ES2842748T3 - Escherichia coli patogénica atenuada o inactivada para el tratamiento del cáncer urogenital - Google Patents

Abstract

Una cepa de E. coli patógena inactivada para su uso en el tratamiento del cáncer de vejiga, en donde dicha cepa de E. coli debe administrarse por vía intravesicular.

Description

DESCRIPCIÓN

Escherichia coli patogénica atenuada o inactivada para el tratamiento del cáncer urogenital

[0001] La presente descripción se refiere a bacterias patógenas inactivadas o atenuadas, composiciones que comprenden las bacterias, y el uso de las mismas para el tratamiento de cánceres tales como cánceres urinarios y de próstata.

[0002] El cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común en los hombres, tanto en Europa como en EE.UU. Las altas y crecientes tasas de incidencia en pacientes mayores de 65 años sugieren que la carga de este cáncer aumentará con el envejecimiento de la población.

[0003] El uso de bacterias para mejorar la inmunidad y tratar el cáncer fue iniciado en 1891 por William Coley, quien trató con éxito los sarcomas con extractos de bacterias piógenas (Coley, WB 1910, Proc R Soc Med. 3, 1-48).

[0004] La vacuna Bacillus Calmette-Guerin (BCG) de Mycobacterium bovis es un tratamiento estándar para el cáncer de vejiga superficial junto con la quimioterapia. La eliminación del tumor inducida por BCG implica una respuesta inmune local con liberación masiva de citocinas y una respuesta inmune de tipo retardado predominantemente a través de células Th1.

[0005] Las células asesinas naturales (NK) son células del sistema inmune innato que matan células tumorales e infectadas con virus. La destrucción de las células NK está mediada principalmente por los Receptores Citotóxicos Naturales (RCN) que reconocen los ligandos presentes en la superficie de las células diana. Los niveles de expresión de los ligandos de RCN en tumores de vejiga pueden predecir la eficacia del tratamiento con BCG sobre el cáncer de vejiga en humanos (Yutkin et al. J Urol 178, 2660-2664). En un modelo murino, se encontró que el tratamiento exitoso con BCG del tumor de vejiga dependía de las células NK y era completamente ineficaz en ratones deficientes en NK (Brandau y col., Int J Cancer 2001, 92, 697-702). La terapia con BCG para el cáncer de vejiga no invasivo del músculo reduce el riesgo de recurrencia en un 32% y las probabilidades de progresión del tumor en un 27%. Sin embargo, la inmunoterapia con BCG se ve muy obstaculizada por su toxicidad y las reacciones adversas graves que provoca la interrupción del tratamiento en el 10-58% de los pacientes. Aunque atenuado, BCG sigue siendo un microbio virulento y su inoculación en la vejiga del paciente a menudo conduce a infecciones graves que amenazan la vida. BCG puede infectar los pulmones, el hígado, los huesos y el sistema circulatorio. Esta infección es difícil de tratar debido a la lenta respuesta del BCG a los antibióticos. Además, BCG es un microbio tedioso (de alto mantenimiento) de crecimiento lento (tiempo de duplicación de 23 h).

[0006] La infección del tracto urinario (ITU), causada por patógenos urinarios de Escherichia coli (UPEC) es una enfermedad muy común y aproximadamente el 50% de las mujeres tendrán por lo menos un episodio de UTI en algún momento de sus vidas. Las células asesinas naturales (NK) reconocen varios patógenos, sin embargo, su participación en la UTI mediada por UPEC es prácticamente desconocida. Últimamente, los inventores de la presente invención demostraron que las UPEC se adhieren a las células NK principalmente a través de sus fimbrias de tipo I y destruyen las células NK mediante la toxina hemolisinaA. En ausencia de hemolisinaA, las células NK responden directamente a las bacterias y secretan TNF-a, lo que da como resultado una reducción de la carga bacteriana en las vejigas infectadas (Gur et al., 2013. Cell Host Microbe 14, 664-674).

[0007] El documento WO 2005/120560 describe métodos para tratar cánceres de un órgano, tejido o célula específicos en un sujeto mediante la administración de un antígeno de una o más especies bacterianas patógenas que son patógenas en el órgano, tejido o célula específicos.

[0008] La patente EP. 1765391 describe una preparación de bacterias muertas de una o más especies bacterianas patógenas, o un extracto de pared celular, un extracto de membrana celular, un extracto de célula completa o un antígeno aislado del mismo para su uso en el tratamiento de un cáncer en un órgano o tejido específico en un sujeto.

[0009] Radford et al. (Gene Therapy, 2002, 9: 1455-1463) describe que la inmunización de ratones por inyección directa de E. coli recombinante que expresa listeriolisina O (antígeno tumoral) y ovoalbúmina (OVA)proporciona una respuesta antitumoral, lo que da como resultado una protección completa de 75% de ratones que se expusieron a la línea celular de melanoma que expresa OVA (B16-OVA).

[0010] Existe una necesidad insatisfecha de métodos adicionales con una mayor eficacia para el tratamiento del cáncer, que tienen menos o ningún efecto secundario.

[0011] La presente invención se refiere a las realizaciones tal como se definen en las reivindicaciones. La presente invención se dirige a una cepa de E. coli inactivada para su uso en el tratamiento del cáncer de vejiga, en donde dicha cepa de E. coli se administra por vía intravesicular. La presente divulgación en algunas realizaciones proporciona cepas bacterianas deficientes en hemolisina mutadas derivadas de Escherichia coli patógena urinaria y composiciones que las comprenden para tratar el cáncer. Se proporciona además en el presente documento una E. coli patógena urinaria inactivada para el tratamiento del cáncer. En particular, las bacterias descritas en este documento son útiles para atenuar o inhibir el crecimiento tumoral e incluso inducir la regresión tumoral. La presente divulgación proporciona además métodos para tratar el cáncer que comprenden la administración de E. coli patógena mutada o inactivada directamente al sitio del tumor.

[0012] La presente invención se basa en parte en el descubrimiento inesperado de que el tratamiento de ratones portadores de tumor de vejiga con hemolisina mutado de cepas E. coli mejora significativamente la supervivencia de los ratones. Además, las cepas bacterianas patógenas de E. coli que fueron inactivadas por formaldehído mostraron una actividad anti-cáncer de vejiga muy potente. Además, las cepas bacterianas de E. coli, cuando se administraron directamente en la vejiga, mostraron una actividad anticancerígena muy superior en comparación con Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) y Helicobacter pylori. Ahora se describe que el tratamiento con bacterias de acuerdo con los principios de la divulgación redujo notablemente la carga tumoral en ratones con cáncer de vejiga. Inesperadamente, aunque los tratamientos comenzaron después de que los ratones ya tenían tumores visibles, los tumores retrocedieron y, sorprendentemente, la mayoría de los tumores se eliminaron en varias semanas.

[0013] Sin desear quedar ligado por ninguna teoría particular o mecanismo de acción, el efecto anti-cáncer de las bacterias deficientes en hemolisina puede ser debido a la disminución de la citotoxicidad hacia las células NK. Escherichia coli patógena urinaria, cuando se inocula en la vejiga, recluta células asesinas naturales en la vejiga, se adhieren a las células NK y las destruyen. Cuando se administran en la vejiga, las bacterias deficientes en hemolisina de la invención reclutan las células NK (y las células T) hacia la vejiga pero no matan, o matan con menos eficacia, las células NK. Ahora se describe por primera vez que una mutación en el gen de hemolisina hlyA es suficiente para provocar una actividad anticancerígena mejorada de E. coli uropatógena (UPEC) que alberga la mutación.

[0014] Se describe en el presente documento que las cepas de E. coli uropatógeno (UPEC), y E. coli enteropatógeno (EPEC) inactivados por formaldehído, muestran una actividad anti-cáncer de vejiga altamente potente. Inesperadamente, las UPEC y EPEC inactivadas con formaldehído tuvieron un efecto anticancerígeno muy eficaz en ratones que tenían tumores visibles y grandes. La tasa de supervivencia de estos ratones fue notablemente alta.

[0015] La presente descripción proporciona además métodos ventajosos de tratamiento del cáncer que comprende administración intravesicular de bacterias. La actividad terapéutica de la bacteria fue muy potente cuando se administró directamente en la vejiga de modelos de ratón de cáncer de vejiga.

[0016] De acuerdo con un aspecto, la presente descripción proporciona una cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutante derivada de una cepa patógena de E. coli o componente de la misma para uso en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario.

[0017] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana deficiente en hemolisina es una cepa mutada urinaria o enteropatógena de E. coli. Según determinadas realizaciones, la cepa bacteriana mutada se deriva de E. coli uropatógena (UPEC). Según otras realizaciones, la cepa bacteriana mutada se deriva de E. coli enteropatógena (EPEC).

[0018] De acuerdo con algunas realizaciones, la cepa bacteriana de E. coli deficiente en hemolisina mutante tal como se define en las reivindicaciones es para uso en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario por la administración intravesicular. Según realizaciones ejemplares, la cepa bacteriana deficiente en hemolisina es para administración local en o en las proximidades del sitio del cáncer.

[0019] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana mutada tiene una mutación en el gen hly.

[0020] De acuerdo con algunas realizaciones, el gen hly se selecciona del grupo que consiste en: hlyA, hlyC, y hlyD. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención.

[0021] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutante tiene una cantidad reducida de hemolisina por al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% en comparación con el tipo salvaje. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención.

[0022] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutante tiene hemolisina, al haber reducido la actividad de por lo menos 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% en comparación con el tipo silvestre. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención.

[0023] De acuerdo con algunas formas de realización, se atenúa la cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutante.

[0024] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una cepa CFT073 de Escherichia coli uropatogénica inactivada o componente de la misma para uso en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario. Según algunas realizaciones, el tratamiento comprende la administración intravesicular.

[0025] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona una cepa bacteriana patógena inactivada de E. coli para su uso en el tratamiento de cáncer de vejiga mediante la administración intravesicular. Según realizaciones ejemplares, la cepa bacteriana patógena inactivada es para administración local en o en las proximidades del sitio del cáncer.

[0026] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana patógena inactivada es uropatógenos E. coli (UPEC). Según otras realizaciones, la cepa bacteriana patógena inactivada es E. coli enteropatógena (EPEC).

[0027] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una cepa bacteriana de E. coli para su uso en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario, en donde la cepa bacteriana tiene fimbria de tipo I, la cepa bacteriana se selecciona entre el grupo que consiste en: (i) una cepa bacteriana mutante deficiente en hemolisina derivada de una cepa patógena de E. coli; (ii) una UPEC inactivada; y (iii) una EPEC inactivada. Cada posibilidad representa una realización separada.

[0028] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa de UPEC es CFT073.

[0029] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una cepa bacteriana de E. coli para su uso en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario, en donde la cepa bacteriana sobreexpresa fimbria de tipo I.

[0030] La presente invención proporciona una cepa bacteriana de E. coli para su uso en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario, en donde la cepa bacteriana sobreexpresa fimbria de tipo I, la cepa bacteriana se selecciona del grupo que consiste en: (i) una cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutante derivada de una cepa patógena de E. coli; (ii) una UPEC inactivada; y (iii) una EPEC inactivada; y en donde la cepa bacteriana se va a administrar por vía intravesicular. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención.

[0031] De acuerdo con algunas realizaciones, el cáncer del sistema genitourinario se selecciona del grupo que consiste de: cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de riñón y cáncer de la uretra. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención. Según ciertas realizaciones, el cáncer del sistema genitourinario es un cáncer de vejiga. Según realizaciones ejemplares adicionales, el cáncer es un carcinoma urotelial de vejiga no invasivo de músculo.

[0032] El componente bacteriano puede seleccionarse de entre el grupo constituido por una proteína, una membrana y una fracción de pared celular. Cada posibilidad representa una realización separada de la divulgación. Según ciertas realizaciones de la divulgación, el componente es fimbria de tipo 1. Según otras realizaciones de la divulgación, el componente comprende Lipopolisacáridos (LPS).

[0033] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana tiene fimbria de tipo I.

[0034] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana o un componente de la misma es para el uso en combinación con un agente anticancerígeno.

[0035] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana o un componente de la misma es para el uso en combinación con otro tipo de cepa bacteriana patógena en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario.

[0036] La cepa bacteriana se puede administrar per se o como una composición que comprende la bacteria. Según algunas realizaciones, la cepa bacteriana es para administración semanal. Según ciertas realizaciones, la cepa bacteriana es para administración semanal en una forma de dosificación unitaria que comprende de 107 a 1012 células bacterianas. Según ciertas realizaciones, la cepa bacteriana es para administración semanal en una forma de dosificación unitaria que comprende de 107 a 1012 durante un período de al menos 2 semanas.

[0037] La presente divulgación proporciona además una cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutante derivada de Escherichia coli uropatógena (UPEC), siendo un mutante de Escherichia coli CFT073, en donde el mutante tiene una inserción en el gen de la toxina de hemolisina, y en donde el mutante se selecciona del grupo que consiste en: C93 que tiene una inserción en el gen hlyA, E49 que tiene una inserción en hlyC y D57 que tiene una inserción en hylD. Según algunas realizaciones, la cepa bacteriana mutante es C93 que tiene una inserción en el gen hlyA.

[0038] Aquí se incluye una composición farmacéutica que comprende la cepa bacteriana y un vehículo farmacéutico aceptable.

[0039] La composición farmacéutica puede formularse para la administración intravesicular.

[0040] Además se proporciona en este documento un método de tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario, comprendiendo el método administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutante derivada de una cepa patógena de cepa bacteriana de E. coli o componente de la misma.

[0041] Se proporciona además en el presente documento un método de tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario, comprendiendo el método administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cepa Escherichia coli uropatogénica inactivada o componente de la misma. Según algunas realizaciones, la cepa inactivada es CFT073. Según realizaciones particulares, la inactivación se realiza mediante formaldehído.

[0042] Se proporcionan además en el presente documento un método de tratamiento de cáncer de vejiga, comprendiendo el método intravesicularmente administrar a un sujeto en necesidad del mismo una E. coli patógena inactivada. Según algunas realizaciones, la E. coli inactivada administrada tiene fimbria de tipo I.

Las Figuras 1A-1D muestran el efecto de UPEC C93 deficiente en hemolisina sobre la supervivencia de modelos de ratón de cáncer de vejiga.

La Figura 1A es una comparación entre el tratamiento con células C93 y el tratamiento con células de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG), con o sin anticuerpos anti-NK NK1,1. El porcentaje de supervivencia de los ratones durante el experimento es el indicado. Se utilizó PBS como control.

Las Figuras 1B-1D muestran el efecto de UPEC C93 deficiente en hemolisina sobre el tamaño del tumor. Se indujo carcinoma de vejiga en ratones C57BL utilizando células tumorales de carcinoma de vejiga MB49 transfectadas de forma estable con el gen de luciferasa (luc) (MB49- luc). Los ratones se trataron con BCG, mutante C93 inactivado con hemolisina UPEC o con PBS (control negativo) los días 3, 10, 17 y 24 después de la inoculación del tumor. El volumen y la diseminación del tumor se determinaron los días 14 (figura 1B), 21 (figura 1C) y 27 (figura 1D) en animales anestesiados mediante formación de imágenes en tiempo real de la expresión de luciferasa. Las flechas indican tumores visibles.

La Figura 2 muestra el efecto de UPEC de tipo salvaje inactivado con formaldehído (CFT073) sobre la supervivencia de modelos de ratón de carcinoma de vejiga. Se indujo carcinoma de vejiga en ratones C57BL usando células tumorales de carcinoma de vejiga MB49. Diez días después, los ratones se trataron con 108 células de UPEC CFT073 de tipo salvaje inactivadas con formaldehído. Los tratamientos semanales se continuaron durante 30 días (las flechas indican el día de tratamiento). Se utilizó PBS como control negativo.

Las Figuras 3A-3B muestran el efecto de los tratamientos C93 o UPEC inactivados con formaldehído sobre la morfología de la vejiga en modelos de ratón de carcinoma de vejiga. Se indujo carcinoma de vejiga en ratones C57BL usando células tumorales de carcinoma de vejiga MB49. Los ratones tratados con PBS (control negativo), con mutante de UPEC C93 inactivado con formaldehído (Figura 3A), o con UPEC de tipo salvaje inactivado con formaldehído (CFT073) (Figura 3B). El día 56 después de la inoculación del tumor, se recogieron vejigas de los ratones supervivientes y se fotografiaron.

La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento con UPEC inactivado con formaldehído (CFT073 FA), E. coli enteropatógeno (EPEC FA) o Helicobacter pylori (HP FA) sobre la supervivencia de modelos de ratón de carcinoma de vejiga. Se utilizó PBS como control negativo.

La Figura 5 muestra el efecto de UPEC y Helicobacter pylori inactivados con formaldehído sobre el reclutamiento local de células inmunes. Se inocularon 108 de UPEC inactivado con formaldehído o Helicobacter pylori en la vejiga de ratones. Los ratones se sacrificaron 2 días después y las células NK y T se cuantificaron mediante citometría de flujo.

La Figura 6 muestra cantidades relativas de citocinas/quimiocinas en vejigas de modelos de ratón de carcinoma de vejiga que se trataron con diferentes cepas de bacterias. Se inocularon 1x108 células de UPEC CFT073 inactivadas con formaldehído (FA), E. coli XL1 blue (cepa de laboratorio de E. coli), Helicobaterpylori o BCG en las vejigas de cada ratón. Se utilizó una matriz comercial estándar para cuantificar las cantidades relativas de citocinas/quimiocinas.

La Figura 7 muestra el efecto de los tratamientos de UPEC inactivado con formaldehído (CFT073 FA), C93 inactivado con formaldehído (C93 FA), UPEC inactivado por calor (CFT073 HI) o C93 inactivado por calor (C93 HI) sobre la supervivencia de modelos de ratón de carcinoma de vejiga. El porcentaje de supervivencia después de la inducción del carcinoma de células de transición (TCC) es el indicado. Se utilizó PBS como control negativo.

La Figura 8 muestra el efecto de la vía de administración sobre el reclutamiento de células inmunes. Los ratones se inocularon por vía intravesicular o subcutánea con 108 UPEC CFT073 inactivado con formaldehído (n=5 por grupo). Después de 48 horas, se recolectaron las vejigas y se extrajeron los linfocitos de sangre periférica (p Bl ) de las vejigas y se analizaron mediante citometría celular.

[0043] La presente divulgación proporciona cepas bacterianas patógenas inactivadas y uso de los mismos para el tratamiento de cánceres urogenitales. La presente divulgación describe además métodos para tratar cánceres del sistema genitourinario usando una cepa bacteriana mutada deficiente en hemolisina. Además, se proporcionan métodos para tratar el cáncer que comprenden la etapa de administrar directamente una cepa bacteriana patógena mutada o inactivada a la cepa del sitio del cáncer.

[0044] Los métodos de la presente descripción son ventajosos con respecto a métodos conocidos previamente para el uso de bacterias en que su capacidad de deprimir células del sistema inmune se reduce o neutraliza. Las bacterias de la divulgación sirven como agentes potentes y efectivos que reclutan al sistema inmunológico contra las células cancerosas. Las bacterias de la divulgación pueden servir como terapia universal para pacientes con cáncer de vejiga. La terapia no depende del sistema inmunológico adaptativo, lo que requiere una exposición temprana a las bacterias. Sin desear limitarse a ninguna teoría con respecto al mecanismo de acción, las bacterias de la divulgación actúan localmente y reclutan células inmunes y/o proteínas relacionadas con el sistema inmunitario en el sitio del cáncer. Además, las bacterias de la divulgación, cuando se administran por vía intravesicular a ratones, no activan necesariamente una respuesta inmunitaria sistémica, por lo que tienen efectos secundarios mínimos. Además, las bacterias de la divulgación demostraron ser eficaces cuando las bacterias se inactivan. En general, las cepas bacterianas descritas en este documento parecen muy prometedoras como medicación eficaz para tratar una variedad de cánceres sin provocar efectos secundarios no deseados.

[0045] Los inventores de la presente solicitud han demostrado que Escherichia coli patógenas urinarias se adhieren a células asesinas naturales humanas y murinas (NK) y principalmente a través de sus fimbrias de tipo I y matan las células NK a través de su toxina hemolysinA. Se prepararon tres cepas de E. coli patógena urinaria, mutadas en el operón de hemolisina A y denominadas 'C93' (mutadas en hlyA), 'E49' (mutadas en hlyC) y 'D57' (mutadas en hlyD). Se descubrió que la cepa de E. coli mutada C93 mejora la supervivencia de modelos de ratón de cáncer de vejiga. El gen hlyA codifica la proteína estructural de la toxina hemolisinaA. En algunas formas de realización, el número de acceso hlyA es AE014075,1. La hlyC codifica la lisina aciltransferasa que activa la hemolisina y, en algunas realizaciones, la hlyC Gen ID: 1789689. La hlyD codifica la proteína translocadora de hemolisina. Según algunas realizaciones, la hemolisina es la toxina hemolisinaA.

[0046] El término "deficiente en hemolisina" se refiere a una bacteria que carece por completo de la hemolisina o tiene una cantidad reducida de hemolisina por al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en comparación con la cepa bacteriana de tipo salvaje. El término "deficiente en hemolisina" se refiere además a una forma mutada o funcionalmente inactiva de la hemolisina, en donde la forma mutada tiene una actividad reducida en al menos un 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% en comparación con la forma de tipo salvaje. La forma de tipo salvaje de la cepa bacteriana tiene hemolisina activa.

[0047] El término "cepa bacteriana patógena" se refiere a cualquier cepa bacteriana que puede causar infección.

[0048] Los términos "patógenos urinarios" y "uropatógenos" se usan aquí de forma intercambiable.

[0049] El término "componente cepa bacteriana" se refiere a un componente de la cepa bacteriana que es capaz de exhibir una actividad anti-cáncer en una manera similar a la cepa bacteriana. Los ejemplos no limitantes del componente son proteína, membrana y fracción de pared celular. Según algunas realizaciones, el componente bacteriano es un componente inmunoestimulador.

[0050] De acuerdo con ciertas realizaciones, el componente es fimbria de tipo I. Las fimbrias de tipo 1 son orgánulos de adhesión expresados por muchas bacterias gramnegativas. Facilitan la adherencia a las superficies mucosas, en particular a la superficie de la vejiga, y a las células inflamatorias, y contribuyen a la patogenia de E. coli en el tracto urinario.

[0051] El término "tiene fimbria de tipo I" se refiere a una cepa bacteriana que tiene una fimbria activa o en funcionamiento de tipo I.

[0052] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana es una cepa mutante que sobreexpresa fimbria de tipo I. Como se usa en este documento, el término "sobreexpresa" se refiere a una bacteria que está genéticamente modificada para producir fimbria de tipo I en una cantidad que es mayor que la cantidad que se produce en una bacteria no modificada. La sobreexpresión se puede lograr mutando la proteína para producir una forma más activa o una forma que sea resistente a la inhibición, eliminando inhibidores o añadiendo activadores, y similares. La sobreexpresión también se puede lograr eliminando represores, agregando múltiples copias del gen a la célula o regulando positivamente el gen endógeno y similares. La sobreexpresión de fimbria de tipo I puede producirse como se describe en Chelsea Lane et al. (Journal Of Bacteriology, 2007, Vol. 189, N° 15. p. 5523-5533).

[0053] Según cierta realización, el componente incluye lipopolisacáridos (LPS). Los lipopolisacáridos, también conocidos como lipoglicanos y endotoxinas, son moléculas grandes que consisten en un lípido y un polisacárido compuesto por antígeno O, núcleo externo y núcleo interno unidos por un enlace covalente.

[0054] Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado.

[0055] Los términos "cáncer urogenital" y "cáncer del sistema genitourinario" se usan aquí de forma intercambiable y se refieren a cualquier tipo de cáncer del sistema genital o urinario. Los ejemplos no limitantes incluyen cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de uretra y cáncer de próstata.

[0056] Tal como se utiliza aquí, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal, tal como un mamífero como un perro, gato, ganado, y preferiblemente un humano.

[0057] Se pretende que el término "tratar" un sujeto para una enfermedad, como se usa en el presente documento, abarca el curado, así como mejora al menos un síntoma de la enfermedad.

[0058] Los términos "instilación intravesicular" o "intravesical" se usan aquí de forma intercambiable y se refieren a una terapia de método, en donde el fármaco se inserta directamente a la vejiga, de preferencia por catéter.

[0059] El término "mutante" tal como se utiliza aquí se refiere a las bacterias tal como se definen en las reivindicaciones para el uso como se define en las reivindicaciones, en donde las bacterias se han mutado una o más veces, por ejemplo, uno o más de los genes hly o cualquier otro gen que participe en la vía de síntesis o expresión de hemolisina.

[0060] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana es atenuada o inactivada.

[0061] De acuerdo con algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona bacterias patógenas atenuadas. El término "atenuado", como se usa en este documento, describe la disminución en la capacidad de las bacterias para causar enfermedades en un animal como entero, por ejemplo, medido por la LD⁵⁰ de las bacterias. Más específicamente, las características patogénicas de la cepa de bacterias atenuadas se han reducido en comparación con las bacterias de tipo salvaje, aunque las bacterias atenuadas son capaces de crecer y mantenerse en cultivo. Una cepa atenuada de bacterias de acuerdo con la presente divulgación es, por lo tanto, una que no mata al animal al que se administra, o es una que mata al animal solo cuando el número de bacterias administradas es mucho mayor que el número de bacterias no atenuadas de tipo silvestre que serían necesarias para matar al mismo animal.

[0062] Según otras realizaciones, están inactivadas las bacterias tal como se define en las reivindicaciones para el uso como se define en las reivindicaciones. El término cepa bacteriana inactivada designa bacterias "no vivas" o "muertas".

[0063] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana se inactiva por exposición a un compuesto fijador. Según algunas realizaciones, la cepa bacteriana se inactiva mediante un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: formaldehído, paraformaldehído, glutaraldehído y derivados de los mismos. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención.

[0064] Sin limitarse por ninguna teoría o mecanismo, se especula que la inactivación de formaldehído es superior a otros métodos de inactivación en preservación de la función de fimbria de tipo I. Se especula que la fimbria de tipo I permite que la cepa bacteriana se adhiera a la pared de la vejiga y no se lave.

[0065] Bacterias deficientes en hemolisina pueden ser generadas por cualquier método tal como se conoce en la técnica. En el presente documento se describe una diversa variedad de diferentes mecanismos para generar tales bacterias. Según algunas realizaciones, los genes que participan en la síntesis de hemolisina están mutados. Según realizaciones ejemplares, los genes se mutan para reducir o eliminar su expresión. Según realizaciones adicionales, la función de la hemolisina se altera proporcionando inhibidores.

[0066] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana deficiente en hemolisina es una cepa bacteriana mutada. El término "mutante", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos, ADN o ARN que difiere de la secuencia de tipo salvaje. Los mutantes incluyen la inserción, deleción y/o sustitución de nucleótidos en el ADN de la cepa bacteriana, con la condición de que el/los mutante/s afecte(n) a la expresión y/o actividad de la hemolisina. El término "mutante" también se refiere a cualquier modificación de ADN o proteína que afecte a la expresión y/o actividad de la hemolisina.

[0067] El término "mutación de inserción" se refiere a la adición de uno o más pares de bases de nucleótidos en una secuencia de ADN.

[0068] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana tiene una mutación por deleción. Se prefiere que las mutaciones en los genes descritos anteriormente se introduzcan como deleciones, ya que esto evitará las mutaciones de reversión y mejorará la seguridad de las cepas que las contienen. Se prefiere usar una mutación sin cicatriz, que se refiere a una mutación que deja una secuencia exógena mínima ("cicatriz"). En particular, es importante eliminar el marcador de resistencia utilizado para la eliminación.

[0069] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana deficiente en hemolisina es un mutante UPEC estable borrado por hemolisina-A (AhlyA).

[0070] De acuerdo con ciertas realizaciones, las bacterias deficientes en hemolisina tienen sólo un único tipo de mutación hly, como se ha descrito anteriormente. En otras realizaciones más, las bacterias tienen dos o más mutaciones hly específicas.

[0071] La cepa bacteriana deficiente en hemolisina puede tener mutaciones atenuantes que mejoran su seguridad y aptitud para el tratamiento humano. Los genes aro son necesarios en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos y el corismato intermedio metabólico. Las mutaciones en los genes aro se están atenuando porque los mutantes no pueden sintetizar el corismato, que a su vez es necesario para sintetizar el folato (no producido por los mamíferos), el principal donante de metilo en muchas reacciones biosintéticas. El corismato también es necesario para la síntesis de enterobactina, una proteína involucrada en la adquisición in vivo de hierro. OmpF y OmpC son porinas de la membrana externa que median la osmorregulación en E. coli. Escherichia coli enterotoxigénica viva (ETEC) atenuada por deleciones de los genes que codifican aroC, ompC y ompF, y los genes de las enterotoxinas enterotoxina termolábil (LT), enterotoxina termoestable (ST) y enterotoxina termoestable 1 (EAST), se utiliza como una vacuna oral disponible comercialmente conocida como ACAM2017 (Acambis plc, Cambridge, Reino Unido) que recientemente se demostró que es segura para su uso incluso en humanos infectados por el VIH. Por tanto, sería útil atenuar las bacterias mutando los genes descritos anteriormente. Según algunas realizaciones, la cepa bacteriana deficiente en hemolisina se muta adicionalmente en al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes aroC, ompC y ompF. Cada posibilidad representa una realización separada.

[0072] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutada involucrada en infección de la vejiga o componente de la misma para uso en el tratamiento de un cáncer del sistema urinario.

[0073] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una cepa E. coli deficiente en hemolisina o componente de la misma para uso en el tratamiento de un cáncer del sistema urinario o cáncer de próstata. Según algunas realizaciones, la cepa de E. coli deficiente en hemolisina o un componente de la misma se utiliza en el tratamiento del cáncer de vejiga.

[0074] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una E. coli uropatogénica inactivada (UPEC) para uso en el tratamiento de un cáncer del sistema urogenital.

[0075] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una E. coli enteropatógena inactivada para su uso en el tratamiento de un cáncer del sistema urogenital.

[0076] Según otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para tratar un cáncer del sistema urogenital en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar directamente a la vejiga de dicho sujeto una cepa bacteriana deficiente en hemolisina mutante o componente de la misma. Según algunas realizaciones, la cepa bacteriana es E. coli. Según determinadas formas de realización, la cepa bacteriana es UPEC. Según otras realizaciones, la cepa bacteriana es EPEC.

[0077] De acuerdo con algunas realizaciones, la cepa bacteriana exhibe al menos una actividad biológica seleccionada entre el grupo constituido por: la estimulación de la actividad antitumoral citolítica de los linfocitos y/o células NK; reclutar células T y neutrófilos; estimular la proliferación de células NK; e inducir la regresión de tumores establecidos y/o de tumores sólidos primarios. Cada posibilidad representa una realización separada.

[0078] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método de tratamiento de un cáncer de vejiga, el método que comprende administrar directamente a la vejiga de un sujeto en necesidad del mismo una cepa inactivada de Escherichia coli CFT073 o componente de la misma. Según algunas realizaciones, el método comprende una administración local en el sitio del cáncer o en sus proximidades.

[0079] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para tratar un cáncer del sistema urogenital en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administración de una cepa bacteriana de E. coli, dicha cepa bacteriana sobreexpresa fimbria de tipo I.

[0080] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una cepa bacteriana patógena de E. coli para su uso en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario, en donde la cepa bacteriana sobreexpresa fimbria de tipo I.

[0081] De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una cepa bacteriana patógena de E. coli para su uso en el tratamiento de un cáncer de vejiga, en donde la cepa bacteriana sobreexpresa la fimbria de tipo I.

[0082] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana se inactiva. Según determinadas formas de realización, la cepa bacteriana se inactiva con formaldehído.

Administración

[0083] Las bacterias de la descripción se pueden administrar usando cualquier práctica conocida. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana se administra al paciente por vía parenteral. Según algunas realizaciones, la administración parenteral es la administración intravesicular, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, bucal, transdérmica, intradérmica, intraviteral o subcutánea. Cada posibilidad representa una realización separada.

[0084] De acuerdo con ejemplos de realización, la cepa bacteriana como se define en las reivindicaciones para el uso como se define en las reivindicaciones se administra intravesicularmente. En determinadas formas de realización, la cepa bacteriana se administra directamente o junto al sitio del cáncer.

Composiciones farmacéuticas

[0085] La presente descripción proporciona en algunas realizaciones las composiciones farmacéuticas que comprenden la cepa bacteriana o componente de la misma y un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente o diluyente.

[0086] El término "composición farmacéutica", como se usa en el presente documento se refiere a cualquier composición que comprende al menos un ingrediente farmacéuticamente activo, formulado de tal manera que facilita la accesibilidad del ingrediente activo al órgano diana.

[0087] Las composiciones de la descripción pueden incluir el conjunto de bacterias, o pueden incluir extractos y/o componentes tales como extractos de la pared celular o membrana celular que exhibe la actividad contra el cáncer de acuerdo con la divulgación.

[0088] Las composiciones de la divulgación se pueden administrar solos o en combinación con otros compuestos, y en la presente de un adyuvante, tampón o vehículo. El tampón o vehículo incluye, pero no se limita a agua para inyección o solución salina fisiológica.

[0089] De acuerdo con algunas formas de realización, la cepa bacteriana o un componente de la misma es para el uso en combinación con un agente anticancerígeno.

[0090] De acuerdo con algunas realizaciones, la composición se formula para la administración intravesicular. Según determinadas realizaciones, la cepa bacteriana o composición que comprende la cepa bacteriana se proporciona en una forma de dosificación. Según algunas realizaciones, la forma de dosificación se administra en una cantidad seleccionada de 1 ng/kg a 1 g/kg, 10 ng/kg a 0,1 g/kg, 50 ng/kg a 10 mg/kg, 0,1 pg/kg a 1 mg/kg y 0,2 pg/kg a 0,2 mg/kg de cuerpo. Cada posibilidad representa una realización separada. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día.

[0091] De acuerdo con algunas realizaciones, el periodo de tratamiento es de al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 4 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, menos 6 meses, o al menos 1 año. En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1 día a 1 semana, de 1 semana a 4 semanas, de 1 mes a 3 meses, de 3 meses a 6 meses, de 6 meses a 1 año o durante más de un año. Cada posibilidad representa una realización separada.

[0092] De acuerdo con algunas realizaciones, de 106 a 1012 microorganismos total se puede administrar al paciente en una forma de dosificación dada. Según determinadas realizaciones, se pueden administrar al paciente de 107 a 1010 microorganismos en total en una forma de dosificación dada. Según realizaciones adicionales, se puede proporcionar una cantidad eficaz en una cantidad de 0,5 ml a 40 ml de la composición bacteriana que tiene de 106 a 1011 bacterias por ml.

[0093] Cualquiera de las preparaciones descritas en el presente documento puede administrarse como un tratamiento único o como múltiples tratamientos, tal como una vez a la semana durante varias semanas, o la composición puede administrarse de manera intermitente de acuerdo con un calendario establecido, por ejemplo, una vez por semana, una vez al mes, o cuando el paciente recae de la enfermedad primaria.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 - Efecto de la UPEC C93 deficiente en hemolisina sobre la supervivencia de ratones

modelos de cáncer de vejiga

Mutantes deficientes hemolisina:

[0094] Construcción de UPEC CFT073 (presentado bajo ATCC®700928™) Biblioteca transposón: EZ:: transposomes TnKan (Gur et al., Cell Host Microbe, 2013 Dic 11; 14 (6): 664-74) se purificaron del plásmido pMODKan según las instrucciones del fabricante y se electroporaron en bacterias UPEC CFT073 que albergan un plásmido pCM18 que expresa GFP. La biblioteca se examinó para identificar los genes implicados en la muerte de las células n K incubando los mutantes durante 3 horas con células NK a 37°C. Se seleccionaron más de 1000 clones mutados. Se identificaron tres mutantes que tenían una capacidad de adhesión intacta, pero una actividad destructora alterada. Para determinar la ubicación del transposón, se purificó el ADN genómico de los clones seleccionados (GenElute, Sigma) y se restringió con HpaI, MfeI y Ndel (New England Biolabs) que no se escinden dentro del transposón insertado. A continuación, los fragmentos resultantes se autoligaron (TaKaRa) y se utilizaron como molde para la PCR inversa (Herculase II, Agilent) para la amplificación de las secuencias flanqueantes de los transposones. Las secuencias generadas se volaron contra el genoma de CFT073 para determinar la ubicación de la mutación de inserción. Se identificaron los genes alterados de los tres mutantes y se encontró que residían en el operón hlyA que codifica la toxina hemolisinaA: 'C93' (mutado en hlyA), 'E49' (mutado en hlyC) y 'D57' (mutado en hlyD) (Gur et al., Cel1Host Microbe. 11 de diciembre de 2013; 14 (6): 664-74).

Cáncer de células de transición (TCC):

[0095] La línea de células de cáncer de vejiga MB49, derivada de ratones C57/B16, se inyectó/implantó intravesicalmente en ratones hembra utilizando un protocolo descrito por Günther et al. (Cancer Research, 2834-2837, 59 1 de junio de 1999). Brevemente, se anestesiaron ratones hembra (10-12 ratones por grupo), de 8-10 semanas de edad, con ketamina/xalazina. Se afeitó un área de aproximadamente 1 cm2 en la espalda del animal y luego se colocó a los ratones en una placa de tierra de la unidad de cauterización. Se cateterizó la vejiga urinaria con un catéter de teflón de calibre 25 y se insertó un alambre guía de punta suave de calibre 24 (0,7 x 19 mm) hasta que tocó la pared de la vejiga. El alambre guía se unió a la unidad de cauterización y se aplicó corriente de coagulación monopolar durante 5 segundos al ajuste de potencia más bajo. Después de retirar el alambre, se instilaron 50 pl de suspensión de células tumorales d Me M MB49 (30.000 células tumorales por ratón). Luego, se pinzó el catéter y se dejó en la vejiga durante 2-3 horas mientras se anestesia el ratón. Se utilizó MB49-luc transfectado de forma estable con luciferasa, lo que permitió el seguimiento de los tumores con una cámara CCCD.

Tratamiento intravesical:

[0096] Dos días después de la implementación de células tumorales, los ratones fueron asignados al azar en 6 grupos y recibieron varios tratamientos a través de la instilación intravesical una vez a la semana. Las bacterias o PBS se inyectaron a través de catéteres insertados en las vejigas.

Grupo 1: Tratamiento con PBS. La primera instilación intravesical fue 3 días después de la inoculación de TCC, luego cada semana (5 inyecciones en total).

Grupo 2: Tratamiento con PBS como se describe para el grupo 1 y anti-NK1,1 (mAb PK136, por inyección intraperitoneal) dos veces por semana (el día 1, el día 4 y luego cada semana durante 6 semanas).

Grupo 3: Tratamiento con 50 pl que contiene 109/ml de bacterias C93. La primera instilación intravesical fue 3 días después de la inoculación de TCC, luego cada semana (5 inyecciones en total).

Grupo 4: Tratamiento con 50 pl que contiene 109/ml de bacterias C93 como se describe para el grupo 3 y anti-NK1,1 (mAb PK136) dos veces por semana (el día 1, el día 4 y luego cada semana durante 6 semanas). Grupo 5: Tratamiento con una cepa Onco-Tice® BCG (2-8x108 u Fc por vial). El vial se reconstituyó en 3 ml de solución salina normal y se inyectaron 0,05 ml por ratón. La primera instilación intravesical fue 3 días después de la inoculación de TCC, que cada semana (5 inyecciones en total).

Grupo 6: Tratamiento con una cepa Onco-Tice® BCG como se describió anteriormente en combinación con anti-NK1,1 (mAb PK136) dos veces por semana (el día 1, el día 4 y luego cada semana durante 6 semanas).

[0097] Los ratones se examinaron diariamente en la primera semana y luego 3 veces a la semana. La progresión del tumor se controló semanalmente utilizando la formación de imágenes CCCD. Para el ensayo de luciferasa/formación de imágenes de CCCD in vivo, los ratones se anestesiaron con isoflurano. La luciferina se inyectó IP en una cantidad de 125 pg/g de peso corporal y la formación de imágenes se realizó en 5-10 minutos.

[0098] Todos los ratones se sacrificaron el día 62 después de la implantación del tumor usando anestesia de ketamina/xilasina con la posterior dislocación del cuello.

[0099] Procedimiento experimental:

Día -1: Examen de la línea de células MB49 tumorales para la luciferasa y la inyección NK1,1 (100 microgramos por ratón) para los ratones de los grupos 2, 4 y 6.

Día 0: implantación del tumor.

Día 3: El tratamiento con PBS, C93, o BCG como se describe anteriormente y la inyección NK1,1 (100 microgramos por ratón) para los ratones de los grupos 2, 4 y 6.

[0100] Para las 5,5 semanas restantes después de la implantación del tumor:

- Tratamiento con PBS, C93 o BCG una vez a la semana.

- Formación de imágenes CCCD una vez a la semana

Resultados:

[0101] Para examinar el efecto de bacterias deficientes en hemolisina sobre el cáncer, se indujo cáncer de vejiga en ratones, y se midió la tasa de supervivencia y el tamaño del tumor de los ratones tratados con células C93. Se inocularon ratones C57BL (10 ratones por grupo) en la vejiga con células de carcinoma de vejiga MB49. Como se describió anteriormente, los ratones se trataron con PBS, C93 o BCG, con o sin mAb NK1,1, anticuerpos que agotan las células NK.

[0102] Como se muestra en la Figura 1A, el tratamiento del cáncer de vejiga con C93 aumenta la tasa de supervivencia en comparación con el tratamiento o control con BCG. Sorprendentemente, el tratamiento con C93 casi no se vio afectado por el agotamiento de las células NK, que tiene una actividad anticancerosa convincente. Por el contrario, el tratamiento con BCG se vio muy afectado por el agotamiento de las células NK. Sorprendentemente, todos los ratones tratados con C93 sobrevivieron al estudio. Además, el tratamiento con C93 indujo la regresión del tumor. La mayoría de los ratones tenían tumores grandes y visibles el día 14 después de la implantación de las células tumorales. Sorprendentemente, no se observaron tumores visibles en ratones tratados con células C93 después de 27 días. Por el contrario, los ratones tratados con PBS y varios de los ratones tratados con BCG tenían tumores visibles (Figuras 1B-1D). El día 56 después de la inoculación del tumor, se recogieron vejigas de los ratones supervivientes y se fotografiaron. La Figura 3A demuestra que las vejigas de los ratones tratados con C93 parecen normales. Por el contrario, la vejiga de un ratón tratado con PBS está agrandada y deformada.

EJEMPLO 2 - Efecto de UPEC inactivado en la supervivencia del modelo de ratón de cáncer de vejiga

[0103] UPEC CFT073 fueron expuestos a formaldehído (4% en PBS) durante la noche, se lavaron tres veces y se llevaron a OD = 1 (aproximadamente 109 células/ml).

[0104] Para probar si todas las bacterias murieron por el tratamiento con formaldehído, 100 pl de la OD=1 suspensión fueron sembrados en 1:1, 1:10, y 1:100 diluciones e incubados durante la noche a 37°C. No se detectó crecimiento, lo que confirma la inactivación bacteriana.

[0105] La cantidad de formaldehído residual en la preparación bacteriana se midió usando el Formaldehyde VACUettes Kit (Catálogo N° K-4605D) chemetrics (VA. Ee .UU.) y se encontró que era 0-5 ppm (0,0005%) (n=3).

[0106] A continuación, se examinó el efecto de las bacterias inactivadas de formaldehído en la tasa de supervivencia de modelos de ratón de cáncer de vejiga. Se inocularon células de carcinoma de vejiga MB49 en la vejiga de ratones C57BL. Los tratamientos comenzaron diez días después de la inoculación del cáncer. Los ratones se trataron semanalmente (días marcados con flechas; Figura 2) con PBS (control negativo) o con 108 células de la cepa CFT073 de UPEC de tipo salvaje que se inactivaron con formaldehído. La Figura 2 muestra que el tratamiento con UPEC inactivado con formaldehído es muy eficaz contra el carcinoma de vejiga. La tasa de supervivencia de los ratones tratados con la cepa CFT073 de UPEc inactivada aumentó de forma espectacular. El día 56 después de la inoculación del tumor, se recogieron vejigas de los ratones supervivientes y se fotografiaron. La Figura 3B demuestra que las vejigas de los ratones tratados con CFT073 parecen normales. Por el contrario, la vejiga de un ratón tratado con PBS está agrandada y deformada.

EJEMPLO 3 - Efecto de la E. coli enteropatógena inactivada (EPEC) sobre la supervivencia de modelo de ratón de cáncer de vejiga

[0107] Para examinar adicionalmente el efecto de la inactivación por formaldehído, la tasa de supervivencia de modelos de ratón del cáncer de vejiga tratados con UPEC o EPEC que fueron inactivados por formaldehído. Se inocularon células de carcinoma de vejiga MB49 en la vejiga de ratones C57BL. Los ratones se trataron semanalmente con 3x108 células/ratón UPEC (CFT073 FA), EPEC (EPEC FA) y Helicobacter pylori, comenzando el día 10 después de la inoculación con TCC.

[0108] Como se muestra en la Figura 4, los ratones con un cáncer de vejiga tratados con UPEC y EPEC exhibieron una tasa de supervivencia significativamente mayor en comparación con tratamiento y contro1 Helicobacter pylori (PBS).

EJEMPLO 4 - UPEC de tipo salvaje inactivado pero no Helicobacter pylori atraen células T y NK a la vejiga

[0109] Fue examinada la capacidad de las bacterias UPEC para reclutar células inmunitarias. Se inocularon 1x108 de UPEC CFT073 o Helicobacter pylori inactivado con formaldehído en la vejiga de ratones. Dos días después, se sacrificaron los ratones y se cuantificaron las células NK y T mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 5, el número de células NK y células T (panel superior; 6,9% y 22%, respectivamente) en las vejigas de ratones inoculados con UPEC fue significativamente mayor en comparación con las vejigas inoculadas con Helicobacter pylori (panel inferior; 0,9% y 4% para las células NK y T, respectivamente).

[0110] A continuación, se examinó el perfil de respuesta citocinas/quimiocinas después de la inoculación bacteriana. Se inocularon 1x108 de UPEC CFT073 inactivado con formaldehído (FA), azul de E. co liXL I (cepa de laboratorio de E. coli), Helicobater pylori o BCG en las vejigas de cada ratón. Después de 2 días, se sacrificaron los ratones y se cuantificaron las citocinas/quimiocinas de la vejiga usando una matriz de citocinas. Sorprendentemente, las cantidades de varias citocinas y otras moléculas relacionadas con el sistema inmunitario, como IL-1ra y sICAM-1, fueron significativamente más altas en las vejigas inoculadas con UPEC inactivado con formaldehído (FA) en comparación con la inoculación con otros tipos de bacterias (Figura 6).

[0111] En general, estos resultados sugieren que UPEC inactivados inducen una respuesta inmune local.

EJEMPLO 5 - Cepas de E. coli inactivadas por formaldehído tienen una actividad anticancerígena superior en comparación con bacterias muertas por choque térmico

[0112] A continuación, se realizó una comparación entre la inactivación de formaldehído y la inactivación de choque térmico. Los ratones que portaban células de carcinoma de vejiga MB49 se trataron semanalmente con la cepa CFT073 o C93 mutante de UPEC inactivada con formaldehído y con cepas CFT073 o C93 que se destruyeron por calor. El procedimiento se realizó como se describe en el ejemplo 1. Los ratones de control recibieron PBS.

[0113] La Figura 7 demuestra que el tratamiento con bacterias que fueron inactivadas con formaldehído es superior al tratamiento con bacterias inactivadas por calor, mostrando una tasa de supervivencia mejorada.

EJEMPLO 6 - Efecto de la vía de administración en el reclutamiento de células inmunes

[0114] Para examinar el efecto de la vía de administración, los ratones se inocularon intravesicularmente o por vía subcutánea con 108 formaldehído inactivado UPEC CFT073 (n=5 por grupo). Después de 48 horas, se recolectaron las vejigas y se extrajeron los linfocitos de sangre periférica (PBL) de las vejigas y se analizaron mediante citometría celular.

[0115] Como se muestra en la Figura 8, el número de PBL fue significativamente mayor (150.000 vs. 1400 en el conteo total) en la vejiga de los ratones inoculados intravesicularmente, de los cuales 17% eran células T (CD3 positivas) y 17% eran células NK que expresan GFP.

EJEMPLO 7 - Efecto de la extracción de membrana bacteriana y proteínas de membrana bacteriana en la supervivencia del modelo de ratón de cáncer de vejiga

Extracción de la membrana bacteriana y proteínas de membrana:

[0116] Las células bacterianas se cultivan durante la noche y se lavaron en PBS y se resuspendieron en PBS suplementado con 3 mM de PMSF (Sigma-Aldrich, Alemania). Se usa una prensa francesa (8.000 psi x 3 veces) para romper las células y las células intactas se eliminan por sedimentación a 10.000 x g a 4°C durante 10 minutos.

[0117] Alternativamente, las células se rompen usando perlas de vidrio. Las suspensiones celulares se colocan en tubos de microcentrífuga de 2 ml que contienen 600 pl de perlas de vidrio (106 pm, Sigma). A continuación, las células se rompen de dos a cuatro veces utilizando el disruptor celular FastPrep (Bio 101, Savant Instruments, Inc., NY, EE. UU.) A una velocidad de 6 m/s durante 45 s, con enfriamiento con hielo entre interrupciones. Los lisados se centrifugan a 10.000 x g durante 5 min.

[0118] El sobrenadante se recoge y se somete a centrifugación de alta velocidad (150.000 x g a 4°C durante 1 hora), y se lava dos veces el sedimento resultante que contiene las paredes celulares, se resuspende en tampón de fosfato de sodio y se mantiene a -80°C hasta que se use. Para determinar la cantidad e integridad de las proteínas, una muestra de cada membrana sedimentada se hierve en tampón de muestra SDS-PAGE durante 10 minutos y se fracciona usando SDS-PAGE (12% y 4%) para visualizar las bandas de proteínas.

Preparación de vesículas de membrana exterior:

[0119] Los cultivos estacionarios se cosechan por centrifugación a 10.000 x g durante 20 min a 4°C. Los sobrenadantes del cultivo se recogen y filtran a través de un filtro de 0,2 pm (Whatman Schleicher & Schuell). Los sobrenadantes libres de células se centrifugan a 100.000 x g durante 2 h. El sobrenadante se descarta y el sedimento que contiene las vesículas se lava dos veces con solución salina tamponada con Tris (TBS, Tris-HCl 0,05 M [pH 7,8], NaCl 0,1 M) mediante centrifugación a 100.000 x g. El sedimento se almacena a -20°C hasta su uso posterior. Lisado bacteriano:

[0120] Las células bacterianas se cultivan durante la noche, se lavan en PBS y se resuspenden en PBS suplementado con 3 mM de PMSF (Sigma-Aldrich, Alemania).

[0121] Las suspensiones celulares se colocan en tubos de microcentrífuga de 2 ml que contenían 600 |jl de cuentas de vidrio (106 jm , Sigma). Las células se rompen de dos a cuatro veces utilizando el disruptor celular FastPrep (Bio 101, Savant Instruments, Inc., NY, EE. UU.) A una velocidad de 6 m/s durante 45 s, con enfriamiento con hielo entre interrupciones. Los lisados se centrifugan a 10.000 x g durante 5 min y se recoge el líquido sobrenadante.

[0122] El extracto de proteína bacteriana del lisado bacteriano y la fracción de membrana se administran a un modelo de ratón de cáncer de vejiga como se describe en los ejemplos anteriores. Se examinan la tasa de supervivencia y el tamaño del tumor.

EJEMPLO 8 - Ensayo clínico de cepas bacterianas de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores

[0123] Un estudio clínico está diseñado para evaluar el efecto de las cepas bacterianas en pacientes con cáncer de vejiga. El objetivo principal es evaluar la eficacia y la seguridad de la E. coli CFT073 uropatógena inactivada con formaldehído administrada como seis instilaciones intravesicales de 1010 UFC (o células) inactivadas por instilación. El principal objetivo de eficacia es determinar la capacidad del tratamiento para prevenir la recurrencia del tumor después de 6 instilaciones intravesicales semanales del producto probado. La recurrencia se evalúa 8-10 semanas después del comienzo del tratamiento. El principal objetivo de seguridad es determinar los efectos adversos inducidos por el producto probado. Los objetivos secundarios incluyen determinar la libertad a largo plazo (un año) de recurrencia del cáncer y el tiempo hasta la recurrencia del tumor en pacientes libres de tumor que no recurrieron después de 8 a 10 semanas.

Diseño del estudio:

[0124] Reclutamiento de sujetos - Los pacientes son reclutados a través de la oncología clínica urológica en Hadassah Medical Center, Israel.

[0125] Criterios de inclusión de sujetos - Pacientes que se sometieron a escisión transuretral completa de cáncer de vejiga no invasivo de músculo recurrente, de riesgo intermedio a alto recurrente (NMIBC), y tienen antecedentes de al menos un curso de tratamiento intravesical de quimioterapia o inmunoterapia adyuvante antes de esta recurrencia.

Criterios de exclusión de sujetos:

[0126]

i. Mujeres embarazadas o en período de lactancia

ii. Carcinoma urotelial de alto grado T1 de vejiga

iii. Carcinoma urotelial del tracto superior concomitante

iv. TCC en divertículo vesical o uretra prostática

v. CU con invasión muscular

vi. CU metastásico

vii. Estado funcional de Karnofsky <60

viii. Estado de inmunodeficiencia conocido

ix. Infección activa del tracto urinario

x. otra malignidad activa

[0127] Los pacientes que dieron su consentimiento para participar en el estudio comienzan el tratamiento dentro de 4-5 semanas después de una resección transuretral del tumor de vejiga (TURBT). Los pacientes son tratados con instilación intravesical semanal de UPEC inactivada con formaldehído durante 6 semanas. El producto se administra a través de 12 catéteres uretrales French Tiemann y se pide a los pacientes que se abstengan de orinar durante 2 horas.

Seguimiento de sujetos:

[0128] Pruebas de cultivo de orina, análisis de orina, cistoscopia y citología de orina se llevan a cabo 2 meses después del último tratamiento intravesical y cada 4 meses durante 2 años a partir de entonces.

Tabla 1. Curso de tratamiento, seguridad y evaluación de enfermedades.

Formulación y preparación:

[0129] Colonias frescas de CFT073 se cultivan en medio LB durante la noche. Se sedimentan 1010 UFC de bacterias mediante centrifugación a 4°C, 6000 rpm durante 5 minutos y se lavan dos veces con 30 ml de PBS. El sedimento se resuspende en 10 ml de formaldehído al 4% y luego las bacterias se incuban durante la noche a 4°C para inactivación. Las bacterias inactivadas se sedimentan mediante centrifugación en las mismas condiciones, se lavan tres veces en 30 ml de PBS, se resuspenden en PBS y se llevan a una concentración de 109 células/ml (DO = 1,600 nm). El producto final está etiquetado como CFT-FA (UPEC CFT073 inactivado por formaldehído).

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de E. coli patógena inactivada para su uso en el tratamiento del cáncer de vejiga, en donde dicha cepa de E. coli debe administrarse por vía intravesicular.

2. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de la reivindicación 1, en donde la cepa de E. coli es E. coli uropatógena (UPEC); o en donde la cepa de E. coli es E. coli enteropatógena (EPEC).

3. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la cepa de E. coli patógena se inactiva con formaldehído.

4. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la cepa patógena se usa en combinación con un agente anticanceroso; o en donde la cepa de E. coli patógena es para administración semanal.

5. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la E. coli inactivada es para administración semanal en una dosis que comprende de 107 a 1012 células bacterianas.

6. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cepa bacteriana tiene fimbria de tipo I.

7. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la E. coli patógena es una cepa de Escherichia coli CFT073.

8. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la cepa de E. coli sobreexpresa la fimbria de tipo I.

9. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 4 y 8, en donde la cepa de E. coli es una cepa bacteriana mutante deficiente en hemolisina.

10. La cepa de E. coli patógena inactivada para el uso de la reivindicación 9, en donde la cepa bacteriana tiene una mutación en el gen hly.

11. La cepa E. coli patógena inactivada para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 ,2 y 4, en donde la cepa de E. coli sobreexpresa fimbria de tipo I y en donde el E. coli es una cepa bacteriana mutante deficiente en hemolisina.

12. Una cepa bacteriana de E. coli para uso en el tratamiento de un cáncer del sistema genitourinario, en donde la cepa bacteriana sobreexpresa la fimbria de tipo I, la cepa bacteriana se selecciona del grupo que consiste en: (i) una cepa bacteriana mutante deficiente en hemolisina derivada de una cepa patógena de E. coli; (ii) una Escherichia coli uropatógena inactivada (UPEC); y (iii) una Escherichia coli enteropatógena inactivada (EPEC); y en donde la cepa bacteriana se administra por vía intravesicular.