KR102559788B1 - 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 - Google Patents
다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102559788B1 KR102559788B1 KR1020220049750A KR20220049750A KR102559788B1 KR 102559788 B1 KR102559788 B1 KR 102559788B1 KR 1020220049750 A KR1020220049750 A KR 1020220049750A KR 20220049750 A KR20220049750 A KR 20220049750A KR 102559788 B1 KR102559788 B1 KR 102559788B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- tissue
- decellularization
- inactivation
- decellularized
- mammalian
- Prior art date
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 17
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 71
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 40
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 117
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 14
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 7
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 claims description 6
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 225
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 61
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 235000019784 crude fat Nutrition 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 239000002585 base Substances 0.000 description 16
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 14
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 11
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 11
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 11
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 208000005422 Foreign-Body reaction Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 3
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229950008885 polyglycolic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 238000003541 multi-stage reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N phentermine hydrochloride Chemical compound [Cl-].CC(C)([NH3+])CC1=CC=CC=C1 NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
- A61L27/3625—Vascular tissue, e.g. heart valves
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
Abstract
본 발명은, 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 있어서, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하인 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 조직 매트릭스는 DNA 함량이 매우 낮아 면역이나 이물 반응을 최소화하고, 엘라스틴 함량이 높아 상처 치유, 흉터 억제 효과가 높은 장점이 있다.
Description
본 발명은 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 엘라스틴 함량이 높고, 탈세포 효율이 높아 생산성을 향상시킬 수 있는 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
세포외기질(extracellular matrix; ECM)은 세포 밖에 존재하면서, 세포와 밀접하게 연관된 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, GAG와 같은 성분들을 포함한 삼차원적인 망 구조체로, 세포와 조직 사이의 공간을 채워줌으로써 세포를 보호하고 지지해주는 역할을 하고, 인티그린과 같은 세포 수용체를 통해 세포가 세포외기질 내 성분과 상호작용할 때 신호 전달 경로로 사용되며, 이 외에도 다양한 기능을 갖는다.
구체적으로, 세포외기질은 성장인자, 효소 및 기타 세포의 활성에 관여하는 분자를 포획하여 세포의 기능 및 역할을 조절하고, 세포외기질에 포함되어 있는 콜라겐과 피브로넥틴은 세포가 형태를 유지하고 이동하는데 필요한 물리적 강도를 제공한다.
한편, 엘라스틴과 라미닌은 탄성을 제공하고, 인체 조직 및 기관에 따라 특정한 성분이 세포외기질 내에 분포되어 있어, 해당 조직 및 기관의 특정 기능을 수행할 수 있도록 조절하는 역할을 한다.
특히, 세포외기질에 포함되어 있는 엘라스틴의 경우에는 세포외기질에 탄성을 제공할 뿐만 아니라 손상된 조직의 치유과정에서 엘라스틴 생성률이 낮은 경우에는 원래 조직과 동일한 구조로 수복되지 못하여, 흉터 생성의 원인으로 작용하므로, 상처의 치료나 조직의 재생에 있어서 매우 중요한 물질로 취급되고 있어, 의료기기나 재생의료 분야에서 널리 응용되고 있다.
일반적으로 이식용 혹은 연구용 인공 조직이나 장기 또는 신약 개발을 위한 장기 모델의 제작시 생체 독성이 없으며 면역 반응을 유발하지 않는 생체적합성 소재를 이용한다. 기존에는 PLA(poly latic acid)나 PGA(poly glycolic acid)과 같은 생체적합성 고분자가 이용되었으나, 최근에는 동물 조직 유래 생체 소재가 각광받고 있으며, 이러한 동물 조직 유래 생체 소재로 탈세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix; dECM)을 기반으로 한 생체 소재를 주로 사용하고 있다.
이와 같이 동물 조직에서 유래한 생체 소재는 세포, 지방, 바이러스 및 기타 이물질 등 면역이나 염증 반응을 일으키는 물질을 포함하고 있어, 동물 조직에서 유래한 생체 소재를 제조하는 데 있어서 가장 중요한 부분은 이러한 이물질들을 제거하는 공정이다. 이들 물질을 제거하기 위해 일반적으로, 산이나 알칼리, 효소 처리를 하는데, 아직까지는 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질 모두를 효율적으로 제거할 수 있는 방법이 개발되지 않은 실정이며, 종래의 방법을 이용하는 경우에는 생체 소재의 수득률이 낮고, 처리 시간이 오래 걸리는 단점이 있을 뿐만 아니라 엘라스틴 함량이 낮은 단점이 있다.
본 발명에서는 엘라스틴 함량이 높고, 탈세포 효율이 높아 생산성을 향상시킬 수 있는 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는, 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 있어서, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하인 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 관한 것이다.
상기 1차 탈세포화 단계는, 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용한 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용한 제2 탈세포화 단계;를 포함할 수 있다.
상기 조직은, 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 제1 탈세포화 단계는, n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되고, 상기 제2 탈세포화 단계는, 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행될 수 있다.
상기 2차 탈세포화 단계는, DNase를 사용하여 될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는, 탈세포화된 조직 매트릭스의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 포함한다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하일 수 있다.
상기 1차 탈세포화 단계와 2차 탈세포화 단계의 사이에, 산성 용액을 사용한 중화 단계와 PBS를 사용한 세척 단계가 더 수행될 수 있다.
상기 2차 탈세포화 단계와 제2 불활성화 단계의 사이에, 탈색 단계 및/또는 탈지 단계가 더 수행될 수 있다.
상기 제2 불활성화 단계는, 유기산과 알코올의 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 제2 불활성화 단계 이후, 세척, 포장 및 멸균 단계가 수행될 수 있다.
본 발명의 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스는 탈세포화 과정에서 엘라스틴 손실률이 적어, 엘라스틴으로 인한 손상조직의 재상피화, 육아조직 및 신생혈관 형성을 촉진하여 조직재생을 빠르게 도울 수 있다.
본 발명의 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스의 제조방법은 탈세포 효율이 우수하고, 공정 시간이 짧아서 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.
도 1(A) 및 1(B)는 실험예 1의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 2는 실험예 2의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 3(A) 및 3(B)는 실험예 3의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 4(A) 및 4(B)는 실험예 4의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 실험예 5의 실험 결과를 도시한 표이다.
도 2는 실험예 2의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 3(A) 및 3(B)는 실험예 3의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 4(A) 및 4(B)는 실험예 4의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 실험예 5의 실험 결과를 도시한 표이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에서, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)% 를 의미한다.
또한, 본 명세서 전체에서 "포유류"는 사람을 제외한 포유류를 의미하는 것으로, 사람을 제외한다는 언급 없이 단순히 "포유류"라고 기재되어 있더라도 사람을 제외한 포유류로 이해되어야 하며, "세포가 제거된다"라는 표현은 DNA가 파괴되거나 제거되는 것을 포함하는 포괄적인 의미로 이해되어야 한다.
또한, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.
본 발명은 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 다단계 방식의 탈세포 과정을 거쳐 포유류 유래 조직 내 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질이 효과적으로 제거되고, 탈세포 과정 중 엘라스틴 손실이 적어서 엘라스틴으로 인한 조직재생 촉진, 흉터 생성 억제 등의 효과가 최대화된 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
먼저, 본 발명의 일 실시예는 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스는, 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 있어서, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조된다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하일 수 있다. 또한, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L) 이 20% 이하이다.
여기서, 감소율(L)은, 하기의 수식 (1)로 정의되며, 이때 L0는 준비 단계에서 조직의 엘라스틴 함량을 의미하고, Lf는 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량을 의미한다.
먼저, 상기 준비 단계는 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 단계이다. 여기서 포유류는 사람을 제외한 포유류로, 예를 들어, 돼지, 말, 소, 양 등일 수 있고, 상기 조직은 이러한 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하기 위해 먼저 포유류의 조직이 채취된다. 이렇게 채취된 포유류의 조직은, 준비 단계에서 포유류 조직에 달라붙어 있는 쓸모없는 조직 및 혈액이 제거되고, 세척, 건조 및 절삭되어 준비된다. 이렇게 준비된 포유류의 조직은 냉동상태로 보관될 수 있으며, 작업이 요구될 때 해동되어 사용될 수 있다. 냉동상태의 조직 원료를 사용하는 경우, 준비 단계는 냉동상태의 조직 원료를 꺼내어 준비하는 단계일 수 있다.
다음으로, 준비 단계에서 준비된 포유류의 조직은 전처리 단계를 통해 전처리된다.
이 단계는 포유류의 조직을 세척하는 단계로, 포유류의 조직이 냉동상태인 경우에는 이 단계를 통해 해동, 세척 및 절삭될 수 있다. 이 단계에서는 세척수로 증류수, 정제수, 식염수 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 이 단계부터 제2 불활성화 단계까지 물리적 교반이 이루어질 수 있다.
이렇게 전처리 단계를 통해 준비된 포유류의 조직은 제1 불활성화 단계, 1차 탈세포화 단계, 2차 탈세포화 단계 및 제2 불활성화 단계를 거치며 면역 및 이물 반응을 유발할 수 있는 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질이 제거될 수 있다. 이와 같이 다단계 반응을 통해 탈세포화됨으로써 각 단계에서의 탈세포 효율, 이물질 제거 효율이 현저히 향상되므로 한 번에 처리되는 조직의 양이 증가하고, 처리 시간이 짧아져 결과적으로 탈세포화된 조직 매트릭스의 생산성 및 수득률이 향상되는 효과를 얻을 수 있다.
먼저, 상기 제1 불활성화 단계는 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화 하는 단계이다.
이 단계는, 조직을 탈세포처리하기 전에 먼저 조직 내 바이러스를 일차적으로 불활성화시킴으로써 1차 및 2차 탈세포화 단계에서 세포, 조지방 및 이물질을 보다 효과적으로 제거하기 위해 수행된다.
이 단계에서 사용되는 알코올은 n-프로판올일 수 있으며, 바이러스 불활성화 효과를 얻기 위해 50~90% 농도의 n-프로판올 수용액이 사용되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 65~80% 농도의 n-프로판올 수용액이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 제1 불활성화 단계에서 바이러스 불활성화를 위한 알코올로 n-프로판올을 사용한다. 이와 같이 바이러스 불활성화를 위해 n-프로판올이 사용되는 경우에는 조직이 보다 부드러워지는데, 조직이 부드러우면 조직 내로 처리액이 보다 잘 침투하므로 바이러스 불활성화 및 탈세포화가 전체적으로 균일하게 수행되는 효과가 얻어진다. 결과적으로 불활성화, 탈세포화 처리 효율이 향상되고 보다 균일한 조직을 수득할 수 있으며, 최종적으로 얻어진 탈세포화된 조직 매트릭스의 품질 및 신뢰성이 향상될 수 있다.
일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 사용되는 에탄올이 사용될 경우, 탈세포화될 포유류의 조직을 고정하여 경화시키는 특징이 있는데, 본 발명의 이 단계에서 n-프로판올 대신에 에탄올이 사용될 경우, 조직이 단단해져 후속 단계에서 조직을 느슨하게 하여 처리 물질의 침투력을 향상시키는 공정의 효율이 저하되므로 바람직하지 않다.
또한, iso-프로판올의 경우에는 바이러스 불활성화 효과가 낮으므로, 제1 불활성화 단계에서 iso-프로판올을 사용할 경우에는, 충분한 바이러스 불활성화 효과가 얻어지지 않아, 후속되는 1차 및 2차 탈세포화 단계에서 탈세포 효율이 감소하므로, 제1 불활성화 단계에서는 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하다.
이 단계에서 프로판올 수용액 100 중량부에 대하여 전처리된 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있다.
상기 1차 탈세포화 단계는 제1 불활성화 단계를 거쳐 바이러스 불활성화된 조직에 염기 수용액을 처리하여 세포를 제거하는 단계이다.
이 단계는 먼저 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용하여 조직을 처리하는 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용하여 조직을 처리하는 제2 탈세포화 단계를 포함한다. 여기서 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액이고, 알코올은 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하며, 이 경우, 제1 탈세포화 단계는 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 조직을 처리하여 수행되는 단계이고, 제2 탈세포화 단계는 수산화나트륨 수용액에 조직을 처리하여 수행되는 단계이다.
이와 같이 탈세포화 단계가 두 단계에 거쳐서 수행되면, 먼저 제1 탈세포화 단계를 통해 탈세포 제거 뿐만 아니라 조지방 등의 이물질이 제거되어, 제2 탈세포화 단계에서 보다 효과적인 탈세포 과정이 이루어진다.
제1 및 제2 탈세포화 단계 각각에서, 처리 용액 100 중량부에 대하여 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있으며, 이는 종래 처리 용량의 약 두 배에 가까운 것으로, 본 발명의 다단계 방식을 통해 효과적인 탈세포 처리가 가능하기 때문에 이와 같이 기존에 비해 두 배 용량의 조직을 충분히 처리할 수 있는 효과가 있다.
구체적으로, 제1 탈세포화 단계는 바이러스 불활성화된 조직을 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 처리하는 단계이다. 이 단계에서 조직 내 조지방과 수산화나트륨이 비누화 반응을 하여, 조지방이 조직으로부터 분리, 제거되는데, 이때 n-프로판올은 이러한 비누화 반응을 촉진시키고 비누화 반응의 생성물을 서로 응집시키는 작용을하여 조지방이 보다 빠르고 효율적으로 조직으로부터 분리, 제거되도록 한다.
이때 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 조직을 처리하는 처리 시간은 10~48시간, 바람직하게는 15~40시간, 더욱 바람직하게는 18~28시간 일 수 있고, 처리 온도는 0~30℃, 바람직하게는 10~28℃, 더욱 바람직하게는 18~25℃일 수 있다. 이러한 온도 범위에서 상기 시간동안 처리될 때 조직 구조의 큰 손상이나 엘라스틴의 손실 없이 충분한 조지방 제거 효율을 얻을 수 있다.
상기 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물은 n-프로판올의 농도 50~95%, 바람직하게는 60~90%, 더욱 바람직하게는 65~85%일 수 있고, 수산화나트륨의 농도 0.05M 초과 및 0.2M 미만인 수용액일 수 있다. 이들 농도 범위는 제1 탈세포화 단계에서 조직 손상을 최소화할 수 있고, 동시에 조지방 등의 이물질이 효과적으로 제거될 수 있는 농도 범위로, 특히 수산화나트륨의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 1차 탈세포화 단계의 처리 효율이 떨어지고, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 조직 구조 자체가 붕괴되어 용해되는 문제가 있으므로, 상술한 농도 범위의 n-프로판올, 수산화나트륨 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제2 탈세포화 단계는 제1 탈세포화 단계를 거친 조직을 염기 수용액에 처리하여 조직을 연화시킴으로써 조직의 구조를 느슨하게 하면서, 동시에 탈세포 반응이 일어나는 단계이다. 조직에 포함되어 있는 조지방이나 각종 이물질은 탈세포 반응에 있어 일종의 물리, 화학적인 장벽으로 작용하는데, 앞서 조직이 제1 탈세포화 단계를 거쳐 조지방이나 각종 이물질이 제거된 상태이기 때문에 제2 탈세포화 단계에서 탈세포 반응이 보다 효과적으로 이루어질 수 있다.
이 단계에서 조직을 염기 수용액에 처리하는 처리 시간은 10~48시간, 바람직하게는 15~40시간, 더욱 바람직하게는 18~28시간 일 수 있고, 처리 온도는 0~30℃, 바람직하게는 10~28℃, 더욱 바람직하게는 18~25℃일 수 있으며, 이러한 온도 범위에서 상기 시간동안 처리될 때 조직 구조의 붕괴, 엘라스틴의 손실 없이 조직 구조가 충분히 느슨하게 변형되고, 적절한 탈세포화 반응이 이루어질 수 있다.
이때 처리액으로 사용되는 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액일 수 있으며 수산화나트륨 수용액에 포함된 수산화나트륨의 농도는 0.05M 초과 및 0.2M 미만일 수 있다. 수산화나트륨의 농도가 0.05M 이하인 경우에는 조직 구조가 충분히 느슨해지지 않아 후술될 2차 탈세포화 단계에서의 탈세포 효율이 떨어지는 문제가 있고, 0.2M 이상인 경우에는 본 단계에서 일부 조직이 느슨해지는 수준을 넘어서 와해되거나 용해되어 최종 수율이 현저히 떨어지고, 엘라스틴이 손실될 수 있으므로 상술한 농도의 수산화나트륨 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
1차 탈세포화 단계 이후에 효소를 이용한 2차 탈세포화 단계가 수행되는데, 이 두 단계 사이에 중화단계 및 세척단계가 수행될 수 있다.
중화단계는 1차 탈세포화 단계에서 사용된 수산화나트륨을 중화하기 위해 산성수용액으로 처리하는 단계로, 이때 사용되는 산성수용액의 종류로 예를 들어, 염산, 황산, 아세트산, 퍼아세트산 중 적어도 어느 하나 이상이 포함된 산성수용액이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들의 농도 또한 작업 환경이나 조건에 맞추어 적절히 조절되어 사용될 수 있다.
세척단계는 후속 공정인 2차 탈세포화 단계에서 효소처리할 때 잔류물로 인한 효소 반응성 저하를 방지하기 위해 수행되는 단계로, 세척단계에서 사용되는 세척액으로는 버퍼용액이 사용될 수 있으며, 예를 들어 PBS(Phosphate buffered saline) 용액이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 2차 탈세포화 단계는, 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 단계로, 1차 탈세포화된 조직에 DNA 분해효소를 처리하여 1차 탈세포화된 조직 내의 DNA를 제거하는 단계이다.
이 단계에서 DNA 분해효소가 포함된 처리 용액 100 중량부에 대하여 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있으며, 이는 앞서 설명한 바와 같이 기존에 비해 약 두 배에 가까운 처리 용량으로, 본 발명의 다단계 탈세포 처리 과정에 의해 처리 효율이 증가하기 때문에 달성 가능한 처리 용량이다.
이 단계에서 효소 활성 및 충분한 DNA 분해 효율을 얻기 위해 조직을 DNA 분해효소로 처리하는 처리 시간은 10~35시간, 바람직하게는 18~30시간일 수 있고, 처리 온도는 30~45℃ 바람직하게는 35~42℃일 수 있다.
본 발명에서 처리 용액에 포함되는 DNA 분해효소의 농도는 0.0001~0.005wt%이며, 이는 통상 종래의 유사 기술에서 사용되어 왔던 DNA 분해효소 농도에 비해 수 배 ~ 수백 배 낮은 농도이다. 본 발명의 1차 탈세포화된 조직은, 1차 탈세포화 단계를 거치며 조직 내 조지방을 포함한 이물질이 제거되고, 조직의 구조가 느슨해지게 된다. 이 상태에서 DNA 분해효소가 투입되면 조직 구조 내부로 DNA 분해효소가 매우 용이하게 침투할 수 있으며, 이에 따라 저농도의 DNA 분해효소를 사용하더라도 최소 동일하거나 더 우수한 DNA 제거 효율을 확보할 수 있으므로, 본 발명에서는 상기와 같은 저농도의 DNA 분해효소를 사용할 수 있다.
그러나, DNA 분해효소의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 DNA 분해 효율이 떨어지므로 0.0001% 이상의 농도로 사용되는 것이 바람직하고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 추가되는 DNA 분해효소의 양에 비해 DNA 분해효율이 향상되는 정도가 극히 미미하므로 비경제적이기 때문에, 상술한 농도 범위의 DNA 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 2차 탈세포화 단계를 거쳐 탈세포화된 조직은 제2 불활성화 단계를 거치며 추가적인 바이러스의 제거가 이루어지는데, 이 두 단계 사이에 추가적으로 탈색단계 및/또는 탈지단계가 수행될 수 있다. 탈색 단계는 조직의 색을 제거하는 단계로, 예를 들어 조직을 과산화수소수로 처리하여 수행될 수 있고, 탈지 단계는 조직 내에 포함된 지방질을 추가로 더 제거하는 단계로, 예를 들어 케톤 용액, 바람직하게는 아세톤 용액을 이용하여 수행될 수 있다.
이어서 2차 탈세포화 단계를 거친 조직 내에 포함된 바이러스를 추가적으로 더 불활성화하는 제2 불활성화 단계가 수행된다. 이 단계는 산을 사용하여 조직 내 바이러스를 불활성화하는 단계로, 구체적으로는 조직을 유기산과 알코올의 혼합물로 처리하는 단계이다.
이때 사용되는 유기산은 과산화아세트산이 사용될 수 있는데, 과산화아세트산은 산화제로, 바이러스의 불특정 자유 라디칼 손상을 유발하는 방식으로 바이러스를 불활성화할 수 있다. 이 단계에서 사용되는 과산화아세트산은 0.05~1% 농도로 사용될 수 있다.
또한 이 단계에서 사용되는 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 등 탄소수 1~4의 저급 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 에탄올은 바이러스를 불활성화하는 기능과 조직 구조를 고정하여 조직을 단단하게 만드는 기능을 수행하기 때문에 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 단계를 거쳐 최종적으로 바이러스가 불활성화되고, 조지방, DNA가 제거되며 엘라스틴을 포함한 각종 세포외기질 성분이 포함된 조직 매트릭스가 얻어질 수 있다.
이렇게 얻어진 조직 매트릭스에 포함된 DNA의 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하로 매우 낮은 DNA 함량을 가져 면역이나 각종 이물 반응 유발이 최소화될 수 있다.
또한, 상기 조직 매트릭스는 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거치며 감소된 엘라스틴 함량이 매우 낮아 엘라스틴에 의한 상처 치유 및 흉터 억제 등의 효과를 갖는 장점이 있다. 구체적으로, 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이다. 이러한 수치값은 종래의 탈세포방식이 적용된 경우, 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 50% 이상으로 매우 높게 나타나는 것과 비교하여 매우 낮은 수치이다.
한편, 제2 불활성화 단계 이후에는 세척, 포장, 멸균, 가공 등의 단계가 추가적으로 더 수행될 수 있다. 세척은 버퍼 용액, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있고, 포장은 상기 조직 매트릭스를 보관이나 이송할 때의 오염을 방지하고 취급이 용이하도록 수행되며, 포장시 보존액에 담긴 상태로 포장될 수도 있다.
멸균은 제2 불활성화 단계 이후에 발생되는 추가적인 오염을 제거하기 위해 수행되며, 멸균을 위해 예를 들어, 전자선 조사 또는 방사선 조사가 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
가공은 상기 조직 매트릭스를 활용 가능한 형태로 가공하는 것으로, 예를 들어, 건조, 분말화, 용액화 등의 방식이 적용될 수 있는데, 이와 같이 가공되어 바이오 잉크나 주사제 등과 같은 형태로 활용이 가능하며, 이에 제한되지 않고 다양한 형태로도 활용될 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시예는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예와 중복되는 설명은 일부 생략한다.
상기 제조 방법은 구체적으로, 탈세포화된 조직 매트릭스의 제조 방법에 있어서, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 포함한다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L) 이 20% 이하일 수 있다.
여기서, 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)은 하기 수식 (1)로 정의되고, L0는 준비 단계에서 조직의 엘라스틴 함량이며, Lf는 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량이다.
먼저, 상기 준비 단계는 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 단계이다. 여기서 포유류는 사람을 제외한 포유류로, 예를 들어, 돼지, 말, 소, 양 등일 수 있고, 상기 조직은 이러한 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 전처리 단계는 준비 단계에서 준비된 포유류의 조직을 세척하는 단계로, 필요에 따라서는 이 단계에서 조직이 적당한 크기로 절단될 수 있으며, 앞서 냉동 상태의 조직이 준비되는 경우에는 이 단계에서 해동이 이루어질 수 있다.
상기 제1 불활성화 단계는 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화 하는 단계로, 일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 에탄올을 사용하나, 본 발명에서는 n-프로판올을 사용한다. 이는, 에탄올이 조직을 단단하게 고정시켜 후속 단계에서의 연화 효율을 저하시키는 반면, n-프로판올의 경우에는 조직을 부드럽게 만들어 후속 단계에서의 연화 효율을 향상시키기 때문이다.
상기 1차 탈세포화 단계는 제1 불활성화 단계를 거쳐 바이러스 불활성화된 조직에 염기 수용액을 처리하여 세포를 제거하는 단계이다. 이 단계는 먼저 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용하여 조직을 처리하는 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용하여 조직을 처리하는 제2 탈세포화 단계를 포함한다.
여기서 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액이고, 알코올은 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하다.
구체적으로, 제1 탈세포화 단계는 바이러스 불활성화된 조직을 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 처리하는 단계로, 이 단계를 거쳐 조직 내 조지방 및 이물질이 제거되며 조직이 일부 연화된다. 제2 탈세포화 단계는 수산화나트륨 수용액에 조직을 처리하는 단계로, 이 단계에서 조직의 연화와 동시에 탈세포 반응이 일어나는데, 앞서 조지방이 포함된 이물질이 제거되어 이러한 효과가 보다 향상될 수 있다.
제1 및 제2 탈세포화 단계에서 수산화나트륨은 0.05M 초과 및 0.2M 미만의 농도로 포함될 수 있는데, 이는 수산화나트륨에 의한 비누화, 연화 반응이 충분히 일어나면서, 조직의 와해나 용해를 방지하기 위한 바람직한 농도범위이다.
다음으로, 1차 탈세포화 단계 이후에 효소를 이용한 2차 탈세포화 단계가 수행되는데, 이 두 단계 사이에 중화단계 및 세척단계가 수행될 수 있다. 중화단계는 1차 탈세포화 단계에서 사용된 수산화나트륨을 중화하기 위해 산성수용액으로 처리하는 단계이고, 세척단계는 후속 공정인 2차 탈세포화 단계에서 효소처리할 때 잔류물로 인한 효소 반응성 저하를 방지하기 위해 수행되는 단계이다.
상기 2차 탈세포화 단계는, 1차 탈세포화된 조직을 DNA 분해효소처리하여 조직 내 DNA를 제거하는 단계이다. 본 발명의 1차 탈세포화된 조직은, 1차 탈세포화 단계를 거치며 조직 내 조지방을 포함한 이물질이 제거되고, 조직의 구조가 느슨해지게 된다. 이 상태에서 DNA 분해효소가 투입되면 조직 구조 내부로 DNA 분해효소가 매우 용이하게 침투할 수 있으며, 이에 따라 저농도의 DNA 분해효소를 사용하더라도 최소 동일하거나 더 우수한 DNA 제거 효율을 확보할 수 있으므로, 본 발명에서는 DNA 분해효소를 0.0001~0.005wt%의 저농도로 사용한다. DNA 분해효소의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 DNA 분해 효율이 떨어지고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 추가되는 DNA 분해효소의 양에 비해 DNA 분해효율이 향상되는 정도가 극히 미미하므로 비경제적이기 때문에, 상술한 농도 범위의 DNA 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 2차 탈세포화 단계를 거쳐 탈세포화된 조직은 제2 불활성화 단계를 거치며 추가적인 바이러스의 제거가 이루어지는데, 이 두 단계 사이에 추가적으로 탈색단계 및/또는 탈지단계가 수행될 수 있다. 탈색 단계는 조직의 색을 제거하는 단계로, 예를 들어 조직을 과산화수소수로 처리하여 수행될 수 있고, 탈지 단계는 조직 내에 포함된 지방질을 추가로 더 제거하는 단계로, 예를 들어 케톤 용액, 바람직하게는 아세톤 용액을 이용하여 수행될 수 있다.
이어서 2차 탈세포화 단계를 거친 조직 내에 포함된 바이러스를 추가적으로 더 불활성화하는 제2 불활성화 단계가 수행된다. 이 단계는 조직을 유기산과 알코올의 혼합물로 처리하는 단계로, 유기산으로는 과산화아세트산이, 알코올로는 에탄올이 사용될 수 있으며, 이러한 혼합 용액을 이용하여 조직을 처리함으로써 조직 내 바이러스가 효과적으로 제거될 수 있다.
이러한 단계를 거쳐 최종적으로 바이러스가 불활성화되고, 조지방, DNA가 제거되며 엘라스틴을 포함한 각종 세포외기질 성분이 포함된 조직 매트릭스를 제조할 수 있다.
이렇게 얻어진 조직 매트릭스에 포함된 DNA의 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하로 매우 낮은 DNA 함량을 가져 면역이나 각종 이물 반응 유발이 최소화될 수 있다.
또한, 상기 조직 매트릭스는 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거치며 감소된 엘라스틴 함량이 매우 낮아 엘라스틴에 의한 상처 치유 및 흉터 억제 등의 효과를 갖는 장점이 있다. 구체적으로, 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이다. 이러한 수치값은 종래의 탈세포방식이 적용된 경우, 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 50% 이상으로 매우 높게 나타나는 것과 비교하여 매우 낮은 수치이다.
한편, 제2 불활성화 단계 이후에는 세척, 포장, 멸균, 가공 등의 단계가 추가적으로 더 수행될 수 있다. 세척은 버퍼 용액, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있고, 포장은 상기 조직 매트릭스를 보관이나 이송할 때의 오염을 방지하고 취급이 용이하도록 수행되며, 멸균은 제2 불활성화 단계 이후에 발생되는 추가적인 오염을 제거하기 위해 수행된다.
가공은 상기 조직 매트릭스를 활용 가능한 형태로 가공하는 것으로, 예를 들어, 건조, 분말화, 용액화 등의 방식이 적용될 수 있는데, 이와 같이 가공되어 바이오 잉크나 주사제 등과 같은 형태로 활용이 가능하며, 이에 제한되지 않고 다양한 형태로도 활용될 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예를 통해 본 발명의 구체적인 작용과 효과를 설명하고자 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로서 제시된 것으로, 실시예에 따라 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
1. 준비 및 전처리 단계
먼저, 세척, 건조, 절삭 및 냉동 보관된 돼지 심장 연결 대동맥을 준비하고, 해동한 뒤 증류수를 이용하여 세척한 후 50×50mm 크기로 절단하여 원료 조직 시편을 준비하였다.
2. 제1 불활성화 단계
다음으로, 70% n-프로판올 1L에 원료 조직 시편 250g을 투입하고 온도 20℃, 교반 속도 150RPM으로 24시간 교반하여 제1 불활성화 단계를 수행하였다.
3-1. 1차 탈세포화 단계(제1 탈세포화 단계)
이어서, 증류수에 n-프로판올이 70%의 농도로 포함되고, 수산화나트륨 0.1M의 농도로 포함된 혼합용액을 준비하고, 상기 혼합용액 100 중량부에 대하여 상기 원료 조직 시편이 23 중량부로 포함되도록 혼합한 뒤 온도 20℃, 교반 속도 150RPM으로 24시간 교반하여 제1 탈세포화 단계를 수행하였다.
3-2. 1차 탈세포화 단계(제2 탈세포화 단계)
다음으로, 미리 준비된 0.1M의 수산화나트륨 수용액 100 중량부에 대하여 제1 탈세포화 단계를 거친 조직 시편이 24 중량부로 포함되도록 혼합한 뒤, 앞 단계와 동일한 조건에서 24시간 동안 교반하여 제2 탈세포화 단계를 수행하였다.
계속해서 상기 제2 탈세포화 단계를 거친 조직 시편을 아세트산 수용액에 침지하고 교반하여 중화한 뒤, PBS 용액으로 세척하였다.
4. 2차 탈세포화 단계
이어서, DNase가 0.00011wt%의 농도로 포함된 처리 용액에 상기 조직 시편을 투입하고 온도 37℃에서 23시간 동안 150RPM의 교반 속도로 교반하여 2차 탈세포화 단계를 수행하였다. 2차 탈세포화 단계가 완료된 조직시편을 20℃의 3% 과산화수소수에 1시간동안 처리하여 탈색하고, 20℃의 20% 아세톤 수용액에 1시간동안 처리하여 탈지처리하였다.
5. 제2 불활성화 단계
이어서, 상기 조직 시편을 증류수에 n-프로판올이 70%의 농도로 포함되고, 0.2%의 과산화아세트산이 포함된 혼합용액에 침지하고, 20℃에서 4시간 반 동안 처리하여 제2 불활성화 단계를 수행하였다.
마지막으로, 상기 처리 과정을 모두 거친 조직 시편을 PBS 용액 및 증류수로 세척하여 본 발명의 일 실시예에 따른 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 준비하였다.
[실험예 1]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하되, 제1, 제2 및 2차 탈세포화 단계를 순차적으로 거칠 때 각 단계가 수행된 직후 조직 시편을 채취하여 조직 시편 1mg당 포함된 엘라스틴 함량을 측정하고, 그 결과를 도 1(A)에 나타내었다. 또한 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량을 측정하여, 원조직의 엘라스틴 함량에 대하여 각 단계가 수행된 시점에서의 엘라스틴 함량을 백분율로 나타내어 도 1(B)에 도시하였다.
도 1(A) 및 도 1(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
엘라스틴 함량은, 분석 키트 Fastin Elastin Assay kit F2000(제조사: Biocolor)를 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 실험한 뒤, Multimode plate reader Victor Nivo™(제조사: Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 513mm에서 엘라스틴을 분석하고, 스탠다드 물질과 비교하여 엘라스틴 함량을 측정하였다.
도 1(A), 1(B)의 결과를 참조하면, 각 공정이 진행됨에 따라 엘라스틴 함량이 약간 손실되는 것을 확인할 수 있으나, 최종 공정이 완료된 시점에서 약 80% 이상의 엘라스틴이 남아있는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하되, 제1, 제2 및 2차 탈세포화 단계를 각각 한 단계씩만 생략하고, 최종 공정까지 거친 조직 시편을 채취하여 조직 시편 1mg당 포함된 엘라스틴의 함량을 측정하고, 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량을 동일한 방법으로 측정한 뒤, L값을 계산하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.
또한, 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량에 대하여 각 단계가 생략되어 얻어진 조직 매트릭스에 포함된 엘라스틴 함량을 백분율로 계산하여 그 결과를 도 2에 도시하였다.
엘라스틴 함량은, 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였고, 표 1 및 도 2에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
| 모든 공정 진행 | 1공정 제외 | 2공정 제외 | 3공정 제외 | |
| L0(㎍/㎎) | 615.6 | |||
| Lf(㎍/㎎) | 514.9 | 503.5 | 507.8 | 519.1 |
| L(%) | 16.4 | 18.2 | 17.5 | 15.7 |
먼저 표 1을 살펴보면, 모든 공정을 진행하는 경우와, 하나의 공정을 생략하였을 때 모두 L값이 20% 이하로 나타나는 것을 확인할 수 있고, 도 2를 참조하면, 특정 공정을 생략하더라도 엘라스틴 함량이 크게 달라지지 않는 것을 확인할 수 있다.따라서, 본 실험 결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 공정 중 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계 중 어느 한 단계를 생략하더라도 엘라스틴 함량에는 크게 영향이 없는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 3]
실험예 1과 동일한 방법으로 실험하되, 각 단계 수행 후 엘라스틴 함량이 아닌 DNA 함량을 측정하였다. DNA 함량은, 분석 키트 Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay kits and dsDNA Reagents(제조사: Invitrogen)를 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 실험한 뒤, Multimode plate reader Victor Nivo™(제조사: Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 480~520mm에서 DNA 함량을 측정하였다.
각 단계 수행 후 조직 1mg당 DNA 함량은 도 3(A)에 도시하였고, 원조직의 DNA 함량 대비 각 단계 수행 후 조직의 DNA 함량은 도 3(B)에 백분율값으로 도시하였다. 이때, 도 3(A) 및 도 3(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
도 3(A) 및 도 3(B)를 참조하면, 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계를 모두 거친 뒤 대부분의 DNA가 제거되는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 4]
실험예 2와 동일한 방법으로 실험하되, 각각 하나씩 단계가 생략되어 제조된 조직 매트릭스의 DNA 함량을 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하였다.
각 단계가 생략되어 얻어진 조직 매트릭스 1mg당 DNA 함량은 도 4(A)에 도시하였고, 원조직의 DNA 함량 대비 각 단계가 생략되어 얻어진 조직의 DNA 함량은 도 4(B)에 백분율값으로 도시하였다. 이때, 도 4(A) 및 도 4(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
도 4(A) 및 4(B)를 참조하면, 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계를 모두 거쳐야 DNA가 확실하게 제거되는 것을 확인할 수 있다. 특히, 제2 탈세포화 단계나 2차 탈세포화 단계가 생략되는 경우에는 DNA 제거 효율이 현저히 떨어지는 것을 알 수 있으므로, 본 실험을 통해 각 단계를 모두 순차적으로 거치는 것이 DNA 제거에 있어서 보다 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 5]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하되, 1차 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 수산화나트륨의 농도를 0.005M, 0.1M, 0.2M, 0.3M로 변화시켜가며 조직을 처리하였다.
실험 중에 제2 탈세포화 단계(제2 공정) 처리 중 및 처리 후 조직의 상태를 촬영하여 도 5에 도시하였다. 또한, 최종적으로 얻어진 조직 매트릭스 1mg에 포함되어 있는 DNA의 함량을 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하고, 최초 투입된 조직의 함량에 대하여 최종적으로 얻어진 조직 매트릭스의 함량을 백분율 값으로 나타내 조직 매트릭스 수득률을 계산하였으며, H&E 염색 사진을 촬영한 사진을 도 5에 도시하였다.
도 5를 참조하면, NaOH의 농도가 0.05M인 경우에는 수득률은 양호하나 DNA 함량이 높고, 조직 내에 제거되지 않은 세포핵이 존재하는 것으로 확인되어, 탈세포 효율이 낮은 것을 알 수 있다.
반면, 0.1M의 NaOH 로 처리된 경우에는 제2 탈세포화 단계에서 조직의 구조가 양호하게 유지되고, 최종 처리 후 DNA 함량이 0.6ng/mg으로 매우 낮으며, 수득률이 20.8%로 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
0.2M의 NaOH 로 처리된 경우에는, DNA 함량이 낮으나, 1차 탈세포화 단계 중에 조직의 일부가 와해되어, 최종 수득률이 0.1M의 NaOH로 처리된 경우에 비해 절반도 안되는 것으로 나타났으며, 0.3M의 NaOH로 처리된 경우에는 조직이 거의 용해되는 것으로 나타나 조직 수득이 불가능한 것으로 나타났다.
따라서, 본 실험 결과로부터 1차 탈세포화 단계에서 조직의 와해나 용해가 일어나지 않아 수득률이 우수하고, 조직 내 DNA가 충분히 제거된 조직 매트릭스를 얻기 위해, 1차 탈세포화 단계, 특히 제2 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 NaOH의 농도는 0.05M 초과 및 0.2M 미만인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하되, 1차 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 수산화나트륨의 농도가 0.005M, 0.1M인 경우에 Dnase의 농도를 0.0001~0.003wt%로 변화시켜가며 조직을 처리한 뒤, 최종적으로 얻어진 각 조직 매트릭스의 DNA 함량비 및 조직 매트릭스의 수득률을 계산하여 그 결과를 표 2에 기재하였다.
| NaOH 농도 | 0.05 | 0.1 | ||||
| DNase 농도(wt%) | 0.0028 | 0.0014 | 0.0007 | 0.0002 | 0.0002 | 0.0001 |
| DNA 농도(ng/mg) | 25.7 | 38.0 | 54.7 | 0.2 | 0.3 | 0.6 |
| 수득률(%) | 20.3 | 20.7 | 19.9 | 21.0 | 21.4 | 20.8 |
상기 표 2의 결과를 참조하면, NaOH의 농도가 일정한 경우, DNase의 농도가 증가할수록 최종 조직 매트릭스 내의 DNA 농도가 낮아지는 것을 알 수 있다. 그러나, NaOH의 농도가 0.1M인 경우에 0.05M일때보다 수배 내지 수십배 낮은 농도의 DNase로 처리했음에도 불구하고 최종적으로 얻어진 조직 매트릭스 내 DNA 농도가 오히려 더 낮았으며, 수득률의 차이는 유의미하지 않은 것을 확인할 수 있다.본 실험 결과, NaOH의 농도가 0.05M인 경우, 0.1M인 경우에 비해 DNA 제거 효율이 현저히 떨어지는 것으로 나타나, 1차 탈세포화 단계에서 사용되는 처리액 내 NaOH의 농도는 0.05M을 초과하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
Claims (10)
- 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 있어서,
사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계;
상기 조직을 전처리하는 전처리 단계;
알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계;
바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계;
1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및
산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며,
상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고,
상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이며,
상기 1차 탈세포화 단계는, n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되는 제1 탈세포화 단계; 및 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행되는, 제2 탈세포화 단계;를 포함하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 조직은, 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 2차 탈세포화 단계는, DNase를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스. - 탈세포화된 조직 매트릭스의 제조 방법에 있어서,
사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계;
상기 조직을 전처리하는 전처리 단계;
알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계;
바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계;
1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및
산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 포함하고,
상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고,
상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이며,
상기 1차 탈세포화 단계는, n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되는 제1 탈세포화 단계; 및 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행되는, 제2 탈세포화 단계;를 포함하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 1차 탈세포화 단계와 2차 탈세포화 단계의 사이에, 산성 용액을 사용한 중화 단계와 PBS를 사용한 세척 단계가 더 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 2차 탈세포화 단계와 제2 불활성화 단계의 사이에, 탈색 단계 및/또는 탈지 단계가 더 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 제2 불활성화 단계는, 유기산과 알코올의 혼합물을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 제2 불활성화 단계 이후, 세척, 포장 및 멸균 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220049750A KR102559788B1 (ko) | 2022-04-21 | 2022-04-21 | 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 |
| PCT/KR2023/002941 WO2023204435A1 (ko) | 2022-04-21 | 2023-03-03 | 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220049750A KR102559788B1 (ko) | 2022-04-21 | 2022-04-21 | 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102559788B1 true KR102559788B1 (ko) | 2023-07-27 |
Family
ID=87433153
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220049750A KR102559788B1 (ko) | 2022-04-21 | 2022-04-21 | 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102559788B1 (ko) |
| WO (1) | WO2023204435A1 (ko) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090088054A (ko) * | 2008-02-14 | 2009-08-19 | 주식회사 바이오랜드 | 생체조직 이식재 및 그의 제조 방법 |
| KR20120100748A (ko) * | 2011-02-28 | 2012-09-12 | 주식회사 코리아본뱅크 | 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체를 제조하는 방법 |
| KR20130118418A (ko) * | 2012-04-20 | 2013-10-30 | 주식회사 제네웰 | 생체조직 유래 소재의 탈세포 처리제, 이를 이용한 처리방법 및 이로부터 수득된 생체 재료 |
| KR20140007192A (ko) * | 2012-07-09 | 2014-01-17 | 주식회사 오스코텍 | 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막의 제조방법 |
| KR20160038047A (ko) * | 2013-07-30 | 2016-04-06 | 테옥산 | 히알루론산 및 메피바카인을 포함하는 조성물 |
| WO2017092918A1 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | Biotronik Ag | Method for preparing corneal tissue |
| KR20170122178A (ko) * | 2015-02-27 | 2017-11-03 | 가부시키가이샤 아데카 | 탈세포화 조직 |
| KR20180085341A (ko) * | 2017-01-18 | 2018-07-26 | 구태훈 | 모노-페이직 ha 필러의 특성과 바이-페이직 ha 필러의 특성을 함께 갖는 ha 필러, 필러 주입에 사용되는 주사기 및, 필러의 제조방법 |
| KR20180131721A (ko) * | 2017-05-31 | 2018-12-11 | 포항공과대학교 산학협력단 | 피부 조직의 탈세포화 방법, 인공 피부 제작 방법, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 동결 건조한 탈세화된 피부 조직 및 바이오 잉크 |
| KR102030508B1 (ko) * | 2011-02-03 | 2019-10-10 | 큐-메드 에이비 | 히알루론산 조성물 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5993844A (en) * | 1997-05-08 | 1999-11-30 | Organogenesis, Inc. | Chemical treatment, without detergents or enzymes, of tissue to form an acellular, collagenous matrix |
| US6267786B1 (en) * | 1999-02-11 | 2001-07-31 | Crosscart, Inc. | Proteoglycan-reduced soft tissue xenografts |
-
2022
- 2022-04-21 KR KR1020220049750A patent/KR102559788B1/ko active IP Right Grant
-
2023
- 2023-03-03 WO PCT/KR2023/002941 patent/WO2023204435A1/ko unknown
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090088054A (ko) * | 2008-02-14 | 2009-08-19 | 주식회사 바이오랜드 | 생체조직 이식재 및 그의 제조 방법 |
| KR102030508B1 (ko) * | 2011-02-03 | 2019-10-10 | 큐-메드 에이비 | 히알루론산 조성물 |
| KR20120100748A (ko) * | 2011-02-28 | 2012-09-12 | 주식회사 코리아본뱅크 | 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체를 제조하는 방법 |
| KR20130118418A (ko) * | 2012-04-20 | 2013-10-30 | 주식회사 제네웰 | 생체조직 유래 소재의 탈세포 처리제, 이를 이용한 처리방법 및 이로부터 수득된 생체 재료 |
| KR101410533B1 (ko) | 2012-04-20 | 2014-06-20 | 주식회사 제네웰 | 생체조직 유래 소재의 처리방법 |
| KR20140007192A (ko) * | 2012-07-09 | 2014-01-17 | 주식회사 오스코텍 | 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막의 제조방법 |
| KR20160038047A (ko) * | 2013-07-30 | 2016-04-06 | 테옥산 | 히알루론산 및 메피바카인을 포함하는 조성물 |
| KR20170122178A (ko) * | 2015-02-27 | 2017-11-03 | 가부시키가이샤 아데카 | 탈세포화 조직 |
| WO2017092918A1 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | Biotronik Ag | Method for preparing corneal tissue |
| KR20180085341A (ko) * | 2017-01-18 | 2018-07-26 | 구태훈 | 모노-페이직 ha 필러의 특성과 바이-페이직 ha 필러의 특성을 함께 갖는 ha 필러, 필러 주입에 사용되는 주사기 및, 필러의 제조방법 |
| KR20180131721A (ko) * | 2017-05-31 | 2018-12-11 | 포항공과대학교 산학협력단 | 피부 조직의 탈세포화 방법, 인공 피부 제작 방법, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 동결 건조한 탈세화된 피부 조직 및 바이오 잉크 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Tao Li et al., "A Saponification Method for Chlorophyll Removal from Microalgae Biomass as Oil Feedstock." Mar. Drugs (2016), Vol. 14, 162, pp. 1-19* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023204435A1 (ko) | 2023-10-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20190374679A1 (en) | Method for preparing an animal decellularized tissue matrix material and a decellularized tissue matrix material prepared thereby | |
| US6696074B2 (en) | Processing fetal or neo-natal tissue to produce a scaffold for tissue engineering | |
| US6660280B1 (en) | Collagen product containing collagen of marine origin with a low odor and preferably with improved mechanical properties, and its use in the form of cosmetic or pharmaceutical compositions or products | |
| US7498412B2 (en) | Process for preparing porous collagen matrix from connective tissue | |
| US5916266A (en) | Raw membranous material for medical materials and manufacturing methods thereof | |
| EP1452150B1 (en) | Chemical cleaning of biological material | |
| AU2002309898A1 (en) | EB matrix production from fetal tissues and its use for tissue repair | |
| JPH0552751B2 (ko) | ||
| CN112618799B (zh) | 鱼皮脱细胞真皮基质及其制备方法和应用 | |
| CN107320762B (zh) | 胶原/细菌纤维素复合膜敷料及其制备方法 | |
| CN105797212A (zh) | 一种用于皮肤难愈合创面修复的脱细胞羊膜制备方法及应用 | |
| TW201627015A (zh) | 膠原蛋白海綿 | |
| CN114177340A (zh) | 一种可降解的胎盘脱细胞多孔海绵基质敷料的制备和应用 | |
| CN109364298A (zh) | 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法 | |
| CN109069263B (zh) | 猪角膜脱细胞方法及其脱细胞角膜以及板层干燥角膜使用方法 | |
| CN112618796B (zh) | 一种脱细胞真皮基质材料及其制备方法和应用 | |
| KR102559788B1 (ko) | 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 | |
| US20170080091A1 (en) | Gel sheet using hyaluronic acid | |
| Mansour et al. | The effect of source animal age, decellularization protocol, and sterilization method on bovine acellular dermal matrix as a scaffold for wound healing and skin regeneration | |
| EP2236544A1 (en) | Collagen Implant | |
| CN110960729B (zh) | 一种多糖改性的无细胞基质复合材料、制备及应用 | |
| CN115607739B (zh) | 一种生物肩袖补片及其制备方法 | |
| US8288129B2 (en) | Method for producing hyaluronic acid | |
| CN115154668A (zh) | 用于组织产物的酶处理的方法 | |
| CN114796615B (zh) | 一种软骨脱细胞基质及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GRNT | Written decision to grant |