KR102580788B1 - 신규 미생물을 유효성분으로 포함하는 기능성 사료첨가제조성물 - Google Patents

신규 미생물을 유효성분으로 포함하는 기능성 사료첨가제조성물 Download PDF

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KR102580788B1
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김재형
윤석영
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Abstract

본 발명은 신규 미생물을 유효성분으로 포함하는 기능성 사료첨가제 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명에서 분리 및 동정된 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주에 대하여 탄수화물을 분해하는 소화 효소인 아밀라아제(Amylase)의 활성 증가, 항균 효과를 가지는 효소인 라이소자임(Lysozyme)의 활성 증가 및 세포의 기능조절에 관여하는 효소인 포스파타아제 활성(Phosphatase activity)을 가지는 것을 확인하였고, 내산성, 내담즙성 및 장부착능 검증을 통한 장내 생존능을 확인하였으므로, 이는 기능성 사료첨가제 조성물로 사용될 수 있을 것이다.

Description

신규 미생물을 유효성분으로 포함하는 기능성 사료첨가제 조성물{Functional feed additive composition containing novel microorganisms as active ingredients}
본 발명은 신규 미생물을 유효성분으로 포함하는 기능성 사료첨가제 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 신규한 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주를 유효성분으로 포함하는 기능성 사료첨가제 조성물에 관한 것이다.
현재 우리나라는 핵가족화를 넘어선 1~2인 가구화가 이루어지고 있고, 또한 반려동물을 키우고 있는 인구가 증가하고 있다. 보고에 따르면 우리나라에서는 1천만명 이상의 많은 사람들이 반려동물을 키우고 있으며, 이에 따라 반려동물과 관련된 제품들에 대한 소비자의 관심이 높아지고 있다. 반려동물 중에서 가장 큰 부분을 차지하고 있는 것이 반려견으로, 일반적으로 반려견은 평균적으로 11~13 년 정도 사는 것으로 알려져 있으나, 최근에는 공중보건 향상 및 의료 향상으로 15~20년 정도까지도 그 수명이 연장되었다. 또한, 국민 의식 수준 향상으로 반려동물도 이제 사람과 비슷한 수준의 인격체로 여겨지는 경우가 많다.
하지만, 우리나라의 반려견은 대부분 주택 내에서 생활하기 때문에 운동이 부족하고 스트레스를 많이 받게 되어 손쉽게 대사성 질환에 노출되는 경향이 있다. 가장 대표적인 것이 반려견의 비만이며, 우리나라 반려견의 약 30~53%가 과체중 혹은 비만인 것으로 보고되어 있다. 반려견이 대사성 비만을 앓고 있는 경우 사람과 유사하게 심혈관계 질환이나 관절질환, 면역질환 등 향후 더욱 치명적인 내외과적 질환을 야기하게 되어 반려견과 견주의 삶의 질을 크게 떨어뜨릴 수 있다. 현재 우리나라 동물 의료에 대한 관심은 증가하고 있으나, 현실적인 치료비용이 높아 의료비 부담이 크기 때문에, 반려견의 운동부족으로 인한 변비나 비만 등의 질환의 발생 및 진행을 손쉽게 예방할 수 있는 제제의 개발이 시급한 실정이다.
한편, 반려동물산업에 있어서, 2011년 7월부터 항생제 금지조치에 따른 대체품목인 생균제 시장의 규모가 17여 개의 보조사료 중 44%를 차지하고 있다. 종래 반려동물을 위한 보조사료는 털이나 뼈, 관절 등 주요 기능성 제품의 판매가 주를 이뤘다면 최근에는 유산균, 스트레스 완화, 눈 건강 등 기능적이고 특화된 제품들에 대한 수요가 증가하고 있는 추세이다. 국내시장의 경우, 고가의 유기농 제품과 프리미엄 제품을 포함하여 수입제품이 시장의 대부분을 차지하고 있으며, 반려동물 사료 수입량이 지속적으로 증가하면서 2011년 36,308톤에서 2016년 53,292 톤 규모로 성장하였으며, 관세청 자료에 따르면 반려동물 사료 수입량은 수출량에 비해 훨씬 많았다. 수입제품을 찾는 소비자들의 수요가 증가하면서 해외 유명제품을 수입해서 판매하는 구매대행 업체가 늘어나고 있으나, 현지 가격과의 차이가 상당한 것으로 확인되었다. 이에 따라 수입제품에 버금가는 국내제품을 개발하고 사양실험, 급여효과, 사례 등을 철저히 분석하는 한편 가격경쟁력을 갖추어 향후 증가할 것으로 예상되는 시장상황에 유기적으로 대응할 필요가 있는 상황이다.
본 발명에서는 분리하여 동정을 마친 신규한 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주에 대하여 탄수화물을 분해하는 소화 효소인 아밀라아제(Amylase)의 활성 증가, 항균 효과를 가지는 효소인 라이소자임(Lysozyme)의 활성 증가 및 세포의 기능조절에 관여하는 효소인 포스파타아제 활성(Phosphatase activity)을 가짐을 확인하였고, 내산성, 내담즙성 및 장부착능 검증을 통한 장내 생존능을 확인하였으므로, 본 발명의 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주는 기능성 사료첨가제 조성물로 사용될 수 있을 것이다.
10-2022-0054071
상기 문제점을 해결하기 본 발명의 일 과제는 신규 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주(수탁번호: KCTC15477BP)을 제공하는 데 있다.
상기 문제점을 해결하기 본 발명의 일 과제는 신규 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주(수탁번호: KCTC15477BP)를 유효성분으로 포함하는 기능성 사료첨가제 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 수탁번호 KCTC15477BP로 기탁된 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 "균주"는 아밀라아제 활성 증가의 기능성을 가지는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 "균주"는 라이소자임 활성 증가의 기능성물 가지는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 "균주"는 포스파타아제 활성 증가의 기능성을 가지는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 "균주"는 내산성의 기능성을 가지는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 "균주"는 내담즙성의 기능성을 가지는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 "균주"는 장부착능의 기능성을 가지는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 반려동물용 기능성 사료첨가제 조성물을 제공한다.
마지막으로 상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 사료첨가제 조성물을 유효성분으로 포함하는 반려동물용 기능성 사료를 제공한다.
본 발명은 신규 미생물을 유효성분으로 포함하는 기능성 사료첨가제 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명에서 분리 및 동정된 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주에 대하여 ①탄수화물을 분해하는 소화 효소인 아밀라아제(Amylase)의 활성 증가, ②항균 효과를 가지는 효소인 라이소자임(Lysozyme)의 활성 증가 및 ③세포의 기능조절에 관여하는 효소인 포스파타아제 활성(Phosphatase activity)을 가지는 것을 확인하였고, ④내산성, ⑤내담즙성 및 ⑥장부착능 검증을 통한 장내 생존능을 확인하였다. 아밀라아제 활성을 통해　반려동물의 소화에 도움을 줄 수 있고, 특히　소화력이 떨어지는 노화 반려동물의 영양분 소화,　흡수에 도움을 줄 수 있다. 라이소자임 활성을 통해 반려동물의 장내 유해 균을 억제시킬 수 있으며 이에 따른　면역력 증진에 기여할 수 있다. 포스파타아제　활성을 통해 반려동물의 세포내 활성산소에 의한 돌연변이 세포의 생성　억제를 기대할 수 있다. 또한 내산성 및 내담즙성　기능성을 통해 반려동물에 의해 섭취된 균주가 반려동물의 소화 과정에서 분비되는 위산과 담즙에서의 생존능력을 확인한 것이고, 장부착능　기능성을 통해 균주가 반려동물의 장세포에 부착하여 장시간 장 내에 체류하여 오랜 시간동안 유해균을 억제할 수 있음을 확인한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주가 스트리킹(streaking) 된 플레이트를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
본 발명은 수탁번호 KCTC15477BP로 기탁된 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주에 관한 것이다.
본 발명의 "균주"는 동정결과 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri)와는 99% 유사성을 가지고, 리모실락토바실러스 카비애(Limosilactobacillus caviae)와는 98% 유사성을 가지며, 리모실락토바실러스 프루멘티(Limosilactobacillus frumenti)와는 97% 유사성을 가진다.
본 발명의 "균주"는 아밀라아제 활성 증가의 기능성을 가진다. 아밀라아제는 탄수화물을 분해하는 소화 효소로 본 발명의 균주는 아밀라아제 활성을 가지므로 반려동물의 소화에 도움을 줄 수 있으며, 특히 소화력이 떨어지는 노화 반려동물의 영양분 소화 및 흡수에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 "균주"는 라이소자임 활성 증가의 기능성을 가진다. 라이소자임은 항균 효과를 가지는 효소로 본 발명의 균주는 라이소자임 활성을 가지므로 반려동물의 장내 유해균을 억제시킬 수 있으며 이에 따른 면역력 증진에 기여할 수 있다.
본 발명의 "균주"는 포스파타아제 활성 증가의 기능성을 가진다. 포스파타아제는 세포의 기능조절에 관여하는 효소로 본 발명의 균주는 포스파타아제 활성을 가지므로 반려동물의 세포내 활성산소에 의한 돌연변이 세포의 생성억제에 기여할 수 있다.
본 발명의 "균주"는 내산성 및 내답즙성의 기능성을 가진다. 따라서 본 발명의 균주는 반려동물에 의해 섭취된 균주가 반려동물의 소화 과정에서 분비되는 위산과 담즙에서의 생존능력을 가지는 것이다.
본 발명의 "균주"는 장부착능의 기능성을 가진다. 따라서 본 발명의 균주는 반려동물의 장세포에 부착하여 장시간 장내에 체류하여 오랜 시간동안 유해균을 억제할 수 있는 것이다.
일 측면에서, 본 발명의 균주는 기능성 사료첨가제 조성물 및 이를 포함한 사료로 이용될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제 조성물 및 이를 포함한 사료의 유효성분인 수탁번호 KCTC15477BP로 기탁된 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주는 여러가지 기능성을 가지는 바, 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 펩타이드 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 펩타이드를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예 사료를 본 발명에 따른 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%으로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식 발효 사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제 조성물 및 이를 포함한 사료는 종래 사료에 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 사료에 첨가되는 성분의 일예로서 곡류분말, 고기분말, 및 두류 등을 포함할 수 있다. 상기에서 곡류분말은 쌀가루, 밀가루, 보리가루, 및 옥수수가루 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기에서 고기분말은 닭고기, 소고기, 돼지고기, 및 타조고기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 분말화한 고기분말을 사용할 수 있다. 상기에서 두류는 대두, 강낭콩, 완두콩, 및 검정콩 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제 조성물 및 이를 포함한 사료는 상기에서 언급한 종래 사료에 첨가되는 성분인 곡류분말, 고기분말, 및 두류 이외에도 사료의 영양성을 증대시키기 위해 영양제, 및 무기물 중에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가할 수 있으며, 사료 품질의 저하를 막기 위해 항곰팡이제, 항산화제, 항응고제, 유화제, 및 결착제 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 균주는 기능성 식품/건강기능식품 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 식품/건강기능식품 조성물은 유효성분인 수탁번호 KCTC15477BP로 기탁된 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기에서 서술될 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품/건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 신규의 기능성 균주 분리
본 발명의 기능성 균주를 분리하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.
[1 단계] 균주 분리를 위한 분변시료의 채취는 출생 후 3주 이내의 영아견(모유 수유견)을 대상으로 하였으며, 배변 시 바로 채취하여 변이 오염되지 않도록 하였으며, 이때 채취하는 분변시료에 모견의 혀나 타액이 접촉되지 않도록 주의하였다.
[2 단계] 채취한 분변시료는 펩톤수(pepton water)가 담긴 멸균용기에 담아서 적당히 각반한 후 냉장 보관 및 이송하였다.
[3 단계] Lactobacilli MRS 한천배지를 물에 분산시킨 후, 섭씨 121℃, 15분의 조건으로 멸균시킨 후 섭씨 53℃로 냉각한 후 빈 페트리디쉬(petri dish)에 10 내지 15 ㎖씩 분주한 후 배지가 굳을 때까지 상온에서 정치하였다. 이후, 충분히 건조시켰다.
[4 단계] 시료에 2배의 펩톤수를 추가로 가한 후 볼텍싱(vortexing) 하여 완전 분산시켰다.
[5 단계] 분산된 시료를 미리 준비한 Lactobacilli MRS 한천배지 플레이트에 100 ㎕ 분주한 후, 유리 스프레더(spreader)를 이용하여 수분이 없어질 때까지 비벼주었다.
[6 단계] 플레이트를 섭씨 37℃ 항온 배양기에서 24 내지 48시간 동안 배양하였다.
[7 단계] 배양된 플레이트를 확인하여 미생물 집락(콜로니)를 확인하였다. 이 때 콜로니의 형태, 크기 및 색에 따라 모두 다른 콜로니를 확인하였다.
[8 단계] 멸균된 백금이를 이용하여 상기 [7 단계]에서 확인된 콜로니를 채취한 후 새로운 Lactobacilli MRS 한천배지 플레이트에 접종하였다.
[9 단계] 상기 [7 단계] ~ [8 단계]의 과정을 2~3회 반복하였고, 플레이트에 확인된 콜로니가 모두 동일한 형태이며, 현미경상으로도 동일 함이 확인된 경우 다음과정으로 진행하였다.
[10 단계] Lactobacilli MRS 액체배지를 물에 분산시킨 후, 배양용 튜브에 10 ㎖씩 분주하고 섭씨 121℃, 15분의 조건으로 멸균시킨 후 상온으로 냉각하였다.
[11 단계] 균주의 분리가 완료된 플레이트에서 콜로니 1개를 멸균된 백금이로 취하여 10 ㎖의 Lactobacilli MRS 액체배지에 접종하였다.
[12 단계] 접종된 배지를 진탕 배양기에서 섭씨 37℃, 200rpm의 조건으로 24 내지 48시간 동안 배양하였다.
[13 단계] 배양액을 멸균된 백금이로 취하여 새로운 Lactobacilli MRS 한천배지 플레이트에 접종하였다.
[14 단계] 플레이트에 확인된 콜로니가 모두 동일한 형태이며, 현미경상으로도 동일 함이 확인된 경우 [11 단계] ~ [12 단계]의 과정을 반복하였다.
[15 단계] 배양이 완료된 용액 1 ㎖를 멸균된 이튜브(e-tube)에 넣고 5,000rpm, 5분의 조건으로 원심분리하였다.
[16 단계] 원심분리된 상측액 0.5 ㎖를 제거한 후 멸균된 50% 글리세롤(glycerol) 용액 0.5 ㎖를 가한 후 잘 섞어주었다.
[17 단계] 상기 [16 단계]의 용액을 균주의 글리세롤 용액으로 정하고 섭씨 영하 21℃ 이하에서 보관하면서 이후의 배양 및 실험에 활용하였다.
상기 분리 실험을 통해 총 10개의 균주를 분리 후 각각 계대배양한 배지 내에서 콜로니의 형태, 크기 및 색이 뚜렷한 최종 균주 총 5개를 선택하였고, 이 중 효과가 가장 좋은 NI37 균주에 대하여 16S rRNA 유전자 분석을 진행하였고, 하기 표 1과 같이 미생물 동정을 완료하였다.
샘플명 동정종류 프라이머 동정결과 유사성(%)
NI37 16S rRNA 518F:CCAGCAGCCGCGGTAATAC

805R:GACTACCAGGGTATCTAATC		 Limosilactobacillus reuteri
(Lactobacillus reuteri)		 99
Limosilactobacillus caviae
(Lactobacillus caviae)		 98
Limosilactobacillus frumenti
(Lactobacillus frumenti)		 97
상기 NI37 균주는 하기 실험들에 의해 가장 좋은 기능성을 가지는 것으로 판단되어 한국생명공학연구원에 2023년 06월 22일에 기탁하여 KCTC15477BP의 수탁번호를 부여받았다.
<실험예 1> 분리된 균주의 아밀라아제 효소 활성
본 발명에서 분리된 5개의 균주의 아밀라아제 효소 활성을 확인하기 위해 abcam에서 판매중인 ab102523 아밀라아제 분석 키트(Amylase Assay Kit)(Colorimetric)를 사용하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다(OD 405nm)(ST: Standard, PC: Positive Control). 이때 비교균주 1 내지 4는 상기 실시예 1에서 분리된 총 5개의 균주 중 본 발명의 NI37 균주를 제외한 4개의 균주로 이를 비교군으로 사용하였다.
ST_0 nM ST_4 nM ST_8 nM ST_12 nM ST_16 nM ST_20 nM
0.0 ± 0.0 0.14 ± 0.00 0.29 ± 0.01 0.45 ± 0.00 0.57 ± 0.02 0.71 ± 0.03
PC NI37 비교균주1 비교균주2 비교균주3 비교균주4
1.31 ± 0.02 1.12 ± 0.02 0.35 ± 0.03 0.12 ± 0.02 0.65 ± 0.05 0.42 ± 0.01
상기 표 2에서 확인할 수 있는 것처럼 본 발명의 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주(수탁번호: KCTC15477BP)는 비교균주 1 내지 4 대비 매우 높은 아밀라아제 효소 활성을 확인할 수 있었다. 따라서, 이를 통해 본 발명의 NI37 균주는 반려동물의 소화에 도움을 줄 수 있고, 특히　소화력이 떨어지는 노화 반려동물의 영양분 소화,　흡수에 도움을 줄 수 있을 것이다.
<실험예 2> 분리된 균주의 라이소자임 효소 활성
본 발명에서 분리된 균주의 라이소자임 효소 활성을 확인하기 위해 abcam에서 판매중인 라이소자임 분석 키트(Lysozyme Assay Kit)(E-22013)를 사용하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다(Fluorescence Ex/Em =550/595nm)(ST: Standard). 이때 비교균주 1 내지 4는 상기 실시예 1에서 분리된 총 5개의 균주 중 본 발명의 NI37 균주를 제외한 4개의 균주로 이를 비교군으로 사용하였다.
ST_0 U ST_15.5 U ST_31 U ST_62.5 U ST_125 U ST_250 U ST_500 U
0.0 ± 0.0 631.5 ± 125.9 1607.5 ± 461.0 3540.5 ± 455.4 10295.5 ± 83.4 25463.5 ± 1365.4 46602.5 ± 549.4
NI37 비교균주1 비교균주2 비교균주3 비교균주4
12577.5 ± 243.1 3012.3 ± 153.5 8362.8 ± 382.0 4632.1 ± 224.3 5372.1 ± 184.1
상기 표 3에서 확인할 수 있는 것처럼 본 발명의 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주(수탁번호: KCTC15477BP)는 비교균주 1 내지 4 대비 매우 높은 라이소자임 효소 활성을 확인할 수 있었다. 따라서, 이를 통해 본 발명의 NI37 균주는 반려동물의 장내 유해 균을 억제시킬 수 있으며 이에 따른　면역력 증진에 기여할 수 있을 것이다.
<실험예 3> 분리된 균주의 포스파타아제 효소 활성
본 발명에서 분리된 균주의 포스파타아제 효소 활성을 확인하기 위해 EnzChek에서 판매중인 E12020 포스파타아제 분석 키트(Phosphatase Assay Kit)(Colorimetric)를 사용하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다(Fluorescence Ex/Em =494/518nm)(ST: Standard, PC: Positive Control). 이때 비교균주 1 내지 4는 상기 실시예 1에서 분리된 총 5개의 균주 중 본 발명의 NI37 균주를 제외한 4개의 균주로 이를 비교군으로 사용하였다.
ST_0 μM ST_25 μM ST_50 μM ST_100 μM PC(1U/㎖)
98.5 ± 7.8 18246.5 ± 128.0 32328.0 ± 738.2 51276.5 ± 1192.9 47824.5 ± 1035.2
NI37 비교균주1 비교균주2 비교균주3 비교균주4
6976.5 ± 108.3 2364.2 ± 65.2 4126.3 ± 85.2 2975.5 ± 31.5 3847.1 ± 92.4
상기 표 4에서 확인할 수 있는 것처럼 본 발명의 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주(수탁번호: KCTC15477BP)는 비교균주 1 내지 4 대비 매우 높은 포스파타아제 효소 활성을 확인할 수 있었다. 따라서, 이를 통해 본 발명의 NI37 균주는 반려동물의 세포내 활성산소에 의한 돌연변이 세포의 생성　억제를 기대할 수 있을 것이다.
<실험예 4> 분리된 균주의 장내 생존능 확인
4-1. 내산성 검증
상기 실험예 1 내지 3에서 검증된 본 발명의 NI37 균주를 0.05M Sodium phosphate buffer pH 7.0과 pH 2.5에 각각 접종한 후 37
Figure 112023076197616-pat00001
에서 2시간 동안 배양 후 Lactobacilli MRS 한천배지에 도말하여 생균수를 측정하였고, 하기 표 5에 나타내었다(생균수 측정 후 Log값 변환).
샘플명 pH 7.0 pH 2.5 pH 2.5 생균수 / pH 7.0 * 100
NI37 8.08 ± 0.05 8.13 ± 0.04 100 %
상기 표 5에서 확인할 수 있는 것처럼 본 발명의 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주(수탁번호: KCTC15477BP)는 매우 높은 내산성의 기능성을 확인할 수 있었다. 따라서, 이를 통해 본 발명의 NI37 균주는 반려동물에 의해 섭취된 균주가 반려동물의 소화 과정에서 분비되는 위산에서의 생존능력을 확인한 것이다.
4-2. 내담즙성 검증
상기 실험예 1 내지 3에서 검증된 본 발명의 NI37 균주를 0.3% Oxgall 첨가 배지에 접종한 후 37
Figure 112023076197616-pat00002
에서 8시간 동안 배양 후 Lactobacilli MRS 한천배지에 도말하여 생균수를 측정하였고, 하기 표 6에 나타내었다(생균수 측정 후 Log값 변환).
샘플명 무처리 0.3% Oxgall 0.3% Oxgall / 무처리*100
NI37 10.29 ± 0.01 7.40 ± 0.03 71.9 %
상기 표 6에서 확인할 수 있는 것처럼 본 발명의 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주(수탁번호: KCTC15477BP)는 매우 높은 내담즙성의 기능성을 확인할 수 있었다. 따라서, 이를 통해 본 발명의 NI37 균주는 반려동물에 의해 섭취된 균주가 반려동물의 소화 과정에서 분비되는 담즙에서의 생존능력을 확인한 것이다.
4-3. 장부착능 검증
상기 실험예 1 내지 3에서 검증된 본 발명의 NI37 균주를 1/10로 희석하여 1㎖(미생물 107 이상 기준)을 HT-29 세포주에 부착한 후 37
Figure 112023076197616-pat00003
의 CO2 배양기에서 2시간 동안 배양 후 Lactobacilli MRS 한천배지에 도말하여 생균수를 측정하였고, 하기 표 7에 나타내었다(생균수 측정 후 Log값 변환).
구분 샘플명 무처리 HT-29 cell 부착 HT-29 cell 부착 / 무처리*100
대조군 Lactobacillus rhamnosus GG
(Control)		 8.11 ± 0.06 7.03 ± 0.17 86.6 %
샘플 NI37 10.29 ± 0.01 7.40 ± 0.03 87.8 %
상기 표 7에서 확인할 수 있는 것처럼 본 발명의 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주(수탁번호: KCTC15477BP)는 매우 높은 장부착능의 기능성을 확인할 수 있었다. 따라서, 이를 통해 본 발명의 NI37 균주는 반려동물의 장세포에 부착하여 장시간 장 내에 체류하여 오랜 시간동안 유해균을 억제할 수 있음을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15477BP 20230622

Claims (5)

  1. 수탁번호 KCTC15477BP로 기탁된 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 아밀라아제 활성 증가, 라이소자임 활성 증가 및 포스파타아제 활성 증가의 기능성을 가지는 것을 특징으로 하는,
    리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 내산성, 내담즙성 및 장부착능의 기능성을 가지는 것을 특징으로 하는,
    리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) NI37 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 반려동물용 사료첨가제 조성물.
  5. 제4항의 사료첨가제 조성물을 유효성분으로 포함하는 반려동물용 사료.
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