CN110960729B

CN110960729B - 一种多糖改性的无细胞基质复合材料、制备及应用

Info

Publication number: CN110960729B
Application number: CN201911258795.5A
Authority: CN
Inventors: 曹成波; 王倩; 孙伟; 朱忠强; 孙永强
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2039-12-10
Also published as: CN110960729A

Abstract

本发明属于无细胞基质技术领域，具体涉及一种多糖改性的无细胞基质复合材料、制备及应用。将新鲜的膀胱基质经脱脂、碱处理、酶处理及冻融四步无细胞处理后，与多糖复合，利用多糖上的多个氨基与无细胞膀胱上的活性基团形成交联，提高材料的三维纤维网络结构稳定性，同时将多糖接枝到无细胞膀胱材料中，从而赋予无细胞基质材料优良生物相容性。其中，多糖包括壳聚糖、透明质酸及硫酸软骨素。本发明采用四步无细胞处理、多糖复合、无毒交联等方法制备改性无细胞膀胱基质复合材料，可用于构建再生性角膜材料、膀胱材料、口腔修复膜等组织再生修复材料。

Description

一种多糖改性的无细胞基质复合材料、制备及应用

技术领域

本发明属于无细胞基质技术领域，具体涉及一种多糖改性的无细胞基质复合材料、该复合材料的制备方法及应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

无细胞膀胱基质取材于异种生物，具有来源广泛、成本低廉、低免疫原性、以及功能上类似于膀胱等优点，是膀胱修复的热点材料。但现有无细胞方法制备的无细胞猪膀胱基质材料存在机械性能差、渗尿、降解不可控、生物相容性不佳等缺点，此外，由于无细胞过程中化学试剂的使用，破坏了膀胱中原有的生物活性因子，降低了无细胞膀胱基质诱导组织再生的能力。

壳聚糖具有优良的生物相容性、生物降解性、壳聚糖在植入体内后，可刺激免疫细胞分泌细胞因子、免疫因子，加速细胞增殖、加快植入的支架材料与组织融合。在体内溶菌酶的作用下，壳聚糖会缓慢降解成为寡糖、单糖，被人体吸收，复合壳聚糖可使基质的孔隙率降低，从而降低修复时漏尿的可能。硫酸软骨素广泛存在于细胞外基质和细胞表面，具有抗凝血作用，在无细胞的过程中会导致硫酸软骨素的流失，导致无细胞膀胱基质性能下降，将其复合在基质上可增强基质的生物相容性，从而促进细胞的粘附增殖，诱导组织再生。透明质酸广泛存在于组织器官上，具有保护细胞不受病菌侵害，防止感染，加快创伤恢复的作用。无细胞膀胱基质复合透明质酸后可调控胶原的生成，减少移植物挛缩的发生。发明人的以往研究中，提供了一种通过复合水溶性多糖对无细胞真皮基质材料进行改性修饰的方法，修饰后复合材料可用于制备生物辅料、复合移植支架等，具有良好的力学性能。

理想的膀胱修复材料应至少具备以下特征：1.具有良好的生物相容性，不会引起免疫排斥，2.有足够的机械性能，使膀胱在充盈和排空尿液时不破裂，3.能够有效防止尿液的渗透，避免尿液渗透侵蚀周围组织，4.可诱导血管和组织的新生，5.具有适宜的降解速率。但现有方式制备的无细胞膀胱基质普遍存在渗尿、机械强度低、易降解等缺点，故需开辟新思路和新制备工艺，制备具有优良理化性能的改性无细胞膀胱基质组织工程修复材料。

发明内容

针对上述研究背景，发明人认为通过改性增加无细胞膀胱基质的机械强度，可以有效的降低无细胞膀胱材料的渗漏率，可应用于膀胱修复等。针对目前采用的无细胞膀胱基质存在的不足，本发明通过改性和交联处理膀胱，可降低其抗原性，提高其抗降解性及生物相容性，并增强其诱导组织再生的能力，具有巨大的应用前景。针对该研究成果，本发明提供以下技术方案：

第一方面，提供一种改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法，所述制备方法包括对膀胱组织进行无细胞处理及采用水溶性多糖对无细胞处理后的膀胱基质进行复合的步骤，所述无细胞处理包括采用碱液、表面活性剂及蛋白酶进行处理。

优选的，所述无细胞处理具体步骤如下：

按照料液比3~5:1向去除脂肪、筋膜的膀胱组织中加入碱液及表面活性剂成分作用一段时间；通过盐溶液及酸液对膀胱组织进行脱碱；向脱碱后的猪膀胱中加入蛋白酶脱除残余细胞后冻融。

进一步优选的，所述碱液为混合表面活性剂后的碱液。

在一些具体的实施例中，所述表面活性剂为Trition X-100或SDS，所述碱为NaOH。

在一些具体的实施例中，所述表面活性剂的浓度为0.3%-0.4%。

在一些具体的实施例中，所述NaOH溶液的浓度为0.2%-1.0%。

在一些具体的实施例中，所述碱液及表面活性剂的作用时间为13~18h。

进一步优选的，所述脱碱的具体步骤如下：按照料液比3~5:1向碱处理后的膀胱中加入盐溶液，并通过盐酸将溶液pH保持在8-8.5。

在一些具体的实施例中，所述盐溶液为浓度1.8~2.2%的NH₄Cl溶液。

进一步优选的，所述蛋白酶为胰蛋白酶及中性蛋白酶。

优选的，所述采用水溶性多糖对无细胞处理后的膀胱基质进行复合的步骤具体如下：

向冻融后的无细胞膀胱基质中依次加入壳聚糖、戊二醛及硫酸软骨素进行交联，脱水后得到复合壳聚糖及硫酸软骨素的无细胞膀胱基质材料，将透明质酸溶液涂在所述基质材料表面。

进一步优选的，所述以料液比2~3:1向冻融后的无细胞膀胱基质中加入浓度为0.1%-0.4%的壳聚糖溶液，调节pH至5-6反应20~40min，再调节pH至7.5-8.0反应60-90min。

进一步优选的，所述戊二醛溶液的浓度为0.01%-0.04%，料液比为1.5-2.5:1，反应过程中将pH调节至8.0。

进一步优选的，所述硫酸软骨素的浓度为0.1%-0.4%，料液比3-4:1，反应时间为60-90min。

进一步优选的，所述透明质酸溶液配制方法如下：将透明质酸溶解于稀醋酸溶液中配置成0.8~1.2%w/v的透明溶液。

优选的，所述制备方法还包括对复合透明质酸之后的基质材料进行清洗、冻干及灭菌的步骤。

进一步优选的，所述灭菌采用钴60辐照灭菌。

第二方面，提供第一方面所述改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法得到的改性无细胞膀胱基质复合材料。

第三方面，第二方面所述改性无细胞膀胱基质复合材料作为膀胱修复材料、再生角膜材料、口腔修复材料等方面的应用。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

1.针对现有技术中无细胞膀胱基质在机械性能方面的不足，本发明提供了采用接枝多糖的方式对无细胞膀胱基质进行改性的方法，改性无细胞膀胱基质复合材料具有充足的空间维持能力，致密性更好，阻挡尿液渗透的能力更强。实验表明复合了壳聚糖后，该材料的孔隙率指数降低，渗液量降低，渗液量在0.07-0.14 cc/cm²h之间，可抵抗尿液的渗透，防止在修复时尿液渗透。

2.另外，该改性无细胞膀胱基质复合材料抵抗酶的能力显著增强，实验表明戊二醛的浓度对改性无细胞膀胱基质复合材料的体外降解性有一定的影响，随着戊二醛浓度的升高，该材料抵抗胶原酶降解的能力显著增强，可延长材料的修复时间。通过改性形成的稳定的三维纤维网络结构及可调控的孔隙大小，因此具有广阔的应用空间，技术人员可以根据不同要求将其构建再生性角膜材料、膀胱材料、口腔修复膜等组织再生修复材料。

3.本发明针对该复合材料还对膀胱脱细胞处理方法进行了优化，使其与后期的接枝改性更加适应。采用该脱细胞处理的膀胱基质细胞脱除更彻底，免疫原性更低，生物相容性更好。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中改性无细胞膀胱基质复合材料粒面图（SEM*1500）；

图2为实施例1中改性无细胞膀胱基质复合材料截面图（SEM*2000）；

图3为实施例1中改性无细胞膀胱基质复合材料苏木精-伊红染色图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下述实施例中所述“浓度”，如无特别指代，均表示质量分数；“料液比”指物料与液体的体积比。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种多糖改性的无细胞基质复合材料，该复合材料的制备方法及应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

本实施提供一种含多糖的改性无细胞膀胱基质复合材料，采用以下步骤制备：

（1）将市场上购来的膀胱剪去大块脂肪、筋膜等组织，并使用PBS缓冲液反复冲洗后称重，作为下述工序的计料依据；

（2）碱处理：温度28℃，按与猪膀胱料液比3:1，加入质量浓度0.4%的NaOH、TritonX-100溶液（该溶液中NaOH及Triton X-100的质量浓度均为0.4%），作用16h，充分去除纤维间质并脱除细胞；完成后入按料液比1:4加入蒸馏水水洗三次，每次15min。

（3）消除碱液：按与猪膀胱质量料液比3.0，温度30℃，加入浓度为2%的NH₄CL溶液。pH值控制在8-8.5，作用1.5h，每隔半小时测pH值，并使用稀盐酸调节pH。完成后入按料液比4.0加入蒸馏水水洗两次，每次15min。

（4）酶处理：温度40℃，先按与猪膀胱料液比4:1加入质量浓度0.4%的胰蛋白酶，使其作用30min，再加入1398中性蛋白酶，使溶液中中性蛋白酶的质量浓度为0.2%，作用90min，充分脱除残余细胞；完成后入按料液比4:1加入蒸馏水水洗两次，每次15min。

（5）冻融：将酶处理后的猪膀胱置于-20℃冰箱中冷冻8h，于室温中融化。

（6）复合壳聚糖：向步骤（5）得到的无细胞膀胱基质中加入质量浓度0.4%壳聚糖溶液，料液比3.0，温度30℃，pH至5-6，调整转鼓转速反应30min，再调节pH值至7.5-8.0，再反应60min，处理完毕后放净废液，再向处理后的材料中加入四倍体积的蒸馏水水洗两次，每次15min。

（7）戊二醛交联：向步骤（6）所得材料加入戊二醛溶液，料液比2.5:1，调整温度30℃，pH6.5的条件下反应90min，并在此过程中逐渐调节pH值至8.0，反应完成后，使用大量蒸馏水水洗材料至pH值在7.0左右。

（8）复合硫酸软骨素：加入浓度0.4%硫酸软骨素溶液，料液比3:1，调整温度30-40℃，反应60-90min，反应完毕后按料液比4:1加入蒸馏水水洗两次，每次15min。

（9）复合透明质酸：将透明质酸充分溶解于稀醋酸溶液中配置成浓度为1.00%的透明溶液，将（8）中复合了壳聚糖、硫酸软骨素的无细胞膀胱基质材料离心脱水，使其体积含水量70%-90%，然后使用小喷瓶将透明质酸溶液喷涂到无细胞膀胱基质材料表面，喷涂量1g/m²。

（10）PBS缓冲液清洗：按料液比4:1加入PBS缓冲液清洗两次，每次15min。

（11）冻干：于 -20℃冰箱中冷冻8h，然后调整冷冻干燥机-40℃、气压4Pa，真空冷冻干燥8h。

（12）灭菌：钴60辐照灭菌消毒。

实施例2

（2）碱处理：温度28℃，按与猪膀胱料液比5:1，加入质量浓度0.3%的NaOH、TritonX-100溶液（该溶液中NaOH及Triton X-100的质量浓度均为0.3%），作用13h，充分去除纤维间质并脱除细胞；完成后入按料液比4:1加入蒸馏水水洗三次，每次15min。

（3）消除碱液：按与猪膀胱质量料液比5:1，温度30℃，加入浓度为1.8%的NH₄Cl溶液。pH值控制在8-8.5，作用1.5h，每隔半小时测pH值，并使用稀盐酸调节pH。完成后入按料液比4:1加入蒸馏水水洗两次，每次15min。

（4）酶处理：温度40℃，先按与猪膀胱料液比4:1加入质量浓度0.4%的胰蛋白酶作用30min，再加入1398中性蛋白酶，使溶液中中性蛋白酶的质量浓度为0.2%，作用90min，充分脱除残余细胞；完成后入按料液比4:1加入蒸馏水水洗两次，每次15min。

（6）复合壳聚糖：向步骤（5）得到的无细胞膀胱基质中加入质量浓度0.1%壳聚糖溶液，料液比3:1，温度30℃，pH至5-6，调整转鼓转速反应30min，再调节pH值至7.5-8.0，再反应60min，处理完毕后放净废液，再向处理后的材料中加入四倍体积的蒸馏水水洗两次，每次15min。

（9）复合透明质酸：将透明质酸充分溶解于稀醋酸溶液中配置成浓度为0.8%的透明溶液，将（8）中复合了壳聚糖、硫酸软骨素的无细胞膀胱基质材料离心脱水，使其体积含水量70%-90%，然后使用小喷瓶将透明质酸溶液喷涂到无细胞膀胱基质材料表面，喷涂量1.1g/m²。

（10）PBS缓冲液清洗：按料液比4.0加入PBS缓冲液清洗两次，每次15min。

（11）冻干：于-20℃冰箱中冷冻8h，然后调整冷冻干燥机-40℃、气压4Pa，真空冷冻干燥8h。

（12）灭菌：钴60辐照灭菌消毒。

实施例3

（2）碱处理：温度28℃，按与猪膀胱料液比3:1，加入质量浓度0.38%的NaOH、TritonX-100溶液（该溶液中NaOH及Triton X-100的质量浓度均为0.38%），作用18h，充分去除纤维间质并脱除细胞；完成后入按料液比1:4加入蒸馏水水洗三次，每次15min。

（3）消除碱液：按与猪膀胱质量料液比3:1，温度30℃，加入浓度为2.2%的NH₄Cl溶液。pH值控制在8-8.5，作用1.5h，每隔半小时测pH值，并使用稀盐酸调节pH。完成后入按料液比4:1加入蒸馏水水洗两次，每次15min。

（4）酶处理：温度40℃，先按与猪膀胱料液比4:1加入胰蛋白酶，使其质量浓度0.4%作用30min，再加入1398中性蛋白酶，使溶液中中性蛋白酶的质量浓度为0.2%，作用90min，充分脱除残余细胞；完成后入按料液比4:1加入蒸馏水水洗两次，每次15min。

（6）复合壳聚糖：向步骤（5）得到的无细胞膀胱基质中加入质量浓度0.4%壳聚糖溶液，料液比3:1，温度30℃，pH至5-6，调整转鼓转速反应30min，再调节pH值至7.5-8.0，再反应60min，处理完毕后放净废液，再向处理后的材料中加入四倍体积的蒸馏水水洗两次，每次15min。

（9）复合透明质酸：将透明质酸充分溶解于稀醋酸溶液中配置成浓度为1.00%的透明溶液，将（8）中复合了壳聚糖、硫酸软骨素的无细胞膀胱基质材料离心脱水，使其体积含水量70%-90%，然后使用小喷瓶将透明质酸溶液喷涂到无细胞膀胱基质材料表面，喷涂量0.8g/m²。

（12）灭菌：钴60辐照灭菌消毒。

经测定，实施例1-3中制备得到改性无细胞膀胱基质复合材料主要技术指标如下表1所示：

表1

项目	性能指标
		孔隙率指数（cc/cm2*h）	≤0.11
拉伸强度（MPa）	≥8.15
		48h降解率（%）	≤66.7
苏木精-伊红染色	未见细胞残余
		扫描电镜观察	胶原排列整齐，未见细胞残余
体外细胞毒性	细胞毒性反应不大于1级

实施例4

本实例提供一种含生长因子的改性无细胞膀胱基质复合材料，采取以下步骤制备：

（1）按照实例1操作制备改性无细胞膀胱基质复合材料；

（2）在该材料表面复合10μg/m²的血管内皮生长因子，5μg/m²的神经生长因子。通过上述方法制备的改性无细胞膀胱基质复合材料可促进血管和神经的生成，促进组织的恢复。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims

1.一种改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括对膀胱组织进行无细胞处理及采用水溶性多糖对无细胞处理后的膀胱基质进行复合的步骤，所述无细胞处理包括采用碱液、表面活性剂及蛋白酶进行处理；

所述无细胞处理具体步骤如下：按照料液比3~5:1向去除脂肪、筋膜的膀胱组织中加入碱液及表面活性剂成分作用一段时间；通过盐溶液及酸液对膀胱组织进行脱碱；向脱碱后的猪膀胱中加入蛋白酶脱除残余细胞后冻融；

所述碱液为混合表面活性剂后的碱液；所述表面活性剂为Trition X-100或SDS，所述碱为NaOH；所述表面活性剂的质量浓度为0.3%-0.4%；所述NaOH溶液的质量浓度为0.2%-1.0%；所述碱液及表面活性剂的作用时间为13~18h；

所述采用水溶性多糖对无细胞处理后的膀胱基质进行复合的步骤具体如下：

2.如权利要求1所述改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法，其特征在于，所述脱碱的具体步骤如下：按照料液比3~5:1向碱处理后的膀胱中加入盐溶液，并通过盐酸将溶液pH保持在8-8.5；或所述盐溶液为质量浓度2%的NH₄Cl溶液。

3.如权利要求1所述改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为胰蛋白酶及中性蛋白酶。

4.如权利要求1所述改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法，其特征在于，

以料液比2~3:1向冻融后的无细胞膀胱基质中加入质量浓度为0.1%-0.4%的壳聚糖溶液，调节pH至5-6反应20~40min，再调节pH至7.5-8.0反应60-90min；

或所述戊二醛溶液的质量浓度为0.01%-0.04%，料液比为1.5-2.5：1，反应过程中将pH调节至8.0；

或所述硫酸软骨素的质量浓度为0.1%-0.4%，料液比3.0-4.0：1，反应时间为60-90min；

或所述透明质酸溶液配制方法如下：将透明质酸溶解于稀醋酸溶液中配置成1.00%w/v的透明溶液。

5.如权利要求4所述改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对复合透明质酸之后的基质材料进行清洗、冻干及灭菌的步骤。

6.如权利要求5所述改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法，其特征在于，所述灭菌采用钴60辐照灭菌。

7.权利要求1-6任一项所述改性无细胞膀胱基质复合材料的制备方法得到的改性无细胞膀胱基质复合材料。

8.权利要求7所述改性无细胞膀胱基质复合材料作为膀胱修复材料、再生角膜材料、口腔修复材料方面的应用。