로겐 수용체의 2개의 스플라이스 변형물의 확인
서열번호 1의 누클레오타이드 918 내지 1246 에 상응하는 프로브로 고환 cDNA 라이브러리를 재검색하면 2개의 하이브리드화 클론을 생성하는데, 그 3' 말단을 PCR(프라이머 #4, 서열번호 10 와 함께 유전자-특이적인 프라이머 #10: 5'-GGAAGCTGGCTCACTTGCTG-3' (서열번호 16))에 의해 증폭한 후 클론하고 서열분석했다. 하나의 클론이 신규한 ER의 대안적인 엑손 8(엑손 8B)을 함유하는 것으로 나타났다. 서열번호 2에서 이 스플라이스 변형물의 정지코돈 및 부분을 암호화하는 단백질이 제시되었다. 대안적인 스플라이스 반응을 통해 이 엑손을 도입한 결과로서, 신규한 ER을 암호화하는 판독 프레임이 즉시 종결되었고, 그로 인해 신규한 ER (서열번호 6)의 카르복시말단의 절단부를 생성한다.
서열번호 1의 누클레오타이드 918 내지 1246에 상응하는 프로브로 사람 흉선 cDNA 라이브러리(Clontech HL1074a)를 검색하여, 다른 스플라이스 변형물을 밝혀냈다. λgt10-특이적인 프라이머 #13 5'-AGCAAGTTCAGCCTGTTAAGT-3' (서열번호 19)와 함께 프라이머 #10 (서열번호 16)을 사용하여 하나의 하이브리드화 클론의 3' 말단을 증폭하고 클론한 후 서열분석했다. 엑손 7/엑손 8 경계의 상부에 있는 수득된 누클레오타이드 서열이 전에 확인한 클론과 동일했다. 그러나, 대안적인 엑손 8 (엑손 8C)이 2개의 C-말단 아미노산 및 정지코돈을 암호화하는 3' 말단에 존재했다. 이 스플라이스 변형물의 단백질-암호화 부분의 누클레오타이드 서열은 서열번호 20에 나타나며, 상응하는 단백질 서열은 서열번호 21이다.
신규한 에스트로겐 수용체의 이들 2개의 변형물은 AF-2 영역을 함유하지 않으며, 따라서 리간드-의존성 방식으로 표적 유전자의 전사를 조정하는 능력이 부족하다. 그러나 변형물은, 헤테로이량체화에 의해, 또는 에스트로겐 반응성 요소를 차지하거나 다른 전사 요인과의 상호작용에 의해 야생 유형의 종래의 ER 및/또는 야생 유형의 신규한 ER의 기능을 상당히 저해할 수 있다. 전술한 신규한 에스트로겐 수용체의 2개의 변형물과 매우 유사한 종래의 ER의 돌연변이(ER1-530)가 개시되어 있다. ER1-530은 우성(dominant)-음성 수용체로서 행동하는 것으로 나타났는데, 즉 야생 유형 ER 의 세포내 활성을 조절할 수 있다(인스 외 다수, J. Biol. Chem. 268, 14026-14032, 1993).
실시예 C. 노던 블롯 분석법
클론택에서 시판하는 사람 다중 조직 노던 블롯(MTN-blots)을 구매하여 7% SDS 와 함께 0.5 M 인산염 완충액(pH 7.5)내에서 65 ℃ 로 1시간 이상 예비하이브리드화 하였다. 프로브(서열번호 1에서 누클레오타이드 466 내지 797에 상응함)로 사용한 DNA 단편을 표지화 킷트(암비온사 제품)를 사용하여32P-표지화하고, 끓여서 변성시킨 후 예비하이브리드화 용액에 첨가했다. 세척 조건은 하기와 같았다: 실온의 3X SSC, 65 ℃에서의 3X SSC 및 최종적으로 65 ℃에서의 1X SSC. 필터를 X-레이 필름에 1주일 동안 노출시켰다. 약 8 kb 및 10 kb 인 2개의 전사체를 흉선, 비장, 난소 및 고환에서 검출했다. 또한 1.3 kb의 전사체를 고환에서 검출했다.
실시예 D. 세포주내 ERα 및 ERβ의 발현의 RT-PCR 분석
RNAzol B (신나/바이오텍스)를 사용하여 다수의 사람 및 동물 세포주에서 RNA를 분리했다. 제조자의 지시에 따라 슈퍼스크립트 II 킷트(BRL)를 사용하고 2.5 μg의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조했다. ER을 암호화하는 mRNA 또는 신규한 에스트로겐 수용체에 상응하는 단편의 특이적인 PCR 증폭을 위해 cDNA의 일부를 사용했다. (사용된 프라이머는 사람 및 랫트 서열을 기초로 하였으며, 반면에 세포주의 일부는 랫트도 사람도 아니었다는 것을 강조해야 한다. 도 4의 설명 참고). ERα을 위해 사용된 프라이머는, LBD 의 부분에 상응하는 548 염기쌍의 단편을 만드는 센스 5'-GATGGGCTTACTGACCAACC-3' 및 안티센스 5'-AGATGCTCCATGCCTTTG-3'이다. ERβ을 위해 사용된 프라이머는, LBD 의 부분에 상응하는 565 염기쌍의 단편을 만드는 센스 5'-TTCACCGAGGCCTCCATGATG-3' 및 안티센스 5'-CAGATGTTCCATGCCCTTGTT-3'이다. 나일론 막상에 블롯된 아가로즈 상에서 PCR 시료를 분석했다. 표준 실험 공정(샘브룩 외 다수, 1989)을 사용하여 ERα 및 ERβ 플라스미드 DNA 상에서 전술한 프라이머로 생성된32P-표지화된 PCR 단편으로 이들 블롯을 하이브리드화하였다.
실시예 E. 신규한 에스트로겐 수용체 단백질에 의한 리간드-의존성 전사 활성화
세포 배양물
ATCC (CCL61)로부터 차이니즈 햄스터 난소 (CHO K1) 세포를 수득하고, 페놀레드-부재 M505 배지내 단층 배양물로서 습기있는 분위기(5% CO2)에서 37 ℃ 로 유지하였다. 후자의 배지는, 2.5 mg/ml 탄산나트륨(베이커사 제품), 55 μg/ml 피루브산나트륨(플루카사 제품), 2.3 μg/ml β-머캅토에탄올(베이커사 제품), 1.2 μg/ml 에탄올아민(베이커사 제품), 360 μg/ml의 L-글루타민(머크사 제품), 0.45 μg/ml의 나트륨 셀레나이트(플루카사 제품), 62.5 μg/ml의 페니실린(마이코팜사 제품), 62.5 μg/ml의 스트렙토마이신(서바사 제품), 및 5% 활성탄-처리된 소 태아 혈청(하이클론사 제품)으로 보충된 둘베코의 개질된 이이글(Eagle) 배지(DMEM, 기브코 074-200) 및 뉴트리언트 배지 F12 (Ham's F12, 기브코 074-1700)의 혼합물(1:1)로 이루어져 있다.
재조합 벡터
5'-GATGGATCCTCACCTCAGGGCCAGGCGTCACTG-3' (서열번호 23, 밑줄친 부분은 해독 정지 코돈, 안티센스임)과 조합된 올리고누클레오타이드 5'-CTTGGATCCATAGCCCTGCTGTGATGAATTACAG-3' (서열번호 22, 밑줄친 부분은 해독 개시 코돈임)을 사용하여 PCR 에 의해 서열번호 1내에 제시된 바와 같은 ERβ-암호화 서열을 증폭하였다. 생성된 BamH1 단편(대략 1450 염기쌍임)을 포유류 세포 발현 벡터 pNGV1 (유전자은행 기입 번호 X99274호)내에서 클론하였다.
BamH1-Mscl 단편(서열번호 1의 누클레오타이드 1-81) 대신에 서열번호 24의 누클레오타이드 77-316 에 상응하는 BamH1-Mscl 단편을 사용하여 서열번호 24에 나타난 바와 같은 ERβ 판독 프레임을 암호화하는 발현 구조물을 제조했다. 서열번호 24의 누클레오타이드 77-316 에 상응하는 BamH1-Mscl 단편은, 전술한 5' RACE 단편을 사용하여 서열번호 28과 조합한 서열번호 26으로 PCR 에 의해 제조했다.
리포터 벡터는, 파이어플라이 루시퍼라아제 암호 서열에 연결된 랫트 옥시토신 유전자 조절 영역(HindIII/MboI 단편으로서 위치 -363/+16; 알.이벨 및 디. 리치터의 문헌, Proc.Natl.Acad.Sci. 미국 81, 2006-2010, 1984)을 기초로 하고 있으며, 랫트(알. 아단 외 다수의 문헌, Biochem.Biophys.Res.Comm. 175, 117-122, 1991) 및 사람(에스.리차드 및 에이치. 진그의 문헌, J. Biol.Chem. 265, 6098-6103, 1990)에 대해 시험관내에서 옥시토신 유전자의 조절 영역은 기능적인 에스트로겐 호르몬 반응 요소를 함유하고 있는 것으로 나타났다.
일시적 형질감염
6-웰 넌클론(Nunclon) 조직 배양액 판내에서 1 x 105CHO 세포를 시드화하고, 리포펙틴(기브코 BRL사 제품)을 사용하여 DNA를 도입하였다. DNA (250 μL 옵티멤내의 1 μg의 수용체 및 1 μg의 리포터 벡터, 기브코 BRL사 제품)를 같은 부피의 리포펙틴 시약(250 μL 옵티멤내의 7 μL, 기브코사 제품)과 혼합하고 실온에서 15분동안 방치하였다. 혈청-부재 배지(M505)로 세포를 2회 세척한 후에, 새로운 배지(500 μL 옵티멤, 기브코사 제품)를 세포에 첨가한 후에 DNA-리포펙틴 혼합물을 적가하였다. 37 ℃ 에서 5 시간 동안 세포를 항온배양한 후에 페놀레드-부재 M505 + 5% 활성탄-처리된 소 태아 혈청으로 2회 세포를 세척하고, 37 ℃ 에서 하룻밤동안 항온배양하였다. 24 시간후에 호르몬을 배지(10-1mol/L)에 첨가하였다. 200 μL 융해완충액(0.1 M 인산염 완충액, pH 7.8, 0.2% 트리톤 X-100)을 첨가함으로써 48 시간동안 후-형질감염시켜 세포 추출물을 만들었다. 37 ℃ 에서 5 분동안 세포를 항온배양한 후에 세포 현탁액을 원심분리하고(에펜도르프 원심분리, 5분), 20 μL 시료를 50 μL 루시퍼라아제 분석 시약(프로메가사 제품)에 첨가하였다. 562 nm의 루미노미터(버트홀드 바이올루맛)내에서 10 초동안의 광 방출을 측정하였다.
신규한 에스트로겐 수용체의 안정한 형질감염
전체 길이 ERβ1-530 (상기 참고)을 암호화하는 발현 플라스미드는 전술한 바와 같이 CHO K1 세포내에서 안정하게 형질감염되었다(츄니센 외 다수의 문헌, J.Biol.Chem. 268, 9035-9040, 1993). 이렇게 수득된 단일 세포 클론을 전술한 바와 같이 리포터 플라스미드(랫트 옥시토신-루시퍼라아제)의 일시적인 형질감염으로 검색하였다. 선택을 위해 하이그로마이신 내성 유전자를 함유하는 플라스미드 pDR2A 와 함께 랫트 옥시토신-루시퍼라아제 리포터 플라스미드의 두 번째 안정한 형질감염을 위해, 선택된 클론을 사용하였다. 수득된 단일 세포 클론을 17β-에스트라디올에 대한 반응에 대해 테스트하였다. 그후에 선택된 단일 세포 클론을 트랜스활성화 연구에 사용하였다. 즉, 웰당 1.6 X 104세포 수치로 세포를 96-웰 내에 시드화하였다. 24시간 후에, 배지내에서 호르몬을 상이한 농도로 희석한 후 웰에 첨가하였다. 길항제 실험을 위한 농도는 2 X 10-10M 이었다. 17β-에스트라디올을 각각의 웰에 첨가하였고, 서로 다른 농도의 길항제를 첨가하였다. 24시간 동안 항온배양한 후에 세포를 PBS로 1회 세척한 후 40 μL 융해 완충액(상기 참고)을 첨가하여 융해시켰다. 각각의 웰에 루시퍼라아제 시약(50 μL)을 첨가하고, 탑카운트(팩카드사 제품)를 사용하여 광 방출을 측정하였다.
결과
CHO 세포내 일시적 형질감염된 상태의 2개의 발현 구조물(서열번호 1 및 서열번호 24)을 비교하면, 다수의 항진제 및 길항제에 대한 반응에서 동일한 트랜스활성화를 나타냈다. ERβ 발현 벡터 및 리포터 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 CHO 세포는, 처리되지 않은 세포에 비하여 17β-에스트라디올에 대해 반응하는 루시퍼라아제 활성에서 3 내지 4 배 증가를 나타냈다(도 2 참고). 에스트리올 및 에스트론으로 처리한 경우에 유사한 트랜스활성이 수득되었다. 이 결과는 신규한 ER (ERβ)이 에스트로겐 호르몬에 결합할 수 있다는 것 뿐아니라 리간드-활성화된 수용체가 랫트 옥시토신 프로모터내에서 에스트로겐-반응 요소(ERE)에 결합하고 루시퍼라아제-리포터 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 도 3은 독립적인 유사한 실험에서 10-9mol/L 17β-에스트라디올을 사용하면 ERα가 18배 자극되고 ERβ는 7배 자극되었다는 것을 나타내준다. 또한 17β-에스트라디올로 활성화되었을 때에 안티에스트로겐 ICI-164384는 ERα및 ERβ에 대한 길항제인 것으로 나타난 반면에, 길항제 단독으로는 효과가 없었다. 이 실험에서 0.25 μg β-갈락토시다아제 벡터는 공-형질감염되어 형질감염 효율의 차이를 정상화하였다.
안정하게 감염된 ERα및 ERβ 세포주에서 수행된 트랜스활성화 연구는 유사한 루시퍼라아제 절대 수치를 나타냈다. 17β-에스트라디올에 대한 곡선은 매우 비슷했으나, ERβ 에 비해 ERα는 더 낮은 농도의 호르몬으로 절반-최대 트랜스활성화가 달성되었다는 것을 나타낸다(도 5 참고). Org 4094에 대해서는 영향이 더 큰 것으로 관찰되었다. 랄옥시펜의 곡선은, 이 길항제가 ERβ 트랜스활성화를 차단하는 효능에 비해 ERα 의 트랜스활성화를 차단하는 효능이 더 큰 것을 보여준다.
[서열표]
(1) 일반정보
(i) 출원인
(A) 명칭 : 아크조 노벨 엔.브이.
(B) 거리: 벨페르베그 76
(C) 도시 : 아르넴
(E) 국가 : 네덜란드 공화국
(F) 우편번호(ZIP): 6824 BM
(G) 전화 : 0412-666379
(H) 팩스 : 0412-650592
(I) 텔렉스 : 37503 akpha nl
(ii) 발명의 명칭 : 신규한 에스트로겐 수용체
(iii) 서열 수 : 28
(iv) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 1의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 1434 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 1 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 2의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 1251 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 2 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 3의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 66 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 3 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 4의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 233 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 4 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 5의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 477 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 비공지
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 5 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 6의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 416 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 비공지
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 6 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 7의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 비공지
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 7 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 8의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 8 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 9의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 9 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 10의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 10 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 11의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 11 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 12의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 12 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 13의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 13 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 14의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 14 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 15의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 15 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 16의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 16 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 17의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 17 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 18의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 18 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 19의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 19 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 20의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 1257 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 20 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 21의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 418 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 21 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 22의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 22 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 23의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 23 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 24의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 1898 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 24 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 25 의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 530 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 25 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 26 의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : 다른 핵산
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 26 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 27 의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : 다른 핵산
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 27 의 서열
(2) 서열번호(SEQ ID NO) 28 의 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 유형 : 다른 핵산
(xi) 서열번호(SEQ ID NO) 28 의 서열
Claims (14)
- N-말단 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 단백질을 암호화하는 분리된 DNA 에 있어서,상기 단백질의 DNA-결합 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상 상동성을 나타내고, 상기 단백질의 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 4의 아미노산 서열과 70% 이상 상동성을 나타내는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질의 DNA-결합 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95%, 더 바람직하게는 98%, 가장 바람직하게는 100% 상동성을 나타내는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단백질의 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 4의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100% 상동성을 나타내는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
- 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 단백질을 암호화하는 DNA가 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 21 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
- 제 1항 내지 제 4항에 있어서, DNA가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 20 또는 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 따른 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 따른 DNA 또는 제 6항의 발현 벡터로 형질감염된 세포.
- 제 7항에 있어서, 제 9항 내지 제 11항중 어느 한 항에 따른 스테로이드 수용체 단백질을 발현하는 안정하게 형질감염된 세포주인 세포.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 따른 DNA 또는 제 6항의 발현 벡터로 암호화된 단백질.
- 제 9항에 있어서, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 21 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
- N-말단 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 키메릭 단백질에 있어서,상기 키메릭 단백질의 DNA-결합 도메인 및 리간드-결합 도메인이 서로 다른 단백질로부터 기원하는 경우 키메릭 단백질의 도메인중 하나 이상이 제 9항 또는 제 10항의 단백질로부터 기원하고, 키메릭 단백질의 다른 도메인중 하나 이상이 핵 수용체 슈퍼패밀리로부터의 다른 수용체 단백질로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 키메릭 단백질.
- 제 11항의 단백질을 암호화하는 DNA.
- 제 1항 내지 제 5항 또는 제 12항중 어느 한 항의 DNA, 제 6항의 발현 벡터, 제 7항 또는 제 8항의 세포, 제 9항 내지 제 11항중 어느 한 항의 단백질을 새로운 약물의 확인을 위한 검색 분석법에 사용하는 방법.
- 제 9항 내지 제 11항중 어느 한 항의 단백질을 위한 기능적 리간드를 확인하는 방법으로서,a) 1) 제 1항 내지 제 5항 또는 제 12항의 DNA 와 2) 작동성 호르몬 반응 요소에 기능적으로 연결된 적합한 리포터 유전자를 적합한 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 호르몬 반응 요소(HRE)는 상기 DNA에 의해 암호화된 단백질의 DNA-결합 도메인에 의해 활성화될 수 있고,b) 상기 a)단계의 DNA에 의해 암호화된 단백질의 리간드-결합 도메인에 연결될 수 있는 잠재적인 리간드와 상기 a)단계의 숙주 세포를 접촉시키는 단계, 및C) 상기 a)의 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현을 모니터하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96200820 | 1996-03-26 | ||
| EP96200820,7 | 1996-03-26 | ||
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