KR102601028B1 - 아베마시클립을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
아베마시클립을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아베마시클립을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아베마시클립은 뇌 신경세포에서 염증성 사이토카인인 COX-2, IL-1β, IL-6 또는 iNOS를 억제하는 활성이 우수하고, 염증반응과 관련된 TLR4의 신호전달 억제 및 p-STAT3의 수준을 억제하는 활성이 우수하며, LPS에 의한 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제할 수 있고, 아밀로이드 플라크 억제 및 수상돌기수의 증가와 타우 단백질의 인산화 억제 활성도 있으며, 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스의 장기기억을 향상시킬 수 있는 특징을 갖는다. 그러므로 본 발명의 아베마시클립은 퇴행성 뇌질환 또는 신경염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품의 유효성분으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 아베마시클립(abemaciclib)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서도 뇌에서 발생하는 질환을 뜻하며, 주요증상과 침범되는 뇌부위를 고려해 구분할 수 있는데, 대표적으로 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease)이나 파킨슨 질환 등이 포함된다. 퇴행성 뇌질환은 노화에 따른 신경퇴화와 유전적 및 환경적 요인들로 인해 단백질이 응집돼 신경세포의 사멸로 야기되는 것으로 알려져 있다.
또한, 퇴행성 뇌질환은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 있는데, 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어져 발생하는 것으로 알려져 있고, 특히, 인지기능, 감각기능, 운동기능, 전신기능의 진행성 저하를 수반하는 뇌기능 부전은 결국 성격과 행동의 변화를 가져오고, 환자들이 스스로 자신을 돌볼 수 없는 지경에 이르게 한다. 이러한 뇌세포 사멸의 주요 경로로는 산화적 스트레스에 의한 산화적 독성, 흥분적 독성, 세포자멸사(apoptosis) 등이 제시되고 있으며, 각각은 특이한 신호전달과정을 통하여 세포사멸을 유발하게 된다. 구체적으로, 뇌졸증, 뇌손상, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨 병 환자에서 뇌세포 사멸의 주원인으로 활성 산소종(Reactive Oxygen Species)의 축적 후 단백질, 핵산, 지질의 산화적인 손상이 제시되었고, 특히 자유 라디칼(free radicals)에 의한 산화적 스트레스는 체내의 각 조직에서 일어나는 세포 사멸의 주원인으로 보고되고 있으며, 뇌신경질환에서 나타나는 세포사멸의 주기전의 하나로도 제시되어 왔다(Schapira, A.H., Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264, 1996).
또한, 미세아교세포(microglia)와 성상세포(astrocyte)의 활성은 퇴행성 뇌신경질환의 발병과 진행에 관련되어 있다고 보고되고 있으며, 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(CNS)에 상주하는 면역세포로 외부의 자극에 의해 활성화되어 면역반응과 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 미세아교세포(microglia)는 중추신경계에서 일차적인 면역 기능을 수행하는 세포로서, 가늘고 긴 가지와 얇은 세포체의 모양을 유지하고 있다가 외부에서 유입되거나 내부에서 발생되는 독소들이 존재하게 되면 이들 독소로부터 신경 세포를 보호하기 위해 굵고 짧은 가지와 뚱뚱한 세포체를 가지는 활성화된 모양으로 변화하게 된다.
그러나 박테리아의 내독소인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 인터페론-γ, 베타아밀로이드 또는 갱글리오사이드와 같은 물질로 미세아교세포가 활성화가 되면 정상상태의 미세아교세포와는 달리 포식작용을 활발히 하고, 세포증식을 하며 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 사이토카인, 케모카인, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 등의 유전자를 발현시켜 염증매개물질들을 생성한다. 이러한 미세아교세포의 활성화는 손상된 세포를 제거하고 외부에서 침입하는 박테리아나 바이러스로부터 신경세포를 보호하는 일면이 있으나 iNOS에 의해 생성되는 일산화질소(NO)와 COX-2에 의해 생성되는 프로스타글란딘들, TNF-α 등은 신경세포에도 독성을 나타내기 때문에 결과적으로 미세아교세포의 활성화는 신경세포의 손상을 악화시키게 된다. 따라서 미세아교세포의 적절한 활성화 억제는 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있는 또 다른 방법이 될 수 있다.
또한, 성상세포(astrocyte)는 뇌의 발생과정 뿐만 아니라 정상적인 뇌활동을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 뇌에서의 성상세포는 신경세포가 분비하는 신경전달물질을 적절하게 제거하거나 뇌에서의 이온농도를 조절하면서 신경세포 활성을 보조하는 역할을 하는 것으로 밝혀져 있고, 이 외에도 신경줄기세포가 신경세포로 분화하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 밝혀진 바 있다.
그러나 성상세포는 뇌에 상해를 입었을 때, 증식이 활발해지고 스웰링(swelling)이 일어나며 성상교세포증(astrogliosis)과 같은 반응성 성상세포로 활성화가 된다. 이러한 반응성 성상세포는 에이즈성 치매, 뇌 손상, 허혈성 뇌질환, 알츠하이머병 등에서 관찰되어지고 있다. 따라서 지속적인 성상세포의 활성화는 결국 신경세포의 사멸을 초래한다. 따라서 성상세포의 적절한 활성화 억제 역시 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있는 또 다른 방법이 될 수 있다.
또한, 알츠하이머를 비롯한 퇴행성뇌질환은 베타 아밀로이드(beta-amyloid)의 축적으로 유발되는 것으로도 알려져 있고, 이들 단백질이 응집되어 형성된 플라크(plaque)를 제거하기 위한 연구가 지속되고 있다. 최근들어 타우(Tau) 단백질이 비정상적인 구조를 가지면서 봉입체(inclusion body)를 형성하고 이로 인한 퇴행성 뇌질환이 발생된다는 연구가 발표된 바 있어 타우 단백질이 이들 질환의 표적으로 대두되고 있다.
한편, 현재 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위해 사용되고 있는 치료법으로는 약물치료법, 수술치료법 및 물리치료법등이 있는데, 약물치료의 경우, 일반적으로 뇌에서 부족해진 도파민을 보충해주고, 도파민의 부족으로 인한 신경전달물질의 불균형을 맞춰주며, 신경세포의 파괴를 예방 또는 지연시키고자 하는 목적과 기타 우울증 등의 증상을 조절하기 위한 약물들이 사용되고 있을 뿐, 퇴행성 뇌질환에 대해 아직까지 구체적으로 어떠한 기작으로 신호 전달을 하고 독성을 나타내는지 정확히 규명되지 않고 있기에 근본적이고 효과적인 치료제가 부재한 실정이다.
한편, 아베마시클립(abemaciclib)은 현재 유방암 치료제로 사용되고 있는 약물로서 사이클린 의존성 인산화효소(CDK) 4 및 6의 저해 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있을 뿐, 아직까지 퇴행성 뇌질환과의 관련성에 대해 연구된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 종래 유방암 치료제로 알려진 아베마시클립이 뇌 신경세포의 염증을 효과적으로 억제할 수 있고, 타우 단백질의 인산화 억제 및 장기기억 향상, 아밀로이드 플라크 형성 저해 효과를 가지고 있어 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로서 사용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
그러므로 본 발명의 목적은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인인 COX-2, IL-1β, IL-6 또는 iNOS의 발현 및 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 TLR4(Toll-like receptor 4)의 활성을 억제하고, p-STAT3 수준을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은, 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하고; 아밀로이드 플라크를 억제하며; 수상돌기의 수 증가; 타우 단백질의 인산화 억제; 또는 기억력 및 인지력 증가 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌질환(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한 본 발명은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 염은 전염증성 사이토카인인 COX-2, IL-1β, IL-6 또는 iNOS의 발현 및 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 염은 TLR4(Toll-like receptor 4)의 활성을 억제하고, p-STAT3 수준을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 염은, 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하고; 아밀로이드 플라크를 억제하며; 수상돌기의 수 증가; 타우 단백질의 인산화 억제; 또는 기억력 및 인지력 증가 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌질환(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경염증성 질환은 신경모세포종, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경염증성 질환은 신경모세포종, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 아베마시클립은 뇌 신경세포에서 염증성 사이토카인인 COX-2, IL-1β, IL-6 또는 iNOS를 억제하는 활성이 우수하고, 염증반응과 관련된 TLR4의 신호전달 억제 및 p-STAT3의 수준을 억제하는 활성이 우수하며, LPS에 의한 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제할 수 있고, 아밀로이드 플라크 억제 및 수상돌기수의 증가와 타우 단백질의 인산화 억제 활성도 있으며, 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스의 장기기억을 향상시킬 수 있는 특징을 갖는다. 그러므로 본 발명의 아베마시클립은 퇴행성 뇌질환 또는 신경염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품의 유효성분으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 미세아교세포에서 아베마시클립 처리에 따른 LPS로 유도된 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 수준을 분석한 결과로서, (A)~(B)는 아베마시클립을 농도별 처리후 MTT 어세이를 수행한 결과이고, (C)~(G)는 아베마시클립 을 전처리하고 LPS 처리 후의 전염증성 사이토카인의 수준을 RT-PCR을 통해 분석한 결과이며, (H)~(L)은 LPS를 전처리 후, 아베마시클립 처리 후의 전염증성 사이토카인의 수준을 RT-PCR로 분석한 결과이고, (M)~(O)는 아베마시클립을 전처리하고 LPS 처리 후 항염증성 사이토카인의 수준을 Q-PCR을 통해 분석한 결과이며, (P)~(R)는 LPS 처리 후 아베마시클립을 처리한 다음, 항염증성 사이토카인의 수준을 Q-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 LPS로 유도되는 전염증성 사이토카인의 변화에 대한 아베마시클립 의 영향이 TLR4에 의존적인지를 확인한 결과로서, (A)~(E)는 미세아교세포에 TAK-242를 처리한 다음, 아베마시클립을 처리하고 이후 LPS를 처리한 후, RT-PCR을 통해 세포 내에서의 COX-2, IL-6, IL-1β 및 COX-2의 수준을 측정한 것이며, (F)~(H)는 미세아교세포에 아베마시클립을 처리한 다음, LPS를 처리한 후 웨스턴 블럿을 통해 p-AKT 및 AKT의 수준을 측정한 것이다. (I)~(M)은 미세아교세포에 MK2206 (AKT inhibitor) 처리 후, 아베마시클립을 처리한 다음, LPS를 처리하여 RT-PCR을 통해 세포 내에서 COX-2, IL-6, IL-1β 및 COX-2의 수준을 측정한 결과이고, (N)~(Q)는 미세아교세포에 아베마시클립을 처리한 다음, LPS를 처리하여 수득한 세포 용해물에 대해 핵과 세포질 분획으로 각각 분획화 한 다음, 각 분획물에서의 p-STAT3의 수준을 웨스턴 블럿을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 일차 미세아교세포(primary microglial cell) 및 성상세포(primary astrocytes)에 아베마시클립을 처리한 다음, LPS를 처리하여 전염증성 사이토카인의 수준을 Q-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 일차 미세아교세포(primary microglial cell)에서 측정한 결과를, (B)는 성상세포(primary astrocytes)에서 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 야생형 마우스에서 LPS에 의한 인지기능 저하에 아베마시클립이 미치는 영향을 분석한 것으로, 7일간 매일 야생형 마우스에 아베마시클립을 투여 후 30분 뒤 LPS를 투여 하였고, 8, 9일째 행동 실험을 수행한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 8일 째 Y maze 분석한 결과를, (B)는 8일 및 9일째 NOR test 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 야생형 마우스에서 LPS에 의한 염증성 사이토카인 수준에 아베마시클립이 미치는 영향을 분석한 것으로, 야생형 마우스에 아베마시클립을 3일 동안 매일 주입 후, LPS를 6시간 동안 투여한 다음 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로, (A), (C)는 anti-Iba-1 항체를 사용하였고, (B), (C)는 anti-GFAP 항체를 사용한 결과이다.
도 6은 야생형 마우스에서 LPS에 의한 IL-1β 및 IL-6 염증성 사이토카인의 수준변화에 아베마시클립이 미치는 영향을 분석한 것으로, 야생형 마우스에 아베마시클립 메실레이트를 3일 동안 매일 주입 후, LPS를 6시간 동안 투여한 다음 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로 (A), (C)는 anti-IL-1β 항체를 사용하였고, (B), (C)는 anti-IL-6 항체를 사용한 결과이다.
도 7은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립을 매일 2주 동안 처리한 후, 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로, (A), (D)는 anti-Iba-1 항체를 사용하였고, (B), (D)는 anti-GFAP 항체를, (C), (D)는 anti-IL-1β 항체를 사용한 결과이다.
도 8은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립을 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 인지력과 기억력 개선 활성 및 수상돌기수의 증가 활성을 분석한 것으로, (A)~(B)는 Y-maze, NOR Training 및 NOR test를 수행한 결과를 나타낸 것이고, (C)~(E)는 피질 및 해마조직에서의 수상돌기수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 아베마시클립을 투여한 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에서 피질 및 해마조직 각각에서의 타우 인산화 수준을 측정한 결과를 나타낸 것으로, (A), (D)는 anti-AT180 항체를 이용하여, (B), (D)는 anti-AT100 항체를 이용하여, (C), (D)는 anti-tau5 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에서 아베마시클립 처리에 따른 아밀로이드 플라크 억제 효과를 피질 및 해마조직에서 확인한 것으로, (A)-(B)는 anti-4G8 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립 또는 도네페질을 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 인지력과 기억력 개선 활성 분석한 것으로, (A)는 Y-maze, (B)는 NOR Training 및 NOR test를 측정한 결과이다.
도 12는 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립 또는 도네페질을 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로 (A)-(B)는 anti-GFAP 항체 및 anti-6E10 항체를 사용한 결과이다.
도 13은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립 또는 도네페질을 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로 (A)-(B)는 anti-phospho-GSK-3β(Y216) 항체 또는 anti-DYRK1A 항체를 사용한 결과이다.
도 14는 알츠하이머병 유발 PS19 마우스에 아베마시클립 메실레이트를 복강 (30 mg/kg) 또는 구강 (60 mg/kg)으로 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 인지력과 기억력 개선 활성을 분석한 결과로, (A)는 Y-maze를 측정한 결과를, (B)는 NOR Training 및 NOR test를 통해 분석한 결과이다.
도 2는 LPS로 유도되는 전염증성 사이토카인의 변화에 대한 아베마시클립 의 영향이 TLR4에 의존적인지를 확인한 결과로서, (A)~(E)는 미세아교세포에 TAK-242를 처리한 다음, 아베마시클립을 처리하고 이후 LPS를 처리한 후, RT-PCR을 통해 세포 내에서의 COX-2, IL-6, IL-1β 및 COX-2의 수준을 측정한 것이며, (F)~(H)는 미세아교세포에 아베마시클립을 처리한 다음, LPS를 처리한 후 웨스턴 블럿을 통해 p-AKT 및 AKT의 수준을 측정한 것이다. (I)~(M)은 미세아교세포에 MK2206 (AKT inhibitor) 처리 후, 아베마시클립을 처리한 다음, LPS를 처리하여 RT-PCR을 통해 세포 내에서 COX-2, IL-6, IL-1β 및 COX-2의 수준을 측정한 결과이고, (N)~(Q)는 미세아교세포에 아베마시클립을 처리한 다음, LPS를 처리하여 수득한 세포 용해물에 대해 핵과 세포질 분획으로 각각 분획화 한 다음, 각 분획물에서의 p-STAT3의 수준을 웨스턴 블럿을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 일차 미세아교세포(primary microglial cell) 및 성상세포(primary astrocytes)에 아베마시클립을 처리한 다음, LPS를 처리하여 전염증성 사이토카인의 수준을 Q-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 일차 미세아교세포(primary microglial cell)에서 측정한 결과를, (B)는 성상세포(primary astrocytes)에서 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 야생형 마우스에서 LPS에 의한 인지기능 저하에 아베마시클립이 미치는 영향을 분석한 것으로, 7일간 매일 야생형 마우스에 아베마시클립을 투여 후 30분 뒤 LPS를 투여 하였고, 8, 9일째 행동 실험을 수행한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 8일 째 Y maze 분석한 결과를, (B)는 8일 및 9일째 NOR test 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 야생형 마우스에서 LPS에 의한 염증성 사이토카인 수준에 아베마시클립이 미치는 영향을 분석한 것으로, 야생형 마우스에 아베마시클립을 3일 동안 매일 주입 후, LPS를 6시간 동안 투여한 다음 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로, (A), (C)는 anti-Iba-1 항체를 사용하였고, (B), (C)는 anti-GFAP 항체를 사용한 결과이다.
도 6은 야생형 마우스에서 LPS에 의한 IL-1β 및 IL-6 염증성 사이토카인의 수준변화에 아베마시클립이 미치는 영향을 분석한 것으로, 야생형 마우스에 아베마시클립 메실레이트를 3일 동안 매일 주입 후, LPS를 6시간 동안 투여한 다음 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로 (A), (C)는 anti-IL-1β 항체를 사용하였고, (B), (C)는 anti-IL-6 항체를 사용한 결과이다.
도 7은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립을 매일 2주 동안 처리한 후, 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로, (A), (D)는 anti-Iba-1 항체를 사용하였고, (B), (D)는 anti-GFAP 항체를, (C), (D)는 anti-IL-1β 항체를 사용한 결과이다.
도 8은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립을 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 인지력과 기억력 개선 활성 및 수상돌기수의 증가 활성을 분석한 것으로, (A)~(B)는 Y-maze, NOR Training 및 NOR test를 수행한 결과를 나타낸 것이고, (C)~(E)는 피질 및 해마조직에서의 수상돌기수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 아베마시클립을 투여한 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에서 피질 및 해마조직 각각에서의 타우 인산화 수준을 측정한 결과를 나타낸 것으로, (A), (D)는 anti-AT180 항체를 이용하여, (B), (D)는 anti-AT100 항체를 이용하여, (C), (D)는 anti-tau5 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에서 아베마시클립 처리에 따른 아밀로이드 플라크 억제 효과를 피질 및 해마조직에서 확인한 것으로, (A)-(B)는 anti-4G8 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립 또는 도네페질을 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 인지력과 기억력 개선 활성 분석한 것으로, (A)는 Y-maze, (B)는 NOR Training 및 NOR test를 측정한 결과이다.
도 12는 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립 또는 도네페질을 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로 (A)-(B)는 anti-GFAP 항체 및 anti-6E10 항체를 사용한 결과이다.
도 13은 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스에 아베마시클립 또는 도네페질을 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 뇌의 피질(cortex) 및 해마조직(hippocampus)에 대한 면역조직화학법을 수행한 결과를 나타낸 것으로 (A)-(B)는 anti-phospho-GSK-3β(Y216) 항체 또는 anti-DYRK1A 항체를 사용한 결과이다.
도 14는 알츠하이머병 유발 PS19 마우스에 아베마시클립 메실레이트를 복강 (30 mg/kg) 또는 구강 (60 mg/kg)으로 매일 2주간 투여한 후, 베히클을 투여한 대조군과 함께 인지력과 기억력 개선 활성을 분석한 결과로, (A)는 Y-maze를 측정한 결과를, (B)는 NOR Training 및 NOR test를 통해 분석한 결과이다.
본 발명은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 특징이 있다.
아베마시클립(abemaciclib)은 앞서 종래기술에서도 언급한 바와 같이, 유방암 치료제로 알려져 있으나 아직까지 퇴행성 뇌질환의 치료 가능성에 대해 연구된 바가 없다.
본 발명에 따른 상기 아베마시클립은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염을 사용할 수 있다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명의 일실시예에서는 아베마시클립 메틸레이트(abemaciclib mesylate)를 사용하였다.
이에 본 발명에서는 아베마시클립의 퇴행성 뇌질환의 치료제로 사용가능함을 최초로 규명하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 뇌 신경세포에서 염증유발 인자로 알려진 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 및 전염증성사이토카인의 발현 및 생성을 아베마시클립이 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였는데, 구체적으로 LPS에 의한 COX-2, IL-1β, IL-6 또는 iNOS의 생성이 효과적으로 억제됨을 확인하였다. 여러 가지 염증유발 인자 중에서, 내독소의 하나인 LPS(lipopolysaccharide)는 전염증성 사이토카인의 분비를 증진시키고 이로 인해 산화질소, 프로스타글란딘 등의 염증매개물질이 분비되며, 과도한 염증반응에 의해 다양한 염증질환이 발병된다.
따라서 본 발명자들을 아베마시클립의 LPS에 의한 전염증성 반응을 억제할 수 있어 과도한 염증반응으로 유발될 수 있는 염증질환 및 뇌염증 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 아베마시클립의 염증성 사이토카인의 억제가 TLR4/AKT/STAT3 신호전달 체계와 관련성이 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
TLR4는 LPS의 자극에 의해 세포가 자극되면 NF-kB의 활성화로 여러 염증인자들이 생성되어 염증질환의 병리현상을 유도하는 것으로 알려져 있고, 상기 AKT는 NF-kB를 활성화시키는 것으로 알려져 있으며, AKT의 신호전달은 TLR4 신호경로를 통한 LPS로 유도되는 면역반응과도 관련성이 있는 것으로 알려져 있고, AKT가 넉아웃된 경우 인간의 간암 세포주에서 전염증성 사이토카인의 수준이 감소되는 것으로 알려져 있다. 또한 활성화된 TLR4는 STAT3 및 다른 전사인자들에도 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 지속적으로 활성화된 STAT3은 염증질환의 발병과 밀접한 연관이 있음이 알려져 있다.
본 발명의 일실시예에 의하면, 아베마시클립이 TLR4/AKT/STAT3의 신호전달 활성화를 억제함을 확인하였고, LPS로 유도된 염증성 사이토카인인 COX-2, IL-1β, IL-6 및 iNOS의 수준이 아베마시클립 처리에 의해 미세아교세포 및 성상세포에서 모두 감소된 것으로 나타났으며, p-AKT의 인산화 수준도 감소된 것으로 나타났다.
그러므로 아베마시클립은 뇌 신경세포의 염증유발에 관여하는 TLR4/AKT/STAT3 신호전달의 활성화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
뿐만 아니라 본 발명의 아베마시클립은 LPS에 의한 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하여 활성화된 미세아교세포 또는 활성화된 성상세포가 신경세포에 미치는 손상을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
뇌에서 대식세포의 역할을 하는 미세아교세포(microglial cell)는 중추신경계(central nervous system, CNS) 내 면역반응을 조절하는 중요한 효과세포 (effector cell)이다. 이들의 활성화는 약물이나 독소에 의한 이물질을 제거하고 신경 성장 인자를 분비하여 CNS의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 그러나 손상된 뉴런으로부터 발생하는 신호, 외부 자극에 의해 변형된 비정상적인 형태의 단백질의 축적, 병원체의 침투와 같은 유해한 스트레스에 노출되면 미세아교세포의 활성이 지나치게 증가되어 신경세포의 손상을 유발함으로써 알츠하이머질환, 파킨슨질환, 다발성 경화증, 뇌경색 등과 같은 퇴행성 신경질환을 일으킬 수 있다. 또한 최근에는 미세아교세포 또는 성상세포에서의 과도한 염증반응이 퇴행성 뇌질환의 발병원인이 되고 있다는 연구결과가 밝혀지고 있다.
구체적으로, 과도하게 활성화된 미세아교세포는 정상 상태의 미세아교세포와는 달리 포식작용을 활발히 하고, 세포증식을 하며, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 사이토카인, 케모카인, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 등의 유전자를 발현시켜 염증매개물질들을 생성한다. 미세아교세포의 활성화는 손상된 세포를 제거하고 외부에서 침입하는 박테리아나 바이러스로부터 신경세포를 보호하는 일면이 있으나 iNOS에 의해 생성되는 일산화질소(NO)와 COX-2에 의해 생성되는 프로스타글란딘들, TNF-α 등은 신경세포에도 독성을 나타내기 때문에 결과적으로 미세아교세포의 활성화는 신경세포의 손상을 악화시키게 되며, 퇴행성 뇌질환 또는 퇴행성 신경질환의 원인으로 작용한다.
또한, 성상세포(astrocyte) 역시 정상적인 뇌활동을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 특히 신경세포의 시냅스 형성, 시냅스 숫자 조절, 시냅스 기능, 신경줄기세포의 신경으로의 분화에 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 성상세포가 과도하게 반응성을 가지게 되면, 즉 과도한 활성화 상태를 유지하게 되면 신경세포의 사멸을 초래하고 이웃한 신경세포의 사멸도 유도하는 등, 퇴행성 뇌질환의 원인으로 작용하게 된다. 따라서 과도한 성상세포의 활성화 억제 역시 퇴행성 뇌질환의 새로운 치료 방법에 될 수 있다.
미세아교세포 및 성상세포의 과도한 활성화 원인물질로는 염증반응을 유발시킬 수 있는 박테리아의 내독소인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 인터페론-γ, 베타아밀로이드 및 갱글리오사이드 등이 있다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 아베마시클립이 해마 뉴런에서 수상돌기가지(dendritic spine)를 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었고, 나아가 퇴행성 뇌질환에 속하는 알츠하이머병이 발병된 마우스에 아베마시클립을 투여한 결과, 아밀로이드 플라크 억제, 베타 아밀로이드 억제 및 타우(Tau) 단백질의 인산화 억제 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
베타 아밀로이드(Aβ: 아밀로이드 베타)는 베타 세크리타제와 감마 세크레타제에 의해 분해되어 Aβ를 생성하는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에서 유도되며, 주로 알츠하이머병과 같은 뇌질환의 환자 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주성분이고 비정상적으로 축적될 경우, 각종 뇌질환의 발병원인이 된다.
또한, 과도하게 축적된 베타 아밀로이드는 해마나 대뇌피질 및 주별 세포들에 염증 반응을 일으키며 따라서 신경세포가 손상되고 뇌의 정상적인 기능을 유지하는 신경회로망까지 훼손될 수 있다.
또한 타우 단백질은 분자량이 50000 내지 70000Da인 미세소관 결합 단백질의 일정으로 신경 섬유의 얽힘에 관여한다. 타우 단백질은 정상적인 신경세포의 axon에 존재하는 microtubule-associated protein 중의 하나이다. 이러한 타우 단백질이 과도하게 축적되면 미세소관이 붕괴되면서 정상 신경세포의 네트워크가 와해된다. 타우 단백질이 축적되는 원인으로는 타우 단백질에 인이 과도하게 부착되어 인산화로 인한 중량체를 형성하는데 있는 것으로 알려져 있고 이들 타우 단백질이 축적과 신경세포의 응집은 각종 퇴행성 뇌질환의 원인이 된다고 알려져 있다.
이러한 점에서 본 발명의 아베마시클립이 베타 아밀로이드 억제 및 타우(Tau) 단백질의 인산화 억제 활성을 가지고 있는 바, 신경세포 또는 뇌세포에서 타우(Tau) 단백질의 인산화로 야기되는 퇴행성 뇌질환의 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.
뿐만 아니라 본 발명의 일실시예에서는, 알츠하이머병이 유발된 마우스를 대상으로 아베마시클립을 투여한 군과 투여하지 않은 대조군을 대상으로 인지력 및 기억력 분석을 위한 Y-maze 및 NOR 테스트를 수행하였는데, 아베마시클립을 처리한 알츠하이머병 유발 마우스는 대조군 마우스에 비해 장기기억력이 향상된 것을 확인할 수 있었다.
그러므로 본 발명의 아베마시클립은 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 치료제로 사용 가능하며, 상기 퇴행성 뇌질환은 이에 제한되지는 않으나, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌질환(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
나아가 본 발명의 아베마시클립이 기억력 개선, 인지능력 개선 및 학습력 개선의 효과가 있음을 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스 동물모델에서 확인하였는 바, 본 발명의 아베마시클립 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로도 사용이 가능하다.
본 발명에서, "기억력 개선" 및 "인지능력 개선"은 신체적인 피로, 수면 부족, 지나친 알코올 섭취, 치매 등에 의해 뇌가 위축되고 뇌 신경세포의 파괴가 이루어질 때 일어나는 기억력 감퇴, 기억력 장애 또는 인지능력 감소를, 뇌 세포를 손상시키는 유해물질을 조절하여 인지능력을 유지하거나, 뇌의 신경전달물질을 조절하여 저하된 인지능력을 개선하는 효과를 의미한다. 상기 기억력은 필요한 정보를 받아들여 뇌 속에 저장했다가 필요할 때 꺼내어 사용하는 능력이며, 인지능력은 사물을 분별하여 인지할 수 있는 능력을 말한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 이들 약학적 조성물은 상기 기술된 바와 같이, 퇴행성 뇌질환과 연관된 증상을 비롯한 다양한 질환을 치료하기 위하여 본 발명의 약학적 조성물을 투여할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호로몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
나아가 본 발명은 아베마시클립(abemaciclib mesylate)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 아베마시클립(abemaciclib mesylate)을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 식품학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 건강기능식품은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 건강기능식품에는 본 발명의 유효성분 이외에도 퇴행성 뇌질환의 예방과 개선활성에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있다.
나아가 본 발명은 아베마시클립(abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
신경염증 반응은 선천성 면역세포(미세아교세포)의 활성화, 염증 매개체 예컨대 산화질소(nitric oxide; NO), 사이토카인 및 케모카인의 방출, 대식세포 침윤을 포함하며, 이는 신경 세포 사멸을 유도한다. 미세아교세포 및 성상세포의 염증활성화는 병리학적 마커 및 퇴행성 신경 질환의 진행에 있어 중요한 메커니즘으로 생각되어진다. 미세아교세포 활성의 엄격한 조절은 뇌 항상성을 유지하고 감염 및 염증 질환을 예방하는 데 필수적이다.
한편 본 발명의 일실시예에서는, 아베마시클립이 미세아교세포 및 성상세포에서 LPS로 유도된 전 염증성 사이토카인들의 수준을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였고, 항염 인자들의 발현은 증가시킬 수 있는 것을 확인하였을 뿐만 아니라 미세아교세포 및 성상세포의 활성화를 억제할 수 있는 것을 실험을 통해 확인하였다.
그러므로 본 발명의 아베마시클립은 뇌세포에서의 염증을 억제할 수 있으며 미세아교세포 및 성상세포의 활성 억제를 통해 신경염증성질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 갖는다.
본 발명에서 상기 신경염증성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 신경모세포종, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<준비예 및 실험방법>
본 발명의 실시예에서 수행한 모든 실험은 한국 뇌연구원의 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 승인(KBRI, 승인번호 19-00049, 19-00042)을 받고 수행하였다.
세포주 및 배양조건
BV2 미세아교세포(BV2 microglial cells; Dr. Kyung-Ho Suk 박사로부터 입수)를 5 % 태아 소 혈청(FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 함유된 DMEM/고함량 글루코스(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지를 이용하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 또한 모든 in vitro 실험에서 수득한 결과들은 Image J 소프트웨어를 사용하여 반자동식으로 분석하였고, 그 결과는 현재 실험에 참여하지 않은 독립적인 연구원에 의해 확인되었다. 또한 본 발명의 하기 실시예에서는 아베마시클립으로 시중에서 판매하는 아베마시클립 메실레이트(abemaciclib mesylate)를 사용하였다.
MTT 어세이
세포 생존력은 3- (4,5- 디메틸티아졸 -2- 일) -2,5- 디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석법을 사용하였다. BV2 미세아교세포를 96- 웰 플레이트에 분주하고 FBS의 부재 조건하에서 다양한 농도의 아베마시클립 메실레이트(0.1, 1, 5, 10, 25, 50 μM)를 24시간 동안 처리하였다. 이후 세포를 0.5 mg/ml MTT로 처리하고 37 ℃에서 3 시간 동안 5 % CO2 배양기에서 배양한 다음, 580 nm에서 흡광도를 측정하였다.
RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)
전체 RNA는 TriZol(Invitrogene)을 사용하여 세포로부터 추출하였다. 이후 총 RNA는 oligoDT (GeNetBio, Korea)가 포함된 Superscript cDNA Premix Kit II를 이용하여 cDNA로 역전사 시켰다. RT-PCR은 Prime Taq Premix (GeNetBio, 한국)로 수행하였으며, RT-PCR은 BV 미세아교세포에 대하여 다음의 프라이머들을 이용하여 수행하였다.
IL-1β Forward (F): 5'-AGC TGG AGA GTG TGG ATC CC-3'
IL-1β Reverse (R): 5'-CCT GTC TTG GCC GAG GAC TA-3'
IL-6 Forward (F): 5'-CCA CTT CAC AAG TCG GAG GC-3'
IL-6 Rorward (R): 5'-GGA GAG CAT TGG AAA TTG GGG T-3'
COX-2 Forward (F): 5'-GCC AGC AAA GCC TAG AGC AA-3'
COX-2 Rorward (R): 5'-GCC TTC TGC AGT CCA GGT TC-3'
iNOS Forward (F): 5'-CCG GCA AAC CCA AGG TCT AC-3'
iNOS Rorward (R): 5'-GCA TTT CGC TGT CTC CCC AA-3'
GAPDH Forward (F): 5'-CAG GAG CGA GAC CCC ACT AA-3'
GAPDH Rorward (R): 5'-ATC ACG CCA CAG CTT TCC AG-3'
이후 RT-PCR 산물은 Eco Dye (1 : 5000, Korea)를 포함한 1.5 % 아가로즈 겔에서 전기영동에 의해 분리되었다. 전기영동된 RT-PCR은 Image J(NIH)와 Fusion (Korea)을 사용하여 이미지 분석을 수행하였다.
실시간 PCR(Real-time PCR (Q-PCR))
LPS로 유도된 전염증성 및 항염증성 사이토카인의 수준에 대하여 아베마시클립 메실레이트의 효과를 확인하기 위해, BV2 미세아교세포 및 마우스의 1차 미세아교세포를 30 분 동안 LPS (1 ㎍/ml) 또는 PBS로 처리한 후, 아베마시클립 메실레이트 (5μM) 또는 비히클 (1 % DMSO)을 5.5 시간 처리하였다. 이때, 또 다른 실험에서는 아베마시클립 메실레이트를 먼저 처리 후, LPS를 나중에 처리하였다.
이후 제조업자의 프로토콜에 따라 TRIzol (Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였고, 올리고 (dT) 프라이머가 있는 Superscript cDNA Premix Kit II (GeNetBio, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 시켰다. 그런 다음, Fast SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)와 QuantStudio 5 Real-Time PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 염증 매개체의 mRNA에 대한 사이클 임계값 (Ct) 값은 Gapdh에 대한 Ct 값으로 표준화하였고, 데이터를 대조군과 비교하여 배수 변화(fold change)로 정량화 하였다.
항체 및 억제제
웨스턴 블럿 및 면역조직화학(immunohistochemistry: IHC)의 수행을 위해 사용한 1차 항체들로는 rabbit anti-AKT (1:1000 for WB, Santa Cruz Biotechnology), rabbit anti-p-AKT (Ser473) (1:1000 for WB, Cell Signaling Technology), rabbit anti-STAT3 (Y705, 1:1000 for WB, Cell Signaling Technology)을 rabbit anti-Iba-1 (1:500 for IHC, Wako, Japan), rabbit anti-GFAP (1:500 for IHC, Neuromics, U.S.A), rabbit anti-IL-1beta (1:100 for IHC, Abcam, UK), mouse anti-IL-6 (1:100 for IHC, Santacruz Technology, U.S.A), mouse anti-AT100 (1:200, Invitrogen, U.S.A), mouse anti-AT180 (1:200, Invitrogen, U.S.A), mouse anti-Tau5 (1:200, Invitrogen, U.S.A), rabbit anti-DYRK1A (1:200, abcam, UK), mouse anti-4G8 (1:500, Biolegend, U.S.A), mouse anti-6E10 (1:500, Biolegend, U.S.A), rabbit anti-phospho-GSK-3β(Y216) (1:200, Abcam)을 사용하였다. 또한 억제제들로는 TLR4 inhibitor (TAK-242, 500 nM; Calbiochem), AKT inhibitor (MK2206, 10 mM; Selleckchem)을 사용하였다. 또한, LPS는 대장균 O111:B4 유래의 것으로 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
웨스턴블롯팅
아베마시클립 메실레이트가 AKT 신호전달에 영향을 주는지 확인하기 위해, BV2 미세아교세포를 아베마시클립 메실레이트(5μM) 또는 비히클(1% DMSO) 45분 동안 처리 후, LPS (1 μg/ml) 또는 PBS으로 45분 동안 처리하였다.
이후 세포들을 프로테아제 및 포스파타아제 억제제를 (Roche, USA) 함유하는 RIPA 완충액을 사용하여 용해시켰다. 웨스턴 블럿은 종래 일반적인 웨스턴블롯 방법에 의해 수행하였고, 이미지는 Fusion 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
세포질 및 핵 분획(Cytosol and nuclear fractionation)
아베마시클립 메실레이트가 LPS로 유도된 세포질 및 핵에서 p-STAT3의 수준에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, BV2 미세아교세포를 1시간 동안 serum free media에 배양 후, 아베마시클립 메실레이트(5μM) 또는 비히클(1% DMSO)로 30분 동안 처리하고, 이후 LPS (1 μg/ml) 또는 PBS으로 5.5 시간 처리하였다. 이후 세포를 세포질 분획용 완충액(10 mM HEPES pH 8.0, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 300 mM 슈크로스, 0.1 % NP-40 및 0.5 mM PMSF)을 사용하여 용해시켰다. 용액을 첨가하고 5 분 후, 세포 용해물을 10,000rpm, 4 ℃에서 1 분간 원심 분리하여 상등액을 세포질 분획으로 분리하여 보관하였다. 펠릿은 얼음 상에서 15 분 동안 핵 분획용 완충액(10 mM HEPES pH 8.0, 20 % 글리세롤, 100 mM KCl, 100 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT 및 0.5 mM PMSF)으로 용해시켰다. 이후 4 ℃에서 10,000 rpm으로 15 분간 원심분리 하였고, Western blot 분석은 anti-STAT3 (Y705), PCNA 및 β-actin 항체를 이용하였으며 Fusion 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
마우스 일차 미세아교세포 및 성상세포의 배양
아베마시클립 메실레이트가 일차 아교세포에서 LPS로 유도된 염증성 사이토카인의 수준을 조절하는지를 확인하기 위해, 마우스 혼합 배양물(1 차 미세아교세포 및 1 차 성상 세포의 혼합물)을 제조하였다. 구체적으로, 출생 후 1 일령 C57BL/6 마우스의 전체 뇌를 잘게 자르고 70 μm 나일론 메쉬를 사용하여 기계적으로 파괴시켰다. 혼합된 신경 아교세포를 75 T 배양 플라스크에 분주하고 10 % FBS (100 unit/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 포함)가 보충된 저 글루코스 DMEM 배지에서 성장시켰다. 이후 마우스의 1 차 성상세포를 수득하기 위해, 혼합된 아교세포를 250 rpm에서 밤새 진탕시켰다. 다음날, 컨디셔닝된 배지를 버리고, 나머지 세포를 트립신 -EDTA를 사용하여 분리한 후, 원심분리(1200 rpm, 30 분) 하였다. 원심 분리 후, 컨디션 배지(conditioned medium)를 제거하고, 세포 펠렛 (1차 성상세포)을 수집하여 1 차 성상세포에서 신경 염증에 대한 아베마시클립 메실레이트의 영향에 대한 분석을 수행하였다.
마우스 일차 미세아교세포의 수득을 위해, 혼합된 아교 세포를 37 ℃에서 5 % CO2 인큐베이터에서 40 분 동안 온화한 트립신 처리(무혈청 DMEM에서 0.25 % 트립신의 5배 희석)를 수행하였다. 이후 상층부의 성상 세포층은 모두 버린 후, 10% FBS를 함유하는 저 글루코스 DMEM을 첨가한 다음, 남아 있는 1차 미세 아교 세포를 실험에 사용하였다. 미세아교세포 또는 성상세포를 1시간 동안 serum free media에 배양 후, 아베마시클립(5μM) 또는 비히클(1% DMSO)로 30분 동안 처리하고, 이후 LPS (200 ng/ml) 또는 PBS으로 5.5 시간 처리한 후 실시간 PCR을 수행하였다.
야생형 마우스(wild type mice)
모든 실험은 한국 뇌연구원(IACUC-2016-0013)이 승인된 동물 실험 및 지침에 따라 수행하였다. C57BL6 / N 마우스는 OrientBio Company로부터 구입 하여 사용하였으며, 수컷 C57BL6 / N (8 주, 25-30g) 마우수는 병원균이 없는 시설에서 22 ℃의 주위 온도에서 12 시간의 명암주기 하에 사육하였다. LPS에 의한 인지기능 장애에 대한 아베미시클립의 효능을 확인하기 위해, 야생형 마우스는 7일간 매일 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여) 또는 베히클 (10% DMSO) 투여 30분 후 LPS (250 ㎍/ml, 복강투여) 또는 PBS를 투여하였고, 8일 및 9일째 Y maze와 NOR test를 수행하였다. 행동 시험을 수행하는 기간 (8일 및 9일)동안에는 행동실험 후 아베마시클립과 LPS를 투여하였다. LPS로 유도된 신경염증에 대한 아베마시클립 메실레이트의 영향을 확인하기 위해, 야생형 마우스에 아베마시클립 메실레이트(30 mg/kg, i.p.) 또는 비히클(10 % DMSO)을 매일 3일 동안 복강 내 투여하였고, 이어 연속적으로 LPS (Sigma, Escherichia coli, 10 mg / kg, ip) 또는 PBS를 6 시간 동안 투여한 후 뇌조직을 분석하였다. 또한 데이터는 Image J 소프트웨어를 사용하여 반자동 방식으로 분석되었으며, 결과는 현재 실험에 참여하지 않은 독립적인 연구원에 의해 확인되었다.
알츠하이머 유발 마우스 동물모델 제작(5x FAD mice)
F1 세대 수컷 5x FAD 마우스(stock # 34848-JAX, B6Cg-Tg APPSwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V6799Vas/Mmjax)는 Jackson Laboratory에서 구입하여 사용하였다. 5x FAD 마우스(3 개월령)를 22℃의 주위 온도에서 하루에 12시간의 밝고 어두운 상태로 조절하면서 무균 시설에서 사육하였다. 5xFAD 마우스에 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여) 또는 베히클 (10% DMSO)을 매일 14일간 투여 후, 15일째 Y maze test를 16-17일째 NOR test를 수행 한 후 형광조직 염색 또는 골지 염색을 수행하였다. 또한, 아베마시클립의 퇴행성 뇌질환 병증 조절 효능을 현재 시판되고 있는 치매치료제인 도네페질과 비교하기 위하여, 5xFAD 마우스에 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여), 도네페질 (1 mg/kg, 복강투여) 또는 베히클 (10% DMSO)을 매일 14일간 투여 후, 15일째 Y maze test를 16-17일째 NOR test를 수행하고 형광조직 염색을 수행하였다.
알츠하이머 유발 마우스 동물모델 제작(PS19 mice)
수컷 PS19 마우스(stock # 008169-JAX, B6;C3-Tg (Prnp-MAPT * P301S) PS19Vle/J)는 Jackson Laboratory에서 구입하여 사용하였다. PS19 마우스(6 개월령)를 22℃의 주위 온도에서 하루에 12시간의 밝고 어두운 상태로 조절하면서 무균 시설에서 사육하였다. PS19 마우스에 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여 또는 60 mg/kg, 구강투여) 또는 베히클 (10% DMSO)을 매일 14일간 투여 후, 15일째 Y maze test를 15-16일째 NOR test를 수행 하였다.
형광조직염색(Immunofluorescence staining)
In vivo에서 LPS로 유도된 신경염증에 대한 아베마시클립 메실레이트의 영향을 확인하기 위해, 야생형 마우스에 아베마시클립 메실레이트(30 mg/kg, i.p.) 또는 비히클 (10 % DMSO)을 매일 3일 동안 복강 내 투여하였고, 이어 연속적으로 LPS (Sigma, Escherichia coli, 10 mg / kg, ip) 또는 PBS를 6 시간 동안 투여하였다. 그런뒤, LPS 또는 PBS를 주사한 후, 마우스를 관류시키고 4 % 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 고정시킨 다음, 뇌 조직을 급속 냉동시키고, cryostat(35㎛ 두께)를 사용하여 절편화 하였다. 또 다른 면역조직화학 실험을 위해서는 알츠하이머 유발 마우스(5x FAD mice)에 아베마시클립 메실레이트(30 mg/kg, i.p.) 또는 비히클 (10 % DMSO)을 복강 내 매일 2주간 투여하고, 14일 후 상기와 동일한 방법으로 뇌조직을 절편화하였다.
이후 각 뇌의 섹션은 면역조직화학염색을 위해 처리되었는데, 뇌 절편을 PBS로 헹구고 0.2 % Triton X-100 및 1 % BSA를 함유한 PBS를 이용하여 실온에서 1 시간 동안 막투과(permeabilized) 시켰다. 그 이후, 1차 항체를 PBST (0.2 % Triton X-100 in PBS)에 희석하여 4도씨에서 24시간 반응시키고, 다음날 상기조직을 PBST로 3회 세척 후 형광 신호가 부착된 2차 항체로 상온에서 2시간 반응 시켰다. 그 이후, 뇌절편을 PBS로 3회 세척 후 슬라이드상에 올리고 형광현미경으로 관찰하였다.
골지 염색(Golgi staining)
In vivo에서 수지상극화(dendritic spinogesis)에 대한 아베마시클립 메실레이트의 영향을 확인하기 위해, FD Rapid GolgiStain Kit (FD Neurotechnologies, Ellicott City, MD, USA)를 사용하여 골지 염색을 수행하였다. 구체적으로, 비히클 또는 아베마시클립 메실레이트가 주입된 동물을 암실에서 15일 동안 용액 A 및 B에 각각 침지시키고 이후 용액 C로 옮겨 24 시간 동안 두었다. 그런 뒤 24 시간 후에 용액 C를 교체하고, 각 마우스의 뇌를 VT1000S Vibratome (Leica, Bannockburn, IL, USA)를 사용하여 150-μm 두께로 슬라이스 하였다. 수지상(Dendritic) 이미지는 Axioplan 2(Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 명시야 현미경으로 촬영하였다. 수지상극밀도(dendritic spine density)의 측정은 브레그마(bregma)에 대하여, -1.70 mm 내지 -2.30 mm의 각 마우스 뇌의 8~10개의 절편을 사용하여 측정하였다. 모든 데이터는 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석되었으며, 모든 실험 결과는 현재 실험에 참여하지 않은 독립적인 연구원에 의해 확인되었습니다.
Y 미로 시험 (Y maze)
정상 동물 (wild type mice) 혹은 알츠하이머 유발 동물모델 (5xFAD mice 및 PS19 mice)에 아베마시클립 메실레이트 투여 시 단기 기억력 향상 능력을 검증하기 위해, 각 팔의 길이가 42cm, 너비가 3cm, 높이가 12cm이고, 세 팔의 각도가 120도로 이루어진 Y 모양의 maze의 한 쪽 팔 끝에 동물을 위치하게 하고, 5분간 방문한 팔을 기록 하였다. 그 후에 Percent alteration= (alteration 횟수 / triads 횟수) x 100을 구하여 단기기억력의 척도로 사용하였다.
alteration: 세 개의 서로 다른 팔에 차례로 들어간 경우에 1점 부여함
triads: 전체 방문 횟수-2
신규 물질 탐색 시험 (Novel object recognition test)
정상 동물 (wild type mice) 혹은 알츠하이머 유발 동물모델 (5xFAD mice 및 PS19 mice)에 아베마시클립 메실레이트 투여 시 장기 기억력 향상 능력을 검증하기 위해, 42 x 42x 25cm 크기의 상자에서 모양과 크기가 동일한 두 개의 물체를 구석에 위치시킨 후 동물을 상자 가운데서 출발시키고, 동물이 물체에 관심을 보이는 시간을 5분간 기록 하였다. 24시간 후 두 물체 중 하나를 새로운 것으로 교체한 후 기존 물체와 새로운 물체로 접근한 시간을 각각 측정하고, 새로운 물체에 대한 선호도를 분석하여 장기 기억 분석 지표로 사용하였다.
통계처리
Graphpad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 양측 T- 검정 또는 ANOVA를 사용하여 모든 데이터를 분석하였다. post-hoc 분석은 Tukey의 Multiple Comparison 테스트로 수행하였고 유의성은 p <0.05로 설정하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M로 나타내었다(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).
<실시예 1>
아베마시클립의 BV2 미세아교세포에 대한 세포독성 여부 및 전염증성 사이토카인의 수준감소 분석
본 발명자들은 아베마시클립이 BV2 미세아교세포에 대한 세포 독성이 있는지 확인하기 위해, BV2 미세아교세포에 아베마시클립을 농도별(0.1, 1, 5, 10, 25, 50uM)로 처리한 후, MTT 분석을 수행하였다.
분석 결과, 도 1A 및 1B에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립은 BV2 미세아교세포에 대해 세포 독성을 유발하지 않는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명자들은 아베마시클립이 LPS로 유도되는 전염증성 사이토카인들의 발현수준에 영향을 주는지 확인하기 위해, BV2 미세아교 세포에 아베마시클립 (5 μM) 또는 비히클 (1 % DMSO)을 30분 동안 전처리하고, LPS(1㎍/ ml) 또는 PBS로 5.5 시간 동안 처리한 다음, 염증성 사이토카인들의 mRNA 수준을 분석하였다. 이때, 또 다른 실험으로 BV2 미세아교 세포에 LPS(1㎍/ ml) 또는 PBS를 30분 동안 전처리하고, 아베마시클립(5 μM) 또는 비히클(1 % DMSO)을 5.5 시간 동안 처리한 다음, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1beta, iNOS, 및 COX-2 의 mRNA 수준을 분석하였다.
그 결과, 도 1C~1G에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립을 전처리 후 LPS로 염증을 유도한 경우, 염증성 사이토카인 IL-6, IL-1beta, iNOS, COX-2의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났고, LPS로 염증을 유도 후 아베마시클립을 처리한 경우, 염증성 사이토카인 IL-6, IL-1beta, iNOS, COX-2들의 생성이 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다 (도 1H-1L).
따라서 이러한 결과는 아베마시클립이 염증반응이 유발되기 전과 후 모두 작용하여 전염증성 사이토카인의 생성을 억제시킬 수 있음을 의미한다. 또한, 본 발명자들은 아베마시클립이 항-염증 반응에도 영향을 주는지 확인하기 위해, BV2 미세아교세포를 30분 동안 아베마시클립(5 μM) 또는 비히클 (1 % DMSO)을 전처리하고, 이후 LPS(1μg/mL) 또는 PBS로 5.5시간 동안 처리한 후, IL-4, IL-10 및 MRC-1의 mRNA 수준을 측정하였다.
또한 이때, BV2 미세아교세포를 30분 동안 LPS(1μg/mL) 또는 PBS로 전처리한 후, 아베마시클립(5 μM) 또는 비히클(1 % DMSO)을 5.5시간 동안 처리한 군에 대해서도 IL-4, IL-10 및 MRC-1의 mRNA 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 1M~1R에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립은 LPS가 처리된 BV2 미세아교세포에서 IL-4, IL-10 및 MRC-1 mRNA 수준을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났으며, 또한, 아베마시클립을 먼저 전처리하고, 이후 LPS를 처리한 경우에서도 동일하게 항염증 인자들인 IL-4, IL-10 및 MRC-1의 mRNA 수준이 유의하게 증가되는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명자들은 이러한 결과들을 통해, 아베마시클립이 LPS로 유도된 전염증성 사이토카인들의 발현 및 생성을 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 항염증성 사이토카인의 발현 및 생성을 촉진시키는 활성이 있어, 과도한 염증반응으로 유발될 수 있는 뇌염증으로 인한 뇌염증 관련 질환 및 퇴행성뇌질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 2>
아베마시클립의 TLR4/AKT/STAT3 신호전달에 미치는 영향 분석
아베마시클립이 어떠한 신호전달체계를 통해 LPS-유도 염증반응을 조절할 수 있는지를 확인하기 위해, TLR4 신호전달에 대한 아베마시클립의 영향을 분석하였다. 이를 위해 먼저 BV2 미세아교세포를 배양 후, 1시간 동안 starvation으로 유지시킨 후, TAK-242(TLR4 억제제, 500 nM) 또는 비히클 (1 % DMSO)로 30분 동안 처리하고 이후 아베마시클립(5 μM) 또는 비히클(1% DMSO)을 30분 동안 처리 후, LPS(1μg/ml) 또는 PBS로 5시간 동안 처리하였다. 이후 각 실험군에 대한 염증성 사이토카인의 수준을 RT-PCR을 통해 분석하였다.
그 결과, 아베마시클립을 처리한 군들은 LPS로 유도되는 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, iNOS 및 COX-2의 mRNA 수준을 유의하게 감소시켰고, 특히 TAK-242 및 아베마시클립을 병용처리한 군에서 LPS로 유도되는 전염증성 사이토카인 iNOS mRNA 수준이 유의적으로 변화가 없는 것으로 나타났다(도 2A~2E 참조). 따라서 아베마시클립은 LPS에 의한 염증반응의 최종산물인 iNOS의 발현이 TLR4 신호전달경로에 의존하여 억제한다는 것을 알 수 있었다.
또한 본 발명자들은 아베마시클립이 LPS 매개의 염증반응 억제에 관여하는 세포 내 신호 전달경로를 확인하기 위해, BV2 미세아교세포를 배양 후, 1시간 동안 starvation을 유지한 후, 아베마시클립(5 μM) 또는 비히클(1% DMSO)을 45분 동안 처리한 후, LPS(1μg/ml) 또는 PBS로 45분 동안 처리한 다음, AKT 및 p-AKT(인산화됨)의 정도를 웨스턴 블럿을 통해 분석하였다.
그 결과, 아베마시클립이 처리된 BV2 미세아교 세포에서는 LPS에 의해 유도되는 p-AKT의 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났고, 반면 AKT 단백질의 총 발현수준에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 2F~2H 참조).
다음으로, 아베마시클립이 AKT 의존적으로 LPS-매개의 전염증성 사이토카인의 수준을 억제하는지 확인하기 위해, BV2 미세아교세포를 MK2206(AKT 억제제, 10uM) 또는 비히클 (1 % DMSO)로 30 분 동안 처리한 다음, 아베마시클립(5 μM) 또는 비히클 (1% DMSO)을 30분 동안 처리하고 이후 LPS (1μg/ml) 또는 PBS를 5시간 동안 처리하였다.
이후 전염증성 사이토카인의 수준을 분석한 결과, MK2206, 아베마시클립 및 LPS를 모두 처리한 군이 다른 군에 비해 LPS로 유도되는 iNOS, IL-1beta 및 COX-2의 mRNA 수준이 유의성 있게 변화하지 않음을 확인하였다(도 2I~2M 참조). 이러한 결과는 LPS로 유도된 전염증성 사이토카인의 iNOS, IL-1beta 및 COX-2가 AKT 신호전달을 아베마시클립이 억제하여 뇌염증을 억제시킬 수 있음을 의미한다.
또한, 아베마시클립이 세포질 및 핵에서의 p-STAT3 수준을 조절할 수 있는지를 확인하기 위해, BV2 미세아교세포를 아베마시클립(5 μM) 또는 비히클(1% DMSO)로 30분 동안 처리하고 LPS로 5.5 시간 동안 처리 후, 각 실험군으로부터 세포 용해물을 수득하고, 다시 세포질과 핵 분획물로 분획화한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 p-STAT3의 수준을 분석하였다.
그 결과, 도 2N~2Q에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립에 의해 핵에서의 p-STAT3 수준이 유의하게 감소되는 것으로 나타났고, 반면 세포질(cytosol)에서의 p-STAT3 수준에는 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 아베마시클립은 핵에서의 p-STAT3 수준을 억제하여 궁극적으로 STAT3의 활성화를 억제할 수 있음을 의미하는데, 이는 STAT3의 인산화(p-STAT3)는 핵 내에서 염증반응과 관련된 인자들의 발현을 유도하는 역할을 하는 것으로 알려져 있어, p-STAT3 수준 억제는 염증인자들의 발현을 저해시킬 수 있으므로 궁극적으로 과도한 염증반응을 억제할 수 있음을 의미한다.
<실시예 3>
미세아교세포 및 성상세포에서 아베마시클립 처리에 따른 LPS에 의한 전염증성 사이토카인의 억제효과 분석
미세아교세포에서 아베마시클립이 LPS-유도된 신경염증과 관련성이 있는지를 분석하기 위해, 저혈당(low glucose) 조건 하에서 일차 미세아교세포를 배양 후, 일차 미세아교세포를 아베마시클립 (5μM) 또는 비히클 (1 % DMSO)로 30분 동안 전처리하고, LPS (200 ng/ml) 또는 PBS로 5.5시간 동안 처리한 다음, 실시간 PCR을 수행하여 전염증성 사이토카인의 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립이 처리된 일차 미세아교세포에서 LPS로 유도된 전 염증성 사이토카인들의 수준이 매우 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다.
또한 본 발명자들은 동일한 약물 처리 조건에서 아베마시클립이 일차 성상세포에서도 LPS에 의한 신경염증 반응을 조절할 수 있는지를 확인하였는데, 그 결과, 아베마시클립이 처리된 일차 성상세포에서도 유의적으로 LPS 매개의 염증성 사이토카인인 COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-a 및 iNOS의 mRNA 수준이 감소되는 것으로 나타났다(도 3B).
이러한 결과는 아베마시클립이 미세아교세포 및 성상세포 모두에서 LPS에 의한 신경염증 반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다.
<실시예 4>
야생형 마우스에서 LPS로 유도되는 인지기능 저하에 대한 아베마시클립의 영향 분석
아베마시클립이 야생형 마우스에서 반복적인 염증자극으로 유발되는 기억기능 저하를 향상시키는지 확인하기 위해, 야생형 마우스에 7일간 매일 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여) 또는 베히클 (10% DMSO) 투여하고 30분 후, LPS (250 ㎍/ml, 복강투여) 또는 PBS를 투여하였으며, 8일 째 Y maze와 NOR 훈련을 시켰고 9일째 NOR 테스트를 수행하였다. 행동 시험을 수행하는 기간 (8일 및 9일)동안에는 행동실험 후 아베마시클립과 LPS를 투여하였다.
그 결과, 도 4A-4B에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립의 처리는 LPS에 의해 유발된 기억력이 결핍된 마우스의 공간 기억력(Y maze 수행으로 분석) 및 인식 메모리(NOR 테스트 수행으로 분석)를 향상시키는 것으로 나타났다.
<실시예 5>
야생형 마우스에서 LPS로 유도되는 미세아교세포/성상세포의 활성화 및 전염증성 사이토카인 수준에 대한 아베마시클립의 영향 분석
In vivo에서도 아베마시클립이 LPS로 유도되는 신경염증을 조절할 수 있는지를 분석하였다. 이를 위해, 야생형 마우스(정상 마우스)에 아베마시클립 (30 mg /kg, ip) 또는 비히클 (10% DMSO)을 3일 동안 매일 주사하고, LPS (10 mg/kg, ip) 또는 PBS를 6시간 동안 처리하였다. 이후 상기 마우스로부터 피질(cortex) 및 해마(hippocampus)를 각각 분리한 후, 항-Iba-1, 항-GFAP 항체 및 항-IL-1β 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 5A, 5C에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립 처리군에서는 피질(cortex)에서 LPS로 유도된 Iba-1이 유의하게 감소되는 것으로 나타났고, 반면, 해마(hippocampus)에서는 아베마시클립의 처리에 따른 Iba-1 감소가 피질에서보다는 미비한 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 아베마시클립이 미세아교세포의 세포 활성화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 아베마시클립이 LPS로 유도되는 성상세포의 활성화를 억제할 수 있는지 확인하였는데, 그 결과, 도 5B~5C에 나타낸 바와 같이, 피질(cortex)에서는 LPS로 유도된 성성세포의 활성화 표지자인 GFAP이 유의하게 감소되는 것으로 나타났고, 반면, 해마(hippocampus) 에서는 GFAP의 감소가 피질에서보다는 미비한 것으로 나타났다.
또한, 아베마시클립이 LPS로 유도되는 전 염증성 사이토카인의 수준에 영향을 주는지 확인한 결과, 도 6A, 6C에 나타낸 바와 같이, 피질(cortex) 및 해마 CA1 region (hippocampus) 에서 아베마시클립 처리에 의해 LPS로 유도된 IL-1β가 유의적으로 감소된 것으로 나타났으며, 도 6B, 6C에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스의 피질(cortex)에서 LPS로 유도된 IL-6도 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다.
그러므로 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 아베마시클립이 정상 신경세포에서도 LPS에 의한 미세아교세포 및 성상세포의 활성화를 억제할 수 있고, 전염증성 사이토카인의 생성 및 발현을 억제할 수 있어, LPS에 의한 뇌신경세포의 염증 유발은 사전에 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
퇴행성 뇌질환 유발 마우스에서 아밀로이드 베타에 의해 유도되는 미세아교세포/성상세포의 활성화 및 전염증성 사이토카인 수준에 대한 아베마시클립의 영향 분석
상기 실시예 5를 통해 정상 마우스의 뇌 신경세포에서 아베마시클립이 뇌염증을 억제할 수 있는 활성이 있음을 확인함에 따라, 본 발명자들은 퇴행성 뇌질환 중 하나인 알츠하이머 질환을 유발시킨 마우스(5x FAD mice)를 대상으로, 아베마시클립의 처리가 뇌염증 억제 활성이 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 알츠하이머 유발 5x FAD 마우스를 대상으로 아베마시클립(30 mg /kg, ip) 또는 비히클 (10 % DMSO)을 매일 2주 동안 복강 내 투여 후, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 면역조직화학 염색법을 수행하였다.
그 결과, 도 7A, 7D에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립 처리군에서는 피질(cortex) 및 해마(hippocampus)에서 미세아세포 활성의 지표자인 Iba-1이 유의하게 감소되는 것으로 나타났고, 도 7B, 7D에 나타낸 바와 같이, 피질(cortex)에서는 아베마시클립 처리군이 대조군에 비해 성성세포의 활성화 표지자인 GFAP이 유의하게 감소되는 것으로 나타났으며, 반면, 해마(hippocampus) 에서는 GFAP의 감소가 피질에서보다는 미비한 것으로 나타났다.
또한, 도 7C, 7D에 나타낸 바와 같이, 피질(cortex) 에서 아베마시클립 처리군이 대조군에 비해 염증성 사이토카인인 IL-1β가 유의적으로 감소된 것으로 나타났다.
그러므로 아베마시클립이 퇴행성 뇌질환이 유발된 뇌의 신경세포에서 미세아교세포 및 성상세포의 활성화를 억제할 수 있고, 전염증성 사이토카인의 생성 및 발현을 억제할 수 있어, 퇴행성 뇌질환에 대한 새로운 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.
<실시예 7>
아베마시클립에 의한 퇴행성 뇌질환 유발 마우스의 뇌조직에서 인지기능 및 수상돌기가지 밀도(dendritic spine density) 증가현상 분석
아베마시클립이 수상돌기가지(dendritic spine)의 형성과 학습 및 기억력 증진에 영향을 주는지를 확인하기 위해, 알츠하이머 유발 마우스에 아베마시클립 (30 mg /kg, ip) 또는 비히클 (10 % DMSO)을 복강 내 투여시키고, 15일째에 Y maze실험을 수행하였고, 16일째에 NOR 훈련을 수행하였으며, 17일째에 NOR 테스트를 수행하였다. 또한, 상기 마우스의 피질 및 해마 뉴런에 대해 수상돌기가지의 수를 측정하였다.
그 결과, 도 8A, 8B에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립의 처리는 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스의 단기기억 및 장기기억력을 향상시키는 것으로 나타났고, 도 8C~8E에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립 처리군이 대조군에 비해 대뇌피질 및 해마 조직 AO 영역에서 수상돌기가지 수가 증가되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 골지 염색 사진 결과에서도 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명의 아베마시클립은 퇴행성 뇌질환이 유발된 뇌조직에서 수상돌기가지의 수를 증가시킬 수 있으며, 퇴행성 뇌질환으로 인한 감소된 인지력 및 기억력이 증진되는 것으로 나타나, 아베마시클립을 퇴행성 뇌질환의 치료제로서 사용 가능하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 8>
아베마시클립의 타우 인산화 억제 활성 분석
타우 인산화에 대한 아베마시클립의 영향을 확인하기 위해, 알츠하이머병이 유발된 3 개월령 5x FAD 마우스에 아베마시클립 (30 mg / kg, ip) 또는 비히클 (10% DMSO)을 매일 2주 동안 투여한 후, 인산화된 타우 단백질을 검출할 수 있는 항 -AT100 항체, 항 -AT180 항체 및 항 Tau-5 항체를 이용하여 면역조직화학을 수행하였다.
그 결과, 아베마시클립이 주입된 퇴행성 뇌질환(알츠하이머병)이 유발된 5x FAD 마우스의 대뇌피질에서는 아베마시클립을 주입하지 않은 대조군에 비해 인산화된 타우 단백질인 AT100이 유의미하게 감소되는 것으로 나타났고, 5x FAD 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 아베마시클립을 주입하지 않은 대조군에 비해서도 AT180 및 Tau-5의 수준이 모두 유의미하게 감소한 것으로 나타났다(도 9A~9D 참조).
따라서 이러한 결과를 아베마시클립은 퇴행성 뇌질환의 원인으로 알려진 타우 인산화를 효과적으로 억제하여 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 9>
퇴행성 뇌질환 마우스에서 아베마시클립에 의한 Aβ 플라크 감소효과 분석
아베마시클립이 아밀로이드 플라크(Aβ)의 병리기전에 영향을 미치는지 분석하기 위해, 3 개월된 알츠하이머병 유발 마우스인 5x FAD 마우스에 아베마시클립 (30 mg / kg, ip) 또는 비히클 (10 % DMSO)을 매일 2주 동안 주사하였고, 이후 상기 마우스로부터 피질 및 해마 조직을 각각 분리한 후, 아밀로이드 플라크(Aβ)의 수준 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립이 투여된 알츠하이머 유발 마우스의 해마 CA1 부위에서 아밀로이드 플라크(Aβ)의 수준이 비히클을 처리한 대조군에 비해 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났다.
<실시예 10>
퇴행성 뇌질환 마우스에서 아베마시클립에 의한 인지기능 향상 효능 및 도네페질과의 효능 비교
아베마시클립의 퇴행성 뇌질환 병증 조절 효능을 현재 시판되고 있는 치매 치료제인 도네페질과 비교하기 위하여, 5xFAD 마우스에 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여), 도네페질 (1 mg/kg, 복강투여) 또는 베히클 (10% DMSO)을 매일 14일간 투여 후, 15일째 Y maze test를 16-17일째 NOR test를 수행 하였다.
그 결과, 도 11A, 11B에 나타낸 바와 같이, 도네페질을 투여한 군은 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스에서 단기기억 및 장기기억력이 향상되었고, 아베마시클립 메실레이트의 처리도 도네페질과 비슷한 수준으로 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스의 단기기억 및 장기기억을 향상시키는 것으로 나타났다.
<실시예 11>
퇴행성 뇌질환 마우스에서 아베마시클립에 의한 성상세포 활성저해 효능 및 도네페질과의 효능 비교
아베마시클립의 퇴행성 뇌질환 병증 조절 효능을 현재 시판되고 있는 치매치료제인 도네페질과 비교하기 위하여, 5xFAD 마우스에 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여), 도네페질 (1 mg/kg, 복강투여) 또는 베히클 (10% DMSO)을 매일 14일간 투여 후, 15~17일째 행동실험을 수행하고 면역 조직화학분석을 시행하였다.
그 결과, 도 12A, 12B에 나타낸 바와 같이, 도네페질의 투여는 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스의 대뇌피질에서 성상세포 활성 및 성상세포의 증식을 감소시켰고, 아밀로이드 플라크와 직접적으로 상호작용하는 성상세포의 숫자도 감소시킨 것으로 나타났다. 또한 아메마시클립을 투여한 군에서도 도네페질 투여군과 유사한 수준으로 성상세포 활성 및 증식을 억제하고, 아밀로이드 플라크와 상호작용하는 성상세포의 수를 감소시키는 것으로 나타났다.
<실시예 12>
퇴행성 뇌질환 마우스에서 아베마시클립에 의한 타우 인산화 효소 활성 저해 분석 및 도네페질과의 효능 비교
아베마시클립의 퇴행성 뇌질환 병증 조절 효능을 현재 시판되고 있는 치매치료제인 도네페질과 비교하기 위하여, 5xFAD 마우스에 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여), 도네페질 (1 mg/kg, 복강투여) 또는 베히클 (10% DMSO)을 매일 14일간 투여 후, 15~17일째 행동실험을 수행 하고 면역 조직화학분석을 시행하였다.
그 결과, 도 13A에 나타낸 바와 같이, 도네페질의 투여는 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스의 해마에서 타우 인산화 효소인 phospho-GSK-3β의 발현을 감소시켰으며, 아베마시클립의 투여는 해마부위에서 도네페질 투여보다 타우 인산화 효소인 phospho-GSK-3β 발현 저해 효능이 유의미하게 높은 것으로 나타났다. 또한, 도 13B에 나타낸 바와 같이, 도네페질의 투여는 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스의 피질 및 해마에서 타우 인산화 효소인 DYRK1A의 발현을 감소시켰으며, 아베마시클립의 투여는 피질 및 해마부위에서 도네페질 투여보다 타우 인산화 효소인 DYRK1A발현 저해 효능이 유의미하게 높은 것으로 나타났다.
<실시예 13>
타우 과발현 퇴행성 뇌질환 마우스에서 아베마시클립에 의한 인지기능 향상 효능 확인
아베마시클립이 APP를 과발현하는 퇴행성뇌질환 동물모델인 5xFAD 마우스에서 타우 인산화 감소 및 타우 인산화 효소 활성 저해 효능을 보였으므로, 타우를 과발현하는 퇴행성뇌질환 동물모델인 PS19 마우스에서 아베마시클립이 인지기능을 조절할 수 있는지 확인하기 위해, 6개월령 PS19 마우스에 아베마시클립 (30 mg/kg, 복강투여 또는 60 mg/kg, 구강투여) 또는 베히클 (10% DMSO)을 매일 14일간 투여 후, 15일째 Y maze test를 15-16일째 NOR test를 수행하였다.
그 결과, 도 14A, 14B에 나타낸 바와 같이, 아베마시클립의 투여는 타우의 과별현으로 퇴행성 뇌질환이 유발된 마우스의 공간지각 능력 및 인식 메모리 기능을 향상시키는 것으로 나타났다.
이상의 결과들을 통해, 본 발명자들은 아베마시클립이 LPS로 유도되는 전염증성 사이토카인들의 발현 및 생성을 효과적으로 억제할 수 있고, LPS로 유도된 미세아교세포 및 성상세포의 활성화를 억제할 수 있으며 동시에 아밀로이드 플라크 억제, 수상돌기수의 증가, 장기기억 향상 및 타우 단백질의 인산화 억제활성을 모두 가지고 있으므로, 아베마시클립 메실레이트를 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (16)
- 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌병증(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 염증성 사이토카인인 COX-2, IL-1β, IL-6 또는 iNOS의 발현 및 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌병증(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 TLR4(Toll-like receptor 4)의 활성을 억제하고, p-STAT3 수준을 억제하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌병증(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은,
미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하고;
아밀로이드 플라크를 억제하며;
수상돌기의 수 증가;
타우 단백질의 인산화 억제; 또는
장기기억 향상을 갖는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌병증(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 삭제
- 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌병증(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제6항에 있어서,
상기 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 염은 염증성 사이토카인인 COX-2, IL-1β, IL-6 또는 iNOS의 발현 및 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌병증(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제6항에 있어서,
상기 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 염은 TLR4(Toll-like receptor 4)의 활성을 억제하고, p-STAT3 수준을 억제하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌병증(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제6항에 있어서,
상기 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 염은,
미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하고;
아밀로이드 플라크를 억제하며;
수상돌기의 수 증가;
타우 단백질의 인산화 억제; 또는
장기기억 증가 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌병증(encephalopathy) 및 뇌졸중으로 이루어진 군 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 외상후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 아베마시클립 (abemaciclib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 외상후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 신경염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 삭제
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2021
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