KR102613289B1 - 아세테이트 착물 및 아세테이트 정량화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아세테이트 정량화 방법 및 그 아세테이트 정량화 방법에서 유용한 아세테이트 착물에 관한 것이다. 그러한 방법 및 착물은, MRI 및 NMR 분광학에서 조영제 품질 관리를 위한 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 측정하는 것을 비롯한, 아세테이트 정량화가 요구되는 임의의 응용분야에 유용하다. 그 개시된 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 설포살리실란으로부터 그리고 아세테이트, Fe3 + 및 살리실산으로부터 제조될 수 있다.

Description

아세테이트 착물 및 아세테이트 정량화 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2015년 10월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제14/884,992호를 우선권 주장의 기초 출원으로 한 것이고, 그 출원의 전체 내용은 본원에 참고 인용되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 아세테이트 정량화 방법 및 아세테이트 정량화 방법에 유용한 아세테이트 착물에 관한 것이다. 그러한 방법 및 착물은 MRI 및 NMR 분광법에서 사용하기 위한 조영제 품질 관리에 대한 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 측정하는 것을 비롯한, 아세테이트 정량화가 요구되는 임의의 응용분야에 유용하다.
약학 제품의 품질 관리("QC") 분석은 건강 관리 분야에서 사용되는 제품의 안전성을 보장하며 그리고 유용하지 않은 사양 제품이 환자 내로 진입할 위험을 제거하는 데 도움을 주는 필수적인 작업이다. 일부 실제 예에서, 약학 제품의 QC는 그 제품의 제조 직후 및 환자에 대한 주입 직전에 수행되어야 한다. 최종 제조가 주입 직전에 실시되는 약학 제품의 한가지 예로는 MRI 및 NMR 분광법에서 사용하기 위한 과분극화 조영제(hyperpolarized imaging agent)가 있다.
MRI 및 NMR 분광법에서 사용하기 위한 조영제의 과분극화는 조영제에서의 감도를 증가시키기 위해 수행된다. 그러나, 그러한 과분극화는, 과분극화 조영제가 매우 짧은 수명 영역을 갖고 있기 때문에, 그 조영제를 환자에게 주입하기 직전에만 수행되어야 한다. 즉, 조영제는 이의 제조원으로부터 의도한 최종 용도(즉, 환자에 대한 주입)의 위치로 단지 수분 내에 신속하게 전달되어야 한다. 이러한 제품에서는, 주입 직전에 수행된 QC 분석이 유일한 옵션이 된다. 추가로, QC 분석은 환자에게 임의의 추가 화학 물질을 도입하여 약학 제품의 멸균성을 보존하는 일 없이 짧은 시간 내에 수행되어야 한다. 이러한 QC 분석을 위한 장치는 공지되어 있으며, 그의 설명은 예를 들어 미국 특허 제7,803,320호, 제7,519,492호 및 제7,610,157호에서 확인할 수 있다.
일반적인 과분극화 조영제는, 예를 들어 미국 특허 제8,731,640호, 제8,763,410호 및 제7,633,290호에 개시된 바와 같이, 13C1-피루베이트이다. 피루베이트 이외에도, 아세테이트가 다수의 대사 과정에 중요한 것으로 공지되어 있다. 그러나, 자외선 흡수에 의해 쉽게 측정될 수 있는 피루베이트와는 달리, 아세테이트는 QC 목적으로는 그러한 흡수를 갖고 있지 않다. 아세테이트 시약으로부터의 거의 즉각적이고 강력한 신호는 13C QC 요건을 충족시키는 데 중요하다. 예를 들어, 미국 특허 제4,035,239호에 기재된 바와 같이, 효소 기반 검출 방법을 이용하는 아세테이트에 대한 공지된 검정(assay)이 존재한다. 그러나, 효소 기반 아세테이트 검정 방법은 시간 소모적이며, 이는 과분극화 아세테이트의 매우 짧은 수명 영역에 기인하여 과분극화 아세테이트의 QC에 그 검정 방법이 적합하지 않게 한다. 추가로, 효소 기반 아세테이트 검정 방법은 비용이 많이 든다. 게다가, 효소 뱃치에 있어서 안정성 및 활성 차이에 기인하여, 공지된 아세테이트 표준물질을 사용하는 추가 보정 단계가 일반적으로 요구된다.
문헌에는 또한 Fe(III) 이온의 존재하에 로다민 6G-페닐우레아(RGPU) 컨쥬게이트에 기초한 아세테이트 이온에 대한 비색 및 형광 검정도 보고되어 있다(Hu et al., Chem. Commun., 47 : 1622-1624 (2011)). 이러한 검정에서, 아세테이트 이온의 첨가는 RGPU-Fe 착물의 해리 및 유리 RGPU의 방출을 촉진하게 되며, 이는 결과적으로 형광성에서의 변화 및 분홍색에서 무색으로의 색상 이동을 초래하게 된다. 이 RGPU 기반 검정의 반응 매질은 물과 아세토 니트릴의 1:1 혼합물이며, 검출 가능한 아세테이트 농도 범위는 0-200 nM이다. 그러나, 이 농도 범위는 과분극화 조영제의 QC에 대해 요구되는 것보다 낮은 약 6 차수 크기이다. 또한 이 RGPU 기반 검정은 100% 수용액에서 작동하지 않으므로, 아세테이트 농도를 조정하기 위해 그리고 최적의 검정 조건을 위한 아세테이트를 함유하는 액상 조성물의 특성을 조정하기 위해 복수의 희석 단계를 필요로 한다. 따라서, RGPU 기반 방법은 번거롭고, 시간 소모적이며, 신뢰성이 없다. 따라서, 바람직하게는 용매로서 물을 사용하는 신속하고 저렴한 아세테이트 검정 방법에 대한 필요성이 있어 왔다. 본원에 개시된 방법 및 착물은 이러한 필요성을 해결하며, 과분극화 아세테이트 조영제의 검정(이에 국한되는 것은 아님)을 비롯한, 광범위하게 다양한 응용분야에서 아세테이트를 검정하는데 이용될 수 있다.
발명의 개요
본 발명의 실시양태들은 종래이 아세테이트 검정 방법과 연관된 상기 논의된 단점들을 극복한 한 것들이다.
본 발명자들은 아세테이트 정량화에 유용한 신규한 아세테이트 착물을 발견하게 되었다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 아세테이트 착물에 관한 것이며, 여기서 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 화학식(Ia)의 화합물 또는 화학식(Ib)의 화합물을 포함한다:
화학식(Ia)
화학식(Ib)
상기 식 중에서, R1은 -OH 또는 -O-이고, R2는 -OH 또는 -O-이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 아세테이트 착물 및 용매를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ia)의 화합물 또는 화학식(Ib)의 화합물을 포함한다:
화학식(Ia)
화학식(Ib)
상기 식 중에서, R1은 -OH 또는 -O-이고, R2는 -OH 또는 -O-이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 시료내 아세테이트의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시켜 아세테이트 착물을 형성시키는 접촉 단계로서, 산 화합물은 설포살리실산 및 살리실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접촉 단계, 및 아세테이트 착물을 광도계 측정하여 시료내 아세테이트 농도를 결정하는 측정 단계를 포함하고, 산 화합물이 설포살리실산일 때, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 +, 및 하기 화학식(Ia)의 화합물을 포함하고, 산 화합물이 살리실산일 때, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ib)의 화합물을 포함한다:
화학식(Ia)
화학식(Ib)
상기 식 중에서, R1은 -OH 또는 -O-이고, R2는 -OH 또는 -O-이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시켜 아세테이트 착물을 형성시키는 접촉 단계로서, 산 화합물은 설포살리실산 및 살리실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접촉 단계, 및 아세테이트 착물을 광도계 측정하여 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 결정하는 측정 단계를 포함하며, 산 화합물이 설포살리실산일 때, 아세테이트 착물은 13C 과분극화 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ia)의 화합물을 포함하고, 산 화합물이 살리실산일 때, 아세테이트 착물은 13C 과분극화 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ib)의 화합물을 포함한다:
화학식(Ia)
화학식(Ib)
상기 식 중에서, R1은 -OH 또는 -O-이고, R2는 -OH 또는 -O-이다.
유리하게도, 본 발명의 실시양태에 따른 방법은 저렴하고, 현행 피루베이트 기반 정량 플랫폼과 호환성이 있으며, 그리고 신속하고 정확한 아세테이트 정량화를 허용한다. 게다가, 본 발명의 실시양태에 따른 방법은 용매로서 물에 의해 용이하게 이용될 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따른 아세테이트 착물 및 방법의 본원에 기술되어 있는 새롭고 유리한 특색들은 종래의 아세테이트 검정 방법의 단점들을 극복하고 있다.
본 발명의 이러한 특색, 양태 및 이점, 및 다른 특색, 양태 및 이점은 후술하는 상세한 설명을 첨부되어 있는 도면 전반에 걸쳐 유사 문자가 유사 부분을 나타내는 도면을 참조하여 읽을 때 보다 잘 이해할 수 있을 것이다. 상기 도면을 간단히 설명하면, 다음과 같다.
도 1은 수용액 중의 Fe3+/SSA 착물의 잡 플롯(Job plot)을 도시한 것이다.
도 2는 일련의 Fe/SSA/아세테이트의 혼합물의 흡광도 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 아세테이트의 몰 분율에 대한 450 nm 흡광도의 잡 플롯을 도시한 것이다.
도 4는 아세테이트/Fe/SSA 착물의 흡광도 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5는 아세테이트/Fe/SSA 착물의 흡광도를 기초로 하여 2가지 상이한 pH 조건에서 아세테이트 표준물질의 보정 곡선을 도시한 것이다.
도 6은 전달 함수 연구의 결과들의 그래픽 표현을 도시한 것이다.
도 7은 수용액 중의 Fe3+/SA 착물의 잡 플롯을 도시한 것이다.
도 8은 일련의 Fe/SA/아세테이트 혼합물의 흡광도 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 9는 아세테이트의 몰 분율에 대한 465 nm 흡광도의 잡 플롯을 도시한 것이다.
도 10은 아세테이트/Fe/SA 착물의 흡광도를 기초로 하여 아세테이트 표준물질의 보정 곡선을 도시한 것이다.
도 11은 QC 광학 모듈을 이용하는 아세테이트 QC 방법에 영향을 미치는 인자의 특성 요인도(cause-and-effect diagram)를 도시한 것이다.
도 12는 과분극화 13C 아세테이트 QC에 있어서 잠재적인 유체 경로 바닥 판 설계의 개략도를 도시한 것이다.
후술하는 명세서 및 후술하는 청구범위에서는, 하기 의미들을 갖는 것으로 정의되어야 하는 다수의 용어가 언급될 수 있다.
단수 형태 부정 관사 및 정관사는 내용이 명확하게 반대 지시하고 있지 않은 한 복수의 지시대상을 포함한다.
명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 본원에서 사용되는 바와 같이 근사치 언어는 이 언어가 언급하고 있는 기본적인 기능에서의 변화를 결과적으로 초래하는 일 없이 허용 가능하게 다양할 수 있는 임의의 정량적 표현을 수정하는 데 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어(들)에 의해 수정된 값은 명시된 정확한 값으로 국한되지 않아야 한다. 일부 실제 예에서, 근사치 언어는 그 값을 측정하는 기기의 정밀도에 상응할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "광도계 측정"이란 용어는 광을 측정하는 모든 방법을 의미한다. 따라서, 광도계 측정은 비색법에 의한 흡광도 측정을 비롯한 흡광도 측정을 포함한다. 광 흡광도를 비롯하여 광을 측정하기에 적합한 방법은 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 오션 옵틱스(Ocean Optics) 섬유 광학 분광계는 흡광도를 측정하여 흡광도 값을 결정하는 데 사용될 수 있다. 웰-플레이트 리더(well-plate reader) 또는 UV-Vis 분광계가 흡광도를 측정하는데 사용될 수 있다. 더구나, LED와 같은 광원 및 광다이오드와 같은 광 검출기가 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 광도계 측정으로부터의 아세테이트 농도의 결정은 실시 예 섹션에서 제공된 전달 함수 방정식(transfer function equation)을 이용함으로써 수행될 수 있다. 또한, 광도계 측정으로부터의 아세테이트 농도의 결정은, 보정 곡선을 얻기 위해서 기지의 아세테이트 농도를 갖는 기준 시료로 실험을 실시함으로써 수행될 수 있다. 이어서, 그 얻어진 보정 곡선은 미지의 아세테이트 농도를 지닌 시료로부터 아세테이트 농도를 결정하는 데 이용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 13C 과분극화 아세테이트의 품질 관리를 위한 설계된 장치"라는 용어는 과분극화 조영제의 QC에서 사용될 수 있는 모든 장치를 의미하며, 여기서 그 장치는 본원에 개시된 하나 이상의 아세테이트 착물을 광도계 측정하기 위해서 구비되어 있다. 예를 들면, 기지의 과분극화 피루베이트 QC 장치는 본원에 개시된 하나 이상의 아세테이트 착물을 광도계 측정하는데 적합하게 될 수 있다. 그러한 장치의 한가지 잠재적 실시예는 실시예 13에 기술되어 있다.
본 발명은 아세테이트 검정 방법 및 개시된 아세테이트 검정 방법에서 유용한 아세테이트 착물에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 아세테이트, Fe3+ 및 하기 화학식(Ia)의 화합물 또는 하기 화학식(Ib)의 화합물을 포함하는 아세테이트 착물에 관한 것이다:
화학식(Ia)
화학식(Ib)
상기 식 중에서, R1은 -OH 또는 -O-이고, R2는 -OH 또는 -O-이다.
하나의 실시양태에서, 아세테이트 착물에서 아세테이트는 13C 과분극화 아세테이트이다. 또다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 화학식(Ia)의 화합물을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트]3n([Fe3+][화학식(Ia)])n을 가지며, 여기서 n은 1 내지 3의 정수이다. 따라서, n은 1, 2 또는 3일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 화학식(Ib)의 화합물을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트][Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트]m[Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]p을 가질 수 있으며, 여기서 m은 1 내지 3의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수이다. 따라서, m은 1, 2 또는 3일 수 있다. 게다가, p는 1, 2 또는 3일 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트][Fe3 +][화학식(Ib)의 화합물]을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 [아세테이트]2[Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]2을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트]3[Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]3을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 착물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 아세테이트 착물 및 용매를 포함하는 조성물로서, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ia)의 화합물 또는 하기 화학식(Ib)의 화합물을 포함하는 것인 조성물에 관한 것이다:
화학식(Ia)
화학식(Ib)
상기 식 중에서, R1은 -OH 또는 -O-이고, R2는 -OH 또는 -O-이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물 내 아세테이트는 13C 과분극화 아세테이트이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3+ 및 화학식(Ia)의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 [아세테이트]3n([Fe3 +][화학식(Ia)의 화합물)])n을 가지며, 여기서 n은 1 내지 3의 정수이다. 하나의 실시양태에서, n은 1이다. 또다른 실시양태에서, n은 2이다. 또다른 실시양태에서, n은 3이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3+ 및 화학식(Ib)의 화합물을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트][Fe3 +][화학식(Ib)의 화합물]을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트]m[Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]p을 가질 수 있으며, 여기서 m은 1 내지 3의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수이다. 따라서, m은 1, 2 또는 3일 수 있다. 더구나, p는 1, 2 또는 3일 수 있다.
본 발명의 조성물은 에틸렌디아민테트라아세트산("EDTA") 및 금속 이온을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 금속 이온은 Zn2 +, Cu2 + 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 버퍼를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물내 용매는 수성 용매이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물내 용매는 물이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 시료내 아세테이트의 농도를 측정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시켜 아세테이트 착물을 형성시키는 접촉 단계로서, 산 화합물은 설포살리실산 및 살리실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접촉 단계, 및 아세테이트 착물을 광도계 측정하여 시료내 아세테이트의 농도를 결정하는 측정 단계를 포함하며, 여기서 산 화합물이 설포살리실산일 때, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ia)의 화합물을 포함하고, 산 화합물이 살리실산일 때, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 화학식(Ib)의 화합물을 포함한다:
화학식(Ia)
화학식(Ib)
상기 식 중에서, R1은 -OH 또는 -O-이고, R2는 -OH 또는 -O-이다.
하나의 실시양태에서, 시료내 아세테이트는 13C 과분극화 아세테이트이다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 13C 과분극화 아세테이트의 품질 관리를 위한 설계된 장치를 이용하여 수행된다.
하나의 실시양태에서, 산 화합물은 설포살리실산이고, 광도계 측정 단계는 약 350 nm 내지 약 550 nm의 광 파장에서 아세테이트 착물의 흡광도 값을 측정하는 단계; 및 아세테이트 착물의 흡광도 값으로부터 시료내 아세테이트의 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법에 사용된 광 파장은 또한 약 430 nm 내지 약 470 nm일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 산 화합물은 살리실산이고, 광도계 측정 단계는 약 400 nm 내지 약 650 nm의 광 파장에서 아세테이트 착물의 흡광도 값을 측정하는 단계; 및 아세테이트 착물의 흡광도 값으로부터 시료내 아세테이트의 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 본 방법에서 사용된 광 파장은 또한 약 400 nm 내지 약 520 nm일 수 있다.
기술된 방법에서 시료는 아세테이트 및 수성 용매를 포함할 수 있다. 시료는 버퍼를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본원에서 개시된 방법의 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트]3n([Fe3+][화학식(Ia)의 화합물])n을 가질 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 3의 정수이다. 따라서, n은 1, 2 또는 3일 수 있다.
또다른 실시양탱서, 본원에 개시된 방법의 아세테이트 착물은 [아세테이트][Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트]m[Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]p를 가질 수 있으며, 여기서 m은 1 내지 3의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수이다. 따라서, m은 1, 2 또는 3일 수 있다. 게다가, p는 1, 2 또는 3일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시키는 단계는 시료를 시약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 시약 조성물은 Fe3 +-설포살리실산 착물 또는 Fe3 +-살리실산 착물을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 시약 조성물은 액체이다. 또다른 실시양태에서, 시약 조성물은 건조 분말이다.
하나의 실시양태에서, 시료는 EDTA를 추가로 포함하고, 시약 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하며, 여기서 금속 이온 Zn2 +, Cu2 + 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 시약 조성물은 버퍼를 추가로 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 측정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시켜 아세테이트 착물을 형성시키는 접촉 단계로서, 산 화합물은 설포살리실산 및 살리실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접촉 단계, 및 아세테이트 착물을 광도계 측정하여 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 결정하는 측정 단계를 포함하며, 여기서 산 화합물이 설포살리실산일 때, 아세테이트 착물은 13C 과분극화 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ia)의 화합물을 포함하고, 산 화합물이 살리실산일 때, 아세테이트 착물은 13C 과분극화 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ib)의 화합물을 포함한다:
화학식(Ia)
화학식(Ib)
상기 식 중에서, R1은 -OH 또는 -O-이고, R2는 -OH 또는 -O-이다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법은 13C 과분극화 아세테이트의 품질 관리를 위한 설계된 장치를 사용하여 수행된다.
하나의 실시양태에서, 산 화합물은 설포살리실산이고, 광도계 측정 단계는 약 350 nm 내지 약 550 nm의 광 파장에서 아세테이트 착물의 흡광도 값을 측정하는 단계; 및 아세테이트 착물의 흡광도 값으로부터 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법에서 사용된 광 파장은 또한 약 430 nm 내지 약 470 nm일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 산 화합물은 살리실산이며, 광도계 측정 단계는 약 400 nm 내지 약 650 nm의 광 파장에서 아세테이트 착물의 흡광도 값을 측정하는 단계; 및 아세테이트 착물의 흡광도 값으로부터 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법에서 사용된 광 파장은 또한 약 400 nm 내지 약 520 nm일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 시료는 13C 과분극화 아세테이트 및 수성 용매를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 시료는 버퍼를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본원에 개시된 방법의 아세테이트 착물은 화학식[13C 과분극화 아세테이트]3n([Fe3+][화학식(Ia)의 화합물])n을 가질 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 3의 정수이다. 하나의 실시양태에서, n은 1이다. 또른 실시양태에서, n은 2이다. 또다른 실시양태에서, n은 3이다.
또다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법의 아세테이트 착물은 화학식 [13C 과분극화 아세테이트][Fe3 +][화학식(Ib)의 화합물]을 가질 수 있다. 또다른 실시양태에서, 아세테이트 착물은 [13C 과분극화 아세테이트]m[Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]p을 가질 수 있으며, 여기서 m은 1 내지 3의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수이다. 따라서, m은 1, 2 또는 3일 수 있다, 추가로, p는 1, 2 또는 3일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시키는 단계는 시료를, Fe3 +-설포살리실산 착물 또는 Fe3 +-살리실산 착물을 포함하는 시약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 시약 조성물은 액체이다. 또다른 실시양태에서, 시약 조성물은 건조 분말이다.
하나의 실시양태에서, 시료는 EDTA를 추가로 포함하고, 시약 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하며, 여기서 금속 이온 Zn2 +, Cu2 + 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 시약 조성물은 버퍼를 추가로 포함한다.
이 기술된 설명은, 임의의 장치 또는 시스템을 구성 및 이용하는 것 및 임의의 인용된 방법을 수행하는 것을 비롯하여, 가장 우수한 양태를 포함하고 있는 본 발명의 실시양태를 개시하기 위해서, 그리고 또한 해당 기술 분야의 당업자가 본 발명을 실시하는 것도 가능하도록 하기 위해서 실시예를 이용한다. 본 발명의 특허 가능한 영역은 그 제공된 실시예의 영역에 국한되는 것이 아니라 해당 기술 분야의 당업자에게 일어나는 다른 실시예를 포함할 수 있다. 그러한 다른 실시예는, 이것이 청구범위의 문자 그대로의 언어와 상이하지 않은 구조적 요소를 갖고 있다면 또는 그것이 청구범위의 문자 그대로의 언어로부터 비실질적인 차이를 지닌 균등한 구조적 요소를 포함하고 있다면, 청구범위의 영역 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1
Fe/ SSA 착물의 잡 플롯
Fe3 +/SSA 착물 형성은 철 정량화를 위한 비색 방법으로서 일반적으로 이용되고 있다. 철 및 SSA는 산성 매질 중에 1:1 비이올렛 착물을 형성하고 pH가 중성 및 염기성 범위로 증가함에 따라 오렌지색 및 황색으로 이동한다. 본 발명자의 연구에서, Fe/SSA 시약은 SSA의 존재에 기인하여 산성인 수용액으로 제조하였다. 다양한 부피의 1 mM Fe3 +을 1 mM SSA 용액과 혼합하였고, 총 부피를 2 mL로 일정하게 유지하였다. Fe3 + 및 SSA의 총 몰 농도를 일정하게 유지하였다. 오션 옵틱스 섬유 광학 분광계 셋업 및 UV-Vis 광원을 흡광도 측정에 사용하였다. 잡 플롯은, 도 1에 도시되어 있는 바와 같이, Fe3 +의 몰비를 연속적으로 다양하게 하면서 흡광도 변화를 측정함으로써 얻었다. 예를 들면, 0.2의 Fe(III) 비율에서, 0.4 mL의 1mM Fe3 +을 1.6 mL의 1mM SSA 용액과 혼합하였다. 490 nm에서 피크 흡광도는 0.5 몰비에서 최대치에 도달하였는데, 이는 Fe3 +:SSA의 1:1 화학량론에 해당한다.
실시예 2
아세테이트, Fe 3 + , 및 SSA 혼합 연구
Fe3 +를 아세테이트와만 혼합하는 것은 예상되었던 임의의 색상을 발생시키지 않았다. 시약 A(0.5 mM Fe3 +, 200 mM 아세테이트) 및 시약 B(0.5 mM Fe3 +, 200 mM SSA)를 다양한 몰비로 혼합하여 아세테이트, Fe3 + 및 SSA의 혼합물을 연구하였다. 예를 들면, 0.2의 아세테이트의 몰비에서, 0.4 mL의 시약 A를 1.6 mL의 시약 B와 혼합하였다. 철 농도는 SSA와 아세테이트의 조합의 총 농도에 대하여 일정하게 유지하였다. 그 결과는 도 2에 도시되어 있다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 아세테이트의 몰 분율이 0.5 미만일 때, 흡광도 스펙트럼은 490 nm에서 흡광도 최대치를 가졌는데, 이는 Fe/SSA 착물 흡광도와 일치하였다. 아세테이트의 몰 분율이 증가함에 따라, 흡광도 최대치는 470 nm로 이동하였다. 피크 흡광도가 처음에 증가하였고, 이어서 일단 몰 분율이 0.7 초과한 후에 감소하였다. 0.5 내지 1.0의 몰 분율 범위 내에 있는 데이타 지점은 2차 다항 함수에 의해 핏팅되었으며, 0.75 몰비에서 최대치를 산출하였다. 이는 SSA 1몰당 Fe3 + 1몰당 아세테이트 3 몰의 몰비(즉, 아세테이트:Fe3+:SSA의 몰비 3:1:1)을 갖는 아세티이트, Fe3 + 및 SSA의 착물("아세테이트/Fe/SSA 착물")에 상응하였다.
Fe3 + 농도는 정확성 및 재현성 고려사항에 있어서 99% 흡광도(A =2)를 넘어서지 않으면서 비교적 큰 흡광도 신호를 갖기 위해서 0.5-0.65 mM 범위 내에 유지하였다. 도 3은 아세테이트 농도에 대한 최대 흡광도 변화가 0.5 내지 0.7로 증가하는 아세테이트의 몰 분율에 의해 달성되었다는 점을 보여준다. 요구된 아세테이트 정량화 농도 범위가 200-300 mM이기 때문에, 이러한 아세테이트의 농도 범위에 있어서 최적 SSA 농도는 130-200 nM인 것으로 계산되었다.
실시예 3
아세테이트/Fe/ SSA 착물의 제조
Fe3 + 및 설포살리실산("SSA") 시약("Fe/SSA 시약")은 FeCl3 및 5-설포살리실산 2수화물을 수 중에 용해시켜 0.65 mM Fe3 + 및 200 mM SSA의 최종 농도에 도달하도록 함으로써 제조하였다. Fe/SSA 시약 용액은 SSA의 존재에 기인하여 산성이었다.
아세테이트 표준물질은 트리스 및 수산화나트륨을 함유하는 염기성 버퍼에 아세트산을 희석함으로써 제조하였다. 예를 들면, 5 g의 아세트산을 83.6 g의 염기성 버퍼(720 mM NaOH 및 400 mM TRIS) 및 110 g의 희석 매질(수 중의 0.1% 염기성 버퍼)과 혼합하여 pH 7.6의 ~410 mM 아세테이트 스톡 용액인 최종 아세테이트 스톡 용액을 제조하였다. 이어서, 그 아세테이트 스톡 용액을 희석 매질로 희석하여 200-300 mM 아세테이트 시료를 필요에 따라 제조하였다.
아세테이트, Fe3 + 및 SSA의 아세테이트 착물("아세테이트/Fe/SSA")의 용액은 Fe/SSA 시약 용액(1 mL)을 아세테이트 표준물질의 수용액(1 mL)과 1:1 부피비로 혼합함으로써 제조하였다.
실시예 4
아세테이트 정량화를 위한 아세테이트/Fe/ SSA 착물 - 분광학 측정
아세테이트 정량화는 실시예 3에서 제조된 아세테이트/Fe/SSA 착물의 용액의 흡광도 측정에 의해 수행하였다. 흡광도 측정은 1 cm 경로 길이 큐벳을 통해 수행하였다. 오션 옵틱스 섬유 광학 분광계(USB4000) 및 UV-Vis 광원을 초기 평가에 사용하였다. 게이지 및 전달 함수 연구 동안, 상업적 시스템에서 피부르산 검출을 위한 설계된 LED-광다이오드(PD) 기반 QC 플레이트를 사용하였다. 구체적으로, 1 cm 경로 길이 TOPAS(등록상표) 큐벳(조사되고 에이징된 것), 채널 4 LED(450 nm) 및 채널 3 PD 검출을 이용하였다. 흡광도 측정의 결과는 도 4에 도시되어 있다.
실시예 5
아세테이트 정량화를 위한 아세테이트/Fe/ SSA 착물 - 아세테이트 농도의 결정을 위한 보정
도 5는 pH 6.8 및 8.2에서 아세테이트/Fe/SSA 착물의 흡광도 값을 기초로 한 아세테이트 표준물질의 보정 곡선을 도시한 것이다. 400 mM 아세테이트 스톡 용액의 제조 동안, 다양한 양의 중성 버퍼를 아세트산과 혼합하여 최종 pH 6.8 및 8.2에 도달하도록 하였다. 이어서, 400 mM 아세테이트 스톡 용액을 200 내지 300 mM 사이의 5가지 상이한 농도로 희석하였다. 이들 아세테이트 용액 1 mL 분량을 1 mL Fe/SSA 시약과 혼합하였고, 흡광도를 오션 옵틱스 섬유 광학 분광계 셋업으로 측정하였다.
실시예 6
아세테이트 정량화를 위한 아세테이트/Fe/ SSA 착물 - 게이지 및 전달 함수 연구
중심 합성(central composite)(반응 표면) 설계는 실험 인자를 연구하기 위해 그리고 QC 모듈(표 1)을 사용하여 아세테이트 농도를 보정하는 전달 함수를 결정하기 위해 이용하였다. 총 50회 운전을 무작위 순서로 각 온도 블록 내에서 수행하였고, 각 온도 블록을 운전하는 순서도 마찬가지로 무작위로 하였다. EPA는 전자 상자성 시약을 의미하고, 본 연구에서 EPA는 트리스(8-카르복실-2,2,6,6-테트라(2-(1-메톡시-2,2-d2-에틸))-벤조[1,2-d:4,5-d']비스(디티올-4-일)메틸 나트륨 염이었다. 그것은 최종 용해된 분극화 아세테이트 용액 중에 존재하였고, 가시 범위에서 그의 흡광도에 기인하여, 그것은 DOE 중에 포함되었다. 본 발명자들은 트리스 버퍼의 온도 감도(-0.03 pH/도)를 고려하였는데, 그 버퍼는 pH 조정을 위해 사용하였다. 모든 표준물질의 pH 값은 30℃에서 소정의 실험 설계에 상응하도록 실온에서 조정하였다. 예를 들면, 아세테이트 표준물질은 21℃에서 pH = 7.47로 조정하였는데, 이는 30℃에서 pH = 7.2에 상응하였다. 실험의 설계("DOE: design of experiment")에 대한 흡광도 값은 분석을 위한 DESIGN-EXPERT(등록상표)(version 8.0.6.)로 처리하였다. 표 1은 중심 합성(반응 표면) 설계 기초하여 실험 파라미터 세팅에 대한 정보를 제공한다.
표 2는 DOE 운전의 ANOVA 분석 결과를 나타낸 것이다. 아세테이트 농도, pH, 온도, 아세테이트 농도*pH 및 pH2는 유의적인 것으로 확인되었다. EPA는, 가장 유사하게는 아세테이트/Fe/SSA 착물로부터의 큰 흡광도 기여에 기인하여, 유의적이지 않았다. 농도에서의 ±2% 변동을 지닌 EDTA는 역시 마찬가지로 유의적이지 않는 것으로 확인되었다. R2(0.9920)과 R2 조정된 것(0.9911) 사이의 우수한 일치는 전달 함수에서 사용된 용어가 유의적인 것임을 보여주었다. R2(0.9920)과 R2 예측된 것(0.9888) 사이의 일치는 모델의 품질이 매우 높다는 것을 나타내었다.
전달 함수는 50개 지점에 대한 측정된 흡광도 값을 기초로 하여 아세테이트 농도를 예측하는데 이용하였다. 잔류 표준 편차(RSD), 구체적으로 RSD250mM은 0.7%(1.8 mM)인 것으로 계산되었다(표 3, 도 6). 온도 입력은 전달 함수로부터 제거되면, 그 방정식은 미미하게 조정된다(표 2 참조). RSD250mM는 0.8%(2 mM)로 미미하게 약화되는 것으로 계산되지만, 여전히 그 사양의 3% 내에 매우 우수하게 존재한다.
표 2는, 아세테이트 정량화에 대하여 유의적인 인자, 모델이 실험 데이타에 얼마나 잘 피팅되는지의 여부, 및 입력 인자, 예컨대 Abs, pH, 온도 등을 기초로 하여 아세테이트 농도를 유도하는 전달 함수를 포함하는, DESIGN-EXPERT(등록상표)으로부터의 분석 결과들을 열거한 것이다.
표 2의 방정식 1 및 2에서 기호는 하기 의미들을 갖는다:
"[아세테이트]"는 "아세테이트의 몰 농도"의 의미를 갖고;
"-" 기호는 "마이너스"의 의미를 가지며;
"+" 기호는 "플러스"의 의미를 갖고;
"E-03" 기호는 "10- 3와의 곱하기", 즉 "0.001와의 곱하기"의 의미를 가지며;
"Abs" 약어는 "흡광도"의 의미를 갖고;
"pH"는 "아세테이트/Fe/SSA 착물을 함유하는 용액의 pH 값"의 의미를 가지며;
"온도"는 "아세테이트/Fe/SSA 착물을 함유하는 용액의 온도(℃)"의 의미를 갖고;
"*" 기호는 "곱하기"의 의미를 가지며;
"/" 기호는 "나누기"의 의미를 갖고;
"^" 기호는 "~의 곱"의 의미를 갖는다.
표 3은 표 2로부터의 방정식 1 또는 2가 이용될 때 아세테이트 정량화로 유도된 상대 오차를 입증해 보여준 것이다. 표 3은 입력 파라미터들 중 하나로서 온도를 제거하면 아세테이트 정량화에 대한 영향이 미미하다는 것을 보여준다.
추가의 10개 유효 지점은 일련의 아세테이트 농도, pH 및 온도에 걸쳐 제조하였다. 10개 아세테이트 시료를 제조한 후, Fe/SSA 시약(1 mM Fe(NH4)(SO4)2, 200 mM SSA)과 1:1의 부피로 혼합하였다. 표 2로부터의 방정식 2를 예측에 이용하였다. 도 6은 50개 DOE 지점 및 10개 유효 지점 둘 다를 플롯팅한 것이다. 다른 유효 지점보다 선형 모델로부터 보다 현저하게 벗어나 있는 pH 6.8을 지닌 1개 유효 지점이 존재하였는데, 이는 그러한 pH에서 불량한 완충력과 연관될 수 있다. 유효 세트에 대한 RSD250mM은 2.66%인 것으로 계산되었는데, 이는 3% 사양 요건 내에 여전히 존재한다(pH 6.8 데이타를 배제한 RSM250mM은 2%이다).
QC 광학 모듈을 이용하는 전달 함수 연구
발광 다이오드-광다이오드 모듈이 게이지 연구에서 아세테이트 농도를 구별하기에 충분한 것으로 입증되어 있긴 하지만, 측정 오차를 유발하는 검출된 흡광도 신호에 영향을 미칠 수 있는 수 많은 인자가 있다. 도 11은 일련의 가능한 인자를 열거하는 특성 요인도이다.
일련의 실험은 실험의 설계("DOE")를 수행하기 전에 인자들을 선별하기 위해서 수행한다. pH 및 온도는 기지의 인자이다. 1.2-1.8%에서 글리세롤은 흡광도 신호에 유의적으로 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. EDTA는 강한 착화제이며, 이것은 Fe3+와 착화되어 무색 착물을 형성할 때 흡광도 감소를 야기할 것이다.
용해 매질 중의 0.1 g/L EDTA(0.27 mM)의 존재는 아세테이트/Fe/SSA 착물의 형성을 중단시키지만, EDTA의 20% 변동은 유의적인 영향을 갖는다. EDTA 변동에 대한 가능한 경감은 EDTA와 착화하는 제2 금속 이온을 제공하므로, EDTA 노이즈를 "완충시키게 된다". 200 mM ZnCl2의 첨가는 EDTA가 농도에서 20% 변하면 흡광도 변동을 0.08%로 감소시키는 것으로 입증되었다. 추후에, ZnCl2를 함유하는 반응 혼합물은 느린 붕괴(20분 후 15% 손실)를 갖는 것으로 확인되었다. 이는 검출이 수초 내에 행해지기 때문에 QC 방법에 대한 인자가 아니다.
실시예 7
아세테이트 정량화를 위한 아세테이트/Fe/ SSA 착물 - 아세테이트 시료내 EDTA 효과에 대한 보상
EDTA가 아세테이트 시료의 수용액 중에 존재한다면 그리고 EDTA 농도가 시료마다 큰 백분율로 변동한다면, 이는 아세테이트 보정에 영향을 미칠 수 있다. 금속 이온, 예컨대 Cu2 + 및/또는 Zn2 +를 첨가하는 것은 EDTA 변동에 대한 Fe/SSA 시약의 강건성을 개선할 수 있다. 이 조정된 Fe/SSA 시약은 1 mM Fe3 +의 공급원인 1 mM Fe(NH4)(SO4)2; 200 mM 5-설포살리실산; 및 200 mM ZnCl2를 포함할 수 있다. Fe/SSA 시약의 또다른 예는 1 mM Fe(NH4)(SO4)2; 200 mM 5-설포살리실산; 및 200 mM CuCl2를 포함할 수 있다. 이어서, Fe/SSA 시약은 아세테이트 시료의 수용액(pH 6.8-8.2)과 1:1의 부피비로 혼합한다. 예를 들어, 1 mL의 Fe/SSA 시약 용액을 1 mL의 수성 아세테이트 시료와 혼합한다.
실시예 8
아세테이트 정량화를 위한 아세테이트/Fe/ SSA 착물 - 건조된 Fe/ SSA 시약 사용
아세테이트 정량화 과정을 단순화하기 위해서, 고정량의 Fe/SSA 시약은 빈 용기 또는 광학 큐벳으로 분취할 수 있고 실온에서 또는 가열기 상에서 건조시킬 수 있다. 이어서, 건조된 Fe/SSA 시약이 얻어질 수 있다. 아세테이트 시료의 수용액의 후속 첨가는 건조된 Fe/SSA 시약 분말을 용해시키고, 결과적으로 아세테이트/Fe/SSA 착물의 형성을 유도한다. 이러한 절차는 필드 응용분야 및 QC 응용분야에 적합하다. 건조된 Fe/SSA 시약은 매우 수용성인데, 이는 급속 반응 및 신속 측정에 용이하다. 예를 들어, 1 mL의 Fe/SSA 시약, 예컨대 1 mM Fe(NH4)(SO4)2 및 200 mM의 5-설포살리실산의 수용액은 1 cm 경로 길이 큐벳 내부에서 건조될 수 있다. 아세테이트 시료의 수용액(pH 6.8-8.2) 1.2 mL의 후속 첨가는 결과적으로 시료내 아세테이트의 흡광도 측정 및 정량화를 위한 아세테이트/Fe/SSA 착물의 형성을 유도한다. 보다 높은 농도에서 보다 적은 양의 Fe/SSA 시약은 건조 공정을 속력 증가시키는데 사용될 수 있다.
실시예 9
FE/SA 착물의 잡 플롯
도 7에 도시된 잡 플롯은 Fe3 +의 몰비를 연속적으로 다양하게 하면서 흡광도 변화를 측정함으로써 얻어졌다. Fe3 + 및 살리실산("SA")의 총 몰 농도는 일정하게 유지하였다. 1 mM Fe3 +의 다양한 부피를 1 mM SA 용액과 혼합하고, 총 부피를 2 mL로 일정하게 유지하였다. 예를 들어, Fe3 + 몰비 0.2에서, 0.4 mL의 1 mM Fe3 +를 1.6 mL의 1 mM SA 용액과 혼합하였다. 오션 옵틱스 섬유 광학 분광계 셋업 및 UV-Vis 광원을 흡광도 측정에 사용하였다. 520 nm에서의 피크 흡광도는 SA의 몰비 0.6-0.7에서 최대치에 도달하였는데, 이것은 Fe:SA의 1:3 화학량론에 상응하였다.
실시예 10
아세테이트, Fe 3 + 및 SA 혼합물 연구
아세테이트, Fe3 + 및 SA("아세테이트/Fe/SA 착물")을 연구하기 위해서, 시약 A(1 mM Fe3 +, 15 mM 아세테이트) 및 시약 B(1 mM Fe3 +, 15 mM SA)를 다양한 몰비로 혼합하였다. 철 농도와 SA와 아세테이트의 총 조합 농도는 일정하게 유지하였다. 예를 들어 아세테이트의 몰비 0.2에서, 0.4 mL의 시약 A를 1.6 mL의 시약 B와 혼합 하였다. 오션 옵틱스 섬유 광학 분광계 셋업 및 UV-Vis 광원을 흡광도 측정에 사용하였다. 결과는 도 8에 도시되어 있다. 아세테이트 첨가에 의해, 흡광도의 최대치는 보다 낮은 파장으로 이동하기 시작하였다(Fe3 +/SA의 경우 520 nm에서 465 nm로 이동한다).
도 9에 도시된 바와 같이, 피크 흡광도는 먼저 증가하였고, 일단 몰 분율이 0.5 초과한 후에 감소하였다. 이것은 Fe3 +(아세테이트)m(SA)m의 아세테이트/Fe/SA 착물 화학식에 해당하며, 여기서 m은 1, 2 또는 3일 수 있다.
상기 데이터는 SA의 농도보다 낮은 아세테이트 농도에 의해, 흡광도가 아세테이트 농도에 따라 증가한다는 것을 보여준다. 일단 아세테이트 농도가 SA의 농도보다 높으면, 흡광도는 아세테이트 농도가 증가함에 따라 감소한다.
실시예 11
아세테이트/Fe/SA 착물의 제조 및 보정
Fe3 + 및 살리실산("SA") 시약("Fe/SA 시약")은 황산암모늄(III) 및 살리실산을 용해시켜 최종 농도 1 mM Fe3 + 및 15 mM SA에 도달하도록 함으로써 제조하였다. 아세테이트 표준물질은 실시예 3에 기재된 것과 유사한 절차로 제조하였다.
Fe/SA 시약 용액을 아세테이트 표준물질의 수용액과 1:1 부피비로 혼합함으로써 아세테이트, Fe3 + 및 SA의 아세테이트 착물( "아세테이트/Fe/SA 착물") 용액을 제조하였다. 오션 옵틱스 섬유 광학 분광계 셋업 및 UV-Vis 광원을 흡광도 측정에 사용하였다.
200-300 mM 아세테이트의 정량화를 위해, 아세테이트 용액과 1 mM Fe3 +/15 mM SA의 1:1 혼합물은 도 10에 도시된 보정 곡선을 생성하였다. 흡광도 변화 대 아세테이트 농도의 상관 관계가 있다. 흡광도는 아세테이트 농도와 선형적인 상관 관계가 있다.
실시예 12
아세테이트 정량화를 위한 아세테이트/Fe/SA 착물 - 아세테이트 시료내 EDTA 작용을 위한 보상
EDTA가 아세테이트 시료의 수용액에 존재한다면 그리고 EDTA 농도가 시료마다 큰 백분율로 변동한다면, 이는 아세테이트 보정에 영향을 미칠 수 있다. Cu2 + 및/또는 Zn2 +와 같은 금속 이온을 첨가하는 것은 EDTA 변동에 대한 Fe/SA 시약의 견고성을 향상시킬 수 있다. 조정된 Fe/SA 시약은 1 mM Fe3 +의 공급원인 1 mM Fe(NH4)(SO4)2; 200 mM 살리실산; 및 200 mM ZnCl2를 포함할 수 있다. Fe/SA 시약의 다른 예는 1 mM Fe(NH4)(SO4)2; 200 mM 살리실산; 및 200mM CuCl2를 포함할 수 있다. Fe/SA 시약은 아세테이트 시료의 수용액(pH 6.8-8.2)과 1:1의 부피로 혼합한다. 예를 들어, 1 mL의 Fe/SA 시약 용액을 1 mL의 수성 아세테이트 시료와 혼합한다.
실시예 13
과분극화 아세테이트의 QC
과분극화 조영제의 QC에 대한 일반적인 절차는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제7,803,320호 및 제7,519,492호에 기재되어 있다. 이러한 절차는 과분극화 아세테이트의 QC를 위한 본원에 기술된 방법에 적합하게 될 수 있다.
예를 들어, 하나의 실시양태에서, 과분극화 13C 아세테이트 시료는 제품의 QC 분석을 허용하는 큐벳을 포함하는 QC 부속 장치 내로 진입한다. Fe/SSA 시약은 큐벳 또는 유로에서 예비 건조될 수 있다. 형성된 착물의 광학 측정은 LED-광다이오드 셋업 또는 다른 형태를 사용하여 수행할 수 있다. 특수한 QC 부속 장치는 피루베이트 시약 QC 사용을 위해 기존 부속 장치에 부가된 여분의 큐벳일 수 있다.
게다가, 오프라인 버전도 구현될 수 있다. 오션 옵틱스 분광계 또는 LED-광다이오드 셋업을 측정에 사용할 수 있다. Fe/SSA 시약은 예비 분취되거나 큐벳에서 건조될 수 있다. 이어서, 고정된 양의 용해된 13C 아세테이트 용액은 측정을 위해 큐벳에 첨가할 수 있다. 착물의 형성 및 측정은 QC를 위한 속력 요건을 만족하면서 수초 내에 수행될 수 있다.
도 12는 과분극화 13C 아세테이트 QC에 대한 잠재적인 유체 경로 바닥 판 설계의 개략도를 도시한 것이다. 그 유체 경로 바닥 판은 흡광도/형광성 측정을 위한 성형된 TOPAS® 큐벳과 NMR의 액체 상태 분극화(LSP) 측정을 위한 원통형 홀더를 포함한다. 전자 상자성 시약( "EPA")은 UV-Vis 흡광도를 통해 직접 측정된다. 따라서 추가 시약이 필요하지 않다. 수용된 제품은 먼저 EPA 큐벳에 도달한다. 이어서, 제품은 pH 및 아세테이트 검출을 위한 분석 큐벳에 도달하기 전에 NMR 벌브를 통과한다. 흐름은 순차적으로 또는 동시적으로 발생할 수 있다. pH 측정을 위해, pH 민감성 형광 염료는 NMR 벌브의 팁 내부에 예비 침착되어 있다. 수용된 제품은 염료를 용해시키고 이 혼합물은 측정을 위한 1cm 경로 길이의 큐벳에 도달한다. 건조한 Fe/SSA 시약을 유지하기 위해서, 추가의 NMR 벌브/큐벳을 내장할 수 있다. 수용된 제품은 Fe/SSA 시약을 용해시키고 그 혼합물은 1cm 길이의 큐벳에 도달한다. 이어서, 과분극화 13C 아세테이트 정량화를 위해 아세테이트/철/SSA 착물의 광도계 측정을 수행할 수 있다.
본 발명의 특정한 특색들만이 본 명세서에 예시 및 설명되어 있지만, 해당 기술 분야의 당업자라면 많은 변형예 및 변경예를 실시할 수 있을 것이다. 그러므로, 첨부된 청구 범위는 본 발명의 실제 기술사상 내에 속하는 것으로서 그러한 모든 변형예 및 변경예를 포함하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.
본원 전반에 걸쳐, 다양한 참조 문헌이 언급되어 있다. 이들 참고 문헌의 개시 내용 전체는 본원에서 기술된 바와 같이 본원에 참고 인용되어 있다.

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  13. 시료내 아세테이트의 농도를 결정하는 방법으로서,
    시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시켜 아세테이트 착물을 형성시키는 접촉 단계로서, 산 화합물은 설포살리실산 및 살리실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접촉 단계, 및
    아세테이트 착물을 광도계 측정하여 시료내 아세테이트의 농도를 결정하는 측정 단계
    를 포함하고, 산 화합물이 설포살리실산일 때, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ia)의 화합물을 포함하며, 산 화합물이 살리실산일 때, 아세테이트 착물은 아세테이트, Fe3+ 및 하기 화학식(Ib)의 화합물을 포함하는 것인 방법:
    화학식(Ia)

    화학식(Ib)

    상기 식 중에서,
    R1은 -OH 또는 -O-이고,
    R2는 -OH 또는 -O-이다.
  14. 제13항에 있어서, 시료내 아세테이트는 13C 과분극화 아세테이트를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 방법은 13C 과분극화 아세테이트의 품질 관리를 위한 설계된 장치를 사용하여 수행하는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 산 화합물은 설포살리실산이고, 광도계 측정 단계는
    350 nm 내지 550 nm의 광 파장에서 아세테이트 착물의 흡광도 값을 측정하는 단계, 및
    아세테이트 착물의 흡광도 값으로부터 시료내 아세테이트의 농도를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 광 파장은 430 nm 내지 470 nm인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 산 화합물은 살리실산이고, 광도계 측정 단계는
    400 nm 내지 650 nm의 광 파장에서 아세테이트 착물의 흡광도 값을 측정하는 단계, 및
    아세테이트 착물의 흡광도 값으로부터 시료내 아세테이트의 농도를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 광 파장은 400 nm 내지 520 nm인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트]3n([Fe3+][화학식(Ia)의 화합물])n을 가지며, 여기서 n은 1 내지 3의 정수인 방법.
  21. 제13항에 있어서, 아세테이트 착물은 화학식 [아세테이트]m[Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]p를 가지며, 여기서 m은 1 내지 3의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수인 방법.
  22. 제13항에 있어서, 시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시키는 단계는 시료를, Fe3+-설포살리실산 착물 또는 Fe3 +-살리실산 착물을 포함하는 시약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  23. 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 결정하는 방법으로서,
    시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시켜 아세테이트 착물을 형성시키는 접촉 단계로서, 산 화합물은 설포살리실산 및 살리실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접촉 단계, 및
    아세테이트 착물을 광도계 측정하여 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 결정하는 측정 단계
    를 포함하고, 산 화합물이 설포살리실산일 때, 아세테이트 착물은 13C 과분극화 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ia)의 화합물을 포함하며, 산 화합물이 살리실산일 때, 아세테이트 착물은 13C 과분극화 아세테이트, Fe3 + 및 하기 화학식(Ib)의 화합물을 포함하는 것인 방법:
    화학식(Ia)

    화학식(Ib)

    상기 식 중에서,
    R1은 -OH 또는 -O-이고,
    R2는 -OH 또는 -O-이다.
  24. 제23항에 있어서, 방법은 13C 과분극화 아세테이트의 품질 관리를 위한 설계된 장치를 사용하여 수행하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 산 화합물은 설포살리실산이고, 광도계 측정 단계는
    350 nm 내지 550 nm의 광 파장에서 아세테이트 착물의 흡광도 값을 측정하는 단계, 및
    아세테이트 착물의 흡광도 값으로부터 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 광 파장은 430 nm 내지 470 nm인 방법.
  27. 제23항에 있어서, 산 화합물은 살리실산이고, 광도계 측정 단계는
    400 nm 내지 650 nm의 광 파장에서 아세테이트 착물의 흡광도 값을 측정하는 단계, 및
    아세테이트 착물의 흡광도 값으로부터 시료내 13C 과분극화 아세테이트의 농도를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 광 파장은 400 nm 내지 520 nm인 방법.
  29. 제23항에 있어서, 아세테이트 착물은 화학식 [13C 과분극화 아세테이트]3n([Fe3+][화학식(Ia)의 화합물])n을 가지며, 여기서 n은 1 내지 3의 정수인 방법.
  30. 제23항에 있어서, 아세테이트 착물은 화학식 [13C 과분극화 아세테이트]m[Fe3+][화학식(Ib)의 화합물]p를 가지며, 여기서 m은 1 내지 3의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수인 방법.
  31. 제23항에 있어서, 시료를 Fe3 + 및 산 화합물과 접촉시키는 단계는 시료를, Fe3+-설포살리실산 착물 또는 Fe3 +-살리실산 착물을 포함하는 시약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.




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