KR102541118B1 - 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 점막염 예방 또는 치료용 용도 - Google Patents

수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 점막염 예방 또는 치료용 용도 Download PDF

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반재구
김의중
장인익
김정현
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Abstract

본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 점막염의 예방 또는 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수퍼옥시드 디스뮤타제는 항암제 또는 방사선 치료의 부작용인 점막 상피 세포의 증식 억제를 개선 또는 치료하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 점막염 예방 또는 치료용 용도{SUPEROXIDE DISMUTASE AND USES THEREOF FOR PREVENTING OR TREATING MUCOSITIS}
본 발명은 점막염의 예방 또는 치료를 위한 수퍼옥시드 디스뮤타제의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 점막염의 예방 또는 치료에 유용한 수퍼옥시드 디스뮤타제, 이의 점막염의 예방 또는 치료를 위한 용도, 조성물 또는 방법에 관한 것이다.
점막염은 가벼운 염증에서 심하게는 궤양의 발생으로 인한 점막의 손상을 특징으로 하는 병적 상태이다. 점막염은 항암 화학치료와 방사선치료 후 흔히 발생하는 부작용 중 하나로, 구강 내 발생 빈도가 높으며, 소장, 식도, 위, 대장에서도 발생하기 쉽다. 항암 화학치료를 받는 환자의 40%에서 점막염이 발생하며, 두경부암(head and neck cancer) 환자의 경우, 화학치료 와 방사선치료 후 발병율은 약 90%로 증가한다. 현재 몇 가지 치료방법이 제시되고 있지만 아직 효능 확실하지 않은 상태이다(Oral mucositis: the hidden side of cancer therapy. J Exp Clin Cancer Res 39,210 (2020); https://www.ons.org/pep/mucositis). 과거 항암치료의 가장 주요한 부작용은 구토 증상과 골수기능 저하로 인한 면역력의 감소였으나, 최근에는 점막염이 암환자 치료에서 심각한 부작용 중 하나로 여겨지고 있다. 구강 및 위장관 점막의 상피세포는 체내에서 가장 빠르게 생장하는 조직으로 특히, 소장은 교체주기가 가장 빨라 약 7일에 한 번 주기로 교체된다. 항암 화학치료나 방사선치료는 점막 세포의 재생을 방해할 수 있으며, 환자의 영양 부족은 세포 재생을 더욱 악화시킬 수 있다. 방사선에 의한 장 점막의 손상은 혈관 내피세포의 세포자멸사에 따른 미세혈관 손상이 원인으로 지목되고 있으며, 혈관 내피세포와 혈소판이 점막염의 발병기전에 역할이 있을 것으로 추정된다.
점막염은 많은 환자에서 심각한 통증, 전신 감염의 위험성 증가, 영양 섭취 감소를 유발할 수 있으며, 일부 환자에서는 점막염으로 인하여 적절한 용량의 항암치료를 할 수 없게 되어 치료 의지의 후퇴가 나타날 수 있는 등 환자의 삶의 질을 심대하게 떨어뜨릴 수 있다. 현재까지, 구강 점막염에 관한 치료제가 활발히 연구 중이지만, 구강 점막염과 위장관 점막염을 예방하거나 치료하기 위한 새로운 방법은 여전히 필요한 실정이다.
본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 점막염의 예방 또는 치료를 위한 수퍼옥시드 디스뮤타제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 점막염의 예방 또는 치료를 위한 경구 투여 효능 및 안전성을 확보한 바실러스 유래의 수퍼옥시드 디스뮤타제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 점막염의 예방 또는 치료를 위한 경구 투여 효능 및 안전성을 확보한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 유래의 수퍼옥시드 디스뮤타제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 점막염의 예방 또는 치료를 위하여 생산하기 편리하게 세포외 분비되는 바실러스 유래 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 유래의 수퍼옥시드 디스뮤타제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 점막염의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물 또는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 점막염의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 항암 치료 시에 발생할 수 있는 점막염의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 점막염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 개선된 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 점막염의 예방, 개선 또는 치료를 위한, 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe, GRAS) 박테리아, 예컨대 바실러스 유래의 수퍼옥시드 디스뮤타제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 점막염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 경구 투여 효능 및 안전성을 확보한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 유래의 수퍼옥시드 디스뮤타제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 점막염의 예방 또는 치료를 위하여 생산하기 편리하게 세포외 분비되는 바실러스 유래 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 유래의 수퍼옥시드 디스뮤타제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 방사선요법 및/또는 화학요법을 받는 대상에서 점막염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 개선된 수퍼옥시드 디스뮤타제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 수퍼옥시드 디스뮤타제를 유효 성분으로 포함하는 점막염의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 수퍼옥시드 디스뮤타제를 유효 성분으로 포함하는 점막염의 예방 또는 개선을 위한 식품 또는 사료조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 수퍼옥시드 디스뮤타제를 유효 성분으로 포함하는 조성물 및 상기 조성물의 상기 조성물의 복약 또는 투여 지침을 포함하는 지시서를 포함하는 점막염의 치료 또는 예방을 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 수퍼옥시드 디스뮤타제 또는 상기 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 점막염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 수퍼옥시드 디스뮤타제의 점막염 예방 또는 치료를 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 수퍼옥시드 디스뮤타제의 점막염 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 용도가 제공된다.
본 발명에 따른 수퍼옥시드 디스뮤타제, 조성물, 방법 및 키트는 점막염의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 본 발명에 따른 수퍼옥시드 디스뮤타제는 경구 도포 또는 경구 투여되는 경우에, 낮은 용량에서도, 점막염의 예방 또는 치료에 효과적임이 확인되었다.
본 발명에 따른 수퍼옥시드 디스뮤타제는 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe, GRAS) 박테리아인 바실러스 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스에서 유래하여 경구 투여 효능 및 안전성이 확보될 뿐만 아니라 배양 시 상등액에서 직접 회수할 수 있는 생산 장점도 취할 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 실험 동물(랫트)을 이용하여 점막염을 유발하고, 본 발명의 SOD를 구강 내 도포 및 경구 투여를 통해 농도별로 적용하여 체중 및 사료 섭취량을 측정한 결과, SOD 미투여군 대비 SOD 투여군에서 점막염 유발로 감소했던 체중 및 사료 섭취량이 다시 증가함이 확인되었다. 또한, 구강 및 장 내 점막염에서 재상피화 및 융모 위축 개선 정도가 SOD 농도 의존적으로 관찰되었으며, 위장관(예: 소장) 내 및 혈중 반응성 산소종(ROS; Reactive oxygen species) 수준이 SOD 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 수퍼옥시드 디스뮤타제는 ROS 수준을 감소시키고 상피세포의 재상피화 또는 위축된 융모 세포의 개선 등을 통해 점막염을 예방, 개선 또는 치료하는 데에 효과적으로 사용될 수 있으며, 정상적인 영양분 섭취를 가능하게 하여 체중 증가 효과도 기대할 수 있다.
도 1은 실시예 1.1에서 수행된 이중 교차 재조합을 위한 모식도를 나타낸다.
도 2는 발현 숙주 GFBS220과 생산 균주 BSBA310에서 PCR을 이용하여 결손 유전자를 확인한 결과를 나타낸다. W는 야생형 B. subtilis KCTC 3135를 나타내고, 220은 발현 숙주 GFBS220를 나타내고, 310은 SodA2 생산 균주 BSBA310을 나타낸다.
도 3은 SodA(바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 GF423의 배양 상층액에서 N-말단 시퀀싱을 통해 확인된 Mn-SOD)와 본 발명의 수퍼옥시드 디스뮤타제(SodA2)의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 4는 sodA2 유전자의 과발현을 위한 발현 벡터를 나타낸다. 여기서, rrnB T1T2는 전사 종결인자를 나타내고; rep(pBR322)는 E. coli에서 작동하는 pBR322로부터의 레플리콘을 나타내고; rep(pUB110)는 B. subtilis에서 작동하는 pUB110로부터의 레플리콘이고; KanR은 카나마이신 내성 유전자(아미노글리코시드 O-뉴클레오티딜트랜스퍼라제)를 나타내고; BJ27 promoter는 B. subtilis에 대한 강력한 프로모터를 나타낸다.
도 5는 생산 균주 BSBA310을 제조하기 위한 전체 절차를 나타내는 도면이다.
도 6a 및 6b는 점막염 동물 모델의 체중 및 사료 섭취량 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 7a 내지 도 7c는 점막염 동물 모델의 구강 점막염 평가 결과를 나타낸다. 도 7a는 구강 점막염 점수매김 결과를 나타내며, 도 7b는 구강 점막염 조직평가 결과를 나타내고, 도 7c는 재상피화된 구강 점막 상피의 두께를 정량적으로 나타내는 도면이다.
도 8a 내지 도 8c는 점막염 동물 모델의 장 내 점막염 평가 결과를 나타낸다. 도 8a는 장 내 점막염 점수매김 결과를 나타내며, 도 8b는 장 내 점막염 조직평가 결과를 나타내는 도면이다. 도 8c는 장 융모 길이를 정량적으로 나타내는 도면이다.
도 9a 및 도 9b는 장 내 및 혈액 내 ROS 평가 결과를 나타내는 도면이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 일 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예에서 다른 구현예로 변경되거나 구현예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 발명을 설명하면서 제시된 용어는 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 그의 통상적인 의미로 이해되어야 하며, 그 용어가 정의된 발명의 태양 또는 구현예뿐만 아니라 본 명세서에 사용된 동일한 용어에 모두 적용된다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
정의
용어 "대상"은 "환자"와 상호교환적으로 사용되고, 점막염의 예방 또는 치료를 필요로 하거나 방사선요법 및/또는 화학요법을 받는 포유동물, 예를 들어, 영장류(예컨대 인간), 반려 동물(예컨대, 개, 고양이 등), 가축 동물(예컨대, 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예컨대, 랫트 마우스, 기니피그 등)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 대상체는 인간이다.
용어 "치료"는 예방적 및/또는 치료적 처치를 포함한다. 상기 예방적 및/또는 치료적 처치는 당업계에서 인정되는 모든 종류의 처치를 포함하며 예컨대, 대상에 본 발명의 조성물 또는 SOD를 투여하는 것을 포함한다. 만약 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태(예컨대 질병 또는 대상의 다른 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태)의 임상적 징후 전에 투여된다면, 그러한 처치 또는 치료는 예방적 처치 또는 치료이다(예컨대, 대상의 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태가 진행되는 것으로부터 대상을 보호하는 것). 반면에 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태의 임상적 징후 후에 투여된다면, 그러한 처치 또는 치료는 존재하는 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태 또는 이의 부작용을 감소, 완화 또는 안정화하는 등의 치료적 처치이다.
용어 "예방"의 의미는 당업계에 잘 알려져 있다. 점막염과 같은 의학적 상태와 관련하여 사용될 때, 본 발명의 약학 조성물 또는 SOD를 투여하여 이를 투여받지 않은 대상과 비교하여 의학적 상태(예컨대, 체중감소, 점막 염증 또는 궤양, 설사, 및 위장관(예: 소장) 내 또는 혈중 높은 ROS 수준 등)의 빈도를 감소시키거나 발병 및 증상을 지연시키는 것을 의미한다.
용어 "투여"는 대상에 예방적 또는 치료적 목적(예컨대 점막염의 예방 또는 치료)을 달성하기 위한 유효 성분을 제공하는 것을 의미한다.
용어 "도포"는 대상에 예방적 또는 치료적 목적(예컨대 점막염의 예방 또는 치료)을 달성하기 위한 유효 성분을 생체 표면(예컨대, 피부 또는 점막)에 접촉시키는 모든 방법을 의미하며, 이를 통해 해당 조성물을 피부 또는 점막 내부로 흡수시키는 것을 목적으로 한다.
점막염
본 발명은 적어도 부분적으로 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD)의 투여, 특히 경구 도포 또는 경구 투여가 점막염을 예방 또는 치료하는 데 효과적이라는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명의 일 태양에 따르면, SOD의 점막염의 예방 또는 치료용 용도가 제공된다.
용어 “점막염”은 입에서 항문에 이르기까지 구강 및 소화관의 점막에 염증 또는 궤양이 발생하는 질병을 지칭한다.
일 구현예에서, 점막염은 예를 들어 항암 치료(예를 들어, 화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합)를 포함하는 암 치료의 부작용으로서 발생될 수 있다. 조혈모 세포 이식(HSCT) 등을 위한 화학요법 및/또는 방사선 요법의 컨디셔닝 요법은 많은 환자들에게 점막염을 야기할 수 있다. 또한, 점막염은 단순성 포진 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 또는 캔디다(candida)와 같은 바이러스, 진균 또는 세균 감염에 의한 점막 손상으로부터 발생될 수도 있으며, 전신 홍반 루푸스(SLE), 베체트 병(BD) 등과 같이 호중성 백혈구의 감소 상태 및 자가면역질환들과 같은 여러 질환 또는 질병에 의해 야기될 수도 있다.
상기 방사선요법은 방사선을 이용한 질병의 예방 또는 치료법 또는 방사선을 이용한 의학적 처치법을 의미하며, 단독으로 또는 화학요법과 병행하여 점막염을 유발하는 임의의 방사선요법을 포함한다. 또한, 화학요법은 화학약품을 이용한 질병의 예방 또는 치료법 또는 화학약품을 이용한 의학적 처치법을 의미하며, 단독으로 또는 방사선요법과 병행하여 점막염을 유발할 수 있는 임의의 화학요법을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방사선요법 및 화학요법은 암의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있고, 상기 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 및 안구 내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 여성 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비 시스템 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 및 급성 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병), 어린이 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물 형성증, 1차 CNS 림프종, 종양 신생 혈관 형성, 척수 축 종양, 뇌간 교세포종, 뇌하수체 선암종, 카포시 육종, 표피양암, 편평 상피 세포 암, T 세포 림프종, 환경에 의해 유발되는 암(예를 들어, 석면에 의해 유발되는 암)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 암의 예방 또는 치료를 위한 화학요법은 항암제를 이용한 화학요법일 수 있으며, 이의 부작용으로서 점막염이 유발될 수 있다. 상기 항암제를 이용하는 것은 항암제를 단독 또는 복합으로 이용하는 것을 포함하며, 항암제와 다른 물질(예: 항암제 이외의 약물, 항암제 부작용 억제 약물 등)을 함께, 순차적으로, 또는 역순으로 투여하여 점막염을 유발하는 것도 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 점막염을 유발할 수 있는 항암제는 세포독성 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포독성 항암제는 빠르게 분화하는 세포를 공격하는 약물로서, 예를 들어, 뉴클레오시드 아날로그[예: 아자시티딘(Azacitidine), 카페시타빈(Capecitabine), 카르모푸르(Carmofur), 클라리딘(Cladribine), 클로파라빈(Clofarabine), 시타리빈(Cytarabine), 데시타빈(Decitabine), 플로스우리딘(Floxuridine), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 메르캅토퓨진(Mercaptopurine), 넬라라빈(Nelarabine), 펜토스타틴(Pentostatin), 테가푸르(Tegafur), 티오구아닌(Tioguanine) 등], 엽산길항제(antifolate)[예: 메토트렉세이트(Methotrexate), 메트렉시드(Pemetrexed), 랄티트렉시드(Raltitrexed) 등], 대사길항제(antimetabolite)[예: 히드록시우레아(Hydroxycarbamide) 등], 토포이소머라아제 I(Topoisomerase I) 저해제[예: 이리노테칸(Irinotecan), 토포테칸(Topotecan) 등], 안트라사이클린[예: 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 이다르비신(Idarubicin) 등], 포도필로톡신[예: 에토포시드(Etoposide), 테니포시드(Teniposide) 등], 탁산[예: 카바지탁셀(Cabazitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 파클리탁셀(Paclitaxel) 등], 빈카 알카로이드[예: 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 빈플루닌(Vinflunine), 비노렐빈(Vinorelbine) 등], 알킬화제[예: 벤다무스틴(Bendamustine), 부설판(Busulfan), 카무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 클로메틴(Chlormethine), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 다카바진(Dacarbazine), 포테무스틴(Fotemustine), 이포스파미드(Ifosfamide), 로무스틴(Lomustine), 멜팔란(Melphalan), 스트렙토조토신(Streptozotocin), 테모졸로미드(Temozolomide) 등], 백금 화합물[예: 카보플라틴(Carboplatin), 시스플라틴(Cisplatin), 네자플라틴(Nedaplatin), 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 등] 또는 기타 약물[예: 알트레타민 (Altretamine), 블레오마이신(Bleomycin), 보르테조밉(Bortezomib), 닥티노마이신(Dactinomycin), 에스트라무스틴(Estramustine), 익사베필론(Ixabepilone), 미토마이신(Mitomycin), 프로카바진(Procarbazine) 등] 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 표적 항암제는 다른 세포(예를 들어, 정상 세포)와 차이가 나는 암 세포의 특정 부분을 표적으로 하여 암 세포를 선택적으로 공격하는 약물로서, 예를 들어, 단클론항체[예: 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 데노수맙(Denosumab), 젬투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 이브리투모맙 튜세탄(Ibritumomab tiuxetan), 이필리무맙(Ipilimumab), 니볼루맙(Nivolumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 파니투무맙(Panitumumab), 펨브로리주맙(Pembrolizumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 리툭시맙(Rituximab), 토시투맙(Tositumomab), 트라스투주맙(Trastuzumab) 등], 타이로신 키나제 억제제[예: 아파티닙(Afatinib), 애플리버셉트(Aflibercept), Axitinib(액시티닙), 보수티닙(Bosutinib), 크리조티닙(Crizotinib), 엘로티닙(Erlotinib), 제피티닙(Gefitinib), 이매티닙(Imatinib), 라파티닙(Lapatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 파조티닙(Pazopanib), 포나티닙(Ponatinib), 레고라티닙(Regorafenib), 록소리티닙(Ruxolitinib), 소라페닙(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib), 반데타닙(Vandetanib) 등], mTOR 저해제[예: 에베로리무스(Everolimus), 템시로리무스(Temsirolimus) 등], 레티노이드[예: 알리트레티노인(Alitretinoin), 벡사로텐(Bexarotene), 이소트레티노인(Isotretinoin), 타미바로텐(Tamibarotene), 트레티노인(Tretinoin) 등], 면역조절제[예: 레날리도마이드(Lenalidomide), 포말리도마이드(Pomalidomide), 탈리도마이드(Thalidomide) 등], 히스톤 탈아세틸화효소 저해제[예: 파노비노스탓(Panobinostat), 로미뎀신(Romidepsin), 발프로에이트(Valproate), 보리노스탓(Vorinostat) 등], 또는 기타 약물[예: 아나그렐리드(Anagrelide), 삼산화비소(Arsenictrioxide), 아스파라기나제(Asparaginase), BCG 백신, 데닐류킨 디피톡스(Denileukin diftitox), 베무라페닙(Vemurafenib) 등] 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 면역 항암제는 체내 면역체계를 활용해 암 세포를 공격하는 약물로서, 예를 들어, 면역체크포인트억제제[예: 아테졸리주맙(Atezolizumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 아벨루맙(Avelumab), 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 더발루맙(Durvalumab) 등], 면역세포작용강화제[예: 블리나투모맙(blinatumomab) 등] 또는 기타 약물[예: 알렘투주맙(Alemtuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 엘로투주맙(Elotuzumab) 등] 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 약물이 표적 항암제이자 면역 항암제일 수 있다.
특히, 또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서 점막염을 유발할 수 있는 항암제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide, CPA), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 프리드니손(Prednisone), 에토포시드(Etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 파클리탁셀(Paclitaxel), 젬시타빈Glemcitabine), 비노렐빈(Vinorelbine), 류코보린(Leucovorin), 이리노테칸(Irinotecan), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 점막염은 구강 점막염(예컨대 구강 궤양, 재발성 구강 궤양(Recurrent oral ulceration), 또는 인두 점막염), 식도 점막염, 위장관 점막염(예컨대 장 염증 질환 또는 장 궤양 질환), 직장 점막염 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 점막염은 궤양 또는 염증, 통증유발, 음식물 섭취 장애, 설사, 체중감소, ROS 수준 감소, 출혈, 감소된 상피 두께, 홍반 등과 같은 하나 이상의 증상을 유발할 수 있다. 구체적으로, 점막염은 궤양 또는 염증, 통증유발, 음식물 섭취 장애, 설사, 체중감소, ROS 수준 감소, 출혈, 감소된 상피 두께, 및 홍반으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 증상을 유발할 수 있다.
다른 구현예에서, 점막염의 예방, 개선 또는 치료가 필요한 대상에 SOD를 투여함으로써, 대상에서 음식물 섭취 장애 감소, 궤양 회복, 재상피화 개선, 설사 증상 개선 및 장 융모 위축 개선과 같은 효과를 가져올 수 있다. 구체적으로, SOD의 투여는 대상에서 음식물 섭취 장애 감소, 궤양 회복, 재상피화 개선, 설사 증상 개선 및 장 융모 위축 개선으로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 가져올 수 있다. 또한, SOD는 점막염의 위장관(예: 소장) 내 또는 혈중 반응성 산소종(ROS; Reactive oxygen species) 수준을 감소시키는 효과를 가져올 수 있다.
수퍼옥시드 디스뮤타제(Superoxide dismutase; SOD)
본 발명의 다른 태양에 따르면, 점막염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 개선된 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD)가 제공된다.
SOD는 수퍼옥시드 라디칼 (O2 ㆍ-)의 일반 분자 산소(O2)와 과산화수소(H2O2)로의 디스뮤테이션(dismutation)을 번갈아 촉매하는 효소로서, SOD는 활성 산소 종을 제거하여 산화 스트레스를 줄이는 데 중요한 역할을 한다. SOD는 원핵 세포와 진핵 세포에 널리 분포하고 있으며, 다양한 유형의 금속 중심(구리/아연, 니켈, 망간, 및 철)에 따라 4가지 부류로 분류된다. 망간 함유 SOD[Mn-SOD]는 여러 세균, 진핵 세포의 엽록체, 미토콘드리아, 및 세포질에 광범위하게 존재한다. 용어 "SOD"는 수퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, SOD는 망간에 결합하는 것(Mn-SOD)일 수 있다. 구체적으로 SOD는 탈아미드화된 Mn-SOD일 수 있다. 보다 구체적으로, SOD는 서열번호 2를 기준으로 74번 및 137번 아미노산 잔기가 Asp로 치환된 것일 수 있다. 보다 더 구체적으로, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 발명의 SOD 또는 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열도 포함되는 것으로 해석된다. 상기 실질적인 동일성은 당업계에 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석하는 경우, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
다른 구현예에서, SOD는 SOD 효소 활성을 갖는 개질된(modified 또는 engineered) 폴리펩티드로서 다양한 측면(생체내, 시험관내 또는 생체외 안정성, 균일성, 및/또는 형태적 변경)에 영향을 미치거나 미치지 않는 하나 이상의 변이, 예컨대, 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 정제, 검출 또는 안정성 증가를 위한 이종성 물질(예컨대, HIS tag, Ha tag, myc tag를 포함한 당업계에 공지된 tag, GFC 및/또는 항체의 Fc 도메인)을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, SOD는 천연 또는 재조합 미생물로부터 유래될 수 있으며, 다양한 공급원으로부터 단리 또는 정제되는 과정을 거쳐 제조된 효소일 수 있다.
일 구현예에서, SOD는 천연 또는 재조합 미생물로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, SOD는 박테리아로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, SOD는 약물 또는 식품에 사용하기에 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe, GRAS) 박테리아로부터 공급될 수 있다. 구체적으로, SOD는 바실러스 종 균주에서 유래될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 균주(KCTC 13222 BP)로부터 유래된 것일 수 있다. GF423 균주(KCTC 13222 BP)는 한국생명공학연구원에 2017년 3월 6일자로 기탁된 것이다.
다른 구현예에서, SOD는 도 4에 도시된 발현 벡터를 포함하는 재조합 균주로부터 유래된 것일 수 있다. 또한 상기 SOD는 도 5에 도시된 방법을 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합 균주로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 재조합 균주는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 재조합 균주는 하기 유전자가 결실된 바실러스 종 균주일 수 있다: AprE, NprE, Bpr, Epr, NprB, Vpr, Mpr, IspA, SrfAC, spoIIAc, EpsE 및 Xpf. 상기 균주의 제조를 위한 상세한 과정은 실시예 1을 참조한다.
상기 균주 유래의 SOD는 세포 외부로 분비되는 효소이므로, 상기 균주를 이용하여 SOD를 제조하는 경우, 고가의 정제과정(예를 들어, 컬럼 정제)을 거치지 않고 인간에게 안전성이 확보된 SOD를 대량으로 생산할 수 있기 때문에, 효율적인 생산이 가능하다.
일 구현예에서, SOD는 천연 또는 재조합 숙주를 비롯한 다양한 공급원으로부터 단리되거나 정제될 수 있다. 예를 들어, 점막염을 예방하거나 치료하는 활성을 갖는 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 GF423의 배양 상층액으로부터 추출될 수 있다. 간략하게 말하면, 먼저 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 GF423을 다양한 유형의 배지에서 배양하여 배양액을 얻을 수 있다. 예를 들어, 복합 배지(pH 6.0 내지 7.0)를 사용하여 상기 균주를 25℃내지 42℃에서 1일 내지 4일 동안 성장시킨다. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 GF423을 배양하기 위한 다른 적합한 배지에는 LB(Luria-Bertani) 배지, ISP(International Streptomyces Project) 배지, NA(nutrient agar) 배지, BHI(brain heart infusion agar) 배지, SDA(sabouraud dextrose agar) 배지, PDA(potato dextrose agar) 배지, NB(nutrient broth) 배지 등이 포함된다. 바람직하게는, LB 배지, ISP 배지, BHI 배지, SDA 배지, 또는 NB 배지가 사용될 수 있다. 또한, SOD는 PubMed 또는 BRENDA(월드 와이드 웹의 brenda-enzymes.org)와 같은 데이터베이스에 제공된 정보를 사용하여 다른 천연 또는 재조합 숙주로부터 공급될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 SOD는 단리 또는 정제된 효소일 수 있다. 이때, 단리되거나 정제된 SOD 또는 그의 생물학적 활성 부분에는 그것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질이 실질적으로 없다. 예를 들어, 정제물은 균주 배양물로부터 한외 여과(Ultrafiltration), 황산암모늄 처리, 컬럼 정제, 농축 등을 통해 순수 분리된 것이거나, 한외 여과, 농축 등을 통해 얻어진 배양 농축액일 수 있다. "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 문구는, 단백질이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 그러한 단백질이 분리된 단백질의 제조물을 포함한다. 구체적으로, "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 문구는 원하지 않는 단백질이 건조 중량을 기준으로 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 5% 미만인 단백질의 제조물을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, SOD는 다음과 같은 정제 방법으로 정제하는 것이 바람직할 수 있지만, 이로 한정되지는 않는다. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 GF423을 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 배양 상층액을 수집한다. 상층액 분획을 고체상 추출로 전처리하고, 이어서 크로마토그래피로 단리하고 정제한다. 이때, SOD는 다양한 방식의 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 바람직하게는, 소수성 상호작용 크로마토그래피가 사용된다.
일 구현예에서, 상기 SOD는 균주 용해물(lysate), 균주 배양물, 균주 배양 농축액, 균주 배양 추출물, 또는 그의 건조 형태로 포함될 수 있다. 이때, "균주 용해물"은 균주를 배양하여 기계적 또는 화학적으로 파쇄하여 얻은 것을 의미하며 이로부터 추출, 희석, 농축, 정제 등의 추가 공정을 거친 것을 모두 포함할 수 있다. "균주 배양물"은 균주를 배양하여 얻은 배양액 그 자체 또는 그의 상층액을 의미할 수 있다. "균주 배양 농축액"은 균주 배양물로부터 한외 여과, 황산암모늄 처리, 컬럼 정제, 농축 등을 통해 순수 분리된 것이거나, 한외 여과, 농축 등을 통해 얻어진 배양 농축액을 지칭한다. "균주 배양 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다. 상기 건조 형태는 동결 건조 형태를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 SOD는 점막염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 투여되어 위장의 음식물 섭취 장애 감소, 궤양 회복, 재상피화 개선, 설사 증상 개선, 장 융모 위축 개선 중 하나 이상의 효과를 나타냄이 확인되었다. 다른 일 실시예에 따르면, 상기 SOD는 점막염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 경구 도포 또는 경구 투여되어 위장관(예: 소장) 내 또는 혈중 ROS(Reactive oxygen species) 수준을 감소시키는 효과를 나타내었다.
투여 용량
본 발명은 적어도 부분적으로 본 발명의 SOD가 낮은 용량으로 경구 도포 또는 경구 투여하는 경우에도 점막염의 예방 또는 치료에 효과적임을 확인함으로써 완성되었다.
본 발명의 SOD는 대상체의 중량을 기준으로 약 50 units/kg 내지 약 2500 units/kg/day, 바람직하게는 약 125 units/kg/day 내지 약 1000 units/kg/day, 보다 바람직하게는 약 125 units/kg/day 내지 약 500 units/kg/day 또는 약 250 units/kg/day 내지 약 1000 units/kg/day, 보다 더 바람직하게는 약 250 units/kg/day, 약 500 units/kg/day, 또는 약 1,000 units/kg/day의 용량으로 투여될 수 있다. 특히, 본 발명의 SOD가 경구 도포되는 경우에는 대상체의 중량을 기준으로 경구 투여 용량의 절반으로 낮추는 경우에도 점막염의 예방 또는 치료 효과를 효과적으로 나타낼 수 있다. 예를 들어, SOD가 구내 도포되는 경우에는 약 25 units/kg/day 내지 약 1250 units/kg/day, 바람직하게는 약 125 units/kg/day 내지 약 500 units/kg/day, 보다 바람직하게는 약 250 units/kg/day, 약 500 units/kg/day, 또는 약 1000 units/kg/day의 용량으로 적용될 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, SOD를 유효 성분으로 포함하는 점막염의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 SOD는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 조합되어 점막염의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 형성할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 인간을 제외한 동물에 적용되는 경우에 수의학적 조성물이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제는 당업계에 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 이산화규소 등의 광물유 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 첨가제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 제제화를 위한 첨가제는 약제 분야에서 통상 사용하는 것 중에서 적합한 것을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 사용 방법에 따라 바람직한 형태로 제형화될 수 있으며, 특히 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 그러한 제형의 구체적인 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제, 주사용액, 경고제(Plasters), 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 에어로졸제, 엑스제(Extracts), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 침제, 크림제, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 패치제 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최신판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 생체 내 표적에 도달할 수 있는 통상적인 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어 경구 도포, 경구 투여, 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐 내, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의해 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 경구 투여의 경우, 위산으로부터의 보호를 위해 SOD가 쉘락(shellac)으로 코팅될 수 있지만, 코팅제는 이로 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 코팅제의 예에는 쉘락, 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 제인(zein), 유드라짓(Eudragit), 및 이들의 조합이 포함된다. SOD가 코팅되는 경우, SOD는 용액 중에서 코팅될 수 있다. 구체적으로, 정제된 용액과 쉘락 함유 용액이 혼합되고, 이어서 동결 건조된다. 이 동결 건조된 샘플은 분말로 만들어져 사용 시까지 약 4 ℃에서 보관될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 복합 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 도포제 형태로 적용되거나 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 유효한 양으로 투여된다. 용어 "약학적으로 유효한 양" 또는 "수의학적으로 유효한 양"은 의학적 또는 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자 또는 동물의 체중, 성별, 연령, 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 조성물의 총 중량에 기초하여 약 2 내지 약 1500 U/mg, 구체적으로 약 5 내지 약 1000 U/mg, 보다 구체적으로 약 10 내지 약 800 U/mg, 보다 더 구체적으로 약 100 내지 약 500 U/mg의 양으로 SOD를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이러한 양은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 방사선요법 및/또는 화학요법과 함께, 순차적으로, 또는 역순으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 방사선요법 및/또는 화학요법 실시 전, 실시 후, 또는 실시 전과 후 모두에 투여될 수 있다.
치료 또는 예방 방법
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 SOD 또는 조성물을 점막염을 갖거나 이의 위험이 있는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 점막염의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다.
본 발명에서 "투여"는 목적하는 작용을 수행하여 예방 또는 치료를 가능하게 하는 임의의 다양한 투여를 포함한다. 투여 경로와 관련하여는 상술한 바를 참조한다. 예컨대, 상기 방법은 점막염을 갖거나 점막염이 발생할 위험이 있는 대상에게 본 발명의 SOD 또는 조성물을 치료학적 유효량으로 하나 이상의 소화관 영역에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 구강 점막염을 갖거나 발생할 위험이 있는 대상에게 본 발명의 SOD 또는 조성물을 치료학적 유효량으로 구강 내 도포하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 SOD의 유효량 또는 효과적인 무독성 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 SOD의 치료 활성량은 질환 단계, 질환의 중증도, 대상체의 연령, 성별, 의학적 합병증, 및 체중과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 SOD의 투여량 및 투여요법은 최적 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 분할 용량이 매일, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다 등으로 투여될 수 있고/거나, 용량이 치료 상황의 긴박함에 따라 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다.
상기 방법은 점막염을 치료하거나 예방하기 위한 하나 이상의 다른 제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 다른 제제에는 화합물, 유전자 치료제, 단백질(항체 포함) 등 점막염을 호전 또는 개선시킬 수 있는 임의의 제제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 하나 이상의 추가 제제는 상기 SOD 또는 약학 조성물과 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여될 수 있다. 또한, 개별 성분은 동일하거나 상이한 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있다.
한편, 일 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 SOD 또는 조성물을 대상이 방사선 요법을 받기 전, 후 또는 전과 후 모두에 대상에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 SOD 또는 조성물을 대상이 화학요법을 받기 전, 후 또는 전과 후 모두에 대상에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 항암 치료를 받는 대상에 본 발명의 SOD 또는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
이 때, 본 발명의 SOD 또는 조성물은 화학요법(예컨대 상기 항암제 투여) 및/또는 방사선요법과 그 순서 및 회수에 관계없이 병용될 수 있다.
식품 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 SOD를 유효 성분으로 포함하는 점막염의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물이 제공된다. 이러한 식품 조성물은 의료용 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 식품 조성물을 포함한다.
용어 "의료용 식품" 또는 "뉴트라슈티컬 식품"은 인체에 유익한 기능을 할 가능성이 있는 원료 또는 성분으로 제조된 식품으로서, 정상적인 기능을 유지하거나 인체의 생리적 기능을 활성화함으로써 건강을 유지시키거나 개선시키는 식품을 지칭하고, 식품의약품안전처에 의해 규정되지만 이로 한정되지 않으며, 임의의 통상적인 건강 식품을 그 의미에서 배제하지 않는다.
또한, 상기 식품에는 각종 식품류, 식품 첨가제, 음료(예를 들어, 기능성 음료, 천연 과일 주스 및 야채 음료), 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품, 기타 기능성 식품 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
상기 식품은 당업계에 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 의료용 식품, 뉴트라슈티컬 식품 또는 건강기능식품은 점막염을 예방하거나 개선시킬 목적으로 상기 SOD에 더하여 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 추가로 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 통상의 기술자는 그 제형에 따라 적절한 성분을 조합하여 제조할 수 있다.
상기 상술한 제형 내 유효 성분으로서의 본 발명에 따른 수퍼옥시드 디스뮤타제의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 약 0.001 내지 약 99.9 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 50 중량% 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식품의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효 성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 약 10 내지 약 1000 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 건강기능식품의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없을 수 있으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 수 있다.
사료 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 SOD를 유효 성분으로 포함하는 점막염의 예방 또는 개선을 위한 사료 조성물이 제공된다. 본 발명에서 식품 조성물은 사료 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 사료 조성물은 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 사료 조성물은 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료첨가용 부형제(탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등)를 포함할 수 있다.
키트
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명의 SOD 또는 조성물을 포함하는 점막염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 키트가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 키트는 본 발명의 SOD 또는 조성물의 사용을 지시하는 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 상기 지시서는 유효 성분의 복약 또는 투여 지침을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 지시서는 방사선요법 및/또는 화학요법과의 병용, 또는 항암제와의 병용에 대한 복약 또는 투여 지침을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 지시서에는 방사선요법 및/또는 화학요법과의 병용, 또는 항암제와의 병용에 대한 투여 시점, 순서, 횟수, 용량 등에 관한 지침을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. 수퍼옥시드 디스뮤타제(SodA2)를 발현하는 재조합 균주의 제조
실시예 1.1. 발현 숙주 GFBS220의 제조
발현 숙주 GFBS220는 Bacillus subtilis KCTC 3135를 이용하여 제조하였다. B. subtilis KCTC 3135는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 분양받았다. 후공정을 용이하게 하게 위해 B. subtilis KCTC 3135 지놈에서 하기 표 1에 제시된 유전자를 제거하였다.
유전자 명칭 단백질 명칭 기능
AprE 세린 알칼리 프로테아제(서브틸리신 E) 세포외 프로테아제
NprE 세포외 중성 메탈로프로테아제 세포외 프로테아제
Bpr 바실로펩티다제(bacillopeptidase) F 세포외 프로테아제
Epr 세포외 세린 프로테아제 세포외 프로테아제
NprB 세포외 중성 프로테아제 B 세포외 프로테아제
Vpr 세포외 세린 프로테아제 세포외 프로테아제
Mpr 세포외 메탈로프로테아제 세포외 프로테아제
IspA 세포내 세린 프로테아제 세포내 프로테아제
SrfAC 서팩틴 신타제 서팩틴(surfactin) 합성
spoIIAC RNA 폴리머라제 포자형성-특이적 시그마 인자(시그마-F) 포자형성
EpsE 추정 글리코실트랜스퍼라제 세포외 다당류
Xpf RNA 폴리머라제 시그마 인자 PBSX 프로파지 유전자의 전사
유전자의 제거는 지놈 상에서 이중 교차 재조합(double cross-over recombination)을 이용하여 수행하였다(도 1). 구체적으로, 온도 민감성 복제 기점을 가지는 벡터 pUCori-ts-cm에 조작 대상 유전자 양 옆의 DNA 염기 서열과 상동성을 갖는 DNA 절편(up frag. 및 down frag.)을 클로닝하였다. 클로닝에 사용된 PCR 조건 및 프라이머는 각각 표 2 및 표 3에 제시되어 있다.
PCR 단계 온도 시간
최초 변성 95℃ 30초
30회 주기 95℃50℃
72℃		 30초
30초
1분/kb
최종 신장 72℃ 10분
PCR에 사용한 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소(NEB, USA)임.
표적 유전자 상동 쌍 프라이머 서열(5'→3') 서열번호
AprE 단편 1 F ctacggggtctgacgcagatatcgtaaccgaagaacg 5
R tgttgcagacatgttgctgaacgccatc 6
단편 2 F caacatgtctgcaacatatcttggaaac 7
R gataagctgtcaaaccagagattggataggctatcaag 8
NprE 단편 1 F ctacggggtctgacgcagggcattactgcaccataatc 9
R gaggtacgccttcagcagcctgaacacc 10
단편 2 F gctgaaggcgtacctcacgccttcttcc 11
R gataagctgtcaaaccagttgtcagatttgcatccttc 12
Bpr 단편 1 F ctacggggtctgacgcagagcaatttccagcccgcttc 13
R gtatgatgaggcatgaacagcaatcccg 14
단편 2 F tcatgcctcatcatactcaacaagggtg 15
R gataagctgtcaaaccagttcccagccggatgttcaac 16
Epr 단편 1 F ctacggggtctgacgcaggctttctgccagccgatagg 17
R tgtgtcaaagccgttatgcttggctccg 18
단편 2 F taacggctttgacacagcacaaactgcc 19
R gataagctgtcaaaccaggtctcccatacatgaacgac 20
NprB 단편 1 F ctacggggtctgacgcagagtaatcttgtaggaggctg 21
R tgtgactgtcatattcaccgtcgtgtgg 22
단편 2 F tgaatatgacagtcacacagtattccgcc 23
R gataagctgtcaaaccagattaggatacggtctggctg 24
Vpr 단편 1 F ctacggggtctgacgcagatgtacgctgagccgaatag 25
R ggaatcacatttgcggagatacggcgtc 26
단편 2 F ccgcaaatgtgattccggcacatcaaac 27
R gataagctgtcaaaccagaccgttttccgaatctgacc 28
Mpr 단편 1 F ctacggggtctgacgcagcgttatcccgaatgcccgtg 29
R ggctttgttcctttagtgtcaaccaccc 30
단편 2 F ctaaaggaacaaagccgattcgctccgc 31
R gataagctgtcaaaccagaaattgactgctccacgctg 32
SrfAC 단편 1 F ctacggggtctgacgcaggatatgtattacctatcgcc 33
R gccccttcatccagttcactgcttccttg 34
단편 2 F ggaagcagtgaactggatgaaggggcttcgctg 35
R gataagctgtcaaaccagaacgcttcgacatcactttc 36
spoIIA
 단편 1 F ctacggggtctgacgcagagcggacgatgggagactgg 37
R gccacctcatgcagccgatctggaagag 38
단편 2 F ggctgcatgaggtggctgagcggctcgg 39
R gataagctgtcaaaccagctcattgttttggtgagctg 40
IspA 단편 1 F ctacggggtctgacgcagtgctgcttggcattcatttc 41
R gccattgaagcaatgcctccgtttgaatc 42
단편 2 F acggaggcattgcttcaatggctgcccctcatg 43
R gataagctgtcaaaccagtcaatgctctcgtcatattc 44
EpsE 단편 1 F ctacggggtctgacgcagcaagcaaatgggctgggagg 45
R gacaagccatgctttctgccaaagtgcg 46
단편 2 F gaaagcatggcttgtcaagcatgaatag 47
R gataagctgtcaaaccagtgttgtatacattcagcagc 48
Xpf 단편 1 F gatcctctacggttcatccatgtccgaac 49
R tctatgatcctcctcatttttg 50
단편 2 F gaggaggatcatagaaagcttgtcatacgtttgcc 51
R gagttttcgttcggatcctccgctttttgtttg 52
이렇게 제조된 벡터를 B. subtilis 세포로 도입한 후, 37℃(비복제온도)에서 클로람페니콜이 함유된 배지를 이용하여 형질전환체(단일 교차 상동 재조합)를 선별하였다. 선별된 형질전환체를 항생제가 없는 LB 배지로 30℃복제 허용 온도)에서 배양(제2 교차)한 후, 항생제가 없는 LB 한천배지로 39℃에서 배양하였다. 생성된 콜로니를 대상으로 클로람페니콜 감수성을 가지는 균주(plasmid curing)를 선별하였다. 선별된 콜로니를 대상으로 PCR을 수행하여 이중 교차 재조합체(double cross-over recombinant)를 확보하고, 2차 순수 분리를 수행하여 최종 재조합체를 선별하고, GFBS220으로 명명하였다.
GFBS220의 결손 유전자 부위는 표 4에 제시된 프라이머와 PCR을 이용하여 증폭한 후 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 확인하였다. 발현 숙주 GFBS220에서 PCR을 이용하여 결손 유전자를 확인한 결과를 도 2에 나타낸다.
유전자
부위(locus)		 PCR 프라이머(서열번호) B. subtilis
KCTC 3135의 PCR 산물의 크기		 GFBSL210 PCR 산물의 크기
AprE F caaggcttgaaataacgttg (서열 번호 53)
R ttcgctgattacaacattgg (서열 번호 54)		 3115bp 2116bp
NprE F ggaacagatgatagctcatc (서열 번호 55)
R acactccgagaaggctgaag (서열 번호 56)		 3487bp 2145bp
Vpr F ctgcggcctgcacagccgcc (서열 번호 57)
R cgctgaatgacggtggtaag (서열 번호 58)		 3733bp 2293bp
NprB F agtaatcttgtaggaggctg (서열 번호 59)
R cgccaatgaagtgaaggagg (서열 번호 60)		 2666bp 2153bp
Mpr F ggttgaggcgattgcgacgg (서열 번호 61)
R ccattctgcaaaatcagctc (서열 번호 62)		 2734bp 2076bp
spoIIAC F aagatatgaagaaagccggg (서열 번호 63)
R acagccgcttcataagcctg (서열 번호 64)		 2628bp 2102bp
ThrC F tcaagctgtcatgtacggag (서열 번호 65)
R tccgatacgaatggctgtcg (서열 번호 66)		 376bp 5455bp
실시예 1.2. 발현 벡터 pBE1-sodA2의 제작
바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 GF423의 배양 상층액에서 N-말단 시퀀싱(문헌[Kang et al., 2018])을 통해 Mn-SOD를 확인하였다. 상기 GF423 균주는 한국생명공학연구원에 각각 2017년 3월 6일자로 기탁된 것이다(수탁번호 KCTC 13222 BP). 상기 Mn-SOD의 유전자는 박테리아 SOD에 대한 명명법에 따라 sodA로 명명되었고, 그의 아미노산 서열은 도 3 및 서열번호 2를 참조한다(그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1을 참조함). 효소 제조물의 LC-UV-MS/MS 펩티드 매핑은 100% 아미노산 서열 커버리지를 생성했지만, Asn74 및 Asn137 잔기에서 각각 73% 및 17% 존재비로 탈아미드화가 관찰되었다. 따라서, 정제된 효소의 균질성을 개선하기 위해 두 Asn 잔기를 Asp로 치환하였다. SodA2로 명명된 이러한 변이체 sodA의 아미노산 서열은 도 3 및 서열번호 4(그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3을 참조함)를 참조한다.
4개의 프라이머(표 5)와 주형인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 지놈을 사용하는 중복 신장 PCR을 이용하여 sodA2 유전자를 증폭시켰다. Asn의 Asp로의 치환을 위한 뉴클레오티드에는 밑줄이 그어져 있다.
프라이머 서열(5'→3') 서열번호
1 SOD F GGAGGAATTACAATGGCTTACAA 45
2 D74 R TGCATGTCCGCCGCCATCGTTGCGGAC 46
3 D74 F CAGTCCGCAACGATGGCGGCGGACATG 47
4 D137 R TTCAAGTTTGCCGTCGTTTACAACGAGC 48
5 D137 F CTCGTTGTAAACGACGGCAAACTTG 49
6 SOD R CAAAACAGAAGCTTCATTATTTTGCT 50
sodA2 유전자를 포함하는 증폭된 DNA 단편 및 NdeI 및 HindIII 처리에 의해 선형화된 플라스미드 pBE1을 SLIC 방법(문헌[Jeong et al. 2012])으로 시험관내에서 어셈블링하고, 이어서 생성된 작제물을 E. coli C2984H 내로 형질전환시켰다. 제한 효소 매핑으로 정확한 클론을 스크리닝하고, 뉴클레오티드 시퀀싱으로 확인했다. 이렇게 생성된 발현 벡터 pBE1-sodA2는 도 4에 도시되어 있다.
실시예 1.3. 생산 균주 BSBA310의 제조
발현 벡터 pBE1-sodA2를 B. subtilis GFBS220 내로 형질전환시켰다. 형질전환체들로부터 균주를 선택하고, LB2 배지에서 2회의 단일 콜로니 분리 절차에 의해 순수한 클론을 확립하였다. 선택된 균주를 BSBA310으로 명명하고, 글리세롤 스톡법으로 -80℃에서 보관하였다. 이러한 생산 균주 BSBA310에서 PCR을 이용하여 결손 유전자를 확인한 결과를 도 2에 나타낸다. 또한, 생산 균주 BSBA310을 제조하기 위한 전체 절차는 도 5에 요약되어 있다.
실시예 2. 생산 균주 BSBA310으로부터 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SodA2)의 분리 및 정제
실시예 2.1. 생산 균주 BSBA310의 배양
실시예 1에서 얻은 생산 균주 BSBA310의 배양을 위해, LB 한천 배지(LB(Luria-Bertani) 한천; 트립토판 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L, 한천 15 g/L)에서 형성된 단일 콜로니를 LB 배지 30 ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이 종배양액(seed culture)을 다시 1 mM 황산망간(MnSO4)이 포함된 LB 배지 3 L에 접종하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다.
실시예 2.2. SodA2의 분리 및 정제
실시예 2.1에서 얻은 세포 배양액을 4℃ 3,578 x g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 초미세여과(Ultrafiltration, 이하 UF, MWCO 10,000)를 이용하여 10배 농축하였다. 농축된 세포 배양액 1L당 390 g의 황산암모늄을 넣고 20분간 교반을 하고 원심분리를 하고 상등액을 취하였다. 취한 상등액을 페닐세파로스 HP 컬럼을 사용하여 정제를 하였다. 정제 과정은 2M 황산암모늄 농도의 50 mM 인산칼륨 pH 7.0을 사용해서 컬럼을 평형화하였으며, 이후 황산암모늄을 넣고 얻은 상등액을 컬럼에 통과시켰고, 컬럼에 붙은 SodA2를 1.6 M 황산암모늄을 포함한 50 mM 인산칼륨 pH 7.0을 사용해서 회수하였다. 컬럼을 통해 정제를 한 정제액을 모아서 초미세여과를 통해 정제 과정중에 형성된 고농도 염을 제거하며 농축을 하였다. 농축액을 제균 필터로 여과한 후, 동결건조하였다. SodA2의 활성은 SOD 분석 키트(Cayman Chemical, Michigan, USA)를 이용하여 분석하였다. SOD 활성 1 단위(unit)는 수퍼옥시드 라디칼을 50% 억제하는 효소의 양으로 정의된다. 건조된 SodA2 효소의 활성은 1000 내지 1,500 U/mg이었다.
실시예 3. 투여 물질의 제조
경구 투여를 통한 위 내 투여군의 경우, 쉘락(Shellac)(EXCELACS co., LTD., Bangkok)을 3% 에탄올 농도가 되도록 녹이고 0.2 um 무균 필터를 사용해서 제균하였다. 에탄올로 녹인 쉘락을 PBS로 희석하였다. 동결건조한 SodA2를 20 mg/mL로 녹이고, 쉘락 용액과 SOD 용액을 1:1로 섞은 후, 동결건조시켰다. 동결건조된 쉘락 코팅 SodA2에 덱스트린을 사용해서 1:9 내지 12(쉘락 코팅 SodA2 : 덱스트린) 비율로 혼합하여, 동물 시험 시 사용한 물질을 제조하였다. 제조된 SOD 활성은 90 내지 110 U/mg이 되도록 하였다. 위내 투여군의 경우 최종 10 U/mg으로 희석하여 사용하였다
구내 도포군의 경우, SodA2를 2% 메틸셀룰로오스(Sigma) 겔로 현탁하여 사용하였다. 구내 도포군의 SOD 활성은 100 U/mg으로 조절하였다.
실시예 4. 점막염 모델의 제작 및 SodA2의 투여
점막염 모델을 제작하기 위하여 6주령의 Sprague Dawley 랫트(구입처: 오리엔트바이오)를 구입하여 1주일간 순화한 후, 무작위로 8개 군으로 나누었다. 8개 군은 다음과 같다: G1(대조군), G2(질환군), 구강 내 도포군(G3, G4, G5) 및 경구 투여를 통한 위 내 투여군(G6, G7, G8). 점막염 모델의 시험군과 투약 농도 및 동물 수는 표 6을 참조한다. 점막염 유발은 5-플루오로우라실(구입처: Sigma, 100 mg/kg)을 1일차 및 3일차에 2회 복강 투여하였고, 5일차에 케타민(구입처: 유한양행; 40 mg/kg)으로 마취 후, 항암 치료를 받는 환자들의 저작 운동 시 발생하는 만성 자극(chronic irritation)을 유발하기 위해 18 게이지 주사 바늘로 좌측 구강 내 점막에 상처를 내어 기계적 궤양 병변을 유발하였다. 대조군인 G1은 모의 수술(sham operation)을 실시하였다.
시험군 투약 농도 동물
수
mg/kg/day SOD U/kg/day
G1 대조군 비히클 투여 8
G2 질환군 비히클 투여 8
G3 구강 내 도포군(저농도) 1.25 125 8
G4 구강 내 도포군(중농도) 2.5 250 8
G5 구강 내 도포군(고농도) 5 500 8
G6 위 내 투여군(저농도) 25 250 8
G7 위 내 투여군(중농도) 50 500 8
G8 위 내 투여군(고농도) 100 1,000 8
구강 내 도포군은 비히클로 2% 메틸셀룰로오스 겔을 사용하여 시험물질을 현탁하여 조제한 후, 구강 점막 부위에 약물이 모두 도포될 수 있도록 마이크로피펫을 이용하여 100 ul를 도포하였다. 위 내 투여군의 경우, PBS를 비히클로 하여 시험물질을 10 mL/kg 용량으로 경구(Oral gavage) 투여하였다. 투여 기간은 구강 점막염 유발을 위한 기계적 수술 완료 후 정상군의 궤양이 봉합되는 10일 동안 진행되었으며, 1일 1회 오전 10시경에 투여하였다. G1(대조군)과 G2(질환군)에는 비히클만 투여하였다.
실시예 5. 체중 및 사료 섭취량 측정
구강 및 위장 내 점막염 유발에 의한 에너지 흡수 장애를 평가하기 위해 2 내지 3일 간격으로 체중 및 사료 섭취량을 측정하였다. 사료 섭취량의 측정은 전날 케이지에 사료를 급이 하기 전 무게를 측정한 후 다음 날 남아있는 사료량을 측정하여 섭취량을 계산하였으며, 케이지에 있는 개체수로 나누어 평균 사료 섭취량을 계산하였다.
정상군인 G1의 경우 10일 동안 꾸준하게 체중 및 사료 섭취량이 증가하였다. 반면, 점막염이 유발된 G2 내지 G8의 경우 G1에 비해 사료 섭취량이 현저히 떨어졌으며, 체중은 초반에 잠시 증가하였다가 이후 지속적으로 감소하는 양상을 보였다. 한편, 약물 투여군(G3 내지 G8)의 경우 G2에 비해 체중 및 사료 섭취량 증가가 관찰되었으며, 특히 체중은 SodA2의 중, 고농도 투여군인 G5, G7 및 G8에서 통계적으로 유의하게 증가하였고, 사료 섭취량은 SodA2 고농도인 G5 및 G8에서 통계적으로 유의하게 증가하였다. 시험군의 체중 및 사료 섭취량 그래프는 도 6a 및 도 6b에 도시하였다.
실시예 6. 구강 점막염 점수매김 및 조직평가
구강 점막염 점수매김
기계적 궤양 병변 유발 직후부터 궤양 부위를 3 내지 4일 간격으로 관찰하고, 하기의 표 7 기준에 따라 구강 점막염 점수매김을 진행하였다. 점수매김의 기준은 문헌[Araujo et al. PLoS One 2015, 10: e0116799]을 참조한다.
점수 기준
0 건강한 점막 및 침식 또는 혈관 확장의 증거 없음
1 홍반의 존재 및 점막 침식의 증거 없음
2 심한 홍반, 혈관 확장 및 표면 미란
3 점막의 1개 이상의 면에 궤양이 존재하고, 면적의 25% 이하에 영향을 미치며, 심한 홍반 및 혈관 확장.
4 볼 점막 면적의 약 50%에 있는 궤양
5 조직 노출을 불가능하게 만드는 완전히 궤양이 있는 볼 점막
구강 점막염은 기계적 궤양 유발 이후 10일 동안 궤양 부위의 재상피화 정도를 분석하였다. 정상군인 G1의 경우 궤양 부위가 빠르게 회복되어 10일째에는 재상피화는 완료되고 경미한 상처부위 흔적만 확인할 수 있었다. 반면, G2군의 경우 5-FU로 인한 궤양 부위 상피세포 분화가 억제되어 재상피화는 거의 이루어지지 않았으며, 일부 개체의 경우 지속적인 저작 자극으로 인하여 궤양 부위가 더 커지는 양상도 나타났다. 약물 투여 군의 경우, 농도 의존적으로 재상피화가 촉진되어 궤양 부위가 봉합되는 것을 확인하였다(도 7a).
구강 점막염 조직평가
구강 점막이 포함된 조직을 채취하여 10% 포르말린에 고정 후 일반적인 조직 처리 과정을 거쳐 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 슬라이드 글라스를 제작하였다. 이후, 점막염에 의한 병변 부위를 현미경을 이용하여 검경하여 점막염 부위의 재상피화 정도를 평가하고, 구강 점막 상피의 두께를 분석하였다.
G1의 경우, 궤양성 점막염이 유발된 부위 모두 재상피화가 완료되어 있었으며, 점막 하 부위에 육아 조직의 증식으로 인한 조직의 경미한 융기가 관찰되었고, 가벼운 염증소견이 남아 있는 개체들이 일부 있었으나, 대부분 치유가 완료되어 정상 구조물을 보이고 있었다(도 7b의 왼쪽 아래). G2의 경우, 궤양성 점막염이 유발된 부위 모두에서 재상피화는 전혀 일어나지 않았으며, 석회화, 괴사 및 육아 조직의 증식(염증세포 침윤) 등이 관찰되었다. G3 및 G6(SodA2 저농도 투여군)의 경우, G2군과 별다른 차이를 보이지 않았으며 심한 궤양성 점막염 부위가 관찰되었다. 반면, G4, G5, G7 및 G8(SodA2 중, 고농도 투여군)의 경우에는 재상피화가 일어나 궤양의 크기가 감소해 있었고, 점막 하 부위의 염증 및 괴사도 점차 감소하는 양상을 보였다(도 7b). 재상피화 정도를 정량적으로 분석한 결과에서도 앞선 구강 점막염 점수매김 그래프의 양상과 유사하게 정상군인 G1의 경우 재상피화 정도가 현저하게 높았으며, G2의 경우 재상피화는 거의 이루어지지 않았다. 약물 투여군의 경우, 농도의존적으로 재상피화가 촉진되어 SodA2 중, 고농도 투여군인 G4, G5, G7 및 G8에서는 G2에 비해 통계적으로 유의하게 재상피화가 증가하였다(도 7c).
실시예 7. 장 내 점막염 점수매김 및 조직평가
장 내 점막염 점수매김
10일간의 시험기간 동안 1일 1회 항문 주변 및 분변을 육안으로 관찰하여 하기 표 8과 같은 점수매김 평가방법으로 설사 정도를 평가하였다.
점수 기준
0 정상 분변
1 가벼운 설사를 나타내는 약간 젖고 부드러운 분변
2 중등도의 설사를 나타내는 축축하고 형태가 없는 분변
3 심한 설사를 나타내는 묽은 변
G1의 경우 10일간의 시험기간 동안 설사가 발생하지 않았으나, 5-FU 투여 군(G2 내지 G8)의 경우, 약물투여 개시 시점부터 설사를 보였으며, 약물투여 5일 동안 심한 축축한 설사가 유지된 후, 이후 5일 동안 점차 설사가 나아지는 양상을 보였다. 특히, SodA2의 중, 고농도 투여군인 G4, G5, G7 및 G8의 경우 G2에 비해 통계적으로 유의하게 설사 점수가 감소하였다(도 8a).
장 내 점막염 조직평가
장 내 점막이 포함된 조직을 채취하여 10% 포르말린에 고정 후 일반적인 조직 처리 과정을 거쳐 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 슬라이드 글라스를 제작하였다. 이후, 점막염에 의한 병변 부위를 현미경을 이용하여 검경하여 점막염 부위의 장융모 변화를 평가하고, 장 융모 길이를 분석하였다.
G1의 경우 융모(villi)와 융모 움(crypt) 등의 정상적인 소장의 해부조직학적 구조물을 확인할 수 있었다. 반면, G2의 경우 심한 융모의 위축이 특징적으로 관찰되었으며, 이로 인한 흡수 불량으로 설사 및 체중감소가 나타난 것을 알 수 있었다. 약물 투여군(G3 내지 G8)의 경우 융모 위축이 개선되는 양상이 농도 의존적으로 뚜렷하게 나타났으며, 염증세포의 침윤은 경미한 정도로 그룹 간에 차이를 보이는 정도는 아니었다(도 8b). 장 융모 길이를 정량적으로 분석한 결과에서도, G2의 경우 G1에 비해 융모의 위축이 일어나 융모 길이의 감소가 나타났다. 약물 투여군(G3 내지 G8)의 경우 G2에 비해 융모 위축이 개선되는 양상이 농도 의존적으로 뚜렷하게 나타났다. 특히, G5, G7 및 G8의 경우 장 융모 길이가 통계적으로 유의하게 증가함을 알 수 있었다(도 8c).
실시예 8. 구강 및 장 내 점막염의 ROS 평가
소장 내 ROS 평가
부검을 실시하여 장 조직을 채취한 후 장 조직 100 mg을 PBS로 2회 세척하고 단백질 분해 효소 억제제 혼합물을 포함하는 아이스-냉각 50 mM TBS(pH 7.4) 1 mL을 가한 후 비드-균질기를 이용하여 조직을 파쇄하고, 파쇄물을 4℃에서 10분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리하여 상층액을 저장하였다. 조직 파쇄액을 아이스-냉각 로크버퍼(154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 3.6 mM NaHCO3, 2.0 mM CaCl2, 10 mM D-glucose 및 5 mM HEPES, pH 7.4)로 희석하여 최종 농도가 5 mg tissue/mL가 되도록 하였다. 이후, 로크버퍼(pH 7.4), 0.2 mL 파쇄액 및 10 μL DCFH-DA(구입처: Sigma, 5 μM)을 혼합하여 1 mL의 반응 혼합물을 45분 동안 인큐베이션하고, DCF의 형광을 분광형광계(Excitation: 484 nm, Emission: 530 nm)로 측정하였다. 블랭크는 DCFH-DA를 넣지 않은 파쇄액의 배경 형광으로 보정하였다.
소장 조직의 ROS 수준을 DCFH-DA를 통해 분석한 결과, G2의 ROS 수준은 G1에 비해 2배 이상 증가하였다. 약물 투여군의 경우, 구강 내 도포(G3 내지 G5) 및 위 내 투여군(G6 내지 G8) 모두 G2에 비해 농도 의존적으로 감소하는 양상이 관찰되었다(도 9a). 즉, 5-FU로 인한 점막염에서 SodA2의 투여는 구강 내 도포군 및 위 내 투여군 모두에서 농도 의존적으로 ROS 수준을 감소시키는 효과가 확인되었다.
혈중 ROS 평가
혈중 ROS 수준은 루미놀-증폭 화학발광 신호(Luminol-amplified chemiluminescence signal)를 이용하여 측정하였다. 40 μL의 혈장을 96 웰 플레이트에 분주한 뒤 화학발광 스펙트럼 분석기를 이용하여 기준값을 측정하였다. 이후, 96 웰 플레이트에 200 μL의 루미놀(구입처: Sigma, 200 mM, pH 7.4)을 첨가 후 10분 동안 인큐베이션하고 1분 간격으로 발광 값을 측정하여 기준값으로 보정하였다.
혈액내 ROS 수준을 루미놀 발광을 통해 분석한 결과, G2에서의 루미놀 발광은 G1에 비해 약 0.5배 정도 증가하였다. 약물 투여군의 경우, 구강 내 투여(G3 내지 G5) 및 위 내 투여군(G6 내지 G8) 모두 G2에 비해 농도 의존적으로 감소하는 양상이 보였다. 특히, 루미놀 첨가 6분 경과 시점에서 G5, G7 및 G8은 통계적으로 유의하게 감소하였으며, 7분 경과 시점에서는 G5, G7 및 G8, 8분 내지 9분 경과 시점에서는 G5 및 G8, 10분 경과 시점에서는 G8이 통계적으로 유의하게 감소하였다(도 9b).
실시예 9. 통계적 분석
모든 수치 자료는 GraphPad Prism 통계 프로그램(Ver.8.0)을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 먼저, 분산의 동질성을 평가하기 위해 Levene's test를 수행한 후, 일원 분산 분석(one way ANOVA test)를 실시하여 각 시험군간 유의성을 확인하였다. 일원 분산 분석을 수행한 결과, 시험군간 유의성이 확인되면 분산의 동질성 유무에 따라 Tukey 사후검정을 실시하였다. 모든 데이터는 Mean ± SEM로 표시하였고, 신뢰구간은 95%로 설정하였다.
실시예 10. 결론 및 고찰
5-FU 항암제를 복강 투여하여 구강 점막염 및 장 내 점막염을 동시에 유발한 후, SodA2를 10일간 구강 내 도포 및 위내(경구) 투여한 결과 구강 점막의 궤양 부위의 재상피화를 촉진하였고, 설사의 개선 및 장 융모의 위축을 농도 의존적으로 개선하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 또한 점막염이 발생한 장 조직 및 혈액내 ROS 수준을 낮추어 증상이 개선되는 효과가 있는 것도 확인할 수 있었다. 약물의 투여 경로로 인한 차이는 크게 없는 것으로 확인되었다.
결론적으로 SodA2(Bacillus균 유래 SOD 효소)는 항암제 부작용으로 인한 구강 및 장 내 점막염의 억제 및 치료제로서 유용한 소재가 될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> BiomLogic, Inc. GENOFOCUS CO., LTD. <120> SUPEROXIDE DISMUTASE AND USES THEREOF FOR PREVENTING OR TREATING MUCOSITIS <130> KC21556 <160> 72 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 609 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 atggcttaca aacttccaga attgccttac gcttatgatg ctttagaacc tcatatcgat 60 aaggaaacga tgacgattca ccatacgaag caccataaca catacgtgac aaacctcaac 120 aaagcgatcg aaggatctgc gcttgcagag aaatctgtag atgagcttgt tgctgatttg 180 aacgcagtgc cggaggacat ccgcacggca gtccgcaaca atggcggcgg acatgcaaac 240 cactctttat tctggactct tttatctccg aacggcggag gcgaaccgac tggtgagctt 300 gctgaagaga tcaaaagcac gttcggaagc ttcgatcaat ttaaagaaaa attcgccgca 360 gcagctgcag gccgtttcgg ttcaggctgg gcttggctcg ttgtaaacaa cggcaaactt 420 gaaattacaa gcacgccaaa ccaagattca ccgctttcag aaggtaaaac acctgttctc 480 ggtcttgatg tttgggagca tgcgtactac ctgaactacc aaaaccgccg tcctgattac 540 atttcagctt tctggaatgt tgtgaactgg gatgaagttg cccgtcttta cagcgaagca 600 aaataatga 609 <210> 2 <211> 201 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 2 Met 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38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IspA_frgament 1_forward primer <400> 41 ctacggggtc tgacgcagtg ctgcttggca ttcatttc 38 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IspA_frgament 1_reverse primer <400> 42 gccattgaag caatgcctcc gtttgaatc 29 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IspA_frgament 2_forward primer <400> 43 acggaggcat tgcttcaatg gctgcccctc atg 33 <210> 44 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IspA_frgament 2_reverse primer <400> 44 gataagctgt caaaccagtc aatgctctcg tcatattc 38 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EpsE_frgament 1_forward primer <400> 45 ctacggggtc tgacgcagca agcaaatggg ctgggagg 38 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EpsE_frgament 1_reverse primer <400> 46 gacaagccat gctttctgcc aaagtgcg 28 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EpsE_frgament 2_forward primer <400> 47 gaaagcatgg cttgtcaagc 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NprE_PCR primer_forward <400> 55 ggaacagatg atagctcatc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NprE_PCR primer_reverse <400> 56 acactccgag aaggctgaag 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vpr_PCR primer_forward <400> 57 ctgcggcctg cacagccgcc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vpr_PCR primer_reverse <400> 58 cgctgaatga cggtggtaag 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NprB_PCR primer_forward <400> 59 agtaatcttg taggaggctg 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NprB_PCR primer_reverse <400> 60 cgccaatgaa gtgaaggagg 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpr_PCR primer_forward <400> 61 ggttgaggcg attgcgacgg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpr_PCR primer_reverse <400> 62 ccattctgca aaatcagctc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D137_forward primer <400> 71 ctcgttgtaa acgacggcaa acttg 25 <210> 72 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD_reverse primer <400> 72 caaaacagaa gcttcattat tttgct 26

Claims (21)

  1. 바실러스 유래 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효 성분으로 포함하는
    화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하는 암 치료에 의해 유발된 구강 점막염의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 음식물 섭취 장애 감소, 궤양 회복, 재상피화 개선, 및 혈중 반응성 산소종(ROS; Reactive oxygen species) 수준의 감소로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 가져오는
    약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 대상이 방사선 요법을 받기 전, 후 또는 전과 후 모두에 대상에 투여되는
    약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 대상이 화학요법을 받기 전, 후 또는 전과 후 모두에 대상에 투여되는
    약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 항암 치료를 받는 대상에 투여되는
    약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 화학요법에 사용되는 항암제는 세포독성 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는
    약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 바실러스 유래 Mn-SOD인
    약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는,
    약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 균주(KCTC 13222 BP)로부터 유래된 것인
    약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 단리 또는 정제된 효소인
    약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 균주 용해물(lysate), 균주 배양물, 균주 배양 농축액, 균주 배양 추출물 또는 그의 건조 형태로 포함되는
    약학 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 구강 내 도포되거나 경구 투여되는
    약학 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 대상의 중량을 기준으로 50 units/kg/day 내지 2500 units/kg/day의 용량으로 투여 또는 적용하기 위한
    약학 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 SOD는 대상의 중량을 기준으로 125 units/kg/day 내지 1000 units/kg/day의 용량으로 투여 또는 적용하기 위한
    약학 조성물.
  17. 바실러스 유래 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효 성분으로 포함하는
    화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하는 암 치료에 의해 유발된 구강 점막염의 치료 또는 예방을 위한 수의학적 조성물.
  18. 바실러스 유래 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효 성분으로 포함하는
    화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하는 암 치료에 의해 유발된 구강 점막염의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
  19. 제1항 및 제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 상기 조성물의 복약 또는 투여 지침을 포함하는 지시서를 포함하는
    화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하는 암 치료에 의해 유발된 구강 점막염의 치료 또는 예방을 위한 키트.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 지시서는 방사선요법 및/또는 화학요법과의 병용, 또는 항암제와의 병용을 지시하는 내용을 포함하는
    키트.
  21. 제1항 및 제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물 또는 바실러스 유래 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 인간을 제외한 대상에 투여하는 단계를 포함하는
    화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하는 암 치료에 의해 유발된 구강 점막염을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013083695A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Apeiron Biologics Ag Compositions for preventing or treating adverse reactions of egfr inhibition
KR20200027624A (ko) * 2018-09-04 2020-03-13 주식회사 제노포커스 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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