JP5783377B2 - 網膜色素変性症を予防する及び遅発させるためのセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝性網膜変性を予防する及び遅発させるためのセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤の使用と、それらを含む、特に、脂質ナノスフェアに基づく組成物に関する。

（技術の現状）
用語網膜色素変性症（ＲＰ）は、両眼網膜の進行性の変性に関する一群の遺伝性疾患を含む。発症した人は、夜間視力の漸次的な低下と、周辺視野の減少（“トンネル視野”として知られる）を患い、やがて、中心視力を失う可能性もある。そして、該疾病は、低視力（ｈｙｐｏｖｉｓｉｏｎ）及び失明にまで進行することがある。他の一般的な特性は、まぶしさに対する増加した感度であり、言い換えれば、明るさから暗さまでの、及びその逆の変化での遅れた適応である。該疾患は、その疾患名に起因する色素の特徴的な沈着によって、光受容体（錐体及び主に桿体であり、周辺視力に関与する）、又は網膜色素上皮に影響を及ぼし得る。

網膜色素変性症は、およそ４０００人に１人に発症し、世界中にみられ、現在治療することができない。イタリアでは、少なくとも１５，０００人が発症し、低視覚（ｈｙｐｏｓｉｇｈｔ）であり、有効な治療法はなく、明らかな経済的・社会的影響を及ぼしている。ＥＵの少なくとも１５０，０００人が、不治の疾患に罹患している。該疾病は、遺伝性であるが、生殖能力に影響を及ぼさず、また、工業国での平均寿命の増加により、その発生率は増加する傾向にある。

Ｈｏｄｇｅ ＷＧら［Ｃａｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ２００６ Ａｕｇ；４１（４）： ４８１−９０］は、網膜及び水晶体の疾患を治療し、特に、網膜色素変性症の進行を予防する又は遅らせるω‐３脂肪酸の可能な使用について記載する。しかしながら、著者は、治験が予備的段階にあることを強調している。

ある神経栄養因子の使用が提案されたが、それは未だ試験段階にあり、これらの物質がタンパク質構造を有し、高分子量であり、また、自由に細胞に浸透しないという事実によって、制限される。特に、Ｔｈａｎｏｓ Ｃ、Ｅｍｅｒｉｃｈ Ｄ．［Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００５ Ｎｏｖ；５（ｌｌ）： １４４３−５２］は、網膜色素変性症、黄斑変性、緑内障等の網膜疾患の治療のためのＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＬＥＤＧＦ、ＰＥＤＦ等の神経栄養因子の制御放出について記載する。

一部の筆者によれば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような抗酸化剤による、あるいはビタミンＡパルミテートのような栄養補助食品による経口治療は、網膜錐体の二次変性を遅発させる。しかしながら、これらの治療の有効性は、科学界では未だ論争の的になっている。Ｂｅｒｓｏｎ ＥＬ．［Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｃｌｉｎ． ２０００ Ｆａｌｌ；４０（４）： ９３−１１１］は、ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ及びＢ６栄養補助食品、低タンパク食等の栄養上のアプローチによって、光受容体に影響を及ぼす変性網膜疾患を治療する試みについて記載する。

研究の中には、網膜電図（ＥＲＧ）によって機器で測定したところ、陽性細胞反応を観察し、高圧室で酸素により治療した患者の統計的に有意な振幅の増加を示しているものがあるが、高圧治療は、特に有効ではない。

Ｈｏｄｇｅ ＷＧ， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ２００６ Ａｕｇ；４１（４） ：４８１−９０ Ｔｈａｎｏｓ Ｃ、Ｅｍｅｒｉｃｈ Ｄ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００５ Ｎｏｖ；５（ｌｌ）： １４４３−５２ Ｂｅｒｓｏｎ ＥＬ．， Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｃｌｉｎ． ２０００ Ｆａｌｌ；４０（４）： ９３−１１１

非毒性量のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤のインビボでの投与、セラミド生合成の初期の臨界的状態に触媒作用を及ぼす酵素が、光受容体の変性速度を低減させる、それらの生存を延長させる、及びそれらの機能的性能（特に、残存視覚の使用対象時間）を改善することによって、疾患（すなわち、網膜色素変性症）の進行を遅らせることができることを今般見出した。

また、脂質ナノスフェア製剤が、ナノスフェアにセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤を充填させ、眼内注射に使用する濃度と同様の水性分散物を得ることができるだけでなく、網膜に（特に、網膜色素上皮との界面に）高濃度の化合物を提供し、薬剤を放出し、毒性を生じないことも見出した。

ＥＲＧを行ったものと同じ網膜の組織区分を示す。 ＭＹＲ‐ＳＬＮ及びＵ‐ＳＬＮ（未充填固体脂質ナノスフェア）処理マウスのＯＮＬにおける核の平均列数の定量分析を示す。 左側でＥＲＧのトレースを記録した２匹のＳＬＮ処理マウスの網膜の縦断面を示す。 ｔ検定分析は、光受容体の核の列数が、Ｐ２４〜Ｐ３０間隔において、ＭＹＲ‐ＳＬＮ処理網膜で高いことを示す。

（発明の詳細）
本発明は、遺伝性網膜変性（すなわち、網膜色素変性症）を予防する及び遅発させるためのセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）阻害剤の使用と、ＳＰＴ阻害剤を含む脂質ナノスフェアに基づく組成物に関する。

セリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤の例は、ミリオシン、及び次の書誌参照で特定される化合物を含む。

Ｓａｓａｋｉ， Ｓ．ら［Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ４７： ４２０−３３ （１９９４）］は、ＳＰＴ阻害剤としてミリオシンと構造上関連する化合物であるミセステリシンについて記載する。

ＶａｎＭｉｄｄｌｅｓｗｏｒｔｈ Ｆ．ら［Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４５： ８６１−７ （１９９２）］は、他の種の効力のあるＳＰＴ阻害剤スフィンゴフンギンについて記載する。

他のＳＰＴ阻害剤は、シクロセリン、Ｄ‐セリン、ビリジオフンギンＡ、及びリポキサマイシンを含む。

ＵＳ ２００８０２４９２７４号は、ミリオシンの投与によるアテローム性動脈硬化症の治療方法について記載する。

ＷＯ ２００５０９２３２５号は、哺乳動物の高トリグリセリド血症治療のための薬剤の調製におけるミリオシンの使用について記載する。

ＷＯ ２００８０４６０７１号は、インスリン耐性、心臓血管疾患、メタボリック症候群、及び炎症性疾患の治療のためのＳＰＴ調節活性を有する化合物について記載する。

ＷＯ ２００８０８３２８０号は、インスリン耐性、膵臓β細胞アポプトーシス、肥満、心臓血管疾患、脂質異常症、及び脆弱Ｘ症候群に有用な、ＳＰＴに作用する化合物について記載する。

ＷＯ ２００４０３９３５１号は、眼科分野で使用するのに適しているリン脂質ナノスフェアを含む医薬組成物について記載する。

特に、本発明は、遺伝性網膜変性（すなわち、網膜色素変性症）を予防する及び遅発させるためのミリオシンの使用と、ミリオシンを充填した脂質ナノスフェアに基づく組成物に関する。

ミリオシンは、菌類由来の天然化合物であり、細胞膜で可溶であり、細胞を自由に貫通することができ、セリンパルミトイルトランスフェラーゼに対して阻害作用を有する。

ミリオシンの投与は、セラミド（マウスＲＰモデルに存在するスフィンゴリピド）のデノボ合成の抑制を誘発する。

網膜に投与したミリオシンが、光受容体の代謝経路に直接作用することが可能であり、遺伝性網膜変性疾患の光受容体細胞の死の時点において活性化される代謝経路を選択的に阻害することにより、ＲＰの影響を受ける光受容体の死を部分的に抑制することを見出した。

しかしながら、ミリオシンが正常細胞に対して効果がなく、好ましくないことに留意する必要がある。したがって、本化合物を用いて、網膜色素変性症における光感受性網膜細胞の進行性の変性の過程を遅らせ、該疾患を発症した被験者の有効な視野状態を延長することができる。これは、徐々に進行する疾患なので、遅発は（部分的な遅発であっても）、発症した被験者の視機能の相当な改善に関与し、その人の生活の質を改善する。

ミリオシンのインビボでの実験動物への投与が、網膜の光受容体間の選択的な変化を誘発し、光受容体の生存を延長し、これらの細胞の変性速度の付随する減少がみられることを見出した。

さらに、網膜電図検査法によって測定したところ、網膜の視機能の増加がみられた。

ミリオシン治療は、網膜細胞の死の活性プロセスを、それを生ずる変異体にかかわらず、抑制する。ＲＰ治療に関する主な障害が、遺伝子異質性によるものであるので、これは、用いる方法の計り知れない利点である。

（試験の項）
ＲＰ治療でのミリオシンの有効性を調査するために計画された研究を、ｒｄ１０変異マウスモデルで行なった。このマウスは、桿体特異的ホスホジエステラーゼ遺伝子のベータサブユニットのミスセンス突然変異を示し、常染色体劣性ヒトＲＰの形態を模倣する。桿体によって発生したＥＲＧ（網膜電図）が、Ｐ２５まで記録可能であるという事実によって示されるように、桿体の死は、生存１２日目（Ｐ１２）くらいで始まり、Ｐ２４でピークとなる。網膜錐体の死に関しては、反応はＰ４５で消滅する。

桿体変性は、アポプトーシスの特性を示す。

生化学、形態学及び電気生理学に基づく多分野にわたるアプローチを用いて、ｒｄ１０変異マウスで信号を送るスフィンゴリピドによる目標として光受容体の死を確定し、次の結果を得た。

（Ａ． 内因性セラミドレベル）
種々の齢群の麻酔をかけたｒｄ１０変異及び野生型（ｗｔ）マウスから網膜を単離した後、スフィンゴリピド（内因性セラミド）のレベルを試験した。単離した網膜を脂質抽出のために処理し、ジアシルグリセロールキナーゼ試験によって、内因性セラミド／無機リン酸塩の比を測定した。内因性セラミドレベルは、重度の光受容体変性時に、ｒｄ１０変異マウスの網膜で増加し、試験したすべての齢で常に上昇することが分かった。反対に、同じ遺伝的背景を有する野生型（ｗｔ）の対照動物の網膜セラミドレベルは、十分な網膜成長後に変化はなかった。

これらの結果は、セラミドが、光受容体に影響を及ぼすアポトーシスプロセスの原因となる役割を果たし、光受容体の死をもたらすことを示す。したがって、進行的に変性することが知られている残存網膜細胞（例えば、錐体細胞、双極細胞、及び桿体水平細胞）は、セラミド依存性プロセスの結果、死ぬと考えられる。

（Ｂ． 次のミリオシン治療による内因性セラミドレベルの減少）
５００ナノリットルのミリオシン（１８８ｍＭ）の単回硝子体内注射を、Ｐ１９齢のｒｄ１０及びｗｔマウスの右眼に行った。ビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）を同じ動物の左眼に注射した。左右両眼の網膜をＰ２１で単離し、上で説明した生化学的セラミド試験のために、それらを別々に処理した。

その結果として、対照の眼よりも、ミリオシンで処理したｒｄ１０マウスの眼で、顕著に低いセラミドレベルがみられた。このセラミドレベルの減少は、次の定量形態学的方法によって示されるように、ｒｄ１０変異マウスの核濃縮症の（死んだ）光受容体の数の顕著な減少に相当した。

反対に、ミリオシン注射は、ｗｔマウスの網膜セラミドレベルを有意に下げなかった。

（Ｃ． 核濃縮症の光受容体の計測）
Ｐ１９で注射した動物をＰ２１で回収し、それらの眼を摘出し、整えた。左右両眼の網膜を単離し、蛍光性ＤＮＡ結合分子で染色し、スライドに載置した。網膜の４つの径線に沿って等間隔に共焦点顕微鏡下で、光受容体核心部を含む外部核層をサンプリングした。像をコンピューター化された作業端末に移し、核濃縮症の光受容体を各走査範囲で計測した。各対の処理した及び対照の網膜における核濃縮症の光受容体の総数を算出した。

ミリオシン注射が、光受容体の死亡率をおよそ５０％低減させることが分かった（ｎ＝１７、ｒｄ１０マウスを用い、３４個の眼に注射し、計測した）。ＤＭＳＯのみで処理した網膜における核濃縮症の光受容体の概算数は、他の研究で用いた未処理のｒｄ１０マウスの網膜で過去にみられたものと同範囲残存した。

（Ｄ． 組織学的観察）
組織学的見地から、ミリオシンを注射したｒｄ１０及びｗｔマウスが、正常な網膜形態を示すことが観察された。さらに、他と同じように注射した、神経節細胞にＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を有するマウス（Ｔｈｙ１‐ＧＦＰマウス）の網膜は、神経節細胞の形態及び構造の優れた維持を示し、網膜の層化は、概して良好であった。

（Ｅ． 毒性試験）
研究前および研究中に行った対照試験では、ミリオシンの眼内注射が、ｒｄ１０又はｗｔマウスのいずれかに対し悪影響を及ぼさないことを示した。ミリオシンが、現在まで例外的にインビボで用いられただけで、眼内注射されたことがないことに留意する必要がある。培養細胞に関する利用可能な文献に基づき、ガラス体液により、７／８倍の稀釈液を算出して、用量を選択した。大多数の光受容体がアポトーシスサイクルに入るのを防止するという重要な理由のために、アポトーシス性光受容体の死のピークに先行する眼内投与の使用対象時間を選択した。そして、全体的でないか、あるいは局所的な炎症反応症状（例えば、マクロファージによる侵入）、又は視覚反応性の増加が、処理した動物でみられるという事実に基づき、毒性は否定された。

（Ｆ． 光受容体の機能回復）
ヒト患者（特に、ＲＰに罹患した患者）の網膜の生理を試験するのに広く利用される方法である、フラッシュ網膜電図（ＥＲＧ）を記録することによって、光受容体の機能回復について検討した。

上述した眼内注射した２つのグループのｒｄ１０マウスは、ビヒクルを注射した眼と比較して、ミリオシンを注射した眼においてＥＲＧ反応／応答の回復を示さなかった。これは、単回注射によって投与したミリオシンの用量が、少なすぎて、光に対する光受容体の顕著な反応における検出可能な変化が生じないことを示唆する。ミリオシンの繰り返しによる眼内注射であっても、マウスの小さなサイズの眼（及びおよそＰ１９の同じマウス）に適したプロトコルではなかった。度重なる一般的な麻酔薬及び眼内注射は、高い危険性の動物の死及び白内障発症をそれぞれ伴う。

したがって、脂質ナノスフェアの使用に基づいて、新しい非侵襲性のミリオシンの投与方法を開発した。これらは、ＥＰ５２６６６６号及びＷＯ２００４０３９３５１号によって調製した、好ましくは４０〜２４０ナノメートルの平均径を有する脂質からなる粒子である。その製剤の使用の結果、ミリオシンを脂質ナノスフェアに充填し、眼内注射に使用する濃度と同様の水性分散物を得ることができた。

蛍光色素を充填した、及び有効成分を充填しない（空の）蛍光ナノスフェアの、眼内部への到達能をまず評価した。共焦点顕微鏡による観察においては、眼表面へのこれらのナノスフェアの投与２４時間後、蛍光粒子が、網膜（特に、色素上皮との界面）に高度に集中することが分かった。

０．２７ｍｇ／ｍＬの濃度のミリオシンを充填した脂質ナノスフェアを、ｒｄ１０変異マウスの同腹の子に投与した。それらの眼が開いた時（Ｐ１４）に、それぞれの同腹の子を２つのグループに分けた：第１のグループに、毎日点眼剤の形態で（１個の眼当たり７５０ナノリットル）ミリオシンを充填したナノスフェアを与え、また、第２のグループには、同じ化学的な処方であるがミリオシンを含まない未充填の（空の）ナノスフェアを与えた。光受容体の発生し得る機能回復を評価するのに行ったＥＲＧの記録は、Ｐ２１（記録可能なＥＲＧがこの変異体で最も大きい）で開始し、Ｐ３０まで継続した。未処理のｒｄ１０動物では、桿体によって発生したＥＲＧは、その齢で消滅した。ミリオシン充填ナノスフェアで処理したｒｄ１０動物では、特にＰ２４（光受容体の死のピーク）、及びＰ２８〜Ｐ３０の間隔で、薬剤の治療効果がみられた。この晩年期では、対照群と比較して、ミリオシンで処理した動物の明確な錐体誘導反応が持続した。

ｒｄ１０変異マウスにおけるすべてのＥＲＧ消滅後の錐体誘導反応の維持は、非常に重要な結果である。ヒトＲＰ患者の残存視覚は、錐体に基づき、該錐体は、桿体の死後に死ぬことが分かっている。

ＥＲＧの記録に続いて、動物の眼を摘出し、それらの眼を整え、区分し、網膜部分を蛍光核色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｙｅ）で染色して、外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さ及び全体的な網膜の形態を評価した。

ＥＲＧを行ったものと同じ網膜の組織区分を図１ａに示す。

Ｐ２４齢の２匹のｒｄ１０変異マウスで、強度を増加した閃光に対するＥＲＧ反応が生じた。大きい灰色のトレースは、ＭＹＲ‐ＳＬＮ（ミリオシン‐固体脂質ナノスフェア）処理マウスからの反応であり、黒色のトレースは、対照動物からの反応である。

ＯＮＬにおける保護された核の列数は、対照のマウスよりもミリオシン処理で有意に高い。

ＭＹＲ‐ＳＬＮ及びＵ‐ＳＬＮ（未充填固体脂質ナノスフェア）処理マウスのＯＮＬにおける核の平均列数の定量分析は、図１ｂに示す。

Ｐ２１〜Ｐ３５齢のｒｄ１０マウスのコホートから得た暗順応のＥＲＧ反応のプロットを示す。正の値は、ＥＲＧのｂ波の振幅を示し、負の値はａ波の振幅を示す。ＭＹＲ‐ＳＬＮで処理したマウス（灰色のグラフ）は、使用対象時間Ｐ２７〜Ｐ３５で良好なａ波反応を示す（^＊：ｐ＜０．０５ ウィルコクソン‐マン‐ホイットニー検定）。

図１ｃは、左側でＥＲＧのトレースを記録した２匹のＳＬＮ処理マウスの網膜の縦断面を示す。ＭＹＲ‐ＳＬＮ処理動物の光受容体の列数は、対照より高く、生存の増加を示す。

図１ｄでは、ｔ検定分析は、光受容体の核の列数が、Ｐ２４〜Ｐ３０間隔において、ＭＹＲ‐ＳＬＮ処理網膜で高いことを示す。

したがって、脂質ナノスフェア形態でのミリオシンの連続的な投与は、光受容体を網膜色素変性症の進行的な変性から保護する非侵襲性の手段となる。

（Ｇ． 考察）
上述した結果は、デノボセラミド生合成の抑制によって網膜のセラミドレベルを低減させることにより、光受容体のアポトーシスの死亡率を減少させることが可能であることを示す。

したがって、得られた結果は、ミリオシンの投与後、光受容体変性の減少を維持することが可能であることを示す。よって、本発明によるミリオシンの使用は、光受容体を長期間生存可能に維持するのを補助する（そうでなければ、死ぬことが分かっている）有効な治療上の戦略と考えることができる。

これは、ｒｄ１０変異マウスに特有な適度に攻撃的な表現型、及び網膜のアーキテクチャの維持が、劣性ホスホジエステラーゼ変異体を有する患者を遺伝子治療の可能な候補であることを確認するという事実を考慮して、特に関心を惹くものである。

また、桿体生存率の小規模な増加が、恐らく錐体の高い生存能力に比例していると一般に考えられている。

推奨される治療の使用目的については、上述したとおり、好ましくは、本発明による組成物を、本発明の一態様を構成する、局所的眼投与用の脂質ナノスフェアの形態で製剤化するのがよい。上で示した該ナノスフェアの調製方法は、ＥＰ ５２６６６６号及びＷＯ ２００４０３９３５１号に開示されている。

また、本発明による組成物は、局所的眼投与に適した他の方法で製剤化することができる。例えば、硝子体内注射、結膜下注射、前房内注射若しくは球後注射等の眼科用の点眼剤又は注射剤の形態であり、できる限り適切な賦形剤を用いて、可能ならば、“レミントンの製薬ハンドブック（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｎ． Ｙ．， ＵＳＡ）”に記載されているような製薬技術で周知の従来法により調製してもよい。

Claims (3)

1. 網膜色素変性症である遺伝性網膜変性を予防する及び遅発させるための薬剤の調製におけるミリオシンの使用。
2. 前記薬剤が、眼投与に適した医薬剤形である、請求項１に記載の使用。
3. 前記薬剤が、脂質ナノスフェアの形態である、請求項２に記載の使用。