KR20240032684A - 수퍼옥시드 디스뮤타제를 발현하는 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 섬유화 질환 예방 또는 치료용 용도 - Google Patents

수퍼옥시드 디스뮤타제를 발현하는 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 섬유화 질환 예방 또는 치료용 용도 Download PDF

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김의중
김정현
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Abstract

본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제를 발현하는 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 수퍼옥시드 디스뮤타제를 포함하는 조성물의 섬유화 질환의 예방, 개선 또는 치료용 용도에 관한 것이다. 본 조성물을 경구 투여하면 수퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드가 체내 활성산소를 제거하여 폐 섬유증 또는 간 섬유증과 같은 섬유화 질환의 예방, 개선 또는 치료에 도움을 줄 수 있다.

Description

수퍼옥시드 디스뮤타제를 발현하는 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 섬유화 질환 예방 또는 치료용 용도{BACILLUS STRAIN EXPRESSING SUPEROXIDE DISMUTASE, BACILLUS STRAIN SPORES AND/OR SUPEROXIDE DISMUTASE, AND USES THEREOF FOR PREVENTING OR TREATING OF FIBROTIC DISEASES}
본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제를 발현하는 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 포함하는 조성물 및 이의 섬유화 질환 예방, 개선 또는 치료용 용도에 관한 것이다.
섬유화는 콜라겐 등의 세포외 기질(extracelluar matirx, ECM)이 조직에 축적되어 구조적 문제 및 기능적 문제를 야기하는 질환으로, 원인을 알 수 없는 특발성이거나 또는 다양한 원인에 의해 발병할 수 있다. 예를 들어, 폐 섬유증은 만성 염증(예컨대 유육종증, 베게너 육아종증 등), 감염, 환경적 요인(예컨대 석면, 특정 기체에 노출 등), 이온화 방사선에 노출(예컨대, 가슴의 종양을 치료하기 위한 방사선 치료 등), 만성 질환 및 특정 약물(예컨대, 블레오마이신, 아미오다론, 부설판, 메토트렉세이트 및 니트로푸란토인 등)의 부작용을 포함하는 여러 조건에 의해 야기될 수 있다. 또한, 원인을 알 수 없는 특발성 폐 섬유증은 폐에서 대표적으로 섬유화를 일으키는 질병으로서, 특발성 폐 섬유증의 발병에는 산화 스트레스가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특발성 폐 섬유화증 환자는 정상인보다 활성산소의 농도는 더 높으면서 항산화 작용은 감소되어 있는 것으로 확인되었으며, 이는 비가역적 폐 손상 및 섬유화로 진행될 수 있다. 하지만, 특발성 폐 섬유증의 병인은 정확히 알려져 있지 않으며, IFN-γ 와 같은 약제가 개발 중에 있지만 아직까지 효과적인 약물은 없다. 또 다른 예로, 간 섬유증은 비알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)과 같은 비알코올성 지방간질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)에 의하여 발생하거나 바이러스성 간염(HBV, HBC 등), 알코올, 간 독성 물질(아세트아미노펜의 과다복용, 비소와 같은 화학물질 등), 유전적 원인 등에 의하여 발생할 수 있다. 특히, NASH는 지방 침착과 함께 간 세포 손상과 염증이 동반된 상태로 간 섬유화를 일으키는 대표적인 질환 중 하나이며, 간 섬유증이 악화되면 간경변으로 진행할 수 있으며, 더욱 악화되면 간암으로 발전할 수 있다. 비알코올성 지방간염의 치료와 병증의 진행을 예방하기 위한 약물의 필요가 있으나, 현재까지 섬유화와 지방간염을 효과적으로 호전시키는 약물은 없다.
따라서, 폐 섬유증, NASH, 간 섬유증 등을 포함하는 섬유증 질환을 치료할 수 있는 약물의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 섬유화 질환의 예방 또는 치료를 위한 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
본 발명은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 SOD를 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 SOD를 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 SOD를 대상에 투여하는 단계를 포함하는 섬유화 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 수퍼옥시드 디스뮤타제의 섬유화 질환의 예방, 개선 또는 치료용 용도를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 바실러스 종 균주는 SOD를 발현하는 균주 또는 SOD를 과발현하도록 변이되거나 재조합된 균주일 수 있다.
다른 구현예에서, 바실러스 종 균주 포자는 SOD를 발현하는 균주 또는 SOD를 과발현하도록 변이되거나 재조합된 균주로부터 유래된 포자를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 바실러스 종 균주는 바실러스 벨레젠시스 종 균주일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 바실러스 종 균주는 수탁번호 KCTC 13222 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주, 수탁번호 KCTC 13227 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주 및 수탁번호 KCTC 15552 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주로부터 선택된 하나 이상인 균주일 수 있다.
일 구현예에서, SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 Mn-SOD일 수 있다.
다른 구현예에서, SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 탈아미드화된 Mn-SOD일 수 있다.
또 다른 구현예에서, SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 바실러스 종 균주에서 유래한 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, SOD 활성을 갖는 폴리펩티드가 유래된 균주는 바실러스 벨레젠시스 종 균주일 수 있다.
또 다른 구현예에서, SOD 활성을 갖는 폴리펩티드가 유래된 바실러스 종 균주는 수탁번호 KCTC 13222 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주, 수탁번호 KCTC 13227 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주 및 수탁번호 KCTC 15552 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주로부터 선택된 하나 이상인 균주일 수 있다.
또 다른 구현예에서, SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 코팅제로 코팅된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, SOD 활성을 갖는 폴리펩티드의 코팅제는 쉘락(shellac)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 섬유화 질환은 폐 섬유화 질환 또는 간 섬유화 질환일 수 있다.
다른 구현예에서, 폐 섬유화 질환은 간질성 폐 질환, 폐 섬유증 및 특발성 폐 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 간 섬유화 질환은 비알코올성 지방간염, 간섬유증, 특발성 간 섬유증, 간경변, 알코올성 지방간염, 만성 간질환, 바이러스성 간염으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 조성물의 유효성분은 경구 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 상기 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상을 포함하고, 상기 둘 이상의 성분이 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 수의학적 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 사료 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 섬유화 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물의 섬유화 질환 예방, 개선 또는 치료를 위한 용도가 제공된다.
본 발명자들은 본 발명의 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물이 섬유화 질환에서 예방 또는 치료적 효과가 있음을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 바실러스 종 균주 포자는 폐 섬유증 유발 전 또는 후에 투여하였을 때 모두 섬유증을 개선하는 효과를 나타냈으며, SOD 발현량을 증가시킨 바실러스 종 균주 포자에서 더 우수한 예방 또는 치료 효과가 나타나는 것으로 확인되었다. 또한, SOD의 체내 활성산소 제거 효과는 유리 SOD를 투여하는 것 보다는 종 균주 포자 형태로 투여하였을 때 우수하였으며, 이는 포자 형태가 체내에서 더욱 안정적임을 나타내는 결과이다. 한편, 위산에서의 안정성을 향상시킨 경구용 SOD는 단독으로 투여하여도 폐 섬유화를 개선시키는 데 효과가 있었으며, SOD 정상 균주 포자와 병용 투여 시 상승된 효과를 나타내었다. 본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 바실러스 종 균주는 비알코올성 지방간염 동물모델의 간 섬유증에서 우수한 치료 효과를 나타내었으며, 이러한 효과는 SOD를 과발현하는 균주 변이체를 투여한 경우에 더 큰 것으로 확인되었다. 또한, 상기 조성물을 투여한 경우, 간 섬유증 개선뿐만 아니라 비알코올성 지방간염 지표(전혈당 수치, 혈장 ALT 수준, 혈장 CK-18 수준, 간 중성지방 함량 등)의 개선 및 NAFLD 활성도 점수(NAS)의 유의한 감소도 나타내었다. 이와 같이, 본 발명에 개시된 바와 같은 조성물은 섬유화 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 효과적임을 확인하였다.
도 1은 SodA2를 발현하는 재조합 생산 균주(BSBA310)를 제조하기 위한 전체 절차를 나타낸다.
도 2는 sodA2 유전자의 과발현을 위한 발현 벡터를 나타낸다. 여기서, rrnBT1T2는 전사 종결인자를 나타내고; rep(pBR322)는 E. coli에서 작동하는 pBR322로부터의 레플리콘을 나타내고; rep(pUB110)는 B. subtilis에서 작동하는 pUB110로부터의 레플리콘이고; KanR은 카나마이신 내성 유전자(아미노글리코시드 O-뉴클레오티딜트랜스퍼라제)를 나타내고; BJ27 promoter는 B. subtilis에 대한 강력한 프로모터를 나타낸다.
도 3은 GF423 균주의 프로모터를 치환하여 SOD 활성을 증가시킨 GF427 균주의 클로닝 과정을 나타내는 모식도이다. 도 3a는 GF423 게놈 DNA를 주형으로 얻은 PCR 산물을 이용하여 pUori-cm-amp-10sod를 제작하는 과정을 나타내고, 도 3b는 pUori-cm-amp-10sod를 주형으로 얻은 PCR 산물을 이용하여 pUori-cm-amp-P3-SOD를 제작하는 과정을 나타낸다.
도 4는 폐 섬유증 마우스 모델에서 섬유화 예방 효과를 확인하기 위한 시험 물질 및 블레오마이신의 투여 일정을 도시하였다.
도 5는 GF424 포자의 농도별 투여에 따른 하이드록시프롤린 함량 측정 결과를 도시한다.
도 6은 GF424 포자의 농도별 투여에 따른 폐 세척액 중 면역 관련 세포 수의 측정 결과를 도시한다. 도 6a는 총 면역세포(Total BAL cells)의 수, 도 6b는 호중구(Neutrophils)의 세포 수, 도 6c는 림프구(Lymphocytes)의 세포 수 및 도 6d는 대식세포(Macrophages)의 세포 수를 나타낸다.
도 7은 GF424 포자의 농도별 투여에 따른 TGF-β1 농도 측정 결과를 도시한다.
도 8은 GF424 포자의 농도별 투여에 따른 폐 조직 절편의 염색(H&E 및 마슨 삼색 염색) 결과를 도시한다. 스케일 바(Scale bar)는 500 ㎛를 나타낸다.
도 9는 GF424 포자의 농도별 투여에 따른 폐 섬유화 관련 유전자 마커(도 9a, Col1a1; 도 9b, TGF-β; 도 9c, CTGF 및 도 9d, IL-6)의 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과를 도시한다.
도 10은 GF424 포자의 농도별 투여에 따른 활성산소 부산물(도 10a, MDA; 및 도 10b, 4-HNE) 측정 결과를 도시한다.
도 11은 SOD 발현량에 차이를 보이는 균주 포자(SOD 녹아웃, 정상 발현 및 과발현)의 투여에 따른 하이드록시프롤린 함량 측정 결과를 도시한다.
도 12는 SOD 발현량에 차이를 보이는 균주 포자(SOD 녹아웃, 정상 발현 및 과발현)의 투여에 따른 폐 세척액 중 면역 관련 세포 수의 측정 결과를 도시한다. 도 12a는 총 면역세포(Total BAL cells)의 수, 도 12b는 호중구(Neutrophils)의 세포 수, 도 12c는 림프구(Lymphocytes)의 세포 수 및 도 12d는 대식세포(Macrophages)의 세포 수를 나타낸다.
도 13은 SOD 발현량에 차이를 보이는 균주 포자(SOD 녹아웃, 정상 발현 및 과발현)의 투여에 따른 TGF-β1 농도 측정 결과를 도시한다.
도 14는 SOD 발현량에 차이를 보이는 균주 포자(SOD 녹아웃, 정상 발현 및 과발현)의 투여에 따른 폐 조직 절편의 염색(H&E 및 마슨 삼색 염색) 결과를 도시한다. 스케일 바(Scale bar)는 500 ㎛를 나타낸다.
도 15는 SOD 발현량에 차이를 보이는 균주 포자(SOD 녹아웃, 정상 발현 및 과발현)의 투여에 따른 폐 섬유화 관련 유전자 마커(도 15a, Col1a1; 도 15b, α-SMA; 도 15c, TGF-β; 도 15d, CTGF; 도 15e, TNF-α 및 도 15f, IL-6)의 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과를 도시한다.
도 16은 SOD 발현량에 차이를 보이는 균주 포자(SOD 녹아웃, 정상 발현 및 과발현)의 투여에 따른 폐 섬유화 관련 마커의 웨스턴 블롯 결과를 도시한다.
도 17은 SOD 발현량에 차이를 보이는 균주 포자(SOD 녹아웃, 정상 발현 및 과발현)의 투여에 따른 폐 섬유화 마우스 모델의 생존율 추정 결과를 도시한다.
도 18은 SOD 발현량에 차이를 보이는 균주 포자(SOD 녹아웃, 정상 발현 및 과발현)의 투여에 따른 활성산소 부산물(도 18a, MDA; 및 도 18b, 4-HNE) 측정 결과를 도시한다.
도 19는 유리 SOD 및 균주 포자의 투여에 따른 하이드록시프롤린 함량 측정 결과를 도시한다.
도 20은 유리 SOD 및 균주 포자의 투여에 따른 TGF-β1 농도 측정 결과를 도시한다.
도 21은 유리 SOD 및 균주 포자의 투여에 따른 폐 조직 절편의 염색(H&E 및 마슨 삼색 염색) 결과를 도시한다. 스케일 바(Scale bar)는 500 ㎛를 나타낸다.
도 22는 유리 SOD 및 균주 포자의 투여에 따른 폐 섬유화 관련 유전자 마커(도 22a, Col1a1; 도 22b, α-SMA; 도 22c, TGF-β; 도 22d, CTGF; 도 22e, TNF-α 및 도 22f, IL-6)의 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과를 도시한다.
도 23은 유리 SOD 및 균주 포자의 투여에 따른 폐 섬유화 관련 마커의 웨스턴 블롯 결과를 도시한다.
도 24는 유리 SOD 및 균주 포자의 투여에 따른 활성산소 부산물(도 24a, MDA; 및 도 24b, 4-HNE) 측정 결과를 도시한다.
도 25는 폐 섬유화 마우스 모델에서 분리한 일차 폐 섬유아세포에서 면역 형광염색 결과를 나타낸다. 각각의 폐 섬유아세포를 α-smooth muscle actin(α-SMA), Collage 1(Col1a1) 및 DAPI 항체로 염색하였으며, 스케일 바(Scale bar)는 50 ㎛를 나타낸다.
도 26은 폐 섬유화 마우스 모델에서 분리한 일차 폐 섬유아세포에서 폐 섬유화 관련 유전자 마커(도 26a, TGF-β; 도 26b, Col1a1; 도 26c, TNF-α 및 도 26d, IL-6)의 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과를 도시한다.
도 27은 폐 섬유증 마우스 모델에서 경구용 SOD(GF103), 균주 포자 및 경구용 SOD와 균주 포자의 병용 투여에 따른 하이드록시프롤린 함량 측정 결과를 도시한다.
도 28은 폐 섬유증 마우스 모델에서 경구용 SOD(GF103), 균주 포자 및 경구용 SOD와 균주 포자의 병용 투여에 따른 TGF-β1 농도 측정 결과를 도시한다.
도 29는 폐 섬유증 마우스 모델에서 경구용 SOD(GF103), 균주 포자 및 경구용 SOD와 균주 포자의 병용 투여에 따른 폐 조직 절편의 염색(H&E 및 마슨 삼색 염색) 결과를 도시한다. 스케일 바(Scale bar)는 500 ㎛를 나타낸다.
도 30은 폐 섬유증 마우스 모델에서 경구용 SOD(GF103), 균주 포자 및 경구용 SOD와 균주 포자의 병용 투여에 따른 폐 섬유화 관련 유전자 마커(도 30a, Col1a1; 도 30b, α-SMA; 도 30c, TGF-β; 도 30d, IL-6; 도 30e, IL-1β 및 도 30f, TNF-α)의 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과를 도시한다.
도 31은 폐 섬유증 마우스 모델에서 경구용 SOD(GF103), 균주 포자 및 경구용 SOD와 균주 포자의 병용 투여에 따른 활성산소 부산물(도 31a, MDA; 도 31b, 4-HNE; 및 도 31c, 8-OHdG) 측정 결과를 도시한다.
도 32는 폐 섬유증 마우스 모델에서 섬유화 치료 효과를 확인하기 위한 시험 물질 및 블레오마이신의 투여 일정을 도시하였다.
도 33은 폐 섬유증 마우스 모델에서 SOD 과발현 균주인 GF424 및 GF424보다 더 많은 SOD를 발현하는 균주인 GF427의 포자 투여에 따른 하이드록시프롤린 함량 측정 결과를 도시한다.
도 34는 폐 섬유증 마우스 모델에서 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427)의 포자 투여에 따른 TGF-β1 농도 측정 결과를 도시한다.
도 35는 폐 섬유증 마우스 모델에서 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427)의 포자 투여에 따른 폐 조직 절편의 염색(H&E 및 마슨 삼색 염색) 결과를 도시한다. 스케일 바(Scale bar)는 500 ㎛를 나타낸다.
도 36은 폐 섬유증 마우스 모델에서 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427)의 포자 투여에 따른 폐 섬유화 관련 유전자 마커(도 36a, Col1a1; 도 36b, TGF-β; 도 36c, CTGF; 도 36d, TNF-α; 도 36e, IL-6 및 도 36f, IL-1β)의 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과를 도시한다.
도 37은 폐 섬유증 마우스 모델에서 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427)의 포자 투여에 따른 폐 섬유화 관련 마커의 웨스턴 블롯 결과를 도시한다.
도 38은 폐 섬유증 마우스 모델에서 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427)의 포자 투여에 따른 활성산소 부산물(도 38a, MDA; 도 38b, 4-HNE; 및 도 38c, 8-OHdG) 및 산화적 스트레스의 중요 마커인 티올(도 38d)의 측정 결과를 도시한다.
도 39는 폐 섬유증 마우스 모델에서 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427)의 포자 투여에 따른 폐 섬유화 유발 바이오마커의 발현 정도를 확인한 그래프이다. 상피 손상 마커(도 39a, SP-D), 섬유화 마커(도 39b, MMP-7; 도 39c, Tenascin-C 및 도 39d, Periostin), 염증성 마커(도 39e, CXCL13) 및 혈전증 마커(도 39f, PAI-1)에 대한 발현 정도를 도시한다.
도 40은 폐 섬유증 마우스 모델에서 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427)의 포자 투여에 따른 폐 섬유화 마우스 모델의 생존율 추정 결과를 도시한다.
도 41은 비알코올성 지방간염 STAM™ 모델에서 바실러스 벨레젠시스 종 균주의 간 섬유증 치료 효과 확인을 위한 실험에서 간 샘플 중 좌측외엽을 분리 및 절개하여 실험에 사용될 부분을 표기한 도면이다.
도 42는 비알코올성 지방간염(NASH, STAM™ 모델)을 유도하고 처리를 진행하는 21일 동안 10개의 그룹에 속하는 마우스의 체중 변화를 확인한 그래프이다.
도 43은 비알코올성 지방간염(NASH, STAM™ 모델)을 유도하고 처리가 모두 종료된 21일차 당일에 10개의 그룹에 속하는 마우스의 장기 중량 변화를 확인한 그래프이다. 도 43a는 체중, 간 중량 및 간 대 체중 비율의 결과 값을 정리한 표이며, 도 43b는 체중 그래프, 도 43c는 간 중량 그래프 및 도 43d는 간 대 체중 비율 결과를 나타내는 그래프이다.
도 44는 비알코올성 지방간염(NASH, STAM™ 모델)을 유도하고 처리가 모두 종료된 마우스 모델의 혈장 및 간 샘플을 이용한 생화학 분석 결과를 나타내었다. 도 44a는 전혈당 수준, 혈장 ALT 수준, 혈장 CK-18 수준 및 간 중성지방 함량의 결과 값을 정리한 표이다. 도 44b는 전혈당 수준, 도 44c는 혈장 ALT 수준, 도 44d는 혈장 CK-18 수준 및 도 44e는 간 중성지방 함량을 나타내는 그래프이다.
도 45는 비알코올성 지방간염(NASH, STAM™ 모델)을 유도하고 처리가 모두 종료된 마우스 모델의 간 샘플을 이용한 H&E 염색 및 NAFLD 활성도 점수 평가 결과를 나타낸다. 도 45a 내지 도 45c는 10개의 그룹에 속하는 마우스의 간 샘플을 H&E 염색한 결과이며, 도 45d는 질병 대조군의 간 절편을 나타내는 H&E 염색 결과이다. 도 45e는 Kleiner의 기준에 따라 계산한 NAFLD 활성도 점수(NAS)를 수치화한 표이며, 도 45f는 각 그룹의 NAS를 나타내는 그래프이다. 도 45g 내지 도 45i는 NAS의 상세 내역인 지방증 점수(도 45g), 염증 점수(도 45h) 및 풍선화(Ballooning) 점수(도 45i)를 나타낸다.
도 46은 비알코올성 지방간염(NASH, STAM™ 모델)을 유도하고 처리가 모두 종료된 마우스 모델의 간 샘플을 이용한 시리우스 레드(Sirius red) 염색 결과를 나타낸다. 도 46a는 시리우드 레드 염색된 간 절편의 현미경 사진이며, 도 46b는 섬유화 정도를 수치화한 표이며, 도 46c는 각 그룹의 섬유화 정도(시리우스 레드 양성)를 나타낸 그래프이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 발명을 설명하면서 제시된 용어는 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 그의 통상적인 의미로 이해되어야 하며, 그 용어가 정의된 발명의 태양 또는 구현예뿐만 아니라 본 명세서에 사용된 동일한 용어에 모두 적용된다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
정의
용어 "대상"은 "대상자" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용되고, 섬유화 질환의 예방, 개선 또는 치료를 필요로 하는 포유동물, 예를 들어, 영장류(예컨대 인간, 원숭이, 침팬지 등), 반려 동물(예컨대, 개, 고양이 등), 가축 동물(예컨대, 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예컨대, 랫트, 마우스, 기니피그 등)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 대상은 인간이다.
용어 "치료"는 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질환 및/또는 다른 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태(예컨대 폐 섬유증 또는 간 섬유증 등 섬유화 질환)를 부분적으로 또는 완전히 치유하는 점에서 치료적 효과를 가진다. 바람직한 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 "치료"는 이미 나타난 질환 또는 장애의 의료적 개입을 의미할 수 있다.
용어 "예방"은 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다.
용어 "투여"는 대상에 예방적 또는 치료적 목적(예컨대, 폐 섬유증 또는 간 섬유증 등 섬유화 질환의 예방 또는 치료)을 달성하기 위한 유효 성분을 제공하는 것을 의미한다.
바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 SOD의 섬유화 질환 예방 또는 치료 용도
본 발명은 적어도 부분적으로 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물의 투여가 섬유화 질환, 예컨대 폐 섬유화 질환(간질성 폐 질환, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증 등) 또는 간 섬유화 질환(비알코올성 지방간염, 간 섬유증, 특발성 간 섬유증, 간경변, 알코올성 지방간염, 만성 간질환, 바이러스성 간염 등)의 예방, 개선 또는 치료에 효과가 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명의 일 태양에 따르면, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 섬유화 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 또는 SOD 단독의 섬유화 질환 예방, 개선 또는 치료용 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD로부터 선택된 둘 이상의 조합의 섬유화 질환 예방, 개선 또는 치료용 용도가 제공된다.
섬유화 질환(fibrotic diseases) 또는 섬유증(fibrosis)은 다양한 조직의 구조 및 기능을 변화시키는 손상 또는 염증에 따른 콜라겐 매트릭스의 비정상적인 축적을 특징으로 한다. 섬유화 질환 또는 섬유증은 신장, 간, 폐, 심장, 골수, 및 피부 등 다양한 장기의 조직에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 상기 섬유화 질환 또는 섬유증으로는 간 섬유증, 간경변, 성대반흔형성, 성대 점막 섬유증, 후두의 섬유화, 폐 섬유증, 췌장 섬유증, 골수 섬유증, 심근경색, 심근경색 후의 심근의 섬유화, 심근 섬유증, 심내막심근 섬유증, 비장 섬유증, 종격 섬유증, 혀점막 아래 섬유증, 장관 섬유화(예를 들면, 염증성장질환을 수반하는 것 등), 후복막섬유증, 자궁 섬유증, 강피증, 유선 섬유증 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 섬유화 질환은 폐 섬유증일 수 있다. 폐 섬유증은 협의의 폐 섬유증(PF)뿐만 아니라, 간질성 폐 질환(ILD)(자가면역증상, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 블레오마이신과 같은 항암제, 항생제 등 약물 투여, 독성 물질 등에 의한 폐 섬유화 또는 폐 손상) 또는 특발성 폐 섬유증(IPF)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 섬유화 질환은 폐 섬유증(PF) 또는 특발성 폐 섬유증(IPF)일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 섬유화 질환은 간질성 폐 질환(ILD)일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 섬유화 질환은 간 섬유증일 수 있다. 간 섬유증은 협의의 간 섬유증뿐만 아니라, 비알코올성 지방간염, (진행성) 간섬유증, 특발성 간 섬유증, 간경변, 알코올성 지방간염, 만성 간질환, 또는 바이러스성 간염을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 섬유화 질환은 비알코올성 지방간염(NASH)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 바실러스 벨레젠시스 균주 포자를 폐 섬유증 유발(블레오마이신 처리) 전·후에 경구 투여하였을 때 폐 섬유화 정도가 크게 개선되었고, 이러한 효과는 SOD의 발현정도가 큰 SOD 과발현 균주 변이체의 포자를 투여한 경우에 더 큰 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 실시예에서, SOD 과발현 균주 포자를 투여한 후, 블레오마이신 유도된 폐 섬유화 마우스 모델의 21일 생존율은 폐 섬유증을 유도하지 않은 정상 마우스와 거의 유사할 정도로 우수한 것으로 확인되었다(예방적 효과). 또한, 블레오마이신을 처리하여 폐 섬유화를 유도한 마우스 모델에 SOD 과발현 균주 포자를 투여한 경우에는 정상 마우스만큼 생존율이 높지는 않았지만, 블레오마이신 투여군에 비해 현저하게 생존율이 상승하였다(치료적 효과).
본 발명의 또 다른 실시예에서, 위산에서의 안정성을 높인 경구용 SOD를 단독으로 투여한 경우에도 블레오마이신 유도된 폐 섬유화 마우스 모델의 폐 섬유화를 개선시키는 데 효과가 있었으며, 상기 경구용 SOD를 SOD 정상 균주 포자와 병용 투여하였을 때도 폐 섬유화 억제 효과를 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 스트렙토조토신 용액 및 고지방 식이를 통해 NASH를 유발한 동물모델에 바실러스 벨레젠시스(바실러스 아밀로리쿼파시엔스) 균주를 경구 투여하였을 때 간 섬유화 정도가 크게 개선되었고, 이러한 효과는 SOD 발현 정도가 크게 개선된 균주일수록 효과가 우수하였다. 또한, 비알코올성 지방간염 지표(전혈당 수치, 혈장 ALT 수준, 혈장 CK-18 수준, 간 중성지방 함량 등)의 개선 및 NAFLD 활성도 점수(NAS)의 유의한 감소도 나타내었다.
바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 SOD를 포함하는 조성물
본 발명의 다른 태양에 따르면, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물이 제공된다. 구체적으로 조성물은 (i) 바실러스 종 균주, (ii) 바실러스 종 균주 포자, (iii) SOD, (iv) 바실러스 종 균주 및 바실러스 종 균주 포자, (v) 바실러스 종 균주 및 SOD, (vi) 바실러스 종 균주 포자 및 SOD 또는 (vii) 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포자"는 "스포어"와 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 상기 바실러스 종 균주 포자는 바실러스 종 균주를 적합한 배지에서 배양하고 포자 형성을 유도한 후에 생성된 포자를 분리하여 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, 바실러스 종 균주는 약물 또는 식품에 사용하기에 일반적으로 안전한 것으로 간주되는 GRAS 세균으로부터 공급될 수 있다. 바실러스 종 균주 포자는 프로테아제 및 낮은 pH에 내성이 있는 것으로 알려져 있다(문헌 [Cutting SM. Bacillus probiotics. Food Microbiol. 2011;28:214-220. doi: 10.1016/j.fm.2010.03.007]; 및 문헌[Wang Y, et al., In vitro assessment of probiotic properties of Bacillus isolated from naturally fermented congee from inner Mongolia of China. World J. Microb. Biot. 2010;26:1369-1377. doi: 10.1007/s11274-010-0309-7] 참조).
또한, 바실러스 종 균주는 여러 국가에서 승인된 GRAS 프로바이오틱스(probiotics)이다. 구체적으로, 바실러스 종 균주는 바실러스 벨레젠시스(B. velezensis), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(B. amyloliquesfaciens), 바실러스 메틸로트로피쿠스(B. methylotrophicus), 바실러스 시아멘시스(B. siamensis), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 테퀴렌시스(B. tequilensis), 바실러스 아트로페어스(B. atrophaeus), 바실러스 모자벤시스(B. mojavensis), 또는 바실러스 발리스모르티스(B. vallismortis)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바실러스 종 균주 포자는 상술한 균주로부터 유래될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 바실러스 종 균주는 바실러스 벨레젠시스(바실러스 아밀로리쿼파시엔스) 균주(예컨대, GF423 균주, GF424 균주 또는 GF427 균주)일 수 있다. 바실러스 종 균주 포자는 바실러스 벨레젠시스(바실러스 아밀로리쿼파시엔스) 균주(예컨대, GF423 균주, GF424 균주 또는 GF427 균주)로부터 유래될 수 있다. GF423 균주, GF424 균주 및 GF427 균주는 한국생명공학연구원에 각각 2017년 3월 6일자, 2017년 3월 13일자 및 2023년 8월 14일자로 기탁된 것이다(수탁번호 KCTC 13222 BP, 수탁번호 KCTC 13227 BP 및 수탁번호 KCTC 15552 BP). 또한, GF423 균주의 특성 및 배양방법은 한국등록특허 제1762199호에 기재되어 있고 이의 개시 내용 전체가 참조로 본 명세서에 통합된다. 상기 기탁된 바실러스 종 균주는 이전 출원에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스로 분류 및 기재하였으나, 게놈 기반의 분류 방법인 DDH 및 ANI를 이용하여 비교한 결과, 종 단위(species level) 구별 기준을 만족하지 못하여 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)에 속하는 미생물로 분류해야 한다고 제안되었으며, LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature; https://lpsn.dsmz.de/species/bacillus-velezensis)에도 "바실러스 벨레젠시스"로 등재되었다(문헌 [Fan, Ben, et al. "Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, and Bacillus siamensis form an "operational group B. amyloliquefaciens" within the B. subtilis species complex." Frontiers in microbiology 8 (2017): 22.] 참조). 바실러스 벨레젠시스와 바실러스 아밀로리쿼파시엔스가 이형이명(분류학적 이명, heterotypic synonym)이라는 점을 고려할 때, 두 명칭은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주는 바실러스 벨레젠시스 균주와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 이에 따라, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주, GF424 균주 및 GF427 균주는 바실러스 벨레젠시스 GF423 균주, GF424 균주 및 GF427 균주와 동일한 균주로 이해될 수 있다.
기탁된 바실러스 종 균주가 바실러스 벨레젠시스로 분류된 과정은 다음과 같다. 기탁된 바실러스 종 균주를 분리하여 DDH, ANI 및 AAI 분석(유전자 기반 분류법)을 통해 상동성이 높은 기준 균주 3종과 16S rRNA 유전자 및 전체 게놈을 비교하였다(표 1 참조).
바실러스
아밀로리쿼파시엔스 플란타룸 		바실러스
아밀로리쿼파시엔스
아미리로리쿼파시엔스 		바실러스 섭틸리스 스피지제니 종 구별기준 (threshold) (%)
기준 균주 FZB42 DSM7 NRRL B-23049 -
16S rRNA 99.67~99.73% 99.46~99.66% 99.18~99.39% 98.65%
DDH 92.10% 78.60% 32.70% 70%
ANI 98.65% 93.59% 80.04% 94%
AAI 98.79% 95.09% 79.88% 95%
표 1을 참조하면, DDH 및 ANI 결과를 통해 기탁된 바실러스 종 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 아종 아미리로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens subspecies amyloliquefaciens) 보다 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 아종 플란타룸(Bacillus amyloliquefaciens subspecies plantarum)과 유사함을 알 수 있다(DDH 종 구별 기준은 70% 이상이며, ANI 종 구별 기준은 94% 이상임). 한편, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 아종 플란타룸은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 아종 아미리로리쿼파시엔스의 기준균주(type strain)인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 DSM7과 게놈 기반의 분류 방법인 DDH와 ANI를 이용하며 비교 시, 종 단위 구별 기준을 만족하지 못하여 아밀로리쿼파시엔스 아종 아미리로리쿼파시엔스와 동일한 종이 아니라 바실러스 벨레젠시스에 속하는 미생물로 분류되었다. 일부 구현예에서, 바실러스 종 균주는 SOD를 발현 또는 생성하는 균주이거나 SOD를 과발현 또는 과생성하도록 변이되거나 재조합된 변이 균주일 수 있다. 일부 구현예에서, 바실러스 종 균주 포자는 SOD를 발현 또는 생성하는 균주의 포자일 수 있다. 또한, 바실러스 종 균주 포자는 SOD를 과발현 또는 과생성하도록 변이되거나 재조합된 균주로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 바실러스 종 균주는 천연에서 분리된 균주(예컨대 GF423 균주)일 수 있거나, SOD를 과발현 또는 과생성하도록 변이된 변이체 균주(예컨대 GF424 또는 GF427 균주)일 수 있다.
다른 구현예에서, 바실러스 종 균주 포자는 바실러스 벨레젠시스 균주의 SOD를 발현하도록 재조합된 다른 바실러스 종 균주로부터 유래될 수 있다. 이러한 재조합 균주에 대해서는 하기에서 더 설명한다.
바실러스 종 균주의 포자 형성은 당업계에 알려진 통상의 기술을 사용하여 유도될 수 있다. 예컨대, 포자는 균주를 전배양한 후 본 배양할 때에 DSM(Difco Sporulation Medium), NB(Nutrient broth), SYP(Starch Yeast extract Peptone medium), LB2(Luria-Bertani 2) 등의 배지에서 포자 형성을 유도하여 얻어질 수 있으며, 천연, 변이체, 또는 재조합 숙주를 비롯한 다양한 공급원을 배양하여, 영양세포 제거 후 여과, 농축 또는 원심분리 등을 통하여 분리될 수 있다.
한편, 수퍼옥시드 디스뮤타제(Superoxide dismutase; SOD)는 수퍼옥시드(O2 ㆍ-) 라디칼의 일반 분자 산소(O2)와 과산화수소(H2O2)로의 디스뮤테이션(dismutation)을 번갈아 촉매하는 효소로서, SOD는 활성 산소 종을 제거하여 산화 스트레스를 줄이는 데 중요한 역할을 한다. SOD는 원핵 세포와 진핵 세포에 널리 분포하고 있으며, 다양한 유형의 금속 중심(구리/아연, 니켈, 망간 및 철)에 따라 4가지 부류로 분류된다. 망간 함유 SOD[Mn-SOD]가 많은 세균 또는 진핵 세포의 엽록체, 미토콘드리아 및 세포질에 광범위하게 존재한다. 본 발명에서 용어 "SOD"는 수퍼옥시드 디스뮤타아제 활성을 갖는 (폴리)펩티드와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, SOD는 수퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 융합체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, SOD는 망간에 결합하는 것(Mn-SOD)일 수 있다. 바람직하게는, SOD는 탈아미드화된 Mn-SOD일 수 있다. 또한, SOD는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다(SodA). 바람직하게는, SOD는 서열번호 2를 기준으로 74번 및 137번 아미노산 잔기가 Asp로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, SOD는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(SodA2). 일부 구현예에서, SOD는 단백질 번역 과정 중 시작 코돈인 메티오닌(Met)이 제거된 형태일 수 있다. 바람직하게는, 탈아미드화된 Mn-SOD의 메티오닌(Met)이 제거된 형태일 수 있다. SOD는 서열번호 2를 기준으로 1번 아미노산 잔기인 Met이 결실된 것일 수 있다. 바람직하게는, SOD는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(Met-deleted SodA). 또한, SOD는 서열번호 4를 기준으로 1번 아미노산 잔기인 Met이 결실된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, SOD는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(Met-deleted SodA2).
본 발명의 SOD 또는 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열도 포함되는 것으로 해석된다. 상기 실질적인 동일성은 당업계에 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석하는 경우, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
일부 구현예에서, SOD는 SOD 효소 활성을 갖는 개질된(modified 또는 engineered) 폴리펩티드로서 다양한 측면(생체내, 시험관내 또는 생체외 안정성, 균일성, 및/또는 형태적 변경)에 영향을 미치거나 미치지 않는 하나 이상의 변이, 예컨대, 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 정제, 검출, 생체내 전달 또는 안정성 증가를 위한 이종성 물질(예컨대, HIS tag, HA tag, myc tag를 포함한 당업계에 공지된 tag, GFC 및/또는 항체의 Fc 도메인)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 SOD는 천연, 변이체 또는 재조합 미생물을 비롯한 다양한 공급원로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, SOD는 박테리아로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, SOD는 약물 또는 식품에 사용하기에 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe, GRAS) 박테리아, 예를 들어 바실러스 종(Bacillus sp.) 균주 또는 그의 변이체 또는 재조합체로부터 유래될 수 있다. 바실러스 종 균주의 구체적인 예는 상술한 바와 같다. 보다 바람직하게는, SOD는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주(예컨대, GF423 균주, GF424 균주 또는 GF427 균주) 또는 이들의 배양 상등액으로부터 얻어질 수 있다. 상기 바실러스 벨레젠시스 GF424 균주는 sod 유전자의 발현을 개선하기 위해 바실러스 벨레젠시스 GF423 균주를 UV 조사에 의해 돌연변이시킴으로써 얻은 균주이다. 상기 바실러스 벨레젠시스 GF427 균주는 sod 유전자의 발현을 개선하기 위해 바실러스 벨레젠시스 GF423 균주의 프로모터 서열을 보다 강력한 프로모터 성능을 갖는 염기 서열로 치환하여 얻은 균주이다. 바실러스 벨레젠시스 GF423, GF424 또는 GF427 균주에서 유래된 SOD 효소(SodA)는 Mn-SOD이며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시됨). 또한, SOD는 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2를 기준으로 74번 및 137번 아미노산 잔기가 Asp로 치환된 탈아미드화된 SOD일 수 있고(SodA2), 이는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3으로 표시됨). 또한, SOD는 시작 코돈인 메티오닌(Met)이 제거된 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 4를 기준으로 1번 아미노산 잔기가 결실된 SOD일 수 있고, 이는 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 서열번호 1 내지 6의 서열은 표 2에 나타낸 바와 같다.
구분 서열 서열번호
SodA의 뉴클레오티드 서열 ATGGCTTACAAACTTCCAGAATTGCCTTACGCTTATGATGCTTTAGAACCTCATATCGATAAGGAAACGATGACGATTCACCATACGAAGCACCATAACACATACGTGACAAACCTCAACAAAGCGATCGAAGGATCTGCGCTTGCAGAGAAATCTGTAGATGAGCTTGTTGCTGATTTGAACGCAGTGCCGGAGGACATCCGCACGGCAGTCCGCAACAATGGCGGCGGACATGCAAACCACTCTTTATTCTGGACTCTTTTATCTCCGAACGGCGGAGGCGAACCGACTGGTGAGCTTGCTGAAGAGATCAAAAGCACGTTCGGAAGCTTCGATCAATTTAAAGAAAAATTCGCCGCAGCAGCTGCAGGCCGTTTCGGTTCAGGCTGGGCTTGGCTCGTTGTAAACAACGGCAAACTTGAAATTACAAGCACGCCAAACCAAGATTCACCGCTTTCAGAAGGTAAAACACCTGTTCTCGGTCTTGATGTTTGGGAGCATGCGTACTACCTGAACTACCAAAACCGCCGTCCTGATTACATTTCAGCTTTCTGGAATGTTGTGAACTGGGATGAAGTTGCCCGTCTTTACAGCGAAGCAAAATAA 서열번호 1
SodA의 아미노산 서열 MAYKLPELPYAYDALEPHIDKETMTIHHTKHHNTYVTNLNKAIEGSALAEKSVDELVADLNAVPEDIRTAVRNNGGGHANHSLFWTLLSPNGGGEPTGELAEEIKSTFGSFDQFKEKFAAAAAGRFGSGWAWLVVNNGKLEITSTPNQDSPLSEGKTPVLGLDVWEHAYYLNYQNRRPDYISAFWNVVNWDEVARLYSEAK 서열번호 2
SodA2의 뉴클레오티드 서열 ATGGCTTACAAACTTCCAGAATTGCCTTACGCTTATGATGCTTTAGAACCTCATATCGATAAGGAAACGATGACGATTCACCATACGAAGCACCATAACACATACGTGACAAACCTCAACAAAGCGATCGAAGGATCTGCGCTTGCAGAGAAATCTGTAGATGAGCTTGTTGCTGATTTGAACGCAGTGCCGGAGGACATCCGCACGGCAGTCCGCAACGATGGCGGCGGACATGCAAACCACTCTTTATTCTGGACTCTTTTATCTCCGAACGGCGGAGGCGAACCGACTGGTGAGCTTGCTGAAGAGATCAAAAGCACGTTCGGAAGCTTCGATCAATTTAAAGAAAAATTCGCCGCAGCAGCTGCAGGCCGTTTCGGTTCAGGCTGGGCTTGGCTCGTTGTAAACGACGGCAAACTTGAAATTACAAGCACGCCAAACCAAGATTCACCGCTTTCAGAAGGTAAAACACCTGTTCTCGGTCTTGATGTTTGGGAGCATGCGTACTACCTGAACTACCAAAACCGCCGTCCTGATTACATTTCAGCTTTCTGGAATGTTGTGAACTGGGATGAAGTTGCCCGTCTTTACAGCGAAGCAAAATAA 서열번호 3
SodA2의 아미노산 서열 MAYKLPELPYAYDALEPHIDKETMTIHHTKHHNTYVTNLNKAIEGSALAEKSVDELVADLNAVPEDIRTAVRNDGGGHANHSLFWTLLSPNGGGEPTGELAEEIKSTFGSFDQFKEKFAAAAAGRFGSGWAWLVVNDGKLEITSTPNQDSPLSEGKTPVLGLDVWEHAYYLNYQNRRPDYISAFWNVVNWDEVARLYSEAK 서열번호 4
Met-deleted SodA의 아미노산 서열 AYKLPELPYAYDALEPHIDKETMTIHHTKHHNTYVTNLNKAIEGSALAEKSVDELVADLNAVPEDIRTAVRNNGGGHANHSLFWTLLSPNGGGEPTGELAEEIKSTFGSFDQFKEKFAAAAAGRFGSGWAWLVVNNGKLEITSTPNQDSPLSEGKTPVLGLDVWEHAYYLNYQNRRPDYISAFWNVVNWDEVARLYSEAK 서열번호 5
Met-deleted SodA2의 아미노산 서열 AYKLPELPYAYDALEPHIDKETMTIHHTKHHNTYVTNLNKAIEGSALAEKSVDELVADLNAVPEDIRTAVRNDGGGHANHSLFWTLLSPNGGGEPTGELAEEIKSTFGSFDQFKEKFAAAAAGRFGSGWAWLVVNDGKLEITSTPNQDSPLSEGKTPVLGLDVWEHAYYLNYQNRRPDYISAFWNVVNWDEVARLYSEAK 서열번호 6
또한, SOD는 상기 바실러스 벨레젠시스 균주의 SOD 발현 유전자를 포함하는 다른 재조합 균주(예컨대, 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis) 종 균주)로부터 유래될 수 있다. 상기 재조합 균주는 당업계에 알려진 통상적인 단백질 생산 균주를 이용하여 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 (재조합 균주의 모균주인) 바실러스 서브틸리스 균주는 KCTC 3135일 수 있으며, 상기 KCTC 3135 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 분양받을 수 있다. 또한, 상기 재조합 균주는 후공정을 유리하게 하기 위해 하기 표 3에 나타낸 유전자 중 하나 이상이 제거될 수 있다.
유전자 명칭 단백질 명칭 기능
AprE 세린 알칼리 프로테아제(서브틸리신 E) 세포외 프로테아제
NprE 세포외 중성 메탈로프로테아제 세포외 프로테아제
Bpr 바실로펩티다제(bacillopeptidase) F 세포외 프로테아제
Epr 세포외 세린 프로테아제 세포외 프로테아제
NprB 세포외 중성 프로테아제 B 세포외 프로테아제
Vpr 세포외 세린 프로테아제 세포외 프로테아제
Mpr 세포외 메탈로프로테아제 세포외 프로테아제
IspA 세포내 세린 프로테아제 세포내 프로테아제
SrfAC 서팩틴 신타제 서팩틴(surfactin) 합성
spoIIAC RNA 폴리머라제 포자형성-특이적 시그마 인자(시그마-F) 포자형성
EpsE 추정 글리코실트랜스퍼라제 세포외 다당류
Xpf RNA 폴리머라제 시그마 인자 PBSX 프로파지 유전자의 전사
예컨대, 상기 재조합 균주는 도 1에 도시된 과정을 거쳐 제조될 수 있다. 또한, 상기 재조합 균주는 도 2에 도시된 발현 벡터를 포함할 수 있다. 상기 도면에서 sodA 및 sodA2는 SOD를 코딩하는 유전자를 나타낸다. 상기 균주 유래의 SOD는 세포 외부로 분비되는 효소이므로, 상기 균주를 이용하여 SOD를 제조하는 경우, 고가의 정제 과정(예를 들어 컬럼 정제)을 거치지 않고 개체에 안전성이 확보된 SOD를 대량으로 생산할 수 있기 때문에 효율적인 생산이 가능하다.
일부 구현예에서, SOD는 상기 천연, 변이체 또는 재조합 미생물을 다양한 배양 배지에서 배양하여 수득될 수 있다. 예를 들어 SOD는 바실러스 벨레젠시스 GF423 균주, GF424 균주 또는 GF427 균주의 배양 상층액으로부터 분리될 수 있다. 구체적으로, 먼저 바실러스 벨레젠시스 균주를 다양한 유형의 배지에서 배양하여 배양액을 얻을 수 있다. 예를 들어, 복합 배지(pH 6.0 내지 7.0)를 사용하여 상기 균주를 약 25℃ 내지 약 42℃에서 약 1 일 내지 약 4 일 동안 성장시킨다. 상기 바실러스 벨레젠시스 균주를 배양하기 위한 다른 적합한 배지로는 LB(Luria-Bertani) 배지, ISP(International Streptomyces Project) 배지, NA(nutrient agar) 배지, BHI(brain heart infusion agar) 배지, SDA(sabouraud dextrose agar) 배지, PDA(potato dextrose agar) 배지, NB(nutrient broth) 배지 등이 포함된다. 바람직한 구현예에서, LB 배지, ISP 배지, BHI 배지, SDA 배지, 또는 NB 배지가 사용될 수 있다. 또한, SOD는 PubMed 또는 BRENDA(월드 와이드 웹의 brenda-enzymes.org)와 같은 데이터베이스에 제공된 정보를 사용하여 다른 천연, 변이체 또는 재조합 숙주로부터 공급될 수 있다.
일부 구현예에서, SOD는 천연, 변이체 또는 재조합 균주의 배양물로부터 단리되거나 정제된 것일 수 있다. 이때 단리되거나 정제된 SOD 또는 그의 생물학적 활성 부분에는 그것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다. 예를 들어, 정제물은 균주 배양물로부터 한외 여과(Ultrafiltration), 황산암모늄 처리, 컬럼 정제, 농축 등을 통해 순수 분리된 것이거나, 한외 여과, 농축 등을 통해 얻어진 배양 농축액일 수 있다. "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 문구는, 단백질이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 그러한 단백질이 분리된 단백질의 제조물을 포함한다. 일부 구현예에서, "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 문구는 원하지 않는 단백질이 건조 중량을 기준으로 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 5% 미만인 단백질의 제조물을 포함한다.
SOD는 다음과 같은 정제 방법으로 정제하는 것이 바람직할 수 있지만, 이로 한정되지는 않는다. 예컨대, 앞서 바실러스 벨레젠시스 균주를 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 수집한다. 상등액 분획을 고체상 추출로 전처리하고, 이어서 크로마토그래피로 단리하고 정제한다. 다양한 방식의 크로마토그래피를 사용하여 SOD를 정제할 수 있다. 바람직하게는, 소수성 상호작용 크로마토그래피가 사용된다.
일부 구현예에서, SOD는 균주 용해물(lysate), 균주 배양물, 균주 배양 농축액, 균주 배양 추출물, 또는 그의 건조 형태로 포함될 수 있다. 이때, "균주 용해물"은 균주를 배양하여 기계적 또는 화학적으로 파쇄하여 얻은 것을 의미하며 이로부터 추출, 희석, 농축, 정제 등의 추가 공정을 거친 것을 모두 포함할 수 있다. "균주 배양물"은 균주를 배양하여 얻은 배양액 그 자체 또는 그의 상층액을 의미할 수 있다. "균주 배양 농축액"은 균주 배양물로부터 한외 여과, 황산암모늄 처리, 컬럼 정제, 농축 등을 통해 순수 분리된 것이거나, 한외 여과, 농축 등을 통해 얻어진 배양 농축액을 지칭한다. "균주 배양 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다. 상기 건조 형태는 동결 건조 형태를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, SOD는 그것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질, 예컨대 세포외 소포체(Extracellular vesicle)를 포함할 수 있다. 이 경우에 SOD를 포함하는 세포 물질은 상기 기술한 바와 같이 당업계에 알려진 통상의 기술을 사용하여 천연, 변이체 또는 재조합 숙주를 비롯한 다양한 공급원을 배양하여 그 배양액으로부터 여과, 농축 등의 방법으로 분리될 수 있다.
섬유화 질환의 예방 또는 치료 방법
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 바와 같은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 섬유화 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법이 제공된다. 예컨대, 섬유화 질환이 발생하였거나 발생할 가능성이 있는 대상에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물을 치료학적 또는 식품학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 섬유화 질환은 본 명세서에 설명된 바와 같다.
일부 구현예에서, 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 또는 SOD를 단독으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 조합하여 대상에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 투여는 경구 또는 비경구 투여일 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 또는 SOD가 대상에 경구 투여되는 경우에도 섬유화 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 조성물의 유효량 또는 효과적인 무독성 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 SOD를 포함하는 조성물의 치료 활성량은 질환 단계, 질환의 중증도, 대상체의 연령, 성별, 의학적 합병증, 및 체중, 그리고 대상체에서 요망되는 반응을 유발하는 종 균주 포자의 SOD 발현 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량 및 투여요법은 최적 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 분할 용량이 매일, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다 등으로 투여될 수 있고/거나, 용량이 치료 상황의 긴박함에 따라 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다.
일 예로, 바실러스 종 균주 또는 바실러스 종 균주 포자는 104 내지 1012, 104 내지 1010, 104 내지 109, 105 내지 1012, 105 내지 1011, 105 내지 1010 또는 105 내지 109 cfu로 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 섬유화 질환을 유발하거나 유발할 우려가 있는 하나 이상의 다른 제제를 투여하는 경우에 섬유화 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위해 함께 투여될 수 있다. 상기 다른 제제에는 항생제, 면역억제제, 심장 질환에 대한 약물 및 암 화학 요법 약물 등 다른 질환을 호전 또는 개선시킬 목적으로 투여하는 약물로 의도치 않은 섬유화 질환을 유발할 가능성이 있는 임의의 제제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 SOD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물이 다른 제제와 함께 투여되는 경우에, 이들은 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 다른 제제가 투여되기 전부터 투여될 수 있다. 각각의 성분은 다른 성분이 투여될 때와 상이한 시간에 대상에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 투여는 비-동시적으로(예를 들어 개별적으로 또는 순차적으로) 주어진 기간에 걸쳐 여러 간격으로 주어질 수 있다. 또한, 개별 성분은 동일하거나 상이한 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 투여될 수 있는 경로는 약학 조성물에 자세히 기재되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 상기 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여될 수 있다. 즉, 다음의 (i) 내지 (vii)의 구성을 포함하는 조성물은 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여되어 섬유화 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다: (i) 바실러스 종 균주 및 바실러스 종 균주 포자, (ii) 바실러스 종 균주 및 SOD, (iii) 바실러스 종 균주 포자 및 SOD 또는 (iv) 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD. 바람직하게는, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD가 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여되어 섬유화 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상술한 바와 같은 조성물을 포함하는 약학 또는 수의학적 조성물이 제공된다. 다시 말해서, 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학 또는 수의학적 조성물이 제공된다. 본 발명의 약학 조성물은 인간을 제외한 동물에 적용되는 경우에 수의학적 조성물이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 섬유화 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 섬유화 질환에 대한 내용은 상술한 바와 같다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제는 당업계에 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 이산화규소 등의 광물유 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 첨가제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 제제화를 위한 첨가제는 약제 분야에서 통상 사용하는 것 중에서 적합한 것을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 사용 방법에 따라 바람직한 형태로 제형화될 수 있으며, 특히 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 그러한 제형의 구체적인 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제, 주사용액, 경고제(Plasters), 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 에어로졸제, 엑스제(Extracts), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 침제, 크림제, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 패치제 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최신판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여시 정맥 내, 피하, 복강 내, 폐 내, 동맥 내, 근육 내, 직장, 질 내, 관절 내, 전립선 내, 비 내, 안구 내, 방광 내, 척추강 내 투여 또는 심실 내 투여(예를 들어 뇌실 내 투여)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 복합 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.
경구 투여의 경우, 위산으로부터의 보호를 위해 SOD가 쉘락(shellac)으로 코팅될 수 있지만, 코팅제는 이로 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 코팅제의 예에는 쉘락, 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 제인(zein), 유드라짓(Eudragit), 및 이들의 조합이 포함된다. SOD가 코팅되는 경우, SOD는 용액 중에서 코팅될 수 있다. 구체적으로, 정제된 용액과 쉘락 함유 용액이 혼합되고, 이어서 동결 건조된다. 이 동결 건조된 샘플은 분말로 만들어져 사용 시까지 약 4 ℃에서 보관될 수 있다. 일부 구현예에서, SOD는 쉘락 코팅을 통해 위산에서의 안정성을 높인 경구용 SOD일 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 4를 기준으로 1번 아미노산 잔기인 Met이 결실된 쉘락 코팅된 SOD일 수 있다. 보다 바람직하게는, SOD는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 쉘락 코팅된 SOD일 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 유효한 양으로 투여된다. 용어 "약학적으로 유효한 양" 또는 "수의학적으로 유효한 양"은 의학적 또는 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자 또는 동물의 체중, 성별, 연령, 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이러한 양은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 액체 형태, 고체 형태, 겔 형태, 분말 형태, 페이스트 형태 등을 포함하여 당업계에 알려진 인체 투여에 적용되는 다양한 형태를 가질 수 있다.
식품 또는 사료 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 기술한 바와 같은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 조성물이 제공된다. 이러한 식품 조성물은 의료용 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 식품 조성물을 포함한다. 따라서, 상기 식품 조성물은 섬유증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.
용어 "의료용 식품" 또는 "뉴트라슈티컬 식품"은 인체에 유익한 기능을 할 가능성이 있는 원료 또는 성분으로 제조된 식품으로서, 정상적인 기능을 유지하거나 인체의 생리적 기능을 활성화함으로써 건강을 유지시키거나 개선시키는 식품을 지칭하고, 식품의약품안전처에 의해 규정되지만 이로 한정되지 않으며, 임의의 통상적인 건강 식품을 그 의미에서 배제하지 않는다.
또한, 상기 식품에는 각종 식품류, 식품 첨가제, 음료(예를 들어, 기능성 음료, 천연 과일 주스 및 야채 음료), 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품, 기타 기능성 식품 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
상기 식품은 당업계에 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 의료용 식품, 뉴트라슈티컬 식품 또는 건강기능식품은 섬유증 질환을 예방하거나 개선시킬 목적으로 상기 SOD에 더하여 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 추가로 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 통상의 기술자는 그 제형에 따라 적절한 성분을 조합하여 제조할 수 있다.
상기 상술한 제형 내 유효성분으로서의 본 발명에 따른 바실러스 종 균주, 균주 포자 및/또는 SOD의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다
본 발명의 식품의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 10 내지 1,000 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 건강기능식품의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없을 수 있으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상술한 바와 같은 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 SOD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 사료 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명의 사료 조성물은 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 사료 조성물은 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료첨가용 부형제(탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등)를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
제조예 1. SOD 발현 바실러스 벨레젠시스 균주 포자의 제조
본 실시예에서 사용되는 SOD를 발현하는 바실러스 벨레젠시스(바실러스 아밀로리쿼파시엔스) 균주의 포자는 생물자원센터(KCTC)에 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주(수탁번호: KCTC 13227BP, 수탁일자: 2017년 3월 13일)(이하 "GF424 균주"), 생물자원센터(KCTC)에 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주(수탁번호: KCTC 13222BP, 수탁일자: 2017년 3월 6일)(이하 "GF423 균주") 및 생물자원센터(KCTC)에 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주(수탁번호: KCTC 15552BP, 수탁일자: 2023년 8월 14일)(이하 "GF427 균주") 로부터 하기의 방법에 따라 제조하였다.
상기 바실러스 벨레젠시스 균주의 단일 콜로니를 14 mL 튜브에 들어있는 LB 1 mL에 접종하고, 37℃ 및 200 rpm에서 12시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL를 500 mL 플라스크 내의 LB 배지 50 mL로 옮기고, 37℃ 및 200 rpm에서 12시간 동안 배양하였다. 이후, 20 mL의 배양 배지를 2.5 L 배플 플라스크 내의 SYP 또는 DSM 1 L로 옮겼다. 접종된 배양액을 37℃ 및 200 rpm에서 24시간 내지 120시간 동안 배양하였다.
SYP 배지는 1.5% 소이톤(soy tone), 0.5% 효모 추출물, 0.5 % K2HPO4, 0.1% MnSO4, 0.1% MgSO4, 10 mM FeSO4, 0.04% (NH4)2SO4, 0.04% (NH4)2PO4, 0.1% CaCl2 및 2% 포도당을 함유하고, DSM 배지는 박토 영양 브로쓰 8 g/L, KCl 1 g/L, MgSO4 0.25 g/L, Ca(NO3)2 0.16415 g/L, MnCl2 0.9521 mg/L 및 FeSO4 0.152 mg을 함유한다. 상기 배지에 첨가되는 MnSO4, MgSO4, FeSO4, (NH4)2SO4, (NH4)2PO4 및 CaCl2는 사용 전에 ddH2O에 용해시켜 첨가하였다.
배양 후, 라이소자임(0.5 g/L)을 배양 브로쓰에 첨가하고, 37℃ 및 200 rpm에서 1시간 동안 배양하여 남아있는 영양 세포를 제거하였다. 6000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 미정제 포자를 수거하였다. 수거된 미정제 포자를 물로 2회 세척하고, 0.02% SDS로 세척하고, 다시 물로 2회 세척하고, 이어서 PBS 용액에 현탁시킴으로써 정제하였다. 포자 현탁액을 -20℃에서 보관하였다. 희석된 포자 용액을 LB 한천 플레이트에 도말한 후 콜로니를 계수함으로써 포자 수를 결정하였다.
상기 포자를 실험 조건에 따라 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)에 용해하여 100 ul 부피로 준비하였다.
제조예 2. GF427 균주의 제조
SOD를 발현하는 바실러스 벨레젠시스 GF427 균주는 GF423 균주로부터 하기의 방법에 따라 SOD 활성을 증가시키도록 GF423 sodA 유전자의 프로모터 서열을 보다 강력한 프로모터 성능을 갖는 염기 서열로 치환하여 제조하였다.
기존 GF423 균주의 프로모터 서열 및 변이체 GF427 균주의 프로모터 서열은 다음과 같다: GF423 프로모터 서열(5'-TTGATTACCACGCTTTCTTTT―GTTACATT-3')(서열번호: 7) 및 GF427 프로모터 서열(5'-TTGACTTT-ACGCTTTCTTATAGGTTATAAT-3')(서열번호: 8).
게놈 상에서 염기서열의 치환은 이중 교차 재조합으로 수행하였다(도 3). GF423 게놈 DNA를 주형으로 하고, SOD up F 및 Psodmut R 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 얻은 PCR 산물 및 GF423 게놈 DNA를 주형으로 하고, Psodmut F 및 SOD dw R 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 얻은 PCR 산물을 준비하였다. 다음, LIC 방법을 이용하여 PCR 산물을 BamHI으로 절단한 pUori-cm-amp-tsrepA에 클로닝하여, pUori-cm-amp-10sod를 제작하였다(도 3a).
다음, pUori-cm-amp-10sod를 주형으로 하고, SOD PF 및 SOD P3R 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 얻은 PCR 산물 및 동일한 주형과 SOD P3F 및 SOD PR 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 얻은 PCR 산물을 준비하였다. LIC 방법을 이용하여 PCR 산물을 HindIII와 ClaI으로 절단한 pUori-cm-amp-10sod에 클로닝하여, 치환에 사용될 pUori-cm-amp-P3-SOD를 제작하였다(도 3b). 벡터는 대장균, E. coli C2984H를 사용하여 제작하였고, 사용한 프라이머의 염기 서열, PCR 조건 및 LIC 반응액 조성은 각각 표 4, 표 5, 및 표 6에 나타내었다.
프라이머 서열(5'→3') 서열번호
SOD up F tccagatcctctacgggcgctgcgtatgctggaa 9
Psodmut R aacttttctaatctcattataacaaaagaaagcg 10
Psodmut F cgctttcttttgttataatgagattagaaaagtt 11
SOD dw R gagttttcgttcggatctgtcctccggcactgcg 12
SOD PF gtaatggaataagccgaaagcttccagagctg 13
SOD P3R attataacctataagaaagcgtaaagtcaatgaaaaagctcacaatcc 14
SOD P3F ttgactttacgctttcttataggttataatgagattagaaaagttc 15
SOD PR catcgtttccttatcgatatgaggttctaaag 16
Cm C F ccgctatctttacaggtacatca 17
SOD mid R gaaccgaaacggcctgcag 18
424 conf F ggcaggcattatattaggcc 19
424 conf R gcactgcgttcaaatcagca 20
SOD DC F2 ggattcagcgcttcaaaatc 21
-10 SOD R cgcgaacttttctaatctcatta 22
SOD P2-R ctaatctcattataacctat 23
cm conf F acctttctgatgtagagaaatataatggttcggg 24
cm conf R cggcattatctcatattataaaagccagtcatt 25
PCR 단계 온도 시간
최초 변성 95℃ 30초
30회 주기 95℃50℃
72℃		 30초
30초
1분/kb
최종 신장 72℃ 10분
PCR에 사용한 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소(TAKARA, JAPAN)임.
혼합물 용량(ul)
선형화된 벡터 2
PCR 산물 1 1
PCR 산물 2 1
10X T4 polymerase buffer 1
10X BSA 1
T4 polymerase 0.5
DW 3.5(~to 10 ul)
총합 10
pUori-cm-amp-10sod를 전기천공법으로 GF423 균주에 형질전환(Transformation)하였다. GF423 균주를 LB-Sor 배지(1x LB, 0.5M 소르비톨)에 접종하여 37℃, 200rpm에서 배양하다가 OD 0.8에 글라이신을 최종 농도가 10 mg/ml가 되도록 넣어 준 뒤, 1.5 시간 동안 더 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 얼음에 넣고 15분 동안 식혀준 뒤, 4000rpm, 4℃, 10분 조건으로 원심분리하였다. 회수된 세포를 전기-형질전환 버퍼(0.5 M 소르비톨, 0.5 M 만니톨 및 10% 글리세롤 포함)로 3번 세척해준 뒤 같은 버퍼를 이용하여 배양 용량의 1/50로 세포를 재현탁하여 전기천공에 이용하였다. pUori-cm-amp-10sod의 DNA 0.5 ug을 제작된 세포와 섞은 뒤 차갑게 식힌 1 mm 갭 전기천공 큐벳에 넣고 3분 동안 얼음에서 반응시켰다. 다음, MicroPulser Electroporation 시스템(구입처: Bio-rad)을 이용하여 전계 강도(field strength)를 2.5V, 25 uF, 200 Ω 조건으로 설정하여 단일 전기 펄스를 가하였다(시간 상수 = 4.8-5.8). 펄스 직후 1 mL의 LB-Sor 배지를 넣어준 뒤, 37℃, 200 rpm에서 2시간 동안 회복시켰다. 이후, 세포를 항생제 고체배지(1x LB, cm 2.5 ug/ml, 1.5% agar)에 도말하여 37℃ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 생성된 콜로니는 cm conf F 및 cm conf R 프라이머를 사용한 PCR을 통해 형질전환 여부를 확인하였다.이중 교차 재조합의 유도 및 확인은 다음과 같이 진행하였다. 확인된 콜로니를 LB 배지에 첨가하여 37℃, 200 rpm에서 24시간 동안 배양한 뒤, 1/105로 희석하여 항생제 고체배지(1x LB, agar 1.5%)에 100 ul 도말하여 37℃ 인큐베이터에 20시간 배양하였다. 배양하여 얻은 콜로니 중 프라이머 Cm C F와 SOD mid R을 이용하여 PCR을 진행하여 단일 교차 재조합이 일어난 콜로니를 확보하였다. 확보된 콜로니를 다시 LB 브로쓰에 접종하고 28℃에서 20시간 배양한 후 1/105로 희석하여 LB 고체배지에 도말하고 배양하였다. 확인된 콜로니는 항생제 고체배지와 일반 고체배지에 모두 찍어 플라스미드가 제거된 콜로니를 확인하였다. 플라스미드가 제거된 콜로니 중 돌연변이 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 엔지니어링에 성공한 콜로니만 밴드가 확인되도록 PCR 조건을 설정하여 돌연변이에 성공한 콜로니를 선별하였다. 사용한 프라이머는 SOD DC F2, -10 SOD R 쌍, SOD DC F2, SOD P2 R 쌍을 사용하였다. 선별된 콜로니는 424 conf F 및 424 conf R 프라이머를 사용하여 PCR을 진행하고, PCR 산물을 겔 정제한 후 샘플을 시퀀싱하여 정확한 치환을 확인한 후 'GF427'로 명명하였다. 이러한 균주를 한국생명공학연구원에 2023년 8월 14일자로 기탁하였다(KCTC 15552 BP).
GF427 균주의 SOD 발현량의 증가를 확인하기 위해, SOD 활성이 개선된 형태인 GF424 균주의 SOD 발현량과 비교하였다. 배양 상등액의 SOD 활성은 다음과 같이 측정하였다. GF424 및 GF427 균주를 모두 50 ug/mL 농도의 MnSO4가 들어간 1x SYPG(1.5% 소이톤, 1% 효모 추출물, 0.5% 제2 인산칼륨(Potasium phosphate dibasic), 1% 포도당)에 콜로니를 접종하여 20시간 동안 배양하였다. 배양액을 12,000 rpm, 10분 조건으로 원심분리하고 배양 상등액을 회수하여, SOD 활성 측정에 사용하였다. SOD의 활성은 GF424의 경우 22.2 U/mL로 측정되었으며, GF427의 경우 GF424에 비해 약 3배 높은 67.8 U/mL로 측정되었다.
또한, GF427 균주 포자는 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 준비하였다.
실시예 1. 폐 섬유화 동물모델에서 SOD 과발현 균주 포자의 섬유증 예방 효과 확인
실시예 1.1. 폐 섬유화 동물모델의 확립 및 시험
SOD 과발현 균주 포자(GF424 포자)가 폐 섬유화 동물모델에서 예방적 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 폐 섬유화 동물모델을 확립하고 다음의 방법으로 실험을 진행하였다. 7주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 일주일 동안 순화 기간을 거친 뒤, 일반증상을 관찰하여 건강상태를 확인하고 건강한 동물을 시험에 사용하였다. 상기 마우스는 대조군(CTL), 블레오마이신 처리군(Bleo) 및 시험군(GF424 포자 투여군; B+Spore SOD)의 3개 그룹으로 나누었다. 시험군 마우스는 다시 3개 그룹으로 나누어 제조예 1에서 제조한 GF424 포자를 3가지 농도(1x106 CFU, 1x107 CFU 및 1x108 CFU)로 각 시험군 마우스에 3주 동안 1일 1회(주당 총 5회) 경구 투여하였고, 포자 투여를 시작한 날(-D7)로부터 7일째 되는 날(D0)에 블레오마이신(Bleomycin sulfate, 구입처: Millipore)을 3 U/kg 용량으로 1회 기관내(intratracheal) 투여하여 폐 섬유화를 유발하였다. 총 21일 동안 진행된 포자 및 블레오마이신의 투여 일정은 도 4를 참조한다. 한편, 대조군(CTL)은 폐 섬유화를 유발하지 않았으며 포자도 투여하지 않았다. 블레오마이신 처리군(Bleo)은 포자 투여 없이 D0에 블레오마이신을 3 U/kg 용량으로 1회 기관내 투여하여 폐 섬유화를 유발하였다(도 4 참조).
포자 최초 투여일로부터 21일이 되는 날에 실험을 종료하고 각 그룹의 마우스를 희생시켰다.
실시예 1.2. 하이드록시프롤린 농도 측정을 통한 콜라겐 농도 측정
하이드록시프롤린(Hydroxyproline)은 포유류에서는 거의 콜라겐에서만 발견되는 아미노산으로 콜라겐의 양을 직접적으로 측정할 수 있는 대표적인 지표이다. 다음의 과정을 통해 하이드록시프롤린 양을 측정하였다. 폐 섬유화 마우스 모델의 왼쪽 폐를 적출하여 10 mg의 폐 조직 당 100 ul의 멸균수를 첨가한 뒤, 조직을 완전히 곱게 갈아주었다. 곱게 갈린 조직의 현탁액과 동일한 양의 염산(HCl, ~12N)을 첨가한 뒤, 완전히 밀봉하여 120℃에서 3시간 동안 끓였다. 반응을 마친 세포 현탁액을 원심분리(4℃, 10,000 x g, 3분)하여 깨끗한 상층액만 새 튜브로 옮겨 담았으며, Hydroxyproline Colorimetric Assay Kit(구입처: Biovison) 및 멀티플레이트 분광계(Multiplate Spectrometer)를 이용하여 560 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 5를 참조하면, 블레오마이신에 의해 폐 섬유화가 진행되어 콜라겐의 양이 증가한 블레오마이신 처리군에서는 대조군에 비해 하이드록시프롤린이 높게 측정되었다. 반면, GF424 포자 투여군에서는 모든 농도에서 블레오마이신 처리군에 비해 하이드록시프롤린 양(즉, 콜라겐 양)이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 1x107 CFU 농도 투여군에서 가장 현저하게 감소되었다.
실시예 1.3. 폐 세척액 내 면역세포 수의 측정
폐 섬유화 마우스 모델의 목 기관지를 일부 절개하여 1 ml의 멸균된 PBS를 넣었다가 다시 회수하는 과정을 두 번 반복하였다. 회수하여 모아진 약 2 ml의 폐세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)을 신속하게 4℃ 온도에서 2,200 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 상층액은 새로운 2 ml 튜브에 담고, 세포 침전물에는 신선한 PBS 0.5 ml을 넣어 세포를 재현탁하였다. 세포 현탁액의 총 세포 수를 헤모사이토미터(Hemocytometer)를 이용하여 측정한 뒤, 샘플 당 1 X 105 cells/0.5 ml 농도로 PBS에 희석하여 준비하였다. 이렇게 준비한 세포를 세포 원심분리기(Cytocentrifuge)를 이용하여 600 rpm의 속도로 5분 동안 현미경 슬라이드에 붙였다. 슬라이드의 세포는 Diff-Quik 시약(구입처: Sysmex)을 사용하여 염색한 후, 총 폐 세척액 세포 중 대식세포(Macrophages), 림프구(Lymphocytes) 및 호중구(Neutrophils) 세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 도 6a 내지 도 6d를 참조하면, 블레오마이신 처리군에서는 상기 3종의 세포를 합친 총 세포 수(Total BAL cells) 및 각 세포 수 모두가 대조군 대비 증가하였고, GF424 포자 투여군에서는 블레오마이신 처리군에 비해 총 세포 수 및 각 세포 수 모두가 감소함을 확인하였다. 특히, 폐 섬유화에서 발견되는 면역세포의 대부분은 대식세포이고, 1x107 CFU 농도 투여군에서 대식세포 및 림프구 수가 가장 현저하게 감소됨을 확인하였다.
실시예 1.4. 폐 세척액 내 성장인자 베타 1(TGF-β1)의 농도 측정
성장인자 베타 1(TGF-β1)은 폐 섬유화의 발생에 매우 중요한 역할을 하는 인자로서, 활성산소 또는 여러 요인에 의해 세포가 자극을 받으면 TGF-β1이 활성화되고, 그로 인해 하위 메커니즘을 통해 폐 섬유화가 진행된다. TGF-β1을 측정하기 위하여 실시예 1.3에서 폐 세척액을 원심분리한 후 따로 모은 상층액을 4배로 농축하였다. 농축한 폐 세척액은 TGF-β1 ELISA kit(구입처: R&D systems) 및 멀티플레이트 분광계를 이용하여 450 nm에서 측정하여 폐 세척액 내 TGF-β1의 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 7을 참조하면, 블레오마이신 처리군에서는 폐 섬유화에 의한 TGF-β1의 양이 대조군 대비 현저하게 증가하였다. 반면, GF424 포자 투여군에서는 모든 농도에서 블레오마이신 처리군에 비해 TGF-β1의 양이 감소하였으며, 특히, 1x107 CFU 농도 투여군에서 현저하게 감소하였다.
실시예 1.5. 병리학적 조직 염색을 통한 폐 섬유화 확인
실시예 1.1에서 희생시킨 마우스에서 적출한 폐 조직을 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde, PFA) 용액에 하루 이상 담가 전처리 과정을 진행하였다. 다음, 폐 조직을 파라핀 블록으로 제작한 뒤, 5 ㎛ 두께로 절단하여 슬라이드에 붙였다. 조직 절편은 조직병리학적인 변화를 비교하기 위해 헤마톡실린과 에오신(H&E) 및 마슨 삼색 염색(Masson's trichrome stain)으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다.
관찰 결과, 도 8을 참조하면, 블레오마이신에 의해 증가된 폐 섬유화가 GF424 포자 투여군의 모든 농도에서는 효과적으로 감소한 것을 확인할 수 있었고, 특히 1x107 CFU의 농도 투여군에서 가장 효과가 좋았다.
실시예 1.6. 폐 섬유화 유전자 마커의 발현 수준 측정
폐 섬유화가 진행되면 활성화되는 것으로 알려져 있는 대표적인 유전자 마커인 Col1a1(콜라겐의 합성을 증가시키는 인자), TGF-β1(근섬유화세포를 활성화시켜 섬유화를 진행시키는 인자), CTGF(결합조직성장 인자) 및 IL-6(염증성 사이토카인)의 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time qRT-PCR)으로 확인하였다.
실시예 1.1에서 희생시킨 마우스에서 적출한 우폐엽(Right lung lobe) 중 일부분을 TRIzol reagent(구입처: Thermo Fisher Scientific)를 이용해 곱게 갈아낸 뒤 총 RNA(Total RNA)를 추출하였다. 추출한 RNA는 M-MLV RT reagent (구입처: Promega)를 사용하여 cDNA를 합성하였으며, 합성한 cDNA를 사용하여 Go Taq qPCR master mix(구입처: Promega) 프로토콜에 따라 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time qRT-PCR)을 수행하였다. 상대적인 mRNA 발현 정도는 18S rRNA를 내부 대조군으로 사용하여 보정하였고, 2-ΔΔCq 방법을 이용하여 값을 산정하였다. 이 실험 및 이하 qRT-PCR 실험에 사용한 프라이머(primer) 정보는 하기의 표 7에 정리하였다.
유전자명 프라이머 서열(5'→3') 서열 번호
Col1a1(Type 1 collage) F: GCTCCTCTTAGGGGCCACT 26
R: CCACGTCTCACCATTGGGG 27
α-SMA(α-Smooth Muscle Actin) F: GCTCCTCTTAGGGGCCACT 28
R: CCCAGACATCAGGGAGTAATG 29
TGF-β1(Transforming growth factor beta 1) F: AGACCACATCAGCATTGAGTG 30
R: GGTGGCAACGAATGTAGCTGT 31
CTGF(Connective tissue growth factor) F: GGGCCTCTTCTGCGATTTC 32
R: ATCCAGGCAAGTGCATTGGTA 33
IL-6(InterLeukin-6) F: CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG 34
R: GTCCTTAGCCACTCCTTCTG 35
TNF-α(tumor necrosis factor-α) F: CTTCTGTCTACTGAACTTCGGG 36
R: CAGGCTTGTCACTCGAATTTTG 37
IL-1β F: ACGGACCCCAAAAGATGAAG 38
R: TTCTCCACAGCCACAATGAG 39
18S rRNA F: CAGCGTGGTCAGGATAGAAC 40
R: CTTGATTTGAATGCAGCGGAC 41
그 결과, 도 9a 내지 도 9d를 참조하면, 전반적으로 블레오마이신 처리군 보다 GF424 포자 투여군에서 4종의 유전자의 발현이 모두 감소하는 경향을 보였다.
실시예 1.7. 활성산소 부산물 농도 측정
지질 과산화(lipid peroxidation)는 동물과 식물 모두에서 발생하는 생체 내 세포 손상의 대표적인 메커니즘이다. 지질 과산화물(lipid peroxidase)의 가장 일반적인 부산물인 말론디알데히드(MDA, malondialdehyde) 및 4-하이드록시노네날(4-HNE, 4-hydroxynonenal)의 폐 조직내 농도를 다음과 같이 측정하였다.
실시예 1.1에서 희생시킨 마우스에서 적출한 폐 조직의 일부를 1X RIPA 버퍼(protease inhibitor cocktail 포함, 구입처: Abcam)에 넣어 곱게 갈아주었다. 조직 현탁액을 4℃, 12000 rpm, 10분 조건으로 원심분리한 뒤, 깨끗한 상등액만 따로 분리하여 새 1.5 ml 튜브에 옮겨 담았다. 단백질 정량은 BCA assay kit (구입처: Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 멀티플레이트 분광계로 562 nm에서 측정하였다. 부산물 정량은 동량의 샘플을 MDA ELISA kit(구입처: Cell Biolabs, cat#. STA-832)와 HNE ELISA kit(구입처: Cell biolabs, cat#. STA-838)를 사용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 실험을 수행하고, 멀티플레이트 분광계를 이용하여 450 nm에서 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 10a 및 도 10b를 참조하면, 폐 조직 내에 존재하는 활성산소 부산물(MDA 및 4-HNE)의 양이 블레오마이신 처리군 보다 GF424 포자 투여군에서 모두 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 전반적으로, 1x107 CFU 농도에서 더 효과적으로 감소하였다.
실시예 2. 폐 섬유화 동물모델에서 SOD의 발현 수준이 상이한 균주 포자의 예방 효과 확인
실시예 2.1. SOD 발현 수준이 상이한 균주 포자의 제조 및 시험
폐 섬유화의 예방적 효과에 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD)의 발현 정도가 직접적으로 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 SOD 발현 정도가 상이한 바실러스 벨레젠시스 균주 3종의 포자를 준비하였다. 상기 3종의 균주는 SOD 유전자를 제거한 균주(녹아웃, knock-out, '-'로 표기, GF423Δ), 천연에서 분리된 SOD 발현의 정상 균주(wild, '+'로 표기, GF423), 및 SOD를 과발현하도록 유전자 조작된 과발현 균주(overexpression, '++'로 표기, GF424)이다.
sodA 기능이 결손된 상기 녹아웃 균주인 바실러스 벨레젠시스 ΔsodA를 다음과 같이 이중 교차 재조합에 의해 제작하였다. 먼저, 상동 재조합을 위해 sodA 유전자를 플랭킹하는 한 쌍의 DNA 단편을, 상류 단편(upstream fragment)에 대한 프라이머(5'aaacagctgggatgaacacaagtgagag 3'(서열번호 42) 및 5' cacactcttaagtttgcttccaattctggaagtttgtaag 3'(서열번호 43))와 하류 단편(downstream fragment)에 대한 프라이머(5' ctactgacagcttccaaggatacctgaactaccaaaaccg 3'(서열번호 44) 및 5' aaacagctgaagctcatgaccacagcaag 3'(서열번호 45))를 이용하여 그의 염색체로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 에리쓰로마이신 내성(EmR) 유전자를 프라이머(5' gaagcaaacttaagagtgtg 3'(서열번호 46) 및 5' tccttggaagctgtcagtag 3'(서열번호 47))를 이용하여 pDG1664(문헌 [Guerout-Fleury,A.M. ey al., Gene 180:57-61 (1996)] 참조)로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 상류 단편, EmR 유전자, 및 하류 단편을 순서대로 조립하고, 바실러스 서브틸리스에서 작동하는 온도 민감성 복제 기점을 포함하는 pUori-ts 플라스미드의 PvuII 자리에 클로닝하였다(문헌 [J Bacteriol 176, no. 6;1761-1763] 참조). 생성된 플라스미드를 전기천공법(문헌 [Zhang G.Q. et al., Anal Biochem. 409:130-137 (2011)] 참조)에 의해 바실러스 벨레젠시스 GF423 내로 형질전환시켰다. sodA 녹아웃 돌연변이체를 42℃에서 에리쓰로마이신(5 μg/ml)에 내성을 가진 형질전환체들로부터 선택한 다음, 30℃에서 플라스미드 큐어링하였다. sodA 영역 주변의 게놈 상태를 PCR 및 PCR 산물의 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
정상 균주는 바실러스 벨레젠시스 GF423 균주(수탁번호: KCTC 13222BP, 수탁일자: 20170306)이고, 과발현 균주는 바실러스 벨레젠시스 GF424 균주(수탁번호: KCTC 13227BP, 수탁일자: 20170313)이다. 상기 바실러스 벨레젠시스 GF424 균주는 sodA 유전자의 발현을 개선하기 위해 바실러스 벨레젠시스 GF423 균주에 UV를 조사하여 돌연변이를 유발시켜 얻은 균주이다.
상기 균주로부터 제조예 1에 기재된 방법으로 준비한 포자를 블레오마이신으로 폐 섬유화가 유발된 마우스에 1x107 CFU의 농도로 경구 투여하였다. 포자 투여 및 블레오마이신 처리는 실시예 1.1에 기재된 것과 동일한 방식으로 이루어졌으며, 대조군 및 블레오마이신 처리군도 동일하게 준비하였다. 포자 최초 투여일로부터 21일이 되는 날에 실험을 종료하고 각 그룹의 마우스를 희생시켰다(도 4 참조). 바실러스 종 균주 및 종 균주 포자에 관한 정보는 표 8을 참조한다.
포자 물질명 설명 균주명 SOD 활성(상대치)
GF423 포자 Wild-type GF423 1
GF424 포자 SOD 과발현 균주 GF424 ~ 3.5배
GF427 포자 SOD 과발현 균주 GF427 ~ 11배
GF423Δ 포자 SOD 녹아웃 균주 GF423Δ 0.04배
실시예 2.2. 하이드록시프롤린 농도 측정을 통한 콜라겐 농도 측정
콜라겐의 양을 직접적으로 측정할 수 있는 대표적인 지표인 하이드록시프롤린 측정은 실시예 1.2의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 11을 참조하면, SOD 녹아웃 균주의 포자를 투여한 군(B+Spore SOD(-))에서는 하이드록시프롤린 양이 블레오마이신 처리군보다도 높게 측정되었다. 반면, SOD 정상 균주 포자(B+Spore SOD(+)) 및 SOD 과발현 균주 포자(B+Spore SOD(++))를 투여한 군에서는 하이드록시프롤린의 감소를 나타내었다. 특히, SOD 과발현 균주의 포자를 투여한 군에서 가장 큰 감소를 보였다.
실시예 2.3. 폐 세척액 내 면역세포 수의 측정
총 폐 세척액 세포 중 대식세포, 림프구 및 호중구 세포의 수를 측정하기 위한 방법은 실시예 1.3의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 12a 내지 도 12d를 참조하면, 블레오마이신 처리군 대비 SOD 녹아웃 균주 포자, SOD 정상 균주 포자 및 SOD 과발현 균주 포자를 투여한 모든 군에서 폐 세척액 내 면역세포 수의 감소 효과가 나타났다. 면역세포 수의 감소 효과는 SOD 녹아웃 균주 포자를 투여한 군보다는 SOD 정상 균주 포자를 투여한 군에서 더 큰 감소 효과를 보였으며, SOD 과발현 균주의 포자를 투여한 군에서 가장 현저한 감소 효과가 나타났다.
실시예 2.4. 폐 세척액 내 성장인자 베타 1의 농도 측정
폐 세척액을 이용한 TGF-β1의 농도 측정은 실시예 1.4의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 13을 참조하면, 블레오마이신 처리군에서 폐 섬유화로 인해 증가하였던 TGF-β1의 양이 SOD 녹아웃 균주 포자 투여군, SOD 정상 균주 포자 투여군 및 SOD 과발현 균주 포자 투여군 순으로 더 크게 감소하였다.
실시예 2.5. 병리학적 조직 염색을 통한 폐 섬유화 확인
적출한 폐 조직을 이용한 병리학적 조직 염색 방법은 실시예 1.5의 방법과 동일하게 진행하였다.
대조군, 블레오마이신 처리군 및 SOD 발현 수준이 상이한 균주 포자 투여군 (녹아웃, 정상 및 과발현 균주의 포자)의 조직 염색 결과인 도 14를 참조하면, 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유화가 포자 SOD에 의해 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, SOD 과발현 균주의 포자를 투여한 군에서 폐 섬유화의 개선효과가 가장 현저하게 나타났다.
실시예 2.6. 폐 섬유화 유전자 마커의 발현 수준 측정
폐 섬유화가 진행되면 활성화되는 것으로 알려져 있는 대표적인 유전자 마커인 Col1a1, α-SMA, TGF-β1, CTGF, TNF-α 및 IL-6을 표 7의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응으로 유전자 발현을 확인하였다(실시예 1.6의 방법과 동일).
측정 결과, 도 15a 내지 도 15f를 참조하면, 블레오마이신에 의해 증가되었던 유전자 마커들의 발현이 투여된 포자의 SOD 발현 수준에 따라 유의하게 감소하였음을 확인할 수 있었다. SOD 녹아웃 균주 포자 투여군의 경우, Col1a1(도 15a), α-SMA(도 15b) 및 TGF-β1(도 15c) 발현 수준이 블레오마이신 처리군과 비슷하거나 더 높은 수치를 나타내었다. 반면, SOD 정상 균주 포자 투여군 및 SOD 과발현 균주 포자 투여군에서는 블레오마이신 처리군 및 SOD 녹아웃 균주 포자 투여군에 비해 상기 6종의 마커 발현이 현저하게 감소하였다. 특히, SOD 과발현 균주 포자 투여군에서는 TGF-β1(도 15c), CTGF(도 15a) 및 IL-6(도 15f) 유전자의 발현량이 통계적으로 유의하게 감소하였다.
실시예 2.7. 폐 섬유화 마커의 단백질 발현 수준 측정
실시예 2.1에서 희생시킨 폐 섬유화 모델 마우스의 우폐엽 중 일부분을 1X RIPA 버퍼(protease and phosphatase inhibitor cocktail 포함, 구입처: Abcam)에 넣어 곱게 갈아주었다. 조직 현탁액을 원심분리(4℃, 12000 rpm, 10분) 한 뒤, 깨끗한 상등액만 따로 분리하여 새 1.5 ml 튜브에 옮겨 담았다. 웨스턴 블롯(Western blot)을 하기 위하여 단백질 정량은 BCA assay kit(구입처: Thermo Fisher Scientific)를 사용하였으며, 멀티플레이트 분광계로 562 nm에서 측정하였다. 단백질 정량을 통해 산출된 동량의 샘플을 겔의 각 라인마다 분주한 뒤 전기영동을 진행하였고, 겔을 PVDF 멤브레인에 옮긴 뒤 1차 항체(TGF-β(1:1000, 구입처: abcam), phospho-Smad2/3(1:1000, 구입처: abcam), Smad2/3(1:1000, 구입처: abcam), α-SMA(1:1000, 구입처: CST), Col1a1(1:1000, 구입처: CST) 및 GAPDH(1:2000, 구입처: CST))를 붙여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날, 1X PBST 버퍼로 멤브레인을 충분히 씻어준 후 2차 항체(anti-rabbit)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 밴드의 패턴은 이미징 장비(ChemiDoc imaging system, 구입처: Bio-rad)를 이용하여 측정하였다.
측정 결과, 도 16을 참조하면, 블레오마이신 처리군의 경우 폐 섬유화 관련 신호 경로인 TGF-β1-Smad2/3 신호 전달이 활성화되어 TGF-β1 및 phospho-Smad2/3 단백질의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 신호 전달의 결과물인 α-SMA 및 Col1a1의 생산도 증가하였다(Lane 2). 한편, SOD 녹아웃 균주 포자 투여군 및 SOD 정상 균주 포자 투여군에서는 블레오마이신 처리군에 비해 phospho-Smad2/3 단백질의 발현이 약간 감소한 것을 확인할 수 있었으며, α-SMA 및 Col1a1의 발현량도 약간 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Lane 3 및 Lane 4). SOD 과발현 균주 포자 투여군에서는 상위 TGF-β1의 발현이 억제되어 하위 Smad2/3의 인산화가 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 신호전달의 결과물인 α-SMA 및 Col1a1의 생산이 현저하게 감소하였다(Lane 5).
실시예 2.8. 생존율 측정
SOD의 발현 수준이 상이한 균주의 포자를 투여한 후 폐 섬유화를 유도하였을 때 폐 섬유화 마우스 모델의 생존율을 확인하기 위하여 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법에 의해 생존율(Survival rate)을 추정하였으며, 통계적 차이를 계산하기 위해 log-rank test를 사용하였다.
추정 결과, 도 17을 참조하면, 대조군(CTL, N=13/13)의 생존율은 100%를 나타내는 데 비해 블레오마이신 처리군(Bleo, N=10/19)의 생존율은 52.6%로 감소하였다. 한편, SOD 녹아웃 균주 포자 투여군(B+Spore SOD(-), N=5/7)의 생존율은 71.4%를 나타내었으며, SOD 정상 균주 포자 투여군(B+Spore SOD(+), N=5/7)의 생존율도 71.4%를 나타내어 SOD 녹아웃 균주 포자 투여군과 차이가 없었다. 반면, SOD 과발현 균주 포자 투여군(B+Spore SOD(++), N=19/20)의 생존율은 95%로 현저하게 증가하였다. 실험군의 생존율 결과는 하기의 표 9를 참조한다.
모델명 생존율(%), 21일 기준 P-value
CTL vs. group Bleo vs. group
대조군(CTL) 100 - **
블레오마이신 처리군(Bleo) 52.6 ** -
SOD 녹아웃 균주 포자(Spore SOD (-)) 투여군 71.4 * ns
SOD 정상 균주 포자(Spore SOD (+)) 투여군 71.4 * ns
SOD 과발현 균주 포자(Spore SOD (++)) 투여군 95 ns **
이를 통해, SOD가 폐 섬유화에 예방적 효과를 나타내며, 이로 인한 생존율 상승에도 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2.9. 활성산소 부산물 농도 측정
적출한 폐 조직의 활성산소 부산물(MDA 및 4-HNE) 농도 측정 방법은 실시예 1.7의 방법과 동일하게 진행하였다.
그 결과, 블레오마이신에 의해 증가되었던 부산물 농도가 투여된 포자의 SOD 발현 수준에 따라 유의하게 감소하였음을 확인할 수 있었다. SOD 녹아웃 균주 포자 투여군, SOD 정상 균주 포자 투여군 및 SOD 과발현 균주 포자 투여군 순으로 MDA 및 4-HNE의 농도가 유의하게 감소하였다(도 18a 및 도 18b).
실시예 3. 폐 섬유화 동물모델에서 SOD 과발현 균주 포자 및 SOD의 예방 효과 비교
실시예 3.1. 시료의 준비 및 시험
SOD는 단독으로 경구 투여 시 단백질의 활성과 안정성을 유지하기 어렵기 때문에 체내에서 효과를 얻기 전에 대부분 위산에 의해 분해가 될 수 있다. 반면, 박테리아가 생산하는 포자는 가혹한 환경(예를 들어, 극심한 온도, 산 또는 알칼리, 건조 및 독성 화학 물질 등)에 내성이 있어 경구 투여되어도 효과를 나타낼 것으로 예측된다. 두 물질의 효과 비교를 위하여, SOD를 유리 SOD(B+Free SOD, 2 unit/mouse) 및 GF424 포자(B+Spore SOD, 1x107 CFU/mouse) 형태로 경구 투여하여 폐 섬유화 모델 마우스에서의 폐 섬유화 예방적 효과를 비교하였다.
유리 SOD는 바실러스 벨레젠시스 GF424 균주(KCTC 13227BP, 수탁일자: 2017년 3월 13일)의 배양액을 준비하고 하기의 방법으로 추출 및 정제하여 준비하였다.
먼저, LB 한천 배지(LB(Luria-Bertani) 한천; 트립토판 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L, 한천 15 g/L)에서 형성된 단일 콜로니를 LB 배지 30 mL에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이 종 배양액(seed culture)을 다시 1 mM 황산망간(MnSO4)이 포함된 LB 배지 3 L에 접종하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다.
다음, 세포 배양액을 4℃, 3,578 x g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 초미세여과(Ultrafiltration, 이하 UF, MWCO 10,000)를 이용하여 10배 농축하였다. 농축액을 제균 필터로 여과한 후, 동결 건조하였다. SOD의 활성은 SOD 분석 키트(구입처: Cayman Chemical, Michigan, USA)를 이용하여 분석하였다. SOD 활성 1 단위(unit)는 수퍼옥시드 라디칼을 50% 억제하는 효소의 양으로 정의된다. 건조된 SOD 효소는 2 unit의 활성을 나타내도록 PBS에 용해하여 100 ul 부피로 준비하였다.
GF424 포자 투여 또는 유리 SOD 투여 및 두 시험군의 블레오마이신 처리는 실시예 1.1에 기재된 것과 동일한 방식으로 이루어졌으며, 대조군 및 블레오마이신 처리군도 동일하게 준비하였다. 포자 최초 투여일로부터 21일이 되는 날에 실험을 종료하고 각 그룹의 마우스를 희생시켰다(도 4 참조).
실시예 3.2. 하이드록시프롤린 농도 측정을 통한 콜라겐 농도 측정
콜라겐의 수준을 확인할 수 있는 하이드록시프롤린 측정은 실시예 1.2의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 19를 참조하면, 유리 SOD 투여군과 GF424 포자 투여군의 하이드록시프롤린 농도를 측정한 결과, 유리 SOD 투여군의 경우 블레오마이신 처리군의 하이드록시프롤린 농도와 거의 차이가 없는 것과는 달리, GF424 포자 투여군에서는 하이드록시프롤린 값이 통계적으로 유의하게 감소하였다. 따라서, 폐 섬유화를 예방하는데 GF424 포자의 투여가 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3.3. 폐 세척액 내 성장인자 베타 1의 농도 측정
폐 세척액을 이용한 TGF-β1의 농도 측정은 실시예 1.4의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 20을 참조하면, 블레오마이신 처리군에서 폐 섬유화로 인해 증가하였던 TGF-β1의 양이 GF424 포자 투여군에서는 매우 효과적으로 감소하였으며, 유리 SOD는 그 효과가 미미하였다.
실시예 3.4. 병리학적 조직 염색을 통한 폐 섬유화 확인
적출한 폐 조직을 이용한 병리학적 조직 염색 방법은 실시예 1.5의 방법과 동일하게 진행하였다.
대조군, 블레오마이신 처리군, 유리 SOD 투여군 및 GF424 포자 투여군의 조직 염색 결과인 도 21을 참조하면, 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유화가 유리 SOD에 의하여도 약간의 개선 효과를 보였지만, GF424 포자 투여군에서 더 큰 효과를 나타내었다.
실시예 3.5. 폐 섬유화 유전자 마커의 발현 수준 측정
폐 섬유화가 진행되면 활성화되는 것으로 알려져 있는 대표적인 유전자 마커인 Col1a1, α-SMA, TGF-β1, CTGF, TNF-α 및 IL-6을 표 7의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응으로 유전자 발현을 확인하였다(실시예 1.6의 방법과 동일).
측정 결과, 도 22a 내지 도 22f를 참조하면, 블레오마이신에 의해 증가되었던 전 섬유화 마커(Col1a1, α-SMA, TGF-β1 및 CTGF) 및 전 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6)은 유리 SOD 투여군에서는 거의 변화가 없었지만, GF424 포자 투여군에서는 현저하게 감소하였다.
실시예 3.6. 폐 섬유화 마커의 단백질 발현 수준 측정
폐 섬유화 모델 마우스의 폐 섬유화 마커의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 웨스턴 블롯은 실시예 2.7의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 23을 참조하면, 유리 SOD 투여군 및 GF424 포자 투여군 모두에서 폐 섬유화의 주요한 기전인 TGF-β1-Smad2/3 신호 전달의 억제에 의하여 TGF-β1 및 phospho-Smad2/3 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 섬유화 마커인 α-SMA 및 Col1a1은 두 투여군 모두에서 감소하는 경향을 보였지만, Col1a1의 경우 GF424 포자 투여군에 의하여 더 효과적으로 감소하였다(Lane 4).
실시예 3.7. 활성산소 부산물 농도 측정
적출한 폐 조직의 활성산소 부산물(MDA 및 4-HNE) 농도 측정 방법은 실시예 1.7의 방법과 동일하게 진행하였다.
그 결과, 블레오마이신에 의해 증가되었던 활성산소 부산물인 MDA 및 4-HNE의 농도가 유리 SOD 투여군에서는 거의 변화가 없었지만, GF424 포자 투여군에서는 농도가 유의하게 감소하였다(도 24a 및 도 24b).
실시예 4. 폐 섬유화 동물모델에서 분리한 일차 폐 섬유아세포에서의 SOD 과발현 균주 포자의 예방 효과 확인
실시예 4.1. 마우스 일차 폐 섬유아세포의 분리 및 배양
GF424 포자 투여군(B+Spore SOD)은 제조예 1에 기재된 방법으로 준비한 포자를 1x107 CFU의 농도로 경구 투여한 후, 블레오마이신으로 폐 섬유화를 유발하였다. 포자 투여 및 블레오마이신 처리는 실시예 1.1에 기재된 것과 동일한 방식으로 이루어졌으며, 대조군 및 블레오마이신 처리군도 동일하게 준비하였다. 포자 최초 투여일로부터 21일이 되는 날에 실험을 종료하고 각 그룹의 마우스를 희생시켰다(도 4 참조).
폐 섬유증 모델 마우스의 가슴을 개복한 후 PBS(3% Penicillin/Streptomycin)로 충분하게 폐관류를 하였다. 깨끗해진 전체 폐를 적출한 후 3% 항생제(Penicillin/Streptomycin)가 포함된 신선한 PBS로 씻어내고, 씻어낸 폐 조직을 6-웰 플레이트로 옮겨 담은 후, 멸균된 가위로 조각을 냈다. 조각난 조직을 새 15 ml 튜브에 옮겨 담은 후, 600 units/ml DNase I 구입처: Sigma, 품번: DN25) 및 0.14 units/ml liberase(구입처: Roche, 품번: 05401119001) 효소가 포함된 5 ml RPMI-1640(2% Penicillin/Streptomycin, glutamine 미포함) 배지를 넣어준 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 반응이 끝난 후, 조직이 든 튜브를 40 ㎛ 필터, 70 ㎛ 필터 및 100 ㎛ 필터의 순서대로 여과시킨 후, 최종적으로 모아진 튜브를 520 x g 조건으로 10분 동안 원심분리하였다. 마지막으로 상등액을 제거하고 남은 세포에 적정량의 DMEM(15% FBS, 2% Penicillin/Streptomycin) 배지를 넣어 현탁하여 세포 현탁액을 준비하였다.
실시예 4.2. 면역 형광염색을 통한 폐 섬유화 확인
폐 섬유아세포가 외부 자극을 받아 TGF-β 경로가 활성화되면 형태학적 변화(길쭉하게 뻗어 있는 모양) 및 기능적 변화(α-SMA 및 콜라겐과 같은 ECM 생산물 증가)가 일어나 폐 섬유화가 진행된다. 이러한 변화를 확인하기 위해 폐 섬유화가 유도된 마우스의 폐에서 분리한 일차 폐 섬유아세포를 대상으로 폐 섬유화의 대표적인 지표 중의 하나인 α-SMA 및 Col1a1를 다음의 면역 형광염색 방법을 통해 염색하여 확인하였다.
실시예 4.1의 마우스 세포 현탁액을 이용하여 세포 수를 측정한 뒤, 60 mm 배양 디쉬에 2 X 106 세포를 넣어 하루동안 배양하였다. 다음 날, 신선한 DMEM(15% FBS, 2% Penicillin/Streptomycin) 배지로 교체하여 주었고, 세포가 60 mm 배양 디쉬 면적의 85% 내지 90% 가 채워질 때까지 2일 내지 3일에 한 번씩 새 배지로 교체해 주었다. 이후, 디쉬의 세포를 떼어낸 후, 8-채널 슬라이드에 웰 당 40,000개의 세포를 넣고, 세포가 면적의 80% 이상 채워지면 배지를 제거한 후 신선한 PBS로 세척(3회 반복) 후 제거하였다. 4% PFA를 넣어 실온에서 1시간 동안 고정한 후, PBS로 세척하고 블로킹 버퍼(구입처: Invitrogen, 품번: 00-4952-54)를 넣어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS 세척(3회 반복) 후, 1차 항체인 α-SMA(1:200, Mouse mAb, 구입처: CST, 품번: 48938) 및 Col1a1(1:200, Rabbit mAb, 구입처: CST, 품번: 72026)를 블로킹 버퍼에 희석시킨 뒤, 각각의 웰에 넣어 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날, PBS 세척(3회 반복) 후, 2차 항체인 anti-Rabbit-Alexa 555 및 anti-Mouse-Alexa 488을 PBS에 1:500의 비율로 희석하여 각 웰에 넣어준 후, 빛을 차단시켜 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, PBS 세척(3회) 후, PBS가 완전히 제거된 염색된 세포에 DAPI가 포함된 마운팅 용액을 각각 떨어뜨린 후 커버 글라스를 씌운 후 공초점 현미경(구입처: Zeiss)으로 관찰하였다.
측정 결과, 도 25를 참조하면, 블레오마이신 처리군에서는 세포 모양이 길쭉하게 바뀌었으며 α-SMA 및 Col1a1의 발현이 증가하였다. 반면, GF424 포자 투여군에서는 대조군과 유사한 형태학적 변화(세포 모양이 짧아짐) 및 기능적 변화(α-SMA 및 Col1a1의 발현이 감소)가 나타나 폐 섬유화에 예방 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4.3. 폐 섬유화 유전자 마커의 발현 수준 측정
폐 섬유화가 유도된 마우스의 폐 조직에서와 같이 일차 폐 섬유아세포에서도 폐 섬유화 유전자들의 발현 정도에 변화가 있는지를 검증하기 위하여 표 7의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 진행하였다(실시예 1.6의 방법과 동일).
폐 섬유화가 진행되면 활성화되는 것으로 알려져 있는 대표적인 유전자 마커인 TGF-β1(근섬유화세포를 활성화시켜 섬유화를 진행시키는 인자), Col1a1(콜라겐의 합성을 증가시키는 인자), TNF-α 및 IL-6(염증성 사이토카인)의 발현 정도를 측정한 결과, 도 26a 내지 도 26d를 참조하면, 블레오마이신에 의해 증가되었던 전 섬유화 마커(TGF-β 및 Col1a1) 및 전 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6)은 GF424 포자 투여군에서 모두 유의하게 감소하였다.
실시예 5. 폐 섬유화 동물모델에서 경구용 SOD와 균주 포자의 병용 투여 효과 확인
실시예 5.1. 시료의 준비 및 시험
경구용 SOD 및 균주 포자의 병용 투여에 의한 폐 섬유화 예방 효과를 확인하기 위한 실험을 준비하였다. 먼저, 위산에서의 안정성을 높인 경구용 SOD인 GF103을 3가지 농도(1, 10, 20 unit/mouse)로 준비하고, 제조예 1에서 제조한 야생형 균주 GF423 포자(B+Spore SOD(+))를 1X107 CFU/mouse 농도로 준비하였다. 또한, 병행 치료 효과 비교군으로 과발현 균주 GF424 포자(B+Spore SOD(++), 1x107 CFU/mouse)를 준비하였다.
GF103(서열번호 6; Met-deleted SodA2)은 메티오닌이 결실된 SodA2를 쉘락 코팅하여 다음과 같이 제작하였다. 쉘락(Shellac)(EXCELACS co., LTD., Bangkok)을 3% 농도가 되도록 100% 에탄올로 녹이고 0.2 um 무균 필터를 사용해서 필터 준비하였다. 에탄올로 녹인 쉘락 용액을 무균처리 된 1x PBS로 1/20 배로 희석해서 쉘락 용액을 준비하였다. 동결건조한 정제 SodA2를 20 mg/ml로 녹여서 0.2 um 크기의 필터를 사용해서 무균상태가 되도록 준비하였다. 준비된 쉘락 용액과 녹여서 준비한 SOD를 1:1로 교반하며 섞었다. 이후 교반을 10분간 지속하였다. 잘 교반된 물질을 동결건조시켰다. 이를 통해 최종적으로 동걸건조된 쉘락 코팅 SodA2를 준비하였다. 동결건조된 쉘락 코팅 SodA2에 덱스트린을 사용해서 1:9 내지 12(쉘락 코팅 SodA2: 덱스트린) 비율로 넣어 준비하였으며 활성 측정을 통하여 최종적으로 활성이 90 내지 110 U/mg이 되도록 하였다.
유리 SOD는 쉘락 코팅을 하지 않은 동결건조한 정제 SodA2를 사용하였다.
포자 투여 및 블레오마이신 처리는 실시예 1.1에 기재된 것과 동일한 방식으로 이루어졌으며, 대조군 및 블레오마이신 처리군도 동일하게 준비하였다. 포자 최초 투여일로부터 21일이 되는 날에 실험을 종료하고 각 그룹의 마우스를 희생시켰다(도 4 참조).
실시예 5.2. 하이드록시프롤린 농도 측정을 통한 콜라겐 농도 측정
콜라겐의 수준을 확인할 수 있는 하이드록시프롤린 측정은 실시예 1.2의 방법과 동일하게 진행하였다.
하이드록시프롤린 농도 측정 결과, 블레오마이신 처리군에 비해 모든 실험군에서 하이드록시프롤린 농도가 감소하였으며, 즉 경구용 SOD(GF103)의 단독 투여군에서도 농도 의존적으로 하이드록시프롤린 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 경구용 SOD 및 GF423 포자 병용 투여군에서는 경구용 SOD의 1 unit/mouse 및 10 unit/mouse 농도에서 현저한 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 10 unit/mouse 농도의 경구용 SOD와 GF423 포자를 병용 투여한 군에서는 가장 효과가 좋았으며, 과발현 SOD 균주 포자인 GF424 포자 투여군 보다도 하이드록시프롤린 농도가 낮게 측정되었다(도 27).
실시예 5.3. 폐 세척액 내 성장인자 베타 1의 농도 측정
폐 세척액을 이용한 TGF-β1의 농도 측정은 실시예 1.4의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 28을 참조하면, 블레오마이신 처리군에서 폐 섬유화로 인해 증가하였던 TGF-β1의 양이 경구용 SOD(GF103)를 단독 처리했을 때에는 변화가 거의 없었지만, 경구용 SOD와 GF423 포자를 병용 투여한 군에서는 효과적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다. 특히, 20 unit/mouse 농도의 경구용 SOD와 GF423 포자를 병용 투여한 군에서는 가장 효과가 좋았으며, 과발현 SOD 균주 GF424 포자 투여군 보다도 TGF-β1 농도가 낮게 측정되었다. 이에 반해, 경구용 SOD 단독 투여군에서는 거의 변화가 없었다.
실시예 5.4. 병리학적 조직 염색을 통한 폐 섬유화 확인
적출한 폐 조직을 이용한 병리학적 조직 염색 방법은 실시예 1.5의 방법과 동일하게 진행하였다.
대조군, 블레오마이신 처리군, 농도별 GF103 투여군, GF423 포자 투여군, 농도별 GF103 및 GF423 포자의 병용 투여군, GF424 포자 투여군의 조직 염색 결과인 도 29를 참조하면, 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유화가 경구용 SOD 단독 투여군에서도 농도 의존적으로 개선되는 것이 확인되었으며, 경구용 SOD와 GF423 포자를 병용 투여한 군에서도 농도 의존적으로 개선되는 것이 확인되어 병용 투여의 시너지 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 5.5. 폐 섬유화 유전자 마커의 발현 수준 측정
폐 섬유화가 진행되면 활성화되는 것으로 알려져 있는 대표적인 유전자 마커인 Col1a1, α-SMA, TGF-β1, IL-6, TNF-α 및 IL-1β를 표 7의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응으로 유전자 발현을 확인하였다(실시예 1.6의 방법과 동일).
측정 결과, 도 30a 내지 도 30f를 참조하면, 블레오마이신에 의해 증가되었던 전 섬유화 마커(Col1a1, α-SMA 및 TGF-β) 및 전 염증성 사이토카인 마커(IL-6, TNF-α 및 IL-1β)은 경구용 SOD에 의해 효과적으로 감소하였으나, 경구용 SOD 및 GF423 포자의 병용 투여에 의한 시너지 효과는 없었다.
실시예 5.6. 활성산소 부산물 농도 측정
활성산소에 의해 지질 과산화물로부터 만들어지는 부산물인 MDA 및 4-HNE 뿐만 아니라, 활성산소에 의해 산화적 DNA 손상이 유발되면 생성되는 8-하이드록시데옥시구아노신(8-OHdG, 8-hydroxydeoxyguanosine)도 산화적 스트레스의 중요한 마커이다. 따라서, 실시예 1.7의 방법과 동일하게 적출한 폐 조직의 활성산소 부산물(MDA 및 4-HNE)의 농도를 측정하고, 하기의 방법으로 8-OHdG의 농도를 측정하여 각 실험군에서의 값을 비교하였다.
8-OHdG는 폐 조직을 작은 조각으로 자른 뒤, DNeasy Blood & Tissue Kit(구입처: Qiagen, cat#. 69504)를 사용하여 총 DNA를 추출한 뒤, 동량의 DNA를 Oxidative DNA damage ELISA kit(구입처: Cell Biolabs, cat#. STA-320)을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였고, 농도는 멀티플레이트 분광계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
그 결과, 폐 조직 내 존재하는 MDA, 4-HNE, 8-OHdG 모두 경구용 SOD를 처리하였을 때 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며, 경구용 SOD 및 GF423 포자의 병용 투여에 의해서 대체로 더 감소하였다(도 31a 내지 도 31c).
실시예 6. 폐 섬유화 동물모델에서 SOD 과발현 균주 포자의 섬유증 치료 효과 확인
실시예 6.1. 폐 섬유화 동물모델의 확립 및 시험
폐 섬유화 동물모델에 GF424 포자를 투여한 후 폐 섬유화를 유발한 결과 포자의 투여에 의해 폐 섬유화의 예방적 효과가 있음을 확인하였다(실시예 1 등 참조). 이에, 폐 섬유화를 먼저 유발시키고 GF424 균주 포자 및 GF424에 비해 약 4배 정도 더 많은 SOD를 생산하도록 개발된 GF427 균주의 포자를 투여하고, 관련 지표를 확인하였다. GF427 균주의 제작은 제조예 2를 참조한다.
7주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 일주일 동안 순화 기간을 거친 뒤, 일반증상을 관찰하여 건강상태를 확인하고 건강한 동물을 시험에 사용하였다. 상기 마우스는 대조군(CTL), 블레오마이신 처리군(Bleo) 및 시험군(즉, GF424 포자 투여군 또는 GF427 포자 투여군)의 4개 그룹으로 나누었다.
먼저, 블레오마이신(Bleomycin sulfate, 구입처: Millipore)을 3 U/kg 용량으로 1회 기관내(intratracheal) 투여하여 폐 섬유화를 유발하였다(D0). 5일 후, 시험군 마우스는 제조예 1에서 제조한 GF424 포자를 1x107 CFU 농도 및 제조예 2에서 제조한 GF427 균주의 3가지 농도의 포자(1x105 CFU 농도, 1x106 CFU 농도 및 1x107 CFU 농도)를 각 시험군 마우스에 12일 동안 1일 1회(주당 총 5회) 경구 투여하였다. 블레오마이신 최초 투여일로부터 16일이 되는 날에 실험을 종료하고 각 그룹의 마우스를 희생시켰다. 대조군(CTL)은 폐 섬유화를 유발하지 않았으며 포자도 투여하지 않았다. 총 16일 동안 진행된 포자 및 블레오마이신의 투여 일정은 도 32를 참조한다.
실시예 6.2. 하이드록시프롤린 농도 측정을 통한 콜라겐 농도 측정
콜라겐의 수준을 확인할 수 있는 하이드록시프롤린 측정은 실시예 1.2의 방법과 동일하게 진행하였다.
하이드록시프롤린 농도 측정 결과, 블레오마이신 투여군에 비해 모든 실험군에서 하이드록시프롤린 농도가 감소하였으며, GF427 포자는 적은 양의 투여로도 콜라겐 생성을 감소시켰다. 특히, GF424 포자와 동일한 양인 1x107 CFU 농도를 투여한 군에서는 GF427 포자 투여군이 GF424 포자 투여군보다 현저한 감소를 보였다(도 33).
실시예 6.3. 폐 세척액 내 성장인자 베타 1의 농도 측정
폐 세척액을 이용한 TGF-β1의 농도 측정은 실시예 1.4의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 34를 참조하면, 블레오마이신 처리군에서 폐 섬유화로 인해 증가하였던 TGF-β1의 양이 적은 양의 GF427 포자 투여군(1x105 CFU 농도)에서도 감소하는 것을 확인할 수 있었다. GF427 포자 투여군을 1x106 CFU 농도 및 1x107 CFU 농도로 투여한 군에서는 GF424 포자를 투여했을 때보다 더 현저한 감소를 나타내었다.
실시예 6.4. 병리학적 조직 염색을 통한 폐 섬유화 확인
적출한 폐 조직을 이용한 병리학적 조직 염색 방법은 실시예 1.5의 방법과 동일하게 진행하였다.
대조군, 블레오마이신 처리군, GF424 포자 투여군 및 농도별 GF427 포자 투여군의 조직 염색 결과인 도 35를 참조하면, 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유화가 GF427 포자의 모든 농도에서 효과적으로 감소한 것을 확인할 수 있었고, 특히 1x107 CFU 농도에서 가장 현저한 개선 효과가 나타났다.
실시예 6.5. 폐 섬유화 유전자 마커의 발현 수준 측정
폐 섬유화가 진행되면 활성화되는 것으로 알려져 있는 대표적인 유전자 마커인 Col1a1, TGF-β1, CTGF, IL-6, TNF-α 및 IL-1β를 표 7의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응으로 유전자 발현을 확인하였다(실시예 1.6의 방법과 동일).
측정 결과, 도 36a 내지 도 36f를 참조하면, 블레오마이신에 의해 증가되었던 전 섬유화 마커(Col1a1, TGF-β 및 CTGF) 및 전 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-α 및 IL-1β)은 모든 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427) 포자의 투여에 의해 감소하였으며, 특히 GF427 포자 투여군에서 현저한 감소 효과를 나타냈다.
실시예 6.6. 폐 섬유화 마커의 단백질 발현 수준 측정
폐 섬유화 모델 마우스의 폐 섬유화 마커의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 웨스턴 블롯은 실시예 2.7의 방법과 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 도 37을 참조하면, SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427) 포자 투여군 모두에서 폐 섬유화의 주요한 기전인 TGF-β1-Smad2/3 신호 전달의 억제에 의하여 TGF-β1의 발현이 감소하고, phospho-Smad2/3 인산화의 감소를 나타냈다. 또한, 섬유화 마커인 α-SMA 및 Col1a1도 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427) 포자 투여군 모두에서 감소하였다. 특히, 상기 단백질 발현량은 GF427 포자의 1x107 CFU 농도에서 현저하게 감소하였다.
실시예 6.7. 활성산소 부산물 농도 측정
활성산소에 의해 지질 과산화물로부터 만들어지는 부산물인 MDA 및 4-HNE 농도를 실시예 1.7의 방법과 동일한 방법으로 측정하고, 활성산소에 의해 산화적 DNA 손상이 유발되면 생성되는 8-하이드록시데옥시구아노신(8-OHdG, 8-hydroxydeoxyguanosine)의 농도를 실시예 5.6과 동일한 방법으로 측정하였다. 또한, ROS에 의해 인체 내 존재하는 티올(Thiol)의 소실 정도를 측정하여 산화적 스트레스의 정도를 비교하였다.
폐 조직 내 존재하는 MDA, 4-HNE, 8-OHdG 모두 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427) 포자의 농도에 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 한편, ROS에 의해 소실된 유리 티올은 SOD 과발현 균주 포자에 의해 다시 회복됨을 확인하였다. 소실된 티올의 회복은 SOD 과발현 균주 포자의 농도가 증가할수록 더 효과적으로 나타났다(도 38a 내지 도 38d).
실시에 6.8. 바이오마커 분석
실시예 6.1에서 희생시킨 마우스에서 적출한 폐 조직 한 조각을 1X RIPA 버퍼(protease inhibitor cocktail 포함, 구입처: Abcam)에 넣어 곱게 갈아주었다. 조직 현탁액은 4℃, 12000 rpm, 10분 조건으로 원심분리한 뒤, 깨끗한 상등액만 따로 분리하여 새 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 담았다. 단백질 정량은 BCA assay kit(구입처: Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 멀티플레이트 분광계로 562 nm에서 측정하였다. 우폐엽(Right lung lobe) 중 일부분에서 얻은 RNA를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 SP-D, MMP-7, tenascin-C, periostin, CXCL13 및 PAI-1을 분석하였다. 상대적인 mRNA 발현 정도는 18S rRNA를 내부 대조군으로 사용하여 보정하였고, 2-ΔΔCq 방법을 이용하여 값을 산정하였다. 이 실험에 사용한 프라이머(primer) 정보는 하기의 표 10에 정리하였다.
유전자명 프라이머 서열(5'에서 3'방향) 서열번호
SP-D
 F: AGGTCCAGTTGGACCCAAAGGA 48
R: CTGGTTTGCCTTGAGGTCCTATG 49
MMP-7
 F: AGGTGTGGAGTGCCAGATGTTG 50
R: CCACTACGATCCGAGGTAAGTC 51
tenascin-C
 F: GAGACCTGACACGGAGTATGAG 52
R: CTCCAAGGTGATGCTGTTGTCTG 53
periostin
 F: CAGCAAACCACTTTCACCGACC 54
R: AGAAGGCGTTGGTCCATGCTCA 55
CXCK13
 F: CATAGATCGGATTCAAGTTACGCC 56
R: GTAACCATTTGGCACGAGGATTC 57
PAI-1
 F: CCTCTTCCACAAGTCTGATGGC 58
R: GCAGTTCCACAACGTCATACTCG 59
18S rRNA
 F: CAGCGTGGTCAGGATAGAAC 40
R: CTTGATTTGAATGCAGCGGAC 41
폐섬유화를 판별할 수 있는 주요한 마커 6종류의 유전자 발현 정도를 비교한 결과, 도 39a 내지 도 39f에 나타낸 바와 같이, 상피 손상 마커(SP-D), 섬유화 마커(MMP-7, Tenascin-C 및 Periostin), 염증 마커(CXCL13) 및 혈전증 마커(PAI-1) 모두 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427) 포자에 의해 감소하였으며, SOD 과발현 균주 포자의 농도가 증가할수록 더 효과적으로 감소하였다.
실시예 6.9. 생존율 측정
폐 섬유증 치료 모델에서 SOD 과발현 균주(GF424 및 GF427)의 포자 투여가 폐 섬유화 마우스 모델의 생존에 미치는 영향을 확인하였다. 실시예 2.8과 동일한 방법으로 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법에 의해 생존율(Survival rate)을 추정하였으며, 통계적 차이를 계산하기 위해 log-rank test를 사용하였다.
추정 결과, 도 40을 참조하면, 대조군(CTL, N=6/6)의 생존율은 100%를 나타내는 데 비해 블레오마이신 처리군(Bleo, N=7/12)의 생존율은 58.3%로 감소하였다. 한편, GF424 균주 포자 투여군(B+GF424 spore 1x107 CFU 농도, N=7/12)은 58.3%로 블레오마이신 처리군과 차이가 없었으며, GF427 105 포자 투여군(B+GF427 spore 1x105 CFU 농도, N=9/12)은 75%의 생존율을, GF427 106 포자 투여군(B+GF427 spore 1x106 CFU 농도, N=6/12)은 50%의 생존율을, GF427 107 포자 투여군(B+GF427 spore 1x107 CFU 농도, N=9/12)은 75%의 생존율을 나타냈다. GF427 107 포자 투여군에서 사망 개체가 가장 늦게 나타났고, 생존 개체도 가장 많이 남았지만 통계적으로 유의하지는 않았다. 이 결과는 폐 섬유화가 발생된 모델에 SOD를 투여할 경우, 폐 섬유화에 대한 치료 효과가 나타남으로써 생존율도 향상시킬 수 있음을 시사한다.
통계 분석
모든 수치 자료는 GraphPad Prism 통계 프로그램(Ver 9.0)을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 데이터는 그룹 내 평균 ± SEM으로 계산하였으며, 데이터는 t-테스트(two-way analysis of variance)로 분석하였고, *는 p<0.05, **는 p<0.01, ***는 p<0.001, ****는 p<0.0001을 표시하였다.
결론
본 실시예는 바실러스 벨레젠시스 종 균주 포자 및 경구용 SOD를 이용하여 상기 포자의 경구 투여가 폐 섬유화의 예방 또는 치료에 효과적임을 검증하였다. 구체적으로, GF424 포자를 총 3주간 구강 내 투여한 후 폐 섬유화를 유발한 마우스 모델(예방적 효과 확인 모델) 및 폐 섬유화를 유발한 후, GF424 포자를 총 12일간 구강 내 투여한 마우스 모델(치료적 효과 확인 모델) 모두에서 폐 섬유화의 진행이 억제되어 개선되는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
블레오마이신에 의한 특발성 폐섬유화증의 유발은 활성산소(ROS)와 밀접한 관계가 있음이 밝혀져 있다. 따라서 활성산소에 의해 생성되는 대표적인 부산물들을 폐 조직 내에서 농도를 측정하였을 때 SOD가 활성산소 부산물을 감소시키는 것을 확인할 수 있었고, 이는 SOD가 체내 활성산소를 효과적으로 감소시키는 역할을 한다는 것을 입증하는 결과이다.
SOD를 제거시킨 SOD 녹아웃 균주 포자 투여군보다 SOD 과발현 균주 포자 투여군 또는 SOD 정상 균주 포자 투여군에서 폐 섬유화의 예방 및 치료에 효과가 있는 것을 확인하였으며, 특히 SOD 과발현 균주 포자 투여군에서 큰 효과를 보였다. 이를 통해, SOD의 체내 활성산소 제거를 통한 폐 섬유화 예방 및 치료 효과를 확인하였으며, 예방 및 치료 효과로 인한 마우스의 생존율 증가 또한 확인할 수 있었다. 한편, 스포어 형태의 SOD는 SOD를 유리 형태로 경구 투여할 경우 발생할 수 있는 단점(생체 내 흡수가 되기 전에 분해됨)을 극복하여 체내 흡수율을 더욱 증가시켜 현저한 치료 효능을 나타내었다. 또한, 체내 위산에서의 안정성을 높인 경구용 SOD(GF103)를 단독으로 투여하여도 폐 섬유화를 개선시키는 데 효과가 있었고, SOD 정상 균주 포자 투여군(Spore SOD(+))과의 병행효과는 크지는 않지만 소폭 상승된 효과를 볼 수 있었다. 이를 통해, 경구용 SOD(GF103)의 단독 투여 및 병행투여가 폐 섬유화 치료제로서의 가능성이 있음을 확인할 수 있었다. 추가적으로, GF424에 비해 약 4배 정도 더 많은 SOD를 생산하도록 개발된 GF427 균주의 포자의 경우, GF424 균주 포자 보다 적은 양의 투여로도 폐 섬유화 개선 효과를 나타내었다.
결론적으로 바실러스 벨레젠시스 SOD 과발현 균주 포자(GF424 포자 및 GF427 포자), SOD 정상 균주 포자 및 경구용 SOD(GF103)의 단독 투여 및 병행투여는 폐 섬유화증의 억제 및 치료에 유용한 소재가 될 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 비알코올성 지방간염 STAM™ 모델에서 바실러스 벨레젠시스 종 균주 포자의 간섬유증 치료 효과 확인
실시예 7.1. 비알코올성 지방간염 모델의 확립
과발현 SOD 균주인 GF427의 포자가 비알코올성 지방간염(NASH) STAM™ 동물모델에서 간 섬유화에 치료적 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 비알코올성 지방간염 동물모델을 확립하고 정상 SOD 균주인 GF423의 포자 및 경구용 SOD(GF103)와 결과를 비교, 분석하였다.
C57BL/6J 마우스(임신 14일령 암컷, 생후 6주령 수컷)(구입처: SLC, 일본)를 온도(23 ± 3 ℃), 습도(50 ± 20%), 조명(12시간 인공 명암 주기; 08시부터 20시까지 명 주기임) 및 공기 교환의 통제된 SPF 시설에서 유지하였다.
8마리의 정상군을 제외한 모든 그룹에 대해 다음과 같이 NASH를 유도하였다: 태어난 수컷 마우스의 생후 2일차에 200 μg의 스트렙토조토신(STZ, 구입처: Sigma-Aldrich) 용액을 1회 피하 주사하고 4주령 후에 고체 고지방 식이(HFD, High fat diet)(57 kcal% 지방, 구입처: CLEA Japan, Inc., 품번: Cat# HFD32)를 케이지 상단의 금속 뚜껑에 놓아 자유로이 급이하여 NASH를 유도했다.
NASH를 유도한 생후 10주령의 마우스는 치료 시작 전날 체중을 기준으로 8마리씩 9개 그룹으로 무작위 배정하였다. 무작위 배정은 Excel 소프트웨어를 사용하여 체중 계층화 무작위 샘플링으로 수행하였다. NASH 모델 마우스는 체중에 따라 계층화하여 SD를 구하고 그룹 간 평균 체중의 차이를 가능한 한 작게 만들었다. 마우스는 귀 펀치를 통해 식별하였으며, 각 케이지에도 특정 식별 코드를 표시하여 식별하였다.
간 섬유화 치료적 효과를 확인하기 위한 동물 모델은 표 11에 도시된 바와 같이 총 10개의 그룹으로 나누고 상술한 무작위 배정에 의하여 8마리씩 배정하였다.
그룹 실험군 마우스(수) 시험물질 농도(units/mouse) 용량
(ml/kg)		 투여요법
1 정상군 정상(8) - - - -
2 질병 대조군(Disease control) STAM(8) - - - -
3 GF427 최저용량 투여군 STAM(8) GF427 0.05 x 107 CFU 100 μL PO, QD,10 - 13 주
4 GF427 저용량 투여군 STAM(8) GF427 0.1 x 107 CFU 100 μL PO, QD,10 - 13 주
5 GF427 중간용량 투여군 STAM(8) GF427 0.5 x 107 CFU 100 μL PO, QD,10 - 13 주
6 GF427 고용량 투여군 STAM(8) GF427 1 x 107 CFU 100 μL PO, QD,10 - 13 주
7 GF427 최고용량 투여군 STAM(8) GF427 5 x 107 CFU 100 μL PO, QD,10 - 13 주
8 GF423 투여군 STAM(8) GF423 1 x 107 CFU 100 μL PO, QD,10 - 13 주
9 GF103 투여군 STAM(8) GF103 10 U 100 μL PO, QD,10 - 13 주
10 텔미사르탄(Telmisartan) 투여군 STAM(8) 텔미사르탄 10 mg/kg 10 mL/kg PO, QD,10 - 13 주
여기서, PO는 경구 투여를 의미하며, QD는 1일 1회를 의미한다.GF427 투여군은 마우스 당 0.05 x 107(최저용량), 0.1 x 107(저용량), 0.5 x 107(중간 용량), 1 x 107(고용량) 및 5 x 107 CFU(최고용량)의 5가지 용량 수준으로 매일 1회 투여했다. GF423 투여군은 마우스 당 1 x 107 CFU 용량으로 매일 1회 투여했다. GF103은 마우스 당 10 U 용량으로 매일 1회 투여했다. 텔미사르탄은 10 mg/kg의 용량으로 1일 1회 투여했다. GF427, GF423 및 GF103 투여군은 100 μL 용량으로 비히클의 형태로 경구 투여하였고, 텔미사르탄은 10 mL/kg의 용량으로 RO 수(Reverse osmosis water)에 보충된 형태로 경구 투여하였다. 정상군 및 질병 대조군은 희생 전까지 어떠한 처리도 진행하지 않았으며, 이소플루란(구입처: Pfizer Inc.) 마취하에 직접 심장 천자를 통해 방혈함으로써 13주령에 희생시켰다. 동물은 생존력, 임상 징후(무기력, 경련, 호흡곤란) 및 행동을 매일 모니터링하여 시험 물질 투여 전과 투여 후에 독성, 혼수 및 사망의 중요한 임상 징후가 있는지 관찰하였다. 동물이 일주일 이내에 25% 미만의 체중 감소를 보이거나 엎드린 자세와 같은 혼수 징후를 보이면 연구 종료 전에 안락사시키고 샘플을 채취하지 않았다. 모든 동물의 관리 및 실험은 동물의 복지 및 관리에 관한 법률 등에 따라 진행하였다.
실시예 7.2. 시료 준비
실시예 7.1에 사용된 GF427 포자와 GF423 포자는 제조예 1과 동일하게 제조하고, GF103은 실시예 5.1과 동일하게 제조하였다. 텔미사르탄(Micardis®)은 Boehringer Ingelheim GmbH(독일)에서 구입하였다. 본 실시예에서 사용되는 SOD를 발현하는 바실러스 벨레젠시스 GF427 균주는 생물자원센터(KCTC)에 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주(수탁번호: KCTC 13222BP, 수탁일자: 20170306) ("GF423 균주")로부터 SOD 활성을 증가시키도록 GF423 sodA 유전자의 프로모터 서열을 보다 강력한 프로모터 성능을 갖는 염기 서열로 치환하여 제조하였다(제조예 2 참조). GF427 및 GF423 시험 물질은 사용하기 전에 적어도 30초 동안 볼텍싱을 진행하였다. 분취를 수행할 때는, 잘 교반된 용액을 사용하여 원하는 스톡 부피를 얻기 위해 적절한 양의 CFU/mL를 분취에 사용하였다. GF103 시험 물질은 매일 투여하기 전에 GF103 10 mg 분말을 적절한 양의 증류수로 희석했다. GF427, GF423 및 GF103 시험 물질은 투여 전 4℃에서 보관 및 유지하였다. 텔미사르탄 시험 물질은 투여 전에 신선하게 준비하였고, 텔미사르탄 1정을 막자사발에 옮긴 후 RO 수를 서서히 첨가하며 막자로 갈아서 1 mg/mL의 균질한 현탁액을 얻었다.
실시예 7.3. 샘플 준비
13주령 마우스를 희생시킨 후, 냉동 혈장 샘플, 냉동 간 샘플, O.C.T-포매 간 블록 및 파라핀-포매 간 블록을 수집 및 보관하였다.
혈장 샘플 준비
연구 종료 시, 비공복 혈액(non-fasting blood)은 미리 냉각된 주사기를 사용하여 직접 심장 천자를 통해 수집했다. 수집된 혈액은 항응고제(노보헤파린, 구입처: Mochida Pharmaceutical Co. Ltd.)와 함께 미리 냉각된 폴리프로필렌 튜브에 옮겨 원심분리할 때까지 얼음에 보관했다. 혈액 샘플은 4℃에서 15분 동안 1,000 xg으로 원심분리했다. 원심분리 후, 상층액을 수집하여 생화학 실험 및 운송을 위해 -80℃에서 보관하였다.
간 샘플 준비
희생 시, 마우스의 전체 간을 수집하고 차가운 식염수로 세척했다. 개별 간 전체(외피 쪽(parietal side) 및 내장 쪽(visceral side))를 사진 촬영했다. 다음, 간 중량을 측정하고 간 대 체중 비율을 계산했다. 간의 좌측외엽을 분리 및 절개하여 도 41과 같이 보관했다. 도 41에서 a로 표기된 간 표본은 추가 분석 또는 운송을 위해 최적 절단 온도(O.C.T., 구입처: Sakura Finetek Japan) 화합물에 포매된 채로 -80℃에서 보관했다. b로 표기된 간 표본은 Bouin 용액(구입처: Sigma-Aldrich Japan)에서 24시간 동안 고정했다. 고정 후, 이들 표본은 H&E 및 시리우스 레드 염색을 위해 파라핀 포매를 진행했다. c로 표기된 간 표본은 액체 질소에서 급속 냉동하고 유전자 발현 분석을 위해 -80℃에서 보관했다.
추가적으로, 좌측 및 우측 내엽은 운송을 위해 액체 질소에 급속 냉동하여 -80℃에서 보관했다. 우엽은 생화학 실험을 위해 액체 질소에 급속 냉동하여 -80℃에서 보관했다. 꼬리엽은 운송을 위해 액체 질소에 급속 냉동하여 -80℃에서 보관했다.
실시예 7.4. 실험 진행 중 마우스 상태 확인
NASH를 유도하고 처리를 진행하는 21일 동안 10개의 그룹에 속하는 마우스의 체중 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 42를 참조하면, 질병 대조군의 평균 체중은 13일차, 15일차, 16일차 및 17일차에 정상군보다 유의하게 낮았다. 텔미사르탄 투여군의 평균 체중은 17일차부터 21일차까지의 질병 대조군보다 유의하게 낮았다. 한편, 치료 기간 중 어느 날에도 질병 대조군과 다른 치료군(그룹 3 내지 그룹 9) 간의 평균 체중 변화에는 유의미한 차이가 없었다.
치료 기간 동안, 21일차가 되기 전에 죽은 채 발견된 마우스는 다음과 같았다. 질병 대조군에서는 8마리 중 1마리가 안락사되었다. GF427 중간용량 투여군 및 고용량 투여군에서는 마우스 8마리 중 1마리가 죽은 채로 발견되었다. GF423 투여군에서는 마우스 8마리 중 2마리가 죽은 채로 발견되었다. 텔미사르탄 투여군에서는 마우스 8마리 중 2마리가 안락사되었다.
실시예 7.5. 장기 중량 변화 확인
처리가 모두 종료된 21일차에 10개의 그룹에 속하는 마우스의 당일 평균 체중, 간 중량 및 간 대 체중 비율을 측정하였다(도 43a).
도 43a 및 도 43b를 참조하면, 질병 대조군의 희생 당일 평균 체중은 정상군에 비해 감소하는 경향을 보였다. 텔미사르탄 그룹은 질병 대조군에 비해 희생 당일 평균 체중이 유의하게 감소했다. 모든 치료군에서도 희생 당일 평균 체중은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다.
도 43a 및 도 43c를 참조하면, 질병 대조군은 정상군에 비해 평균 간 중량이 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 한편, GF427 고용량 투여군 및 텔미사르탄 투여군은 질병 대조군과 비교하여 평균 간 중량의 유의한 감소를 보였다. GF427 최저용량, 저용량 및 GF423 투여군의 평균 간 중량은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향이 있었다. 나머지 그룹과 질병 대조군 사이에 평균 간 중량의 유의한 차이가 없었다.
도 43a 및 도 43d를 참조하면, 질병 대조군은 정상군에 비해 평균 간 대 체중 비율이 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 한편, GF427 고용량 투여군 및 텔미사르탄 투여군에서 평균 간 대 체중 비율은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향이 있었다. 질병 대조군과 나머지 그룹 사이에 평균 간 대 체중 비율의 유의한 차이가 없었다.
실시예 7.6. 혈장 및 간 조직의 생화학 분석
실시예 7.3의 혈장 샘플 준비 방법 및 간 샘플 준비 방법에 따라 각 마우스의 혈장 또는 간 샘플을 수집한 후, 전혈당 수준, 혈장 ALT 수준, 혈장 CK-18 수준 및 간 중성지방 함량을 측정하여 비교하였다(도 44a).
전혈당 수준 측정
전혈(Whole blood)의 비공복 혈당은 Stat Strip 혈당 측정기(구입처: NIPRO CORPORATION)로 측정했다. 측정 결과, 도 44b를 참조하면, 질병 대조군은 정상군에 비해 전혈당 수치가 유의하게 증가한 것으로 나타났다. GF427 최저용량, 최고용량 및 GF423 투여군의 전혈당 수준은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향이 있었다. 질병 대조군과 나머지 그룹 사이에 전혈당 수치의 유의한 차이가 없었다.
혈장 ALT 수준 측정
혈장 ALT 수치는 FUJI DRI-CHEM 7000(구입처: Fujifilm Corporation)으로 측정했다. 측정 결과, 도 44c를 참조하면, 질병 대조군은 정상군에 비해 혈장 ALT 수준의 유의한 증가를 보였다. GF427 고용량 투여군은 질병 대조군에 비해 혈장 ALT 수준의 유의한 감소를 보였다. GF427 최저용량, 최고용량 및 텔미사르탄 투여군의 혈장 ALT 수준은 질병 대조군과 비교하여 감소하는 경향이 있었다. 질병 대조군과 나머지 그룹 사이에 혈장 ALT 수치의 유의한 차이가 없었다.
혈장 CK-18 수준 측정
혈장 CK-18 수준은 마우스 사이토케라틴 18-M30 ELISA 키트(구입처: Cusabio Biotech Co., Ltd)로 정량했다. 측정 결과, 도 44d을 참조하면, 질병 대조군은 정상군에 비해 혈장 CK-18 수준이 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 모든 그룹은 질병 대조군과 비교하여 혈장 CK-18 수준에서 유의한 감소를 보였다.
간 중성지방 함량 확인
간 총 지질 추출물은 Folch의 방법으로 얻었다(문헌 [Folch J. et al., J. Biol. Chem. 1957;226: 497] 참조). 간 샘플을 클로로포름-메탄올(2:1, v/v)로 균질화하여 실온에서 하룻밤 배양했다. 다음, 클로로포름-메탄올-물(8:4:3, v/v/v)로 세척한 후 추출물을 증발 건조시키고, 이소프로판올에 용해시켰다. 간 중성지방(트리글리세리드)의 함량을 트리글리세리드 E-테스트(구입처: FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)로 측정했다.
측정 결과, 도 44e를 참조하면, 질병 대조군은 정상군에 비해 간 중성지방 함량이 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 한편, GF427 최저용량 투여군을 제외한 모든 그룹은 질병 대조군에 비해 간 중성지방 함량이 유의하게 감소하였다. GF427 최저용량 투여군의 간 중성지방 함량은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다.
실시예 7.7. 간 조직의 H&E 염색 및 NAFLD 활성도 점수 평가를 통한 간 섬유화 확인
실시예 7.3에서 준비된 간 조직의 파라핀 블록으로부터 회전식 마이크로톰(구입처: Leica Microsystems)을 사용하여 절편을 절단했다. 절편화 후, 각 슬라이드에는 블라인드 평가를 위한 번호를 코딩하였다. 각 번호는 Excel 소프트웨어의 RAND 함수를 사용하여 생성하였고, 오름차순으로 정렬하여 슬라이드에 할당했다. 조직 슬라이드를 H&E 염색에 사용하였고 실험자가 평가했다.
H&E 염색을 위해 Bouin 용액에 미리 고정시킨 간 조직의 파라핀 블록으로부터 절편을 절단하고 릴리-마이어 헤마톡실린(구입처: Muto Pure Chemicals Co., Ltd.) 및 에오신 용액(구입처: FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation)으로 염색했다. NAFLD 활성도 점수(NAS)는 표 12에 도시된 바와 같은 Kleiner의 기준에 따라 계산했다(문헌 [Kleiner DE. Et al., Hepatology, 2005;41:1313] 참조). NAS 점수매김을 위해, H&E 염색된 절편의 명시야 이미지를 디지털 카메라(구입처: Leica, 품번: DFC295)를 사용하여 50배 및 200배 배율로 캡처했다. 마우스 당 1개의 절편에서의 지방증 점수(50배 배율에서 대표적인 1개 시야), 마우스당 1개의 절편에서의 염증 점수(200배 배율에서 중심정맥 주변의 대표적인 1개 시야), 마우스 당 1개의 절편에서의 풍선화 점수(200배 배율에서 중심정맥 주변의 대표적인 1개 시야)를 평가하였다.
항목 범위 점수
지방증 50배 배율에서의 지방증
□ <5%
□ 5-33%
□ >33-66%
□ >66%
0
1
2
3
소엽 염증 염증성 병소의 평가
□ No foci
□ <2 foci/200x
□ 2-4 foci/200x
□ >4 foci/200x
0
1
2
3
풍선화 풍선화 세포 수의 평가
□ 없음
□ 풍선화 세포가 거의 없음
□ 많은 세포/현저한 풍선화
0
1
2
H&E 염색된 간 절편의 대표적인 현미경 사진을 촬영하고(도 45a 내지 도 45c), 이로부터 각 항목별 점수 및 NAS 값을 표(도 45e) 및 그래프(도 45f 내지 도 45i)로 나타냄으로써 각 그룹의 지방증, 염증 세포 및 간세포 풍선화 정도를 확인하였다. 질병 대조군의 간 절편을 상세히 확인해본 결과, 정상 그룹과 비교하여 미세소포성 및 거대소포성 지방 침착, 간세포 풍선화 및 염증 세포 침윤을 나타내었다(도 45d). 한편, 질병 대조군과 비교하여 나머지 투여군에서는 지방증, 염증 세포 및 간세포 풍선화 정도가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.도 45e 내지 도 45i를 참조하면, 질병 대조군은 정상군에 비해 NAS의 유의한 증가를 보였다. 한편, GF427 저용량, 중간용량, 고용량, 최고용량, GF423 및 텔미사르탄 투여군은 질병 대조군과 비교하여 NAS의 유의한 감소를 보였다. GF103 그룹의 NAS는 질병 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다. 질병 대조군과 GF427 최저용량 투여군 사이에 NAS의 유의한 차이는 없었다.
실시예 7.8. 간 조직의 시리우스 레드 염색을 통한 간 섬유화 확인
콜라겐 침착을 시각화하기 위해 Bouin에 고정된 간 절편을 피크로(picro)-시리우스 레드 용액(구입처: FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)을 사용하여 염색했다. 먼저, 절편을 탈파라핀화하고 자일렌, 100-70% 알코올 시리즈 및 RO 수로 차례로 친수화한 다음 0.03% 피크로-시리우스 레드 용액(품번: Cat No. 194-16202)으로 60분 동안 처리했다. 0.5% 아세트산 용액과 RO 수로 세척한 후, 염색된 절편을 탈수하고 70-100% 알코올 시리즈와 자일렌으로 세척한 다음, Entellan® new(구입처: Merck)로 밀봉하여 관찰에 사용했다.
섬유화 면적의 정량적 분석을 위해, 시리우스 레드-염색된 절편의 명시야 이미지를 디지털 카메라(구입처: Leica, 품번: DFC295)를 사용하여 200배 배율로 중심정맥 주변에서 캡쳐하고, 절편당 5개 시야 내의 양성 영역을 ImageJ 소프트웨어(미국 국립보건원)를 사용하여 측정했다. 섬유화 면적의 평가를 위한 시리우스 레드-염색된 절편의 대표적인 현미경 사진을 도 46a에 나타내었다.
도 46a 내지 도 46c를 참조하면, 질병 대조군의 간 절편은 정상군에 비해 간소엽의 중심 주변부에서 증가된 콜라겐 침착(시리우스 레드 양성)을 보였다. 또한, 질병 대조군은 정상군에 비해 섬유화 면적(시리우스 레드-양성 면적)의 유의한 증가를 보였다. 한편, GF427 최고용량, GF423, GF103 및 텔미사르탄 투여군에서의 섬유화 면적은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다. 질병 대조군과 나머지 그룹 사이에 섬유화 면적의 유의한 차이가 없었다.
통계 분석
통계 분석은 프리즘 소프트웨어 6(GraphPad 소프트웨어, 미국) 및 본페로니 다중 비교 테스트(Bonferroni Multiple Comparison Test) 사용하여 수행하였다.
P 값 <0.05가 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다. 결과는 평균 ± SD로 표시하였다.
단측 t-검정(one-sided t-test)에서 0.1 미만의 P값이 나왔을 때 추세 또는 경향이 가정되었다. 모든 결과는 다음 그룹 간 비교가 이루어졌다:
1) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 1(정상군)
2) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 3(GF427 최저용량 투여군)
3) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 4(GF427 저용량 투여군)
4) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 5(GF427 중간용량 투여군)
5) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 6(GF427 고용량 투여군)
6) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 7(GF427 최고용량 투여군)
7) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 8(GF423 투여군)
8) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 9(GF103 투여군)
9) 그룹 2(질병 대조군) 대 그룹 10(텔미사르탄 투여군)
결론
본 실시예는 바실러스 벨레젠시스 GF427, GF423 및 경구용 SOD(GF103)를 이용하여 상기 균주의 포자 또는 경구용 SOD의 투여가 비알코올성 지방간염 동물모델의 간 섬유화 치료에 효과적임을 확인하였다. 구체적으로, 스트렙토조토신 용액 및 고지방 식이를 통해 NASH를 유발한 동물모델에 GF427 균주 포자, GF423 균주 포자, GF103를 21일 동안 1일 1회 100 uL 용량으로 비히클의 형태로 경구 투여한 마우스 모델에서 간 섬유화의 진행이 억제되어 개선되는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
GF427 투여군의 전혈당 수치 및 섬유화 면적은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향이 있었으며, 혈장 ALT 수준, 혈장 CK-18 수준, 간 중성지방 함량 및 NAS는 질병 대조군에 비해 유의한 감소를 보였다. GF423 투여군은 질병 대조군에 비해 혈장 CK-18 수준, 간 중성지방 함량 및 NAS에서 유의한 감소를 보였다. 또한, 전혈당 수치 및 섬유화 면적은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향이 있었다. GF103 투여군은 질병 대조군에 비해 혈장 CK-18 수준과 간 중성지방 함량의 유의한 감소를 보였다. 또한, NAS 및 섬유화 면적은 질병 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다.
결론적으로, SOD를 과발현하도록 제작한 GF427 균주의 포자, 야생형 SOD를 발현하는 GF423 균주의 포자 및 경구용 SOD인 GF103은 모두 단독 투여시 간 섬유증의 억제 및 치료에 유용한 소재가 될 수 있음을 확인하였다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)
수탁번호 : KCTC15552BP
수탁일자 : 20230814

Claims (20)

  1. 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 종 균주는 SOD를 발현하는 균주 또는 SOD를 과발현하도록 변이되거나 재조합된 균주인
    약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 종 균주 포자는 SOD를 발현하는 균주 또는 SOD를 과발현하도록 변이되거나 재조합된 균주로부터 유래된 포자를 포함하는
    약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 종 균주는 바실러스 벨레젠시스 종 균주인
    약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 종 균주는 수탁번호 KCTC 13222 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주, 수탁번호 KCTC 13227 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주 및 수탁번호 KCTC 15552 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주로부터 선택된 하나 이상인
    약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 Mn-SOD인
    약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 탈아미드화된 Mn-SOD인
    약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 바실러스 종 균주에서 유래한 것인
    약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 바실러스 종 균주는 바실러스 벨레젠시스 종 균주인
    약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 바실러스 종 균주는 수탁번호 KCTC 13222 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주, 수탁번호 KCTC 13227 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주 및 수탁번호 KCTC 15552 BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 균주로부터 선택된 하나 이상인
    약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는
    약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 코팅제로 코팅된 것인
    약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 코팅제는 쉘락(shellac)을 포함하는
    약학 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 섬유화 질환은 폐 섬유화 질환 또는 간 섬유화 질환인
    약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 폐 섬유화 질환은 간질성 폐 질환, 폐 섬유증 및 특발성 폐 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는
    약학 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 간 섬유화 질환은 비알코올성 지방간염, 간섬유증, 특발성 간 섬유증, 간경변, 알코올성 지방간염, 만성 간질환, 바이러스성 간염으로 이루어진 군에서 선택되는
    약학 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 유효성분은 경구 투여되는
    약학 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 상기 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상을 포함하고, 상기 둘 이상의 성분이 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여되는
    약학 조성물.
  19. 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 섬유화 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 방법.
  20. 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및 수퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
KR1020230116553A 2022-09-01 2023-09-01 수퍼옥시드 디스뮤타제를 발현하는 바실러스 종 균주, 바실러스 종 균주 포자 및/또는 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 섬유화 질환 예방 또는 치료용 용도 KR20240032684A (ko)

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