KR102558265B1 - 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물의 합성 및 용도 - Google Patents

펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물의 합성 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염, 그 제조 방법 및 약학 용도를 개시한다. 상기 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염은 식 (I)에 나타낸 구조를 가지고 있고, 상기 화합물은 프로테아좀 억제제를 제조할 수 있으며, 고형 종양 및 혈액성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물의 합성 및 용도
본 발명은 약물 합성 분야에 속한 것으로, 구체적으로는 일련의 신규 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물의 제조 방법 및 그 약학 용도에 관한 것이다.
현재, 암은 사람의 건강을 해치는 가장 주요한 질환 중의 하나이다. 현재 암에 대한 치료는 수술 치료, 화학 치료, 방사선 치료 등 분야에서 많이 발전되었지만, 여전히 근본적으로 암을 치료할 수 없다. 현재 출시된 항암 약물은 일정한 치료 효과를 가지고 있으나, 심각한 부작용이 있다. 따라서, 유효한 종양 타깃을 통해 표적화 신규 항암 약물을 연구하는 것이 업계의 시급한 문제로 되었다.
유비퀴틴-프로테아좀 경로(Ubiquitin-Proteasome Pathway, UPP로 약칭)는 세포 내 단백질 시스템이 분해하는 주요한 경로로서, 신호 전달, 면역 반응, 미접힘 단백질 반응과 세포 주기 과정을 비롯한 많은 중요한 세포 과정에 참여한다. 이 경로는 심뇌혈관 질환, 암 및 신경계 퇴행성 질환의 발생 등과 밀접하게 관련된다. 유효한 억제제를 사용하여 중요한 단백질이 이 경로에서 지나치게 분해되는 것을 억제하는 것이 상기 질환에 대한 치료에 새로운 착상을 제공할 수 있다. 이러한 신규 타깃에 대해, 2003년에 프로테아좀 억제제 보르테조밉(PS-341)이 FDA의 허락을 받고 최초로 출시되었고, 재발성 골수종의 치료에 사용하였다. 2004년, 이 약물은 허락을 받고 유럽 연합에 출시되었으며, 다발성 골수종의 치료에도 사용하였다. 2005년 9월, 이 약물은 시안 양선()에 의해 중국에 도입되어 광저우에서 최초로 출시되었다. 2005년, 이 약물은 동시에 프랑스, 네덜란드와 벨기에서 의약계의 노벨상으로 불리는 “PrixGalien”상을 수상하였다. 2007년 7월 11일, 이 약물은 또한 미국 FDA의 허락을 받고 재발성 또는 난치성 맨틀세포림프종(Mantle Cell Lymphoma, MCL로 약칭)의 치료에 사용하였으며, 현재까지 FDA의 허락을 받고 MCL을 치료하는 유일한 약물로 되었다. FDA에서 벨케이드를 피하 투여하는 것을 허락하였는데, 이는 벨케이드가 쉽게 흡수되도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 벨케이드에 대한 환자의 내수성을 크게 향상시키며 부작용을 감소시키기도 하였다.
2014년, 벨케이드의 매출액은 30.69억 달러에 도달하였고, 전세계에서 가장 잘 판매되는 종양 약물 top20 중의 하나로 되었다. 벨케이드의 중국 시판가는 3.5mg당 약 13,000 위안이고, 치료 과정당 약 4만 위안의 비용이 필요하는데, 이러한 고가의 비용은 많은 환자에게 매우 큰 경제적 부담으로 되었다. 또한, 현재의 임상 데이터에 따르면, 이러한 약물은 핍력, 구역질, 설사 및 신경 병변 등과 같은 많은 부작용을 가지고 있다. 따라서, 저렴하고 부작용이 적으며 치료 효과가 높은 프로테아좀 억제제 약물을 개발하는 것이 현재 해결해야 할 중요한 문제로 되었다.
치료 효과가 확실한 이러한 타깃에 대해, 구조가 새로운 일련의 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물 프로테아좀 억제제를 설계하였다.
본 발명의 목적은 경구 투여가 가능하고, 구조가 새로우며, 프로테아좀 억제 기능을 가진 일련의 신규 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물을 합성하는 것이다. 20S 프로테아좀 억제제는 종양 세포의 증식을 효과적으로 차단하며, 종양 세포의 자멸사를 유도할 수 있어, 인간 및 동물의 악성 종양과 같은 다양한 질환을 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 목적은 약물 담지체 및 본 발명에 따른 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물을 하나 또는 복수개의 다른 치료제와 동시, 각각, 또는 순차적으로 조합하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물이 프로테아좀 억제제를 제조하는 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물이 항종양 약물을 제조하는 용도를 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 종양은 고형 종양과 혈액성 종양을 포함하며, 그중 고형 종양은 비소세포폐암, 소세포폐암, 폐선암, 폐편평세포암, 췌장암, 유선암, 전립선암, 간암, 피부암, 상피세포암, 위장관기질종양 또는 비인암에서 선택되고, 혈액성 종양은 백혈병, 다발성 골수종, 맨틀세포림프종 또는 조직 세포성 림프종에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 구체적으로 다음과 같이 달성할 수 있다.
식 I에 나타낸 구조를 가진 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
여기서,
Rl은 C1~10 알킬기, C1~10 알콕시기, C1~10 알콕시기 C1~10 알킬기, C3~6 시클로알킬기, 페닐기, 나프틸기, 테트라하이드로나프틸기, 2,5-디클로로페닐기 또는 헤테로사이클기에서 선택되거나, 선택적으로 C1~4 알킬기, C1~4 알콕시기, C1~4 시클로알킬기, 할로겐 또는 할로게노 C1~4 알킬기에 의해 치환되며; R1은 C1~10 알킬기, C1~10 알콕시기, C1~10 알콕시메틸기, C1~10 알콕시에틸기, C3~6 시클로알킬기, 페닐기, 2,5-디클로로페닐기, 피라지닐기, 피리딜기, 나프틸기, 테트라하이드로나프틸기, 옥사졸릴기 또는 이소옥사졸릴기이거나, 선택적으로 C1~4 알킬기, C1~4 알콕시기, 할로겐 또는 할로게노 C1~4 알킬기에 의해 치환되는 것이 바람직하다.
나아가, R1은
인 것이 바람직하며;
여기서, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소, 메틸기, 메톡시기, 에틸기, 에톡시기, 염소, 브롬, 불소 또는 트리플루오로메틸기에서 선택된다.
R2는 H, 페닐기, 메톡시기, 메틸티오기, 사이클로헥실기, 2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥산에서 선택되거나, 선택적으로 하나 또는 복수개의 C1~4 알킬기, C1~4 알콕시기, 니트로기, 할로겐 또는 트리플루오로메틸기에 의해 치환된다.
B, Z1은 Z2와 함께 N, S 혹은 O를 함유하는 헤테로사이클기를 형성하거나, 또는 B는 Z1 및 Z2와 함께 O 복소환을 함유하는 그룹을 형성하고, 산소 원자가 붕소 원자와 연결된다. 바람직하게는, B, Z1은 Z2와 함께 붕산-α-피나네디올 에스테르를 형성하거나, 또는 B는 Z1 및 Z2와 함께 보레이트를 형성하며, 산소 원자가 붕소 원자와 연결되는 것이다. 더욱 바람직하게는, B, Z1은 Z2와 함께 붕산-α-피나네디올 에스테르를 형성하거나, 또는 B는 Z1 및 Z2와 함께 디에탄올아민보레이트, 시트레이트 보레이트, 타르트레이트 보레이트, 말레이트 보레이트, α-하이드록시-글루타레이트 보레이트를 형성하고, 글루코스의 o-하이드록시기 구조와 함께 글루코스 보레이트 등 다른 전구 약물을 형성하는 것이다.
본 발명에 따른 R1, R2 그룹에서, “선택적으로 …에 의해 치환”은 R1, R2 그룹이 이러한 그룹에 의해 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있음을 의미하는데, 즉 예시한 이들 그룹에 의해 치환되는 경우에만 한정되는 것이 아니고, 예시한 이들 그룹에 의해 치환되지 않은 경우도 포함하는 것을 의미한다. 이런 표현 방식은 “R1은 치환 또는 비치환된 C1~10 알킬기, C3~6 시클로알킬기 또는 헤테로시클로알킬기, 페닐기, 나프틸기 또는 인돌기이고, 그중 치환기는 C1~4 알킬기, C1~4 알콕시기, 시아노기, 하이드록시기, 메르캅토기, 아미노기 또는 할로겐임”이라는 표현 방식과 동일하나, 치환 또는 비치환은 C1~10 알킬기에 한정되는 것이 아니고, 전술한 모든 그룹을 포괄하는데, 즉 치환 또는 비치환된 C3~6 시클로알킬기 또는 헤테로시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 벤질기, 치환 또는 비치환된 나프틸메틸기, 치환 또는 비치환된 인돌메틸기 등을 포함하며, 여기서 치환기는 C1~4 알킬기, C1~4 알콕시기, 시아노기, 하이드록시기, 메르캅토기, 아미노기 또는 할로겐이다.
용어 “알킬기”는 포화 탄화수소기를 나타내고, C1~10 알킬기는 1~10개의 탄소 원자를 함유하는 포화 탄화수소기를 의미하며, C1~4 알킬기는 1~4개의 탄소 원자를 함유하는 포화 탄화수소기를 의미한다.
용어 “시클로알킬기”는 고리화된 알킬기를 비롯한 비방향족 카보사이클릭기를 의미한다. 시클로알킬기는 비시클로 또는 다환 시스템을 포함할 수 있다. 시클로알킬기는 예를 들어 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 사이클로헥실기, 시클로헵틸기를 포함하며, C3~6 시클로알킬기는 3~6개의 탄소 원자를 함유하는 시클로알킬기를 의미한다.
용어 “벤질기”는 페닐메틸기를 의미하고, 치환된 벤질기는 벤질기의 벤젠 고리의 적어도 하나의 수소 원자가 수소가 아닌 부분에 의해 치환된 것을 의미하며, 벤질기의 치환기는 할로겐, -CN, -OH, -SH, -NH2, 탄소수가 1~6인 직쇄 또는 분쇄형 알킬기, 탄소수가 1~6인 치환된 직쇄 또는 분쇄형 알킬기일 수 있다.
용어 “헤테로시클로알킬기”는 고리화된 알킬기를 비롯한 비방향족 헤테로카보사이클릭기를 의미하고, 여기서 하나 또는 복수개의 고리형성 탄소 원자는 O, N 또는 S 원자와 같은 헤테로 원자에 의해 치환된다. 헤테로시클로알킬기는 3, 4, 5, 6 또는 7개의 고리형성 원자를 가지고 있는 것이 바람직하다.
용어 “헤테로사이클기”는 헤테로 원자 O, N 또는 S를 함유하는 고리형 그룹을 의미하며, 푸릴, 티오페닐, 피롤릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤조푸릴, 퓨리닐, 아크리디닐, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴 등과 같은 방향족 헤테로사이클기 또는 비방향족 헤테로사이클기를 포함한다.
“1-나프틸메틸기”는 “”를 의미한다.
“2-나프틸메틸기”는 “”를 의미한다.
“인돌메틸기”는 “”를 의미한다.
“2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥산”은 “”를 의미한다.
“테트라하이드로나프틸기”는 “” 또는 “”를 의미한다.
“옥사졸릴”은 “”를 의미하고, “이소옥사졸릴”은 “”를 의미한다.
“디에탄올아만보레이트”는 “”를 의미한다.
“시트레이트 보레이트”는 “”를 의미한다.
“타르트레이트 보레이트”는 “”를 의미한다.
“말레이트 보레이트”는 “”를 의미한다.
“α-하이드록시-글루타레이트 보레이트”는 “”를 의미한다.
“글루코스 보레이트”는 “”를 의미한다.
“알콕시기”는 -O-알킬기를 의미하며, 그 탄소 원자 수는 일반적으로 1~10개이다. 알콕시기는 예를 들어 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기(예컨대, n-프로폭시기와 이소프로폭시기), t-부톡시기 등을 포함한다.
“아릴기”는 방향족 카보사이클릭기를 의미하고, 페닐기, 나프틸기, 안트릴기, 페난트릴기 등과 같은 단일환 또는 다환 방향족 탄화수소를 포함한다.
“아릴옥시기”는 -O-아릴기를 의미하고, 아릴기의 개념은 전술한 바와 같으며, 아릴옥시기는 페녹시기인 것이 가장 바람직하다.
“할로겐”은 불소, 염소, 브롬과 요오드를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염은,
에서 선택된다.
본 발명에 따른 화합물은 항종양 약물을 제조할 수 있으며, 그 제조 경로는 다음과 같다.
상기 반응식에서 그룹 R1, R2, Z1 및 Z2는 각각 전술한 바와 같다. 경로 1은 프탈이미드와 에틸클로로아세테이트를 반응시켜 식 (II-1)을 생성하고, 식 (II-1)과 알라닌을 반응시켜 식 (II-2)를 생성하며, 식 (II-2)와 8-아미노퀴놀린을 반응시켜 식 (II-3)을 생성하고, 식 (II-3)과 아릴아이오다이드를 반응시켜 식 (II-4)를 생성하며, 식 (II-4)를 보론 트리플루오라이드 디에틸이더레이트 조건하에서 반응시켜 식 (II-5)를 생성하고, 식 (II-5)를 에틸렌디아민 조건하에서 반응시켜 식 (II)을 생성하는 것이다. 경로 2는 식 (III-1)이 SOCl2의 작용하에 메탄올과 반응하여 식 (III)을 획득하는 것이다. 경로 1의 식 (II) 또는 경로 2의 식 (III)로 나타낸 화합물은 펩타이드 축합제에 의해 각각 R1-COOH와 반응하여 식 (I-1)의 화합물을 생성하고, 식 (I-1)의 화합물은 비누화된 후 산화되어 식 (I-2)의 화합물을 생성하며, 식 (I-2)의 화합물은 펩타이드 축합제에 의해 보레이트의 아미노하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트와 축합되어 식 (I-3)의 화합물을 생성하고, 식 (I-3)의 화합물은 산성 조건하에서 식 (IV)의 화합물을 생성하며, 마지막으로 식 (IV)의 화합물은 가열된 에틸아세테이트 조건하에서 식 (I)의 화합물을 생성한다.
R1, R2, Z1 및 Z2는 전술한 바와 같다.
이하에서는 본 발명에 따른 화합물의 제조 방법을 더 상세하게 설명하기로 한다.
1. 화합물 II의 제조 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
1) 프탈이미드와 에틸 클로로아세테이트를 트리에틸아민의 작용하에 반응시켜 식 (II-1)의 구조를 가진 화합물을 획득한다.
2) 식 (II-1)의 구조를 가진 화합물과 알라닌을 Na2CO3과 H2O의 조건하에서 반응시켜 식 (II-2)의 구조를 가진 화합물을 생성한다.
3) 먼저 식 (II-2)의 구조를 가진 화합물을 SOCl2의 작용하에 반응시켜 염화 아실을 생성한 후, 8-아미노퀴놀린과 함께 염기성 조건하에서 식 (II-3)의 화합물을 생성한다.
4) 식 (II-3)의 구조를 가진 화합물과 아릴아이오다이드를 팔라듐과 실버 테트라플루오로보레이트의 조건하에서 반응시켜 식 (II-4)의 화합물을 생성한다.
5) 식 (II-4)의 구조를 가진 화합물과 메탄올을 보론 트리플루오라이드 디에틸이더레이트의 조건하에서 반응시켜 식 (II-5)의 화합물을 생성한다.
6) 식 (II-5)의 구조를 가진 화합물과 메탄올을 에틸렌디아민 조건하에서 반응시켜 식 (II)의 화합물을 생성한다.
2. 화합물 (III)의 제조 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
식 (III-1)의 구조를 가진 아미노산과 메탄올을 SOCl2의 작용하에 반응시켜 식 (III)의 구조를 가진 화합물을 획득한다.
3. 화합물 (I)의 제조 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
1) 식 (II) 또는 식 (III)로 나타낸 화합물과 R1-COOH를 펩타이드 축합제의 작용하에 반응시켜 식 (I-1)의 화합물을 생성한다.
2) 식 (I-1)의 구조를 가진 화합물을 염기성 조건하에서 비누화 반응시켜 그 나트륨염을 생상한 후, 산성 조건하에서 화합물 (I-2)을 생성한다.
3) 식 (I-2)의 화합물과 보레이트의 아미노하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트를 펩타이드 축합제에 의해 축합시켜 식 (I-3)의 화합물을 생성한다.
4) 식 (I-3)의 화합물을 이소부틸붕산 조건하에서 반응시켜 식 (IV)의 화합물을 생성한다.
5) 식 (IV)의 화합물을 끓는 에틸아세테이트 조건하에서 반응시켜 식 (I)의 화합물을 생성한다.
상기 반응에 흔히 사용되는 펩타이드 축합제는 N,N-디사이클로헥실-카르보디이미드(DCC), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드염산염(EDC·HCl), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 또는 이소부틸클로로포메이트이다.
R1, R2, Z1 및 Z2는 전술한 바와 같다.
실험을 통해 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 화합물은 프로테아좀 억제 활성 및 항종양 활성이 우수하고, 일부 화합물은 나노몰 수준에서 양호한 프로테아좀 억제 효과 및 항종양 효과를 나타내므로, 프로테아좀 억제제 또는 항종양 약물의 제조에 유용하다. 본 발명에 따른 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물은 펩타이드 붕산류 화합물보다 더 우수한 약물 동태학적 성질을 가지고 있다.
또한, 본 발명에 따른 화합물의 제조 방법은 수율이 높고 공정이 간단하여 산업화 생산에 적합할 수 있다.
도 1은 상이한 화합물을 투여한 후의 ARH-77 이종 이식 종양의 성장 추세를 나타낸다.
도 2는 혈액 세포에서 프로테아좀의 활성을 검출한 결과를 나타낸다.
제1 부분: 화합물의 합성
본 발명에 따른 화합물은 다음과 같이 제조될 수 있다.
가. 화합물 (II)의 제조
1. N-에틸아세테이트프탈이미드 II-1의 제조:
프탈이미드를 DMF에 용해시키고 트리에틸아민을 첨가하며, 0℃에서 에틸 클로로아세테이트를 반응 시스템에 적하하고 천천히 실온으로 승온시킨 후 2시간 동안 반응시켰다. 반응액을 얼음물에 부어 넣은 후 여과하고, 필터 케이크를 얼음물로 세척한 다음 진공에서 건조시켜 순수한 화합물(식 II-1)을 획득하였다.
2. N-프탈릴로 보호한 알라닌 II-2의 제조:
화합물 II-1 및 L-알라닌을 H2O에 용해시키고, Na2CO3을 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응액에 1N HCl를 첨가하여 PH를 2로 조절한 후 여과하고, 진공에서 건조시켜 순수한 화합물(식 II-2)을 획득하였다.
3. 화합물 II-3의 제조:
화합물 II-2를 CH2Cl2에 용해시키며, SOCl2를 첨가하여 6시간 동안 응축 환류시킨 후, 감압하여 용매를 증류 제거하였다. 8-아미노퀴놀린과 DIPEA를 CH2Cl2에 용해시키고, -20℃에서 CH2Cl2에 용해된 염화 아실을 적하한 후, 천천히 실온으로 승온시키고 밤새 반응시켰다. 감압하여 용매를 증류 제거하고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 화합물 II-3을 획득하였다.
4. 화합물 II-4의 제조:
화합물 II-3을 tert-부탄올에 용해시키며, 초산팔라듐, 실버 테트라플루오로보레이트와 알킬아이오다이드를 첨가하여 24시간 동안 응축 환류시켰다. 반응액을 실온으로 회복시킨 후 CH2Cl2로 희석하고, 트리에틸아민을 첨가하여 3시간 동안 반응시킨 후 규조토에 통과시켰다. 감압하여 용매를 증류 제거하고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 화합물 II-4를 획득하였다.
5. 화합물 II-5의 제조:
내벽이 두꺼운 내압병에서 화합물 II-4를 MeOH에 용해시키며, 보론 트리플루오라이드 디에틸이더레이트 용액을 적하하고 100℃에서 밤새 반응시켰다. 반응액에 트리에틸아민을 첨가하여 교반하고, 감압하여 용매를 증류 제거하며, CH2Cl2에 용해시킨 후 각각 산(10% 염산), 알칼리(5% 중탄산나트륨)와 포화 식염수로 세척하고, 건조제(무수황산나트륨과 무수황산마그네슘)로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 감압하여 용매를 건조시킨 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 화합물 II-5를 획득하였다.
6. 화합물 II의 제조:
화합물 II-5를 MeOH에 용해시키며, 에틸렌디아민을 첨가하여 70℃에서 응축 환류시켰다. 5시간 동안 반응시킨 후 여과하고, 여과액을 감압 증류하여 용매를 건조시킨 다음 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 화합물 II를 획득하였다.
나. 화합물 (III)의 제조
화합물 (III-1)을 MeOH에 용해시키고, 얼음-소금 배스에서 SOCl2를 적하하였다. 적하 완료 후 실온으로 승온시켜 밤새 방치하고, 감압하여 용매를 증류 건조시켜 화합물 III를 획득하였다.
다. 화합물 (I)의 제조
1. 화합물 I-1의 제조:
R1-COOH를 CH2Cl2에 용해시키고, 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 첨가하여 -5℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 펩타이드 축합제(EDC·HCl)를 첨가하여 20분 동안 반응시킨 다음 화합물 II 또는 화합물 III를 첨가하며, 10분 후 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 첨가하여 반시간 동안 반응시키고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 각각 산(10% 염산), 알칼리(5% 중탄산나트륨)와 포화 식염수로 세척하고, 건조제(무수황산나트륨과 무수황산마그네슘)로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 감압하여 용매를 증류 건조시킨 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 화합물 I-1을 획득하였다.
2. 화합물 I-2의 제조:
화합물 I-1을 MeOH에 용해시키고, LIOH·H2O와 H2O를 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 그 후, 감압하여 MeOH를 증류 제거하며, 1N HCl를 첨가하여 pH를 2로 조절한 후 에틸아세테이트로 추출하고 분액시키며, 감압하여 용매를 증류 건조시켜 화합물 I-2를 획득하였다.
3. 화합물 I-3의 제조:
화합물 I-2를 CH2Cl2에 용해시키고, 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 첨가하여 -5℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 펩타이드 축합제(EDC·HCl)를 첨가하여 20분 동안 반응시킨 다음 보레이트의 염산염 또는 트리플루오아세테이트를 첨가하며, 10분 후 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 첨가하여 반시간 동안 반응시키고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 각각 산(10% 염산), 알칼리(5% 중탄산나트륨)와 포화 식염수로 세척하고, 건조제(무수황산나트륨과 무수황산마그네슘)로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 감압하여 용매를 증류 건조시킨 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 화합물 I-3을 획득하였다.
4. 화합물 IV의 제조
화합물 I-3을 MeOH에 용해시키고, 이소부틸붕산, n-헥산 및 1N HCl를 첨가한 후 밤새 반응시켰다. 분액하고 MeOH에서 n-헥산상을 2회 추출한 후, n-헥산으로 메탄올상을 1회 세척하였다. 감압하여 메탄올을 제거하고, CH2Cl2로 수상을 2회 추출하며, 수상이 중성으로 될 때까지 포화 식염수로 유기상을 세척하였다. 감압하여 용매를 증류 건조시키고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 화합물 IV를 획득하였다.
5. 화합물 I의 제조
74℃에서 다이올을 함유하는 아민 또는 산을 에틸아세테이트에 용해시키며, 화합물 IV를 첨가하고 온도를 60℃로 낮추었다. 3시간 동안 반응시킨 후 온도를 25℃로 낮추어 밤새 반응시켰다. 여과한 후, 진공에서 건조시켜 순수한 화합물(식I)을 획득하였다.
이하에서는 화합물의 구체적인 합성을 통해 본 발명에 따른 화합물의 제조 과정을 설명하기로 한다.
가. 식(II)의 화합물의 제조:
R2: ; ; ;
1. N-에틸아세테이트프탈이미드(화합물 II-1)의 제조
프탈이미드(7.36g, 50mmol)를 DMF(25mL)에 용해시키고 트리에틸아민(9mL, 65mmol)을 첨가하며, 0℃에서 에틸 클로로아세테이트(5.7mL, 60mmol)를 반응 시스템에 적하하고 천천히 실온으로 승온시켰다, 그 후, TLC를 통해 반응을 검출하며, 2h 후 반응을 종료시키고 반응액을 얼음물에 부어 넣은 후 여과하였다. 필터 케이크를 얼음물로 세척하고, 진공에서 건조시켜 8.67g의 순수한 N-에틸아세테이트프탈이미드를 획득하였다(수율 79.1%, mp 81.4~83.6℃). 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 1.44(-CH3, t, J=7.1Hz, 3H), 4.48(-CH2, q, J=7.1Hz, 2H), 7.80-7.85 (-Ph, m, 2H), 7.93-7.99 (-Ph, m, 2H). MS (ESI): m/z 220.1 [M+H]+.
2. N-프탈릴로 보호한 알라닌(화합물 II-2)의 제조:
화합물 II-1(21.9g, 100mmol)과 L-알라닌(8.9g, 10mmol)을 H2O(100mL)에 용해시키며, Na2CO3(10.6g, 100mmol)을 첨가하고, TLC를 통해 반응을 검출하였다. 2h 후 반응을 종료시키고, 1N HCl를 첨가하여 PH를 2로 조절한 후 여과하며, 진공에서 건조시켜 17.4g의 순수한 화합물(식II-2)을 획득하였다(수율 79.3%, mp 145.8~146.6℃). 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 1.71(-CH3, d, J=7.4Hz, 3H), 5.02(-CH, q, J=7.4Hz, 1H), 7.69-7.75 (-Ph, m, 2H), 7.82-7.88 (-Ph, m, 2H). MS (ESI): m/z 218.2 [M-H]-.
3. (S)-2-(프탈이미도)-N-(8-퀴놀리닐)프로피온아미드(화합물 II-3)의 제조:
화합물 II-2(17.37g, 79.25mmol)를 CH2Cl2(80mL)에 용해시키고, SOCl2(29mL, 396.25mmol)를 첨가하여 6시간 동안 응축 환류시킨 후, 감압하여 용매를 증류 제거하였다. 8-아미노퀴놀린(11.4g, 79.25mmol)과 DIPEA(20.5g, 158.5mmol)를 CH2Cl2(103mL)에 용해시키고, -20℃에서 CH2Cl2(31mL)에 용해된 염화 아실을 적하하며, 적하 완료 후 천천히 실온으로 승온시켜 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 감압하여 용매를 증류 제거한 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 21.2g의 화합물 II-3을 획득하였다(수율 77.42%, mp 180.0~181.9℃). 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 1.98(-CH3, d, J=7.3Hz, 3H), 5.27(-CH, q, J=7.5Hz, 1H), 7.42 (-Ph, dd, J1=4.2Hz, J2=8.3Hz, 1H), 7.51 (-Ph, s, 1H), 7.53 (-Py, d, J=9.0Hz, 1H), 7.65-7.85 (-Ph, m, 2H), 7.90 (-Ph, dt, J1=3.6Hz, J2=7.1Hz, 2H), 8.15 (-Py, d, J=8.3Hz, 1H), 8.69 (-Ph, d, J=4.2Hz, 1H), 8.73 (-Py, dd, J1=4.7Hz, J2=8.9Hz, 1H), 10.33(-CONH, s, 1H). MS(ESI): m/z 346.0 [M+H]+.
4. (S)-메틸 2-아미노-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프로피오네이트(II-4a)의 제조
(1)(S)-2-(프탈이미도)-N-(8-퀴놀리닐)-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프로피온아미드(II-4a)의 제조
화합물 II-3(5.2g, 15mol)을 tert-부탄올(105mL)에 용해시키고, 초산팔라듐(331mg, 1.5mmol), 실버 테트라플루오로보레이트(3.65g, 18.75mmol)와 4-아이오도벤조트라이플루오라이드(6.12g, 22.5mmol)를 첨가하며, 85℃에서 24h동안 응축 환류시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 실온으로 승온시킨 후 CH2Cl2(100mL)로 희석하며, 트리에틸아민(10mL)을 첨가하여 3h동안 교반하였다. 반응액을 규조토에 통과시키고, 감압하여 용매를 증류 제거한 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 5.3g의 고체 결과물을 획득하였다(수율 72.1%, mp 124.0~125.5℃). 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 3.77-3.95(-CH2, m, 2H), 5.47(-CH, dd, J1=6.9Hz, J2=9.7Hz, 1H), 7.39 (-Ph, dd, J1=4.3Hz, J2=8.3Hz, 1H), 7.42 (-Ph, d, J=8.1Hz, 2H), 7.49 (-Ph, d, J=8.2Hz, 2H), 7.51 (-Ph, s, 1H), 7.53 (-Py, t, J=5.5Hz, 1H), 7.68-7.78 (-Ph, m, 2H), 7.78-7.91 (-Ph, m, 2H), 8.12 (-Py, dt, J1=7.1Hz, J2=14.1Hz, 1H), 8.58 (-Ph, dd, J1=1.5Hz, J2=4.2Hz, 1H), 8.67-8.79 (-Py, m, 1H), 10.28(-CONH, s, 1H). MS (ESI): m/z 487.1 [M-H]-.
다른 유사한 화합물도 모두 상기 과정을 통해 제조될 수 있다.
II-4b는 실시예(1)에 따른 방법을 통해 II-3과 1-아이오도-3,5-비스(트리플루오로메틸)벤젠을 합성하여 제조된 것이고, II-4c는 실시예(1)에 따른 방법을 통해 II-3과 6-아이오도-1,4-벤조디옥신을 합성하여 제조된 것이며, II-4d는 실시예(1)에 따른 방법을 통해 II-3과 2,4-디메톡시아이오도벤젠을 합성하여 제조된 것이다.
합성하는 구체적인 화합물 및 그 성질은 하기 표와 같다.
(2)(S)-메틸 2-(프탈이미도)-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프로피오네이트(II-5a)의 제조
내벽이 두꺼운 내압병에서 화합물 II-5a(2g, 4.1mmol)를 MeOH(94mL)에 용해시키고, 보론 트리플루오라이드 디에틸이더레이트 용액(5.2mL, 40.9mmol)을 천천히 적하하며, 100℃에서 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 트리에틸아민(8.6mL, 61.3mmol)을 첨가하여 일정 시간 동안 교반하였다. 감압하여 용매를 증류 제거한 후 CH2Cl2(30mL)로 용해시키며, 각각 산(10% 염산), 알칼리(5% 중탄산나트륨)와 포화 식염수로 세척하고, 건조제(무수황산나트륨과 무수황산마그네슘)로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 감압하여 용매를 증류 건조시킨 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 1.3g의 유상 결과물을 획득하였다(수율 83.2%). 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 3.55-3.71(-CH2, m, 2H), 3.78(-CH3, s, 3H), 5.18(-CH, dd, J1=5.8Hz, J2=10.7Hz, 1H), 7.30 (-Ph, d, J=8.0Hz, 2H), 7.46 (-Ph, d, J=8.0Hz, 2H), 7.67-7.75 (-Ph, m, 2H), 7.79 (-Ph, dt, J1=3.6Hz, J2=7.1Hz, 2H). MS(ESI): m/z 378.3 [M+H]+.
다른 유사한 화합물도 모두 상기 과정을 통해 제조될 수 있다.
II-5b는 실시예(2)에 따른 방법을 통해 II-4b를 합성하여 제조된 것이고, II-5c는 실시예(2)에 따른 방법을 통해 II-4c를 합성하여 제조된 것이며, II-5d는 실시예(2)에 따른 방법을 통해 II-4d를 합성하여 제조된 것이다.
합성하는 구체적인 화합물 및 그 성질은 하기 표와 같다.
(3) (S)-메틸 2-아미노-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프로피오네이트(IIa)의 제조
화합물 II-5a(745mg, 1.9mmol)를 MeOH(19mL)에 용해시키고, 에틸렌디아민(297mg, 4.9mmol)을 첨가하며, 70℃에서 응축 환류시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하며, 5h 후 반응을 종료시킨 후 여과하였다. 여과액을 감압하여 용매를 증류 건조시키고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 311mg의 유상 목표 화합물을 획득하였다(수율 62.4%). 1H NMR (400MHz, DMSO) δ 2.84(-CH2, dd, J1=7.7Hz, J2=13.3Hz, 1H), 2.95(-CH2, dt, J1=9.5Hz, J2=19.0Hz, 1H), 3.59(-CH3, s, 3H), 3.61(-CH, d, J=6.9Hz, 1H), 7.40 (-Ph, t, J=11.9Hz, 2H), 7.59 (-Ph, t, J=21.6Hz, 2H). MS (ESI):m/z 248.1 [M+H]+.
다른 유사한 화합물도 모두 상기 과정을 통해 제조될 수 있다.
IIb는 실시예(3)에 따른 방법을 통해 II-5b를 합성하여 제조된 것이고, IIc는 실시예(3)에 따른 방법을 통해 I-5c를 합성하여 제조된 것이며, IId는 실시예(3)에 따른 방법을 통해 II-5d를 합성하여 제조된 것이다.
합성하는 구체적인 화합물 및 그 성질은 하기 표와 같다.
나. 식 (III)의 화합물의 제조:
R2: a=H; ; ; ; ;
1. 글리신메틸에스테르 염산염(IIIa)의 제조
화합물 IIIa(3g, 40mmol)를 MeOH(30mL)에 용해시키고, 얼음-소금 베스에서 -10℃로 냉각시키며, 교반하면서 SOCl2(29mL, 400mmol)를 천천히 적하하였다. 적하 완료 후 10min 동안 반응시키며, 얼음-소금 배스를 제거하고 실온에서 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 감압하여 농축시킨 후 20mL의 CH2Cl2를 첨가하였다. 반복해서 2회 감압 농축시킨 후 용매를 회전 건조시키고, 건조시켜 5g의 결과물을 획득하였는데(수율 99.5%), 제품을 정제하지 않고 바로 다음 반응에 사용하였다.
본 발명에서 사용한 다른 아미노산 메틸에스테르 염산염은 모두 상기 과정을 통해 제조될 수 있다. 화합물 IIIb는 화합물 IIIa를 합성하는 방법을 통해 D-사이클로헥실글리신을 합성하여 제조된 것이고, 화합물 IIIc는 화합물 IIIa를 합성하는 방법을 통해 L-사이클로헥실글리신을 합성하여 제조된 것이며, 화합물 IIId는 화합물 IIIa를 합성하는 방법을 통해 페닐알라닌을 합성하여 제조된 것이다.
합성하는 구체적인 화합물 및 그 성질은 하기 표와 같다.
2. L-O-메틸세린메틸에스테르 염산염(IIIe)의 제조
(1) BOC-L-O-메틸세린메틸에스테르(IIIe-1)의 제조
BOC-L-세린메틸에스테르(5g, 22.8mmol)를 아세톤(l10mL)에 용해시키고, 아이오도메탄(32mL, 524mmol)과 산화은(8.2g, 35.4mmol)을 첨가하여 59℃의 어두운 곳에서 밤새 동안 응축 환류시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하며, 여과하고 감압하여 용매를 증류 제거한 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 1.8g의 유상 목표 화합물을 획득하였다(수율 34.5%). 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 1.43(-CH3, s, 9H), 3.32(-CH3, s, 3H), 3.57(-CH2, dd, J1=3.4Hz, J2=9.4Hz, 1H), 3.74(-CH3, d, J=6.3Hz, 3H), 3.78(-CH2, dd, J1=3.1Hz, J2=9.4Hz, 1H), 4.35-4.44(-CH, m, 1H), 5.28-5.44(-CONH, m, 1H). MS (ESI): m/z 234.2 [M+H]+.
(2) L-O-메틸세린메틸에스테르 염산염(IIIe)의 제조
화합물 IIIe-1(496mg, 2.1mmol)을 에틸아세테이트(2.5mL)에 용해시키고, 아이스 배스에서 HCl의 에틸아세테이트 용액(5.2mL, 21.2mmol)을 적하하여 실온에서 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 2h 후 반응을 종료시킨 후, 여과하고 필터 케이크를 진공에서 건조시켜 351mg의 순수한 결과물을 획득하였다(수율 97.5%). 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 3.41(-CH3, s, 3H), 3.83(-CH3, s, 3H), 3.95(-CH2, dd, J1=3.6Hz, J2=10.4Hz, 1H), 4.03(-CH2, dd, J1=2.6Hz, J2=10.3Hz, 1H), 4.45(-CH, s, 1H), 8.70 (-NH3 +, s, 3H).
3. S-메틸-L-시스테인메틸에스테르 염산염(IIIf)의 제조
(1) S-메틸-L-시스테인(IIIf-1)의 제조
L-시스테인염산염 일수화물(3.1g, 17.5mmol)을 MeOH(45mL)에 용해시키고, 아이스 배스에서 30%의 나트륨메톡시드의 메탄올 용액(11.2g, 62mmol)을 적하하여 1h 동안 반응시켰다. 그 후, 아이오도메탄(0.9mL, 13mmol)을 적하하고, 실온으로 승온시킨 후 반응시키며, TLC를 통해 반응을 검출하였다. 2h 후 반응을 종료시키고, 10N HCl로 pH를 5로 조절하며, 40mL의 에틸에테르를 첨가하여 10min 동안 교반한 후 여과하였다. 필터 케이크를 60mL의 에틸에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 조생성물 4.715g을 획득하였다.
(2) S-메틸-L-시스테인메틸에스테르 염산염(IIIf)의 제조
S-메틸-L-시스테인(4.715g, 34.9mmol)을 MeOH(25mL)에 용해시키고, 얼음-소금 배스에서 -10℃로 냉각시키며, 교반하면서 SOCl2(25mL, 348.8mmol)를 천천히 적하하였다. 적하 완료 후 10min 동안 반응시키고, 얼음-소금 배스를 제거하며, 실온에서 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 여과한 후 필터 케이크를 CH2Cl2로 세척하며, 진공에서 건조시켜 3.1g의 수순한 S-메틸-L-시스테인메틸에스테르 염산염을 획득하였다(수율 95.4%). 1H NMR(400MHz, D2O) δ 4.44(-CH, dd, J=7.7Hz, 4.6Hz, 1H), 3.90(-CH3, s, 3H), 3.23(-CH2, dd, J=15.1Hz, 4.6Hz, 1H), 3.14-3.07(-CH2, m, 1H), 2.18(-CH3, s, 3H).
다. 식 (I)의 화합물의 제조:
R1:、、、、、
、、、、
Z1 및 Z2: 、
1. (S)-N-(2,5-디클로로벤조일)-3-(4-트리플루오로메틸페닐)알라닌메틸에스테르(I-1a)의 제조
2,5-디클로로벤조산(90mg, 0.47mmol) 및 HOBt(92mg, 0.71mmol)를 CH2Cl2(8mL)에 용해시키고, -10℃에서 10min 동안 반응시킨 후, EDC·HCl(135mg, 0.7mmol)를 첨가하여 30min 동안 반응시키고, 화합물 IIa(116mg, 0.47mmol)를 첨가하여 10min 동안 반응시켰다. 그 후, DIPEA(151mg, 1.17mmol)를 첨가하여 20min 동안 반응시킨 후 실온으로 승온시키고 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 각각 10%의 염산 용액(10mL), 5%의 NaHCO3 용액(10mL)과 포화 식염수(2×10mL)로 세척하며, 무수 Na2SO4로 CH2Cl2 층을 건조시킨 후 여과하고, 감압하여 용매를 증류 제거하여 166mg의 유상 화합물을 획득하였다(수율 84.3%). 제품을 정제하지 않고 바로 다음 반응에 사용하였다.
EDC·HCl 축합법에 의해 획득한 제품의 수율이 높으므로, 본 발명에서 사용한 아미노기가 보호되지 않은 다른 아미노산 메틸에스테르는 실시예 1에 따른 EDC·HCl 축합법을 이용하여 제조될 수 있으며, 메틸에스테르는 모두 정제하지 않고 바로 다음 반응에 사용하였다.
화합물 I-1b는 EDC·HCl 축합법을 통해 2,5-디클로로벤조산과 IIb를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-1c는 EDO·HCl 축합법을 통해 2,5-디클로로벤조산과 IIe를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-1d는 EDC·HCl 축합법을 통해 2,5-디클로로벤조산과 IId를 합성하여 제조된 것이다.
(1). (S)-N-(2,5-디클로로벤조일)글리신메틸에스테르(I-le)의 제조
2,5-디클로로벤조산(7.6g, 40mmol)과 HOBt(8.1g, 40mmol)를 CH2Cl2(200mL)에 용해시키고 -10℃에서 10min 동안 반응시킨 후, EDC*HCl(11.5g, 60mmol)를 첨가하여 30min 동안 반응시키고, 화합물 IIIa(5g, 40mmol)를 첨가하여 10min 동안 반응시켰다. 그 후, DIPEA(18.1g, 140mmol)를 첨가하여 20min 동안 반응시킨 후 실온으로 승온시키고 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 각각 10%의 염산 용액(200mL), 5%의 NaHCO3 용액(200mL)과 포화 식염수(2×200mL)로 세척하며, 무수 Na2SO4로 CH2Cl2 층을 건조시킨 후 여과하고, 감압하여 용매를 증류 제거하여 9.32g의 유상 화합물을 획득하였다(수율 88.9%). 제품을 정제하지 않고 바로 다음 반응에 사용하였다.
화합물 I-1f는 EDC*HCl 축합법을 통해 2,5-디클로로벤조산과 IIIb를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-1g는 EDC*HCl 축합법을 통해 2,5-디클로로벤조산과 IIIc를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-1h는 EDC*HCl 축합법을 통해 2,5-디클로로벤조산과 IIIe를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-1i는 EDC*HCl 축합법을 통해 2,5-디클로로벤조산과 IIIf를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-1j는 EDC*HCl 축합법을 통해 2-피라진카르복실산과 IIa를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-1k는 EDC*HCl 축합법을 통해 2-피라진카르복실산과 IIc를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-1l은 EDC*HCl 축합법을 통해 5,6,7,8-테트라하이드로-1-나프탈렌카르복실산과 IIc를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-1m은 EDC*HCl 축합법을 통해 5-메틸이소옥사졸-3-포름산과 IIIa를 합성하여 제조된 것이다. 화합물 I-1n은 EDC*HCl 축합법을 통해 5-메틸-2-피라진카르복실산과 IIId를 합성하여 제조된 것이다.
본 발명에서 사용한 아미노기가 보호된 다른 아미노산 메틸에스테르는 실시예(1)에 따른 EDC*HCl 축합법으로 제조될 수 있고, 메틸에스테르는 모두 정제하지 않고 바로 다음 반응에 사용하였다.
(2). (S)-N-(메톡시아세틸)페닐알라닌메틸에스테르(I-1o)의 제조
메톡시아세트산(280mg, 3.13mmol)을 CH2Cl2(6mL)에 용해시키고, -10℃에서 SOCl2(0.25mL, 3.45mmol)를 적하하였다. 적하 완료 후, 실온으로 승온시키고 2h 동안 반응시켰다. 메톡시아세틸클로라이드 용액을 바로 다음 단계에 투입시켰다. IIId(0.67g, 3.13mmol)를 3mL의 CH2Cl2에 용해시키고, 트리에틸아민(1.58g, 15.65mmol)을 첨가하며, 메톡시아세틸클로라이드 용액을 적하한 후 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 물로 세척하며, Na2SO4로 건조시킨 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜0.69g의 유상 목표 화합물을 획득하였다(수율 87.3%).
화합물 I-1p는 염화 아실 축합법을 통해 3-메톡시프로피온산과 IIId를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-1q는 염화 아실 축합법을 통해 부티르산과 IIId를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-1r은 염화 아실 축합법을 통해 사이클로프로판카르복실산과 IIId를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-1s는 염화 아실 축합법을 통해 사이클로펜텐카르복실산과 IIId를 합성하여 제조된 것이다.
본 발명에서 사용한 아미노기가 보호된 다른 아미노산 메틸에스테르와 알킬산은 실시예(2)에 따른 축합법으로 제조될 수 있으며, 메틸에스테르는 모두 정제하지 않고 바로 다음 반응에 사용하였다.
합성하는 구체적인 화합물 및 그 성질은 하기 표와 같다.
2. (S)-N-(2,5-디클로로벤조일)-3-(4-트리플루오로메틸페닐)알라닌(I-2a)의 제조
화합물 I-1a(129mg, 0.31mmol)를 2.5mL의 MeOH로 용해시키고, LiOH*H2O(39mg, 0.92mmol)와 H2O(0.8mL)를 첨가하며, TLC를 통해 검출하고, 2h 후 반응을 종료시켰다. 유기상을 회전 건조시키고, 에틸에테르(2×1mL)로 수상을 추출하며, pH가 2~3으로 될 때까지 수상에 염산을 적하하여 흰색 고체를 대량 생성하고, 에틸아세테이트로 추출하며, 감압하여 용매를 증류 제거하고 106mg의 흰색 제품을 획득하였다(수율 86.0%, mp 185.1~186.9℃). 1H NMR (400MHz, DMSO) δ 3.02(-CH2, dd, J1=10.6Hz, J2=13.8Hz, 1H), 3.30(-CH2, dd, J1=4.6Hz, J2=13.9Hz, 1H), 4.68(-CH, ddd, J1=4.7Hz, J2=8.4Hz, J3=10.4Hz, 1H), 7.15 (-Ph, d, J=1.8Hz, 1H), 7.49 (-Ph, t, J=4.9Hz, 2H), 7.52 (-Ph, d, J=6.0Hz, 2H), 7.66 (-Ph, d, J=8.1Hz, 2H), 8.90(-CONH, d, J=8.2Hz, 1H), 13.12(-COOH, s, 1H). MS (ESI): m/z 403.9 [M-H]-.
본 발명에서 사용한 아미노기가 보호된 다른 아미노산은 실시예 2에 따른 방법으로 제조될 수 있다.
화합물 I-2b는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1b를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2c는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1c를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-2d는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1d를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2e는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1e를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-2f는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1f를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2g는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1g를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-2h는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1h를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2i는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1i를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-2j는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1j를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2k는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1k를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-2l은 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1l을 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2m은 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1m을 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-2n은 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1n을 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2o는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1o를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-2p는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1p를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2q는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1q를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-2r은 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1r를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-2s는 실시예 2에 따른 방법을 통해 I-1s를 합성하여 제조된 것이다.
합성하는 구체적인 화합물 및 그 성질은 하기 표와 같다.
3. (S)-N-(2,5-디클로로벤조일)-3-(4-트리플루오로메틸페닐)프로피온아미도-D-류신붕산-(+)-α-피나네디올 에스테르(I-3a)의 제조
화합물 I-2a(340mg, 0.84mmol) 및 HOBt(218g, 1.67mmol)를 CH2Cl2(18mL)에 용해시키고 -10℃에서 10min 동안 반응시키며, EDC*HCl(321mg, 1.67mmol)를 첨가하여 30min 동안 반응시킨 후, (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트(317mg, 0.84mmol)를 첨가하여 10min 동안 반응시켰다. 그 후, DIPEA(433mg, 3.35mmol)를 첨가하여 20min 동안 반응시킨 후 실온으로 승온시키고 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 각각 10%의 염산 용액(20mL), 5%의 NaHCO3 용액(20mL)과 포화 식염수(2×20mL)로 세척하며, 무수 Na2SO4로 CH2Cl2 층을 건조시킨 후 여과하고, 감압하여 용매를 증류 제거한 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 480mg의 유상 목표 화합물을 획득하였다(수율 87.6%). 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 0.82(-CH3, s, 3H), 0.85(-CH3, s, 6H), 1.16(-CH2, dd, J1=7.8Hz, J2=10.8Hz, 1H), 1.28(-CH3, s, 3H), 1.32(-CH2, d, J=14.3Hz, 1H), 1.39(-CH3, s, 3H), 1.41-1.52(-CH, m, 1H), 1.63(-CH, s, 1H), 1.81(-CH2, dd, J1=2.8Hz, J2=14.5Hz, 1H), 1.90(-CH2, d, J=2.4Hz, 1H), l.98-2.05(-CH, m, 1H), 2.12-2.23(-CH2, m, 1H), 2.25-2.38(-CH2, m, 1H), 3.19(-CH, dd, J1=8.5Hz, J2=13.7Hz, 1H), 3.23-3.31(-CH2, m, 2H), 4.21-4.34(-CH, m, 1H), 4.75-4.94(-CH, m, 1H), 5.90(-CONH, dd, J1=5.6Hz, J2=22.2Hz, 1H), 6.94(-CONH, d, J=7.7Hz, 1H), 7.29-7.36 (-Ph, m, 2H), 7.41 (-Ph, dd, J1=4.2Hz, J2=7.8Hz, 2H), 7.51 (-Ph, s, 1H), 7.55 (-Ph, dd, J1=3.7Hz, J2=8.0Hz, 2H). MS (ESI): m/z 653.2 [M+H]+.
본 발명에서 사용한 아미노기가 보호된 다른 아미노산은 실시예 3에 따른 방법으로 제조될 수 있다.
화합물 I-3b는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2b를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-3c는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2c를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-3d는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2d를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-3e는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2e를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-3f는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2f를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-3g는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2g를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-3h는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2h를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-3i는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2i를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-3j는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2j를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-3k는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2k를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-3l은 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2l을 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-3m은 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2m을 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-3n은 EDC·HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2n을 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-3o는 EDC·HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2o를 합성하여 제조된 것이며, 화합물 I-3p는 EDC*HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a,8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2p를 합성하여 제조된 것이고, 화합물 I-3q는 EDC·HCl 축합법을 통해 (aR,3aS,4S,6S,7aR)-헥사하이드로-3a8,8-트리메틸-alpha-(2-메틸프로필)-4,6-메타노-1,3,2-벤조디옥사보로란-2-메틸아민 2,2,2-트리플루오아세테이트와 I-2q를 합성하여 제조된 것이다.
합성하는 구체적인 화합물 및 그 성질은 하기 표와 같다.
4. (S)-N-(2,5-디클로로벤조일)-3-(4-트리플루오로메틸페닐)프로피온아미도-D-류신붕산(IV-1)의 제조
화합물 I-3a(317mg, 0.49mmol)를 3mL의 MeOH에 용해시키고, 이소부틸붕산(247mg, 2.43mmol), n-헥산(3mL)과 1N HCl(1.2mL, 1.2mmol)를 차례로 첨가하여 교반하면서 밤새 반응시켰다. TLC를 통해 반응을 검출하고, n-헥산상을 MeOH(2×3mL)로 2회 추출하며, n-헥산(3mL)으로 메탄올상을 1회 세척하고, 감압하여 메탄올을 증류 제거하였다. CH2Cl2(2×2mL)로 수상을 2회 추출하고, 수상이 중성으로 될 때까지 포화 식염수(3×5mL)로 유기상을 세척하였다. 감압하여 용매를 증류 제거하고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시켜 193mg의 순수한 결과물을 획득하였다(수율 76.5%). 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 1.18(-CH3, s, 3H), 1.25(-CH3, s, 3H), 2.13-2.41(-CH2, m, 2H), 2.45-2.61(-CH, m, 1H), 3.20-3.58(-CH2, m, 2H), 3.58-3.71(-CH, m, 1H), 5.21-5.62(-CH, m, 1H), 7.62-7.75 (-Ph, m, 4H), 7.84 (-Ph, t, J=13.5Hz, 3H). 13C NMR (CDCl3, 100MHz) δ 22.67, 27.21, 31.90, 35.60, 51.28, 54.80, 125.37, 125.55, 128.92, 129.05, 129.47, 129.76, 129.85, 131.34, 131.60, 133.12, 133.17, 139.92, 165.18, 170.98. MS (ESI): m/z 517.1 [M-H]-, calcd: 518.1. HRMS(ESI): calcd for C22H24BCl2F3N2NaO4 [M+Na]+ 541.1054, found 541.1118.
본 발명의 다른 붕산류 화합물은 전술한 방법을 통해 합성할 수 있다.
구체적인 화합물은 하기 표와 같다.
전술한 붕산류 화합물은 시트르산 등과 반응하여 붕산 에스테르류 화합물을 생성하여 전구 약물로 사용할 수 있으며, 제조 방법은 하기 예에서 설명한 바와 같으나 이에 한정되지 않는다.
5. (S)-디에탄올아민 N-(2,5-디클로로벤조일)-3-메톡시프로피온아미도-D-류신 보레이트(V-8A)의 제조
디에탄올아민(160mg, 1.52mmol)을 8mL의 에틸아세테이트에 용해시킨 후 74℃로 승온시키고, 1.5mL의 에틸아세테이트에 용해된 IV-1(500mg, 1.38mmol)을 첨가하며, 온도를 천천히 60℃로 낮추고 3h 동안 반응시킨 후 온도를 천천히 25℃로 낮추어 밤새 방치하였다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 여과한 후 필터 케이크를 진공에서 건조시켜 557mg의 순수한 결과물을 획득하였다(수율 85.4%). 1H NMR (400MHz, DMSO) δ 0.80(-CH3, dd, J1=6.7Hz, J2=9.7Hz, 6H), 1.12-1.39(-CH2, m, 2H), 1.59(-CH, d, J=5.5Hz, 1H), 2.75(-CH2, dd, J1=6.4Hz, J2=26.3Hz, 2H), 2.85-3.04(-CH2, m, 2H), 3.08-3.20(-CH, m, 1H), 3.26(-CH3, s, 3H), 3.59(-CH2, dt, J1=8.1Hz, J2=22.2Hz, 4H), 3.69(-CH2, d, J=5.3Hz, 2H), 4.59(-CH, dd, J1=6.7Hz, J2=12.9Hz, 1H), 6.56 (-NH, s, 1H), 6.99(-CONH, d, J=8.2Hz, 1H), 7.45 (-Ph, d, J=13.7Hz, 1H), 7.54 (-Ph, s, 2H), 8.69-8.82(-CONH, m, J=7.9Hz, 1H). HRMS (ESI): calcd for C20H30BCl2N3O5 [M+Na]+ 496.1548, found: 497.1546.
6. (S)-N-(2,5-디클로로벤조일)-3-메톡시프로피온아미도-D-류신붕산 시트레이트(V-8B)의 제조
구연산(192.12mg, 0.39mmol)을 2mL의 에틸아세테이트에 용해시킨 후 74℃로 승온시키고, 구연산이 완전히 용해된 후 1mL의 에틸아세테이트에 용해된 화합물 IV-1(363.03mg, 0.36mmol)을 첨가하며, 온도를 천천히 60℃로 낮추고 3h 동안 반응시킨 후 온도를 천천히 25℃로 낮추어 밤새 방치하였다. TLC를 통해 반응을 검출하고, 여과한 후 필터 케이크를 진공에서 건조시켜 90.0mg의 순수한 결과물을 획득하였다(수율 48.6%). 1H NMR (400MHz, DMSO) δ 0.86(-CH3, d, J=6.3Hz, 6H), 1.39-1.21(-CH2, m, 2H), 1.70(-CH, d, J=26.1Hz, 1H), 2.81-2.52(-CH2, m, 4H), 2.88(-CH, s, 1H), 3.15(-CH3, s, 3H), 3.30-3.55(-CH2, m, 2H), 4.46(-CH, m, 1H), 7.78-7.44 (-Ph, m, 3H), 9.12 (-NH, s, 1H), 10.73 (-NH, s, 1H), 12.15(-COOH, s, 2H). HRMS (ESI): calcd for C20H30BCl2N3O5 [M+Na]+ 583.1028, found: 583.1030.
본 발명의 다른 디에탄올아민보레이트, 시트레이트 보레이트 전구 약물 화합물도 모두 실시예 5 및 실시예 6에 따른 방법을 통해 합성할 수 있다. 구체적인 화합물은 하기 표와 같다.
제2 부분: 프로테아좀 활성 억제에 대한 측정
프로테아좀 활성 억제
본 발명에서는 형광 폴리펩타이드 서브스트레이트 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(Suc-LLVY-AMC, Sue는 숙시닐기, AMC는 7-아미도-4-메틸쿠마린)를 이용하여 프로테아좀의 키모트립신 유사 효소의 활성을 측정하였다.
본 발명에서 사용한 프로테아좀은 사람 적혈구 20S 프로테아좀이고, 효소, 형광 서브스트레이트 및 테스트용 완충액은 모두 Enzo사에서 구입하였다. 실험 시스템은 16μL인데, 그중 서브스트레이트는 8μL이며, 프로테아좀은 4μL(0.8ng)이고 최종 농도는 50μM이며, 약물(억제제)은 4μL이고 최종 농도는 2×10-6M~4.88×10-10M이며, 마지막의 농도는 0M이고 실제 배합 농도는 8×10-6M~1.95×10-9M이며, 마지막의 농도는 0M이었다. 구체적인 실험 과정은 다음과 같다.
1. 약물의 배합:
약물을 칭량한 후 DMSO에 첨가하여 농도가 10-2M로 될 때까지 용해시켰다. 파이펫으로 2μL를 흡수하고 98μL의 DMSO에 첨가하여 2×10-4M 농도의 약물을 얻은 후, 2×10-4M 농도의 약물에서 8μL를 흡수하고 198μL의 H2O에 첨가하여 8×10-6M 농도의 약물을 얻으며, 동일한 방법을 통해 2×10-6M, 5×10-7M, 1.25×10-7M, 3.12×10-8M, 7.8×10-9M, 1.95×10-9M 농도의 약물을 획득하였는데, 마지막의 농도 0M은 약을 첨가하지 않은 것이다.
2. 서브스트레이트의 제조:
25mg의 형광 폴리펩타이드 서브스트레이트를 654μL의 DMSO에 용해시켜 50mM의 저장액을 획득하였다. 상기 저장액을 -20℃에서 보관하고, 사용 시 500배로 희석하며, 각 샘플에 8μL를 첨가하여 반응 시스템에서 최종 서브스트레이트의 농도가 5μM로 되도록 하였다.
3. 반응 시스템의 제조:
완충액을 이용하여 20S 프로테아좀(2ng/μL)을 농도가 8ng/μL인 용액으로 희석하고, 웰당 4μL의 방식으로 384웰 형광 마이클로플레이트에 첨가한 후, 각 웰에 4μL의 측정 대기 샘플을 첨가하고, 현재 출시된 약물인 벨케이드를 양성 대조약으로 사용하며, 37℃에서 15min 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 각 웰에 8μL의 형광 서브스트레이트를 첨가하고, 37℃의 어두운 곳에서 1시간 동안 반응시킨 후, 360nm/460nm 형광 마이크로플레이트 리더(BMG LABTECH POLARstar OPTIMA Microplate Reader)를 이용하여 형광값을 검출하였다.
4. 데이터의 처리
해당 서브스트레이트를 제외한 후 농도가 상이한 약물에 의한 결과물의 형광값을 계산하며, GraphPad Prism 소프트웨어를 활용하여 약물이 프로테아좀을 억제할 수 있는 IC50 농도를 계산하였다.
일부 화합물의 결과는 하기 표와 같다.
여기서, Velcade 및 MLN9708의 화학식은 다음과 같다.
세포주 활성 억제
본 발명에서 사용한 검출액은 Promega사의 단일 용액 세포 증식 검출 키트이고, 사용한 세포는 U266, RPMI8226, ARH77이었다. 실험 시스템은 110μL인데, 90μL의 세포 현탁액, 10μL의 검출액, 10μL의 약물(억제제)을 함유하며, 최종 농도는 4.54×10-8M~1.77×10-9M이고, 마지막의 농도는 0M이며, 실제 배합 농도는 5×10-7M~1.95×10-8M이고, 마지막의 농도는 0M이었다. 구체적인 실험 과정은 다음과 같다.
1. 약물 배합:
약물을 정확하게 칭량한 후 DMSO에 첨가하여 10-2M로 될 때까지 용해시켰다. 피펫으로 1μL를 흡수하고 199μL의 DMSO에 첨가하여 5×10-5M 농도의 약물을 얻은 후, 5×10-5M 농도의 약물에서 3.3μL를 흡수하고 326.7μL의 무혈청 RPMI1640 배지를 첨가하여 5×10-7M 농도의 약물을 얻었다. 그 후, 1.5배의 농두 구배로 희석하여 3.3×10-7M, 2.2×10-7M, 1.48×10-7M, 9.87×10-8M, 6.58×10-8M, 4.38×10-8M, 2.92×10-8M, 1.95×10-8M 농도의 약물을 획득하였는데, 마지막의 농도 0M는 약을 첨가하지 않은 것이다.
2. 세포 현탁액의 배합:
세포 수를 각각 센 후, 1×104개/웰로 U266을 희석 배합하는데, RPMI8226 및 ARH77은 모두 1×104개/웰이었다.
3. 반응 시스템의 제조:
웰당 90μL의 방식으로 96웰 형광 엘리사 플레이트에 세포 현탁액을 첨가하고, 24h 동안 배양한 후 각 웰에 10μL의 측정 대기 샘플을 첨가하였다. 현재 출시된 약물인 벨케이드를 양성 대조약으로 사용하고 24h 동안 배양하며, 반응이 완료된 후 각 웰에 10μL의 검출액을 첨가하고 2~3h 동안 배양하며, 490nm 형광 마이크로플레이트 리더(BMGLABTECHPOLARstarOPTIMAMicroplate Reader)에 의해 흡광도를 검출하였다.
4. 데이터의 처리
백 그라운드를 제외한 후 농도가 상이한 약물에 의한 결과물의 흡광도를 계산하며, GraphPad Prism 소프트웨어를 활용하여 세포 독성에 대한 약물의 IC50 농도를 계산하였다.
일부 화합물의 결과는 하기 표와 같다.
체외 효소 활성 및 세포 독성 결과에 따르면, 본 발명에 따른 화합물 및 그 전구 약물은 현재 시중의 프로테아좀 약물에 비해 체외 효소 활성 및 다양한 세포에서 더 우수한 활성을 나타냄을 알 수 있다.
체내 약물 동태학 평가
체중이 220±20g인 SD 수컷 랫트 12마리를 무작위로 4 군으로 나누었다.
그중 두 군에 대해서는 각각 꼬리 정맥주사 방식을 통해 하기 표에 나타낸 사용량으로 IV-9 및 V-9A를 투여하며, 투여 전 및 투여 후 10min, 20min, 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h 및 36h에 경정맥 채혈을 통해 약 0.200mL를 채혈하고 EDTA-K2가 담긴 시험관에 넣으며, 15min 동안 고속 원심 분리(7800×g)시킨 후 혈장을 분리시킨 후 -15℃~-35℃에서 보관하였다. IV-9와 V-9A를 정맥주사 투여 시의 약물 동태학 차이를 비교하는 데 사용하였다.
나머지 두 군에 대해서는 각각 위내 투여 방식을 통해 하기 표에 나타낸 사용량으로 IV-9 및 V-9A를 투여하며, 투여 전 및 투여 후 5min, 10min, 20min, 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h 및 36h에 경정맥 채혈을 통해 약 0.200mL를 채혈하고 EDTA-K2가 담긴 시험관에 넣으며, 15min 동안 고속 원심 분리(7800×g)시킨 후 혈장을 분리시키고 -15℃~-35℃에서 보관하였다. IV-9와 V-9A를 경구 투여할 때의 약물 동태학 차이를 비교하는 데 사용하였다.
V-9A와 그 전구 약물(IV-9)의 약물 동태학 변수 대비
상기 약물 동태학 데이터에 따르면, 화합물 IV-9를 디에탄올아민보레이트 전구 약물(V-9A)로 제조한 후, 화합물의 약물 동태학 성질이 현저하게 개선되고, 반감기(T1/2)가 약간 연장되며, 경구생체이용률이 11%(IV-9)에서 24.9%(V-9A)로 향상된 것을 알 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 일련의 펩타이드 보레이트 에스테르류 화합물은 펩타이드 붕산류 화합물에 비해 더 우수한 약물 동태학 성질을 가지고 있음을 알 수 있다.
동물 이종 이식 모델 평가
인간 다발성 골수종 세포계 ARH-77을 이용하여 Balb/cnude 마우스에 종양을 피하 접종함으로써, 이식 종양 모델을 구축하였다. 구체적인 실험 과정은 다음과 같다.
1. Shanghai Bikai Laboratory Animal Co., Ltd.에서 4~6주령의 Balb/cnude 마우스를 구입하고, 베리어시스템에서 환경에 적응하도록 일주일 동안 사육하였다.
2. 세포를 대수생장기까지 배양하고, 세포를 소화시켜 원심 분리시킨 후, 마트리겔을 통해 1×107개/ml의 밀도로 재부유시키며, 얼음 위에 대기시켰다. 베리어시스템에서 마우스 한 마리당 1×106개의 세포를 접종하는 방식으로 종양세포를 우측 전지 겨드랑이에 접종하는데, 한 마리당 100μL 부피로 접종하였다.
3. 계속 사육하고 버니어 캘리퍼스로 종양 부피를 측정하며, 평균 부피가 100~150mm3로 증가될 때 동물을 무작위로 3 군, 즉 공백 대조군, 양성 대조군(화합물 MLN-9708)과 실험군(화합물 V-2A)으로 나누는데, 각 군마다 6마리씩 나누었다.
종양 부피 계산 공식:
4. 5% β-술포부틸시클로덱스트린나트륨 수용액을 이용하여 사용한 화합물을 적절한 농도로 배합하고, 용액이 맑아질 때까지 초음파 처리한 후 4℃의 냉장고에 넣어 보관하였다.
5. 경구투여 방식으로 투여하는데, 양성 대조군은 매주 2회 투여하고 투여량은 5mg/kg이며, 실험군은 매일 투여하고 투여량은 1mg/kg이며, 3주간 지속적으로 투여한 후 사망하게 하여 실험을 종료하였다. 그 동안 종양 부피를 매주 2회씩 측정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 활용하여 종양 성장에 대한 약물의 억제 효과를 검출하였다. 구체적인 실험 결과는 첨부된 도 1에 나타낸 바와 같다.
약물 투여 후 ARH-77 이종 이식 종양의 성장에 대한 영향
상기 결과에 따르면, 화합물 V-9A는 사용량이 1mg/kg인 경우 종양 억제률이 63.48%에 도달하고, 현재 출시된 경구용 프로테아좀 억제제 MLN-9708(5mg/kg 사용량)의 종양 억제률(25.28%)보다 현저하게 높다는 것을 알 수 있다. 상기 연구 결과에 따르면, 현재 출시된 제품에 비해 V-9A는 더 낮은 사용량으로 체내에서 더 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
체내 혈액 세포 약력학에 대한 연구
본 발명에 따른 화합물은 혈액 계통의 악성종양을 치료할 수 있으므로, 1회 투여한 후 혈액 중의 프로테아좀 활성을 검출하여 화합물의 효과를 평가하고, 서로 다른 시점에서 채혈하여 검출함으로써 체내 약력학을 연구할 수 있다.
구체적인 실험 과정은 다음과 같다.
1. Shanghai Bikai Laboratory Animal Co., Ltd.에서 8주령의 암컷 ICR 마우스를 구입하여 실험에 사용하고, 베리어시스템에서 환경에 적응하도록 일주일 동안 사육하였다.
2. 동물을 3군, 즉 양성 대조군(MLN9708)과 두개의 실험군(IV-9, V-9A)으로 나누는데, 각 군마다 3마리씩 나누었다.
3. 투여 전, 각 동물의 안와정맥총에서 100μL의 혈액을 채혈하여 자체 공백 대조군으로 사용하고, 이 샘플 중의 혈액 세포에 대해 측정한 프로테아좀 활성을 100%로 하였다. 투여한 후 시간을 카운트하기 시작하고, 각각 투여 후 1시간, 24시간에 안와정맥총에서 채혈하여 혈액 세포 중의 프로테아좀 활성을 검출하며, 0시의 데이터와 비교하면 혈액 중의 프로테아좀 활성에 대한 약물의 억제 효과 및 회복 상황을 알 수 있다.
4. 모두 경구투여 방식으로 투여하는데, MLN9708의 투여량은 5mg/kg이고, IV-9군, V-9A군의 투여량은 모두 2mg/kg이었다.
5. Promega사에서 혈액 세포 중의 프로테아좀 활성을 검출하기 위한 키트를 구입하며, 구체적인 실험 과정은 다음과 같다. 100μL 전혈을 흡취하며, 500μL의 PBS를 첨가하여 세척하고 적혈구를 수집하였다. 다시 세척한 후 100μL의 PBS를 첨가하여 재부유시키고, 현탁액에서 50μL를 흡취하며, 세포 분해액을 첨가하여 단백질 정량하여 검출값을 정정하였다. 20μL를 별도로 흡취하여 PBS를 통해 100μL로 되도록 5배 희석하며, 해당 희석액을 사용하여 형광 펩타이드 서브스트레이트와 반응시키고 마이크로플레이트 리더를 통해 프로테아좀의 활성을 검출하였다.
실험을 통해 획득한 구체적인 데이터는 첨부된 도 2에 나타낸 바와 같다. 연구 결과에 따르면, 투여 후 1시간에, 화합물 IV-9는 MLN9708와 거의 비슷한 억제 활성을 가지게 되고, V-9A는 더 우수한 억제 활성을 가지게 되며, 투여 후 24시간에, MLN9708군은 프로테아좀의 활성이 대조군 활성의 80%로 회복되는데, IV-9는 단지 대조군 활성의 약 60%로 회복되고, V-9A군은 단지 대조군 활성의 약 40%로 회복되는 것을 알 수 있다. 상기 연구 데이터에 따르면, 본 발명에 따른 화합물은 더 우수한 약력학 성질을 가지고 있기 때문에, 체내에서 효과가 더욱 우수하고 더욱 지구적인 것을 알 수 있다.
본 발명에 따른 화합물의 사용량은 투여 방식, 치료 용도, 환자의 건강 상태 및 의사의 처방에 따라 결정될 수 있다. 조합 약물에서 본 발명에 따른 화합물의 농도 및 차지한 비율은 투여 경로, 투여량 및 화학적 특성을 비롯한 다양한 요소에 따라 변경될 수 있는데, 예를 들면 본 발명에 따른 화합물은 장내투여 방식이 아닌 대략 0.1 내지 10%w/v의 화합물을 함유하는 수성 생리 완충액에 사용될 수 있다. 일반적인 사용량 범위는 매일 대략 1μg/kg 내지 1g/kg이다. 구체적인 실시형태에서, 사용량 범위는 매일 약 10μg/kg 체중 내지 100mg/kg 체중이다. 사용량은 투여 경로, 환자의 건강 상태, 질환 또는 실조 유형과 발병 정도, 화합물의 상대적 생물학 효과 및 부형제의 레시피에 따라 변경될 수 있다. 유효 사용량은 체외 또는 동물 모델 테스트 시스템의 사용량 반응 그래프에 따라 추산될 수 있다.

Claims (10)




  1. ,, 또는 중 하나인, 화합물 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  2. 약물 담지체 및 제1항에 따른 화합물을 포함하며, 선택적으로 동시, 각각, 또는 순차적으로 하나 또는 복수개의 다른 치료제와 조합되고, 고형 종양 및 혈액성 종양의 치료에 사용되는, 약물 조성물.
  3. 약물 담지체 및 제1항에 따른 화합물을 포함하고, 고형 종양 및 혈액성 종양의 치료에 사용되는, 약물 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화합물을 프로테아좀과 접촉시키면, 상기 프로테아좀이 억제되는, 화합물 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화합물이 프로테아좀 억제제를 제조하는데 사용되는, 화합물 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 고형 종양은 비소세포폐암, 소세포폐암, 폐선암, 폐편평세포암, 췌장암, 유선암, 전립선암, 간암, 피부암, 상피세포암, 위장관기질종양 또는 비인암에서 선택되는 약물 조성물.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 혈액성 종양은 백혈병, 다발성 골수종, 맨틀세포림프종 또는 조직 세포성 림프종에서 선택되는, 약물 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    또는 인, 화합물 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 삭제
  10. 삭제
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