HU221411B1 - Novel estrogen receptor - Google Patents

Novel estrogen receptor Download PDF

Info

Publication number
HU221411B1
HU221411B1 HU9700636A HUP9700636A HU221411B1 HU 221411 B1 HU221411 B1 HU 221411B1 HU 9700636 A HU9700636 A HU 9700636A HU P9700636 A HUP9700636 A HU P9700636A HU 221411 B1 HU221411 B1 HU 221411B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
ser
seq
dna
arg
Prior art date
Application number
HU9700636A
Other languages
English (en)
Inventor
Rein Dijkema
Sietse Mosselman
Original Assignee
Akzo Nobel Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26142641&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU221411(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Akzo Nobel Nv filed Critical Akzo Nobel Nv
Publication of HU9700636D0 publication Critical patent/HU9700636D0/hu
Publication of HUP9700636A2 publication Critical patent/HUP9700636A2/hu
Publication of HUP9700636A3 publication Critical patent/HUP9700636A3/hu
Publication of HU221411B1 publication Critical patent/HU221411B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
  • Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát a sejtmagi hormonreceptorok főcsaládjába tartozóreceptorok, közelebbről, a szteroidreceptorok közé tartozó receptorokképezik. A találmány tárgyát képezik az új ösztrogénreceptorokatkódoló DNS-ek, a DNS-- eket tartalmazó expressziós vektorok, a DNS-ekkel transzfektált sejtek, a DNS-ek által kódolt proteinek, a recep-torproteinek ligandumainak azonosítására szolgáló eljárások. Atalálmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti DNS-ek,expressziós vektorok, sejtek és proteinek alkalmazása új gyógyhatásúanyagok azonosítására szolgáló szűrővizsgálati eljárásokban. ŕ

Description

A találmány tárgyát a sejtmagi hormonreceptorok főcsaládjába tartozó receptorok, közelebbről, a szteroidreceptorok közé tartozó receptorok képezik. A találmány tárgyát képezik az új ösztrogénreceptorokat kódoló DNS-ek, a DNS-eket tartalmazó expressziós vektorok, a DNS-ekkel transzfektált sejtek, a DNS-ek által kódolt proteinek, a receptorproteinek előállítására szolgáló eljárások, valamint az említett proteinek ligandumainak azonosítására szolgáló eljárások.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti DNS-ek, expressziós vektorok, sejtek és proteinek alkalmazása új gyógyhatású anyagok azonosítására szolgáló szűrővizsgálati eljárásokban.
A szteroidhormon-receptorok a génexpresszió ligandumfiiggő transzkripciós szabályozásában szerepet játszó, sejtmagi hormonreceptorok főcsaládjába tartoznak. Ez a receptor főcsalád nem szteroidhormonok számára szolgáló receptorokat is tartalmaz, például Dvitamin, pajzsmirigyhormonok és retinoidok számára szolgáló receptorokat [Giguere és munkatársai: Natúré 330, 624 (1987); Evans R. M. és munkatársai: Science 240, 889 (1988)]. Számos olyan sejtmagi receptorszerű szekvenciát azonosítottak továbbá, amelyek úgynevezett árva („orphan”) receptorokat kódolnak: ezek a receptorok strukturális rokonságban állnak a sejtmagi receptorokkal, ezért a sejtmagi receptorok közé sorolják őket, bár eddig, hozzájuk feltételezhetően kapcsolódó ligandumokat nem sikerült azonosítani [O’Malley B. W.: Endocrinology 125, 1119 (1989); Mangelsdorf D. J. és Evans R. M.: Cell 83, 841 (1985)].
A sejtmagi hormonreceptorok főcsaládja elemekből felépülő struktúrával rendelkezik, amelyben hat különböző struktúrával és funkcióval rendelkező, A-F jelölésű dómén kapcsolódik [Evans: Science 240, 889 (1988)]. A sejtmagi hormonreceptorokat variábilis Nterminális régió jellemzi (A/B-domén), amelyet egy centrálisán elhelyezkedő, nagymértékben konzervált DNS-kötő dómén (a továbbiakban DBD; C-domén), egy variábilis összekötő dómén (D-domén), egy konzervált ligandumkötő dómén (a továbbiakban LBD; Edomén) és egy variábilis C-terminális régió (F-domén) követ.
Az N-terminális régió, amely méretét és szekvenciáját tekintve nagymértékben variábilis, a főcsalád különböző tagjai közt igen kismértékű állandóságot mutat. A receptor eme része a transzkripció aktiválásában játszik szerepet [Bocquel és munkatársai: Nucl. Acid Rés. 17, 2581 (1989); Tora és munkatársai: Cell 59, 477 (1989)].
A DBD-régió körülbelül 66-70 aminosavból áll, és a DNS-kötő aktivitásért felelős: a receptornak a kromatinban, a specifikus célzott gén transzkripciós szabályozóegységében található specifikus DNS-szekvenciákhoz, úgynevezett hormonválaszt közvetítő elemekhez („hormoné responsive elements”; a továbbiakban HRE) történő kötődését irányítja [Martinez és Wahli: „Nuclear Hormoné Receptors”, „Acad. Press” 125. old. (1991)].
Az LBD-domén a receptor C-terminális részén található, és ez felelős elsősorban a ligandumkötő aktivitásért. Az LBD-domén tehát nélkülözhetetlen a hormon által történő ligandumfelismerés és a ligandum megkötése szempontjából, továbbá transzkripciót aktiváló funkcióval is rendelkezik, ezáltal meghatározza a receptor hormonra adott válaszának specifitását és szelektivitását. Bár az egyes LBD-doménok struktúrája mérsékelten állandó, azok homológiájukat tekintve a sejtmagi hormonreceptorok főcsaládjának tagjai között jelentős variabilitást mutatnak [Evans: Science 240, 889 (1988); Fuller P. J.: FASEB J. 5, 3092 (1991); Mangelsdorf és munkatársai: Cell #3, 835(1995)].
Az N-terminális régióra lokalizálható funkciók és az LBD-, valamint DBD-doménok egymástól függetlenül fejtik ki működésüket, és kimutatták, hogy ezek a doménok sejtmagi receptorok között felcserélhetőek [Green és munkatársai: Natúré 325, 75 (1987)]. Ily módon, kiméra sejtmagi receptorokat kapunk, ilyen például a WO-A-8905355 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett receptor.
Amikor egy sejtmagi receptorhoz kapcsolódni képes hormontermészetü ligandum diffúzióval bejut a sejtbe, és azt az LBD-domén felismeri, ott a hormonligandum a specifikus receptorproteinhez kötődik, ezáltal a receptorprotein alloszterikus változását idézi elő. A fenti változás eredményeképp, a ligandum/receptor komplex transzkripciót aktiválni képes állapotba kerül, és a DBD-doménon keresztül nagy affinitással képes a kromatin-DNS-ben található, megfelelő HRE-elemekhez kötődni [Martinez és Wahli: „Nuclear Hormoné Receptors”, „Acad. Press” 125. old. (1991)]. Ezáltal a ligandum/receptor komplex specifikus, célzott gének expresszióját szabályozza. A fenti receptorcsalád sokfélesége a receptorok különböző ligandumokkal szemben mutatott eltérő kötődési képességéből adódik.
A szteroidhormon-receptorok a sejtmagi receptorok főcsaládján belül külön osztályt képeznek, amennyiben ligandumaik szteroidhormonok. Klasszikus szteroidreceptorok a glükokortikoid (GR) receptorok, mineralokortikoid (MR) receptorok, progeszteron (PR) receptorok, androgén (AR) receptorok és ösztrogén (ER) receptorok. A szteroidhormonok azzal a különleges képességgel rendelkeznek továbbá, hogy aktiválódva homodimerekként képesek palindróma DNS-szekvenciákhoz - az úgynevezett HRE-elemekhez kötődni. A GR, MR, PR és AR ugyanazt a DNS-szekvenciát ismerik fel, míg az ER az előzőtől eltérő DNS-szekvencia felismerésére képes [Beato és munkatársai: Cell 83, 851 (1995)]. A DNS-hez történő kötődést követően, a szteroidreceptor feltételezhetően az alapvető transzkripciós gépezet összetevőivel és szekvenciaspecifikus transzkripciós faktorokkal lép kölcsönhatásba, és ezáltal specifikus célzott gének expresszióját szabályozza.
Több, a hormon/receptor komplexekre érzékeny HRE-elemet azonosítottak. Ezek a HRE-elemek a különböző célzott gének transzkripciós szabályozóegységeiben helyezkednek el, például emlős növekedési hormon gének (amelyek glükokortikoidokra, ösztrogénre, tesztoszteronra érzékenyek), emlős prolaktin gének és progeszteronreceptor gének (amelyek ösztrogénre érzékenyek), madár ovalbumin gének (amelyek progeszte2
HU 221 411 BI ronra érzékenyek), emlős metallothionein gén (amely glükokortikoidokra érzékeny), valamint emlős hepatikus a2p-globulin gén (amely ösztorgénre, tesztoszteronra és glükokortikoidokra érzékeny) transzkripciós szabályozóegységeiben helyezkednek el.
A szteroidhormon-receptorokról tudjuk, hogy szerepet játszanak az embrionális fejlődésben, a felnőttkori homeosztázisban, valamint egyes szervek fiziológiájában. A szteroidhormon-reakcióutak zavara különböző betegségeket és rendellenességeket eredményez. Mivel a szteroidreceptorok működésüket hormon által aktivált transzkripciós szabályozóanyagokként fejtik ki, várható, hogy a fenti receptorok mutációja és rendellenessége, valamint azok túlzott stimulációja vagy blokkolása lehet a megváltozott minta alapvető oka. A fenti receptorok, azok mechanizmusa és hatása, valamint az említett receptorokhoz kötődő ligandumok alaposabb ismerete segítségünkre lehet, hogy jobban megértsük a hormon általi jelközvetítés módjának alapvető mechanizmusát, végül segítséget nyújthat a megváltozott hormon/receptor működéssel kapcsolatos betegségek és rendellenességek megfelelőbb kezeléséhez.
Ebből a célból több emlősből, ezen belül emberből, szteroidreceptorokat és több más sejtmagi receptort kódoló cDNS-t izoláltak, és a megfelelő aminosavszekvenciákat következtetéssel meghatározták; például a következő humán szteroidreceptorokat kódoló cDNS-eket izolálták: PR, ER, GR, MR és AR, és a következő humán nem szteroidreceptorokat kódoló cDNS-eket izolálták: D-vitamin-receptort, pajzsmirigyhormonok receptorait, valamint retinoidok, például a retinol-A és a retinolsav receptorát. Ezen felül több mint 100, emlőseredetű „árva” receptort kódoló cDNS-t izoláltak, amelyek feltételezett ligandumai még nem ismertek [Mangelsdorf és munkatársai: Cell 83, 835 (1995)]. Nagy szükség van azonban további sejtmagi receptorokra vonatkozó alaposabb ismeretek megszerzésére, a fenti receptorok normális fiziológiában és kóros állapotokban betöltött szerepének tisztázása céljából.
A találmány tárgyát képezik ilyen új, sejtmagi receptorok. Közelebbről, a találmány tárgyához tartoznak új, ösztrogén közvetítette aktivitással rendelkező szteroidreceptorok. Az említett új szteroidreceptorok új ösztrogénreceptorok, amelyek például ösztradiol, ösztron és ösztriol által képesek aktivált állapotba kerülni, és képesek azokhoz kötődni.
Azt találtuk, hogy az új ösztrogénreceptor humán csecsemőmirigyben, lépben, perifériásvér-eredetű leukocitákban (PBL-ekben), petefészekben és herében, 8 kb nagyságú transzkriptumként expresszálódik. További transzkriptumokat is azonosítottunk. Petefészekben, csecsemőmirigyben és lépben egy további, körülbelül 10 kb nagyságú transzkriptumot azonosítottunk. Herében egy másik, 1,3 kb nagyságú transzkriptumot mutattunk ki. Ezek a transzkriptumok feltehetően a találmány szerinti ösztrogénreceptort kódoló gén normálistól eltérő hasítása és összeillesztése („splicing”) következtében jönnek létre.
A találmány szerinti új ösztrogénreceptort kódoló cDNS klónozása szerint az említett receptornak több összeillesztési variánsa különböztethető meg. A keletkező proteinek szintjén ezek a variánsok csak a C-terminális részen térnek el egymástól.
Egy ER-t kódoló cDNS-t a korábbiakban izoláltak [Green és munkatársai: Natúré 320, 134 (1986); Greene és munkatársai: Science 231, 1150 (1986)], és a megfelelő aminosavszekvenciát következtetéssel meghatározták. Ez a receptor és a találmány szerinti receptor azonban egymástól eltérő receptorok, és azokat eltérő nukleotid-szekvenciákkal rendelkező, egymástól különböző gének kódolják. A technika állása szerint korábbiakban ismert ER (a továbbiakban klasszikus ER) és a találmány szerinti ER nemcsak aminosavszekvenciájukat tekintve különböznek egymástól, hanem génjeik is különböző kromoszómákon találhatók. A klasszikus ER-t kódoló gén a 6. kromoszómán helyezkedik el, a találmány szerinti ER-t kódoló génről pedig kimutattuk, hogy az a 14. kromoszómán található. Továbbá a találmány szerinti ER-t szöveti megoszlása is megkülönbözteti a klasszikus receptortól, ami arra utal, hogy a két receptor között lényeges eltérés lehet az ösztrogén által kiváltott jelközvetítés szintjén.
Ezen felül leírták az ERRa és ERRP-jelű árva receptorokat, amelyek ösztrogénreceptorszerű struktúrával rendelkeznek [Giguere és munkatársai: Natúré 331, 91 (1988)]. Ezekről az árva receptorokról azonban nem közölték, hogy azok képesek lennének ösztradiol vagy bármely más, a klasszikus ER-hez kötődő hormon megkötésére, és eddig nem találtak olyan ligandumot, amelyek kötődnének a fenti receptorokhoz. A találmány szerinti, új ösztrogénreceptort az is egyértelműen megkülönbözteti ezektől a receptoroktól, hogy az előbbi képes ösztrogének megkötésére.
Az a tény, hogy egy új ösztrogénreceptort találtunk, annál is meglepőbb, mivel a szakirodalomban egyéb ösztrogénreceptorok létére történő utalás nem található: sem a klasszikus ER, sem az ERRa és ERRP-jelű árva receptorok izolálása nem utalt vagy figyelmeztetett további ösztrogénreceptorok, például a találmány szerinti receptorok létére. További ER-ek izolálása jelentős előrelépés lehet a már létező klinikai terápiás eljárások szempontjából, amelyek egyetlen ER jelenlétének feltételezésén alapulnak, és valamennyi ösztrogén közvetítette rendellenességet és/vagy betegséget erre a receptorra vezetnek vissza. A találmány szerinti receptorok alkalmazhatók olyan hormon analógok kifejlesztésére, amelyek szelektív módon képesek aktiválni a klasszikus ER-t vagy a találmány szerinti, új ösztrogénreceptort. Ez tekinthető a találmány egyik legfőbb előnyének.
A találmány tárgyát képezik egyrészt új szteroidreceptorokat kódoló izolált cDNS-ek. Közelebbről, a találmány tárgyát képezik új ösztrogénreceptorokat kódoló izolált cDNS-ek.
A találmány fenti vonatkozása szerint a találmány tágyát képezik szteroidreceptorokat kódoló izolált DNS-ek, amelyek N-terminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmaznak, és az említett receptorproteinek DNS-kötő doménjának aminosavszekvenciája legalább 80%-os homológiát mutat
HU 221 411 Bl a 3. azonosító számú aminosavszekvenciával, és az említett receptorproteinek ligandumkötő doménja legalább 70%-os homológiát mutat a 4. azonosító számú aminosavszekvenciával.
Közelebbről, az izolált DNS-ek N-terminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmazó szteroidreceptor-proteineket kódolnak, és az említett receptorproteinek DNS-kötő doménjának aminosavszekvenciája legalább 90%-os, előnyösen 95%-os, még előnyösebben 98%-os, és legelőnyösebben 100%-os homológíát mutat a 3. azonosító számú aminosavszekvenciával.
Még közelebbről, az izolált DNS-ek N-terminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmazó szteroidreceptor-proteineket kódolnak, és az említett receptorproteinek ligandumkötő doménjának aminosavszekvenciája legalább 75%-os, előnyösen 80%-os, még előnyösebben 90%-os, és legelőnyösebben 100%-os homológiát mutat a 4. azonosító számú aminosavszekvenciával.
A találmány szerinti előnyös izolált DNS-ek például az 5., 6., 21. vagy 25. azonosító számú szekvenciák szerinti aminosavszekvenciával rendelkező szteroidreceptor-proteineket kódoló DNS-ek.
A találmány szerinti, még előnyösebb izolált DNSek az 1., 2., 20. és 24. azonosító számú szekvenciák szerinti nukleotid-szekvenciákat tartalmazó izolált DNS-ek.
A találmány szerinti DNS-t előállíthatjuk cDNS alapján. Más eljárás szerint a kódolószekvencia lehet genomi eredetű DNS, vagy azt előállíthatjuk DNS-szintetizáló technikák alkalmazásával.
A találmány szerinti DNS előnyösen alkalmazható a találmány szerinti, új receptorproteinek in vivő, megfelelő mennyiségben, és lényegében tiszta formában történő expresszálására.
Másrészt a találmány tárgyát képezik a fent említett DNS-molekulák által kódolt aminosavszekvenciákat tartalmazó szteroidreceptorok.
A találmány szerinti szteroidreceptorok N-terminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmaznak, és az említett receptorok DNS-kötő doménjának aminosavszekvenciája legalább 80%-os homológiát mutat a 3. azonosító számú aminosavszekvenciával, az említett receptorok ligandumkötő doménjának aminosavszekvenciája pedig legalább 70%-os homológiát mutat a 4. azonosító számú aminosavszekvenciával.
Közelebbről, a találmány szerinti szteroidreceptorok N-terminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmaznak, és az említett receptorok DNS-kötő doménjának aminosavszekvenciája legalább 90%-os, előnyösen 95%-os, még előnyösebben 98%-os, és legelőnyösebben 100%-os homológiát mutat a 3. azonosító számú szekvencia szerinti aminosavszekvenciával.
Még közelebbről, a találmány szerinti szteroidreceptorok N-terminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmaznak, és az említett receptorok ligandumkötő doménjának aminosavszekvenciája legalább 75%-os, előnyösen 80%-os, még előnyösebben 90%-os, és legelőnyösebben 100%-os homológiát mutat a 4. azonosító számú aminosavszekvenciával.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány tárgyát képezik előnyös DBD- és LBD-doménok kombinációit tartalmazó szteroidreceptor-proteinek, valamint az ilyen receptorokat kódoló DNS-ek is.
Előnyösen, a találmány szerinti szteroidreceptorok az 5., 6., 21. vagy 25. azonosító számú szekvenciák szerinti aminosavszekvenciákat tartalmazzák.
A találmány tárgyához tartoznak ezen felül az említett DBD- és LBD-doménok aminosavszekvenciájában variációkat tartalmazó szteroidreceptor-proteinek, amennyiben azok nem vesztik el DNS-kötő vagy ligandumkötő aktivitásukat. A fenti aminosavszekvenciákban előforduló variációk lehetnek a következők: az említett szekvencián belül egy aminosav (vagy aminosavak) deléciója, szubsztitúciója, inszerciója, inverziója vagy addíciója, amely a szekvencia egészében aminosaveltérést (amonosaveltéréseket) eredményez. A proteinekről és peptidekről rendelkezésre álló ismereteink alapján, a technika állása szerint jól ismert, hogy ezek az amonosaveltérések olyan aminosavszekvenciákat eredményeznek, amelyek különböznek attól a natív aminosavszekvenciától, amelyből származnak, de még homológiát mutatnak azzal. Olyan aminosavszubsztitúciók leírása, amelyek várhatóan nem változtatják meg lényegesen a biológiai és immunológiai aktivitást, megtalálható például a következő szakirodalmi helyen: Dayhof M. D.: „Atlas of protein sequence and structure”, „Nat. Biomed. Rés. Found.”, Washington D. C., 5. kötet, 3. szuppl. (1978). Rokon aminosavak közt létrejövő aminosavhelyettesítések, vagy az evolúció során gyakran előforduló aminosavhelyettesítések többek között a következők: Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Arg/Lys, Asp/Asn és Ile/Val. A fenti információ alapján Lipman és Pearson kidolgoztak egy proteinösszehasonlításra szolgáló, gyors és érzékeny eljárást [Science 227, 1435 (1985)], amely alkalmas homológ polipeptidek közti funkcionális hasonlóság meghatározására.
A találmány szerinti DBD-domén aminosavszekvenciájában található olyan variációk, amelyek a 3. azonosító számú szekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosavszekvenciát eredményeznek, még elegendő DNS-kötő aktivitással rendelkező receptorok keletkezéséhez vezetnek. A találmány szerinti LBD-domén aminosavszekvenciájában található olyan variációk, amelyek a 4. azonosító számú szekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát eredményeznek, még elegendő ligandumkötő aktivitással rendelkező receptorok keletkezéséhez vezetnek.
A leírásban a homológia fokát PCGENE-nel történő meghatározás alapján, százalékban fejeztük ki. A homológia fokát a találmány szerinti szekvenciával történő egyeztetés alapján, az azonos aminosavak százalékos arányaként adtuk meg. A maximális egyeztetést kihagyott helyek tették lehetővé.
A klasszikus ER és a találmány szerinti ER aminosavszekvenciájának összehasonlítása szerint, azok DBD-doménja nagyfokú hasonlóságot mutatott. A „P4
HU 221 411 Bl box” (E-G-X-X-A aminosavak) megtartottsága, amely a klasszikus ER-nek a célzott DNS-elemekkel történő aktuális kölcsönhatásáért felelős [Zilliacus és munkatársai: Mól. Endo. 9, 389 (1995); Glass: End. Rév. 75, 391 (1994)], arra utal, hogy a találmány szerinti ER ösztrogén választ közvetítő elemek („estrogen responsive elements”, ERE-k) felismerésére képes. A találmány szerinti receptorok valóban, ERE-tartalmú riporterkonstrukciókon ligandumfüggő transzaktiváló hatást fejtettek ki. A klasszikus ER és a találmány szerinti ER specifitásának megfelelő célzott gének tehát egymást átfedhetik. Ez azt jelentheti, hogy olyan szövetekben, ahol mindkét ER expresszálódik, ezek a receptorok versengenek az ERE-helyekért. A találmány szerinti ER a klasszikus szabályozástól eltérő módon fejthet ki szabályozó hatást a célzott gének transzkripciójára, vagy az ösztrogénválaszt közvetítő elemek elfoglalásával egyszerűen gátolhatja a klasszikus ER működését, Más magyarázat szerint a transzkripciót befolyásolhatja a különböző receptorok heterodimerizációja.
A találmány szerinti előnyös szteroidreceptorok tehát a DNS-kötő dómén „P-box” régiójában tartalmazzák az „E-G-X-X-A” aminosavszekvenciát, ahol „X” bármely aminosav lehet. A találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen receptorokat kódoló izolált DNS-ek.
A találmány szerinti receptorok előállítására alkalmazható eljárások a technika állása szerint jól ismertek [Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, „Cold Spring Harbor Laboratory Press”, „Cold Spring Harbor” (1989)]. A legelőnyösebb eljárás szerint a fenti receptorokat a kívánt proteint kódoló DNS expresszálásával állítjuk elő.
A találmány szerinti receptorokat kódoló nukleinsav-szekvenciák klónozására gazdasejtek és klónozóvektorok kombinációjának széles skálája alkalmazható. Alkalmazható klónozóvektorok lehetnek például kromoszomális, nem kromoszomális és szintetikus DNSszekvenciák, például különböző ismert bakteriális plazmidok, valamint plazmidok, fágok vagy vírus-DNS-ek kombinációjából származó, szélesebb gazdaspektrummal rendelkező plazmidok és vektorok. Alkalmas gazdasejtek lehetnek bakteriális gazdasejtek, élesztők és más gombák, növényi vagy állati gazdasejtek, például kínaihörcsög-petefészek („Chinese Hamster Ovary”, CHO) sejtek vagy majomsejtek, valamint más gazdasejtek.
A találmány szerinti ligandumkötő dómén expresszálására alkalmazható vektorok tartalmazhatnak továbbá a ligandumkötő doménhoz funkcionálisan kapcsolt szabályozószekvenciákat. Az ilyen szabályozószekvenciák általánosságban tartalmaznak egy promoterszekvenciát, és tartalmaznak az expresszió szintjét szabályozó és/vagy fokozó szekvenciákat. Az említett vektorokban igen gyakran jelen van egy replikációs origó és/vagy egy domináns szelekciós marker. A szabályozó- és egyéb szekvenciák természetesen a választott gazdasejttől függően változhatnak.
Gazdasejtek transzformálására vagy transzfektálására alkalmazható eljárások a technika állása szerint jól ismertek [lásd például: Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, „Cold Spring Harbor Laboratory” (1989)].
A találmány szerinti DNS-eket tartalmazó rekombináns expressziós vektorok, valamint az említett DNSekkel vagy említett expressziós vektorokkal transzformáit sejtek szintén a találmány tárgyát képezik.
A találmány tárgyához tartoznak ezen felül egy Nterminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmazó kiméra receptorproteinek, amennyiben a doménok legalább egyike a találmány szerinti receptorproteinekből származik, és az említett kiméra receptorprotein legalább egy további doménja a sejtmagi receptorok főcsaládjába tartozó másik receptorproteinből származik, azzal a kikötéssel, hogy az említett kiméra receptorprotein DNS-kötő doménja és ligandumkötő doménja különböző proteinekből származik.
Közelebbről, a találmány szerinti kiméra receptor tartalmazhatja a találmány szerinti LBD-domént, amely LBD-domén a 4. azonosító számú aminosavszekvenciával legalább 70%-os homológiát mutató aminosavszekvenciával rendelkezik. Ebben az esetben az N-terminális doménnak és a DBD-doménnak más sejtmagi receptorból, például PR-ből kell származnia. Ezúton olyan kiméra receptort kapunk, amelyet a találmány szerinti ER ligandumja aktivál, és amelynek célzott génjeit progeszteron-válaszelem szabályozása alatt álló gének képezik. A találmány szerinti LBD-domént tartalmazó kiméra receptorok alkalmazhatók vegyületek szűrésére, a találmány szerinti ER-t aktiválni képes új ligandumok vagy hormonanalógok azonosítása céljából.
Ezen felül a találmány szerinti DBD-domént tartalmazó kiméra receptorok, amelyekben a DBD-domén a
3. azonosító számú aminosavszekvenciával legalább 80%-os homológiát mutató aminosavszekvenciával rendelkezik, és amelyek tartalmaznak továbbá egy másik sejtmagi receptorból származó LBD-domént és adott esetben N-terminális domént, sikeresen alkalmazhatók az említett sejtmagi receptorok számára szolgáló új ligandumok vagy hormonanalógok azonosítására. Az ilyen kiméra receptorok különösen alkalmasak árva receptorok ligandumjainak azonosítására.
Mivel a szteroidreceptorok három, különböző funkcióval rendelkező, egymástól többé-kevésbé független domént tartalmaznak, lehetséges, hogy mind a három funkcionális dómén a szteroidreceptorok főcsaládjának különböző tagjaiból származzon.
A különböző eredetű részeket tartalmazó molekulákat kiméráknak nevezzük. A találmány szerinti ligandumkötő domént és/vagy DNS-kötő domént tartalmazó kiméra receptorok előállíthatok kémiai úton történő összekapcsolással, de a doménok összekapcsolását legelőnyösebben DNS-szinten végezhetjük, ismert molekuláris biológiai eljárások alkalmazásával, a megfelelő szteroidreceptor-doménokat kódoló nukleinsavszekvenciák fuzionáltatásával. A találmány tárgyát képezik tehát a találmány szerinti kiméra receptorproteineket kódoló DNS-ek is.
Ilyen kiméra proteinek előállíthatok úgy, hogy alkalmas gazdasejteket transzferálunk az említett kiméra re5
HU 221 411 Bl ceptorproteineket kódoló DNS-ekkel, majd ezeket a sejteket megfelelő körülmények mellett tenyésztjük.
Különösen előnyös, ha a szteroidreceptor expressziójához szükséges információkat hordozó vektoron felül a gazdasejteket egy riportermolekula expressziójához szükséges információt hordozó vektorral is transzformáljuk vagy transzfektáljuk. A riportermolekulát kódoló vektor egy funkcionális riportergénhez működőképesen kapcsoltan, egy vagy több, hormonválaszt közvetítő elemet (HRE-elemet) tartalmazó promoterszekvenciát tartalmaz. Az ilyen HRE-elem az aktivált szteroidreceptorok célzott DNS-ét képezi, következésképp fokozza a riportermolekulát kódoló DNS transzkripcióját. Amennyiben a szteroidreceptorokat in vivő környezetben vizsgáljuk, a riportermolekula termelődése képezi a ligandum stimuláló hatására adott sejtes választ. Kombinálhatjuk azonban in vitro egy receptor ligandumkötő doménját más szteroidreceptorok DNS-kötő doménjaival és transzkripciót aktiváló doménjaival, ezáltal lehetővé téve más HRE-elemek és riportermolekula rendszerek alkalmazását. Egy másik ilyen rendszert az MMTV-LTR-ben található HREelemek alkalmazásával állítottak elő [egér emlőtumorvírus hosszú terminális ismétlődő szekvenciája, egy riportermolekulával, például a szentjánosbogár luciferáz génnel vagy a CAT (kloramfenikol transzferáz) bakteriális génnel kapcsoltan]. További alkalmazható HREelemek például a következők: a patkány oxitocin-promoter, a retinoiksav-választ közvetítő elem, a pajzsmirigyhormon-választ közvetítő elem és az ösztrogénválaszt közvetítő elem; leírtak továbbá szintetikus, hormonválaszt közvetítő elemeket is (lásd például Fuller: lásd fent, 3096. oldal). Riportermolekulaként CAT-on és luciferázon felül β-galaktozidáz is alkalmazható.
A találmány szerinti szteroidhormon-receptorok és kiméra receptorok alkalmazhatók új ligandumok és hormonanalógok in vitro azonosítására. Ebből a célból kötődési vizsgálati eljárásokat végezhetünk, a találmány szerinti DNS-ekkel vagy a találmány szerinti DNS-eket tartalmazó expressziós vektorokkal transzformáit sejtek alkalmazásával, amely sejtek a találmány szerinti szteroidreceptorokat vagy kiméra receptorokat expresszálják.
A találmány szerinti új szteroidhormon-receptorok és kiméra receptorok, valamint a találmány szerinti ligandumkötő doménok alkalmazhatók vizsgálati eljárásokban, a sejtmagi receptorok számára szolgáló funkcionális ligandumok vagy hormonanalógok azonosítására.
A találmány tárgyát képezik tehát eljárások a találmány szerinti szteroidreceptorok és kiméra receptorok számára szolgáló funkcionális ligandumok azonosítására, amely eljárások szerint:
a) megfelelő gazdasejtekbe 1) a találmány szerinti DNS-eket vagy expressziós vektorokat juttatunk; valamint 2) egy működőképes, hormonválaszt közvetítő elemhez (HRE-hez) funkcionálisan kapcsolt, megfelelő riportergént juttatunk; azzal a kikötéssel, hogy az említett HRE-t az említett DNS által kódolt receptorprotein DNS-kötő doménja aktiválni képes;
b) az a) lépésből származó gazdasejteket feltételezett ligandumokkal érintkeztetjük, amelyek az a) lépés szerinti DNS által kódolt receptorprotein ligandumkötő doménjához kötődhetnek;
c) az a) lépés szerinti riportergén által kódolt receptorprotein expresszióját meghatározzuk.
Ha a riportergén expressziója az alapszintű (ligandum jelenléte nélkül megfigyelhető) expersszióhoz képest fokozódik, a funkcionális ligandum agonistának tekinthető; ha a riportergén expressziója változatlan marad, vagy az alapszintű expresszióhoz képest csökken, a funkcionális ligandum megfelelő (részleges) antagonista lehet.
Ilyen vizsgálat kivitelezése céljából a funkcionális szteroidreceptort kódoló vektorral, valamint a hormonválaszt közvetítő elem és ahhoz kapcsolt riportermolekula expressziója számára információt hordozó vektorral transzformált vagy transzfektált sejteket megfelelő tápfolyadékban tenyésztünk. A receptort aktiváló megfelelő ligandum hozzáadását követően a riportermolekula termelődése fokozódik, amely termelődés a riportermolekula kimutatására érzékeny vizsgálati eljárásokkal egyszerűen meghatározható. Lásd például a WO-A-8803168 számú nemzetközi közzétételi iratot. Ismert szteroidreceptorok esetében alkalmazható vizsgálati eljárásokat leírtak a korábbiakban [lásd például Tsai S. és munkatársai: Cell 57, 443 (1989); Mayer M. és munkatársai: Cell 57, 433 (1989)].
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán az új ösztrogénreceptor (ERp)-Northem-blot analízise látható. Két különböző, több szövetmintát tartalmazó Northem-blotot (Clontech) hibridizáltattunk ERp-ra specifikus hibridizációs próbával (lásd a példákban). Az ábrán jelöltük az alkalmazott humán szöveteket, amelyekből az RNS származott, valamint a molekulaméret-markereket, kilobázisban (kb) megadva.
A 2. ábrán látható hisztogram szerint a 17[l-ösztradiol, az ösztriol és az ösztron 3-4-szeresére fokozta az ERP által közvetített luciferázaktivitást. ERfi-t kódoló expressziós vektort transzfektáltunk tranziens módon CHO-sejtekbe, egy olyan riporterkonstrukcióval együtt, amely a szentjánosbogár luciferázt kódoló szekvencia előtt a patkány oxitocin-promotert tartalmazta (lásd a példákban).
A 3. ábra 17p-ösztradiol (E2) ERa- és ERp-receptorokra kifejtett hatását mutatja, egymagában, vagy az ICI—164384 (ICI) antiösztrogénnel együtt alkalmazva. Tranziens módon CHO-sejteket transzfektáltunk az ERa-t (a klasszikus ER-t) és ERp-t kódoló expressziós konstrukciókkal, valamint a példákban ismertetett, patkány oxitocinpromoter-luciferáz riporterkonstrukcióval. A luciferáz aktivitást triplikátumokban meghatároztuk, és ugyanazon lizátumokban a β-galaktozidáz meghatározásán keresztül a transzfekciós hatékonyságra normalizáltuk.
A 4. ábrán ERa- és ERp-receptorok expresszióját ábrázoltuk több sejtvonalban, RT-PCR-analízissel történő meghatározás szerint (lásd példák). Az alkalma6
HU 221 411 Β1 zott sejtvonalak különböző szövet/sejt típusokból származtak, amelyek a következők voltak: endometrium (ECC1, Ishikawa, HEC-1A, RL95-2); oszteoszarkoma (SAOS-1, U2-OS, HŐS, MG63); emlőstumorok (MCF-7, T47D), endothelium (HUV-EC-C, BAEC-1); simaizom (HISM, PAC-1, A7R5, A10, RASMC, CavaSMC); máj (HepG2); vastagbél (CaCo2); és vagina (Hs-760T, SW-(54).
Valamennyi sejtvonal humán eredetű volt, kivéve a PAC-1-, A7R5-, A10- és RASMC-sejtvonalakat, amelyek patkányeredetű sejtvonalak; a BAEC-1-sejtvonalat, amely szarvasmarhaeredetű sejtvonal; és a CavaSMCsejtvonalat, amely tengerimalaceredetű sejtvonal.
Az 5. ábrán ERa-t és ERP-t, valamint patkány oxitocin-luciferáz ösztrogén érzékeny riportergént expresszáló, stabilan transzfektált CHO-sejtvonal alkalmazásával végzett transzaktivációs vizsgálati eljárás eredményét szemléltetjük (a részleteket lásd a példákban). Hormonfüggő transzaktivációs görbéket határoztunk meg a 17P-ösztradiol és az Org4094 esetében. A raloxifen ösztrogén-antagonista esetében a sejteket 2x10 10 mol/1 17p-ösztradiollal kezeltük, növekvő raloxifen koncentrációk jelenlétében. A válasz maximális értékeit önkényesen 100%-nak vettük.
A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
Az új ösztrogénreceptor molekuláris klónozása
Két, inozint (I) tartalmazó degenerált oligonukleotidot állítottunk elő, amelyeket a humán szteroidhormonreceptorok konzervált DNS-kötő doménjai és ligandumkötő doménjai alapján terveztünk:
1. láncindító oligonukleotid:
’- GGIGA(C/T)GA(A/G)GC(A/T)TCIGGITG(C/T)CA(C/T)TA(C/T)GG-3’ (7. azonosító számú szekvencia); és
2. láncindító oligonukleotid:
’ - AAGCCTGG(C/G)A(C/T)IC(G/T)(C/T)TTIG CCCAI(C/T)TIAT-3’ (8. azonosító számú szekvencia).
Templátként, humán EBV-stimulált PBL-ekből (perifériás vér eredetű leukocitákból) nyert cDNS-t használtunk. Egy (1) pg össz-RNS-t reverz transzkripciós eljárással átírtunk, 50 mmol/1 KCl-t, 10 mmol/1 TrisHCl-t (pH=8,3), 4 mmol/1 MgCl2-t, 1 mmol/1 dNTPelegyet (Pharmacia), 100 pmol véletlenszerű hexanukleotidot (Pharmacia), 30 egység Ribonukleáz-gátlót (Gibco BRL), valamint 200 egység „M-MLV” reverz transzkriptázt (Gibco BRL) tartalmazó, összesen 20 pl reakcióelegyben. A reakcióelegyeket 30 percig, 37 °Con inkubáltuk, majd 5 percig, 100 °C-on hővel inaktiváltuk. A kapott cDNS-t 100 pl, a következő összetételű PCR-reakcióelegyben használtuk fel: 10 mmol/1 Tris-HCl (pH = 8,3); 50 mmol/1 KC1, 1,5 mmol/1 MgCl2, 0,001 vegyes% zselatin; 3% DMSO; 1 pg #1. láncindító oligonukleotid és #2. láncindító oligonukleotid, valamint 2,5 egység „Amplitaq” DNS polimeráz (Perkin Elmer). A PCR-reakciókat „Perkin Elmer 9600” termociklusos készülékben végeztük. A kezdeti denaturációt (4 perc, 94 °C-on) 35 ciklus követte, amelyekben a következő paramétereket alkalmaztuk: 30 másodperc, 94 °C-on; 30 másodperc, 45 °C-on; és 1 perc 72 °C-on; végül a reakcióelegyet 7 percig, 72 °C-on inkubáltuk, majd 4 °C-on tároltuk. A fenti reakcióelegyekből származó mintákat 1,5%-os agarózgélen analizáltunk. A kérdéses fragmenseket a gélből kivágtuk, a fentivel megegyező PCR-körülmények alkalmazásával ismételten amplifikáltuk, majd „Qiaex II” (Qiagen) felhasználásával tisztítottuk. A fragmenseket pCRU-vektorba klónoztuk, és a „TA” klónozó reagenskészlet (Invitrogen) alkalmazásával, transzformációs eljárással baktériumokba juttattuk. A „Qiagen plasmid midi” reagenskészlet (Qiagen) utasításai szerint plazmid-DNS-t izoláltunk, nukleotidszekvenciaanalízis céljára. A nukleotidszekvencia-analízist az „ALF” automatikus szekvenáló készülékkel (Pharmacia), T7 DNS szekvenáló reagenskészlettel (Pharmacia) végeztük, vektorspecifikus vagy fragmensspecifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával.
Az egyik klónozott ffagmens megfelelt a klasszikus ösztrogénreceptorral szoros rokonságot mutató, új ösztrogénreceptomak (ER). A klónozott új ösztrogénreceptor-fragmens egy részét (466-797. nukleotidok közti fragmenst) PCR-eljárással amplifikáltuk, a #3. oligonukleotid (TGTTACGAAGTGGGAATGGTGA; 9. azonosító számú szekvencia) és a #2. oligonukleotid alkalmazásával, és hibridizációs próbaként használtuk, humán heréből Ág ti 1-ben előállított cDNS-génkönyvtár (Clontech, #HL101b) szűrésére. Rekombináns fágokat 135 mm átmérőjű lemezekre, lemezenként 40 000 plakk-képző egység (pfu) sűrűségben kioltottunk (0,2% maltózzal kiegészített LB-táptalajban tenyésztett Y1090 baktériumok alkalmazásával), és azokról replika filtereket készítettünk (Hybond-N, Amersham), a gyártó utasításai szerint. A filtereket először 7% SDS-t tartalmazó, 0,5 mol/1 foszfátpufferben (pH=7,5), 65 °C-on, legalább 30 percig előhibridizáltattuk. A DNS-próbákat „Qiaex-II-vel” (Qiagen) tisztítottuk, „Decaprime” reagenskészlet (Ambion) alkalmazásával 32P-vel jelöltük, és az előhibridizációs oldathoz adtuk. A filtereket egy éjszakán át, 65 °C-on hibridizáltattuk, majd 0,5xSSC/0,l% SDS összetételű oldatban, 65 °C-on mostuk. Két pozitív plakkot azonosítottunk, amelyek azonosnak bizonyultak. Ezeket a kiónokat egy ismételt szűréssel tisztítottuk. A fágok eluátumán, a kgt 11-specifikus láncindító oligonukleotidok (#4: 5 ’ - TTG AC ACC AG ACC AACTGGT AATG- 3 ’, 10. azonosító számú szekvencia; és #5: 5’-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3’, 11. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával végzett PCR-reakció mindkét klón esetében 1700 bázispár hosszúságú fragmenst eredményezett. Ezt követően a #6., génspecifikus láncindító oligonukleotid (5’-GTACACTGATTTGTAGCTGGAC-3’; 12. azonosító számú szekvencia) és a #4., kgtll-specifikus láncindító oligonukleotid, valamint a #7., génspecifikus láncindító oligonukleotid
HU 221 411 Bl (5’-CCATGATGATGTCCCTGACC-3’; 13. azonosító számú szekvencia) és az #5., Xgtl 1-specifikus láncindító oligonukleotid kombinációjával végzett PCR-reakciók körülbelül 450 bázispár és 1000 bázispár hosszúságú fragmenseket eredményeztek, amelyeket a pCRIIvektorba klónoztunk, és nukleotid-szekvencia-analízisre használtunk. Ezeket a PCR-reakciókat a fentivel megegyező körülmények mellett végeztük, azzal az eltéréssel, hogy a láncindító oligonukleotidokat eltérő koncentrációban alkalmaztuk (mindkét esetében 200 ng koncentrációban), valamint eltérő hibridizációs hőmérsékletet alkalmaztunk (60 °C). Mivel a cDNSklónban az ER-rel kimutatható homológia az ER-ben a 7,- és 8.-exon határának megfelelő helyen (az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 1247-1248. nukleotidok között) hirtelen megszűnik, arra következtettünk, hogy ez a szekvencia megfelel az új ER 7.-intronjának. A fenti cDNS-klón nukleotid-szekvenciája helyességének igazolására, a cDNS-klón alapján egy 1200 bp fragmenst állítottunk elő a #4., kgt 11-specifikus láncindító oligonukleotid és a #8., a 7.-exon 3’-végének megfelelő génspecifikus láncindító oligonukleotid (5’-TCGCATGCCTGACGTGGGAC-3’; 14. azonosító számú szekvencia), valamint a korrektor („proofreading”) Pfu polimeráz (Stratagene) alkalmazásával. A fenti fragmenst szintén a pCRII-vektorba klónoztuk, az egészet szekvenáltuk, és kimutattuk róla, hogy az a korábbiakban kapott szekvenciával azonos.
Hogy az új ER 7.-exonjától 3’-irányban található nukleotid-szekvenciákat megkapjuk, a klasszikus ER AF-2-régiója alapján tervezett degenerált oligonukleotidot használtunk (#9: 5’-GGC(C/G) TCC AGC ATCTCCAG(C/G)A(A/G)CAG-3’; 15. azonosító számú szekvencia) a #10., génspecifikus láncindító oligonukleotiddal (5’-GGAAGCTGGCTCACTTGCTG-3’; 16. azonosító számú szekvencia) együtt, templátként heréből származó cDNS alkalmazásával („Maradion ready testis cDNA”, Clontech, katalógusszám: #7414-1). Egy, az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 1112-1332. nukleotidoknak megfelelő, 220 bp hosszúságú specifikus fragmenst klónoztunk és szekvenáltunk. Az 1112-1247. nukleotidok azonosak voltak a cDNS-klónban található megfelelő szekvenciával. Az ettől 3’-irányban található szekvencia nagyfokú homológiát mutatott a klasszikus ER megfelelő régiójával. Hogy az új ER AF-2-régiójától 3’-irányban található szekvenciákat megkapjuk, RACE (a cDNS-végek gyors amplifikációjára szolgáló) PCR-reakciókat végeztünk, templátként a „Maradion ready testis cDNA” (Clontech) reagenskészlet alkalmazásával. A kiinduló PCR-reakciót a #11. oligonukleotid (5’-TCTTGTTCTGGACAGGGATG-3’, 17. azonosító számú szekvencia) és a reagenskészlet mellékelt, APl-jelű láncindító oligonukleotid kombinációjával végeztük. A fenti reakcióelegy mintája alapján, egy közbeiktatott láncindító oligonukleotid felhasználásával történő („nested”) PCR-reakciót végeztünk, a #10. oligonukleotid alkalmazásával (16. azonosító számú szekvencia). Ezt követően a fenti reakcióelegy egy mintáját olyan, közbeiktatott láncinditó oligonukleotid alkalmazásával történő („nested”) PCR-reakcióban használtuk fel, amelyben a #12. oligonukleotidot (5’-GCATGGAACATCTGCTCAAC-3’; 18. azonosító számú szekvencia) kombináltuk az oligo-dT láncindító oligonukleotiddal. A kapott specifikus szekvencia (az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 1256-1431. nukleotidoknak megfelelő szekvencia) nukleotid-szekvencia-analízise az új ER ligandumkötő doménjának karboxi-terminális végét kódoló szekvenciára derített fényt, amely szekvencia tartalmazott egy F-domént, egy transzlációs stopkodont, valamint tartalmazta az 1. azonosító számú szekvencián nem szereplő, 3’-végi nem transzlálódó szekvencia egy részét. Az ennek alapján következtetett aminosavszekvenciát az 5. azonosító számú szekvencia mutatja.
Annak a lehetőségnek a vizsgálata céljából, hogy az új ösztrogénreceptor tartalmaz-e további 5’-irányú transzlációs kezdőkodont, RACE-PCR-kísérletet végeztünk, a „Maradion ready testis cDNA” (Clontech; katalógusszám: #7414-1) reagenskészlet alkalmazásával. Először a 12. azonosító számú szekvencia szerinti oligonukleotid (az 1. azonosító számú szekvenciában a 416-395. nukleotidoknak megfelelő antiszensz oligonukleotid), valamint a reagenskészlethez mellékelt AP-l-oligonukleotid alkalmazásával végeztünk PCRreakciót. Az ezt követően közbeiktatott oligonukleotid felhasználásával végzett („nested”) PCR-reakciót a 27. azonosító számú szekvencia szerinti oligonukleotid (az 1. azonosító számú szekvenciában a 254-231. nukleotidoknak megfelelő antiszensz oligonukleotid), valamint a reagenskészlethez mellékelt ΑΡ-2-oligonukleotid alkalmazásával végeztük. A kapott, elmosódott mintából a 300 bázispámál nagyobb fragmenseket kivágtuk, „Genecleanll” reagenskészlettel (BiolOl) tisztítottuk, és „TA” klónozó reagenskészlet (Clontech) alkalmazásával klónoztuk. A telepeket PCR-eljárással szűrtük, a 22. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 28. azonosító számú szekvencia szerinti génspecifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. A legnagyobb méretű inszertet tartalmazó kiónt szekvenáltuk. A kapott nukleotid-szekvencia megfelelt a 24. azonosító számú szekvencia szerinti 1-490. nukleotidoknak. Az előbbi szekvencia alapján nyilvánvaló, hogy az első, leolvasási keretbe eső, 5’-irányú kezdőkodon a 24. azonosító számú szekvencia szerinti 77-79. pozíciókban található. Ettől a transzlációs kezdőkodontól 5’-irányban egy leolvasási keretbe eső transzlációs stopkodon található (a 24. azonosító számú szekvencia szerinti 11-13. pozíciókban). Következésképp, az új ösztrogénreceptor leolvasási kerete 530 aminosavból áll (lásd a 25. azonosító számú szekvenciát), és a receptor 59,234 kD számított molekulatömeggel rendelkezik.
Az 5’-RACE eljárással kapott nukleotid-szekvencia helyességének igazolására humán genomi eredetű kiónokat nyertünk és analizáltunk. ZEMBL3-ban létesített humán genomi eredetű génkönyvtárat (Clontech; HL1067J) szűrtünk az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 1-416. nukleotidoknak megfelelő hibridizációs próbával. Egy erős hibridizációs jelet adó kiónt plakk-tisztítottunk, és abból ismert eljárások alkalmazá8
HU 221 411 Β1 savai DNS-t tisztítottunk [(Sambrook és munkatársai: (1989)]. A DNS-t több restrikciós enzimmel emésztettük, agarózgélen elektroforetizáltuk, majd nejlonfilterekre blottoltuk. A biot, fent említett RACE-fragmenssel (a 24. azonosító számú szekvencia szerinti 1-490. nukleotidoknak megfelelő próbával) történő hibridizációjával egy körülbelül 800 bázispár méretű, hibridizálódó Sau3A-ffagmenst mutattunk ki. Ezt a ffagmenst pGEM3Z-vektor BamHI-helyére klónoztuk, és szekvenáltuk. A nukleotid-szekvencia egy báziseltérést tartalmazott, amely feltehetően a RACE-fragmensben PCR által létrehozott pontmutációnak felelt meg. Az 5’-RACE-ffagmensben a 172. nukleotid guaninnak (G) bizonyult, több független genomi szubklónban azonban ez a bázis adenin (A) volt.
2. példa
Az új ösztrogénreceptor két különböző összeillesztési („splice’j variánsának azonosítása
A hereeredetű cDNS-génkönyvtár ismételt szűrése az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 918-1246. nukleotidoknak megfelelő próbával, két hibridizálódó ki ónt eredményezett, amelyek 3’-végeit PCR-eljárással amplifikáltuk [a #10. génspecifikus láncindító oligonukleotid (5’-GGAAGCTGGCTCACTTGCTG-3’) 16. azonosító számú szekvencia és a #4. láncindító oligonukleotid (10. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával], majd a PCR-termékeket klónoztuk, és szekvenáltuk. Az egyik kiónról kimutattuk, hogy az új ER-en belül egy alternatív 8.-exont (8.B-exon) tartalmaz. A 2. azonosító számú szekvencia a fenti összeillesztési variáns proteint kódoló részét és a stopkodont tartalmazó szekvenciáját szemlélteti. Egy eltérő összeillesztési reakció következtében, amely a fenti exon közbeiktatását eredményezi, az új ER olvasási kerete itt azonnal véget ér, ezáltal csonka karboxi-véggel rendelkező új ER keletkezik (6. azonosító számú szekvencia).
Humán csecemőmirigy eredetű cDNS-génkönyvtár szűrése (Clontech; HL1074a) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 918-1246. nukleotidoknak megfelelő próbával, egy további összeillesztési variáns létére derített fényt. Egy hibridizálódó klón 3’-végét a #10. láncindító oligonukleotid (16. azonosító számú szekvencia) és a #13., XgtlO-specifikus láncindító oligonukleotid (5’-AGCAAGTTCAGCCTGTTAAGT-3’; 19. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával amplifikáltuk, klónoztuk, és szekvenáltuk. Az így kapott nukleotid-szekvencia a 7. exon/8. exon határától 5’irányban megegyezett a korábbiakban azonosított kiónokban található szekvenciával. Ebben azonban, a 3’végen egy alternatív 8.-exon (8.C-exon) volt jelen, amely a két C-terminális aminosavat, valamint azt követő stopkodont kódolt. A fenti összeillesztési variáns proteint kódoló részének megfelelő nukleotid-szekvenciát a 20. azonosító számú szekvencia szemlélteti, a megfelelő proteinszekvenciát pedig a 21. azonosító számú szekvencia mutatja.
Az új ösztrogénreceptor fenti két variánsa nem tartalmazza az AF-2-régiót, tehát feltehetően nem képesek ligandumfüggő módon célzott gének transzkripcióját szabályozni. A variánsok azonban heterodimerizáció révén vagy ösztrogénválaszt közvetítő elemek elfoglalásával vagy más transzkripciós faktorokkal történő kölcsönhatás révén, esetleg gátolhatják a vad típusú klasszikus ER és/vagy a vad típusú új ER működését. Leírták a klasszikus ER egy mutánsát (ERI-530), amely nagyon hasonlít az új ösztrogénreceptor fenti két variánsára. Az ERl-530-receptorról kimutatták, hogy az domináns-negatív receptorként viselkedik, azaz a vad típusú ER intracelluláris aktivitását módosítani képes [Ince és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 14 026 (1993)].
3. példa
Northern-blot-analízis
Több különböző humán szövetet tartalmazó Northem-blotokat (MTN-blotokat) a Clontechtől szereztünk be, és azokat legalább egy órán át, 65 °C-on 7% SDS-t tartalmazó, 0,5 mohi foszfátpufferben (pH=7,5) előhibridizáltattuk. A hibridizációs próbaként használt DNS-ffagmenst (az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 466-797. nukleotidoknak megfelelő fragmenst) jelölő reagenskészlet alkalmazásával (Ambion) 32P-vel jelöltük, forralással denaturáltuk, és az előhibridizációs oldathoz adtuk. A mosásnál a következő paramétereket alkalmaztuk: 3xSSC, szobahőmérsékleten; majd 3 x SSC, 65 °C-on; végül 1 χ SSC, 65 °C-on. A filtereket ezt követően egy hétig röntgenfilmeken exponáltuk. A csecsemőmirigyben, lépben, petefészekben és herében két, körülbelül 8 kb és 10 kb nagyságú transzkriptumot mutattunk ki. A herében egy további, 1,3 kb nagyságú transzkriptum volt megfigyelhető.
4. példa
Az ERtt- és ER$-receptorok expressziójának RT-PCR-analizise sejtvonalakban
Több humán és állati eredetű sejtvonalból RNS-t izoláltunk, „RNAzol B” (Cinna/Biotecx) alkalmazásával. cDNS-t 2,5 pg össz-RNS alapján, a „Superscript II” reagenskészlettel (BRL) állítottunk elő, a gyártó utasításai szerint. A cDNS egy részét az ER-t vagy az új ösztrogénreceptort kódoló mRNS-eknek megfelelő ffagmensek specifikus PCR-amplifikációjára használtuk fel. (Hangsúlyozzuk, hogy az alkalmazott láncindító oligonukleotidok humán és patkányeredetű szekvenciákon alapultak, míg egyes szövetek nem humán vagy nem patkányeredetű szövetek voltak; lásd 4. ábra). Az ERa-receptor esetében a következő láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk: szensz: 5’-GATGGGCTTACTGACCAACC-3’; antiszensz: 5’-AGATGCTCCATGCCTTTG-3’, amelyek az LBD-domén egy részének megfelelő, 548 bázispárból álló fragmenst eredményeztek. Az ERp-receptor esetében a következő láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk: szensz: 5’-TTCACCGAGGCCTCCATGATG-3’; és antiszensz: 5’-CAGATGTTCCATGCCCTTGTT-3’, amelyek az LBDdomén egy részének megfelelő, 565 bázispárból álló fragmenst eredményeztek. A PCR-mintákat agarózgélen analizáltuk, majd nejlon-filterekre blottoltuk. Ezeket a biotokat ismert eljárások alkalmazásával [Sambrook
HU 221 411 Bl és munkatársai: (1989)], az ERa- és ERp-plazmidDNS-ek alapján a fent említett láncindító oligonukleotidokkal előállított, 32P-jelölt PCR-fragmensekkel hibridizáltattuk.
5. példa
Az új ösztrogénreceptor-protein által közvetített ligandumjiiggő transzkripciós aktiváció
Sejttenyészetek
Kínaihörcsög-petefészek (CHO KI) sejteket (CCL61) az ATCC gyűjteményéből szereztünk be, és azokat 37 °C-on, párásított légtérben (5% CO2), fenolvörösmentes M505-tápfolyadékban, egyrétegű tenyészetként tartottuk fenn. Az utóbbi tápfolyadék összetétele a következő volt: Dulbecco-féle módosított Eagletápfolyadék („Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium”, DMEM; Gibco 074-200) és „Nutrient Médium F12” („Ham’s F12”; Gibco 074-1700) 1:1 elegye, amelyet
2.5 mg/ml nátrium-karbonáttal (Baker), 55 pg/ml nátrium-piruváttal (Fluka), 2,3 pg/ml β-merkapto-etanollal (Baker), 1,2 pg/ml etanol-aminnal (Baker), 360 pg/ml L-glutaminnal (Merck), 0,45 pg/ml nátrium-szelenittel (Fluka), 62,5 pg/ml penicillinnel (Mycopharm),
62.5 pg/ml streptomycinnel (Serva), és 5%, aktív szénnel kezelt boíjúszérummal (Hyclone) egészítettünk ki.
Rekombináns vektorok
Az 1. azonosító számú szekvencia szerinti ERp-kódoló szekvenciát PCR-eljárással amplifikáltuk, az 5’-CTTGGATCCATAGCCCTGCTGTGATGAATT ACAG-3’ (22. azonosító számú szekvencia; a transzlációs kezdőkodont aláhúzással jelöltük) és az 5 ’ - G ATGG ATCCTC ACCTC AGGGCC AGGCGTCA CTG-3’ (23. azonosító számú szekvencia; a transzlációs stopkodont aláhúzással jelöltük; antiszensz) oligonukleotidok alkalmazásával. A kapott BamHI-fragmenst (körülbelül 1450 bázispár) a pNGVl-jelű emlőssejt expressziós vektorba klónoztuk („Genbank” nyilvántartási szám: X99274).
A 24. azonosító számú szekvencia szerinti ERp leolvasási keretet kódoló expressziós konstrukciót úgy állítottuk elő, hogy egy BamHI-Msei-fragmenst (az 1. azonosító számú szekvenciában az 1-81. nukleotidoknak megfelelő fragmenst) a 24. azonosító számú szekvenciában a 77-316. nukleotidoknak megfelelő BamHI-MscI-fragmenssel helyettesítettünk. Az utóbbi fragmenst PCR-eljárással kaptuk, a 26. azonosító számú szekvencia szerinti és a 28. azonosító számú szekvencia szerinti oligonukleotidok, valamint a fent említett 5’-RACE-fragmens alkalmazásával.
A riportervektor a szentjánosbogár-luciferázt kódoló szekvenciához kötött, patkány oxitocin gén szabályozórégión alapult [-363/+16. pozícióknak megfelelő HindlII/Mbol fragmens; R, íveli és D. Richter: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2006 (1984)]; az oxitocin gén szabályozórégiójáról kimutatták, hogy az mind patkányban [R. Adan és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 175, 117 (1991)], mind emberben [S. Richard és H. Zingg: J. Bioi. Chem. 265, 6098 (1990)] in vitro funkcionális, ösztrogénhormon-választ közvetítő elemeket tartalmaz.
Tranziens transzfekció χ 105 CHO-sejtet 6 mélyületű „Nunclon” szövettenyésztó edényekbe oltottunk, majd a sejtekbe lipofektin (Gibco BRL) alkalmazásával DNS-t juttattunk be. Ebből a célból a DNS-t [1 pg receptor és riportervektor, 250 pl „Optimem” tápfolyadékban (Gibco BRL)] azzal megegyező térfogatú lipofektin reagenssel elegyítettük (7 pl, 250 μΐ „Optimem” tápfolyadékban, Gibco), és 15 percig, szobahőmérsékleten állni hagytuk. Miután a sejteket szérummentes tápfolyadékkal (M505) kétszer mostuk, a sejtekhez új tápfolyadékot adtunk (500 μΐ Optimem, Gibco), majd cseppenként hozzájuk adtuk a DNS-lipofektin elegyet. Miután a sejteket 5 órán át, 37 °C-on inkubáltuk, azokat fenolvörösmentes, 5%, aktív szénnel kezelt borjúszérummal kiegészített M505-táptalajjal kétszer mostuk, majd egy éjszakán át, 37 °C-on inkubáltuk. Huszonnégy (24) óra elteltével a táptalajhoz hormonokat adtunk (10~7 mol/1). A transzfekciót követően 48 órával 200 μΐ lízispuffer [0,1 mol/1 foszfátpuffer (pH = 7,8); 0,2% Triton X-100] hozzáadásával sejtextraktumokat készítettünk. Öt (5) percig, 37 °C-on végzett inkubálást követően, a sejtszuszpenziót centrifugáltuk (Eppendorf centrifugában, 5 percig), majd 50 μΐ luciferáz vizsgálati reagenshez (Promega) 20 μΐ mintát adtunk. A fénykibocsátást luminométerben (Berthold Biolumat), 10 percen át, 562 nm-es hullámhosszon határoztuk meg.
Az új ösztrogénreceptor stabil transzfekciója
A teljes hosszúságú ERpi-530-at (lásd fent) kódoló expressziós plazmidot a korábbiakban leírtak szerint, stabil módon CHO-Kl-sejtekbe transzfektáltuk [Theunissen és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 9035 (1993)]. Az így kapott, egy-egy sejtből származó kiónokat a fent ismertetettek szerint, a riporterplazmid (patkány oxitocin-luciferáz) tranziens transzfekciójával szűrtük. Kiválasztott kiónokat egy második transzfekció során, a patkány oxitocin-luciferáz riporterplazmiddal, valamint a szelekciót szolgáló, hygromycinrezisztenciagént tartalmazó pDR2A-plazmiddal stabilan transzfektáltunk. Az így kapott, egy-egy különálló sejtből származó ki ónokat 17P-ösztradiolra adott válaszra teszteltük. Ezt követően kiválasztott, egyetlen sejtből származó kiónokat transzaktivációs vizsgálati eljárásokban használtunk fel. Röviden, sejteket 96 mélyületű lemez mélyületeibe oltottunk (1,6χ 104 sejt/mélyület). Huszonnégy (24) óra elteltével a mélyületekhez tápfolyadékban, különböző koncentrációkig hígított hormont adtunk. Az antagonisták hatását vizsgáló kísérletekben valamennyi mélyülethez 2x10-10 mol/1 koncentrációban 17p-ösztradiolt, valamint az antagonista különböző koncentrációjú hígításait adtuk. A sejteket 24 órás inkubálást követően PBS-sel egyszer mostuk, majd 40 μΐ lízispuffer (lásd fent) hozzáadásával lizáltattuk. Valamennyi mélyülethez luciferáz-reagenst adtunk (50 μΐ), és a fénykibocsátást „Topcount” (Packard) készülék alkalmazásával mértük.
Eredmények
A két expressziós konstrukció (1. azonosító számú szekvencia és 24. azonosító számú szekvencia) CHOsejtek tranziens transzfekciójával történő összehasonlí10
HU 221411 Bl tása szerint, azok számos agonistára és antagonistára azonos transzaktivációs választ adtak. ER[i expressziós vektorral és riporterplazmiddal tranziens módon transzfektált CHO-sejtekben 17P-ösztradiol hatására a luciferáz aktivitás a kezeletlen sejtekhez képest 3-4-szere- 5 sére emelkedett (lásd 2. ábra). Hasonló transzaktiváció volt megfigyelhető ösztriollal és ösztronnal történő kezelést követően is. Az eredmények nemcsak arra utalnak, hogy az új ER (ERP) képes ösztrogénhormonokhoz kötődni, hanem arra is, hogy a ligandum által aktiválódott receptor a patkány oxitocin-promoterben képes ösztrogénválaszt közvetítő elemekhez (EREkhez) kötődni, és a luciferáz-riportergén transzkripcióját aktiválni. A 3. ábra szerint egy, az előbbihez hasonló független kísérletben 10~9 mol/1 17p-ösztradiol 15 18-szoros stimulációt eredményezett ERa esetében, és 7-szeres stimulációt eredményezett ERp esetében. Ezen felül az ICI-164384-jelű antiösztrogén 17βösztradiollal történő aktiválást követően mind az ERa, mind az ERp esetében antagonista hatással rendelkezett, míg ez az antagonista egymagában hatástalan volt. Ebben a kísérletben a sejtekbe az előbbi vektorokkal együtt 0,25 pg β-galaktozidáz-vektort transzfektáltunk, hogy a transzfekciós hatékonyság eltéréseire normalizálhassunk.
Stabilan transzfektált ERa- és ERp-sejtvonalakon végzett transzaktivációs vizsgálatokban hasonló abszolút luciferáz-értékeket kaptunk. A 17p-ösztradiol eseté10 ben nagyon hasonló görbéket kaptunk; ezek szerint félmaximális transzaktivációt alacsonyabb hormonkoncentrációkkal érhetünk el az ERa-receptoron keresztül, mint az ERp-receptoron keresztül (5. ábra). Az ORG4094 esetében is ez a helyzet, bár sokkal kifejezettebb hatás figyelhető meg. A raloxifen alkalmazásával kapott görbék azt mutatják, hogy ennek az antagonistának transzaktivációt blokkoló hatása ERa-receptor esetében nagyobb, mint az ERp-receptoron keresztül történő transzaktivációt blokkoló hatás.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1434 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGAATTACA GCATTCCCAG CAATGTCACT AACTTGGAAG GTGGGCCTGG TCGGCAGACC 60
ACAAGCCCAA ATGTGTTGTG GCCAACACCT GGGCACCTTT CTCCTTTAGT GGTCCATCGC 120
CAGTTATCAC ATCTGTATGC GGAACCTCAA AAGAGTCCCT GGTGTGAAGC AAGATCGCTA 180
GAACACACCT TACCTGTAAA CAGAGAGACA CTGAAAAGGA AGGTTAGTGG GAACCGTTGC 240
GCCAGCCCTG TTACTGGTCC AGGTTCAAAG AGGGATGCTC ACTTCTGCGC TGTCTGCAGC 300
GATTACGCAT CGGGATATCA CTATGGAGTC TGGTCGTGTG AAGGATGTAA GGCCTTTTTT 360
AAAAGAAGCA TTCAAGGACA TAATGATTAT ATTTGTCCAG CTACAAATCA GTGTACAATC 420
GATAAAAACC GGCGCAAGAG CTGCCAGGCC TGCCGACTTC GGAAGTGTTA CGAAGTGGGA 480
ATGGTGAAGT GTGGCTCCCG GAGAGAGAGA TGTGGGTACC GCCTTGTGCG GAGACAGAGA 540
AGTGCCGACG AGCAGCTGCA CTGTGCCGGC AAGGCCAAGA GAAGTGGCGG CCACGCGCCC 600
CGAGTGCGGG AGCTGCTGCT GGACGCCCTG AGCCCCGAGC AGCTAGTGCT CACCCTCCTG 660
GAGGCTGAGC CGCCCCATGT GCTGATCAGC CGCCCCAGTG CGCCCTTCAC CGAGGCCTCC 720
ATGATGATGT CCCTGACCAA GTTGGCCGAC AAGGAGTTGG TACACATGAT CAGCTGGGCC 780
AAGAAGATTC CCGGCTTTGT GGAGCTCAGC CTGTTCGACC AAGTGCGGCT CTTGGAGAGC 840
TGTTGGATGG AGGTGTTAAT GATGGGGCTG ATGTGGCGCT CAATTGACCA CCCCGGCAAG 900
CTCATCTTTG CTCCAGATCT TGTTCTGGAC AGGGATGAGG GGAAATGCGT AGAAGGAATT 960
CTGGAAATCT TTGACATGCT CCTGGCAACT ACTTCAAGGT TTCGAGAGTT AAAACTCCAA 1020
CACAAAGAAT ATCTCTGTGT CAAGGCCATG ATCCTGCTCA ATTCCAGTAT GTACCCTCTG 1080
GTCACAGCGA CCCAGGATGC TGACAGCAGC CGGAAGCTGG CTCACTTGCT GAACGCCGTG 1140
ACCGATGCTT TGGTTTGGGT GATTGCCAAG AGCGGCATCT CCTCCCAGCA GCAATCCATG 1200
CGCCTGGCTA ACCTCCTGAT GCTCCTGTCC CACGTCAGGC ATGCGAGTAA CAAGGGCATG 1260
GAACATCTGC TCAACATGAA GTGCAAAAAT GTGGTCCCAG TGTATGACCT GCTGCTGGAG 1320
ATGCTGAATG CCCACGTGCT TCGCGGGTGC AAGTCCTCCA TCACGGGGTC CGAGTGCAGC 1380
CCGGCAGAGG ACAGTAAAAG CAAAGAGGGC TCCCAGAACC CACAGTCTCA GTGA1434
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1251 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HU 221 411 Β1
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:
ATGAATTACA GCATTCCCAG ACAAGCCCAA ATGTGTTGTG CAGTTATCAC ATCTGTATGC GAACACACCT TACCTGTAAA GCCAGCCCTG TTACTGGTCC GATTACGCAT CGGGATATCA AAAAGAAGCA TTCAAGGACA GATAAAAACC GGCGCAAGAG ATGGTGAAGT GTGGCTCCCG AGTGCCGACG AGCAGCTGCA CGAGTGCGGG AGCTGCTGCT GAGGCTGAGC CGCCCCATGT ATGATGATGT CCCTGACCAA AAGAAGATTC CCGGCTTTGT TGTTGGATGG AGGTGTTAAT CTCATCTTTG CTCCAGATCT CTGGAAATCT TTGACATGCT CACAAAGAAT ATCTCTGTGT GTCACAGCGA CCCAGGATGC ACCGATGCTT TGGTTTGGGT CGCCTGGCTA ACCTCCTGAT A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZÉK A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
CAATGTCACT AACTTGGAAG GCCAACACCT GGGCACCTTT GGAACCTCAA AAGAGTCCCT CAGAGAGACA CTGAAAAGGA AGGTTCAAAG AGGGATGCTC CTATGGAGTC TGGTCGTGTG TAATGATTAT ATTTGTCCAG CTGCCAGGCC TGCCGACTTC GAGAGAGAGA TGTGGGTACC CTGTGCCGGC AAGGCCAAGA GGACGCCCTG AGCCCCGAGC GCTGATCAGC CGCCCCAGTG GTTGGCCGAC AAGGAGTTGG GGAGCTCAGC CTGTTCGACC GATGGGGCTG ATGTGGCGCT TGTTCTGGAC AGGGATGAGG CCTGGCAACT ACTTCAAGGT CAAGGCCATG ATCCTGCTCA TGACAGCAGC CGGAAGCTGG GATTGCCAAG AGCGGCATCT GCTCCTGTCC CACGTCAGGC 7ENCIA ADATAI:
GTGGGCCTGG
CTCCTTTAGT
GGTGTGAAGC
AGGTTAGTGG
ACTTCTGCGC
AAGGATGTAA
CTACAAATCA
GGAAGTGTTA
GCCTTGTGCG
GAAGTGGCGG
AGCTAGTGCT
CGCCCTTCAC
TACACATGAT
AAGTGCGGCT
CAATTGACCA
GGAAATGCGT
TTCGAGAGTT
ATTCCAGTAT
CTCACTTGCT
CCTCCCAGCA
ATGCGAGGTG
TCGGCAGACC GGTCCATCGC AAGATCGCTA GAACCGTTGC TGTCTGCAGC GGCCTTTTTT GTGTACAATC CGAAGTGGGA GAGACAGAGA CCACGCGCCC CACCCTCCTG CGAGGCCTCC CAGCTGGGCC CTTGGAGAGC CCCCGGCAAG AGAAGGAATT AAAACTCCAA GTACCCTCTG GAACGCCGTG GCAATCCATG A 1251
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
HOSSZA: 66 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Cys Al a Va 1 Cys Ser Asp Tyr Al a Ser Gly Tyr H i s Tyr Gly Va 1 Tr P
1 5 10 15
Ser Cy s Glu Gly Cy s Ly s Al a Phe Phe Ly s Arg Ser Ile Gin Gly Hi s
20 25 30
Asn As p Tyr I 1 e Cy s Pro Al a Thr Asn Gin Cy s Thr Ile Asp Ly s As n
35 40 45
Arg Arg Ly s Ser Cy s Gin Al a Cy s Arg Leu Arg Ly s Cys Tyr Glu Va 1
50 55 60
Gly Me t
65
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 233 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Val Leu Thr Le u Leu Glu Al a G1 u Pro Pr 0 Hi s Val Le u I le Ser
1 5 10 1 5
Arg Pro Ser Al a Pr 0 Phe Thr G1 u Al a Ser Me t Me t Me t Se r Leu Thr
20 25 30
Lys Leu Al a As p Ly s Glu Leu Va 1 Hi s Me t I 1 e Se Γ Trp Al a Ly s Ly s
35 40 45
Ile Pro Gly Phe Va 1 Glu Leu Se r Le u Phe As P G1 n Val Ar g Leu Leu
50 55 60
Glu Ser Cy s Trp Me t Glu Va 1 Le u Me t Me t G1 y Le u Me t Tr P Arg Ser
65 70 75 80
Ile As p Hi s Pro G1 y Ly s Leu I 1 e Ph e Al a Pr 0 As P Leu Va 1 Leu As p
85 90 95
HU 221 411 Β1
Arg As p Glu Gly 100 Ly s Cy s Val Glu Gly 105 Ile Le u Glu Ile Ph e 110 As p Me t
Leu Leu Al a Thr Thr Ser Arg Phe Arg Glu Leu Lys Leu Gin Hi s Ly s
115 120 125
Glu Tyr Leu Cy s Val Ly s Al a Me t Ile Leu Leu Asn Ser Ser Me t Tyr
130 135 140
Pro Leu Val Thr Al a Thr Gin As p Al a Asp Ser Ser Arg Ly s Leu Al a
145 150 155 160
Hi s Leu Leu Asn Al a Val Thr As p Al a Leu Val Trp Val Ile Alá Lys
165 170 175
Ser Gly Ile Ser Ser Gin Gin Gin Ser Me t Arg Leu Al a Asn Leu Leu
180 185 190
Me t Leu Leu Ser Hi s Val Arg Hi s Al a Ser Asn Ly s Gly Me t Glu Hi s
195 200 205
Leu Le u Asn Me t Ly s Cy s Ly s Asn Val Val Pro Val Tyr As p Leu Leu
210 215 220
Leu Glu Me t Le u Asn Al a Hi s Va 1 Leu
225 230
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 447 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen
MOLEKULATÍPUS: fehérje
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:
Me t As n Tyr Ser I 1 e Pro Ser As n Val Thr As n Leu Glu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Gly Arg Gin Thr Thr Ser Pro As n Va 1 Leu Trp Pro Thr Pro Gly Hi s
20 25 30
Leu Ser Pro Leu Va 1 Va 1 Hi s Arg Gin Leu Ser Hi s Leu Tyr Alá Glu
35 40 45
Pro Gin Ly s Ser Pro Trp Cy s Glu Al a Arg Ser Leu Glu Hi s Thr Leu
50 55 60
Pro Val Asn Arg Glu Thr Leu Ly s Arg Ly s Va 1 Ser Gly Asn Arg Cy s
65 70 75 80
Alá Ser Pro Va 1 Thr Gly Pro Gly Ser Ly s Arg As p Al a Hi s Phe Cy s
85 90 95
Al a Val Cy s Ser As p Tyr Al a Ser Gly Tyr Hi s Tyr Gly Val Trp Ser
100 105 110
Cys Glu Gly Cys Lys Al a Phe Phe Lys Arg Ser Ile G1 n Gly Hi s Asn
115 120 125
Asp Tyr I le Cys Pro Al a Thr As n Gin Cys Thr Ile Asp Ly s Asn Arg
130 135 140
Arg Lys Ser Cys Gin Al a Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly
145 150 155 160
Me t Val Lys Cy s Gly Ser Arg Arg Glu Arg Cys Gly Tyr Arg Leu Va 1
165 170 175
Arg Arg Gin Arg Ser Al a Asp Glu Gin Leu Hi s Cys Al a Gly Lys Al a
180 185 190
Ly s Arg Ser Gly Gly Hi s Al a Pro Arg Va 1 Arg Glu Leu Leu Leu As p
195 200 205
Al a Leu Ser Pro Glu Gin Leu Val Leu Thr Le u Leu G1 u Al a Glu Pro
210 215 220
Pr o Hi s Val Le u Ile Ser Arg Pro Ser Al a Pro Phe Thr Glu Al a Ser
225 230 235 240
Me t Me t Me t Ser Leu Thr Ly s Leu Al a As p Ly s Glu Leu Va 1 Hi s Me t
245 250 255
Ile Ser Trp Al a Ly s Ly s I 1 e Pro Gly Phe Va 1 Glu Leu Ser Leu Phe
260 265 270
HU 221 411 Β1
Asp Gin Val 275 Arg Le u Leu Glu Ser 280 Cy s Trp Met Glu Va 1 285 Leu Me t Me t
Gly Leu Me t Trp Arg Ser Ile As p Hi s Pro Gly Ly s Leu Ile Phe Al a
290 295 300
Pro As p Leu Val Leu Asp Arg As p Glu Gly Ly s Cy s Val Glu Gly Ile
305 310 315 320
Leu Glu Ile Phe As p Me t Leu Leu Al a Thr Thr Ser Arg Phe Arg Glu
325 330 335
Leu Ly s Leu Gin Hi s Ly s Glu Tyr Leu Cy s Va 1 Ly s Al a Me t Ile Le u
340 345 350
Leu As n Ser Ser Me t Tyr Pro Leu Val Thr Al a Thr Gin As p Al a Asp
355 360 365
Ser Ser Arg Ly s Leu Al a Hi s Leu Le u Asn Al a Val Thr Asp Alá Leu
370 375 380
Val Trp Va 1 Ile Al a Lys Ser Gly Ile Ser Ser Gin Gl n Gl n Ser Me t
385 390 395 400
Arg Leu Al a Asn Le u Leu Me t Leu Leu Ser Hi s Va 1 Arg Hi s Al a Ser
405 410 415
Asn Ly s Gly Me t Glu Hi s Leu Leu Asn Me t Ly s Cy s Ly s As n Va 1 Val
420 425 430
Pro Va 1 Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Me t Leu Asn Al a Hi s Va 1 Leu Arg
435 440 445
Gly Cy s Lys Ser Ser Ile Thr Gly Ser Glu Cy s Ser Pro Al a Glu As p
450 455 460
Ser Ly s Ser Ly s Glu Gly Ser Gin Asn Pro Gin Ser Gin
465 470 475
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 416 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen
MOLEKULATÍPUS: fehérje
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t As n Tyr Ser Ile Pro Ser Asn Val Thr As n Leu Glu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Gly Arg Gin Thr Thr Ser Pro As n Va 1 Leu Trp Pro Thr Pro Gly Hi s
20 25 30
Leu Ser Pro Leu Va 1 Va 1 Hi s Arg Gin Leu Ser Hi s Le u Tyr Al a Glu
35 40 45
Pro Gin Lys Ser Pr o Trp Cy s Glu Al a Arg Ser Leu Glu Hi s Thr Leu
50 55 60
Pro Val As n Arg Glu Thr Leu Ly s Arg Ly s Val Ser Gly Asn Arg Cys
65 70 75 80
Al a Ser Pro Val Thr Gly Pro Gly Ser Lys Arg Asp Al a Hi s Phe Cys
85 90 95
Al a Va 1 Cys Ser As p Tyr Al a Ser Gly Tyr Hi s Tyr Gly Val Trp Ser
100 105 110
Cys Glu Gly Cys Lys Al a Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gin Gly Hi s Asn
1 15 120 125
Asp Tyr Ile Cy s Pro Al a Thr Asn Gin Cy s Thr Ile Asp Ly s Asn Arg
130 135 140
Arg Ly s Ser Cys Gin Al a Cys Arg Le u Arg Ly s Cys Tyr Glu Val Gly
145 150 155 160
Me t Va 1 Ly s Cy s Gly Ser Arg Arg Glu Arg Cy s Gly Tyr Arg Leu Va 1
165 170 175
Arg Arg Gin Arg Ser Al a As p Glu Gin Le u Hi s Cys Al a Gl y Lys Al a
180 185 190
Ly s Arg Ser Gly Gly Hi s Al a Pro Arg Va 1 Arg Glu Leu Leu Leu As p
195 200 205
HU 221 411 Bl
Al a Leu 210 Ser Pro Glu Gin Leu 215 Va 1 Leu Thr Leu Le u 220 Glu Al a Gl u Pro
Pro Hi s Val Leu Ile Ser Arg Pro Ser Al a Pro Phe Thr Glu Al a Ser
225 230 235 240
Me t Me t Me t Ser Leu Thr Ly s Leu Al a As p Ly s Glu Leu Va 1 Hi s Me t
245 250 255
Ile Ser Trp Al a Ly s Lys Ile Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser Leu Phe
260 265 270
As p Gin Val Arg Leu Leu Glu Ser Cy s Trp Me t Glu Val Leu Me t Me t
275 280 285
Gly Le u Me t Trp Arg Ser Ile Asp Hi s Pro Gly Lys Leu Ile Phe Al a
290 295 300
Pro Asp Leu Val Leu Asp Arg As p Glu Gly Ly s Cys Val Glu Gly Ile
305 310 315 320
Leu Glu Ile Phe As p Me t Le u Leu Al a Thr Thr Ser Arg Phe Arg Glu
325 330 335
Leu Lys Leu Gl n Hi s Lys Glu Tyr Leu Cys Va 1 Ly s Al a Me t Ile Leu
340 345 350
Leu As n Ser Ser Me t Tyr Pro Leu Val Thr Al a Thr Gl n As p Al a As p
355 360 365
Ser Ser Arg Ly s Leu Alá Hi s Le u Leu Asn Al a Va 1 Thr As p Alá Leu
370 375 380
Val Trp Val Ile Al a Ly s Ser Gl y Ile Ser Ser Gin Gin Gin Ser Me t
385 390 395 400
Arg Le u Al a As n Leu Leu Me t Leu Leu Ser Hi s Va 1 Arg Hi s Al a Arg
405 410 415
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 29bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: mindkettő
TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGIGAYGARG CWTCIGGITG YCAYTAYGG 29
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 29 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAGCCTGGSA YICKYTTIGC CCAIYTIAT 29
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 22 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGTTACGAAG TGGGAATGGT GA 22
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HU 221 411 BI
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTGACACCAG ACCAACTGGT AATG 24
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG 24
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 22 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTACACTGAT TTGTAGCTGG AC 22
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCATGATGAT GTCCCTGACC 20
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGCATGCCT GACGTGGGAC 20
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCSTCCAGC ATCTCCAGSA RCAG 24
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGAAGCTGGC TCACTTGCTG 20
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HU 221 411 Bl
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCTTGTTCTG GACAGGGATG 20
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCATGGAACA TCTGCTCAAC 20
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCAAGTTCA GCCTGTTAAG T 21
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1257 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGAATTACA GCATTCCCAG CAATGTCACT AACTTGGAAG GTGGGCCTGG TCGGCAGACC ACAAGCCCAA ATGTGTTGTG GCCAACACCT GGGCACCTTT CTCCTTTAGT GGTCCATCGC CAGTTATCAC ATCTGTATGC GGAACCTCAA AAGAGTCCCT GGTGTGAAGC AAGATCGCTA GAACACACCT TACCTGTAAA CAGAGAGACA CTGAAAAGGA AGGTTAGTGG GAACCGTTGC GCCAGCCCTG TTACTGGTCC AGGTTCAAAG AGGGATGCTC ACTTCTGCGC TGTCTGCAGC GATTACGCAT CGGGATATCA CTATGGAGTC TGGTCGTGTG AAGGATGTAA GGCCTTTTTT AAAAGAAGCA TTCAAGGACA TAATGATTAT ATTTGTCCAG CTACAAATCA GTGTACAATC GATAAAAACC GGCGCAAGAG CTGCCAGGCC TGCCGACTTC GGAAGTGTTA CGAAGTGGGA ATGGTGAAGT GTGGCTCCCG GAGAGAGAGA TGTGGGTACC GCCTTGTGCG GAGACAGAGA AGTGCCGACG AGCAGCTGCA CTGTGCCGGC AAGGCCAAGA GAAGTGGCGG CCACGCGCCC CGAGTGCGGG AGCTGCTGCT GGACGCCCTG AGCCCCGAGC AGCTAGTGCT CACCCTCCTG GAGGCTGAGC CGCCCCATGT GCTGATCAGC CGCCCCAGTG CGCCCTTCAC CGAGGCCTCC ATGATGATGT CCCTGACCAA GTTGGCCGAC AAGGAGTTGG TACACATGAT CAGCTGGGCC AAGAAGATTC CCGGCTTTGT GGAGCTCAGC CTGTTCGACC AAGTGCGGCT CTTGGAGAGC TGTTGGATGG AGGTGTTAAT GATGGGGCTG ATGTGGCGCT CAATTGACCA CCCCGGCAAG CTCATCTTTG CTCCAGATCT TGTTCTGGAC AGGGATGAGG GGAAATGCGT AGAAGGAATT CTGGAAATCT TTGACATGCT CCTGGCAACT ACTTCAAGGT TTCGAGAGTT AAAACTCCAA CACAAAGAAT ATCTCTGTGT CAAGGCCATG ATCCTGCTCA ATTCCAGTAT GTACCCTCTG GTCACAGCGA CCCAGGATGC TGACAGCAGC CGGAAGCTGG CTCACTTGCT GAACGCCGTG ACCGATGCTT TGGTTTGGGT GATTGCCAAG AGCGGCATCT CCTCCCAGCA GCAATCCATG CGCCTGGCTA ACCTCCTGAT GCTCCTGTCC CACGTCAGGC ATGCGAGGTC TGCCTGA1257 A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 418 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
HU 221 411 Bl
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:
Val
Va 1 25 Gin
Al a
Arg
Ser
Gly 105 Ly s
Gin
Leu
Glu
Gin 185 Arg
Leu
Ser
Al a
Gly 265 Cy s
Hí s
Glu
Al a
Leu 345
Me t 1 Asn Tyr Ser Ile 5 Pro Ser As n
Gly Arg Gin Thr 20 Thr Ser Pro Asn
Leu Ser Pro 35 Leu Va 1 Va 1 Hi s Arg 40
Pro Gin 50 Lys Ser Pro Trp Cys 55 Glu
Pro 65 Va 1 Asn Arg G1 u Thr 70 Leu Ly s
Al a Ser Pro Val Thr 85 Gly Pro Gly
Al a Va 1 Cys Ser 100 As p Tyr Al a Ser
Cy s G1 u Gly 115 Cy s Ly s Al a Phe Phe 120
Asp Tyr 130 Ile Cy s Pro Al a Thr 135 Asn
Arg 145 Ly s Ser Cy s Gin Al a 150 Cy s Arg
Me t Va 1 Ly s Cy s Gly 165 Ser Arg Arg
Arg Arg Gin Arg 180 Ser Al a As p Glu
Ly s Arg Ser 195 Gly Gly Hi s Al a Pro 200
Al a Le u 210 Ser Pro Glu Gin Leu 215 Va 1
Pro 225 Hi s Val Leu Ile Ser 230 Arg Pro
Me t Me t Me t Ser Leu 245 Thr Ly s Leu
Ile Ser Trp Al a 260 Lys Lys Ile Pro
Asp Gin Val 275 Arg Leu Leu Glu Ser 280
Gly Leu 290 Me t Trp Arg Ser Ile 295 As p
Pro 305 As p Leu Val Leu Asp 310 Arg As p
Leu Glu Ile Phe As p 325 Me t Leu Le u
Leu Ly s Leu Gin 340 Hi s Ly s Glu Tyr
Leu Asn Ser 355 Ser Me t Tyr Pro Le u 360
Ser Ser 370 Arg Ly s Leu Al a Hi s 375 Le u
Val 385 Trp Val Ile Al a Ly s 390 Ser G1 y
Arg Le u Al a Asn Leu 405 Leu Me t Leu
Thr Asn Leu Glu Gly Gly Pro 10 15
Leu Trp Pro Thr Pro Gly His 30
Leu Ser His Leu Tyr Ala Glu 45
Arg Ser Leu Glu His Thr Leu 60
Lys Val Ser Gly Asn Arg Cys 75 80
Lys Arg Asp Ala His Phe Cys 90 95
Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser 110
Arg Ser Ile Gin Gly His Asn 125
Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg 140
Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly 155 160
Arg Cys Gly Tyr Arg Leu Val 170 175
Leu His Cys Ala Gly Lys Ala 190
Val Arg Glu Leu Leu Leu Asp 205
Thr Leu Leu Glu Ala Glu Pro 220
Ala Pro Phe Thr Glu Ala Ser 235 240
Asp Lys Glu Leu Val His Met 250 255
Phe Val Glu Leu Ser Leu Phe 270
Trp Met Glu Val Leu Met Met 285
Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala 300
Gly Lys Cys Val Glu Gly Ile 315 320
Thr Thr Ser Arg Phe Arg Glu 330 335
Cys Val Lys Ala Met Ile Leu 350
Val Thr Ala Thr Gin Asp Ala Asp 365
Leu Asn Ala Val Thr Asp Ala Leu 380
Ile Ser Ser Gin Gin Gin Ser Me t 395 400
Leu Ser His Val Arg His Ala Arg 410 415
Ser Ala
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 34bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HU 221 411 Bl
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA :
CTTGGATCCA TAGCCCTGCT GTGATGAATT ACAG 34
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATGGATCCT CACCTCAGGG CCAGGCGTCA CTG 33
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1898 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CACGAATCTT TGAGAACATT ATAATGACCT TTGTGCCTCT TCTTGCAAGG TGTTTTCTCA GCTGTTATCT CAAGACATGG ATATAAAAAA CTCACCATCT AGCCTTAATT CTCCTTCCTC CTACAACTGC AGTCAATCCA TCTTACCCCT GGAGCACGGC TCCATATACA TACCTTCCTC CTATGTAGAC AGCCACCATG AATATCCAGC CATGACATTC TATAGCCCTG CTGTGATGAA TTACAGCATT CCCAGCAATG TCACTAACTT GGAAGGTGGG CCTGGTCGGC AGACCACAAG CCCAAATGTG TTGTGGCCAA CACCTGGGCA CCTTTCTCCT TTAGTGGTCC ATCGCCAGTT ATCACATCTG TATGCGGAAC CTCAAAAGAG TCCCTGGTGT GAAGCAAGAT CGCTAGAACA CACCTTACCT GTAAACAGAG AGACACTGAA AAGGAAGGTT AGTGGGAACC GTTGCGCCAG CCCTGTTACT GGTCCAGGTT CAAAGAGGGA TGCTCACTTC TGCGCTGTCT GCAGCGATTA CGCATCGGGA TATCACTATG GAGTCTGGTC GTGTGAAGGA TGTAAGGCCT TTTTTAAAAG AAGCATTCAA GGACATAATG ATTATATTTG TCCAGCTACA AATCAGTGTA CAATCGATAA AAACCGGCGC AAGAGCTGCC AGGCCTGCCG ACTTCGGAAG TGTTACGAAG TGGGAATGGT GAAGTGTGGC TCCCGGAGAG AGAGATGTGG GTACCGCCTT GTGCGGAGAC AGAGAAGTGC CGACGAGCAG CTGCACTGTG CCGGCAAGGC CAAGAGAAGT GGCGGCCACG CGCCCCGAGT GCGGGAGCTG CTGCTGGACG CCCTGAGCCC CGAGCAGCTA GTGCTCACCC TCCTGGAGGC TGAGCCGCCC CATGTGCTGA TCAGCCGCCC CAGTGCGCCC TTCACCGAGG CCTCCATGAT GATGTCCCTG ACCAAGTTGG CCGACAAGGA GTTGGTACAC ATGATCAGCT GGGCCAAGAA GATTCCCGGC TTTGTGGAGC TCAGCCTGTT CGACCAAGTG CGGCTCTTGG AGAGCTGTTG GATGGAGGTG TTAATGATGG GGCTGATGTG GCGCTCAATT GACCACCCCG GCAAGCTCAT CTTTGCTCCA GATCTTGTTC TGGACAGGGA TGAGGGGAAA TGCGTAGAAG GAATTCTGGA AATCTTTGAC ATGCTCCTGG CAACTACTTC AAGGTTTCGA GAGTTAAAAC TCCAACACAA AGAATATCTC TGTGTCAAGG CCATGATCCT GCTCAATTCC AGTATGTACC CTCTGGTCAC AGCGACCCAG GATGCTGACA GCAGCCGGAA GCTGGCTCAC TTGCTGAACG CCGTGACCGA TGCTTTGGTT TGGGTGATTG CCAAGAGCGG CATCTCCTCC CAGCAGCAAT CCATGCGCCT GGCTAACCTC CTGATGCTCC TGTCCCACGT CAGGCATGCG AGTAACAAGG GCATGGAACA TCTGCTCAAC ATGAAGTGCA AAAATGTGGT CCCAGTGTAT GACCTGCTGC TGGAGATGCT GAATGCCCAC GTGCTTCGCG GGTGCAAGTC CTCCATCACG GGGTCCGAGT GCAGCCCGGC AGAGGACAGT AAAAGCAAAG AGGGCTCCCA GAACCCACAG TCTCAGTGAC GCCTGGCCCT GAGGTGAACT GGCCCACAGA GGTCACAAGC TGAAGCGTGA ACTCCAGTGT GTCAGGAGCC TGGGCTTCAT CTTTCTGCTG TGTGGTCCCT CATTTGGTGA TGGCAGGCTT GGTCATGTAC CATCCTTCCC TCCACCTTCC CAACTCTCAG GAGTCGGTGT GAGGAAGCCA TAGTTTCCCT TGTTAGCAGA GGGACATTTG AATCGAGCGT TTCCACAC 1898
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 530 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
HU 221 411 Bl
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 As p I le Lys As n 5 Ser Pro Ser Ser Leu 10 Asn Ser Pro Ser Ser 15 Tyr
Asn Cy s Ser Gin 20 Ser I le Leu Pro Leu 25 Glu Hi s Gly Ser I le 30 Tyr 1 le
Pro Ser Ser 35 Tyr Va 1 As p Ser Hi s 40 Hi s Glu Tyr Pro Al a 45 Me t Thr Phe
Tyr Ser 50 Pro Al a Va 1 Me t Asn 55 Tyr Ser I le Pro Ser 60 Asn Val Thr Asn
Leu 65 G1 u Gly Gly Pro Gly 70 Arg Gin Thr Thr Ser 75 Pro Asn Val Leu Trp 80
Pro Thr Pro Gly Hi s 85 Leu Ser Pro Leu Val 90 Va 1 Hi s Arg Gin Leu 95 Ser
Hi s Leu Tyr Al a 100 Glu Pro Gin Ly s Ser 105 Pro Trp Cy s Glu Al a 110 Arg Ser
Leu Glu Hi s 115 Thr Leu Pro Va 1 Asn 120 Arg Glu Thr Leu Ly s 125 Arg Ly s Va 1
Ser Gly 130 As n Arg Cy s Al a Ser 135 Pro Va 1 Thr Gly Pro 140 Gly Ser Lys Arg
As p 145 Al a Hi s Phe Cy s Al a 150 Val Cy s Ser As p Tyr 155 Al a Ser Gly Tyr Hi s 160
Tyr Gly Val Trp Ser 165 Cy s Glu Gly Cy s Ly s 170 Al a Phe Phe Ly s Arg 175 Ser
I le Gin Gly Hi s 180 As n As p Tyr I le Cys 185 Pro Al a Thr Asn Gin 190 Cy s Thr
I le As p Ly s 195 Asn Arg Arg Ly s Ser 200 Cy s Gin Al a Cy s Arg 205 Le u Arg Ly s
Cy s Tyr 210 Glu Va 1 Gly Me t Val 215 Ly s Cys Gly Ser Arg 220 Arg Glu Arg Cys
Gly 225 Tyr Arg Leu Va 1 Arg 230 Arg Gin Arg Ser Al a 235 Asp Glu Gin Leu Hi s 240
Cys Al a Gly Ly s Al a 245 Lys Arg Ser Gly Gly 250 Hi s Al a Pro Arg Val 255 Arg
Glu Leu Leu Leu 260 As p Al a Leu Ser Pro 265 Glu Gin Leu Val Leu 270 Thr Leu
Leu G1 u Al a 275 Glu Pro Pro Hi s Va 1 280 Leu I 1 e Ser Arg Pro 285 Ser Al a Pro
Phe Thr 290 Glu Al a Ser Me t Me t 295 Me t Ser Leu Thr Ly s 300 Leu Al a As p Ly s
Glu 305 Leu Val Hi s Me t I 1 e 310 Ser Trp Al a Ly s Ly s 315 I 1 e Pro Gly Phe Val 320
Glu Leu Ser Leu Phe 325 As p G1 n Va 1 Arg Leu 330 Leu Glu Ser Cy s Trp 335 Me t
Glu Va 1 Leu Me t 340 Me t Gly Leu Me t Trp 345 Arg Ser I le As p Hi s 350 Pro Gly
Ly s Leu I le 355 Phe Al a Pro As p Leu 360 Val Leu As p Arg As p 365 Glu Gly Ly s
Cys Va 1 370 Glu Gly I 1 e Leu Glu 375 I le Phe As p Me t Leu 380 Leu Al a Thr Thr
Ser 385 Arg Phe Arg Glu Leu 390 Ly s Le u G1 n Hi s Ly s 395 Glu Tyr Le u Cys Val 400
Ly s Al a Me t I le Leu 405 Leu Asn Ser Ser Me t 410 Tyr Pro Leu Va 1 Thr 415 Al a
Thr Gin Asp Al a 420 Asp Ser Ser Arg Ly s 425 Leu Al a H i s Leu Leu 430 Asn Al a
Val Thr Asp 435 Al a Leu Va 1 Trp Va 1 440 I le Al a Ly s Ser Gly 445 I le Ser Ser
Gin Gin 450 G1 n Ser Me t Arg Le u 455 Al a Asn Leu Leu Me t 460 Leu Leu Ser Hi s
HU 221 411 Bl
Va 1 465 Arg Hi s Al a Ser Asn 470 Ly s Gly Me t Glu Hi s 475 Leu Leu As n Me t Ly s 480
Cy s Ly s Asn Val Va 1 Pro Val Tyr As p Leu Leu Leu Glu Me t Leu Asn
485 490 495
Al a Hi s Val Leu Arg Gly Cy s Ly s Ser Ser lle Thr Gly Ser Glu Cy s
500 505 510
Ser Pro Al a Glu As p Ser Lys Ser Ly s Glu G1 y Ser Gin As n Pro Gin
515 520 525
Ser Gin
530
A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 30 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav
A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGCGGATCC TCTCAAGACA TGGATATAAA 30
A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav
A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGTAACAGGG CTGGCGCAAC GGTTC 25
A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 2 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav
A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACTGGCGATG GACCACTAAA GG 22

Claims (14)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Izolált DNS, amely olyan N-terminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmazó proteint kódol, amely DNS-kötő dómén aminosavszekvenciája legalább 80%-os homológiát mutat a 3. azonosító számú aminosavszekvenciával, és amely ligandumkötő dómén aminosavszekvenciája legalább 70%-os homológiát mutat a 4. azonosító számú aminosavszekvenciával.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti izolált DNS, amely olyan DNS-kötő domént kódol, melynek aminosavszekvenciája legalább 90%-os, előnyösen 95%-os, még előnyösebben 98%-os és legelőnyösebben 100%-os homológiát mutat a 3. azonosító számú aminosavszekvenciával.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti izolált DNS, amely olyan ligandumkötő domént kódol, melynek aminosavszekvenciája legalább 75%-os, előnyösen 80%os, még előnyösebben 90%-os és legelőnyösebben
    100%-os homológiát mutat a 4. azonosító számú aminosavszekvenciával.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti izolált DNS, amely 5., 6., 21. vagy 25. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazó proteint kódol.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti izolált DNS, amely 1., 2., 20. vagy 24. azonosító számú nukleotid-szekvenciát tartalmaz.
  6. 6. Rekombináns expressziós vektor, amely 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-t tartalmaz.
  7. 7. Transzfektált sejt, amely 1-5. igénypont szerinti DNS-ek bármelyikével vagy a 6. igénypont szerinti expressziós vektorral van transzformálva.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti sejt, amely 9-11. igénypontok bármelyike szerinti szteroidreceptor-proteint expresszáló, stabilan transzfektált sejtvonal.
  9. 9. Protein, melyet 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS vagy 6. igénypont szerinti expressziós vektor kódol.
    HU 221 411 Β1
  10. 10. A 9. igénypont szerinti protein, amely 5., 6., 21. vagy 25. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmaz.
  11. 11. Kiméra protein, amely N-terminális domént, DNS-kötő domént és ligandumkötő domént tartalmaz, amely doménok legalább egyike a 9. vagy 10. igénypontok szerinti proteinből származik, és a kiméra protein további doménjainak legalább egyike egy másik, a sejtmagi hormonreceptorok főcsaládjába tartozó receptorproteinből származik, azzal a kikötéssel, hogy a ki- 10 méra protein DNS-kötő doménja és ligandumkötő doménja különböző proteinekből származik.
  12. 12. DNS, amely 11. igénypont szerinti proteint kódol.
  13. 13. Az 1., 5. vagy 12. igénypontok szerinti DNS, a 15 6. igénypont szerinti expressziós vektor, a 7. vagy 8. igénypont szerinti sejt vagy a 9-11. igénypontok bármelyike szerinti protein alkalmazása szűrővizsgálatokban, új hatóanyagok azonosítására.
  14. 14. Eljárás a 9-11. igénypontok bármelyike szerinti protein funkcionális ligandumának azonosítására, azzal 5 jellemezve, hogy
    i) megfelelő gazdasejtbe 1) 1., 5. vagy 12. igénypont szerinti DNS-t juttatunk; valamint 2) egy működőképes, hormonválaszt közvetítő elemhez (HRE-hez) funkcionálisan kapcsolt, megfelelő riportergént juttatunk; azzal a kikötéssel, hogy a HRE-t a DNS által kódolt protein DNS-kötő doménja aktiválni képes;
    ii) az i) lépés szerinti gazdasejteket feltételezett ligandumokkal érintkeztetjük, amelyek adott esetben az i) lépés szerinti DNS által kódolt protein ligandumkötő doménjához kötődnek;
    iii) az i) lépés szerinti riportergén által kódolt protein expresszióját nyomon követjük.
HU9700636A 1996-03-26 1997-03-24 Novel estrogen receptor HU221411B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96200820 1996-03-26
EP96203284 1996-11-11

Publications (4)

Publication Number Publication Date
HU9700636D0 HU9700636D0 (en) 1997-05-28
HUP9700636A2 HUP9700636A2 (hu) 1998-04-28
HUP9700636A3 HUP9700636A3 (en) 1999-01-28
HU221411B1 true HU221411B1 (en) 2002-09-28

Family

ID=26142641

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9700636A HU221411B1 (en) 1996-03-26 1997-03-24 Novel estrogen receptor

Country Status (13)

Country Link
US (3) US7060490B1 (hu)
EP (2) EP1162264A3 (hu)
JP (1) JPH104986A (hu)
KR (1) KR19980041692A (hu)
AT (1) ATE212055T1 (hu)
AU (1) AU715812B2 (hu)
CA (1) CA2200423C (hu)
DE (2) DE798378T1 (hu)
DK (1) DK0798378T3 (hu)
ES (1) ES2123482T3 (hu)
GR (1) GR980300076T1 (hu)
HK (1) HK1001978A1 (hu)
HU (1) HU221411B1 (hu)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69603827T3 (de) 1995-09-08 2009-11-05 Karo Bio Ab Östrogen-Rezeptor
US7157568B1 (en) 1997-08-05 2007-01-02 American Home Products Corporation Human estrogen receptor-β
AU747049B2 (en) * 1997-09-08 2002-05-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Estrogen receptor
US6222015B1 (en) 1997-09-08 2001-04-24 Merck & Co., Inc. Estrogen receptor
DE19839115A1 (de) * 1998-08-27 2000-03-09 Ihf Inst Fuer Hormon Und Fortp Klonierung und Expression von Rinder Estrogenrezeptor-beta
ATE222922T1 (de) 1998-11-20 2002-09-15 Akzo Nobel Nv Estrogenische estra-1,3,5(10)-trien verbindungen mit verschiedenen wirkungen auf estrogenrezeptor alpha und beta mit einer unverzweigten kohlenwasserstoffkette von 5-9 kohlenstoffatomen in position 11
DE19855013C2 (de) * 1998-11-20 2001-09-13 Schering Ag Androgen- und Progesteron-Rezeptor bindendes Hormon Response Element
DE60004377T2 (de) * 1999-04-06 2004-06-09 Akzo Nobel N.V. Oral wirksame 7-alpha-alkyl androgene
ATE529419T1 (de) 2000-03-01 2011-11-15 Organon Nv Chromanderivate als estrogene verbindungen
WO2001070816A2 (en) * 2000-03-22 2001-09-27 Rohm And Haas Company Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
TWI225068B (en) 2000-06-06 2004-12-11 Akzo Nobel Nv Anellated steroid compounds having contraceptive and anti-osteoporosis activity
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
US8715959B2 (en) 2001-02-20 2014-05-06 Intrexon Corporation Substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
DK1456346T3 (da) 2001-02-20 2012-05-29 Intrexon Corp Nyt inducerbart genekspressionssystem baseret på ecdysonreceptor/invertebrat-retinoid-x-receptor
WO2002066615A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Rheogene, Inc. Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
ES2424812T3 (es) 2001-02-20 2013-10-08 Intrexon Corporation Receptores X retinoides quiméricos y su uso en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso
AU2002333682A1 (en) * 2001-08-02 2003-02-17 Gencell S.A. Inducible expression systems employing ppar transcriptional activators
EP1288303A1 (en) * 2001-08-23 2003-03-05 Aventis Pharma S.A. Inducible expression systems employing PPAR transcriptional activators
CA2459827C (en) 2001-09-26 2013-09-03 Subba Reddy Palli Leafhopper ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
US20030077645A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-24 Hager Gordon L. Superfamily receptor chimeras, translocation assay for superfamily receptor ligands, and methods and kits for detecting and characterizing receptor ligands
TW200304371A (en) 2002-02-22 2003-10-01 Akzo Nobel Nv Substituted 10-ary1-11H-benzo [b] fluorenes and 7-ary1-5, 6-dihydro-benz [a] anthracenes for selective effects on estrogen receptors
US7674783B2 (en) 2002-11-22 2010-03-09 Dimera Inc. Estrogen beta receptor agonists to prevent or reduce the severity of cardiovascular disease
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
UA89964C2 (ru) 2004-09-08 2010-03-25 Н.В. Органон 15β-ЗАМЕЩЕННЫЕ СТЕРОИДЫ, КОТОРЫЕ ИМЕЮТ СЕЛЕКТИВНУЮ ЭСТРОГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ
CN105283439B (zh) 2013-03-15 2018-02-02 英特瑞克斯顿股份有限公司 含硼的二酰基肼类化合物
MX2017003403A (es) 2014-09-17 2017-06-19 Intrexon Corp Compuestos de diacilhidrazina que contienen boro.

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0258401A4 (en) * 1986-02-20 1989-06-13 California Biotechnology Inc EUKARYOTIC EXPRESSION OF STEROID RECEPTOR PROTEINS.
US5217867A (en) * 1988-11-30 1993-06-08 The Salk Institute For Biological Studies Receptors: their identification, characterization, preparation and use
FR2649994A1 (fr) * 1989-06-30 1991-01-25 Aderegem Procede d'obtention d'un recepteur humain natif sauvage des oestrogenes et ses applications
AU8951191A (en) * 1990-10-29 1992-05-26 Dekalb Plant Genetics Isolation of biological materials using magnetic particles
EP0609240B1 (en) * 1991-09-17 2002-04-03 The Salk Institute For Biological Studies Receptors of the thyroid/steroid hormone receptor superfamily
DE69603827T3 (de) * 1995-09-08 2009-11-05 Karo Bio Ab Östrogen-Rezeptor
US7157568B1 (en) * 1997-08-05 2007-01-02 American Home Products Corporation Human estrogen receptor-β

Also Published As

Publication number Publication date
GR980300076T1 (en) 1998-11-30
DE69709561T2 (de) 2002-08-29
HUP9700636A2 (hu) 1998-04-28
US7060490B1 (en) 2006-06-13
DE69709561D1 (de) 2002-02-21
EP0798378A3 (en) 1997-12-29
JPH104986A (ja) 1998-01-13
EP1162264A3 (en) 2002-05-15
AU715812B2 (en) 2000-02-10
ES2123482T3 (es) 2002-11-01
KR19980041692A (ko) 1998-08-17
US6680368B1 (en) 2004-01-20
DK0798378T3 (da) 2002-04-29
US6713270B1 (en) 2004-03-30
HU9700636D0 (en) 1997-05-28
HUP9700636A3 (en) 1999-01-28
CA2200423A1 (en) 1997-09-26
AU1652197A (en) 1997-10-02
DE798378T1 (de) 1999-03-04
HK1001978A1 (en) 1998-07-24
ES2123482T1 (es) 1999-01-16
ATE212055T1 (de) 2002-02-15
EP1162264A2 (en) 2001-12-12
CA2200423C (en) 2006-12-19
EP0798378B1 (en) 2002-01-16
EP0798378A2 (en) 1997-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221411B1 (en) Novel estrogen receptor
Yeh et al. Cloning and characterization of a specific coactivator, ARA70, for the androgen receptor in human prostate cells.
Thuerauf et al. Regulation of rat brain natriuretic peptide transcription. A potential role for GATA-related transcription factors in myocardial cell gene expression.
Cho et al. Mosquito ecdysteroid receptor: analysis of the cDNA and expression during vitellogenesis
US5639616A (en) Isolated nucleic acid encoding a ubiquitous nuclear receptor
AU685054B2 (en) Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy
AU616389B2 (en) Hormone receptor compositions and methods
US7297781B2 (en) Genetic sequences encoding steroid and juvenile hormone receptor polypeptides and insecticidal modalities therefor
US20050186617A1 (en) Gene screening method using nuclear receptor
Liu et al. Functional analysis of estrogen-responsive elements in chinook salmon (Oncorhynchus tschawytscha) gonadotropin II beta subunit gene
AU5514100A (en) Novel genetic sequences encoding steroid and juvenile hormone receptor polypeptides and uses therefor
Jehan et al. The mouse vitamin D receptor is mainly expressed through an Sp1-driven promoter in vivo
Chen et al. Phenylalanine-780 near the C-terminus of the mouse glucocorticoid receptor is important for ligand binding affinity and specificity.
Ezashi et al. Genomic organization and characterization of the gene encoding bovine prostaglandin F2α receptor
US20030162257A1 (en) Nucleic acid molecule encoding a novel estrogen receptor beta variant
JP4474694B2 (ja) 化学物質のアンドロゲンレセプター活性調節能の測定用細胞
JP2002247986A (ja) 性ホルモン受容体作用評価に有用な細胞
AU776572B2 (en) Gene screening method using nuclear receptor
EP1544307A1 (en) LAC9 chimeric receptor and uses thereof
WO1998056908A1 (fr) Proteines isoformes du recepteur de la vitamine d
LIUT et al. Functional Analysis of Estrogen-Responsive Elements in Chinook Salmon (Oncorhynchus tschawytscha) Gonadotropin IIP Subunit Gene
WO1997047172A1 (fr) Proteine isoforme du recepteur de la vitamine d
JP2000300258A (ja) 化学物質のエストロゲンレセプター活性調節能の測定用細胞

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee