KR102496206B1 - 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 a 서브유닛 작동체 폴리펩티드 및 이를 포함하는 세포-표적화 분자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 강력한 시가 독소 기능(예: 준세포 경로화 및 세포독성)을 보일 수 있는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 프로테아제-절단 저항성의 분자를 제공한다. 본 발명은, 예를 들어 감염된 또는 악성 세포와 같은, 특정 세포 유형을 표적화하는 프로테아제-절단 저항성의 세포-표적화 분자 또한 제공한다. 본 발명의 어떤 분자는 세포독성이고, 그리고 본 발명의 어떤 세포-표적화 분자는 특정 세포 유형의 표적화된 사멸 및 암, 종양, 성장이상, 면역 장애, 및 미생물 감염을 포함한 질병, 장애, 및 증상의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 어떤 세포-표적화 분자는 프로테아제-절단 민감성의 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 관련된 세포-표적화 분자에 비해서 향상된 체내 내성을 보인다. 본 발명의 세포-표적화 분자는, 예를 들어 항원, 세포독성제, 및 검출 촉진제와 같은, 부가적인 물질을 표적 세포의 내부로 전달할 수 있다.
Description
발명의 분야
[1] 본 발명은 자연적으로 발생하는 시가 독소의 A 서브유닛으로부터 유도된 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 이를 함유하는 세포-표적화 분자에 관한 것으로, 시가 독소 A1 단편 유도 영역의 카르복시 말단 부근에 붕괴된 퓨린-절단 사이트(site)가 존재하고, 선택적으로 시가 독소 A1 단편 유도 영역에 카르복시-말단에 결합된 분자 모이어티(moiety)가 존재하는 것을 특징으로 한다. 여기에서 설명되는 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 표적-세포 분자의 성분, 즉 치료제 및/또는 진단시약으로 유용하다. 예를 들어, 여기에서 설명되는 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 특정 유형의 세포를 표적 사멸하는 용도로 사용하기 위한 항체 독소 및 리간드-독소 융합물과 같은 세포독성의 세포-표적화 분자 성분으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 분자들은 특이적으로 표적된 세포독성에 분류효과 없이 개체에 투여한 후에 비-특이 독성을 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 분자들은 생산, 저장, 및 투여 과정에서 안정도를 향상시킬 수 있다. 본 발명의 특정 분자들은 세포독성을 유발하는 세포 표적 및 촉매 활성 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 중재하기 위한 결합 영역을 포함한다. 본 발명은 분자들은 암, 종양, 면역 장애 및 세균감염을 포함하는 각종 질병, 장애 및 증상의 진단, 진료 및 치료를 위한 치료약 및 진단시약으로의 용도를 갖는다.
발명의 배경
[2] 시가 독소는 독소의 구조, 특성 및 생화학적 활성을 적절히 변화시켜 치료목적으로 사용하도록 시도되어 왔다(특허 US7713915, EP1051482, EP1727827, EP1945660; 및 특허출원 US2009/0156417A1, EP2228383B1, EP2402367A1, US2013/0196928A1, WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/120058, WO 2015/138435, 및 WO 2015/138452 참조, 이들 각각은 전체적으로 본 발명에 참고자료로 인용된다). 시가 독소 및 그 성분들은 체내에서의 정밀한 표적을 위한 고-친화도 표적 결합을 갖는 시가 독소의 높은 세포독성의 조합을 이용하는 항체독소 및 리간드-독소 융합물과 같은 치료제 분자들을 제조하는데 사용될 수 있다. 특히 시가 독소의 촉매 A 서브유닛은 다른 단백질 도메인에 결절 되거나 융합되더라도 안정적이고, 효소 활성적이며, 세포독성을 유지한다(Haddad J et al., J Bacteriol 175: 4970-8 (1993); Backer M et al., J Control Release 74: 349-55 (2001); Backer M, Backer J, Bioconjug Chem 12: 1066-73 (2001); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). 시가 독소 A 서브유닛 폴리펩티드를 함유하는 합성 분자를 설계할 때, 시가 독소 중독의 자연적 메커니즘은 중요한 고려사항이다.
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[3] 수많은 박테리아 독소는 독소 활성화 및/또는 준세포 경로화(subcellular routing)과 같은 최적의 세포독성을 독성을 위한 숙주-세포, 세포내 프로테아제에 의한 사이트-특이 과정(site-specific processing)에 의존한다(Thomas G, Nat Rev Mol Cell Biol 3: 753-66 (2002) 참조). 시가 독소는 독소 활성화와 준세포 경로화를 위하여 사이트-특이 절단을 이용한다. 시가 독소 활성은 단백질 가수분해 절단에 의해 증가한다(Brown J et al., FEBS Lett 117: 84-8 (1980); Reisbig R et al., J Biol Chem 256: 8739-44 (1981)). 시가 독소는 중독된 세포의 가장 효율적인 사멸을 위하여 중독된 세포 내에서 엔도프로테아제 퓨린에 의한 A 서브유닛의 세포내 절단을 필요로 한다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). 이러한 단백질 가수분해 과정은 최대의 시가 독소 세포독성을 위하여 요구되는 가장 효율적인 독소 활성화 및/또는 준세포 경로화를 제공하도록 시가 독소 A서브유닛 유도 성분을 함유하는 분자의 설계에서 반드시 고려되어야 한다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007) 참조).
[4] 관련된 단백질 독소, 특히 이질균(S. dysenteriae) 및 대장균(E. coli)으로부터 분리된 독소의 시가 독소군은 구조적으로 및 기능적으로 관련된 자연적으로 발생하는 다양한 독소로 구성된다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). 상기 시가 독소군의 개체들은 동일한 전체적인 구조 및 행동 메커니즘을 공유한다(Engedal, N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). 상기 시가 독소군의 개체들은 숙주의 감염 중에 독성 인자로서 박테리아에 의해 이용된다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). 감염된 숙주에서, 시가 독소는 단백질 합성을 억제하고 세포 사멸을 유발하는 독소의 강력한 능력 때문에 세포독성을 갖는다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). 숙주 세포에서의 시가 독소의 강력한 세포독성 효과는 인체에서 출혈성 대장염 및 용혈성 요독 증후군을 초래할 수 있다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).
[5] 시가 독소군의 개체들은 시가 단백질 서브유닛의 A(B)5 배열에 의해 특징되는 공통의 다중결합의 단백질구조를 공유한다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). 각각의 시가 독소는 A와 B의 두 단백질 서브유닛으로 구성되는데, 이들은 A(B)5배열 내에서 결합하여 완전 독소 단백질 복합체를 형성한다. 시가 독소 A 서브유닛은 효소 도메인을 포함하는 대략 32-33 킬로달톤(kDa) 단량체이고, 시가 독소 B 서브유닛은 시가 독소 B 서브유닛의 대략 38.1-38.5 kDa 오량체(pentamer)를 형성하도록 4개의 다른 시가 독소 B 서브유닛과 결합하는 대략 7.6-7.7 kDa의 서브유닛이다. B 서브유닛의 오량체는 하나의 A 서브유닛과 결합하여 시가 완전독소를 형성하는데, 이는 약 70-72 kDa이다(O’Brien A, Holmes, R, Microbiol Rev 51: 206-20 (1987)). 대체로, 시가 독소 A 서브유닛은 완전독소 내에서 B 서브유닛 오량체 속으로 연장되는 나선을 갖는 단일의 구상 단백질을 형성한다(Fraser M et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 62: 627-30(2006)).
[6] 시가 독소에 의한 효율적인 세포사멸은 엔도프로테아제 퓨린에 의한 보존된, 표면-노출, 연장된 루프(loop) 구조 내에서 시가 독소 A 서브유닛의 세포내 절단을 필요로 한다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). 퓨린-절단된 시가 독소 A 서브유닛의 아미노-말단 단편은 시가 독소 "A1 단편"(또는 Stxn-A1, SLTn-A1, SLT-nA1)이라 하고, A 서브유닛은 카르복시-말단 단편은 시가 독소 "A2 단편"이라 한다. 시가 독소 A1 단편은 시가 독소의 촉매 도메인을 포함하는 대략 27.5 kDa의 폴리펩티드이다(Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994)).
[7] 단지 시가 독소 A1 단편만이 중독된 세포에서 시토졸(cytosol)에 국소화되고(localize), 시가 독소 A2 단편과 B 서브유닛은 소포체(endoplasmic reticulum) 내에 잔류한다(Tam P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10 (2007)). 보존된, 표면-노출, 연장된 루프 구조에서 시가 독소 A 서브유닛의 단백질 가수분해 절단이 촉매 A1 단편의 유리와 A1 단편의 시토졸에 대한 준세포 경로화에 기여한다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). 시가 독소 A2 단편은 촉매 활성에 불필요한 대략 4.5-4.7 kDa의 폴리펩티드이다(Haddad J et al., J Bacteriol 175: 4970-8 (1993); Backer M et al., J Control Release 74: 349-55 (2001); Backer M, Backer J, Bioconjug Chem 12: 1066-73 (2001); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)).
[8] 퓨린은 모든 인체 조직 내에서 그리고 대부분의 동물 세포에서 매우 다양한 세포에 의해 발현되는 특이화된 세린(serine) 엔도프로테아제이다(Shiryaev S et al., J Biol Chem 282: 20847-53 (2007)). 퓨린은 최소의 이염기 공통 모티프(consensus motif) R-x-(R/K/x)-R 상에 종종 집중된 접근성 모티프를 함유하는 폴리펩티드를 절단한다(Thomas G, Nat Rev Mol Cell Biol 3: 735-66 (2002); Tian S, Biochem Insights 2: 9-20 (2009)). 시가 독소군의 개체들의 A 서브유닛은 보정된, 표면-노출, 연장된 루프 구조를 포함한다(예를 들어, 242-261 in StxA and SLT-1A, and 241-260 in SLT-2). 이는 퓨린에 의해 절단된 보존된 S-R/Y-x-x-R 모티프를 갖는다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007); Faqerquist C, Sultan O, J Biomed Biotechnol 2010: 123460 (2010)). StxA 내의 아미노산 잔기 242-261에 위치한 표면-노출된 연장된 루프 구조는 최소의 퓨린-절단 모티프 R-x-x-R을 플랭킹하는(flanking) 특징을 포함하여, StxA의 퓨린-유도 절단을 위하여 필요하다(Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
[9] 시가 독소 중독 중에, A 서브유닛은 보존된 아르기닌 잔기(예를 들어, StxA 및 SLT-1A 내의 위치 251에서의 아르기닌 잔기 및 Stx2A 및 SLT-2A 내의 위치 250에서의 아르기닌 잔기)의 카르복시 결합에서 퓨린에 의하여 단백질 기수분해로 절단된다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Faqerquist C, Sultan O, J Biomed Biotechnol 2010: 123460 (2010)). 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린 절단은 엔도소말(endosomal) 및/또는 골지(Golgi) 구획(compartments) 내에서 발생한다(Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
[10] A2 단편으로부터 시가 독소 A1 단편의 해리는 A1 단편의 촉매 도메인의 활성화를 위하여 필요하다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). 시가 독소의 촉매 도메인은 퓨린 절단 전에 비활성일 수 있는데, 이는 A 서브유닛의 A2 부분이, A1 부분 속으로 돌출되고 A1 부분의 활성 사이트를 막는 A2 부분의 메티오닌-260으로, A1 부분의 활성 사이트를 막기 때문이다(Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994) 또한 참조).
[11] A2 단편 및 시가 완전독소의 나머지로부터 시가 독소 A1 단편의 해리는 소포체의 루멘으로부터 시토졸까지 A1 단편의 전위를 위하여 필요하다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012)). A1 단편의 유리는 하기의 일련의 복잡한 과정을 유발하는 소수성 도메인을 드러낸다: 1) 소포체-관련 분해(ERAD) 시스템에 의한 A1 단편의 인지, 2) 중첩풀림(unfolding), 3) 소포체막을 통한 반대전위, 및 4) 시토졸 내에서 촉매 형성에 대한 재접힘(refolding)(Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012)).
[12] 우선, 시가 완전독소의 나머지로부터 유리 및 퓨린 절단 후에 드러나는 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단이 ERAD 시스템에 의해 인지된다. ERAD 시스템은 ER 내에서 말단에서 잘못 접혀진 단백질을 식별하고, 그것을 폴리유비퀴틴으로 표시하고, 그것을 프로테아좀 파괴를 위하여 시토졸까지 송출한다(Smith M et al., Science 334: 1086-90 (2011)). 시가 독소의 A1단편은, 상대적으로 소수성인 아미노산 잔기로 구성되고,퓨린 절단에 의해 생성된 A1 단편의 카르복시 말단 상에 위치하는 부분적으로 잘못 접혀진 폴리펩티드 영역을 통하여 접혀지지 않은 ERAD 기질을 흉내냄으로써 시토졸까지 접근하도록 ERAD 통로를 이용한다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012)). 격렬한 절개에 의해 드러난 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단 부근의 부분적으로 접혀지지 않은 일부 소수성 아미노산 잔기는 ERAD 시스템의 소포체 샤페론 단백질에 의해서 인식될 수 있다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012)).
[13] 시가 독소 A1 단편이 중독된 잔핵 세포의 시토졸로 우선 들어갈 때, 접혀지지 않은 결과로 실질적으로 무질서한 형태로 폴리유비퀴티네이트(polyubiqutinated) 되는 것으로 추측되고, 그래서 A1 단편은 그들의 세포독성 촉매 활성을 발산하도록 프로테아좀 분해를 피하고 촉매 활성 형태로 다시 접혀야 한다(Tam P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10 (2007); Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012)). 일단 시토졸 내에서, 활성 시가 독소 A1 단편은 대략 분당 700리보솜의 속도로 A1 단편의 강력한 효소 활성을 통하여 차례로 진핵 리보솜을 가역적으로 불구화할 수 있다(Brigotti M et al., Toxicon 35:1431?1437 (1997); Tam P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10 (2007)). 임계 개수의 리보솜이 비활성화한 후에, 하나의 중독된 숙주 세포가 세포자멸을 통하여 세포 사멸을 유도하도록 단백질 합성에서 충분한 감소를 경험하는 것으로 예측된다(Iordanov M et al., Mol Cell Biol 17: 3373-81 (1997); Smith W et al., Infect Immun 71: 1497-504 (2003); Lee S et al., Cell Microbiol 10: 770-80 (2008); Tesh V, Future Microbiol 5: 431-53 (2010)).
[14] A1 및 A2 단편 사이의 시가 독소 A 서브유닛의 세포 내 퓨린 절단이 최대의 시가 독소 세포독성을 위하여 중요하다. 실험에서는 최대의 시가 완전독소 세포독성이 하기 사항을 요구하는 것을 보여준다: 1)시가 독소 A 서브유닛에서 A1 및 A2 단편 사이에 위치한 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R, 2)최소의 퓨린-절단 사이트를 포함하는 시가 독소 A 서브유닛에서 표면-노출 연장된 루프 구조 내의 특정의 아미노산 잔기, 및 3) 중독된 척추동물 세포에 의한 퓨린의 세포 발현.
[15] 퓨린이 부족한 인체 세포는 시가 독소 세포독성에 대항하여 보호되고, 이들 동일한 퓨린-결핍 세포는 퓨린의 강제 발현에 의하여 민감한 시가 독소로 제조될 수 있다(Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
[16] 퓨린은 특정의 인체 암세포에서 최대의 시가 독소 세포독성을 위해 필요한 것으로 나타났다(Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). 보존된, 표면-노출, 연장된 루프구조에서 붕괴된 퓨린-절단 사이트 및/또는 돌연변이를 갖는 시가 독소는 감소된 세포독성을 나타낸다. 아미노산 잔기 치환체 또는 제거체를 갖는 시가 독소 A 서브유닛의 상기 표면-노출, 연장된 루프 구조에서 S-R/Y/x-x-R 퓨린-절단 모티프를 붕괴시키는 것은 A 서브유닛의 덜 효율적인 절단 및 척추동물 세포내에서 덜 효율적인 리보솜 억제를 초래하였다(Burgess B, Roberts L, Mol Microbiol 10: 171-9 (1993); Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). SLT-1의 A 서브유닛 내에서의 퓨린-절단 모티프의 붕괴는 그 리보솜 억제 활성을 60배로 감소시켰다(Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999)). 또한, 최소의 퓨린-절단 모티프 R-x-x-R을 붕괴시키지 않고 퓨린-절단 모티프의 플랭킹(flanking) 영역을 붕괴시켜도 Stx의 리보솜 억제 활성을 감소시켰다(Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
[17] 시가 독소 세포독성은 퓨린-절단 저항성 시가 독소 변종 및 시가 완전독소를 세포 중독 전에 체외에서 퓨린으로 전처리한 퓨린-결핍 세포에 대하여 증가될 수 있다. 시가 독소 A 서브유닛은 퓨린에 의하여 체외에서 효율적으로 절단될 수 있다[(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995)). 퓨린-결핍 인체세포에 투여 전에 체외에서 Stx를 퓨린으로 전처리하는 것은 리보솜 억제 활성의 30-50배 증가를 초래하였다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). 유사하게, 퓨린-절단 저항성 변종 시가 독소를 체외에서 트립신으로 전처리하는 것은 전처리하지 않는 퓨린-절단 저항성 시가 독소로 중독된 세포와 비교할 때 중독된 척추동물 세포 내에서 증가된 리보솜 억제를 초래하였다(Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
[18] A2 단편으로부터 A1 단편의 해리는 A1 단편의 촉매 도메인의 활성화를 위하여 필요하다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). 시가 독소의 이 촉매 도메인은 촉매 도메인이 입체적으로 방어되기 때문에 퓨린 절단 전에 비활성일 수 있다(Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994) 또한 참조).
[19]시가 독소 세포독성의 모델은 중독된 세포 내에서 퓨린에 의한 시가 독소 A 서브유닛의 세포내 단백질 가수분해 과정이 하기 관점에서 필수적이라는 점이다: 1) 시가 완전독소의 나머지로부터 A1 단편의 유리, 2) A1 단편의 카르복시 말단에서 소수성 도메인을 노출시킴으로써 소포체로부터 A1 단편의 탈출, 및 3) A1 단편의 효소 활성화(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010) 참조). 중독된 세포의 소포체에서 시가 완전독소의 나머지 성분 및 A2 단편으로부터 시가 독소 A1 단편의 효율적인 유리는 야생형 시가 독소와 비교하여, 시토졸에 대한 효율적 세포내 경로화, 최대의 효소 활성, 효율적인 리보솜 비활성화, 및 최적의 세포독성 달성을 위하여 필수적이다.
[20] 모든 다른 모이어티로부터 시가 독소 A1단편의 유리는 1)중독된 세포의 소포체 내에서 세포 인자에 의한 인식을 위한 A1 단편의 카르복시 말단을 노출시키기 위하여 그리고 2)촉매 활성을 극대화하기 위하여 필요하다.
[21] 시가 독소 A1 단편의 유리는 A1 단편의 카르복시 말단을 노출시키기 위하여 필요하다. StxA의 A1 단편의 카르복시 말단 영역에서 대략 224 내지 241 소수성 영역은 소포체의 루멘(lumen)으로부터 시토졸까지 A1 단편의 반대 전위에 역할을 하는 것으로 추측된다(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). 이 소수성 영역내의 몇몇 아미노 잔기는 Stx1A 및 Stx2A 내에서 시가 독소 A 서브유닛의 절단 후에 더 많은 표면적이 이용가능하다(Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). 그래서 시가 독소 A1 단편의 유리 및 카르복시-말단 소수성 영역의 노출은 소포체로부터 시토졸까지 A1 단편의 이동을 유발할 수 있다(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). 또한 A1 단편의 카르복시 말단은 샤페론 단백질 이외의 소포체 수용체에 의해 인식되고 결합되는 리간드로서의 역할을 할 수 있고, 이는 A1 단편의 효율적인 반대전위에 기여하게 된다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005).
[22] 시가 독소 A1 단편의 세포독성을 향상시키는 구조적 변화는 모든 다른 모이어티로부터 A1 단편의 유리 후에 일어날 수 있다. 자유 시가 독소 A1 단편은 시가 완전독소 구조 내에 묻힌 특정의 촉매 영역을 노출시키는 것과 같은 과정으로 최적의 촉매 활성을 나타낸다(Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402 (1993); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011) 참조). 단백질 가수분해 절단 및 환원 조건에 대한 노출 후의 시가 독소 촉매 활성화, 또는 단백질 가수분해 과정 및 환원조건에 대한 노출 후의 시가 독소 세포독성의 향상은 A2 단편으로부터 A1 단편을 분리한 결과라 할 수 있다(Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402 (1993)). 나머지 시가 완전독소로부터 해리된 후의 시가 독소 A1 단편의 구조적 변화는 기능적 변화에 관한 것인데, 그 기능적 변화란, 예를 들어, ERAD 기계(machinery)에 의해 접혀지지 않고 시토졸까지 전위한 후에 더 촉매 활성적인 새롭게 접혀진 구조를 형성하는 능력, 프로테아좀에 의한 분해를 회피하는 시토졸 A1 단편의 능력, 및 더 개방적인 촉매 활성 사이트를 갖고 및/또는 효소 활성을 향상시키는 결합 클레프트(binding clefts)를 갖는 구조를 형성하는 능력을 의미한다(Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)).
[23] 예를 들어, Stx1A 내의 촉매 잔기 N75 및 Y77은 시가 독소 A1 단편의 유리 후에 더 많이 용매 노출될 수 있고, 대략 아미노산 잔기 위치 205 내지 205 으로부터 Stx1 및 Stx2의 A1 단편의 카르복시 말단 내의 많은 잔기들은 A1 단편의 유리 후에 표면 접근성에 상당한 변화를 수행할 수 있다(Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). 특히, Stx1A의 영역 240-251 및 Stx2A의 영역 239-250에서 아미노산 잔기는 시가 독소 A1 단편의 유리 후에 현저한 표면 노출의 증가를 나타냈다(Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). 다른 예는 Stx2A의 영역 42-49 및 246-250 내의 아미노산 잔기가 시가 독소 A1 단편의 유리 후에 더 많은 용매 노출을 나타낸다(Smith M et al., Infect Immun 77: 2730-40 (2009); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). 그래서, 모든 다른 모이어티로부터 시가 독소 A1 단편의 유리는 중독된 세포의 시토졸에 대한 A1 단편의 준세포 경로화, 중독된 세포의 시토졸 내에서의 A1 단편의 효소 활성, 및 중독된 세포의 시토졸 내에서의 A1 단편의 지속성을 향상시키는 구조적 및 기능적 변화에 의한 최대의 시가 독소 세포독성을 위하여 필요하다.
[24] 요약하면, 최대의 시가 독소 세포독성은 시가 독소 A 서브유닛의 절단, A1 단편의 카르복시 말단에 인접한 소수성 영역의 소포체 내의 노출, 및 완전독소의 나머지로부터 A1 단편의 유리를 필요로 하는 것으로 추측되며, 이들 모두는 A1 단편에 대한 다중의 구조적 및 기능적 변화를 초래할 수 있다. 또한 시가 독소 A1 단편의 시토졸까지의 세포 내 최적 이동도 동일한 행사, 즉 A 서브유닛 절단, A1 단편 카르복시 말단의 노출, 및 모든 다른 분자 모이어티로부터 A1 단편의 유리를 필요로 한다. 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린-절단이 없으면, 시가 독소 촉매 도메인의 준세포 경로화는 일어날 수 있지만, 최적에 못 미치고, 덜 효율적이며, 리보솜 억제 효율의 감소를 초래한다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007).
[25] 중독된 척추동물 세포에서 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린 단백질 가수분해 과정이 최대의 세포독성에 결정적이기 때문에, 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 분자를 설계하는 경우, 최대의 시가 독소 세포독성을 보존하기 위하여 자연적으로 발생하는 단백질 가수분해 과정을 유지하거나 그것을 보상하는 것이 중요하다. 시가 독소 A1 단편 유도 성분의 천연의 준세포 경로화 및/또는 세포독성을 교란하는 카르복시-말단 모이어티에 연결된 퓨린-절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛을 포함하는 구조의 퓨린-절단 결핍을 완전히 보상하는 방법은 알려져 있지 않다.
[26]가능한 한 세포독성을 갖는 시가 독소 A 서브유닛 유도 성분을 함유하는 세포독성 분자를 얻는 것이 바람직할 것이다. 또한 다양한 의료목적의 응용에서 특이세포를 사멸하기 위한 높은 성능을 유지하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드 성분을 함유하는 개선된 세포-표적화 분자를 얻는 것도 바람직할 것이다. 그러나, 세포 독성 분자가 세포-표적화된, 면역글로불린-유형 결합 영역과 같은 카르복시 말단 분자 모이어티를 함유하는 경우, 개체로 투여한 후에 감소된 비특이적 독성, 개선된 안정도, 증가된 체내 반감기, 및/또는 개선된 독성 프로파일을 갖는 시가 독소 A 서브유닛 유도 영역을 함유하는 세포독성 분자를 조작하는 방법상의 기술이 필요하다.
발명의 요약
[27] 본 발명은 세포-표적화 분자 및 진단 조성물과 같은 다양한 조성물의 성분으로 사용될 수 있는 다양한 프로테아제-절단 저항성 시가 A 서브유닛 독소 작동체 폴리펩티드 및 그것을 함유하는 세포독성 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 세포 표적을 유발하는 결합 영역과 기능적으로 결합한 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴레펩티드를 함유하는 다양한 세포-표적화 분자를 제공한다. 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티트와 세포-표적화된 결합 영역이 결합하면 강력한 시가 독소 세포독성 및/또는 세포증식억제(cytostasis)의 세포-유형 특이적 표적의 조작을 가능하게 하는 한편 동시에 체내 내성을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 특정의 세포-표적화 분자들은 주어진 복용량에서 생성되는 비특이적 독성의 감소 가능성으로 인하여 치료제 및/또는 진단제로서 척추동물에 투여하는 유용성을 향상시켰다.
[28] 특정의 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자는 1) 하나 이상의 폴리펩티드를 함유하는 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함하고 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역, 2) 하나의 카르복시 말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 영역 및 상기 A1 단편 영역의 상기 카르복시 말단에서 하나의 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 상기 결합 영역이 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단과 결합한다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 상기 결합 영역이 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 융합된다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 상기 결합 영역이 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 융합되어 단일의 연속적인 폴리펩티드를 형성한다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 상기 결합 영역이 상기 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 직접 또는 간접적으로 융합한다. 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티가 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 상기 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 이황화 결합이 아닌 최소한 하나의 공유결합에 의하여 상기 결합 영역에 연결된다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 다른 몇몇 구체예에서는, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역이 하기 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 단일 도메인 항체(sdAb)단편, 나노바디, 낙타과(camelid)로부터 유도된 중쇄 항체 도메인(VHH단편), 연골 어류로부터 유도된 중쇄 항체 도메인, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), VNAR 단편, 단쇄 가변성 단편(scFv), 항체 가변성 단편(Fv), 상보 결정 영역3(CDR3)단편, 제약된 FR3-상보성 결정 영역(CDR)3-FR4 폴리펩티드, Fd 단편, 항원-결합 단편(Fab), 피브로넥틴-유래 10th 피브로넥틴 타입 Ⅲ 도메인 (10Fn3), 테나신 타입Ⅲ 도메인, 안키린 반복 모티프 도메인, 저밀도-지질 단백질-수용체-유도된 A-도메인(LDLR-A), 리포칼린(안티칼린), 쿠니츠 도메인, 단백질-A-유래 Z 도메인, 감마-B 결정-유래 도메인, 유비퀴틴-유래 도메인, Sac7d-유래 폴리펩티드(아피틴), Fyn-유래 SH2 도메인, 미니단백질, C-타입 렉틴-형 도메인 스캐폴드, 가공된 모방 항체, 및 결합 성능을 보유하는 상기 어느 하나의 유전조작 대응물. 본 발명의 세포-표적화 분자의 몇몇 다른 구체예에서는, 상기 결합 영역이 하기 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포외 표적 생체분자에 결합할 수 있다: CD20, CD22, CD40, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM(예: EGP-2, EGP-40), EphB2, 전립선 특이적 막 항원 (prostate-specific membrane antigen), 크립토(Cripto), 엔도글린, 섬유아세포 활성화 단백질, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/SLAMF7, CD33, CD52, CD133, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, 탄산탈수효소 IX, 엽산 구속 단백질, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2, 강글리오시드 Lewis-Y2, VEGFR, Alpha Vbeta3, Alpha5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, 테나신, CD64, 메소텔린, BRCA1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제, 인간 티로시나아제-관련 단백질 1(TYRP1), 티로시나아제-관련 단백질 2, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, 베타-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, 암태아성 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원, 인간 아스파르틸(아스파라진일) 베타-수산화효소, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제 관련 항원, HPV-E7, 엡스타인바 바이러스 항원, Bcr-Abl, 알파-태아단백질 항원, 17-A1, 방광 종양 항원, CD38, CD15, CD23, CD52, CD133, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, FceRIa, 갈렉틴-9, mrp-14, Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, FceRIa, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, 갈렉틴-3, CD11a-c, GITRL, MHC 클래스 II, CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c, 및 상기 전술한 것들의 면역원성 단편(immunogenic fragment). 특정 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자를 결합 영역의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합된 세포에 주사하면, 상기 세포-표적화 분자는 그 세포의 사멸을 야기할 수 있다. 다른 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 세포외 표적 생체분자의 존재 또는 레벨이 다른 두 개의 세포 집단에 투여하면, 상기 세포-표적화 분자는 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포유형에 대해 CD50에서 최소한 3배, 또는 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포유형에서 관측된 CD50보다 더 적게 세포 사멸을 유발할 수 있다. 특정의 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자를 개체가 상기 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합한 세포의 제1 집단, 및 상기 결합 영역의 어떤 세포의 표적 생체분자에도 물리적으로 결합되지 않은 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대하여 상기 세포의 제1 집단의 개체에 대한 상기 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 개체가 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자의 상당량에 물리적으로 결합한 세포의 제1 집단, 및 개체가 상기 결합 영역의 어떤 세포외 표적 생체분자의 상당량에 물리적으로 결합하지 않은 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대하여 상기 세포의 제1 집단의 개체에 대한 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 표적 생체분자 양성 세포의 제1 집단, 및 개체가 세포 표면에서 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 생체분자의 상당량을 발현하지 않는 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대한 상기 세포의 제1 집단의 개체의 상기 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자가 SEQ ID NO: 4-49의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자가 SEQ ID NO: 50-61의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 KDEL 군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 한 개체의 카르복시 말단 소포체 보유/회수 신호 모티프를 더 포함한다. 다른 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 카르복시-말단 소포체 보유/회수 신호 모티프를 포함한다: KDEL(SEQ ID NO: 62), HDEF(SEQ ID NO: 63), HDEL(SEQ ID NO: 64), RDEF(SEQ ID NO: 65), RDEL(SEQ ID NO: 66), WDEL(SEQ ID NO: 67), YDEL(SEQ ID NO: 68), HEEF(SEQ ID NO: 69), HEEL(SEQ ID NO: 70), KEEL(SEQ ID NO: 71), REEL(SEQ ID NO: 72), KAEL(SEQ ID NO: 73), KCEL(SEQ ID NO: 74), KFEL(SEQ ID NO: 75), KGEL(SEQ ID NO: 76), KHEL(SEQ ID NO: 77), KLEL(SEQ ID NO: 78), KNEL(SEQ ID NO: 79), KQEL(SEQ ID NO: 80), KREL(SEQ ID NO: 81), KSEL(SEQ ID NO: 82), KVEL(SEQ ID NO: 83), KWEL(SEQ ID NO: 84), KYEL(SEQ ID NO: 85), KEDL(SEQ ID NO: 86), KIEL(SEQ ID NO: 87), DKEL(SEQ ID NO: 88), FDEL(SEQ ID NO: 89), KDEF(SEQ ID NO: 90), KKEL(SEQ ID NO: 91), HADL(SEQ ID NO: 92), HAEL(SEQ ID NO: 93), HIEL(SEQ ID NO: 94), HNEL(SEQ ID NO: 95), HTEL(SEQ ID NO: 96), KTEL(SEQ ID NO: 97), HVEL(SEQ ID NO: 98), NDEL(SEQ ID NO: 99), QDEL(SEQ ID NO: 100), REDL(SEQ ID NO: 101), RNEL(SEQ ID NO: 102), RTDL(SEQ ID NO: 103), RTEL(SEQ ID NO: 104), SDEL(SEQ ID NO: 105), TDEL(SEQ ID NO: 106), 및 SKEL(SEQ ID NO: 107). 본 발명의 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 효소 활성을 감소하거나 경감시키지만 시토졸에 대한 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 최소한 일부의 준세포 경로화를 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 준세포 경로화 레벨 이하로 감소시키지 않는 시가 독소군의 개체의 자연적으로 발생하는 A 서브유닛에 대한 돌연변이를 포함한다.
[29] 특정 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자는 1) 카르복시 말단을 갖는 시가 독소 A1 단편, 및 A1 단편 영역의 상기 카르복시 말단에서 야생형 시가 독소 A 서브유닛에 대한 최소의 퓨린-절단 모티프 내에 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 및 2) 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있고 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 연결된 결합영역을 포함한다. 본 발명의 이들 세포-표적화 분자들의 구체예에서는, 최소의 퓨린-절단 모티프 내의 돌연변이가 R/Y-x-x-R 퓨린 절단 모티프 내에서 최소한 하나의 아미노산 잔기의 아미노산 제거, 삽입 및/또는 치환이다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정 구체예에서, 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 이황화 결합이 아닌 최소한 하나의 공유 결합에 의해 결합 영역에 연결된다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정의 구체예에서, 결합 영역은 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 직접 또는 간접적으로 융합된다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정의 구체예에서는, 결합 영역이 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 융합되어 단일의 연속적인 폴리펩티드를 형성한다. 어떤 구체예에서는, 결합영역이 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버 커버한다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 단일 도메인 항체(sdAb)단편, 나노바디, 낙타과로부터 유도된 중쇄 항체 도메인(VHH단편), 연골 어류로부터 유도된 중쇄 항체 도메인, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), VNAR 단편, 단쇄 가변성 단편(scFv), 항체 가변성 단편(Fv), 상보 결정 영역3(상보성 결정 영역(CDR)3)단편, 제약된 FR3-상보성 결정 영역(CDR)3-FR4 폴리펩티드, Fd 단편, 항원-결합 단편(Fab), 피브로넥틴-유래 10th 피브로넥틴 타입 Ⅲ 도메인(10Fn3), 테나신 타입Ⅲ 도메인, 안키린 반복 모티프 도메인, 저밀도-지질 단백질-수용체-유도된 A-도메인(LDLR-A), 리포칼린(안티칼린), 쿠니츠 도메인, 단백질-A-유래 Z 도메인, 감마-B 결정-유래 도메인, 유비퀴틴-유래 도메인, Sac7d-유래 폴리펩티드(아피틴), Fyn-유래 SH2 도메인, 미니단백질, C-타입 렉틴-형 도메인 스캐폴드, 조작된 모방 항체, 및 결합 성능을 보유하는 상기 어느 하나의 유전조작 대응물. 본 발명의 세포-표적화 분자의 몇몇 다른 구체예에서는, 상기 결합 영역이 하기 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포외 표적 생체분자에 결합할 수 있다: CD20, CD22, CD40, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM(예: EGP-2, EGP-40), EphB2, 전립선 특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen), 크립토(Cripto), 엔도글린, 섬유아세포 활성화 단백질, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/SLAMF7, CD33, CD52, CD133, EpCAM, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, 탄산탈수효소 IX, 엽산 구속 단백질, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2, 강글리오시드 Lewis-Y2, VEGFR, Alpha Vbeta3, Alpha5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, 테나신, CD64, 메소텔린, BRCA1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제, 인간 티로시나아제-관련 단백질 1(TYRP1), 티로시나아제-관련 단백질 2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, 베타-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, 암태아성 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원, 인간 아스파르틸(아스파라진일) 베타-수산화효소, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제 관련 항원, HPV-E7, 엡스타인바 바이러스 항원, Bcr-Abl, 알파-태아단백질 항원, 17-A1, 방광 종양 항원, CD38, CD15, CD23, CD52, CD133, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, FceRIa, 갈렉틴-9, mrp-14, Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, FceRIa, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, 갈렉틴-3, CD11a-c, GITRL, MHC 클래스 II, CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c, 및 상기 전술한 것들의 면역원성 단편(immunogenic fragment). 특정 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자를 결합 영역의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합된 세포에 주사하면, 상기 세포-표적화 분자는 그 세포의 사멸을 야기할 수 있다. 다른 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 세포외 표적 생체분자의 존재 또는 레벨이 다른 두 개의 세포 집단에 투여하면, 상기 세포-표적화 분자는 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포유형에 대한 CD50은 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포유형에 대해 관측된 CD50보다 최소한 3배 더 적은 CD50으로 세포 사멸을 유발할 수 있다. 특정의 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자를 개체가 상기 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합한 세포의 제1 집단, 및 상기 결합 영역의 어떤 세포의 표적 생체분자에도 물리적으로 결합되지 않은 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대하여 상기 세포의 제1 집단의 개체에 대한 상기 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 개체가 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자의 상당량에 물리적으로 결합한 세포의 제1 집단, 및 개체가 상기 결합 영역의 어떤 세포외 표적 생체분자의 상당량에 물리적으로 결합하지 않은 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대하여 상기 세포의 제1 집단의 개체에 대한 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 표적 생체분자 양성 세포의 제1 집단, 및 개체가 세포 표면에서 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 생체분자의 상당량을 발현하지 않는 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대한 상기 세포의 제1 집단의 개체의 상기 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자가 SEQ ID NO: 4-36의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자가 SEQ ID NO: 50-61의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 KDEL 군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 한 개체의 카르복시 말단 소포체 보유/회수 신호 모티프를 더 포함한다. 다른 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 카르복시-말단 소포체 보유/회수 신호 모티프를 포함한다: KDEL(SEQ ID NO: 62), HDEF(SEQ ID NO: 63), HDEL(SEQ ID NO: 64), RDEF(SEQ ID NO: 65), RDEL(SEQ ID NO: 66), WDEL(SEQ ID NO: 67), YDEL(SEQ ID NO: 68), HEEF(SEQ ID NO: 69), HEEL(SEQ ID NO: 70), KEEL(SEQ ID NO: 71), REEL(SEQ ID NO: 72), KAEL(SEQ ID NO: 73), KCEL(SEQ ID NO: 74), KFEL(SEQ ID NO: 75), KGEL(SEQ ID NO: 76), KHEL(SEQ ID NO: 77), KLEL(SEQ ID NO: 78), KNEL(SEQ ID NO: 79), KQEL(SEQ ID NO: 80), KREL(SEQ ID NO: 81), KSEL(SEQ ID NO: 82), KVEL(SEQ ID NO: 83), KWEL(SEQ ID NO: 84), KYEL(SEQ ID NO: 85), KEDL(SEQ ID NO: 86), KIEL(SEQ ID NO: 87), DKEL(SEQ ID NO: 88), FDEL(SEQ ID NO: 89), KDEF(SEQ ID NO: 90), KKEL(SEQ ID NO: 91), HADL(SEQ ID NO: 92), HAEL(SEQ ID NO: 93), HIEL(SEQ ID NO: 94), HNEL(SEQ ID NO: 95), HTEL(SEQ ID NO: 96), KTEL(SEQ ID NO: 97), HVEL(SEQ ID NO: 98), NDEL(SEQ ID NO: 99), QDEL(SEQ ID NO: 100), REDL(SEQ ID NO: 101), RNEL(SEQ ID NO: 102), RTDL(SEQ ID NO: 103), RTEL(SEQ ID NO: 104), SDEL(SEQ ID NO: 105), TDEL(SEQ ID NO: 106), 및 SKEL(SEQ ID NO: 107). 본 발명의 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 효소 활성을 감소하거나 경감시키지만 시토졸에 대한 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 최소한 일부의 준세포 경로화를 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 준세포 경로화 레벨 이하로 감소시키지 않는 시가 독소군의 개체의 자연적으로 발생하는 A 서브유닛에 대한 돌연변이를 포함한다.
[30] 특정의 구체예에서, 본 발명의 세포독성 분자는 1) 카르복시 말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 영역, 및 2) 상기 A1 단편 영역의 카르복시 말단에 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하고, 이 경우 상기 세포독성 분자는, 제1 세포-표적화 분자의 한 성분이 최소한 하나의 세포 외 표적 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는 결합영역과 상기 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합된 분자 모이어티를 포함할 때, 야생형 시가 독소 A1 폴리펩티드로 이루어지는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 제외한 세포-표적화 분자로 이루어지는 제2 세포-표적화 분자의 세포독성과 동등한 세포독성을 나타낼 수 있다. 이는 제2 세포-표적화 분자가 동일한 기가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 대신에 본 발명의 제1 세포-표적화 분자와 동일한 결합 영역과 동일한 분자 모이어티를 포함하는 것을 의미하고, 상기 제2 세포-표적화 분자는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 카르복시 말단과 야생형 퓨린-절단 사이트를 갖는 시가 독소 A1 단편 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-251, 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-250)을 함유하는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하고, 이 경우 분자 모이어티는 제1 세포-표적화 분자내에서 동일한 결합을 갖는 야생형 시가 독소 A1 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합한다. 다른 구체예에서는, 분자 모이어티가 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 직접 또는 간접으로 융합된 최소한 하나의 아미노산 잔기를 포함한다. 어떤 구체예에서는, 분자 모이어티가 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다. 어떤 구체예에서는, 분자 모이어티가 자연적으로 발생하는 시가 독소의 시가 독소 A2 단편으로부터 유도된 펩티드 및/또는 폴리펩티드로 이루어진다. 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 이황화결합이 아닌 최소한 하나의 공유결합에 의해 분자 모이어티에 연결된다. 어떤 다른 구체예에서는, 분자 모이어티가 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 융합된 폴리펩티드를 함유하여 단일의 연속적인 폴리펩티드를 형성한다. 본 발명의 세포독성 분자의 다른 구체예에서는, 붕괴된 퓨린-절단 모티프가 야생형 시가 독소 A 서브유닛에 대한 최소한 하나의 돌연변이를 함유하고, 상기 돌연변이는 1) 시가-유사 독소 1(SEQ ID NO: 1) 또는 시가 독소(SEQ ID NO: 2)의 A 서브유닛의 248-251, 또는 2) 시가 독소 2(SEQ ID NO: 3)의 A 서브유닛의 247-250에 본래 위치한 영역 내에서 최소한 하나의 아미노산 잔기를 변경시킨다. 본 발명의 세포독성 분자의 다른 구체예에서, 상기돌연변이는 비양전하 아미노산 잔기를 갖는 아르기닌 잔기의 아미노산 잔기 치환체이다. 본 발명의 세포독성 분자의 다른 구체예에서, 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4-49의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 본 발명의 세포독성 분자의 다른 구체예에서, 제1 세포-표적화 분자는 제2 세포-표적화 분자와 비교하여 향상된 체내 내성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 세포독성 분자의 다른 구체예에서, 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 효소활성을 감소하거나 경감시키지만 시토졸에 대한 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 최소한 일부의 준세포 경로화를 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 준세포 경로화 레벨 이하로 감소시키지 않는 시가 독소군의 개체의 자연적으로 발생하는 A 서브유닛에 대한 돌연변이를 포함한다.
[31] 본 발명의 세포독성 분자의 특정 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 R248H 및 R251H를 더 포함하는 SEQ ID NO:2에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 다른 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 R248H 및 R251H를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 R248G 및 R251G를 더 포함하는 SEQ ID NO:1에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 특정 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 R248G 및 R251G를 포함하지 않는다. 시가 독소 분자의 다른 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 A246G, S247A, A253G 및 S254A의 모두를 더 포함하는 SEQ ID NO:1에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 A246G, S247A, A253G, 및 S254A의 모두를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 A246G, S247A, R248G, R251G, A253G, 및 S254A의 모두를 더 포함하는 SEQ ID NO:1에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 A246G, S247A, R248G, R251G, A253G 및 S254A의 모두를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 247-252에서 본래 위치하는 영역의 제거를 더 포함하는 SEQ ID NO:2에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 삭제 245-247 및 253-255 모두를 더 포함하는 SEQ ID NO:2에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 삭제 245-247 및 253-255 모두를 포함하지 않는다.
[32] 특정의 구체예에서는, 본원발명의 세포독성 세포-표적화 분자가 1) 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역, 2) 카르복시 말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 영역, 및 상기 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 및 3) 상기 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합된 분자 모이어티를 포함하고, 여기서 상기 세포독성 세포-표적화 분자는 야생형 시가 독소 A1 폴리펩티드로 이루어지는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 제외하고 세포-표적화 분자로 이루어지는 제2 세포-표적화 분자의 세포독성과 동등한 세포독성을 나타낼 수 있다. 이는 제2 세포-표적화 분자가 동일한 기가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 대신에 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자와 동일한 결합 영역과 동일한 분자 모이어티를 포함하는 것을 의미하고, 상기 제2 세포-표적화 분자는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 카르복시 말단과 야생형 퓨린-절단 사이트를 갖는 시가 독소 A1 단편 영역을 함유하는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하고, 이 경우 분자 모이어티는 제1 세포-표적화 분자내에서 동일한 결합을 갖는 야생형 시가 독소 A1 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 분자 모이어티가 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 결합 영역이 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다. 세포독성 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 분자 모이어티가 결합 영역을 포함한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 분자 모이어티가 자연적으로 발생하는 시가 독소의 시가 독소 A2 단편으로부터 유도된 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 결합 영역이 면역글로불린-유형 결합 영역을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 단일 도메인 항체(sdAb)단편, 나노바디, 낙타과로부터 유도된 중쇄 항체 도메인(VHH단편), 연골 어류로부터 유도된 중쇄 항체 도메인, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), VNAR 단편, 단쇄 가변성 단편(scFv), 항체 가변성 단편(Fv), 상보 결정 영역3(CDR3) 단편, 제약된 FR3-상보성 결정 영역(CDR)3-FR4 폴리펩티드, Fd 단편, 항원-결합 단편(Fab), 피브로넥틴-유래 10th 피브로넥틴 타입 Ⅲ 도메인(10Fn3), 테나신 타입Ⅲ 도메인, 안키린 반복 모티프 도메인, 저밀도-지질 단백질-수용체-유도된 A-도메인(LDLR-A), 리포칼린(안티칼린), 쿠니츠 도메인, 단백질-A-유래 Z 도메인, 감마-B 결정-유래 도메인, 유비퀴틴-유래 도메인, Sac7d-유래 폴리펩티드(아피틴), Fyn-유래 SH2 도메인, 미니단백질, C-타입 렉틴-형 도메인 스캐폴드, 가공된 모방 항체, 및 결합 성능을 보유하는 상기 어느 하나의 유전조작 대응물. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정 구체예에서, 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 이황화 결합이 아닌 최소한 하나의 공유 결합에 의해 결합 영역에 연결된다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정의 구체예에서, 결합 영역은 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 직접 또는 간접적으로 융합된다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정의 구체예에서는, 결합 영역이 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 융합되어 단일의 연속적인 폴리펩티드를 형성한다. 다른 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 세포외 표적 생체분자의 존재 또는 레벨이 다른 두 개의 세포 집단에 투여하면, 상기 세포-표적화 분자는 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포유형에 대한 CD50은 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포유형에 대해 관측된 CD50보다 최소한 3배 더 적은 CD50으로 세포 사멸을 유발할 수 있다. 특정의 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자를 개체가 상기 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합한 세포의 제1 집단, 및 상기 결합 영역의 어떤 세포의 표적 생체분자에도 물리적으로 결합되지 않은 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대하여 상기 세포의 제1 집단의 개체에 대한 상기 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 개체가 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자의 상당량에 물리적으로 결합한 세포의 제1 집단, 및 개체가 상기 결합 영역의 어떤 세포외 표적 생체분자의 상당량에 물리적으로 결합하지 않은 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대하여 상기 세포의 제1 집단의 개체에 대한 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 표적 생체분자 양성 세포의 제1 집단, 및 개체가 세포 표면에서 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 생체분자의 상당량을 발현하지 않는 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대한 상기 세포의 제1 집단의 개체의 상기 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 몇몇 다른 구체예에서는, 상기 결합 영역이 하기 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포외 표적 생체분자에 결합할 수 있다: CD20, CD22, CD40, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM(예: EGP-2, EGP-40), EphB2, 전립선 특이적 막 항원 (prostate-specific membrane antigen), 크립토(Cripto), 엔도글린, 섬유아세포 활성화 단백질, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/SLAMF7, CD33, CD52, CD133, EpCAM, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, 탄산탈수효소 IX, 엽산 구속 단백질, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2, 강글리오시드 Lewis-Y2, VEGFR, Alpha Vbeta3, Alpha5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, 테나신, CD64, 메소텔린, BRCA1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제, 인간 티로시나아제-관련 단백질 1(TYRP1), 티로시나아제-관련 단백질 2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, 베타-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, 암태아성 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원, 인간 아스파르틸(아스파라진일) 베타-수산화효소, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제 관련 항원, HPV-E7, 엡스타인바 바이러스 항원, Bcr-Abl, 알파-태아단백질 항원, 17-A1, 방광 종양 항원, CD38, CD15, CD23, CD52, CD133, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, FceRIa, 갈렉틴-9, mrp-14, Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, CD193, TLR4, FceRIa, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, 갈렉틴-3, CD11a-c, GITRL, MHC 클래스 II, CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c, 및 상기 전술한 것들의 면역원성 단편(immunogenic fragment). 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자가 SEQ ID NO: 4-49의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자가 SEQ ID NO: 50-61의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 KDEL 군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 한 개체의 카르복시 말단 소포체 보유/회수 신호 모티프를 더 포함한다. 다른 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 카르복시-말단 소포체 보유/회수 신호 모티프를 포함한다: KDEL(SEQ ID NO: 62), HDEF(SEQ ID NO: 63), HDEL(SEQ ID NO: 64), RDEF(SEQ ID NO: 65), RDEL(SEQ ID NO: 66), WDEL(SEQ ID NO: 67), YDEL(SEQ ID NO: 68), HEEF(SEQ ID NO: 69), HEEL(SEQ ID NO: 70), KEEL(SEQ ID NO: 71), REEL(SEQ ID NO: 72), KAEL(SEQ ID NO: 73), KCEL(SEQ ID NO: 74), KFEL(SEQ ID NO: 75), KGEL(SEQ ID NO: 76), KHEL(SEQ ID NO: 77), KLEL(SEQ ID NO: 78), KNEL(SEQ ID NO: 79), KQEL(SEQ ID NO: 80), KREL(SEQ ID NO: 81), KSEL(SEQ ID NO: 82), KVEL(SEQ ID NO: 83), KWEL(SEQ ID NO: 84), KYEL(SEQ ID NO: 85), KEDL(SEQ ID NO: 86), KIEL(SEQ ID NO: 87), DKEL(SEQ ID NO: 88), FDEL(SEQ ID NO: 89), KDEF(SEQ ID NO: 90), KKEL(SEQ ID NO: 91), HADL(SEQ ID NO: 92), HAEL(SEQ ID NO: 93), HIEL(SEQ ID NO: 94), HNEL(SEQ ID NO: 95), HTEL(SEQ ID NO: 96), KTEL(SEQ ID NO: 97), HVEL(SEQ ID NO: 98), NDEL(SEQ ID NO: 99), QDEL(SEQ ID NO: 100), REDL(SEQ ID NO: 101), RNEL(SEQ ID NO: 102), RTDL(SEQ ID NO: 103), RTEL(SEQ ID NO: 104), SDEL(SEQ ID NO: 105), TDEL(SEQ ID NO: 106), 및 SKEL(SEQ ID NO: 107). 본 발명의 세포독성 분자의 다른 구체예에서, 제1 세포-표적화 분자는 제2 세포-표적화 분자와 비교하여 향상된 체내 내성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 세포독성 분자의 다른 구체예에서, 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 효소활성을 감소하거나 경감시키지만 시토졸에 대한 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 최소한 일부의 준세포 경로화를 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 준세포 경로화 레벨 이하로 감소시키지 않는 시가 독소군의 개체의 자연적으로 발생하는 A 서브유닛에 대한 돌연변이를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자는 면역 세포 표면 수용체의 단편을 함유하는 카르복시-말단 결합 영역을 포함하지 않는다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서, 상기 결합 영역은 인체 면역세포 표면 공수용체(co-receptor)의 단편을 포함하지 않는다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서, 상기 결합 영역은 타입-I 막전위(transmembrane) 당 단백질인 인체 CD4의 단편을 포함하지 않는다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자는 아미노산 잔기 19-183에 상응하다 인체 CD4의 단편을 함유하는 카르복시 말단 결합 영역에 융합된 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-247, SEQ ID NO:2의 45-247, 및/또는 SEQ ID NO:2의 75-247을 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
[33] 특정의 구체예에서는, 본원발명의 세포독성 세포-표적화 분자가 1) 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역, 2) 카르복시 말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 영역, 및 상기 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 및 3) 상기 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합된 분자 모이어티를 포함하고, 여기서 상기 세포독성 세포-표적화 분자는 야생형 시가 독소 A1 폴리펩티드로 이루어지는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 제외하고 세포-표적화 분자로 이루어지는 제2 세포-표적화 분자의 체내 내성에 비하여 향상된 체내 내성을 나타낼 수 있다. 이는 제2 세포-표적화 분자가 동일한 기가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 대신에 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자와 동일한 결합 영역과 동일한 분자 모이어티를 포함하는 것을 의미하고, 상기 제2 세포-표적화 분자는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 카르복시 말단과 야생형 퓨린-절단 사이트를 갖는 시가 독소 A1 단편 영역을 함유하는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하고, 이 경우 분자 모이어티는 제1 세포-표적화 분자 내에서 동일한 결합을 갖는 야생형 시가 독소 A1 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 분자 모이어티가 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 결합 영역이 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다. 세포독성 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 분자 모이어티가 결합 영역을 포함한다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정 구체예에서, 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 이황화 결합이 아닌 최소한 하나의 공유 결합에 의해 결합 영역에 연결된다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정의 구체예에서, 결합 영역은 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 직접 또는 간접적으로 융합된다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 특정의 구체예에서는, 결합 영역이 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 융합되어 단일의 연속적인 폴리펩티드를 형성한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 분자 모이어티가 자연적으로 발생하는 시가 독소의 시가 독소 A2 단편으로부터 유도된 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 세포외 표적 생체분자의 존재 또는 레벨이 다른 두 개의 세포 집단에 투여하면, 상기 세포-표적화 분자는 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포유형에 대한 CD50은 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포유형에 대해 관측된 CD50보다 최소한 3배 더 적은 CD50으로 세포 사멸을 유발할 수 있다. 특정의 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자를 개체가 상기 세포-표적화 분자 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합한 세포의 제1 집단, 및 상기 결합 영역의 어떤 세포의 표적 생체분자에도 물리적으로 결합되지 않은 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대하여 상기 세포의 제1 집단의 개체에 대한 상기 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 개체가 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자의 상당량에 물리적으로 결합한 세포의 제1 집단, 및 개체가 상기 결합 영역의 어떤 세포외 표적 생체분자의 상당량에 물리적으로 결합하지 않은 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대하여 상기 세포의 제1 집단의 개체에 대한 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 표적 생체분자 양성 세포의 제1 집단, 및 개체가 세포 표면에서 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 생체분자의 상당량을 발현하지 않는 세포의 제2 집단에 투여하면, 상기 세포의 제2 집단의 개체에 대한 상기 세포의 제1 집단의 개체의 상기 세포-표적화 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 결합 영역이 면역글로불린-유형 결합 영역을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 단일 도메인 항체(sdAb)단편, 나노바디, 낙타과로부터 유도된 중쇄 항체 도메인(VHH단편), 연골 어류로부터 유도된 중쇄 항체 도메인, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), VNAR 단편, 단쇄 가변성 단편(scFv), 항체 가변성 단편(Fv), 상보 결정 영역3(CDR)3 단편, 제약된 FR3-상보성 결정 영역(CDR)3-FR4 폴리펩티드, Fd 단편, 항원-결합 단편(Fab), 피브로넥틴-유래 10th 피브로넥틴 타입 Ⅲ 도메인 (10Fn3), 테나신 타입Ⅲ 도메인, 안키린 반복 모티프 도메인, 저밀도-지질 단백질-수용체-유래 A-도메인(LDLR-A), 리포칼린(안티칼린), 쿠니츠 도메인, 단백질-A-유래 Z 도메인, 감마-B 결정-유래 도메인, 유비퀴틴-유래 도메인, Sac7d-유래 폴리펩티드(아피틴), Fyn-유래 SH2 도메인, 미니단백질, C-타입 렉틴-형 도메인 스캐폴드, 가공된 모방 항체, 및 결합 성능을 보유하는 상기 어느 하나의 유전조작 대응물. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자가 SEQ ID NO: 4-49의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 어떤 다른 구체예에서는, 분자 모이어티가 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 직접 또는 간접으로 융합된 최소한 하나의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 세포-표적화 분자가 SEQ ID NO: 50-61의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 KDEL 군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 한 개체의 카르복시 말단 소포체 보유/회수 신호 모티프를 더 포함한다. 다른 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 카르복시-말단 소포체 보유/회수 신호 모티프를 포함한다: KDEL(SEQ ID NO: 62), HDEF(SEQ ID NO: 63), HDEL(SEQ ID NO: 64), RDEF(SEQ ID NO: 65), RDEL(SEQ ID NO: 66), WDEL(SEQ ID NO: 67), YDEL(SEQ ID NO: 68), HEEF(SEQ ID NO: 69), HEEL(SEQ ID NO: 70), KEEL(SEQ ID NO: 71), REEL(SEQ ID NO: 72), KAEL(SEQ ID NO: 73), KCEL(SEQ ID NO: 74), KFEL(SEQ ID NO: 75), KGEL(SEQ ID NO: 76), KHEL(SEQ ID NO: 77), KLEL(SEQ ID NO: 78), KNEL(SEQ ID NO: 79), KQEL(SEQ ID NO: 80), KREL(SEQ ID NO: 81), KSEL(SEQ ID NO: 82), KVEL(SEQ ID NO: 83), KWEL(SEQ ID NO: 84), KYEL(SEQ ID NO: 85), KEDL(SEQ ID NO: 86), KIEL(SEQ ID NO: 87), DKEL(SEQ ID NO: 88), FDEL(SEQ ID NO: 89), KDEF(SEQ ID NO: 90), KKEL(SEQ ID NO: 91), HADL(SEQ ID NO: 92), HAEL(SEQ ID NO: 93), HIEL(SEQ ID NO: 94), HNEL(SEQ ID NO: 95), HTEL(SEQ ID NO: 96), KTEL(SEQ ID NO: 97), HVEL(SEQ ID NO: 98), NDEL(SEQ ID NO: 99), QDEL(SEQ ID NO: 100), REDL(SEQ ID NO: 101), RNEL(SEQ ID NO: 102), RTDL(SEQ ID NO: 103), RTEL(SEQ ID NO: 104), SDEL(SEQ ID NO: 105), TDEL(SEQ ID NO: 106), 및 SKEL(SEQ ID NO: 107). 본 발명의 세포-표적화 분자의 다른 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 효소 활성을 감소하거나 경감시키지만 시토졸에 대한 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 최소한 일부의 준세포 경로화를 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 준세포 경로화 레벨 이하로 감소시키지 않는 시가 독소군의 개체의 자연적으로 발생하는 A 서브유닛에 대한 돌연변이를 포함한다.
[34] 어떤 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자는, 세포독성 또는 세포비독성을 불문하고, 자연적으로 발생하는 시가 독소 B 서브유닛을 포함하지 않는다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자는 천연의 시가 독소 B 서브유닛의 기능성 결합 도메인으로 필수적으로 구성되거나 이를 포함하는 어떤 폴리펩티도도 포함하지 않는다. 오히려, 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서, 시가 독소 A 서브유닛 유도 영역들은 세포 표적을 유발하기 위하여 이형(heterologous) 결합 영역들과 기능적으로 결합한다.
[35] 어떤 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자는, 세포독성 또는 세포무독성을 불문하고, 시가 독소군의 개체의 어떤 시가 독소 A2 단편 또는 그 기능성 단편을 포함하지 않는다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 세포-표적화 분자는 붕괴된 퓨린-절단 모티프의 카르복시-말단에서 천연의 야생형 시가 독소 A2 단편으로부터의 어떤 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
[36] 어떤 구체예에서, 본 발명의 세포독성 분자는 시가 독소군의 개체의 어떤 시가 독소 A2 단편 또는 그 기능성 단편을 포함하지 않는다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 세포독성 분자는 붕괴된 퓨린-절단 모티프의 카르복시-말단에서 천연의 야생형 시가 독소 A2 단편으로부터의 어떤 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
[37] 본 발명의 세포독성 분자의 특정 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 R248H 및 R251H를 더 포함하는 SEQ ID NO:2에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 다른 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 R248H 및 R251H를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 R248G 및 R251G를 더 포함하는 SEQ ID NO:1에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 특정 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 R248G 및 R251G를 포함하지 않는다. 시가 독소 분자의 다른 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 A246G, S247A, A253G 및 S254A의 모두를 더 포함하는 SEQ ID NO:1에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 A246G, S247A, A253G, 및 S254A의 모두를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 A246G, S247A, R248G, R251G, A253G, 및 S254A의 모두를 더 포함하는 SEQ ID NO:1에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 아미노산 잔기 치환체인 A246G, S247A, R248G, R251G, A253G 및 S254A의 모두를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 247-252에서 본래 위치하는 영역의 제거를 더 포함하는 SEQ ID NO:2에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 삭제 245-247 및 253-255 모두를 더 포함하는 SEQ ID NO:2에 나타난 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 세포독성 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 삭제 245-247 및 253-255 모두를 포함하지 않는다.
[38] 본 발명은 또한 본 발명의 분자 및 최소한 하나의 약학적으로 수용가능한 첨가물 또는 매트릭스를 포함하는 약학적 조성물; 및 상기 약학적 조성물을 제조하는데 사용되는 또는 하기 설명하는 본 발명의 방법에 사용되는 상기 분자 또는 상기 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 본 발명의 어떤 세포독성 분자 및 최소한 하나의 약학적으로 수용가능한 첨가물 또는 매트릭스를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
[39] 본 발명의 분자 외에, 상기의 어느 것을 인코딩(encoding) 할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 또는 본 발명의 분자의 단백질을 함유하는 폴리펩티드는 본 발명의 영역이고, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 발현 벡터를 함유하는 숙주세포를 포함하는 발현 벡터도 또한 그러하다. 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포는 본 발명의 분자(예를 들어, 폴리펩티드 또는 단백질), 또는 폴리펩티드 성분 또는 그 단편을 재조합 발현에 의해 제조하는 방법에 사용될 수 있다.
[40] 본 발명은 또한 고체 기질 상에서 고정되는 본 발명의 어떤 물질 조성물도 모두 망라한다. 본 발명의 이러한 조성물들은 여기서 설명되는 분자 검사방법에 사용될 수 있다.
[41] 본 발명의 조성물 외에, 본 발명은 여러 가지 방법들도 제시하는데, 예를 들어, 본 발명의 조성물을 사용하는 방법 및/또는 본 발명의 조성물을 생성하는 방법들이 있다.
[42] 본 발명의 어떤 구체예에서는, 1) 카르복시 말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 영역 및 상기 A1 단편 영역의 카르복시 말단에 인접하여 퓨린-절단 사이트를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 및 2) 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단과 결합하고 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역을 함유하는 이형 분자 모이어티를 포함하는 분자의 체내 내성 및/또는 체내 안정도를 향상시키기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 퓨린-절단 사이트를 함유하는 퓨린-절단 모티프를 붕괴하는 단계로 이루어진다. 이 방법의 어떤 구체예에서, 상기 붕괴단계는 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단의 프로테아제-절단 민감도를 감소시키는 돌연변이, 절단(truncation), 및/또는 아미노산 기능성 그룹 변형을 생성하는 것을 포함한다. 이 방법의 어떤 구체예에서, 이형 분자 모이어티는 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다. 본 발명은 또한 A1단편 영역의 카르복시 말단에 인접한 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 부모 분자에 비하여 향상된 체내 내성을 나타낼 수 있는 상기 방법을 사용하여 생성된 분자를 망라한다.
[43] 본 발명의 어떤 구체예에서는, 1) 카르복시 말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 영역 및 상기 A1 단편 영역의 카르복시 말단에 인접하여 퓨린-절단 사이트를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 및 2) 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단과 결합하고 독성인 이형 분자 모이어티를 포함하는 분자의 체내 내성 및/또는 체내 안정도를 향상시키기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 퓨린-절단 사이트를 함유하는 퓨린-절단 모티프를 붕괴하는 단계로 이루어진다. 이 방법의 어떤 구체예에서, 상기 붕괴단계는 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단의 프로테아제-절단 민감도를 감소시키는 돌연변이, 절단(truncation), 및/또는 아미노산 기능성 그룹 변형을 생성하는 것을 포함한다. 이 방법의 어떤 구체예에서, 이형 분자 모이어티는 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다. 본 발명은 또한 A1단편 영역의 카르복시 말단에 인접한 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 부모 분자에 비하여 향상된 체내 내성을 나타낼 수 있는 상기 방법을 사용하여 생성된 분자를 망라한다.
[44] 본 발명의 어떤 구체예에서는, 세포를 본 발명의 상기 세포-표적화 분자 또는 본 발명의 상기 약학적 조성물의 어느 하나에 접촉하는 단계로 이루어지는 세포 사멸 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서는 상기 세포의 접촉단계가 체내에서 발생한다. 세포 사멸 방법의 다른 구체예에서는, 상기 방법은 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자의 발현 레벨 및/또는 세포외 존재에 있어서 다른 세포들의 혼합물을 접촉할 때 다른 세포들 및/또는 세포 유형들에 대해 우선적으로 세포들 및/또는 세포 유형들을 선별적으로 사멸시킬 수 있다.
[45] 본 발명은 또한 본 발명의 분자 또는 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계로 이루어지는 질병, 장애 및/또는 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 하기 군으로부터 선택된다: 암, 종양, 발육이상, 면역 장애 및 세균감염, 상기 방법의 어떤 구체에에서, 상기 치료되는 암은 하기 군으로부터 선택된다: 뼈암, 유방암, 중앙/말초 신경계 암, 위장암, 생식 세포암, 선암, 두경부암, 혈액암, 신장-요로암, 간암, 폐/흉막암, 전립선암, 육종, 피부암, 및 자궁암. 상기 방법의 어떤 구체예에서, 상기 치료되는 면역 장애는 하기 군으로부터 선택된다: 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 하시모토 갑상선염, 용혈요독증후군, HIV-관련 질병, 홍반 루푸스, 다발경화증, 결절다발동맥염, 다관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 궤양성대장염, 및 혈관염.
[46] 본 발명의 어떤 구체예에서는, 암, 면역 장애, 또는 세균 감염의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 분자(폴리펩티드 또는 단백질)를 함유하는 조성물, 본 발명의 분자를 함유하는 화합물, 또는 본 발명의 조성물(약학적 조성물)을 제공한다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 암, 종양, 면역 장애 또는 세균감염의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용되는 본 발명의 화합물(단백질) 또는 조성물의 용도를 제공한다.
[47] 본 발명의 분자들의 어떤 구체예들은 하나 이상의 부수적인 외인성 물질을 본 발명 분자의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합한 세포 속으로 전달하는데 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 세포(들)를 체내 또는 체외에서 본 발명의 분자, 약학적 조성물 및/또는 진단 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, 외인성 물질을 세포의 내부에 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 필요한 환자에서 외인성 물질을 세포의 내부에 전달하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본 발명의 분자를 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 그때 표적 세포는 본 발명의 분자의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합한다.
[48] 질병, 장애 및/또는 증상의 진단, 예측 및/또는 특성화를 위한 본 발명의 조성물(예를 들어, 세포-표적화 분자, 약학적 조성물, 또는 진단 조성물)의 용도는 본 발명의 영역이다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 암, 종양 또는 면역 장애의 예방 또는 치료에서 본 발명의 하나 이상의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)의 용도를 제공한다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 암, 종양 또는 면역 장애의 예방, 또는 치료용 의약의 제조에서 본 발명의 하나 이상의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)의 용도를 제공한다.
[49] 본 발명의 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자(예를 들어, 분자, 세포-표적화 분자, 폴리펩티드 또는 단백질), 및 세포유형, 조직, 기관, 질병, 장애, 증상, 및/또는 환자에 대한 유용한 진단 정보와 같은 정보 수집을 위한 검출 촉진제를 함유하는 진단 조성물을 제공한다.
[50] 본 발명의 어떤 구체예에서는, 세포를 본 발명의 분자 및/또는 진단 조성물에 접촉하고 상기 분자 및/또는 진단 조성물의 존재를 검출하는 단계로 이루어지는, 세포의 검출 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서는, 상기 세포 접촉 단계가 체외에서 발생한다. 어떤 구체예에서는, 상기 세포 접촉 단계가 체내에서 발생한다. 어떤 구체예에서는, 상기 세포 검출 단계가 체외에서 발생한다. 어떤 구체예에서는, 상기 세포 검출 단계가 체내에서 발생한다.
[51] 예를 들어, 본 발명의 진단 조성물은 검출 촉진제를 함유하는 본 발명의 분자를 포함하는 조성물을 포유류에 투여하고, 체내 또는 체외에서 본 발명의 분자의 존재를 검출함으로써 체내에서 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 수집된 정보는 본 발명 분자의 결합 영역의 세포외 표적에 물리적으로 결합한 세포의 존재에 관한 것이고, 질병, 장애 또는 증상의 진단, 예측, 특성화 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 화합물(예를 들어, 폴리펩티드 및 단백질), 조성물(예를 들어, 약학적 조성물) 및 방법들은 환자가 본 발명의 약학적 조성물에 반응하는 그룹에 속하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
[52] 본 발명의 어떤 구체예에서는, 본 발명의 조성물, 및 선택적으로 사용법, 부가적인 시약, 및/또는 약학적 전달 수단을 포함하는 키트도 제공한다.
[53] 본 발명의 상기 특징과 이점들은 하기 설명하는 내용, 첨부된 특허청구범위, 및 첨부된 도면을 참고로 더 잘 이해될 수 있을 것이다. 본 발명의 상기 요소들은, 어떤 상반되는 설명이 없다면, 본 발명의 다른 구체예를 실현하기 위하여 개별적으로 결합되거나 제외될 수도 있다.
[54] 도 1은 각각이 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드로 이루어지는, 본 발명의 특정의 대표적인 분자들의 일반적 배열을 도시한다. 본 발명의 특정의 대표적인 분자들은, 카르복시 말단에 인접하여 분자 모이어티에 결합한 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 포함한다. "N" 및 "C"는 분자의 폴리펩티드 성분인 아미노-말단 및 카르복시-말단을 각각 의미한다.
[55] 도 2는 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자(SLT-1A-FR::scFv-1)의 퓨린-절단 저항성을 도시하며, 상기 분자는 야생형 퓨린-절단 사이트를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 거의 동일한 세포독성 세포-표적화 분자에 비하여, 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 도 2는 정제된 재조합 인체 퓨린으로 처리되거나 또는 다양한 음성 제어 조건으로 처리된 단백질 시료의 전기영동 후에 쿠마시 착색된(Coomassie-stained) 폴리아크릴아미드 겔을 도시한다. 겔의 레인(lanes)은 숫자로 표시되고, 각 숫자에 대한 주석은 시료를 겔에 적재하기 전에 각각의 세포-표적화 분자 시료의 전처리 조건, 즉 섭씨 온도(℃), 전처리 시간(hrs), 시료 세포독성 단백질의 마이크로그램(μg)당 퓨린 활성 단위(u)양으로("u/μg 퓨린") 또는 "제로 u/μg 퓨린"인 경우에는 "no furin"으로 표시하여 부가된 퓨린의 표시를 나타낸다. "L"로 표시된 레인은 단백질 분자량 사다리의 이동 패턴을 도시하고, 각각의 사다리의 단백질 밴드의 개략적인 크기는 킬로달톤(kDa)으로 표시된다. 숫자로 표시된 주석은 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 각 레인의 각각의 세포-표적화 분자 시료에서 1) 야생형 퓨린-절단 사이트(WT) 또는 2) 붕괴된-절단 모티프(FR)로 존재하는지를 나타낸다. 처리된 시료는 30℃에서 25시간 동안 세포-표적화 분자의 마이크로그램당 0.5 퓨린 활성 단위(u/μg 퓨린)이었다. 도 2는 SLT-1A-FR::scFv-1 가 30℃에서 SLT-1A-FR::scFv-1의 미크로그램 당 0.5 퓨린 활성 단위에 저항성을 나타낸다.
[56] 도 3은 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자(SLT-1A-FR::scFv-2)의 다중 온도에서 퓨린 저항성을 도시하며, 상기 분자는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 도 3은 정제된 재조합 인체 퓨린으로 처리되거나 또는 처리되지 않은 단백질 시료의 전기영동 후에 쿠마시 착색된(Coomassie-stained) 폴리아크릴아미드 겔을 도시한다. 겔의 레인(lanes)은 숫자로 표시되고, 각 숫자에 대한 주석은 시료를 겔에 적재하기 전에 각각의 세포-표적화 분자 시료의 전처리 조건, 즉 섭씨 온도(℃), 전처리 시간(hrs), 시료 세포독성 단백질의 마이크로그램(μg)당 퓨린 활성 단위(u)양으로("u/μg 퓨린") 또는 "제로 u/μg 퓨린"인 경우에는 "no furin"으로 표시하여 부가된 퓨린의 표시를 나타낸다. "L"로 표시된 레인은 단백질 분자량 사다리의 이동 패턴을 도시하고, 각각의 사다리의 단백질 밴드의 개략적인 크기는 킬로달톤(kDa)으로 표시된다. 도 3은 SLT-1A-FR::scFv-2가 4 내지 37℃에서 SLT-1A-FR::scFv-2의 마이크로그램 당 0.5 퓨린 활성 단위에 저항성임을 나타낸다.
[57] 도 4는 대표적인 프로테아제-절단 저항성 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1이 야생형 퓨린-절단 사이트를 갖는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 거의 동일한 세포독성 세포-표적화 분자에 필적하는 세포-표적 세포독성을 나타내는 그래프이다. 표적 양성 세포의 퍼센트 생존능력이 세포에 투여된 세포-표적화 분자 농도의 로그값으로 도시되었다.
[58] 도 5는 대표적인 프로테아제-절단 저항성 세포독성 비-표적 분자 SLT-1A-FR::scFv-1이 야생형 퓨린-절단 사이트를 갖는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 거의 동일한 세포독성 세포-표적화 분자에 필적하는 세포-표적 세포독성을 나타내는 그래프이다. SLT-1A-FR::scFv-1은 또한 비표적 야생형 시가 독소 A 서브유닛 구조물에 필적하는 비-표적 세포독성을 나타낸다. 표적 음성 세포의 퍼센트 생존능력이 세포에 투여된 세포-표적화 분자 농도의 로그값으로 도시되었다.
[59] 도 6은 SLT-A1-WT::scFv-1과 비교하여 SLT-A1-FR::scFv-1을 반복 투여한 쥐의 개선된 생존을 도시한다. 도 6은 주사마다 프로테아제-절단 민감성 SLT-1A-WT::scFv-1 또는 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1의 신체 kg당 2.5 밀리그램을 투여한 3회 주사에 걸친 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 도표를 나타낸다. y축은 복용 그룹 내에서 쥐의 생존 퍼센트이고, x축은 날짜를 나타낸다. 쥐는 프로테아제-절단 민감성 SLT-1A-WT::scFv-1의 내성과 비교하여 프로테아제-절단 저항성 세포-독성 분자 SLT-1A-FR::scFv-1에 대해 우수한 내성을 나타낸다.
[60] 도 7은 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-2가 인체 암의 뮤린 이종이식 모델에서 표적 양성 인체 종양 세포의 체내 성장을 억제하는 것을 도시한다. 도 7은 인체 종양 세포에 의한 루시페라제 리포터(luciferase reporter)의 발현에 기초하여 시간경과에 따라 개개의 쥐마다 생체발광 분석한 종양 크기를 도시한다. 개개의 쥐는 그래프 상에 흑백 삼각형, 백색 원, 또는 흑색 사각형으로 각각 표시된다. Y축은 개개의 쥐의 전체 생체발광 신호로서, 초당 백만 양자 수로(photons/sec) 종양크기를 나타내고, X-축은 주사마다 신체 킬로그램 당 0 내지 2 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 주사한 주사량이다. 4개의 X축 주사량 그룹은 4그룹의 쥐에 해당한다. 실험은 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자의 주사량에 의해 나누어진 10마리 쥐의 4그룹을 포함한다. 그룹 1은 0 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 받은 쥐이고, 그룹 2는 신체 kg 당 0.05 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 받은 쥐이고, 그룹 3은 신체 kg 당 0.5 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 받은 쥐이고, 그룹 4는 신체 kg 당 2 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 받은 쥐이다. 이 실험은 최소한 4주간 실시되었다. 도 7은 대표적인 세포독성 프로테아제-절단 저항성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-2에 의해 나타난 인체 종양 세포 성장의 억제가 복용량과 시간에 의존한다는 것을 도시한다.
[55] 도 2는 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자(SLT-1A-FR::scFv-1)의 퓨린-절단 저항성을 도시하며, 상기 분자는 야생형 퓨린-절단 사이트를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 거의 동일한 세포독성 세포-표적화 분자에 비하여, 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 도 2는 정제된 재조합 인체 퓨린으로 처리되거나 또는 다양한 음성 제어 조건으로 처리된 단백질 시료의 전기영동 후에 쿠마시 착색된(Coomassie-stained) 폴리아크릴아미드 겔을 도시한다. 겔의 레인(lanes)은 숫자로 표시되고, 각 숫자에 대한 주석은 시료를 겔에 적재하기 전에 각각의 세포-표적화 분자 시료의 전처리 조건, 즉 섭씨 온도(℃), 전처리 시간(hrs), 시료 세포독성 단백질의 마이크로그램(μg)당 퓨린 활성 단위(u)양으로("u/μg 퓨린") 또는 "제로 u/μg 퓨린"인 경우에는 "no furin"으로 표시하여 부가된 퓨린의 표시를 나타낸다. "L"로 표시된 레인은 단백질 분자량 사다리의 이동 패턴을 도시하고, 각각의 사다리의 단백질 밴드의 개략적인 크기는 킬로달톤(kDa)으로 표시된다. 숫자로 표시된 주석은 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 각 레인의 각각의 세포-표적화 분자 시료에서 1) 야생형 퓨린-절단 사이트(WT) 또는 2) 붕괴된-절단 모티프(FR)로 존재하는지를 나타낸다. 처리된 시료는 30℃에서 25시간 동안 세포-표적화 분자의 마이크로그램당 0.5 퓨린 활성 단위(u/μg 퓨린)이었다. 도 2는 SLT-1A-FR::scFv-1 가 30℃에서 SLT-1A-FR::scFv-1의 미크로그램 당 0.5 퓨린 활성 단위에 저항성을 나타낸다.
[56] 도 3은 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자(SLT-1A-FR::scFv-2)의 다중 온도에서 퓨린 저항성을 도시하며, 상기 분자는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 도 3은 정제된 재조합 인체 퓨린으로 처리되거나 또는 처리되지 않은 단백질 시료의 전기영동 후에 쿠마시 착색된(Coomassie-stained) 폴리아크릴아미드 겔을 도시한다. 겔의 레인(lanes)은 숫자로 표시되고, 각 숫자에 대한 주석은 시료를 겔에 적재하기 전에 각각의 세포-표적화 분자 시료의 전처리 조건, 즉 섭씨 온도(℃), 전처리 시간(hrs), 시료 세포독성 단백질의 마이크로그램(μg)당 퓨린 활성 단위(u)양으로("u/μg 퓨린") 또는 "제로 u/μg 퓨린"인 경우에는 "no furin"으로 표시하여 부가된 퓨린의 표시를 나타낸다. "L"로 표시된 레인은 단백질 분자량 사다리의 이동 패턴을 도시하고, 각각의 사다리의 단백질 밴드의 개략적인 크기는 킬로달톤(kDa)으로 표시된다. 도 3은 SLT-1A-FR::scFv-2가 4 내지 37℃에서 SLT-1A-FR::scFv-2의 마이크로그램 당 0.5 퓨린 활성 단위에 저항성임을 나타낸다.
[57] 도 4는 대표적인 프로테아제-절단 저항성 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1이 야생형 퓨린-절단 사이트를 갖는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 거의 동일한 세포독성 세포-표적화 분자에 필적하는 세포-표적 세포독성을 나타내는 그래프이다. 표적 양성 세포의 퍼센트 생존능력이 세포에 투여된 세포-표적화 분자 농도의 로그값으로 도시되었다.
[58] 도 5는 대표적인 프로테아제-절단 저항성 세포독성 비-표적 분자 SLT-1A-FR::scFv-1이 야생형 퓨린-절단 사이트를 갖는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 거의 동일한 세포독성 세포-표적화 분자에 필적하는 세포-표적 세포독성을 나타내는 그래프이다. SLT-1A-FR::scFv-1은 또한 비표적 야생형 시가 독소 A 서브유닛 구조물에 필적하는 비-표적 세포독성을 나타낸다. 표적 음성 세포의 퍼센트 생존능력이 세포에 투여된 세포-표적화 분자 농도의 로그값으로 도시되었다.
[59] 도 6은 SLT-A1-WT::scFv-1과 비교하여 SLT-A1-FR::scFv-1을 반복 투여한 쥐의 개선된 생존을 도시한다. 도 6은 주사마다 프로테아제-절단 민감성 SLT-1A-WT::scFv-1 또는 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1의 신체 kg당 2.5 밀리그램을 투여한 3회 주사에 걸친 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 도표를 나타낸다. y축은 복용 그룹 내에서 쥐의 생존 퍼센트이고, x축은 날짜를 나타낸다. 쥐는 프로테아제-절단 민감성 SLT-1A-WT::scFv-1의 내성과 비교하여 프로테아제-절단 저항성 세포-독성 분자 SLT-1A-FR::scFv-1에 대해 우수한 내성을 나타낸다.
[60] 도 7은 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-2가 인체 암의 뮤린 이종이식 모델에서 표적 양성 인체 종양 세포의 체내 성장을 억제하는 것을 도시한다. 도 7은 인체 종양 세포에 의한 루시페라제 리포터(luciferase reporter)의 발현에 기초하여 시간경과에 따라 개개의 쥐마다 생체발광 분석한 종양 크기를 도시한다. 개개의 쥐는 그래프 상에 흑백 삼각형, 백색 원, 또는 흑색 사각형으로 각각 표시된다. Y축은 개개의 쥐의 전체 생체발광 신호로서, 초당 백만 양자 수로(photons/sec) 종양크기를 나타내고, X-축은 주사마다 신체 킬로그램 당 0 내지 2 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 주사한 주사량이다. 4개의 X축 주사량 그룹은 4그룹의 쥐에 해당한다. 실험은 대표적인 세포독성 세포-표적화 분자의 주사량에 의해 나누어진 10마리 쥐의 4그룹을 포함한다. 그룹 1은 0 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 받은 쥐이고, 그룹 2는 신체 kg 당 0.05 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 받은 쥐이고, 그룹 3은 신체 kg 당 0.5 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 받은 쥐이고, 그룹 4는 신체 kg 당 2 밀리그램의 SLT-1A-FR::scFv-2를 받은 쥐이다. 이 실험은 최소한 4주간 실시되었다. 도 7은 대표적인 세포독성 프로테아제-절단 저항성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-2에 의해 나타난 인체 종양 세포 성장의 억제가 복용량과 시간에 의존한다는 것을 도시한다.
[61] 본 발명은 예시적이고 제한하지 않는 구체예들 및 첨부된 도면들을 참고로 하기에 상세히 설명된다. 그러나, 본 발명은 다양한 다른 형태로 구체화될 수 있고, 따라서 하기 설명되는 구체예들은 제한적인 의미로 해석되어서는 안된다. 오히려, 본 구체예들은 본 발명의 개시를 완벽하게 하고 당업자에게 본 발명의 영역을 설명할 목적으로 제공된다.
[62] 본 발명을 보다 쉽게 이해하도록, 하기에 용어들을 정의하였다. 부수적인 정의도 본 명세서에 설명하였다.
[63] 명세서 및 특허청구범위에 사용된 관사(a, an, the)는 별도의 설명이 없는 한 일반 관사의 의미를 갖는다.
[64] 명세서 및 특허청구범위에 사용된 "및/또는(and/or)"은 A 및 B인 경우에, A 및 B 중에서 최소한 하나를 의미한다. 명세서 및 특허청구범위에 사용된 "및/또는"은 두 종 이상일 때 한 예로 A,B 및 C인 경우일 때, 이들 중 최소한 하나 또는 이들의 어떤 조합의 최소한 하나를 의미한다.
[65] 본 명세서에서, '포함' 또는 '함유' 또는 '이루어지는' 등의 (comprise, comprises, comprising) 의미는 열거된 요소를 포함하는 것으로 해석되지만, 열거되지 않은 다른 요소(들)를 배제하는 것이 아니다.
[66] 본 명세서에서, '포함하는(including)'은 '포함하지만 제한되지 않는(including but not limited to)'의 의미로 사용되며, 이 둘은 서로 호환적으로 사용될 수 있다.
[67] '아미노산 잔기(amino acid residue)' 또는 '아미노산(amino acid)'는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 속으로 결합된 아미노산을 포함한다. '폴리펩티드'는 아미노산 또는 아미노산 잔기의 폴리머를 포함한다. '폴리펩티드 서열'은 폴리펩티드를 물리적으로 구성하는 일련의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 의미한다. '단백질'은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 체인으로 이루어진 거대분자이다. '펩티드'는 15~20개보다 작은 아미노산 잔기로 이루어진 작은 폴리펩티드를 의미한다. '아미노산 서열'은 길이에 따라 펩티드 또는 폴리펩티드를 물리적으로 구성하는 일련의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 의미한다. 별도의 설명이 없는 한, 여기서 설명하는 폴리펩티드 및 펩티드 서열은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지의 순서를 표시하면서 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다.
[68] '아미노산', '아미노산 잔기', '아미노산 서열' 또는 '폴리펩티드 서열'은 자연적으로 발생하는 아미노산(L 및 D 입체이성질체를 포함)을 포함하고, 다른 제한이 없는 한, 셀레노시스테인, 피롤리신, N-포르밀메티오닌, 감마-카로복시 글루탐산염, 히드록시프롤린하이푸신, 피로글루탐산, 및 셀레노메티오닌과 같은 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방법으로 기능할 수 있는 공지의 천연 아미노산 유사체를 포함한다. 여기서 참조되는 아미노산 하기 표A와 같이 약자로 명칭된다:
[표 A]
아미노산 명명법
[69] 폴리펩티드와 관련하여 '보존성 치환(conservative substitution)'이란 전체 폴리펩티드의 기능과 구조를 실질적으로 변경하지 않는 폴리펩티드의 아미노산 성분 내의 변화를 의미한다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York (2nd ed., 1992)) 참조).
[70] 여기서 '발현(expressed, expressing, expresses)'의 의미는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 폴리펩티드 또는 단백질로 번역한 것이다. 발현된 폴리펩티드 또는 단백질은 세포외에 존재하고, 세포 표면 막의 성분이 될 수 있거나 또는 세포외 공간 속으로 고립될 수 있다.
[71] 여기서 설명된, 최소한 하나의 세포 표면에 세포외 표적 생체분자의 상당량을 발현하는 세포는 '표적 양성 세포(target positive cells)'또는 '표적+ 세포(target+ cells)'이고 특이 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합된다.
[72] 여기서 사용된 기호 "α"는 그 기호 다음의 생체분자에 결합할 수 있는 면역글로불린-유사 결합 영역의 약자이다. 기호 "α"는 그 기호 다음의 생체분자에 결합할 수 있는 능력에 기초한 면역글로불린-유사 결합 영역의 기능적 특성을 나타내기 위하여 사용된다.
[73] 본 발명의 목적상, 두 분자 성분에 대하여 '관련된(associated)' 또는 '관련(association)'의 의미는 단일의 분자를 형성하기 위하여 결합되거나, 부착되거나 연결되거나 하는 두 성분의 상태를 의미하며, 공유결합 및/또는 비공유결합을 포함한다.
[74] 본 발명의 목적상, '결합(linked)'의 의미는 단일 분자가 형성되도록 하나 이상의 원자 상호인력에 의해 결합된 둘 이상의 분자 성분을 의미하며, 이때 원자 상호인력은 최소한 하나의 공유결합을 포함한다.
[75] 본 발명의 목적상, '융합(fused)'의 의미는 펩티드 결합인 최소한 하나의 공유결합에 의해 결합된 둘 이상의 단백질 성분을 의미한다. 함께 융합된 두개의 단백질 성분의 비제한적 예로는 그 결과 분자가 단일의 연속적인 폴리펩티드가 되도록 펩티드 결합을 통하여 폴리펩티드에 융합된 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드가 있다.
[76] 기호 "::"는 하나의 연속적인 폴리펩티드를 형성하도록 함께 융합되기 전후의 폴리펩티드 영역을 의미한다.
[77] 본 발명의 목적상, "작동체(effector)"의 의미는 인자(들) 및/또는 알로스테리 효과(들)(allosteric effect(s))의 동원(recruitment)을 초래하는 세포독성, 생화학적 신호, 효소촉매분해, 준세포 경로화, 및/또는 분자간 결합과 같은 생화학적 활성을 제공하는 것을 의미한다.
[78] 본 발명의 목적상, '시가 독소 작동체 폴리펩티드', '시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드', '시가 독소 작동체 영역', 또는 '시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역'은 최소한 하나의 시가 독소 기능을 나타낼 수 있는 시가 독소 군의 개체의 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유도된 폴리펩티드를 의미한다. 시가 독소 기능은 예를 들어, 세포 돌입 증진, 지질막 변형, 클라트린-매개 엔도시토시스 자극, 자신의 준세포 경로화 유도, 자신의 후방수송 유도, 세포내 분해 회피, 리보소옴 촉매 비활성화, 세포독성 발효, 및 세포분열 발효를 포함한다.
[79] 본 발명의 목적상, '유래된(derived from)'의 의미는 폴리펩티드가 단백질 내에서 최초로 발견된 아미노산 서열을 포함하는 것인데, 여기서는 전체적인 기능과 구조가 실질적으로 보존되도록 최초의 서열로부터 부가, 삭제, 절단 또는 기타의 변경을 포함한다. 본 발명의 당업자는 한 유도된 폴리펩티드 영역이 폴리펩티드 서열 정렬 소프트웨어와 같은 공지 기술을 사용하여 그 부모 분자를 식별할 수 있을 것이다.
[80] 본 발명의 목적상, '시가 독소 A1 단편 영역'은 필수적으로 시가 독소 A1 단편으로 이루어지고 및/또는 시가독소의 시가 독소 A1 단편으로부터 유도된 폴리펩티드 영역을 의미한다.
[81] 본 발명의 목적상, '이형(heterologous)'은 시가 완전독소 외의 다른 성분을 의미하는데, 예를 들어, 이형 분자 모이어티 또는 폴리펩티드는 자연에 발생하는 박테리아 종에 의해 발현된 천연의 시가 독소의 자연에 발생하는 A 서브유닛의 일부로 발견되지 않거나 연결되지 않은 것이다.
[82] 본 발명의 목적상 그리고 본 발명의 한 분자의 성분들의 결합과 관련하여 '이황화결합(disulfide bond)'는 대칭 및 비대칭의 이황화 결합을 포함한다.
[83] 본 발명의 목적상, '시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단 영역'은 자연적으로 발생하는 시가 독소 A1 단편으로부터 유도된 폴리펩티드 영역을 의미하는데, 그 영역은 소수성 잔기(예를 들어, StxA-A1 및 SLT-1A1의 V236, 및 SLT-2A1의 V235)로 시작되어 소수성 잔기로 이어지며, 그 영역은 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드 사이에 보존된 퓨린-절단 사이트로 끝나고 천연의 시가 독소 A 서브유닛 내에서 A1 단편 및 A2 단편 사이의 교차점에서 끝난다. 본 발명의 목적상, 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단 영역은 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드의 카르복시 말단으로부터 유도된 펩티드 영역을 포함하며, 그 예로 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단을 포함하거나 이로써 이루어지는 펩티드 영역이 있다. 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단으로부터 유도된 펩티드 영역의 비제한적 예로는 Stx1A(SEQ ID NO:2) 또는 SLT-1A(SEQ ID NO:1) 내에서 위치 236에서 위치 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 또는 251까지; 및 SLT-2A(SEQ ID NO:3) 내에서 위치 235에서 위치 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 또는 250까지의 위치에서 자연적으로 위치하는 아미노산 잔기 서열을 포함한다.
[84] 본 발명의 목적상, '인접하는(proximal)'의 의미는 결합된 분자 모이어티에 대한 A1 단편 폴리펩티드의 카르복시 말단에 인접한 것으로, A1 단편 폴리펩티드 영역 내에서 최후 잔기를 정의하는 12개의 아미노산 잔기 또는 그 이하의 아미노산 잔기의 분자 거리를 의미한다.
[85] 본 발명의 목적상, "A1 단편-유도 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다"의 의미는 A1 단편-유도 영역의 카르복시 말단 내의 아미노산 잔기, 예를 들어 Stx1A(SEQ ID NO:2) 또는 SLT-1A(SEQ ID NO:1) 내의 위치 236 내지 251 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3) 내의 위치 235 내지 250의 어느 하나에 위치한 아미노산 잔기로부터 유도된 아미노산 잔기에 공유결합으로 연결된 4.5 kDa 이상의 분자 모이어티를 포함한다. 본 발명의 목적상, "A1 단편-유도 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다"의 의미는 A1 단편-유도 영역의 카르복시 말단 내에서 아미노산 잔기에 공유결합으로 연결된 4.5kDa 이상의 분자 모이어티를 포함하는데, 아미노산 잔기 카르복시 말단은 최후의 아미노산 A1 단편-유도 영역 또는 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 연결된다. 본 발명의 목적상, "A1 단편-유도 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다"의 의미는 ERAD 머시너리(machinery)에 의한 인식과 같은 A1 단편-유도 영역의 카르복시 말단의 세포 인식을 물리적으로 방해하는 4.5 kDa 이상의 분자 모이어티를 포함한다.
[86] 본 발명의 목적상, "A1 단편 영역의 카르복시 말단의 퓨린-절단 모티프"는 시가 독소 A 서브유닛 사이에서 보존되고 천연의 시가 독소 A 서브유닛 내에서 A1 단편 및 A2 단편 사이에서 교차점을 연결하는 특이 퓨린-절단 모티프를 의미한다.
[87] 본 발명의 목적상, "A1 단편 영역의 카르복시 말단에 인접한 퓨린-절단 사이트"는 A1 단편 영역 내에서 최후 잔기를 정의하는 7개 또는 그 이하의 아미노산 잔기 내에서 하나의 아미노산 잔기를 갖는 식별가능한 퓨린-절단 사이트를 의미한다.
[88] 본 발명의 목적상, 시가 독소 작동체 기능은 시가 독소 A 서브유닛으로 부터 유도된 폴리펩티드에 의해 수여되는 생물학적 활성을 의미한다. 시가 독소 작동체 기능의 비제한적 예로는 세포 내재화, 준세포 경로화, 촉매 활성 및 세포독성이 있다. 시가 독소 촉매 활성은 예를 들어 리보솜 비활성화, 단백질 합성억제, N-글리코시다아제 활성, 폴리뉴클레오티드:아데노신 글리코시다아제 활성, RNA 효소 활성, 및 DNA 효소 활성을 포함한다. 시가 독소는 리보솜 비활성화 단백질(RIPs)이다. RIP는 핵산, 폴리뉴클레오시드, 폴리뉴클레오티드, rRNA, ssDNA, dsDNA, mRNA(및 polyA), 및 바이러스성 핵산을 탈퓨린화 할 수 있다(Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4 (1992); Barbieri L et al., Nature 372: 624 (1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13 (1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L et al., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997); Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5 (1999); Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al., J Biochem 128: 883-9 (2000); Brigotti M et al., Toxicon 39: 341-8 (2001); Brigotti M et al., FASEB J 16: 365-72 (2002); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Picard D et al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005)). 몇몇의 RIP는 항바이러스성 활성 및 과산화 디스무타제 활성을 나타낸다(EriceA et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B, Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004); Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81 (2004)). 시가 독소 촉매 활성은 체내 및 체외에서 모두 관찰되었다. 시가 독소 작동체 활성 분석은 단백질 합성 억제 활성, 탈퓨린화 활성, 세포성장 억제, 세포 독성, 수퍼코일 DNA 이완 활성, 및/또는 뉴클레아제 활성과 같은 다양한 활성을 측정할 수 있다.
[89] 여기서 사용된 시가 독소 작동체 기능의 유지는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드 제어에 필적할 만한 재생성을 갖는 적절한 정량분석법에 의해 측정된 바와 같이, 시가 독소 기능성 활성의 레벨을 의미한다. 리보솜 억제에 대하여, 시가 독소 작동체 기능은 10,000 피코몰(PM) 또는 그 이하의 IC50를 나타낸다. 표적 양성 세포 사멸 분석 내의 세포독성에 대하여, 시가 독소 작동체 기능은, 적절한 세포외 표적 생체분자의 세포 유형 및 발현 정도에 따라 다르지만, 1,000 나노몰(nM) 또는 그 이하의 CD50을 나타낸다.
[90] 본 발명의 목적상 그리고 본 발명 분자의 시가 독소 작동체 기능과 관련하여, "합당한 활성(reasonable activity)"은 단지 야생형 시가 독소 폴리펩티드 서열을 함유하는 폴리펩티드의 시가 독소 작동체 활성 영역에 비교하여 정의된 최소 활성 레벨과 동일하거나 그보다 더 큰 시가 독소 작동체 생물학적 활성의 활성 레벨을 의미한다. 세포독성의 시가 독소 작동체 기능에 대하여, 활성의 합리적인 레벨은 야생형 시가 독소 구조물 및 어떤 다른 분자 구조물을 함유하는 분자의 500배 이내에 있는 것을 포함한다.
[91] 여기서 사용된 "상당한(significant)" 시가 독소 작동체 기능의 표시는 완전한 길이의 시가 독소 A1 단편을 함유하는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 필적할 만한 재생성을 갖는 적절한 정량 분석에 의해 측정된 바와 같이, 시가 독소 기능성 활성의 레벨을 의미한다. 체외에서의 리보솜 억제에 대하여, 상당한 시가 독소 작동체 기능은 리보솜의 종(예를 들어, 박테리아, 고세균류, 진핵 생물(해조류, 곰팡이, 식물 또는 동물))에 따라 다르지만, 300 PM 또는 그 이하의 IC50을 나타낸다. 이는 촉매 비활성인 SLT-1A 1-251 이중 돌연변이체(Y77S/E167D)에 대하여 대략 100,000 PM의 IC50과 비교할 때 상당히 큰 억제이다. 실험실의 세포 배양에서 표적 양성 세포 사멸 분석의 세포독성에 대하여, 상당한 시가 독소 작동체 기능은, 적절한 세포외 표적 생체분자의 세포 라인 및 발현 정도에 따라 다르지만, 100, 50, 또는 30 nM 또는 그 이하의 CD50을 나타낸다. 이는 세포 표적 결합 영역 없이, 세포 라인에 따라, 100~10,000 nM의 CD50을 갖는 SLT-1A 성분 단독에 비교할 때 적절한 표적 세포 라인에 대하여 상당히 큰 세포독성이다.
[92] 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 세포독성이 야생형 시가 독소 작동체에 비교하여 감소될지라도, 약화된 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 사용한 적용은 실제로 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 사용한 것과 동등하거나 또는 그보다 더 효과적인데, 이는 가장 높은 효능 변종들이 감소된-효능 변종에서 최소화된 또는 감소된 바람직하지 못한 효과를 나타내기 때문이다. 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 매우 강력해서 시토솔에 도달하는 단지 하나의 분자 또는 내재화되는 40개의 분자로써 사멸시킬 수 있다(p40), 준세포 경로화 또는 세포독성과 같은 현저히 감소된 시가 독소 작동체 기능을 갖는 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드와 비교할 때, 표적 세포 사멸에 관여하는 실질적인 응용 및/또는 특이 세포 유형의 특정 준세포 구획의 감지에 충분히 강력한 효능을 갖는다.
[93] 어떤 시료에서는, IC50 또는 CD50의 정확한 값이 정확한 커브 피트(curve fit)에 대하여 필요한 데이터를 수집하는 불가능 때문에 얻을 수 없는 경우도 있다. 정확하지 못한 IC50 및/또는 CD50 값은 상당한 시가 독소 작동체 기능성 활성을 측정할 때 고려되어서는 안된다. 예를 들어, 이론적으로, 50% 이상의 리보소 억제 또는 세포 사멸이 주어진 시료의 일련의 농도에서 발생하지 않는다면, IC50 또는 CD50은 결정될 수 없다.
[94] 시가 독소 작동체 기능 내의 활성 감지 실패는 세포 주입, 준세포 경로화 및/또는 효소 활성의 부족이라기보다는 부적절한 발현, 폴리펩티드 폴딩(folding), 및/또는 폴리펩티드 안정도에 기인한 것이다. 시가 독소 작동체 기능에 대한 분석은 상당한 양의 시가 독소 작동체 기능 활성을 측정하기 위하여 본 발명 분자의 많은 것을 요하지 않는다. 낮은 또는 전혀 없는 작동체 기능의 근본원인은 단백질 발현 또는 안정도와 관련되는 것으로 결정되듯이, 본 발명의 당업자는 공지된 단백질 화학 및 분자 조작 기술을 이용하여 이러한 요인에 대해 보정할 수 있고, 그럼으로써 시가 독소 기능성 작동체 활성은 회복되어 측정될 수 있다. 예를 들어, 부적절한 세포-기재 발현은 다른 발현 제어 서열을 사용하여 보상될 수 있고, 부적절한 폴리펩티드 폴딩 및/또는 안정도는 말단 서열 안정화, 또는 단백질의 3차원 구조를 안정화하는 비-작동체 영역 내의 상보적인 돌연변이로부터 혜택을 받을 수 있다. 각각의 시가 독소 기능에 대한 새로운 분석이 이용가능할 때, 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 특정 배수의 활성 내에 있는 것과 같이, 시가 독소 작동체 기능을 어떤 레벨에 대하여 분석될 수 있다. 의미있는 활성 차이의 예로는, 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드 활성의 1000배 또는 100배 또는 그 이하의 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 또는 기능성 녹다운(knock-down) 또는 녹아웃(knockout) 시가 독소 작동체 폴리펩티드와 비교하여 3배 내지 30배 또는 그 이상의 활성을 갖는 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 있다.
[95] 어떤 시가 독소 작동체 기능, 예를 들어 준세포 경로화 활성 등은 쉽게 측정할 수 없다. 현재로선 세포독성인 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 실패가 부적절한 준세포 경로화에 기인한 것인지를 식별하는 일반적 정량 분석법은 존재하지 않지만, 시험이 가능한 경우, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 적절한 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드와 비교하여 상당한 레벨의 준세포 경로화에 대하여 분석될 수 있다. 그러나 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 야생형 시가 독소 A 서부유닛 구조물과 동등한 세포독성을 나타내면, 준세포 경로화 활성 레벨은 야생형 시가 독소 A 서브유닛 구조물의 준세포 경로화 활성과 동등한 것으로 추정된다.
[96] 세포독성 분자의 세포독성 활성과 관련한 "선택적 세포독성(selective cytotoxicity)"은 표적 세포군과 비표적 방관자 세포군 사이의 상대적 세포독성 레벨을 의미하는데, 이는 표적 세포 유형의 세포 사멸의 우선도를 나타내는 비표적 세포 유형의 CD50에 대한 표적 세포 유형의 반-최고치 세포독성 농도(CD50)의 비로써 표현될 수 있다.
[97] 세포독성 분자로서의 면역독소 및 리간드-독소 융합물의 효율과 성능은 표적 세포 표면상에서의 표적 항원 밀도(예: Decket T et al., Blood 103: 2718-26 (2004); Du X et al., Blood 111: 338-43 (2008); Baskar S et al., mAbs 4: 349-61 (2012)), epitope location (Press O et al., J Immunol 141: 4410-7 (1988); Godal A et al., In J Cancer 52: 631-5 (1992); Yazdi P et al., Cancer Res 55: 3763-71 (1995) 참조), 표면 결합 세포독성 분자의 내재화 비율(예: Du X et al., Cancer Res 68: 6300-5 (2008) 참조), 및 세포내 여정(Tortorella L et al., PLoS One 7: e47320 (2012))에 의해 영향을 받는다.
[98] 주어진 세포외 표적 생체분자의 세포 표면 표시 및/또는 밀도는 본 발명의 특정의 세포-표적화 분자가 최적으로 사용될 수 있는 응용에 영향을 줄 수 있다. 세포 사이의 주어진 표적 생체분자의 세포 표면 표시 및/또는 밀도의 차이는 본 발명의 주어진 세포-표적화 분자의 내재화 및/또는 세포독성을 정량적으로 그리고 정성적으로 변화시킬 수 있다. 주어진 표적 생체분자의 세포 표면 표시 및/또는 밀도는 표적 생체분자 양성 세포 사이에서 또는 세포 사이클이나 세포 미분화의 다른 지점에서 동일 세포 상에서 현저하게 변화할 수 있다. 특정 세포 또는 세포군에서 주어진 표적 생체분자의 전체 세포 표면 표시는 형광 활성 세포 소팅(FACS) 유동 세포 분석법과 같은 공지의 방법을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
서론
[99] 본 발명은 야생형 시가 독소 세포독성을 나타낼 수 있는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 갖는 시가 독소 A 서브유닛 작동체를 함유하는 프로테아제-절단 저항성 분자를 제공한다. 종전에는, 시가 독소 A 서브유닛 융합 구조물이 세포독성을 나타내고 그들 자신의 세포내 경로화를 자가-유도할 수 있어서 시토솔까지 효소 활성 독소 단편을 전달하였다(Backer M et al., J Control Release 74: 349-55 (2001)); 그러나 퓨린-절개 사이트의 유지는 최대 세포독성을 유지하는데 중요한 것으로 생각된다.
[100] 합성 시가 독소 A 서브유닛 구조물을 설계할 때, 퓨린에 의한 세포내 단백질가수분해를 통한 A1 단편의 유리 및 A1 단편의 시토솔까지의 역전위(retrotranslocation)와 같은 시가 독소 중독의 자연적 메커니즘을 고려해야 한다. 모든 분자 모이어티 카르복시-말단의 시가 독소 A1 단편으로의 폐기가 1) 시토솔까지의 효율적인 경로화를 증진시키기 위하여 중독된 세포의 소포체 내에서 세포 인자에 의한 인식을 위해 A1 단편의 카르복시 말단을 노출시키고, 2) A1 단편이 어떤 카르복시-말단 모이어티가 없을 때 시토솔 내에서 구조물 속으로 다시 접혀지는(refolded) 것과 같이 촉매 활성을 극대화하는 경우에 필요로 될 수 있다. 이러한 메커니즘은 모두 야생형 시가 독소에 대해 관찰된 최대의 시가 독소 세포독성에 기여할 수 있다.
[101] 중독된 척추동물 세포에서 시가 완전독소의 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린 단백질가수분해 과정이 효율적인 세포독성을 위하여 결정적이기 때문에, 고도로 진화된 강력한 시가 독소 세포독성 메커니즘의 효율적인 자연의 준세포 경로화 및 촉매 활성을 보존하기 위하여 퓨린-절단이 유지되거나 자연적으로 발생하는 단백질 가수분해 과정을 위해 보상되어야 한다고 생각되었다. A2 단편으로부터 시가 독소 A1 단편의 분리는 유지되거나, 모방되거나 또는 보상되어야 하는데, 이는 1) 시토솔까지의 효율적 이송을 위하여 소포체 내에서 접근가능한 A1 단편의 카르복시 말단 또는 자연의 A1 단편과 유사한 카르복시 말단을 만들고, 2) 시토솔까지 안정된 최적의 촉매 A1 단편 구조물을 전달하기 위한 것이다.
[102] 종전에는, 퓨린 절단이 부족하지만 효율 및 성능 면에서 최대의 야생형 시가 독소 세포독성을 여전히 나타내는, 이형 카르복시-말단 모이어티를 함유하는 시가 독소 A 서브유닛 유도 구조물을 증명하지 못하였다. 특히 시가 독소 A1 단편 유도 영역의 카르복시 말단이 공유결합으로 결합되고 세포 표적 면역글로블린-유사 결합 영역과 같은 비교적 큰 분자 모이어티에 의해 입체적으로 커버될 때 최대의 시가 독소 세포독성에 대한 단백질 가수분해 과정을 배제하는 시가 독소 A 서브유닛 유도 구조물이 알려지지 않았다.
[103] 놀랍게도, 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 갖는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 함유하는 본 발명의 예시적인 분자들은 최대의 야생형 시가 독소 세포독성을 제공하는 충분한 시가 독소 작동체 기능을 나타냈고, 동시에 비교적 큰(28kDa 이상) 분자 모이어티를 그들의 카르복시 말단에 연결하는 것을 허락하였다. 하기 실시예에서 상세히 설명하듯, 촉매 도메인을 함유하는 시가 독소 A 서브유닛 유도 폴리펩티드를 각각 포함하는 본 발명의 예시적인 분자들은 야생형 시가 독소 A 서브유닛 폴리펩티드와 같은 퓨린-절단성 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 함유하는 세포-표적화 분자에 필적할 만한 시가 독소 세포독성 성능과 효율을 나타낸다. 이소성(ectopic) 프로테아제-절단 사이트를 부가하는 것과 같은, 상보적인 특징의 어떤 부수적인 조작은 필요하지 않았다. 이러한 관찰은 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 유도 폴리펩티드를 함유하는 개선된 세포-표적화 분자의 설계를 가능하게 하였고, 이들 분자는 야생형 시가 독소 A1 단편을 함유하는 세포-표적화 분자와 동등한 세포독성을 나타냈다.
[104] 본 발명은 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 포함하는 프로테아제-절단 저항성 분자를 제공한다. 본 발명의 세포독성 분자는 1) 촉매 활성 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 2) 세포독성 분자 모이어티를 포함하는 것으로 세포 사멸의 응용에 사용될 수 있다. 촉매 활성 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 함유하는 본 발명의 분자들은 특이 세포 유형의 표적 사멸, 및 암, 면역 장애 및 세균감염을 포함하는 다양한 질병의 치료용의 면역독소 및 리간드-독소 융합물의 성분으로 사용될 수 있다. 본 발명의 세포-표적화 분자들은 표적세포 사멸, 외인성 물질의 특이 세포 내로의 전달, 진단 정보 취득, 및 암, 면역 장애 및 세균감염을 포함하는 각종 질병, 장애 및 증상의 치료제와 같은 다양한 용도를 갖는다. 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자들은 특이 세포 유형의 표적 사멸, 및 암, 면역 장애, 및 세균감염을 포함하는 다양의 질병의 치료를 포함한 응용에도 또한 유용하다. 본 발명은 또한 시가 독소 A1 단편 유도 영역의 카르복시 말단에서 퓨린-절단 모티프의 붕괴에 관하여 시가 독소 A1 단편 영역에 분자 모이어티 카르복시-말단을 포함하는, 면역독소 또는 리간드-독소 융합물과 같은 시가 독소 A 서브유닛 유도 분자의 특이 조작방법도 또한 제공한다.
Ⅰ. 본 발명의 세포독성 문자 및 세포-표적화 분자의 일반 구조
[105] 본 발명은 다양한 세포독성 및 세포-표적화 분자를 제공하는데, 각각의 분자들은 시가 독소 A1 단편 유도 영역의 카르복시 말단에서 시가독소 A1 단편 유도 영역 및 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 세포독성 및 세포-표적화 분자들은 야생형 시가 독소 A1 단편을 함유하는 관련된 분자와 비교하여 퓨린-절단 저항성이다. 퓨린-절단 저항성 외에, 본 발명의 분자들은 일반적으로 더 프로테아제-절단 저항성이며, 그래서 감소된 체내 독성, 증가된 안정도, 증가된 저장 반감기, 및/또는 증가된 체내 반감기와 같은 바람직한 물성을 나타낸다.
[106] 본 발명의 세포독성 분자들은 또한 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합한 분자 모이어티를 포함한다. 분자 모이어티의 한 예로는 세포-표면 생체분자에 높은 친화력을 갖고 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드를 함유하는 세포-표적 면역글로불린-유사 결합 영역이 있다.
[107] 본 발명의 세포-표적화 분자들은 또한 세포 표면에 발현된 표적 생체분자와 같은, 세포와 물리적으로 결합한 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역을 포함한다. 여기에 설명된 세포-표적 결합 영역과 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 결합은 시가 독소 A 서브유닛 유도 폴리펩티드 영역의 퓨린 단백질가수분해 과정의 결핍에도 불구하고 강력한 시가 독소 세포 독성의 세포-유사 특이 표적의 조작을 가능하게 해준다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 일반 구조는 다양한 세포-표적 결합 영역의 특정수가 동일한 일반 구조의 변종을 생성하기 위하여 다양한 퓨린-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 결합할 수 있다는 점에서 모듈러식(modular)이다.
[108] 본 발명은 비교적 큰(28kDa 이상) 카르복시-말단 분자 모이어티에 결합 될 때 시가 독소 A1 단편을 A2 단편에 자연적으로 연결하는 퓨린 프로테아제 사이트의 붕괴가 그 세포독성을 약화시키지 않는다는 놀라운 발견에 기초한다. 놀랍게도, 1) ERAD 시스템에 의한 A1 단편의 카르복시 말단의 인식, 2) A1 단편의 언폴딩(unfolding), 3) A1 단편의 유비퀴틴화(ubiquitination), 4) 소포체로부터 시토솔까지의 촉매 도메인의 자리 역이동, 5) 프로테아솜에 의한 촉매 도메인의 분해 회피, 및 6) 완전한 활성 효소 구조물을 형성하기 위한 폴리펩티드를 함유하는 촉매 도메인의 리폴딩(refolding)으로 유도하는 카르복시-말단 소수성 도메인을 노출시키기 위하여 다른 모든 큰 분자 모이어티를 폐기하는 시가 독소 A 서브유닛의 자연적 메커니즘을 방해하는 큰 카르복시-말단 모이어티의 존재에도 불구하고 최대의 야생형 시가 독소 세포독성이 퓨린-절단의 부재시에 가능하다(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); Falguieres T, Johannes L, Biol Cell 98: 125-34 (2006); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011); Li S, PLoS One 7: e41119 (2012) 참조).
[109] 본 발명의 발견 전에는, 최적의 세포독성을 갖고자 하는 시가 독소 A 서브유닛 유도 융합 단백질의 설계에서, 퓨린-절단이 반드시 유지되거나 보상되어야했다. 시가 독소 A 서브유닛 유도 영역 내에 퓨린-절단을 유지함으로써, 시가 독소 A 서브유닛 A1 단편-유사 폴리펩티드가 그 카르복시 말단에 결합한 어떤 모이어티로부터 해방될 수 있고, A1 단편의 카르복시 말단을 입체적으로 커버하며, 그렇게 함으로써 60배 또는 그 이상으로 전체 분자의 리보솜 억제 활성을 향상시킬 수 있다(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); Falguieres T, Johannes L, Biol Cell 98: 125-34 (2006); Di R et al., Toxicon 57: 535-39 (2011); Li S, PLoS One 7: e41119 (2012) 참조). 그 다음 A1 단편-유사 폴리펩티드의 해방된 카르복시 말단은 소포체의 루멘(lumen)으로부터 시토솔까지의 자리이동을 위하여 그 소수성 도메인으로 중독된 세포의 ERAD 머시너리로 신호를 보낼 수 있고, A1 단편-유사 폴리펩티드는 언폴딩(unfolded) 될 수 있고, 폴리펩티드를 함유하는 시가 촉매 도메인은 시토솔까지 효율적으로 자리이동 할 수 있고, 그 촉매 도메인은 야생형 시가 독소에서 발생하는 것과 유사한 시토솔 내에서의 활성 확인 속으로 리폴딩(refold) 될 수 있다. 또한, A2 단편-유사 영역이 융합 단백질 내에 존재하면, A1 단편은 어떤 A2 단편-유사 영역으로부터 해리된 후에 더 촉매 활성을 띠게 된다. 한편, 퓨린-절단의 결핍에 대한 보상은 분자의 카르복시 말단이 퓨린 절단 시가 독소 A1 단편을 모방하도록 융합 단백질의 카르복시 말단에 인접한 "전처리(pre-processed)" 형태로 시가 독소 A 서브유닛 유도 폴리펩티드를 존재시킴으로써 달성될 수 있다.
A. 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드
[110] 본 발명의 모든 세포독성 분자 및 세포-표적화 분자들은 각각 퓨린-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 이들 퓨린-절개 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 각각은 시가 독소군의 A 서브유닛 개체로부터 유도되고, 1) 카르복시 말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 유도 폴리펩티드 및 2) 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드 영역의 카르복시 말단의 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다.
[111] 본 발명의 목적상, "퓨린-절단 저항성(furin-cleavage resistant)"은 폴리펩티드 영역이 자연적으로 발생하는 퓨린-절단 모티프가 붕괴되지 않아서, 유사 폴리펩티드 영역 내에서 자연적으로 발생하는 시가 독소 A 서브유닛에 의해 나타나는 것과 같이 단지 야생형 자연발생 서열만을 포함하는 구조물의 시가 독소 A1 단편 유도 영역의 카르복시 말단 또는 야생형 시가 독소 A 서브유닛 내의 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단보다 더 적은 퓨린 절단을 나타내는 것을 의미한다.
[112] 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 시가 독소군의 개체의 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유도된 폴리펩티드이다. 단백질 독소의 시가 독소군은 시가 독소, 시가-유사 독소 1, 및 시가-유사 독소 2와 같은 구조적으로 그리고 기능적으로 관계있는 다양한 자연 발생 독소로 구성된다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). 시가 독소군의 개체들은 동일한 전체적인 구조 및 행동 메커니즘을 공유한다(Engedal, N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). 예를 들어 Stx, SLT-1 및 SLT-2는 무세포계에서 분명하지 않은 효소 활성을 표시한다(Head S et al., J Biol Chem 266: 3617-21 (1991); Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402 (1993); Brigotti M et al., Toxicon 35:1431-1437 (1997)).
[113] 시가 독소군은 이질균 항원형 1로부터 분리된 시가 독소(Stx), 장출형성 대장균의 항원형으로부터 분리된 시가-유사 독소 2 변종(SLT-1 또는 Stx1 또는 STL-1 또는 Slt-I), 및 장출형성 대장균의 항원형으로부터 분리된 시가-유사 독소 2 변종(SLT2 또는 Stx2 또는 SLT-2)을 망라한다. SLT1은 Stx와 단지 하나의 잔기 만이 다를 뿐, 이 둘은 모두 베로시토톡신(Verocytotoxins) 또는 베로톡신(Verotoxins)(VTs)로 명명된다(O’Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). SLT1 및 SLT2 변종이 아미노산 서열 레벨에서 서로 약 53~60% 만이 유사할지라도, 그들은 시가 독소군의 개체에 공통인 효소활성 및 세포독성의 메커니즘을 공유한다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Stx1a, Stx1c, Stx1d, 및 Stx2a-g로 정의되는 39개 이상의 다른 시가 독소를 설명하였다(Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)). 시가 독소군의 개체들은 시가-독소-인코딩 유전자가 수평적 유전자 이동에 의해 박테리아 종 사이에 확산될 수 있기 때문에 어떤 박테리아 종에 자연적으로 구속되지 않는다(Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Bielaszewska M et al., Appl Environ Micrbiol 73: 3144-50 (2007); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol 21: R242-6 (2011)). 종간(interspecies) 이동의 한 예로써, 하나의 시가 독소가 환자로부터 분리된 A. 헤몰리티쿠스 균주에서 발견되었다(Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006)). 시가 독소 인코딩 폴리뉴클레오티드가 일단 새로운 종(species) 또는 아종(subspecies)로 들어가면, 그 시가 독소 아미노산 서열은 유전적 부동 및/또는 선택압에 의해서 약간의 서열 변형을 유발할 수 있는 것으로 추측되지만 여전히 시가 독소군의 개체에 공통인 세포독성 메커니즘을 유지한다(Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)).
[114] 시가 독소군 개체들의 시가 독소 A 서브유닛은 시가 독소 기능에 중요한 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 보존된 퓨린-절단 사이트를 포함한다. 퓨린-절단 사이트 모티프 및 퓨린-절단 사이트는 당업자에 의하여 및/또는 본 발명의 정보를 이용하여 식별될 수 있다.
[115] 퓨린에 의해 절단된 컨센서스 모티프(consensus motif)는 상당한 구체성을 가지고 식별된다. Schechter I, Berger, A, Biochem Biophys Res Commun 32: 898-902 (1968)에 설명된 명명법을 사용하여 P14 내지 P6'(Tian S, Biochem Insights 2: 9-20 (2009); Tian S, Jianhua W, Int J Biol Sci 6: 89-95 (2010); Tian S et al., Int J Mol Sci 12: 1060-5 (2011); Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012))로 표시되는 20 아미노산 잔기의 영역을 포함하는 퓨린-절단 사이트 모티프가 설명되었다. 이 명명법에 따르면, 절단 사이트는 P1으로 표시된 아미노산 잔기의 카르복시 결합에 있고, 잔기들은 그 비교 P1 잔기로부터 아미노 말단 쪽의 방향 내에 P2, P3, P4 등으로 표시된다. 비교 P1 잔기로부터 카르복시 말단 쪽으로 향하는 잔기들은 P2', P3', P4' 등으로 표시된다.
[116] 일반적인 퓨린-절단 사이트는 P4-P3-P2-P1에 상응하는 교감 모티프 R-x-x-R에 의해 종종 표기되며, 여기서 R은 아르기닌 잔기(표 A 참조), 대쉬(-)는 펩티드 결합, "x"는 임의의 아미노산 잔기를 의미한다(Schalken J et al., J Clin Invest 80: 1545-9 (1987); Bresnahan P et al., J Cell Biol 111: 2851-9 (1990); Hatsuzawa K et al., J Biol Chem 265: 22075-8 (1990); Wise R et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 9378-82 (1990); Molloy S et al., J Biol Chem 267: 16396-402 (1992)). 그러나, 다른 잔기와 위치들은 퓨린-절단 모티프를 정의하는데 도움을 준다(Hosaka M et al., J Biol Chem 266: 12127-30 (1991); Oda K et al., Biochem Biophys Res Commun 179: 1181-6 (1991); Leduc R et al., J Biol Chem 267: 14304-8 (1992); Watanabe T et al., J Biol Chem 267: 8270-4 (1992)). 약간 더 정제된 퓨린-절단 사이트 모티프는 P4-P3-P2-P1에 상응하는 교감 모티프 R-x-[K/R]-R로 보고되기도 하는데, 여기서 슬래쉬(/)는 "또는"을 의미하고, 동일 위치에서 대체가능한 아미노산 잔기를 분할하는데, 이는 퓨린이 이 모티프를 함유하는 기질을 절단하는데 강한 성호도를 갖는 것으로 관찰되었기 때문이다(Rockwell N et al., Chem Rev 102: 4525-48 (2002); Remacle A et al., J Biol Chem 283: 20897-906 (2008); Tian S, Biochem Insights 2: 9-20 (2009); Tian S, Jianhua W, Int J Biol Sci 6: 89-95 (2010); Tian S et al., Int J Mol Sci 12: 1060-5 (2011); Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012) 참조).
[117] 이와 부합되게, 많은 퓨린 억제제들이 모티프 R-x-x-R을 포함하는 펩티드를 함유한다(Misumi Y et al., Biochem Biophys Res Commun 171: 236-42 (1990); Hallenberger S et al., Nature 360: 358-61 (1992); Garten W et al., Biochimie 76: 217-25 (1994); Angliker H, J Med Chem 38: 4014-8 (1995); Van Rompaey L et al., Biochem J 326: 507?514 (1997); Cameron A et al., J Biol Chem 275: 36741-9 (2000); Jean F et al., Proc Natl Acad Sci USA 97: 2864-9 (2000); Basak A, Lazure C, Biochem J 373: 231-9 (2003); Kacprzak M et al., J Biol Chem 279: 36788-94 (2004)). 퓨린의 합성 억제제의 한 예는 R-V-K-R이다(Henrich S et al., Nat Struct Biol 10: 520-6 (2003)). 일반적으로, 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리된 두 개의 양성 전하 아미노산을 갖는 표면 접근성 이염기 아미노산 모티프를 함유하는 폴리펩티드는 모티프 내에서 최종의 염기 아미노산의 카르복시 결합에서 발생하는 절단에 민감한 퓨린-절단으로 예측될 수 있다(Rockwell N et al., Chem Rev 102: 4525-48 (2002); Remacle A et al., J Biol Chem 283: 20897-906 (2008)).
[118] 최소의 퓨린-절단 사이트 R-x-x-R 외에, 하나의 더 큰 퓨린-절단 사이트 모티프가 어떤 위치에서 특정의 아미노산 잔기 선호도를 갖는 것으로 설명된다. 공지된 다양한 퓨린 기질과 비교함으로써, 특정의 물리화학적 특성들이 20 아미노산 잔기 길이의 퓨린-절단 사이트 모티프 내에서 아미노산 잔기에 대해 설명된다. 퓨린-절단 모티프의 P6 내지 P2' 영역이 퓨린의 효소 도메인과 물리적으로 작용하는 코어, 퓨린-절단 사이트를 설명한다. P14 내지 P7 및 P3' 내지 P6'의 두 플랭킹(flanking) 영역이 종종 극성 아미노산 잔기 내에서 소수성이어서 그들 사이에 위치한 코어 퓨린-절단 사이트의 표면 접근성을 증가시킨다.
[119] 일반적으로, 위치 P5에서 P1까지의 퓨린-절단 모티프 영역이 양성 전하 및/또는 높은 등전점을 갖는 아미노산 잔기를 함유하는 경향이 있다. 특히, 퓨린 단백질가수분해 위치를 표시하는 P1 위치는 일반적으로 아르기닌에 의해 점령되지만, 다른 양전하 아미노산 잔기들이 이 위치에서 발생할 수 있다. 위치 P2 및 P3는 유연성 아미노산 잔기에 의해 점령되는 경향이 있고, 특히 P2는 아르기닌, 라이신, 또는 때때로 글라이신과 같은 극소량의 유연성 아미노산 잔기에 의해 점령되는 경향이 있다. P4 위치는 지방족 아미노산 잔기에 의해 점령되고, 양전하 작용기 부족은 P5 및/또는 P6 위치에 위치한 양전하 잔기에 의해 보상될 수 있다(Tian S, Jianhua W, Int J Biol Sci 6: 89-95 (2010)). 위치 P1' 및 P2'는 통상 지방족 및/또는 소수성 아미노산 잔기에 의해 점령되고, P1'위치는 대부분 세린에 의해 점령된다(Tian S, Biochem Insights 2: 9-20 (2009); Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012)).
[121] 본 발명의 세포독성 분자 및 세포-표적화 분자들 각각은 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다.
[122] 본 발명의 목적상, "퓨린-절단 사이트"는 시가 독소 A 서브유닛의 프로테아제 민감 루프 내에서 최소의 퓨린-절단 교감 사이트 R/Y-x-x-R을 의미한다.
[123] 본 발명의 목적상, "퓨린-절단 모티프"는 1) 최소의 퓨린-절단 모티프 P4 내지 P1, 2) 코어 퓨린-절단 모티프 P6 내지 P2', 및 3) 두 개의 플랭킹 폴리펩티드 영역 P14 내지 P7 및 P3' 내지 P6'를 포함하는, 여기서 설명된 20 아미노산 잔기 교감 폴리펩티드 서열 (P14 내지 P6') 만으로 이루어진 폴리펩티드를 의미한다.
[124] 본 발명의 목적상, "붕괴된 퓨린-절단 모티프"는 시가 독소 A1 단편 및 A2 단편 영역 사이의 교차점에서 천연의 시가 독소 A 서브유닛 내에 발견된 퓨린-절단 모티프이고 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린 절단이 A1 및 A2 단편을 생성하도록 위치하는 20 아미노산 잔기 영역으로부터 유도된 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형으로, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 적절한 분석법을 사용하여 퓨린 절단을 감시하기에 충분한 큰 사이즈의 카르복시 말단 폴리펩티드에 융합된 야생형 시가 독소 A1 단편 영역을 함유하는 비교 분자와 비교할 때 감소된 퓨린절단을 나타낸다. 퓨린 절단의 감소는 공지의 분석법 및/또는 본 발명에서 설명하는 방법에 의하여 당업자가 측정할 수 있다. 예를 들어, 비교 분자와 비교하여 한 분자의 퓨린 절단의 감소는 하기 실시예에서 설명된 그리고 동일한 조건에서 시행하고, 절단으로부터 비롯되는 단편들의 밴드 밀도를 정량화하는 체외 퓨린 절단 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 분자들의 어떤 구체예에서는, 붕괴된 퓨린-절단 모티프가 실시예에서 설명된 비교 분자 SLT-1A-WT::scFv-1과 같은 폴리펩티드의 카르복시 말단에서 융합된 야생형 시가 독소 A1 단편을 함유하는 비교분자에 대하여 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 그 이상의 체외 퓨린 절단 감소를 나타낸다.
[125] 시가 독소 A1 및 A2 단편 퓨린 절단 사이의 교차점에서 천연의 시가 독소 A 서브유닛 내에 발견된 20 아미노산 잔기 퓨린-절단 모티프는 어떤 시가 독소에서 잘 특성화된다. 예를 들어, StxA(SEQ ID NO:2) 및 SLT-1A(SEQ ID NO:1)에서, 이 퓨린-절단 모티프는 자연적으로 L238 내지 F257에 위치하고, SLT-2A(SEQ ID NO:3)에서, 이 퓨린-절단 모티프는 자연적으로 V237 내지 Q256에 위치한다. 여기서 설명된 아미노산 상동(homology) 실험 및/또는 퓨린-절단 분석법에 기초하여, 당업자는 다른 천연의 시가 독소 A 서브유닛에서 퓨린-절단 모티프를 식별할 수 있고, 이 경우 상기 모티프는 중독된 진핵세포에 의한 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린 절단 후에 A1 및 A2 단편을 생성하도록 초래한다고 예측된다.
[126] 퓨린-절단 모티프 내의 아미노산 잔기로의 변형은 아미노산 잔기의 작용기에 벌키(bulky) 분자를 연결하는 것을 포함하는 당화 같은, 번역 후 변형뿐만 아니라 다양한 돌연변이를 포함한다. 퓨린-절단 모티프 내에서 아미노산 잔기로의 돌연변이는 삭제, 삽입, 전환, 치환, 및/또는 퓨린-절단 모티프의 카르복시-말단 절단을 포함한다. 이들은 이미 붕괴되었기 때문에, 특정의 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 어떤 퓨린-절단 모티프와 관련된 것으로 쉽게 인식되지 않는다. 하지만 시가 독소 A1 단편 영역의 카르복시 말단은 인식될 수 있고, 그것이 붕괴되지 않았다면 퓨린-절단 모티프가 어디에 위치하는지를 정의할 것이다. 예를 들어, 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 퓨린-절단 모티프의 20 아미노산 잔기보다 적은 것을 포함하고, 시가 독소 A 서브유닛 및/또는 시가 독소 A1 단편과 비교하여 카르복시-말단 절단을 나타낸다.
[127] 퓨린-절단 사이트 또는 퓨린-절단 모티프와 관련한 본 발명의 목적상, '붕괴(disruption)', '붕괴된(disrupted)'은 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 퓨린-절단의 감소를 초래하는 돌연변이와 같은 자연적으로 발생하는 퓨린-절단 사이트로부터의 변형을 의미한다. 퓨린-절단 모티프가 약 20 아미노산 잔기로 이루어지기 때문에, 이론상, 이들 20 위치의 하나 이상을 수반하는 돌연변이, 삭제, 또는 삽입은 퓨린-절단 민감도의 감소를 초래할 수 있다(Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012)). 이 붕괴는 다른 프로테아제에 대한 저항성을 증가시킬 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
[128] 퓨린-절단 사이트 및 퓨린-절단 모티프를 붕괴할 수 있는 돌연변이 유형의 예로는 아미노산 잔기 삭제, 삽입, 전환 및/또는 비표준 아미노산 및/또는 비자연 아미노산으로의 치환을 포함하는 치환이 있다. 또한, 퓨린-절단 사이트 및 퓨린-절단 모티프는 그 사이트 또는 모티프에서 최소한 하나의 아미노산을 보호는 공유결합 화학구조의 부가에 의한 아미노산의 변형을 포함한 돌연변이에 의해 붕괴될 수 있다((Flower D, Expert Opin Drug Discov 7: 807-17 (2012)).
[129] 최소의 퓨린 교감 사이트 R-x-x-R에서 두 아르기닌 잔기의 하나 또는 둘 모두를 알라닌으로 변이시키면 퓨린-절단 모티프를 붕괴하여 그 사이트에서 퓨린-절단을 예방할 것이다(Duda A et al., J Virol 78: 13865-70 (2004)). 유사하게, 최소의 퓨린-절단 모티프 R-x-x-R에서 아르기닌 잔기의 하나 또는 둘을 당업자에게 공지된 비보존성 아미노산 잔기로 치환하는 것은 그 모티프의 퓨린-절단 민감도를 감소시킬 것이다. 특히 아르기닌을 A, G, P, S, T, D, E, Q, N, C, I, L, M, V, F, W, 및 Y 와 같은 양전하가 부족한 비염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것은 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 초래할 것이다. 나아가, 최소의 퓨린-절단 사이트의 퓨린-절단 모티프 또는 코어 퓨린-절단 모티프 내에서의 삭제는 퓨린-절단 모티프의 퓨린-절단 민감도를 감소시킬 것이다.
[130] 본 발명의 분자들의 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 최소의 퓨린-절단 모티프 R/Y-x-x-R의 위치 1 및 4 내의 아미노산 잔기와 같이 교감 아미노산 잔기 P1 및 P4의 하나 또는 둘의 존재, 위치, 또는 작용기의 관점에서 붕괴를 포함한다.
[131] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 둘 외의 다른 아미노산 잔기를 방해하고, 다른 위치 속으로 P4 및/또는 P1을 변경하고, 그리고 상기 P4 및/또는 P1 지정을 제거하는 숫자의 관점에서 교감 아미노산 잔기 P4 및 P1 사이의 공간에 붕괴를 포함한다.
[132] 어떤 퓨린-절단 모티프 붕괴는 서열 목록에 제공된 천연의 시가 독소 A 서브유닛의 특이 아미노산 위치에 대한 비교로서 표시되고, 이는 자연적으로 발생하는 시가 독소 A 서브유닛이 성숙된 시가 독소 A 서브유닛을 생성하도록 제거되고 당업자에게 인지될 수 있는 아미노-말단에서 약 22 아미노산의 신호 서열을 함유하는 전구체 형태를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 나아가, 돌연변이를 포함하는 어떤 퓨린-절단 모티프 붕괴는 천연의 시가 독소 A 서브유닛 내의 특이 위치에(예를 들어, 아미노 말단으로부터 위치 251에 아르기닌 잔기에 대한 R251) 자연적으로 존재하는 특히 아미노산(예를 들어, 아르기닌 잔기에 대한 R) 비교로서, 그리고 검토중인 특별한 돌연변이에서 잔기가 치환되었던 아미노산으로서 표시된다.(예를 들어, R251A는 아미노 말단으로부터 아미노산 잔기 251에서 아르기닌에 대한 아미노산 치환을 나타낸다).
[133] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교되는 것과 같이, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 함유하는데, 그 예로는, StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 R248 및/또는 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 R251; 그리고 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 Y247 및/또는 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 R250이 있다. 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 비붕괴된 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 을 포함하지만 대신에 붕괴된 플랭킹 영역도 포함하여, 그 예로는, 예를 들어, 241-247 및/또는 252-259의 퓨린-절단 모티프 플랭킹 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기 내의 아미노산 잔기 치환체들이 있다.
[134] 어떤 구체예에서, 붕괴는 프로테아제 모티프 영역 내의 최소한 하나의 아미노산 잔기의 삭제, 삽입, 전환, 및/또는 돌연변이를 포함한다. 어떤 구체예에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 시가-유사 독소 1(SEQ ID NO: 1) 또는 시가 독소(SEQ ID NO: 2)의 A 서브유닛의 249-251, 또는 시가-유사 독소 2(SEQ ID NO: 3)의 A 서브유닛의 247-250, 또는 보존된 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 비-천연 시가 독소 작동체 폴리펩티드 서열 내의 동등한 위치에 자연적으로 위치한 아미노산 서열의 붕괴를 포함할 수 있다. 어떤 다른 구체예에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 프로테아제 모티프 영역 내의 최소한 하나의 아미노산 삭제를 포함하는 붕괴를 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 프로테아제 모티프 영역 내의 최소한 하나의 아미노산 삽입을 포함하는 붕괴를 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 아미노산의 전환을 포함하는 붕괴를 포함하는데, 이 경우 최소한 하나의 전환된 아미노산은 프로테아제 모티프 영역 내에 있다. 어떤 다른 구체예에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 비표준 아미노산 또는 화학적으로 변형된 측쇄를 갖는 아미노산으로의 아미노산 치환과 같은 돌연변이를 포함하는 붕괴를 포함한다. 단일 아미노산 치환에 대한 예는 하기 실시예에서 설명된다.
[135] 어떤 구체예에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 프로테아제 모티프 영역 내의 아미노산 치환을 포함하는 붕괴를 포함하며, 상기 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 자연적으로 위치한 아미노산에서 발생한다: SEQ ID NO:3의 247, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 248, SEQ ID NO:3의 250, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 251, 또는 보존된 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 비-천연 시가 독소 작동체 폴리펩티드 서열 내의 동등한 위치. 어떤 다른 구체예에서, 상기 치환은 어떤 비-보존성 아미노산에 관한 것으로, 상기 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 자연적으로 위치한 아미노산에서 발생한다: SEQ ID NO:3의 247, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 248, SEQ ID NO:3의 250, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 251, 또는 보존된 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 비-천연 시가 독소 작동체 폴리펩티드 서열 내의 동등한 위치. 어떤 다른 구체예에서, 상기 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다: R247A, R248A, R250A, R251A, 또는 보존된 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 비-천연 시가 독소 작동체 폴리펩티드 서열 내의 동등한 위치.
[136] 본 발명 분자들의 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 퓨린-절단 모티프 내의 카르복시-말단 아미노산 잔기의 9, 10, 11, 또는 그 이상의 삭제를 포함한다. 이러한 구체예에서는, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프가 퓨린-절단 사이트 또는 최소의 퓨린-절단 모티프를 포함하지 않는다. 다른 말로, 어떤 구체예들은 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 퓨린-절단 사이트가 결핍된다.
[137] 어떤 구체예에서, 본 발명의 분자는 시가 독소 A 서브유닛 사이에서 보존된 표면-노출 프로테아제 민감성 루프 내에 돌연변이를 함유하는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, StxA 및 SLT-1A에서, 이 프로테아제-민감성 루프는 자연적으로 위치 242에서 위치 261까지 위치하고, SLT-2A에서, 이 루프는 자연적으로 위치 241에서 위치 260까지 위치한다. 폴리펩티드 서열 상동성(homology)에 기초하여, 당업자는 다른 시가 독소 A 서브유닛에서 이 보존된 프로테아제-민감성 루프를 식별할 수 있다. 어떤 다른 구체예에서, 본 발명의 분자는 시가 독소 A 서브유닛의 이 프로테아제-민감성 루프 내에 돌연변이를 함유하는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 함유하며, 상기 돌연변이는 퓨린-절단 민감성이 감소되도록 그 루프 내에 특정의 아미노산 잔기의 표면 접근성을 감소시킨다.
[138] 어떤 구체예에서, 본 발명의 분자는 A, G, 또는 H를 갖는 최소의 절단 사이트 교감 모티프 내에 아르기닌 잔기의 하나 또는 둘 모두의 아미노산 잔기 치환을 함유하는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 StxA(SEQ ID NO:2) 및 SLT-1A(SEQ ID NO:3)의 247-252에 자연적으로 위치한 영역, 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 246-251에 자연적으로 위치한 영역의 삭제; StxA(SEQ ID NO:2) 및 SLT-1A(SEQ ID NO:3)의 244-246에 자연적으로 위치한 영역, 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 243-245에 자연적으로 위치한 영역의 삭제; 또는 StxA(SEQ ID NO:2) 및 SLT-1A(SEQ ID NO:3)의 253-259에 자연적으로 위치한 영역, 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 252-258에 자연적으로 위치한 영역의 삭제를 포함한다. 어떤 다른 구체예들은 가능하다면 상기 언급한 돌연변이의 조합을 함유하는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다.
[139] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 카르복시-말단 절단을 포함하며, 상기 절단은 상기 퓨린-절단 모티프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 삭제를 초래한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 최소의 절단 사이트 Y/R-x-x-R 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 삭제하는 카르복시-말단 절단을 포함하며, 그 절단의 예로는, StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 자연적인 아미노산 잔기 위치 250, 249, 248, 247, 246, 245, 244, 243, 242, 241, 240, 또는 그 이하에서 끝나는 절단; 그리고 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 자연적인 아미노산 잔기 위치 249, 248, 247, 246, 245, 244, 243, 242, 241, 또는 그 이하에서 끝나는 절단이 있다.
[140] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 퓨린-절단 모티프의 부분적인 카르복시-말단 절단인 돌연변이를 포함하지만, 본 발명의 어떤 분자들은 전체 20 아미노산 잔기 퓨린-절단 모티프의 완전한 카르복시-말단 절단인 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 어떤 세포독성 세포-표적화 분자들은 StxA(SEQ ID NO:2) 또는 SLT-1A(SEQ ID NO:1)의 자연 위치 240 까지의 A1 단편 영역의 부분적인 카르복시-말단 절단을 포함하는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하지만, 위치 239 또는 그 이하에서는 카르복시-말단 절단을 함유하지 않는다. 유사하게, 본 발명의 어떤 세포독성 세포-표적화 분자들은 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 자연 위치 239까지의 A1 단편 영역의 부분적인 카르복시-말단 절단을 포함하지만 위치 238 또는 그 이하에서는 카르복시-말단 절단을 포함하지 않는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 가장 큰 카르복시-말단 절단에서, 퓨린-절단 모티프의 위치 P14 및 P13은 여전히 존재한다.
[141] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교할 때 퓨린-절단 모티프 내의 아미노산 잔기 치환 및 카르복시 말단 절단을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교할 때 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 내의 아미노산 잔기 치환 및 카르복시-말단 절단을 포함하는데, 상기 절단의 예로는, StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 자연 아미노산 잔기 위치 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고, 적절한 위치에서 어떤 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 R248 및/또는 R251을 포함하는 절단; 그리고 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 자연 아미노산 잔기 위치 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고, 적절한 위치에서 어떤 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 Y247 및/또는 R250을 포함하는 절단이 있다. 어떤 구체예에서, 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 절단된 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 최적의 세포독성을 유지하기 위하여 위치 P9, P8 및/또는 P7에서 퓨린-절단 모티프 아미노산 잔기를 포함한다.
[142] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여, 하나 이상의 내부 아미노산 잔기 삭제를 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 내에 하나 이상의 아미노산 잔기 삭제를 포함한다. 예를 들어, StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 R248 및/또는 R251의 내부 삭제를 포함하는데, 이는 249, 250, 247, 252 등과 같은 주변 잔기들의 삭제의 조합일 수 있고, SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 Y247 및/또는 R250의 내부 삭제를 포함하는데, 이는 249, 249, 246, 251 등과 같은 주변 잔기들의 삭제의 조합일 수 있다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R을 삭제하는 4개의 연속적인 아미노산 잔기들의 삭제를 포함하는데, 그 예로는 R248-R251이 결핍된 StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 Y247-R250이 결핍된 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 있다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 코어 퓨린-절단 모티프를 플랭킹하는 아미노산 잔기 내에 하나 이상의 아미노산 잔기 삭제를 포함하는데, 그 예로는 SLT-1A 또는 StxA 내의 244-247 및/또는 252-255의 삭제가 있다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 전체 표면-노출 프로테아제-절단 민감성 루프의 내부 삭제를 포함하는데, 그 예로 StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 241-262의 삭제; 및 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 240-261의 삭제가 있다.
[143] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 퓨린-절단 모티프 내에 하나의 내부 아미노산 잔기 삭제 및 하나의 카르복시-말단 절단을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 내에 하나의 아미노산 잔기 삭제 및 하나의 카르복시-말단 절단을 포함한다. 예를 들어, 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 갖는 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 절단된 StxA 또는 SLT-1A 폴리펩티드 내에 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 248-249 및/또는 250-251 또는 절단된 SLT-2A 내에 아미노산 잔기 247-248 및/또는 249-250의 삭제를 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R을 삭제하는 4개의 연속적인 아미노산 잔기의 삭제, 및 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 카르복시-말단 절단을 포함하는데, 상기 절단의 예로는, StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 자연 아미노산 잔기 위치 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고, R248-R251이 결핍된 절단; 그리고 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 자연 아미노산 잔기 위치 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고, Y247-R250이 결핍된 절단이 있다.
[144] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 삭제 및 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 내에 하나 이상의 아미노산 잔기 삭제 및 치환을 포함하는데, 그 예로는, StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 R248 및/또는 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 R251; 및 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 Y247 및/또는 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 R250이 있다.
[145] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 삭제 및 카르복시-말단 절단 뿐만 아니라 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 내에 하나 이상의 아미노산 잔기 삭제 및 치환을 포함하는데, 그 예로는, StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 R248 및/또는 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 R251; 및 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 Y247 및/또는 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 R250이 있다.
[146] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 내에 하나의 아미노산 잔기 치환 및 하나의 카르복시-말단 절단을 포함한다. 상기 절단의 예로는, StxA 및 SLT-1A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 자연 아미노산 잔기 위치 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고, 적절한 곳에 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 R248 및/또는 R251을 포함하는 절단; 그리고 SLT-2A 유도 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여, 자연 아미노산 잔기 위치 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고, 적절한 곳에 비양전하 아미노산 잔기로 치환된 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 Y247 및/또는 R250을 포함하는 절단이 있다.
[147] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 포함하는데, 이때 삽입된 아미노산 잔기는 데노보(de novo) 퓨린-절단 사이트를 생성하지 않는다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입은 최소의 퓨린-절단 사이트 R/Y-x-x-R 내에서 아르기닌 잔기 사이의 내부 공간을 붕괴하는데, 그 예로는, StxA 및 SLT-1A 유도 폴리펩티드가 249 또는 250에서 즉 R248과 R251 사이에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 포함하거나, 또는 SLT-2A 유도 폴리펩티드가 248 또는 249에서 즉 Y247과 R250 사이에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 포함하는 것이다.
[148] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교할 때 아미노산 잔기 삽입 및 카르복시 말단 절단을 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교할 때 아미노산 잔기 삽입 및 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교할 때 아미노산 잔기 삽입 및 아미노산 잔기 삭제를 포함한다.
[149] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교할 때 아미노산 잔기 삭제, 아미노산 잔기 삽입, 및 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
[150] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교할 때 아미노산 잔기 삭제, 삽입, 치환, 및 카르복시 말단 절단을 포함한다.
[151] 어떤 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 함유하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 아미노산, 펩티ㄷ, 및/또는 폴리펩티드를 함유하는 분자 모이어티에 직접 융합되는데, 이때 융합된 구조는 단일의 연속적 폴리펩티드를 수반한다. 이들 융합 구체예에서, 상기 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 따르는 아미노산 서열은 융합 합류점에서 데노보 퓨린-절단 사이트를 생성하지 않는다.
[152] 시가 독소 A 서브유닛은 고도로 보존된 표면-노출 루프 구조물 내에 그리고 StxA 및 SLT-1A 내의 L238부터 F257까지의 영역 내에 그리고 SLT-2A 내의 V237부터 Q256까지의 영역 내에 퓨린-절단 모티프 외에 다른 퓨린-절단 모티프를 가질 수 있다. 예를 들어, StxA 및 SLT-1A는 자연적으로 위치한 아미노산 잔기 영역 220 내지 223 주위에 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 그러나, 시가 독소 A 서브유닛 내의 이 제2 퓨린 사이트가 체내에서 절단된다는 증거는 없다. 반대로, 인간 퓨린을 갖는 Stx2 완전독소의 체외 치료는 Arg250 외에 A 서브유닛 내의 어떤 다른 R-x-x-R 모티프에서(예를 들어, 아미노산 잔기 179에서 222까지 자연적으로 위치한 모티프) 절단을 생성하지 않았는데, 이는 시가 독소 A 서브유닛 내의 다른 강력한 이염기 사이트가 퓨린에 접근할 수 없다는 것을 암시한다(Faqerquist C. Sultan O, J Biomed Biotechnol 2010: 123460(2010)). 다른 절단 사이트를 붕괴하는 것이 조작될 수 있다 할지라도, SLT-1A의 영역 220 내지 223에 자연적으로 위치한 퓨린-절단 모티프를 붕괴하는, StxA1 및 SLT-1A 내의 L238 내지 F257에서의 퓨린-절단 모티프는 정상적인 활성 이하로 세포독성 활성을 감소시키며(Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004(1999)), 220 내지 223 영역의 프로테아제 사이트가 프러테아제에 접근할 수 없다면 프로테아제 저항성과 관련된 혜택을 거의 제공하지 못할 것이다.
B. 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대한 카르복시-말단에 위치한 분자 모이어티
[153] 본 발명의 어떤 분자는 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단과 관련된 분자 모이어티를 포함한다. 본 발명은 퓨린-절단가능, 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 비교했을 때, 시가 독소 작동체 세포독성 손실이 전혀 없이, 상대적으로 큰, 분자 모이어티 카르복시 말단이 퓨린-절단 저항성(resistant), 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 부착될 수 있게 한다. "분자 모이어티"는 폴리펩티드, 단백질, 세포독성제, 다당류, 지질, 및 그 외 자연적으로 발생하는 또는 인위적으로 합성한 생체분자를 아우른다.
[154] 중독된(intoxicated) 세포 내의 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린 단백질분해는 최소 세 가지를 가능하게 한다: 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단 노출, 모든 다른 분자 모이어티로부터 A1 단편 해리, 및 소포체로부터 시토졸으로 A1 단편의 전위. A2 단편 및 나머지 시가 완전독소(holotoxin)로부터의 A1의 해리는 소포체의 내강으로부터 시포졸으로의 A1 단편의 전위에 필요하고, 시가 완전독소의 구성요소 중 유일하게 시토졸 구획(cytosolic compartment)에 도달하는 것은 A1 단편이다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Tarn P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10 (2007); Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012)).
[155] 시가 독소에 의한 중독 중에 퓨린 절단의 하나의 중요한 기능은 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단의 노출인 것으로 보인다. 중독된 세포의 소포체에 있는 A1 단편의 카르복시 말단의 노출은 최적의 준세포 경로화(subcellular routing) 및 세포독성에 필요한 것으로 생각된다. 시가 독소 A 서브유닛 유래 구조가 중독된 세포의 소포체에 있는 A1 단편의 카르복시 말단을 노출시킬 수 없을 때는, 그 구조의 세포독성 효과가 감소된다(Burgess B, Roberts L, Mol Microbiol 10: 171-9 (1993); Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). 이는 결과적으로 일반적으로 효율적인 A1 단편의 시토졸으로의 세포내 경로화의 교란(perturbation)을 야기하는, 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단을 입체적으로 커버하는(sterically covering) 하나 이상의 분자 모이어티의 존속에 의해 설명될 수 있다. 퓨린 단백분해 과정을 거치지 않는 시가 독소 A 서브유닛 유래 구조는 중독된 세포의 시토졸에 효율적으로 도달하지 못한다(Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999)).
[156] 시가 독소에 의한 중독 중에 퓨린 절단의 또 다른 중요한 기능은 나머지 시가 완전독소로부터의 시가 독소 A1 단편 유리(liberation)이다. 중독된 세포의 소포체에 있는 A1 단편의 유리는 최적의 준세포 경로화 및 세포독성에 필요한 것으로 생각된다. 중독된 세포의 소포체에서 시가 독소 A1 단편이 퓨린-절단 및 자유로워질 수 없을 때는, 세포독성 효과가 감소된다(Burgess B, Roberts L, Mol Microbiol 10: 171-9 (1993); Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)). 여기서도, 이는 결과적으로 일반적으로 효율적인 A1 단편의 시토졸으로의 세포내 경로화의 변동을 야기하는, 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단과 관련된 하나 이상의 분자 모이어티의 존속에 의해 설명될 수 있다.
[157] 최대 시가 독소 세포독성을 위하여, 모델은 효율적인 시토졸의 경로화, 최적의 단백질 가수분해 효소 복합체 회피, 최적의 촉매 구조 형성, 및 최대 효소 활성화를 위해 그의 카르복시-말단과 관련된 그리고/또는 입체적으로 커버하는 모든 분자 모이어티로부터 자유로워지는 것이 필수적인 것으로 시사한다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007); Smith M et al., Infect Immun 77: 2730-40 (2009); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011); Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012)). 예를 들어, 시가 독소 A2 단편은 야생형 시가 완전독소에 있는 A1 단편에 융합되었고, 시가 독소 B-서브유닛의 오량체(pentamer)는 A2 단편의 카르복시 말단에 결합되었다(Fraser M et al., Nat Struct Biol 1 : 59-64 (1994)). 유사하게, 최대 시가 독소 세포독성은, 예를 들어, 최소 A2 단편만큼 크고(4.5-4.7kDa) 나머지 시가 완전독소의 질량(42.7-43.2 kDa)만큼인 모이어티와 같은, 그의 카르복시 말단과 관련된 모든 분자 모이어티로부터 A1 단편의 유리가 필요할 수 있다.
[158] 앞서 기술된 것과 관련된, 최대 시가 독소 세포독성은 A1 단편의 카르복시 말단을 입체적으로 커버하는 모든 카르복시-말단 모이어티로부터, 효율적인 시토졸로의 전위를 위해서는 이 영역이 노출되어야 하기 때문에, A1 단편의 유리가 필요할 수 있다(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012) 참조).
[159] 더불어, 최대 시가 독소 세포독성을 위해서는, 지질 이중막(lipid bilayer membranes)에 있는 강글리오시드를 결합하는 시가 독소 B 서브유닛과 같은, 세포막 구성요소를 결합하는 세포-표적 결합 도메인을 포함하는 분자 모이어티로부터 A1 단편을 유리시키는 것이 중요할 수 있다. A1 단편이 내부 원형질막(endoplasmic membrane) 표적에 고친화성 결합으로 결합된 세포-표적 모이어티에 공유 결합으로 부착되었을 때는, 시가 독소 A1 단편이 소포체의 지질막에 효율적인 A1 단편의 유리 및/또는 시토졸으로 전위에 필요한 메커니즘 및 단계에 교란을 야기하는 방식으로 계속 연결되어 있을 수도 있다.
[160] 본 발명은 앞서 기술된 모델에서의 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린-절단의 기능이 인공합성된 세포-표적화 분자가 보이는 야생형 레벨의 시가 세포독성에 불필요함을 보여주는 모범적인 구조를 제공한다(아래의 실시예 참조). 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단은 시토졸으로의 효율적인 세포내 경로화를 위하여 노출될 필요가 없는 것으로 보이고, 그리고, 최대 시가 독소 세포독성을 위하여 그외 모든 분자 모이어티로부터의 A1 단편의 유리가 불필요한 것으로 보인다. 그러므로, 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린-절단 모티프(motif)는 세포-표적화 분자에서, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역에 대한 세포-표적화 분자 카르복시 말단과 함께 위치한 분자 모이어티의 존재에도 불구하고, 세포독성을 희생시키지 않고 교란될 수 있다.
[161] 본 발명의 어떤 분자는 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단과 관련된 분자 모이어티를 포함한다. 어떤 다른 구체예에서는, 상기 관련은 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단을 직접적으로, 또는 간접적으로 분자 모이어티에 연결하는 공유 결합을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서는, 상기 관련은 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단을 분자 모이어티의 하나 이상의 아미노산 잔기와 융합시키는 펩티드 결합을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 분자 모이어티는 단일의, 연속된(continuous) 폴리펩티드를 형성하기 위해 융합되고, 이에서 상기 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 분자 모이어티에 대한 연속된 폴리펩티드 아미노-말단 내에 물리적으로 위치한다.
[162] 분자 모이어티의 크기는 달라질 수 있다. 본 발명의 분자의 분자 모이어티는 다음을 포함한다: 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단을 입체적으로 덮을 정도로 큰 모이어티, 지질막결합 표적을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 모든 크기의 모이어티, 본 발명의 시가 독소 A1 단편의 카르복시-말단 근위의 좋은 구조의(well-structured) 3차 폴리펩티드 구조를 제공하는 모든 크기의 모이어티, 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에 비해 더 극성(polar)이고 친수성인 모든 크기의 모이어티, 및 천연(native) 시가 독소 A 서브유닛의 크기(약 28kDa)와 같거나 더 큰 모든 모이어티. 28kDa와 동일하거나 더 큰 크기의 분자 모이어티는 본 명세서에서 "상대적으로 큰"이라 불린다.
[163] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자는 펩티드를 포함하는 분자 모이어티를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자는 1.5kDa 또는 그 이상의 질량을 가진 분자 모이어티를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 상기 분자가 본 명세서에 기술된 시가 독소 생물학적 활동을 유지하는 한, 본 발명의 분자는 최소 4.5kDa, 6,kDa, 9kDa, 12kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 28kDa, 30kDa, 41kDa, 50kDa, 100kDa, 또는 그 이상의 질량을 가진 분자 모이어티를 포함할 수 있다.
[164] 어떤 구체예에서는, 분자 모이어티는 약 4.5kDa의 질량 또는 시가 독소 A2 단편과 동등한 다른 질량을 가진다. 이 크기의 모이어티가 중독된 세포 내의 준세포 경로화 및 리보솜 불활성화의 효율성에 지장을 주지 않으면서 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에 계속하여 부착되어있을 수 있다는 것은 예상 밖이었다.
[165] 어떤 구체예에서는, 분자 모이어티는 약 7.6kDa의 질량 또는 시가 독소 B 서브유닛과 동등한 다른 질량을 가진다. 이 크기의 모이어티가 중독된 세포 내의 준세포 경로화 및 리보솜 불활성화의 효율성에 지장을 주지 않으면서 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에 계속하여 부착되어있을 수 있다는 것은 예상 밖이었다.
[166] 어떤 구체예에서는, 분자 모이어티는 약 6-10kDa 또는 그 이상의 질량을 가지고, 예를 들어, 가공된(engineered) 아르마딜로 반복 폴리펩티드(ArmRPs), 가공된, 피브로넥틴-유래, 10th 피브로넥틴 타입 III(10Fn3) 도메인(모노바디(monobodies), AdNectins™, 또는 AdNexins™); 가공된, 안키린 반복 모티프 함유 폴리펩티드(DbARPins™); 가공된, 저밀도-지질단백질-수용체-유래, A 도메인(LDLR-A)(Avimers™); 가공된, 단백질-A-유래, Z 도메인(Affibodies™); 가공된, 감마-B 결정체-유래 스캐폴드(scaffold) 또는 가공된, 유비퀴틴-유래 스캐폴드(Affilins); 및 Sac7d-유래 폴리펩티드(Nanoffitins® 또는 affitins)와 같은, 항체 모방체 또는 대체 항체 포맷을 포함하는 결합 영역을 포함한다.
[167] 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 약 11kDa 또는 그 이상의 질량을 가지고, 예를 들어, VHH 또는 나노바디(nanobody)와 같은, 세포외 표적 생체분자를 고친화성으로 특이 결합하는 면역글로불린 도메인을 포함하는 결합 영역을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 약 24kDa 또는 그 이상의 질량을 가지고, 예를 들어, scFv와 같은, 세포외 표적 생체분자를 고친화성으로 특이 결합하는 면역글로불린 도메인을 포함하는 결합 영역을 포함한다.
[168] 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 약 12kDa 또는 시가 독소 A2 단편 및 B 서브유닛 복합체의 등가 질량을 가진다. 이 크기의 분자 모이어티가 중독된 세포 내의 준세포 경로화 및 리보솜 불활성화의 효율성에 지장을 주지 않으면서 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에 계속하여 부착되어있을 수 있다는 것은 예상 밖이었다.
[169] 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 약 28kDa의 질량을 가진다. 이 크기의 분자 모이어티가 중독된 세포 내의 준세포 경로화 및 리보솜 불활성화의 효율성에 지장을 주지 않으면서 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에 계속하여 부착되어있을 수 있다는 것은 예상 밖이었다; 그러나, 본 명세서의 실시예는 28kDa 분자 모이어티에 융합한, 시가 독소 A1 단편을 포함하는 퓨린-절단 저항성 분자가 눈에 띄는 준세포 경로화, 리보솜 억제, 또는 세포독성을 보이지 않았음을 나타낸다.
[170] 어떤 구체예에서는, 상기 상대적으로 큰 분자 모이어티는 약 39kDa 또는 시가 독소 B 서브유닛 오량체의 등가 질량을 가진다. 이 크기의 분자 모이어티가 중독된 세포 내의 준세포 경로화 및 리보솜 불활성화의 효율성에 지장을 주지 않으면서 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에 계속하여 부착되어있을 수 있다는 것은 예상 밖이었다.
[171] 어떤 구체예에서는, 상기 상대적으로 큰 분자 모이어티는 약 43.2kDa 또는 시가 독소 A2 단편 및 B 서브유닛 오량체의 등가 질량을 가진다. 이 크기의 분자 모이어티가 중독된 세포 내의 준세포 경로화 및 리보솜 불활성화의 효율성에 지장을 주지 않으면서 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에 계속하여 부착되어있을 수 있다는 것은 예상 밖이었다.
[172] 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 분지형(branched)이다. 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 비-단백질성(non-proteinaceous)이다. 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 본 명세서에 기술된 것과 같은 세포독성제 또는 검출 촉진제이다.
[173] 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드의 카르복시-말단을 입체적으로 커버하는다. 본 발명의 목적을 위하여, "입체적으로 커버하는" 또는 "입체적으로 덮은"은 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드의 카르복시 말단 영역에 직접적으로 공유 결합된 모이어티를 말한다. 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드의 카르복시-말단 영역 내의 소수성의 영역이 계속 파묻혀있어 표면이 소포체에서 노출되지 않도록 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드의 카르복시 말단 영역을 입체적으로 덮고, 그렇게 함으로써 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 계속 덮고, 예를 들어, ERAD 머시너리에 의한 인식과 같은, A1 단편-유래 영역의 카르복시 말단의 세포의 인식을 방지한다.
[174] 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드의 카르복시-말단 영역 내의 소수성의 영역이 계속 파묻혀있어 표면이 소포체에서 노출되지 않도록 하는, 시가 독소 A1 단편의 카르복시-말단 영역보다 더 극성(polar)이고 친수성인 폴리펩티드를 포함하고, 그럼으로써 A1 단편 영역의 카르복시 말단을 계속 덮고, 예를 들어, ERAD 머시너리에 의한 인식과 같은, A1 단편-유래 영역의 카르복시 말단의 세포의 인식을 방지한다.
[175] 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 소포체 막에 결합된 막인 최소 하나의 표적 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역을 포함한다.
[176] 어떤 구체예에서는, 상기 분자 모이어티는 최소 하나의 세포외 표적 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역을 포함한다.
C. 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포-표적화 분자
[177] 본 발명의 분자는 모두 붕괴된 퓨린-절단 모티프 및/또는 퓨린-절단 사이트를 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 세포-표적화 분자는 세포-표적 결합 영역과 관련된 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한다. 이는 세포-표적화 분자가 퓨린-절단 저항성, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 시가 독소 A1 단편을 포함하는 야생형, 시가 독소 작동체 폴리펩티드로 교체된 동일한 세포-표적화 분자와 비교하였을 때 프로테아제-절단 저항성이 더 강하다는 것을 뜻한다.
[178] 프로테아제-절단 저항성 분자는 프로테아제-절단에 더 민감한(sensitive) 변종과 비교하였을 때, 척추동물에 투여 후 증가한 체내 반감기를 보일 수 있다. 더 나아가, 독성 요소(toxic component)(예: 독소 작동체 영역)를 포함한 프로테아제-절단 저항성의, 세포-표적화 분자는 부서지는 경향(propensity to break)을 더 가진, 그로 인해 독성 요소를 방출하는, 프로테아제-절단에 더 민감한 변종과 비교하였을 때 감소된 비-특이적(non-specific) 독성을 보일 수 있다.
[179] 본 발명의 세포-표적화 분자는 서로에 연관된 단일 폴리펩티드, 복수의 폴리펩티드, 분지형의 폴리펩티드 구성요소, 및/또는 하나 이상의 비-폴리펩티드 모이어티를 포함할 수 있다.
[180] 본 발명의 세포-표적화 분자의 결합 영역은 표적 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드 영역을 포함한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자의 결합 영역은 세포외 표적 생체분자를 선택적으로 그리고 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 결합 영역은 무작위로 생성된 펩티드 서열, 자연적으로 발생하는 리간드 또는 그의 유도체, 면역글로불린 유래 도메인, 면역글로불린 도메인의 대안으로 인공 합성적으로 가공된 스캐폴드, 및 그와 같은 것들과 같은 하나 이상의 여러 펩티드의 또는 폴리펩티드의 모이어티를 포함할 수 있다.
[181] 당업계에는 리간드, 단일클론성 항체, 가공된 항체 유도체, 및 가공된 항체의 대체(alternatives)와 같은 결합 특징으로 특정 세포 유형에 폴리펩티드를 표적하는데에 유용한 많은 결합 영역이 알려져있다.
[182] 하나의 특정한, 하지만 비제한적인, 측면에 따르면, 본 발명의 분자의 결합 영역은 세포외 표적 생체분자에, 보통 세포 표면 수용체에, 결합 기능성(binding functionality)을 유지하는 자연적으로 발생하는 리간드 또는 그의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 당업계에 알려진 여러 시토카인(cytokines), 성장인자, 및 호르몬은 동족(cognate) 시토카인 수용체, 성장인자 수용체, 또는 호르몬 수용체를 발현하는 특정 세포 유형의 세포표면에 세포-표적화 분자를 표적하는데에 사용할 수 있다. 리간드의 특정 비제한적인 예시는 표피성장인자, 섬유모세포성장인자, 혈관내피성장인자, 인터류킨(예를 들어 IL-2, IL-6, 및 IL-23), 및 B-세포 활성화 인자(BAFF)를 포함한다.
[183] 어떤 다른 구체예에 따르면, 결합 영역은 세포외 표적 생체분자와 결합할 수 있는 인공합성 리간드를 포함한다(Liang S et al., J Mol Med 84: 764-73 (2006); Ahmed S et al., Anal Chem 82: 7533-41 (2010); Kaur K et al., Methods Mol Biol 1248: 239-47 (2015) 참조).
[184] 비제한적인 하나의 특정 측면에 의하면, 결합 영역은 면역글로불린형 결합 영역을 포함할 수 있다. 이 명세서에 명시된 "면역글로불린형 결합 영역"은 항원 또는 항원결정기와 같은 하나 이상의 표적 생체분자와 결합할 수 있는 폴리펩티드 영역을 말한다. 결합 영역은 표적 분자에 결합하는 능력으로 기능적으로 정의할 수 있다. 면역글로불린형 결합 영역은 주로 항체 또는 항체유사구조 (antibody- like structure)으로부터 유도된다; 그러나, 다른 자원으로부터의 대체 스캐폴드는 용어의 범위에 포함되는 것으로 고려된다.
[185] 면역글로불린(Ig) 단백질은 Ig 도메인으로 알려진 구조 도메인(structural domain)을 가지고 있다. Ig 도메인의 길이는 70-110 아미노산 잔기 이내이며, 7 내지 9개의 역평행 베타 가닥이 두 베타 판(sheet)으로 배열되어 샌드위치 같은 구조를 형성하는 특유의 Ig-폴드(fold)를 가지고 있다. Ig 폴드는 샌드위치의 안쪽 면의 소수성의 아미노산 상호작용과 가닥 안의 시스테인 잔기 사이의 고보존 이황화 결합(highly conserved disulfide bond)에 의하여 안정된다(stabilized). Ig 도메인은 변수(IgV 또는 V-세트), 상수(IgC 또는 C-세트) 또는 중간물(IgI 또는 I-세트)일수 있다. 몇몇 Ig 도메인은 항원결정기와 결합하는 항체의 특이성(specificity)에 중요한 상보결정사이트(상보성 결정 영역(CDR))와 연관이 있을 수 있다. Ig-유사 도메인은 비-면역글로불린 단백질에서도 발견되며 이에 근거하여 단백질의 Ig 상과(superfamily)의 개체로 구분된다. 인간유전자 명명법 위원회(The HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC))는 Ig유사 도메인을 가진 군의 개체 목록을 제공한다.
[186] 이 명세서에 명시된 "중쇄 가변(VH) 도메인" 또는 "경쇄 가변(VL) 도메인"은 각각 어느 항체 VH 또는 VL 도메인(예: 인간 VH 또는 VL 도메인) 및 각각에 해당하는 선천항체(native antibody)의 최소 질적인 항원 결합 능력을 유지한 그의 유도체(예: 쥐 근원(native murine)의 VH 또는 VL 도메인으로부터 유도된 인간화된(humanized) VH 또는 VL 도메인)를 뜻한다. VH 또는 VL 도메인은 세 개의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 ABR에 의하여 붕괴된 "프레임 워크(framework)" 영역으로 구성되어있다. 프레임 워크 영역은 항원의 항원결정기와의 특이 결합을 위해 상보성 결정 영역(CDR)을 정렬(align)하는 역할을 한다. 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지, VH 및 VL 도메인 둘 다 다음의 프레임 워크(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR) 영역을 포함한다: FR1, 상보성 결정 영역(CDR)1, FR2, 상보성 결정 영역(CDR)2, FR3, 상보성 결정 영역(CDR)3, 및 FR4. 낙타과(camelid) VHH 단편, 연골어류의 IgNAR, VNAR 단편, 및 그의 유도체에서는, 단일 중쇄 가변 도메인은 동일한 기본 배열을 포함한다: FR1, 상보성 결정 영역(CDR)1, FR2, 상보성 결정 영역(CDR)2, FR3, 상보성 결정 영역(CDR)3, 및 FR4.
[187] 면역글로불린형 결합 영역은 항체 또는 항원-결합 단편의 폴리펩티드 서열일 수 있는데, 이 아미노산 서열은, 예를 들어 분자 가공 또는 라이브러리 스크리닝(library screening)에 의한 선별에 의하여, 천연 항체 또는 비-면역글로불린 단백질의 Ig-유사 도메인의 서열로부터 변형된다. 면역글로불린형 결합 영역의 생성에 있어서 재조합 DNA 기술 및 시험관 내에서의 라이브러리 스크리닝의 관련성 때문에, 항체는 더 작은 크기, 세포 침투(entry), 또는 다른 치료적 개선과 같은 바람직한 특성을 얻도록 재설계될 수 있다. 가능한 변형은 무한하고, 단지 하나의 아미노산을 변화시키는 것을 비롯하여, 예를 들어, 가변 영역의 완전한 재설계도 가능하다. 일반적으로, 가변 영역의 변화는 항원-결합의 특징 향상, 가변 영역의 안정도를 향상시키고, 또는 면역성 반응의 잠재성(potential)을 감소시키도록 행해질 수 있다.
[188] 본 발명의 분자의 구성요소로 고려되는, 예를 들어 본 발명의 세포-표적화 분자와 같은, 수많은 면역글로불린-유형 결합 영역들이 있다. 면역글로불린 결합 영역은 일반적으로 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 어떤 구체예에서는, 면역글로불린형 결합 영역은 세포외 표적 생체분자와 결합할 수 있는 항체 파라토프(paratope)와 같은 면역글로불린 결합 영역으로부터 유도된다. 어떤 다른 구체예에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역은 어떤 면역글로불린 도메인으로부터 유도되지 않았지만, 세포외 표적 생체분자에 고친화성 결합을 제공함으로써 면역글로불린 결합 영역과 같은 기능을 갖는 가공된 폴리펩티드를 포함한다. 이 가공된 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 면역글로불린으로부터의 상보 결정 영역을 포함하거나 그 영역만으로 구성되는 폴리펩티드 스캐폴드를 선택적으로 포함할 수 있다.
[189] 고친화성 결합 특성을 통하여 특정 세포 유형에 폴리펩티드를 표적화하는데 유용한 수많은 결합 영역이 종래 기술에 존재한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질의 결합 영역은 다음으로부터 이루어진 군으로부터 선택된다: 단일-도메인 항체 도메인(sdAbs), 나노바디, 낙타과로부터 유도된 중쇄 항체 도메인(VHH 단편), 2가 나노바디, 연골어류로부터 유도된 중쇄 항체 도메인, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), VNAR 단편, 단쇄 가변성(scFv) 단편, 다량체화 scFv 단편(이중체, 삼중체, 사중체), 2특이 탄뎀 scFv 단편, 이황화 안정화된(stabilized) 항체 가변성(Fv) 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 이황화 안정화된 항원-결합(Fab) 단편, 2가 F(ab´)2 단편, 중쇄 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 단쇄 Fv-CH3 미니체, 이중특이성의 미니체, 이량체 CH2 도메인 단편(CH2D), Fe 항원 결합 도메인(Fcabs), 분리된 상보결정 영역 3(상보성 결정 영역(CDR)3) 단편, 제한된 프레임 워크(framework) 영역 3, 상보성 결정 영역(CDR)3, 프레임 워크 영역 4(FR3-상보성 결정 영역(CDR)3-FR4) 폴리펩티드, 작은 조절 면역 약물(SMIP) 도메인, 및 모든 파라토프와 결합 기능을 유지하는 상기 물질의 유전자 조작된 대응물(Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012) 참조).
[190] 어떤 다른 구체예에 따라서, 결합 영역은 표적 생체분자의 고친화성 및 특이적 결합, 및 더 높은 안정도 또는 감소된 면역원성과 같은, 개선된 특징의 가공을 가능하게 하는 것과 같은 유사한 기능적 특징을 보이는, 면역글로불린 도메인의 대안으로 가공된 스캐폴드를 포함한다. 본 발명의 단백질의 특정 구체예에서는, 결합 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 가공된 아르마딜로 반복 폴리펩티드(ArmRPs), 가공된 피브로넥틴-유래 10th 피브로넥틴 타입Ⅲ(10Fn3) 도메인(모노체, AdNectins™, 또는 AdNexins™); 가공된 테나신-유래 테나신 타입Ⅲ 도메인(Centryns™); 가공된 안키린 반복 모티프(motif) 함유 폴리펩티드(DARPins™); 가공된 저밀도-지질단백질-수용체-유래, A 도메인(LDLR-A)(Avimers™); 리포칼린(안티칼린); 가공된 단백질 가수분해 효소 억제제-유래, 쿠니츠 도메인; 가공된 단백질-A-유래, Z 도메인(Affibodies™); 가공된 감마-B 결정체-유래 스캐폴드 또는 가공된 유비퀴틴-유래 스캐폴드(Affilins); Sac7d-유래 폴리펩티드(Nanffitins® 또는 affitins); 가공된 Fyn-유래 SH2 도메인(Fynomers®); 및 가공된 항체 모방체 및 결합 기능을 유지하는 상기 물질의 유전자 조작된 대응물(Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011); Alfarano P et al., Protein Sci 21: 1298-314 (2012); Madhurantakam C et al., Protein Sci 21: 1015-28 (2012); Varadamsetty G et al., J Mol Biol 424: 68-87 (2012)).
[191] 본 발명의 어떤 구체예중에서는, 면역글로불린형 결합 영역은 나노바디 또는 단일 도메인 면역글로불린-유래 영역 VHH으로부터 유도되었다. 일반적으로, 나노바디는 낙타과 및 연골 어류(연골어강)에서 찾을 수 있는 자연적으로 발생하는 단일, 단량체 가변 도메인 항체(sdAbs)의 단편으로 구성된다. 나노바디는 이러한 자연적으로 발생하는 항체에서 단일, 단량체 가변 도메인을 절단하여, 예를 들어 IgNAR, VHH, 및 VNAR 구성체와 같은, 더 작고 안정적인 분자를 만드는 것으로 가공된다. 작은 크기 때문에, 나노바디는 항체 전체(whole)가 접근할 수 없는 항원과 결합할 수 있다.
[192] 앞서 기술된 모든 결합 영역은 세포외 표적 생체분자를 향하여 10-5 내지 10-12moles/ℓ의 해리 상수, 바람직하게는 200nM 미만의 해리 상수를 갖는 한 본 발명의 구성요소로 사용될 수 있다.
[193] 세포-특이 표적은 본 발명의 분자를, 예를 들어, 리포솜, 폴리머, 나노담체(nanocarriers), 마이크로스피어, 나노스피어, 덴드리머, 중합의 미셀(polymeric micelles), 예를 들어 나노튜브, 나노로드(nanorods) 및 나노뿔(nanohorns), 자성의 나노입자, 마이크로 에멀젼, 및 그 외 나노구조와 같은 실리콘 또는 탄소 물질과 같은, 세포 표적 담체에 부착하는 것으로 실행될 수 있다(Sinha R et al., Molecular Cancer Therapeutics 5: 1909-17 (2006); L Brinton et al., Journal of the National Cancer Institute 100: 1643-8 (2008); Tanaka T et al., Biomed Micro Devices 11: 49-63 (2009)). 부착은 공유 결합 및/또는 피막화(encapsulation)를 사용하여 실행될 수 있다.
세포외 표적 생체분자
[194] 본 발명의 결합 영역은 세포외 표적 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는, 바람직하게는 암세포, 종양세포, 형질세포, 감염세포 또는 세포내 병원균을 번식하는 숙주세포와 같은 문제세포의 표면에 물리적으로 결합된 폴리펩티드 영역을 포함한다.
[195] "표적 생체분자"는 생물학적 분자를 의미하는 것으로, 흔히 단백질 또는 당화와 같은 번역 후 변형(post-translational modification)에 의하여 변형된 단백질이고, 이들은 단백질을 유기체 내에서 특이 세포 유형 또는 위치에 표적화하기 위하여 결합 영역에 의해 결합 될 수 있다. 세포외 표적 생체분자는 변형되지 않은 폴리펩티드, 생화학적 기능기를 부가시켜 변형된 폴리펩티드, 및 당지질을 포함한 다양한 항원결정기를 포함한다(U.S. 특허 5,091,178; EP 2431743). 세포외 생체분자가 내부에서 내재화되거나 또는 본 발명의 분자와 상호작용할 때 내재화가 쉽게 발생하도록 만드는 것이 바람직하다.
[196] 본 발명의 목적을 위하여, 표적 생체분자를 변형하는 것과 관련한 "세포외"는 세포외 환경에 노출된 그 구조의 최소한 일부를 갖는 생체분자를 의미한다. 세포외 표적 생체분자는 세포 막 구성요소, 막횡단 나선형 단백질, 세포 막-결합 생체분자, 세포-표면-결합 생체분자, 및 분비된 생체분자를 포함한다.
[197] 본 발명에 관해서, 표적 생체분자를 설명할 때 쓰이는 "물리적인 결합"은, 표적 생체분자 및 세포 사이의 복수의 비공유 상호작용과 같은, 표적 생체분자와, 또는 그 일부를, 세포의 외부에 연결하는, 공유 및/또는 비공유 분자간 상호작용 양쪽 다 뜻하며, 각각의 단일 상호작용의 에너지는 대략 1-5 킬로칼로리이다(예: 정전결합, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 힘(hydrophobic forces), 등). 모든 필수적인 막 단백질(membrane protein)은 세포막뿐만 아니라 부수적인 막 단백질에도 물리적으로 결합돼 있다. 예를 들어, 세포외 표적 생체분자는 막횡단 영역(transmembrane spanning region), 지질 앵커(lipid anchor), 당지질 앵커, 및/또는 상기 전술된 것들에 포함된 요소와 비공유적으로 관련(예: 비-특이적(non-specific) 소수성 상호작용 및/또는 지질 결합 상호작용을 통해)되는 것을 포함할 수 있다.
[198] 본 발명의 단백질의 결합 영역은 표적 생체분자의 세포 유형 특이 발현 및/또는 특이 세포 유형에 있어 표적 생체분자의 물리적 국소화와 같은 여러 가지 기준에 따라 설계 또는 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 어떤 세포-표적화 분자는 오로지 단 하나의 세포 유형에 의해 발현하는 세포-표면 표적을 세포 표면에 결합시킬 수 있는 결합 도메인을 포함한다. 이것은 세포외 표적 생체분자를 발현하지 않는“방관자(bystander)”세포 유형보다 높은 우선권(preferentiality)을 가진 특정 세포 유형의 표적화된 세포-사멸을 허용한다(최소 3배의 세포독성 효과). 또는, 결합 영역의 표적 생체분자의 발현은, 세포외 표적 생체분자가 충분히 낮은 양으로 발현 그리고/또는 작은 양으로 표적이 아닌 세포 유형과 물리적으로 결합한다면, 하나의 세포 유형에 제한되지 않을 수 있다. 이는 많은 양의 세포외 표적 생체분자를 발현하지 않거나 많은 양의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 "방관자" 세포 유형보다, 높은 우선권을 가진 특정 세포 유형의 표적된 세포-사멸을 허용한다(최소 3배의 세포독성 효과). 표적화된 세포는 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자를, 예를 들어, 체외, 시험관 내 배양, 또는 다세포 생물 내의 선천적인(native) 원위치에 있는 세포를 포함한, 체내와 같은, 세포의 여러 조건 아래에서 사용하여 사멸할 수 있다.
[199] 본 발명의 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자는 암세포, 면역세포, 및 바이러스, 박테리아, 곰팡이류, 프리온, 또는 원충(protozoans)과 같은 세포내병원체에 감염된 세포에 비례 이상으로(over-proportionately) 또는 배타적으로 존재하는 생물 표지자(biomarkers)를 포함할 수 있다.
[200] 본 발명의 세포-표적화 분자의 일반적인 구조는 모듈러식으로, 여러 가지, 다양한 결합 영역을 동일한 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드와 함께 사용하는 것으로 다양한 세포외 표적 생체분자를 표적할 수 있게 제공하며, 이는 따라서 세포독성, 세포증식억제, 및/또는 다양한 세포 유형에 외인성 물질 전달을 표적할 수 있게 한다. 세포독성이 없는 프로테아제 절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 그럼에도 세포 내로, 어떤 준세포 결실로 외인성 물질을 전달, 및/또는 시토졸으로의 효율적인 준세포 경로화를 제공하는데 유용할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 세포-표적화 분자는 KDEL과 같은, 카르복시-말단 소포체 잔류/회수 신호 모티프를 더 포함할 수 있다.
D. KDEL군의 개체의 소포체 잔류/회수 신호 모티프
[201] 본 발명의 목적을 위하여, "소포체 잔류/회복 신호 모티프", KDEL형 신호 모티프(SEQ ID NO: 62), 또는 신호 모티프는 진핵세포 안에서 KDEL 수용체(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')를 통해서 소포체로의 단백질의 준세포 국소화(localization)를 촉진하기 위해 기능하는 KDEL군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 개체를 말한다.
[202] 카르복시-말단 라이신-아스파라긴-글루탐산염-류신(lysine-asparagine -glutamate-leucine)(KDEL(SEQ ID NO: 62)) 서열은 진핵세포의 용해성 단백질(soluble proteins)을 위한 정식(canonical), 소포체 잔류 및 회복 신호 모티프이며 KDEL 수용체(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')에 의해 인식(recognized)된다(Capitani M, Sallese M, FEBS Lett 583: 3863-71 (2009) 참조). 신호 모티프의 KDEL군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')은 HDEL(SEQ ID NO: 64), RDEL(SEQ ID NO: 66), WDEL(SEQ ID NO: 67), YDEL(SEQ ID NO: 68), HEEL(SEQ ID NO: 70), KEEL(SEQ ID NO: 71), REEL(SEQ ID NO: 72), KFEL(SEQ ID NO: 75), KIEL(SEQ ID NO: 87), DKEL(SEQ ID NO: 88), KKEL(SEQ ID NO: 91), HNEL(SEQ ID NO: 95), HTEL(SEQ ID NO: 96), KTEL(SEQ ID NO: 97), 및 HVEL(SEQ ID NO: 98)과 같은 KDEL-유사 모티프를 포함하며, 이는 모두 다수의 계통 발생계(phylogenetic kingdoms)의 생물들의 소포체의 루멘(lumen)에 자리하는 것으로 알려진 단백질의 카르복시-말단에서 발견된다(Munro S, Pelham H, Cell 48: 899-907 (1987); Raykhel I et al, J Cell Biol 179: 1193-204 (2007) 참조). KDEL 신호 모티프군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')은 합성 구성(synthetic construct) 사용을 보인 최소 46가지 폴리펩티드 변종을 포함한다(Raykhel, J Cell Biol 179: 1193-204 (2007)). 추가의 KDEL(SEQ ID NO: 62) 신호 모티프는 ALEDEL(SEQ ID NO: 109), HAEDEL(SEQ ID NO: 110), HLEDEL(SEQ ID NO: 111), KLEDEL(SEQ ID NO: 112), IRSDEL(SEQ ID NO: 113), ERSTEL(SEQ ID NO: 114), 및 RPSTEL(SEQ ID NO: 115)을 포함한다(Alanen H et al., J Mol Biol 409: 291-7 (2011)). KDEL 신호 모티프(SEQ ID NO: 62)의 대부분을 대표하는 것으로 일반적인 공통(generalized consensus) 모티프는 [KRHQSA]-[DENQ]-E-L(SEQ ID NO: 116)으로 기술된다(Hulo N et al., Nucleic Acids Res 34: D227-30 (2006)).
[203] KDEL군의 신호 모티프(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')를 함유한 단백질은 골지복합체 전체에 널리 분포된 KDEL 수용체(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')에 결속되어 소포체의 루멘 안에 방출을 위하여 미세관-의존 메커니즘(microtubule-dependent mechanism)으로 소포체까지 수송된다(Griffiths G et al., J Cell Biol 127: 1557- 74 (1994); Miesenbock G, Rothman J, J Cell Biol 129: 309-19 (1995)). KDEL 수용체(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')는 골지복합체 및 소포체 사이를 활발하게 순환한다(Jackson M et al., EMBO J 9: 3153-62 (1990); Schutze M et al., EMBO J. 13: 1696-1705 (1994)).
[204] 본 발명의 목적을 위하여, KDEL군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 개체는 진핵세포 안에서 KDEL 수용체(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')를 통해 소포체로의 단백질의 준세포 국소화를 촉진하기 위해 기능하는 합성 신호 모티프를 포함한다. 다시 말해, KDEL군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 몇 개체는 자연적으로 발생하지 않거나 아직 자연에서 발견되지 않았지만 당업계에서 알려진 방법을 사용해 만들어졌거나 만들 수 있고, 실증적으로 입증할 수 있다(예: Raykhel I et al., J Cell Biol 179: 1193-204 (2007) 참조).
[205] 본 발명의 어떤 구체예의 구성요소로서, KDEL형 신호 모티프는 폴리펩티드 또는 단백질 구성요소의 카르복시-말단에 있도록 분자 내에서 물리적으로 배치, 배향(oriented), 또는 배열되었다.
[206] 본 발명의 세포-표적화 분자의 목적을 위하여, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 세포-표적 결합 영역 서로에 관하여, 또는 단백질 전체의 N-말단 및 C-말단에 있어 특정 순서 또는 방향(orientation)은 고정되어있지 않다(도 1 참조). 본 발명의 세포-표적화 분자에서는, 결합 영역과 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역, 및 있는 경우, 분자 모이어티는 서로 직접적으로 연결되거나/또는 당업계에 널리 알려진 하나 이상의 링커(linkers)로 적합하게 연결될 수 있다.
E. 본 발명의 분자의 구성요소를 연결하는 연쇄(linkages)
[207] 본 발명의 각각의 분자 모이어티 및 폴리펩티드 및/또는 단백질 구성요소는, 예를 들어 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역(세포독성이거나 그리고/또는 촉매 활성 및/또는 세포독성을 변형, 감소, 또는 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 가졌을 수 있는)은, 당업계에 널리 알려진 그리고/또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 링커를 통해 서로에게 적합하게 연결될 수 있다. 결합 영역의 각각의 폴리펩티드 서브컴포넌트는, 예를 들어 상보성 결정 영역(CDR), ABR, VHH 영역, 중쇄 가변 영역(VH), 경쇄 가변 영역(VL), IgNAR 영역, 및/또는 VNAR 영역은, 당업계에 널리 알려진 그리고/또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 링커를 통해 서로에게 적합하게 연결될 수 있다(Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv 27: 502-20 (2009); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조). 본 발명의 단백질 및 폴리펩티드 구성요소는, 예를 들어 다연쇄 결합 영역은, 당업계에 널리 알려진 그리고/또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 링커를 통해 서로에게, 또는 본 발명의 다른 폴리펩티드 구성 요소, 및/또는 분자 모이어티에 연결될 수 있다. 본 발명의 펩티드 구성요소는, 예를 들어 KDEL군의 소포체 잔류/회복 신호 모티프(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')는, 당업계에 널리 알려진 하나 이상의 단백질성 링커(proteinaceous linker)와 같은 링커를 통해 본 발명의 다른 구성요소에 연결될 수 있다.
[208] 적합한 링커는 보통 각각의 본 발명의 폴리펩티드 구성요소가 링커나 다른 요소 없이 개별적으로 생산된 폴리펩티드 구성요소와 아주 유사한 3차원 구조와 폴드(fold)하는 것을 허용하는 것이다. 적합한 링커는 단일 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 및 분지형이나 고리형의 여러 비-단백질성 탄소사슬과 같은 상기 전술한 것들이 없는 링커를 포함한다(예: Alley S et al., Bioconjug Chem 19: 759-65 (2008) Ducry L, Stump B, Bioconjug Chem 21: 5-13 (2010); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조).
[209] 접합한 링커는 단백질성일 수 있으며 하나 이상의 아미노산, 펩티드, 및/또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 단백질성 링커는 재조합 융합 단백질 및 화학적으로 연결된 결합체 모두에 적합하다. 단백질성 링커는 보통 약 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 가지고 있다(예: 약 5 내지 30개 또는 약 6 내지 25개의 아미노산 잔기). 선택된 링커의 길이는 선택한 링커의 바람직한 성질 또는 성질들과 같은 다양한 요인에 의해 결정된다(예: Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조).
[210] 적합한 링커는 화학적 링커와 같이 비-단백질성일 수 있다(예: Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Feld J et al., Oncotarget 4: 397- 412 (2013) 참조). 당업계에 알려진 여러 비-단백질성 링커는, 면역글로불린 폴리펩티드를 이형 폴리펩티드(heterologous polypeptides)를 연결하는데에 흔히 사용되는 링커와 같이, 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 20 킬로돌턴(kiloDaltons)보다 큰 분자 모이어티를 연결하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 분자의 폴리펩티드 구성요소는 카르복시, 아민, 설프하이드릴기(sulfhydryl), 카르복실산, 카르보닐기, 히드록실기, 및/또는 고리형 군(cyclic ring group)과 같은 그의 아미노산 잔기 및 탄수화물 모이어티의 기능성 곁사슬을 이용하여 연결할 수 있다. 예를 들어, 이황결합 및 티오에테르결합 모두 두 개 이상의 폴리펩티드를 연결하는데에 사용할 수 있다(예: Fitzgerald D et al., Bioconjugate Chem 1: 264-8 (1990); Pasqualucci L et al., Haematologica 80: 546-56 (1995) 참조). 더불어, 비-천연 아미노산 잔기는 케톤계(ketone group)와 같은 다른 기능성 곁사슬과 함께 사용할 수 있다(예: Axup J et al., Proc Natl Acad Sci USA 109: 16101-6 (2012); Sun S et al., Chembiochem Jul 18 (2014); Tian F et al., Proc Natl Acad Sci USA 111: 1766-71 (2014) 참조). 비-단백질성 화학적 링커의 비제한적인 예는 N-석신이미딜(4-아이오댁틸)-아미노벤조에이트(N-succinimidyl(4-iodoacetyl)- aminobenzoate), S-(N-석신이미딜)티오아세테이트(S-(N-succinimidyl) thioacetate)(SATA), N-석신이미딜-옥시카보닐-cu-메틸-α-(2-파이리딜디티오)톨루엔(N-succinimidyl-oxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene)(SMPT), N-석신이미딜4-(2-파이리딜디티오)-펜타노에이트(N-succinimidyl4-(2-pyridyldithio)-pentanoate)(SPP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산 카르복시산염(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane carboxylate)(SMCC 또는 MCC), 설포석신이미딜(4-아이오댁틸)-아미노벤조이트(sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoate), 4-석신이미딜-옥시카보닐-α-(2-파이리딜디티오) 톨루엔(4-succinimidyl-oxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio) toluene), 설포석신이미딜-6-(α-메틸-α-(파이리딜디티올)-톨루미도) 헥사노에이트(sulfosuccinimidyl-6-(α-methyl-α-(pyridyldithiol)-toluamido) hexanoate), N-석신이미딜-3-(-2-파이리딜디티오)-프로프리오네이트(N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-proprionate)(SPDP), 석신이미딜 6(3(-(-2-파이리딜디티오)-프로프리오나미도) 헥사노에트(succinimidyl 6(3(-(-2-pyridyldithio)-proprionamido) hexanoate), 설포석신이미딜 6(3(-(-2-파이리딜디티오)-프로피오나미도) 헥사노에이트(sulfosuccinimidyl 6(3(-(-2-pyridyldithio)-propionamido) hexanoate), 말레이미도카프로일(maleimidocaproyl)(MC), 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐(maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl)(MC-vc-PAB), 3-말레이미도벤조익산 N-하이드록시석시미드 에스테르(3-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester)(MBS), 알파-알킬 유도체(alpha-alkyl derivatives), 설포NHS-ATMBA(설포석신이미딜 N-[3-(아세틸티오)-3-메틸부티릴-베타-알라닌(sulfoNHS-ATMBA(sulfosuccinimidyl N-[3-(acetylthio)-3-methylbutyryl-beta-alanine])), 설포다이콜로르페놀(sulfodicholorphenol), 2-이미노티올레인(2-iminothiolane), 3-(2-파이리딜디티오)-프로피오닐 하이드라지드(3-(2-pyridyldithio)-propionyl hydrazide), 엘만 시약, 다이클로로트리아지닉산(dichlorotriazinic acid), 및 S-(2-티오피리딜)-L-시스테인(S-(2-thiopyridyl)-L-cysteine)을 포함한다(예: Thorpe P et al., Eur J Biochem 147: 197-206 (1985); Thorpe P et al., Cancer Res 47: 5924-31 (1987); Thorpe P et al., Cancer Res 48: 6396-403 (1988); Grossbard M et al., Blood 79: 576-85 (1992); Lui C et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 8618-23 (1996); Doronina S et al., Nat Biotechnol 21: 778-84 (2003); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412 (2013) 참조).
[211] 적합한 링커는, 단백질성이든 비-단백질성이든, 단백질 가수분해 효소 민감성(sensitive), 환경 산화환원전위(environmental redox potential) 민감성, pH 민감성, 산으로 절단 가능(acid cleavable), 빛으로 절단 가능(photocleavable), 및/또는 열 민감성 링커를 포함할 수 있다(예: Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412(2013) 참조).
[212] 단백질성 링커는 본 발명의 재조합 융합 단백질과 혼합하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 구성요소 또는 그의 서브컴포넌트는 하나 이상의 아미노산, 펩티드, 및 또는 폴리펩티드를 포함한 하나 이상의 링커로 연결될 수 있다. 본 발명의 재조합 융합 단백질에서는, 링커는 일반적으로 약 2 내지 50개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 5 내지 30개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다(Argos P, J Mol Biol 211: 943-58 (1990); Williamson M, Biochem J 297: 240-60 (1994); George R, Heringa J, Protein Eng 15: 871-9 (2002); Kreitman R, AAPS J 8: E532-51 (2006)). 일반적으로, 단백질성 링커는, 예를 들어 트레오닌, 프롤린, 글루타민, 글라이신, 및 알라닌과 같은, 극성(polar), 무전하(uncharged), 및/또는 하전 잔기가 아미노산 잔기 대부분을 구성한다(예: Huston J et al. Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988); Pastan I et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Li J et al., Cell Immunol 118: 85-99 (1989); Cumber A et al. Bioconj Chem 3: 397- 401 (1992); Friedman P et al., Cancer Res 53: 334-9 (1993); Whitlow M et al., Protein Engineering 6: 989-95 (1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84 (1994); Newton et al. Biochemistry 35: 545-53 (1996); Ladurner et al. J Mol Biol 273: 330-7 (1997); Kreitman R et al., Leuk Lymphoma 52: 82-6 (2011); U.S. 4,894,443 참조). 단백질성 링커의 비제한적인 예는 알라닌-세린-글라이신-글라이신-프롤린-글루탐산염(ASGGPE)(SEQ ID NO: 117), 발린-메티오닌(VM), 알라닌-메티오닌(AM), AM(G2에서 4S)XAM(SEQ ID NO: 118)(G는 글라이신, S는 세린, 그리고 x는 1에서 10까지의 정수)을 포함한다.
[213] 단백질성 링커는 바람직한 성질에 따라 선택할 수 있다. 단백질성 링커는, 하나 이상희 융합분자의 폴딩(folding), 안정도, 발현, 용해도, 약동학적인 성질, 약역학적인 성질, 및/또는 융합 구조에 있어 융합되지 않은 동일한 도메인의 활동과 비교했을 때의 융합된 도메인의 활동을 최적화하는 것과 같은, 특정 기능을 원하는 숙련자에게 선택될 수 있다. 예를 들어, 단백질성 링커는 유연성, 경직성, 및/또는 절단 가능 여부(cleavability)에 따라 선택할 수 있다(예: Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조). 숙련자는 링커를 선택할 때 데이터베이스 및 링커 디자인 소프트웨어 도구를 사용할 수 있다. 특정 링커는 발현을 최적화하기 위해 선택될 수 있다(예: Turner D et al., J Immunol Methods 205: 43-54 (1997) 참조). 특정 링커는 동질다합체(homomultimers)를 형성하기 위해 동일한 폴리펩티드 또는 단백질 사이의, 또는 이질다합체(heteromultimers)를 형성하기 위해 다른 폴리펩티드 또는 단백질 사이의 상호작용을 촉진하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 단백질성 링커는 이량체(dimer) 및 더 고차(higher order)의 폴리머 형성에 관련된 상호작용과 같이, 본 발명의 분자의 폴리펩티드 구성요소 사이의 원하는 비-공유 상호작용(non-covalent interactions)을 허용하기 위해 선택될 수 있다(예: U.S. 4,946,778 참조).
[214] 유연한(flexible) 단백질성 링커는 흔히 12개의 아미노산 잔기보다 더 길며, 예를 들어 글라이신, 세린, 및 트레오닌과 같은, 작은, 비극성 아미노산 잔기, 극성 아미노산 잔기, 및/또는 친수성 아미노산 잔기가 풍부하다(예: Bird R et al., Science 242: 423-6 (1988); Friedman P et al., Cancer Res 53: 334-9 (1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84 (1994) 참조). 유연한 단백질성 링커는 구성요소들 사이의 분리 공간(spatial separation)을 늘리기 위해 그리고/또는 구성요소들 사이에 분자내(intramolecular) 상호작용을 허용하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 여러 "GS" 링커는 숙련된 숙련자에게 알려져 있으며 다수의 글라이신 및/또는 하나 이상의 세린, 때로는, 예를 들어 (GxS)n(SEQ ID NO: 119), (SxG)n(SEQ ID NO: 120), (GGGGS)n(SEQ ID NO: 121), 및 (G)n(SEQ ID NO: 122)와 같은, 반복되는 유닛으로 구성되어있고, 상기 x는 1 내지 6이고 n은 1 내지 30이다(예: WO 96/06641 참조). 유연한 단백질성의 링커의 비제한적인 예로는 GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO: 123), GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO: 124), GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO: 125), GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO: 126), EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO: 127), SRSSG(SEQ ID NO: 128), 및 SGSSC(SEQ ID NO: 129)가 있다.
[215] 경직된(rigid) 단백질성 링커는 흔히 뻣뻣한(stiff) 알파-나선형(alpha-helical) 구조물이며 프롤린 잔기 및/또는 하나 이상의 전략적으로 배치된(strategically placed) 프롤린이 풍부하다(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조). 경직된 링커는 구성요소들 사이의 분자내 상호작용을 방지하기 위해 선택될 수 있다.
[216] 적합한 링커는, 예를 들어 절단 및/또는 환경-특이 불안정과 같은 이유로, 체내에서 구성요소 분리를 허용하기 위하여 선택될 수 있다(Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조). 체내에서 절단 가능한 단백질성 링커는 유기체 내의 특정 사이트 또는 특정 세포 유형 내에서 단백질분해 과정을 통해서 그리고/또는 환원 환경(reducing environment)에 의해 결합을 푸는 것이 가능하다(예: Doronina S et al., Bioconjug Chem 17: 144-24 (2006); Erickson H et al., Cancer Res 66: 4426-33 (2006) 참조). 체내에서 절단 가능한 단백질성 링커는 흔히 단백질 가수분해 효소 민감성 모티프 및/또는 하나 이상의 시스테인 쌍(pair)이 형성한 이황화 결합을 포함한다(예: Pietersz G et al., Cancer Res 48: 4469-76 (1998); The J et al., J Immunol Methods 110: 101-9 (1998); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조). 체내에서 절단 가능한 단백질성 링커는 유기체 내의, 또는 세포 내 결실의 특정 위치에만 존재하는 단백질 가수분해 효소에 반응하게, 그리고/또는 특정 생리적인 또는 병리학적인 조건에서만 활성화 되도록(예를 들어, 비정상적으로 높은 수치를 가진 단백질 가수분해 효소, 특정 질병 사이트에서 이상발현한(overexpressed) 단백질 가수분해 효소, 및 병원성 미생물에 특이 발현한 단백질 가수분해 효소) 설계될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 알려진 단백질성 링커 중에는 세포 내에만 존재하는 단백질 가수분해 효소, 특정 세포 유형에만 존재하는 단백질 가수분해 효소, 및 암 또는 염증과 같은 병리학적인 조건에서만 존재하는 단백질 가수분해 효소에 의해 절단된 링커도 있는데, 예로는 R-x-x-R 모티프 및 AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(SEQ ID NO: 116)가 있다.
[217] 본 발명의 분자의 어떤 구체예에서는, 하나 이상의 단백질분해요소 민감성 부분을 포함한 링커는 표적 세포 내에 있는 단백질 가수분해 효소에 의한 절단을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 분자의 어떤 구체예에서는, 절단할 수 없는 링커는 척추동물에 투여 후 원치않는 독성효과를 감소시키기 위해 사용될 수 있다(예: Polson A et al., Cancer Res 69: 2358-64 (2009) 참조).
[218] 적합한 링커는 단백질성이든 비-단백질성이든, 단백질 가수분해 효소 민감성, 환경 산화환원 전위 민감성, pH 민감성, 산으로 절단 가능, 빛으로 절단 가능, 및/또는 열 민감성 링커를 포함할 수 있다(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조).
[219] 적합한 절단 가능 링커는 다음과 같은 당업계에 알려진 절단 가능한 군을 포함한 링커를 포함한다: Zarling D et al., J Immunol 124: 913-20 (1980); Jung S, Moroi M, Biochem Biophys Acta 761: 152-62 (1983); Bouizar Z et al., Eur J Biochem 155: 141-7 (1986); Park L et al., J Biol Chem 261: 205-10 (1986); Browning J, Ribolini A, J Immunol 143: 1859-67(1989); Joshi S, Burrows R, J Biol Chem 265: 14518-25 (1990)에 언급된 링커.
[220] 적합한 링커는 pH 민감성 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 어떤 링커는, 표적 세포의 준세포 내 구획 안에서의 해리(dissociation)를 위해 낮은 pH 환경에서의 그의 불안정도(instability) 때문에 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 트리틸기, 유도된(derivatized) 트리틸기, 비스말레이미디오톡시 프로판기(bismaleimideothoxy propane groups), 아디픽산 디하이드라자이드기(adipic acid dihydrazide groups), 및/또는 산 분해성 트랜스페린기(acid labile transferrin groups)를 포함한 링커는 본 발명의 구성요소의(예: 특정 pH 범위의 환경에 있는 폴리펩티드 요소) 유리(release)가 가능하게 할 수도 있다(Welhoner H et al., J Biol Chem 266: 4309-14 (1991); Fattom A et al., Infect Immun 60: 584-9 (1992) 참조). 선택될 수 있는 어떤 링커는, 종양 조직의 pH가 건강한 조직의 pH보다 낮은 것과 같은, 세포조직 간의 생리학적인 pH 차이와 일치하는 pH 범위에서 절단된 것 일수도 있다(예: U.S. 5,612,474 참조).
[221] 빛으로 절단 가능한 링커는 가시거리 내의 빛과 같이 특정 파장 범위 내의 전자기 방사선 노출에 의하여 절단된 링커이다(Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992) 참조). 빛으로 절단 가능한 링커는 특정 파장 범위 내의 빛에 노출시켜 폴리펩티드 요소와 같은 본 발명의 분자의 구성요소 유리에 사용될 수 있다. 빛으로 절단 가능한 링커의 비제한적인 예는 시스테인을 위한 빛 절단 가능 보호원자단(photocleavable protective group)으로서의 나이트로벤질기, 나이트로벤질옥시카보닐 염화물 교차-링커(cross-linkers), 하이드록시프로필메타크릴아마이드 공중합체(hydroxypropylmethacrylamide copolymer), 글라이신 공중합체, 플루오레세인 공중합체, 및 메틸로다민 공중합체(methylrhodamine copolymer)를 포함한다(Hazum E et al., Pept Proc Eur Pept Symp, 16th, Brunfeldt K, ed., 105-110 (1981); Senter et al., Photochem Photobiol 42: 231-7 (1985); Yen et al., Makromol Chem 190: 69-82 (1989); Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992) 참조). 빛으로 절단 가능한 링커는 광섬유를 사용해 빛에 노출 가능한 질병, 장애, 및 증상 치료를 위해 설계된 본 발명의 분자의 형성을 위해 구성요소를 연결하는 특정한 사용법을 갖고있을 수 있다.
[222] 본 발명의 분자의 어떤 구체예에서는, 세포-표적화 모이어티는, 예를 들어 결합 영역은, 공유 및 비공유 연쇄(covalent and noncovalent linkages)를 포함한 숙련자에게 알려진 많은 방법으로 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역에 연결되어있다(예: Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Behrens C, Liu B, MAbs 6: 46-53 (2014) 참조).
[223] 본 발명의 분자의 어떤 구체예에서는, 상기 분자는 중쇄 가변(heavy chain variable (VH)) 도메인 및 경쇄 가변(light chain variable (VL)) 도메인을 연결하는 링커를 가진 scFv인 세포-표적 결합 영역을 포함한다. 당업계에는 15-잔기 (Gly4Ser)3 펩티드(SEQ ID NO: 130)와 같은 이 용도를 위한 여러 링커가 알려져 있다. 비-공유 다가 구조(multivalent structures)를 생성하는데에 적합한 scFv 링커는 GGS, GGGS(Gly3Ser 또는 G3S)(SEQ ID NO: 131), GGGGS(Gly4Ser 또는 G4S)(SEQ ID NO: 132), GGGGSGGG(SEQ ID NO: 133), GGSGGGG(SEQ ID NO: 134), GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO: 135), 및 GSTSGSGKPGSSEGSTKG(SEQ ID NO: 136)를 포함한다(Pluckthun A, Pack P, Immunolechnology 3: 83- 105 (1997); Atwell J et al., Protein Eng 12: 597-604 (1999); Wu A et al., Protein Eng 14: 1025-33 (2001); Yazaki P et al., J Immunol Methods 253: 195-208 (2001); Carmichael J et al., J Mol Biol 326: 341 -51 (2003): Arndt M et al., FEBS Lett 578: 257-61 (2004); Bie C et al., World J Hepatol 2: 185-91 (2010)).
[224] 본 발명의 분자의 구성요소의 연쇄는, 부착이(attachment) 본 명세서에 기술된 분석을 포함한 적절한 분석으로 측정된 분자의 세포 내재화, 및/또는 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 바람직한 독소 작동체 기능을 크게 저해하지 않는다면, 이러한 것을 할 수 있는 현재 당업계에 알려진 방법에 의한 것일 수 있다.
[225] 본 발명의 세포-표적화 분자의 목적을 위하여, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역 및 결합 영역의 특정순서 또는 배향(orientation)은, 명확히 그 반대를 명시하지 않는 이상, 서로에 관하여 또는 전체 분자에 관하여 고정되어있지 않다(도 1 참조). 본 발명의 세포-표적화 분자의 구성요소는, 결합 영역 및 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 바람직한 활동이 제한되지 않는다면, 어느 순서로든 배열될 수 있다. 바람직한 활동은, 예를 들어, 표적 발현 세포 결합, 세포 내재화 유도, 세포증식억제(cytostasis) 야기, 세포독성 야기, 및/또는 세포의 내부로 외인성 물질 전달과 같은, 능력을 분자에 제공하는 것을 포함한다.
[226] 본 발명의 분자의 어떤 상기의 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 분자 모이어티, 및 선택적인, 소포체 잔류/회수 신호 모티프는 직접적으로 서로에게 연결되거나/또는 당업계에 잘 알려진 및/또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 링커와 같은 삽입(intervening) 폴리펩티드 서열을 통해 서로에게 적합하게 연결될 수 있다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 상기 구체예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역, 결합 영역, 및 어떤 구체예에 존재하는 그 외 요소(예: 분자 모이어티 및/또는 소포체 잔류/회수 신호 모티프)는 직접적으로 서로에게 연결되거나/또는 당업계에 잘 알려진 및/또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 링커와 같은 삽입 폴리펩티드 서열을 통해 서로에게 적합하게 연결될 수 있다.
II. 본 발명의 분자의 구성요소의 특정 구조적 변이의 예시
[227] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 절단된(truncated) 시가 독소 A 서브유닛만을 포함하거나 이를 포함하여 구성된다. 시가-유사 독소 A 서브유닛 절단물(truncations)은 촉매활성적(catalytically active)이고, 시험관 내에서 리보솜을 효소 불활성화할 수 있고, 세포 내에서 발현될 때 세포독성이다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). Slt-1A의 잔기 1-240으로 구성된 카르복시-말단이 절단된 시가 독소 A 서브유닛 단편은 카르복시-말단이 절단된 시가 독소 A 서브유닛 구성(construct)이 효과적으로 진핵세포의 시토졸으로 역전위(retrotranslocate)하는데에 위치 240에 류신 잔기가 필요할 때, 진핵세포의 소포체에서 발현했을 때 완전한(full) 세포독성을 보이는 것으로 나타났다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). 유사하게, Stx2A의 잔기 1-239로 구성된 카르복시-말단이 절단된 시가 독소 A 서브유닛은 진핵세포의 소포체에서 발현했을 때 완전한 세포독성을 보이는 것으로 나타났다(Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)).
[228] 어떤 구체예 중에서는, 본 발명의 분자의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)의 아미노산 75 내지 240만을 포함하거나 이를 포함하여 구성되거나 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 아미노산 75 내지 239만을 포함하거나 이를 포함하여 구성된다. 다른 구체예는 SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)의 아미노산 1 내지 240만을 포함하거나 이를 포함하여 구성되거나 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 아미노산 1 내지 239만을 포함하거나 이를 포함하여 구성된 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 분자이다. 다른 구체예는 SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)의 아미노산 1 내지 240에 더하여, 위치 250의 카르복시 말단이 아닌, 하나 이상의 위치 240의 아미노산 카르복시-말단만을 포함하거나 이를 포함하여 구성된 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 분자이다; 그리고, 유사하게, 다른 구체예는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 아미노산 1 내지 239에 더하여, 위치 249의 카르복시 말단이 아닌, 하나 이상의 위치 239의 아미노산 카르복시-말단만을 포함하거나 이를 포함하여 구성된 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 분자이다.
[229] 어떤 구체예 중에서는, 본 발명의 분자의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)의 아미노산 1 내지 251만을 포함하거나 이를 포함하여 구성되거나 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 아미노산 1 내지 250만을 포함하거나 이를 포함하여 구성되고, 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단에 있는 퓨린-절단 모티프에서 최소 하나의 아미노산 잔기가 붕괴된다. 다른 구체예는 SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)의 아미노산 1 내지 261만을 포함하거나 이를 포함하여 구성되거나 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 아미노산 1 내지 260만을 포함하거나 이를 포함하여 구성되고, 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단에 있는 퓨린-절단 모티프에서 최소 하나의 아미노산 잔기가 붕괴된 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역을 포함하는 분자이다.
[230] 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예중에서는, 상기 세포-표적화 분자는 암세포의 세포 표면에 표면 항원과의 특이적 그리고 고친화성 결합을 위해 선택된 면역글로불린형 폴리펩티드로부터 유도된 결합 영역을 포함하고, 상기 항원은 암세포에 대한 발현에 제한되어있다(예 Glokler J et al., Molecules 15: 2478-90 (2010); Liu Y et al., Lab Chip 9: 1033-6 (2009). 다른 구체예에 따라서, 결합 영역은 암세포의 세포 표면에 표면 항원과의 특이적 그리고 고친화성의 결합을 위해 선택되고, 상기 항원은 비-암세포에 비해 암세포에 의해 과다-발현(over-expressed)되거나 또는 우선적으로(preferentially) 발현된다. 비제한적인, 몇몇의 대표적인 표적 생체분자는 암 및/또는 특정 면역세포 유형과 관련된 하기에 열거된 표적을 포함한다.
[231] 당업계에는 다음을 표적하는 결합 영역과 같이 암세포와 관련된 항원결정기를 인식하는 많은 면역글로불린형 결합 영역이 존재한다: CD4, CD20(B-림프구 항원 단백질 CD20), CD22, CD25(인터루킨-2 수용체 IL2R), CD30(TNFRSF8), CD38(사이클릭 에이디피 라이보스 하이드롤레이스(cyclic ADP ribose hydrolase)), CD40, CD44(히알루로난 수용체), CD71(트랜스페린 수용체), CD73, CD79, 엔도글린(END 또는 CD105), CD200, 기저세포 부착분자(B-CAM 또는 CD239), CD248(엔도시알린(endosialin) 또는 TEM1), 암배아항원 단백질(CEA), 콘드로이틴황산염 프로테오글리칸 4(CSP4, MCSP, 또는 NG2), 표피성장인자(EGFR/ErbB1), 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2/Neu/ErbB2/CD340), 에프린(Ephrin) 타입-B 수용체 2(EphB2), 상피세포 부착분자(EpCAM), 섬유모세포 활성 단백질(FAP/세프라세(seprase)), 단백분해효소 활성 수용체(예를 들어 PAR1), 폴리오 바이러스 수용체-유사 4(PVRL4), B3 흑색종 항원, B4 흑색종 항원, 전립선-특이 막 항원 단백질(PSMA), 및 종양-관련 칼슘 신호 변환기(transducers)(TACSTDs)(예: Lui B et al., Cancer Res 64: 704-10 (2004); Bagley R et al., Int J Oncol 34: 619-27 (2009); Beck A et al., Nat Rev Immunol 10: 345-52 (2010); Andersen J et al., J Biol Chem 287: 22927-37 (2012); Nolan-Stevaux O et al., PLoS One 7: e50920 (2012); Rust S et al., Mol Cancer 12: 11(2013) 참조). 이 표적 생체분자 목록은 비제한적이다. 숙련자라면 어떤 암세포 혹은 다른 바람직한 세포 유형과 관련된 어느 바람직한 표적 생체분자라도 본 발명의 분자를 생성하기 위해 시가 독소 작동체 영역과 결합할 결합 영역을 설계 또는 선택하는데에 사용할 수 있다.
[232] 암세포와 강하게 관련되었고 그들을 결합하는 것으로 알려진 면역글로불린형 결합 영역을 가진 다른 표적 생체분자의 예는 CD19(B-림프구 항원 단백질 CD19), CD21(보체수용체-2 또는 보체 3d 수용체), CS1(SLAM군 7번(SLAM family number 7) 또는 SLAMF7), CD26(디펩티딜펩티드가수분해효소-4(dipeptidyl peptidase-4), DPP4, 또는 아데노신탈아미노효소 복합단백질 2(adenosine deaminase complexing protein 2)), CD33(시알산-결합 면역글로불린형 렉틴-3), CD52(CAMPATH-1 항원), CD56, CD133(프로미닌(prominin)-1), 기저세포 부착분자(BCAM 또는 루터란 혈액군 당단백질, 방광 종양 항원(BTA), 암-테스티스(cancer-testis) 항원 NY-ESO-1, 암 테스티스 항원 LAGE 단백질, 세포 표면 A33 항원 단백질(gpA33), 간세포성장인자 수용체(HGFR 또는 c-Met), 엡스타인바 바이러스 항원, 흑색종관련 항원 1 단백질(melanoma-associated antigen 1 protein)(MAGE-1), 흑색종관련 항원 3(MAGE-3), GAGE/PAGE 단백질(흑색종 관련 암/테스티스 항원), BAGE 단백질(B 흑색종 항원), 뮤신(예를 들어 MUC1 및 암 항원 125(CA-125)), 흑색종의 우선적으로 발현된 항원(Preferentially Expressed Antigen of Melanoma)(PRAME) 단백질, T-세포 1 단백질이 인식하는(recognized by) 흑색종 항원(MART-1/MelanA), 전립선특이항원 단백질(PSA), 전립선 줄기세포 항원 단백질(PSCA), 최종당화산물의 수용체(Receptor for Advanced Glycation Endroducts(RAGE)), 종양-관련 당단백질 72(TAG-72), 및 윌름스종양 항원을 포함한다.
[233] 암세포와 강하게 연관된 다른 표적 생체분자의 예로는 탄산탈수효소 IX(CA9/CAIX), 엽산 결합(folate binding) 단백질(FBP 및 엽산 수용체), 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2, 혈관내피성장인자 수용체(VEGFR), 인테그린 알파-V 베타-3(αvβ3), 인테그린 알파-V 베타-5(αvβ5), 인테그린 알파-5 베타-1(α5β1), 타이로신-단백질 인산화효소 수용체 erB-3, 인슐린-유사 성장인자 1 수용체(IGF1R), 에프린 타입-A 수용체 3(EphA3), 종양괴사인자 수용체 10A(TRAIL-R1/DR4), 종양괴사인자 수용체 10B(TRAIL-R2), 핵인자 카파 B 수용체 활성화제(receptor activator of nuclear factor kappa B(RANK)), 테나신 C, 클라우딘(Claudin) 단백질(CLDN3, CLDN4), 메소텔린(MSLN), 및 CD64(FcγRI)가 있다(예: Hough C et al., Cancer Res 60: 6281-7 (2000); Thepen T et al., Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000); Pastan I et al., Nat Rev Cancer 6: 559-65 (2006); Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Fitzgerald D et al., Cancer Res 71: 6300-9 (2011); Scott A et al., Cancer Immun 12: 14-22 (2012) 참조). 이 표적 생체분자 목록은 비제한적이다.
[234] 그리고 또한, 다음과 같은 그 외의 많은 고려된 표적 생체분자의 예가 있다: 멜라닌세포 단백질 PMEL(gp100), 인간 티로시나제(human tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질 1(TYRP1 또는 TRP-1), 티로시나제-관련 단백질 2(TRP-2), 라이소포스페이티들글레세롤 아실기전이효소 1(lysophosphatidlglycerol acyltransferase 1)(LPGAT1/IAA0205), SART 단백질, ADP-리보실전달효소(ribosyltransferases)(ART1, ART4), 인간 아스파르틸(아스파라기닐(asparaginyl)) 베타-수산화효소(human aspartyl beta-hydroxylase(HAAH)), 에프린 타입-A 수용체 2(EphA2), 타이로신-단백질 인산화효소 수용체 erbB-3, 티로시나제 연관 항원(TAA), 절단점군영역-c-abl 종양유전자(break point cluster region-c-abl oncogene(BCR-ABL)) 단백질, ADAM 금속단백분해효소(metalloproteinases)(예: ADAM-9, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-15, ADAM-17), 알파-태아단백질 항원 17-A1 단백질, 골수 간질(stroma) 항원(BST1, BST2), CD2, CD3(T-세포 공동-수용체(co-receptors)), CD7, CD15, CD23(FC 엡실론 RII), CD53, CD88(보체성분 5a 수용체 1), CD129(인터루킨 9 수용체), CD183(케모카인 수용체 CXCR3), CD191(CCR1), CD193(CCR3), CD244(자연살해세포 수용체 2B4), CD294(GPR44), CD305(백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1), C3aR(보체성분 3a 수용체), FceRIa, 갈렉틴-9, 골수성-관련 단백질-14(mrp-14), 시글렉(시알산-결합 면역글로불린형 렉틴), CD49d, CD13, CD54(세포내 부착분자 1), CD63(테트라스패닌(tetraspanin)), CD69, CD123(인터루킨-3 수용체), CD284(톨-유사 수용체 4), FceRIa, 용해소체-관련(lysosome-associated) 막 단백질(CD107과 같은 LAMP), CD203c, CD14, CD15(루이스 X 또는 단계특이 배아 항원 1), 청소제수용체(예를 들어 CD64 및 CD68), CD80, CD86, CD115(집락자극인자 1 수용체), 항원 F4/80, 면역글로불린-유사 전사(transcript) ILT-3, 인테그린(예를 들어 CD11a-c), CD195(케모카인 수용체 CCR5), CD282(톨-유사(toll-like) 수용체 2), 신데칸(syndecans)(예를 들어 SDC1 또는 CD138), 및 CD225(인터페론-유발 막관통단백질 1(interferon-induced transmembrane protein 1))(표적 생체분자는 Scott A et al., Cancer Immun 12: 14 (2012)); Cheever M et al., Clin Cancer Res 15: 5323-37 (2009) 참조, 그리고 여기에 기술된 표적 생체분자는 비제한적인 예임을 주의할 것). 숙련자라면 바람직한 어느 표적 생체분자라도 본 발명의 분자를 생성하기 위해 프로테아제-저항성의 시가 독소 작동체 영역과 결합할 결합 영역을 설계 또는 선택하는데에 사용할 수 있다.
[235] 어떤 구체예에서는, 결합 영역은 면역체계의 세포 유형의 세포 표면과 특이적 및 고친화성 결합을 위해 선택된 면역글로불린형 폴리펩티드만을 포함하거나 또는 이를 포함하여 구성된다. 예를 들어, 면역글로불린형 결합 도메인은 CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD41, CD56, CD61, CD62, CD66, CD95, CD117, CD123, CD235, CD146, CD326, 인터루킨-2 수용체(IL-2R), 핵인자 카파 B 수용체 활성화제(RANKL), SLAM-관련 단백질(SAP), 및 TNFSF18(종양괴사인자 리간드 18 또는 GITRL)과 결합하는 것으로 알려져 있다.
[236] 어떤 구체예에 있어서, 상기 세포-표적화 분자는 SEQ ID NO: 50-61에 명시된 어느 하나의 폴리펩티드만을 포함하거나 또는 이를 포함하여 구성된다. 이러한 프로테아제-절단 저항성의, CD20-결합, 세포독성의, 세포-표적화 분자의 구체예는 다음을 치료 그리고/또는 진단하는데 사용될 수 있다: 뼈암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 하시모토 갑상선염, 용혈성요독증후군, HIV-관련 질병, 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 결절성다발성동맥염, 다관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 궤양성 대장염, 및/또는 혈관염.
[237] 어떤 구체예에서는, 결합 영역은 세포외 수용체를 표적하기 위해 선택된 리간드만을 포함하거나 또는 이들을 포함하여 구성된다. 대표적인 리간드의 비제한적인 예로는, 다음의 뼈 형성 단백질 및 액티빈 막-결합성 억제제(activin membrane-bound inhibitor) BAMBI(TGFBR으로도 알려짐), CD137L(4-IBB로도 알려짐), 디코이(decoy) 수용체 3 DcR3(TR6 및 TNFRSF6B로도 알려짐), MHC 클래스 I 폴리펩티드-관련 서열(예: MICA, MICB), NKG2D 리간드(예: ULBP1, ULBP2, ULBP3, 및 ULBP4-6), 및 종양괴사인자 TWEAK(TNFSF12 및 AP03L로도 알려짐)가 있다. 더 많은 비제한적인 모범적인 리간드는 실시예의 표 5에 있다.
[238] 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예중에서는, 결합영역은 U.S. 특허출원 2011/0059090에 기술된 대로, 카멜리드 항체(VHH) 단백질 5F7의 단일-도메인 가변성 영역으로부터 유도된 것과 같은, HER2에 특이 고친화성 결합을 보이는 단일 도메인 면역글로불린-유래 영역 VHH이다.
[239] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 SEQ ID NO:50의 아미노산 270-513, SEQ ID NO:51의 261-512, SEQ ID NO:52의 270-514, 또는 SEQ ID NO:53의 279-522만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된 면역글로불린형 결합 영역을 포함하고, 이는 모두 인간 CD20에 특이적으로 고친화성 결합을 보인다.
[240] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 SEQ ID NO:54의 아미노산 267-384, SEQ ID NO:58의 269-512, 또는 SEQ ID NO:61의 269-403만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된 면역글로불린형 결합 영역을 포함하고, 이는 모두 인간 HER2에 특이적으로 고친화성 결합을 보인다.
[241] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 SEQ ID NO:56의 아미노산 269-401만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된 폴리펩티드 리간드를 포함하며, 이는 모두 인간 인터루킨-2 수용체(IL-2 수용체)에 특이적으로 고친화성 결합을 보인다.
[242] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 SEQ ID NO:57의 아미노산 269-508만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된 면역글로불린형 결합 영역을 포함하고, 이는 모두 인간 CD38에 특이적으로 고친화성 결합을 보인다.
[243] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 SEQ ID NO:59의 아미노산 269-516만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된 면역글로불린형 결합 영역을 포함하고, 이는 모두 인간 CD19에 특이적으로 고친화성 결합을 보인다.
[244] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 SEQ ID NO:60의 아미노산 269-518만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된 면역글로불린형 결합 영역을 포함하고, 이는 모두 인간 CD74에 특이적으로 고친화성 결합을 보인다.
[245] 기능적인 세포외 표적 생체분자 결합 사이트를, 더 바람직하게는 표적 생체분자를 고친화성으로 결합 가능한 결합 사이트를(예: KD 참조), 함유한 본 발명의 분자의 폴리펩티드의 단편, 변종, 및/또는 유도체의 사용은 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본 발명이 인간 단백질: CD20, HER2, IL-2 수용체, CD38, CD19, 및 CD74와 결합할 수 있는 폴리펩티드 서열을 제공할 때, 해리상수 10-5 내지 10-12 mol/ℓ으로, 바람직하게는 200nM 이하로, 표적 생체분자에, 바람직하게는 세포 표면에, 결합하는 모든 결합 영역은 본 발명의 세포-표적화 분자 및 본 발명의 방법에 사용하기 위해 치환될 수 있다.
III. 본 발명의 분자의 일반적인 기능
[246] 본 발명은 치료적 및/또는 진단적 사용에 유용한 다양한 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드 및 동일한 것을 포함하는 분자를 제공한다. 본 발명의 시가 독소 유래, 세포-표적화 분자는, 예를 들어 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포-표적화 분자와 균등하지만 프로테아제-절단 민감성, 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 어떤 세포-표적화 분자(예: 카르복시 말단, 세포-표적화 결합 영역을 포함한 세포 표적화된 분자)보다 향상된, 최적의 세포독성을 가지도록 설계될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 유래 분자는, 예를 들어 표적화된 세포 사멸, 특정 세포 유형 안으로 외인성 물질 전달, 진단적 정보 획득, 및 암, 면역 장애, 및 미생물 감염을 포함한 각종 질병, 장애, 및 증상의 치료를 위한 치료법에 쓰일 수 있다.
[247] 세포-표적 결합 영역과 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 연결은, 예를 들어 증가된 분자의 안정도 및 향상된 체내 내성(in vivo tolerability)과 같은, 향상된 특징을 가진 치료법 및 진단법으로 조작할 수 있게한다. 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드에 있는 시가 독소 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서의 퓨린-절단 모티프의 교란은 모티프에서의 퓨린 절단을 감소시키고, 예를 들어 트립신 및 척추동물의 혈관계에 흔한 세포외 단백질 가수분해 효소와 같은, 퓨린 외의 다른 단백질 가수분해 효소로 인한 절단을 감소시킬 수 있다. 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드에 있는 시가 독소 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서의 퓨린-절단 모티프의 교란은 퓨린-절단 민감성, 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 세포-표적화 분자에 필적하는 효능(potency)에, 프로테아제-절단 민감성, 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 어떤 세포-표적화 분자에 비해서 척추동물에 투여 후 향상된 독성 프로파일(toxicity profile)을 가진, 시가 독소 세포 독성의 세포 유형 특이 표적화를 하는 세포-표적화 분자의 가공을 가능하게 한다. 본 발명의 어떤 분자는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 세포-표적화 분자에 비해서 척추동물에 투여 후 감소된 유해 효과(예: 비-특이적 독성)를 보이고 생산, 저장(storage), 및 투여 중 향상된 안정도를 보일 수 있다.
A. 효율적인 세포내 경로화 및 강한 세포독성을 유지하면서 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드의 프로테아제-절단 민감성 감소
[248] 이전에는, 시가 독소 A1 단편 촉매 영역을 포함하는 세포독성 시가 독소 A 서브유닛 구조물은 효과적인 그리고 강한 세포독성을 보존하기 위하여 자연적으로 발생하는 중독된 세포 내에서의 퓨린에 의한 단백질 가수 분해 과정을 반드시 유지 또는 어떻게든 보충(compensate)되어야된다고 생각되었다. 그러나 예상치 못하게 , 카르복시 말단에 상대적으로 큰(28kDa 이상) 모이어티의 존재도 불구하고, 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에서의 표적-세포-매개성(target-cell-mediated) 퓨린-절단 단계 없이도 야생형 시가 독소 제어 구조물(control construct) 수준의 강한 시가 독소 세포독성을 달성했기 때문에, 퓨린 절단 단계는 강한 세포독성을 위해 필요하지 않다는 것이 밝혀졌다(하기 실시예 참조). 중독된 세포내의 퓨린-절단 단계의 결핍은 효율적인 시가 독소 A1 단편의 유리를 방해하고, 즉, 시가 독소 A1 단편 영역에 대한 상대적으로 큰 분자 모이어티의 지속적인 연쇄(continued linkage)를 야기할 것으로 예상되었다. 그러나 이러한 예측에도 불구하고, 상대적으로 큰 카르복시-말단 모이어티를 포함하고, 예를 들어 가공된, 대안의 단백질 가수분해 효소 사이트와 같은, 분명한 상보적인 특징(compensatory feature(s))이 없는, 퓨린-절단이 결핍(deficient)된 시가 독소 A 서브유닛 구조물로 강한 시가 독소 세포독성을 달성했다.
[249] 이러한 결과는 최적의 시가 독소 중독 과정이 모든 다른 큰 분자 모이어티로부터 시가 독소 A1 단편의 유리 및 유리된 A1 단편을 소포체로부터 시토졸로 효율적으로 역전위하기 위한 Al 단편의 카르복시 말단의 노출을 필요로 한다 생각되었기 때문에 놀라웠고, 상기 A1 단편은 중독된 세포의 리보솜을 촉매로 비활성화 시키는 효소 활성 구조를 형성할 수 있다. 특히, 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단을 덮는 분자 모이어티의 존속(persistence) 및/또는 비효율적인 방출(release)은 시가 독소 A1 단편의 ERAD 시스템에 의해 인식된 A1 단편의 소수성의 카르복시 말단 도메인의 노출을 수반하는 시토졸에 효율적으로 접근하는 천연 메커니즘(natural mechanism)을 방해할 것으로 예측되었었다 (Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011); Li S et al., PLoS One 7: e41119 (2012) 참조). 예를 들어, 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단을 덮는 분자의 모이어티의 존속은 시가 독소 A1 단편의 소포체에 있는 ERAD 머시너리(machinery)로의 접근성 및 효소 활성 구조를 생성하는 시토졸으로의 효율적인 접근을 교란시킬 것으로 예측되었었다. 예상 밖으로, 이는 큰 카르복시-말단, 세포-표적화 모이어티의 존재에도 불구하고 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에서 표적-세포-매개성 퓨린 절단 단계가 없이도 효율적이고 강한 시가 독소 세포독성이 달성되었기 때문에 사실이 아닌 것으로 밝혀졌다(하기의 실시예 참조).
[250] 또는, 중독된-세포-매개성 퓨린-절단 단계 결핍은 이론적으로 보상되었을 수 있다. 잠재적인, 상보적인 접근법(compensatory approaches)의 비제한적인 예는 1) 구조물의 하나의 카르복시 말단을 시가 독소 A1 단편-유사 폴리펩티드 영역의 카르복시 말단으로 끝내는 것(terminating), 2) 시가 독소 A 서브유닛 폴리펩티드가 그의 시가 독소 A1 단편-유사 폴리펩티드의 카르복시 말단 근처에 이미 닉된(nicked) 시가 독소 유래 구조물 생산, 3) 선천적인(native) 시가 독소 퓨린-절단 단계 결핍을 기능적으로 대신할 수 있는 이형(heterologous) 및/또는 이소성(ectopic) 단백질 가수분해 효소 사이트 가공, 및 4) 접근법 2 및 3을 겸비한 것을 포함한다. 제 1 접근법에서는, 시가 독소 A1 단편-유사 폴리펩티드의 카르복시 말단은 어느 카르복시-말단 모이어티로도 덮여있지 않고, 그리고, 즉, 시가 독소 A1 단편-유사 폴리펩티드의 카르복시 말단은 소포체의 ERAD 머시너리에 의한 인식을 위해 영구적으로 노출되어있다. 마지막 세 개의 접근법에서는, 시가 독소 A1 단편-유사 폴리펩티드는, 소포체 안에서 시가 독소 A1 단편-유사 폴리펩티드의 카르복시 말단이 ERAD 머시너리에 의한 인식을 위해 노출되도록, 분자가 중독된 세포의 소포체에 도달할 때까지 구조물의 하나 이상의 다른 구성요소로부터 세포내 해리(intracellularly dissociate)가 되도록 설계될 수 있다.
[251] 상보적인 특징(compensatory feature)의 예는, 표적 세포와 접촉하기 전에 A1 단편-유사 영역의 카르복시 말단 근처의 폴리펩티드 영역을 닉(nick)하도록 단백질 가수분해 효소로 전처리된(pretreated), 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 포함한 세포독성 분자이다. 다른 예는 표적 세포의 세포내 단백질 가수분해 효소로 절단된 이소성의, 이형 단백질 가수분해 효소 사이트를 포함하도록 가공된 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포독성 분자이다.
[252] 중독된-세포-매개성 퓨린-절단 단계 결핍을 보상하는 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드 설계를 위해 제안된 이러한 접근법은 가설에 의한 것이다. 네 개의 모든 접근법은 야생형 시가 독소 A 서브유닛을 포함한 분자 또는 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 자연적으로 발생하는 퓨린-절단 사이트를 포함하는 야생형 서열만을 포함하는 시가 독소 A 서브유닛 구조물과 비하여 세포독성의 효율성 및 효능을 상당히 바꿀 수 있다. 덧붙여, 제3 접근법의 특정 변종만이, 표적 세포 엔도프로테아제(endoproteases)에 의존하는 변종이, 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 상대적인 카르복시 말단 위치에서 모이어티가 융합되는 것을 감안할 수도 있다. 그러나, 현재로서는 퓨린 절단과 균등한 완전한 보상의 세포독성을 제공할 수 있는, 퓨린 외의 표적 세포 엔도프로테아제에 의존한 상보적인 접근법은 알려져있지 않고, 칼페인과 같은 대안의 세포 단백질 가수분해 효소는 시가 독소 세포독성을 촉진하는데 덜 효율적인 것으로 나타났다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Kurmanova, Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
[253] 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 본 발명의 분자는 모두 퓨린에 의한 절단에 감소된 민감성을 보인다. 최소한의 퓨린 절단 R/Y-x-x-R 모티프가, 예를 들어 매우 뒤섞인(promiscuous) 단백질 가수분해 효소(예: 트립신)와 같은, 복수의 단백질 가수분해 효소와 공유되기 때문에, 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 어떤 붕괴된 퓨린-절단 모티프는 단지 퓨린 말고도 복수의 단백질 가수분해 효소에 의한 절단에 감소된 민감성을 보일것으로 예측된다(예: Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007) 참조). 예를 들어, 펩티드 분해 효소의 단백질 전환 효소 종류(class)는 인간에 최소 일곱 멤버, PC1, PC2, PC3, PC4, PACE4, PC5, PC6, 및 PC7를 포함하고(Fugere M, Day R, Trends Pharmacol Sci 26: 294-301 (2005)), 이들 중 많은 것이 그의 기질을, 예를 들어 하나 이상의 아르기닌 잔기와 같은, 단일의 또는 한 쌍의 염기성(basic) 잔기에서 절단하는 것으로 알려져 있다(Seidah N, Ann N Y Acad Sci 1220: 149-61 (2011)).
[254] 본 발명의 어떤 세포-표적화 분자는 중독된 세포 안에서 퓨린 절단으로 방출될 수 없는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 융합된 분자 모이어티의 존재에도 불구하고, 프로테아제-절단 민감성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 세포-표적화 분자만큼 효율적이고 강력한 세포독성이다.
B. 표적된 시가 독소 세포독성을 통한 세포 사멸
[255] 본 발명은 퓨린-절단 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 포함한 각종 세포독성 세포-표적-표적화된 분자를 제공한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 특정 세포 유형의 세포 표면과 관련된 세포외 표적 생체분자와 결합하고 그 세포에 침투(entering)할 수 있다. 표적화된 세포 유형 안에서 내재화 되면, 본 발명의 세포-표적된 분자의 어떤 구체예는 세포독성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 단편을 표적 세포의 세토졸 안으로 경로화할 수 있다. 표적화된 세포 유형의 시토졸 안이면, 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예는 리보솜을 효소적으로 불활성화하고 궁극적으로 세포를 사멸할 수 있다. 이 시스템은 모듈러식으로, 예를 들어 면역글로불린형 폴리펩티드와 같은, 많은 각종 세포-표적화 결합 영역이 감소된 프로테아제-절단 민감성 향상을 제공하면서 이 다양한 각종 세포 유형에 대한 강한 세포독성을 표적하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 분자의 세포 사멸을 야기하는 능력치(capacity)는, 즉 그의 세포독성은, 당업계에 널리 알려진 많은 분석법을 하나 이상 사용하여 측정될 수 있다.
[256] 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의, 세포독성 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포독성 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포와 접촉했을 때(표적+ 세포), 상기 세포-표적화 분자는 세포의 사멸을 야기할 수 있다. 세포 사멸은, 예를 들어, 체외 조작된(manipulated) 표적 세포, 시험관 내에서 배양된 표적 세포, 시험관 내에서 배양된 조직 샘플안의 표적 세포, 또는 체내에 있는 표적 세포와 같은, 표적 세포의 다양한 조건 아래에서 본 발명의 세포-표적화된 세포를 사용하여 달성할 수 있다.
[257] 표적 분자의 발현은 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자에 의한 표적화된 세포 사멸을 위해서 선천적(native)일 필요가 없다. 표적 생체분자의 세포 표면 발현은 감염, 병원체 유무 병원체 유무, 및/또는 세포내 미생물 병원체 유무의 결과일 수도 있다. 표적 생체분자의 발현은 인공적일 수도 있는데, 예를 들면 바이러스 발현 벡터 감염으로 인한 강제적인 또는 유발된 발현이 있다(아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 레트로바이러스(retroviral) 참조). 표적 생체분자에 발현을 유발하는 예로는 올-트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid) 및 다양한 합성 레티노이드, 또는 아무 레티노산 수용체(RAR) 작용제와 같은 레티노이드에 노출된 세포의 CD38 발현의 상향조절(upregulation)이 있다(Drach J et al., Cancer Res 54: 1746-52 (1994); Uruno A et al., J Leukoc Biol 90: 235-47 (2011)). 또 다른 예에서는, CD20, HER2, 및 EGFR 발현은 세포를 이온화방사선에 노출시켜 발현을 유발할 수 있다(Wattenberg M et al., Br J Cancer 110: 1472-80 (2014)).
[258] 본 발명의 목적과 관련하여, 야생형 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드를 포함하는 제2 세포-표적화 분자의 세포독성과 비교해 "균등한" 시가 독소 작동체 세포독성을 보인다는 것은, 재현성을 가진 적절한 정량 분석으로 측정된 전장(full-length)의 시가 독소 A1 단편을 포함하는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 맞먹는, 10 퍼센트 이내의 세포독성 레벨을 말한다. 실험실 세포 배양에서의 표적 양성 세포 사멸 분석의 세포독성과 관련하여, "균등한" 세포독성은 일반적으로 관심의 분자에 동일한 결합 영역을 가지고, 해당하는 경우, 관심의 분자에 동일한 분자 모이어티를 포함한 참고(reference) 세포독성 세포-표적화 분자의(본 명세서에서 "제2 세포-표적화 분자"로 명시) CD50 값의 10 퍼센트 이내에 있는 CD50 값이고; 그리고 결합 영역, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및, 해당하는 경우, 참고 분자의 분자 모이어티는 모두 관심의 분자에서 이 요소들이 관련된 것과 동일하게 서로와 관련된다.
[259] 더하여, 만약 본 발명의 분자가 단독으로 또는 세포-표적화 분자의 구성요소로서 야생형 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드를 포함한 참고 세포-표적화 분자와 균등한 세포독성을 보인다면, 본 발명의 분자의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 그 참고 분자의 준세포 경로화와 균등한, 즉 야생형과 균등한 준세포 경로화 활성인, 시가 독소 작동체의 준세포 경로화 활성 레벨을 보인다.
C. 세포 유형 중에 선택적인 세포독성
[260] 특정 세포 유형에 고친화성 결합 영역을 사용하여 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드의 전달을 표적함으로써, 강한 시가 독소 세포-사멸 활성은 특이적으로 표적화된 세포 유형을 우선적으로 사멸하는 것으로 제한할 수 있다. 본 발명의 어떤 세포-표적화 분자는 특정 세포 유형의 집단을 제거하는데 용이하다. 예를 들어, 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자는 하나 이상의 세포 표면에서 상승한 레벨의 특정 표적 생체분자를 발현하는 악성 세포를 제거하는 것으로 어떤 종양, 암, 및/또는 성장이상(growth abnormalities)을 치료하는데에 용이하다.
[261] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자를 세포 유형의 혼합물에 투여함으로써, 상기 세포-표적화 분자는 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포 유형에 비해 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포를 선택적으로 사멸할 수 있다. 시가 독소군의 개체는 진핵세포를 사멸하는데 적합하기 때문에, 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 사용하여 설계된 분자는 강한 세포독성 활성을 보일 수 있다. 고친화성 결합 영역을 사용하여 특정 세포 유형으로의 효소 활성의 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드 전달을 표적 함으로써, 이 강한 세포 사멸 활동은 유기체 내에서 선택된 결합 영역의 표적 생체분자와의 물리적인 관련에 의해 표적화하고자 하는 세포 유형만 사멸하는 것으로 제한할 수 있다.
[262] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 두 가지 이상의 다른 세포 유형의 혼합물 내에서 선택적으로 또는 우선적으로 특정 세포 유형을 사멸할 수 있다. 이는 높은 우선권을 가진 특정 세포 유형에 세포독성 활동 표적화를 활성을 가능하게 하고, 표적 생체분자를 발현하지 않는“방관자(bystander)”세포 유형에 비해 3배의 세포독성 효과를 가능하게 할 수 있다. 또는, 결합 영역의 표적 생체분자의 발현은, 표적 생체분자가 충분히 낮은 양으로 발현 그리고/또는 작은 양으로 표적이 아닌 세포 유형과 물리적으로 결합한다면, 하나의 세포 유형에 제한되지 않을 수 있다. 이는 많은 양의 표적 생체분자를 발현하지 않거나 또는 많은 양의 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 "방관자" 세포 유형에 비해, 3배의 세포독성 효과와 같은 높은 우선권을 가진 특정 세포 유형의 표적화된 세포-사멸을 가능하게 한다.
[263] 세포 표면에 있는 세포외 표적 생체분자의 레벨은 FACS 방법과 같이 숙련자에게 알려진 여러 방법을 사용하여 알 수 있다. 이 명세서 내에 명시된 바와 같이, 세포 표면에서 발현한 상당한 양의 세포외 표적 생체분자는 세포 유형에 따라서 FACS 분석으로 측정된 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 70,000 평균형광강도(MFI)보다 높다.
[264] 어떤 구체예에서는, 세포외 표적 생체분자의 유무 및/또는 세포외 표적 생체분자의 폴리펩티드 서열에 있어 다른 세포 유형의 두 집단에 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자 투여에 있어서, 상기 세포-표적화 분자는 표적 세포 집단에 대해 반 최고치 세포독성 농도(CD50) 값으로 정의된 세포 사멸을 야기할 수 있고, 예를 들어 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자를 발현하지 않는 세포 집단에 있어 동일한 세포-표적화 분자의 CD50 투여량보다 적어도 3배가 낮은 투여량으로 세포 사멸을 야기할 수 있다.
[265] 어떤 구체예에서는, 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포 유형 집단에 대한 본 발명의 세포-표적화 분자의 세포독성 활성은 상기 본 발명의 세포-표적화 분자에 의하여 특이적으로 결합된 세포외 표적 생체분자 어느 것과도 물리적으로 결합하지 않은 세포 유형 집단에 대한 상기 세포독성 활성보다 적어도 3배가 높다. 본 발명에 따르면, 선택적인 세포독성은 (a/b)의 비로 수량화될 수 있는데, (a)는 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 특정 세포 유형의 세포 집단에 대한 세포독성, (b)는 상기 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포 유형의 세포 집단에 대한 세포독성을 의미한다. 어떤 구체예에서는, 세포독성 비율은 선택적인 세포독성을 나타내는데, 이것은 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포 또는 세포 유형의 집단에 비교하여 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포 또는 세포 유형의 집단의 것이 적어도 3배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 75배, 100배, 25배, 500배, 750배, 또는 1000배 이상 높다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 세포외 표적 생체분자의 유무 및/또는 세포외 표적 생체분자의 폴리펩티드 서열에 있어 다른 세포의 두 집단에 본 발명의 어떤 세포독성 단백질을 투여했을 때, 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자는 세포독성 단백질의 결합 영역에 의하여 결합된 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결한된 세포 유형의 세포 사멸을 야기할 수 있고, 예를 들어 세포독성 세포-표적화 분자의 결합 영역에 의해 결합된 세포의 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포 유형과 결합, 또는 그 세포-표적화 분자의 결합 영역에 결합 특이성을 교란하는 서열 변이 또는 돌연변이를 포함하는 세포외 표적 생체분자형(forms)과만 물리적으로 결합된 세포 유형과 결합에서 관측된 CD50보다 적어도 3배 이상 낮은 CD50으로 세포 사멸을 야기할 수 있다.
[266] 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 두 가지 세포 유형의 집단에 본 발명의 세포-표적화 분자를 투여했을 때, 상기 세포-표적화 분자는 제1 세포 집단에 반 최고치 세포독성 농도(CD50) 값으로 정의된 세포 사멸을 야기할 수 있고, 상기 세포 집단의 개체들은 세포 표면에서 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 생체분자를 발현하며, 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 생체분자를 전혀 발현하지 않고, 상당한 양의 어느 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 생체분자도 발현하지 않고, 또는 상당한 양의 어느 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 생체분자도 노출시키지 않는 개체의 제2 세포 집단에 투여한 동일한 세포-표적화 분자의 CD50 투여량보다 3배 낮은 투여량으로 사멸을 야기할 수 있다.
[267] 이러한 우선적인 세포-사멸 기능은 표적 세포가 여러 조건 아래에서 그리고 체외에서 가공된 세포 유형 혼합물, 혼합물로 시험관 내에 배양된 조직, 또는 체내에서 다양한 세포 유형이 있을 때(예를 들어, 다세포 유기체 내의 제자리(in situ) 또는 선천적 위치(native location)에서)와 같은 비-표적화된 방관자 세포들의 존재 하에서, 본 발명의 어떤 세포독성 세포-표적화 분자에 의해 사멸될 수 있게 한다.
D. 향상된 체내 내성 및 안정도
[268] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자(예: 본 발명의 세포-표적화 분자)는 퓨린-절단 민감성 유사체(analogs)와 비교하였을 때 증가된 안정도 및/또는 향상된 체내 내성을 보였다. 증가된 안정도는 시험체 내에서 그리고/또는 체내에서 보여질 수 있다.
[269] 시간경과에 따른 치료적 또는 진단적 분자의 안정도는 중요한 특성이며 분자가 실제로 사용될 수 있는 적용에 영향을 미칠 수 있다. 분자의 안정도는, 예를 들어 투여 후 그리고 다양한 온도 및 농도 범위에서 보관 중에 유기체 내의 안정도와 같은, 시험관 내 및 체내를 포함한다. 어떤 면역독소(immunotoxins) 또는 리간드-독소에 대해서는, 독소 및 다른 구성요소 사이의 연쇄의 안정도는 시간경과 유기체 내에서 표적화되지 않은(untargeted) 독소 방출로 인해 야기된 비-특이적 독성의 양에 영향을 미칠 수 있다.
[270] 본 발명의 어떤 세포-표적화 분자는 치료용으로 그리고/또는 진단용으로 용이하고 그리고 더 프로테아제-절단 민감성인 변종과 비교했을 때 향상된 체내 내성으로 나타나는, 체내에서 감소된 비-특이적인 독성을 보인다. 체내 내성은 당업계에 알려진 그리고/또는 본 명세서에 기술된 기술을 사용하여 숙련자에 의하여 알아낼 수 있다. 사망률(mortality)로 체내 내성을 재는 것 외에도, 예를 들어 체중, 신체적 외관, 측정가능한 임상증상, 비유발 행동(unprovoked behavior), 및 외부 자극에 대한 반응의 측면과 같은, 이환의 징후(signs of morbidity)도 체내 내성을 재는데 사용될 수 있다(예: Morton D, Griffiths P, Vet Rec 116: 431-43 (1985); Montgomery C, Cancer Bull 42: 230-7 (1990); Ullman-Culler? M, Foltz C, Lab Anim Sc 49: 319-23 (1999); Clingerman K, Summers L, J Am Assoc Lab Anim Sci 51: 31-6 (2012) 참조). 안락사(euthanasia)는 이환 및/또는 빈사(moribundity)의 징후에 대응하여 사용될 수 있고 그리고, 즉, 사망 시점(mortality time-point)를 생성한다. 예를 들어, 2-3일동안 체중의 15-20% 감소는 설치류에 대한 이환의 징후로 쓰일 수 있고 안락사 명분이 될 수 있다(예:Institute of Laboratory Animal Research 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed., Washington, DC, U.S.: National Academies Press (2011) 참조).
[271] 본 발명의 목적을 위하여, "향상된 체내 내성"은 포유류의 유기체에 향상된 분자의 투여 이후, 예를 들어 동일한 종(species), 동일한 투여량 및 누적 투여량, 동일한 투여 일정(dosage schedule), 및 관찰 및/또는 측정하는 동안 동일한 시점(time-point)과 같은, 동일한 조건 아래에서 동일한 분석법을 사용하여 비교한 참고 분자에 비교해, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의, 바람직하게는 50% 또는 그 이상과 같은, 재현성이 있는 그리고 통계적으로 유의미한 전체 유기체의 건강 또는 생존에 관한 독성 및/또는 분자의 전반적인 유해한 효과의 감소를 말한다. 독성 및/또는 전반적인 유해한 효과의 감소는 특정 기간 동안 사망률 및/또는 이환의 감소로 측정될 수 있다.
[272] 실시예에 기술된 대로, 독성의 감소는 참고 분자를 받는 포유류에 대한 동일한 시점에서의 100% 사망률(100% mortality)와 비교해 향상된 체내 내성을 가진 분자를 받는 포유류에 대한 주어진 시점에서의 100% 생존률(100% survival)을 나타낼 수도 있다. 사망률은 앞서 제시된 인도적인 이유(compassionate reasons)로 인한 사멸 또는 안락사에 의한 것일 수 있다. 일반적으로, 투여 일정은 2, 3, 4, 또는 그 이상의 주 동안 매주 2 내지 3 복용량으로, 각각의 복용량은 체중 kg당 약 0.001 내지 40mg의 분자이다.
[273] 모범적인, 본 발명의 세포-표적화 분자에 대해서 관측된 향상된 체내 내성은 이 세포-표적화 분자의 훨씬 높은 복용량은 퓨린-절단 민감성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 관련 분자의 복용량에 비해서 포유류에 안전하게 투여될 수 있다는 것을 시사한다. 본 발명의 어떤 세포-표적화 분자는 더 프로테아제-절단 민감성인 변종에 비해 감소된 비-특이적 독성을 보일 수 있는데, 프로테아제-절단 저항성은 시가 독소 작동체 구성요소 및 세포-표적화 모이어티 요소 사이의 연쇄를 보호하고 보존하는데 기여하기 때문이다.
[274] 더하여, 본 발명의 어떤 분자는 더 프로테아제-절단 민감성의 변종에 비해 시험관 내에서 그리고/또는 체내 모두에서 증가된 반감기를 보인다. 분자 안정도는 관심의 분자의 구성요소와 관련해 관심의 분자의 반감기를 측정하는 것으로 분석될 수 있다. 본 발명의 분자의 어떤 구체예는, 특히 시가 독소 작동체 구성요소 및 하나 이상의 구성요소의 지속된 연합(continued association)에 관하여, 퓨린-절단 민감성의 변종에 비해 더 긴 반감기를 가질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 분자의 어떤 구체예는 시가 독소 작동체 구성요소 및, 예를 들어 세포-표적 모이어티와 같은, 다른 구성요소의 지속된 연합에 관하여, 퓨린-절단 민감성의 변종에 비해 더 긴 반감기를 가질 것이고, 퓨린-절단 민감성 사이트는 저 두 구성요소 사이에 자리한다.
E. 표적화된 세포의 내부로 부가적인 외인성 물질의 전달
[275] 직접적인 세포 사멸 외에도, 본 발명의 어떤 분자는 표적화된 세포의 내부로 부가적인 외인성 물질을 전달하는데 선택적으로 사용될 수 있다. 부가적인 외인성 물질의 전달은, 예를 들어, 세포독성, 세포증식 억제, 면역체계 자극, 면역 세포 표적, 정보수집, 및/또는 진단적 기능에 사용될 수 있다. 본 발명의 세포독성 분자의 무독성 변종은, 또는 선택적 독성 변종은, 세포-표적화 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포의 내부에 부가적인 외인성 물질을 전달하고 그리고/또는 그 내부를 라벨(label)하는데 사용할 수 있다. 최소 하나의 세포 표면에 표적 생체분자를 발현하는 다양한 세포 유형 및/또는 세포 집단은 외인성 물질 수용을 위하여 본 발명의 세포-표적화 분자에 의해 표적화될 수 있다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 기능적인 구성요소들은 모듈러식이며, 다양한 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 부가적인 외인성 물질은, 예를 들어 종양 세포 및/또는 그의 준세포 구획의 비침습적인 체내 영상과 같은, 다양한 적용을 제공하기 위하여 다양한 결합영역에 연결되어 있을 수 있다.
[276] 본 발명의 세포-표적화 분자는, 그의 무독성 형태를 포함하여, 세포-표적화 분자의 결합 영역에 의하여 인식되는 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포에 침투할 수 있기 때문에, 본 발명의 세포-표적화 분자의 어떤 구체예는 표적화된 세포의 내부로 부가적 외인성 물질을 전달하는데 사용할 수 있다. 어떤 의미에서는, 본 발명의 분자 전체가 세포에 침투하는 외인성 물질이다; 그러므로, "부가적인" 외인성 물질은 핵심(core) 세포-표적화 분자 자체는 제외하고 연결된 이형물질(heterologous materials)이다. 무독성의 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 세포-표적화 분자의 구성요소로서, 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 그가 있는 세포의 시토졸으로의 세포내 경로화를 효율적으로 지휘하는 한, 세포 표적 세포 내로 외인성 물질을 전달하는데 용이할 수 있다.
[277] 촉매적으로 중요한, 75, 77, 114, 167, 170, 176, 및 203(또는 관련된 시가 독소 A 서브유닛에서 일치하는 위치, 예: SLT-2A에 위치 204)에 선천적으로 배치된 아미노산 잔기만 다른 세포독성 분자 및 본 발명의 세포-표적화 분자의 변종 및 유도체는 모두 다른 위치에 있는 야생형의 아미노산 잔기를 가진 부모분자(parental molecules)와 비교했을 때 동일한 준세포 경로화 활성 레벨을 가질 것이다.
[278] 본 명세서에 명시된 "부가적인 외인성 물질"은 일반적으로 원래의 표적 세포 내에 존재하지 않고, 하나 이상의 분자를 뜻하며, 본 발명의 분자는 세포의 내부에 그러한 물질을 특이적으로 전달하는 데 사용할 수 있다. 부가적인 외인성 물질의 비제한적인 예는 세포독성제, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 검출 촉진제, 및 소분자 화학요법제들이다.
[279] 부가적인 외인성 물질 전달을 위한 본 발명의 분자의 어떤 구체예에서는, 부가적인 외인성 물질은 다음과 같은 세포독성제이다: 소분자 화학요법제, 세포독성 항생제, 알킬화제, 항대사물질, 극소이성화효소 억제제, 및/또는 튜불린 억제제. 세포독성제의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 아지리딘, 시스플라틴, 테트라진, 프로카바진, 헥사메틸멜라민, 빈카 알칼로이드, 탁산(taxanes), 캠토테신(camptothecins), 에토포시드, 독소루비신, 미톡산트론, 테니포시드, 노보비오신, 아클라루비신(aclarubicin), 안트라사이클린(anthracycline), 악티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 돌라스타틴(dolastatins), 메이탄신(maytansines), 도세탁셀(docetaxel), 아드리아마이신, 칼리키아마이신(calicheamicin), 아리스타틴(auristatins), 피롤로벤조다이아제핀(pyrrolobenzodiazepine), 카보플라틴, 5-불소유라실(5-FU), 카페시타빈(capecitabine), 미토마이신 C, 파클리탁셀, l,3-Bis(2-클로로에틸)-l-니트로소우레아(BCNU), 리팜피신, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 및 젬시타빈.
[280] 어떤 구체예에서는, 상기 부가적인 외인성 물질은 효소를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드로 구성된다. 다른 어떤 구체예에서는, 상기 부가적인 외인성 물질은 핵산, 예를 들어 소형 억제 RNA(siRNA) 또는 마이크로 RNA(miRNA)로서 기능을 하는 RNA와 같은 핵산이다. 어떤 구체예에서는, 상기 부가적인 외인성 물질은, 박테리아 단백질, 바이러스성 단백질, 암에서 돌연변이된 단백질, 암에서 비정상적으로 발현된 단백질, 또는 T-세포 상보적 결정 영역으로부터 유도된 항원과 같은, 항원이다. 예를 들어, 외인성 물질은 외인성 항원으로서 기능 할 수 있는 박테리아에 감염된 항원-제시 세포, 및 T-세포 상보적 결정 영역의 특성과 같은, 항원을 포함한다. 외인성 물질의 부가적인 예는 효소와 같은 항원 펩티드보다 큰 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 외인성 물질은 숙련자에게 알려지거나 알려지지 않은 하나 이상의 항원을 선택적으로 포함할 수 있다.
[281] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자의 분자 모이어티는 부가적인 외인성 물질을 포함하거나 또는 그로 필수적으로 이루어진다.
F. 진단 기능을 위한 정보 수집
[282] 본 발명의 어떤 세포-표적화 분자는 시험관내 및/또는 체내에서 특정 세포, 세포 유형, 세포 집단, 및/또는 앞서 명시된 것의 특정 준세포 구획을 탐지하는데 사용된다. 어떤 구체예에서는, 본 명세서에 기술된 세포-표적화된 것은 진단 및 치료 모두, 또는 진단만을 사용된다. 동일한 세포-표적화 분자가 진단 및 치료 모두에 사용되는 경우, 진단용 검출 촉진제를 포함한 세포-표적화 분자의 변종은 본 발명에 기술된 모범적인 치환을 포함한 하나 이상의 아미노산 치환을 통해 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 촉매 불활성에 의해 무독성이 될 수 있다. 검출 촉진제에 결합된 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자의 무독성 형태는 동일한 또는 관련된 결합 영역을 포함하는 최적 투약 방식(therapeutic regimen)과 함께 실행하는 진단 프로그램에 선택적으로 사용할 수 있다.
[283] 본 발명의 다양한 세포-표적화 분자에 당업계에 알려진 검출 촉진제를 결합하는 능력은 암, 종양, 면역, 및 감염된 세포 탐지를 위한 유용한 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포-표적화 분자의 이러한 진단 구체예는 당업계에 알려진 다양한 영상 기술 및 분석법을 통하여 정보 수집용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포-표적화 분자의 진단 구체예는 환자 또는 생체 조직 검사 샘플의 개별 암세포, 면역 세포, 또는 감염된 세포의 세포 내 세포소기관(예를 들어, 세포 내 이입(endocytotic), 골지체, 소포체, 및 시토졸 구획)의 영상을 통한 정보수집용을 위해 사용할 수 있다.
[284] 다양한 유형의 정보는 진단적 용도 또는 기타 용도를 위해 본 발명의 세포-표적화 분자의 진단 구체예를 사용해 수집할 수 있다. 이러한 정보는, 예를 들어, 종양 세포 유형 진단, 환자 질병의 치료 민감성 결정, 시간 경과 항종양 치료의 진행 분석, 시간 경과 면역조절 치료의 진행 분석, 시간 경과 항균성 치료의 진행 분석, 이식 물질에서 감염된 세포 측정, 이식 물질에서 원치않는 세포 유무 측정, 및/또는 종양 덩어리의 외과적 절제 후 잔여 종양 세포의 유무 측정에 용이할 수 있다.
[285] 예를 들어, 환자의 부분 모(母)집단은 본 발명의 세포-표적화 분자의 진단적 변종을 사용하여 수집한 정보를 사용해 확인할 수 있고, 그리고 개별 환자는 그러한 진단 구체예를 사용하여 밝혀진 독특한 특성에 기반해 부분 모집단으로 더 분류될 수 있다. 예를 들어, 특정한 의약 또는 치료의 효과는 환자 부분 모(母)집단을 정의하기 위하여 사용된 기준의 한 유형일 수 있었다. 예를 들어, 본 발명의 특정한 세포독성 세포-표적화 분자의 무독성 진단 변종은 어느 환자가 본 발명의 동일한 분자의 세포독성 변종에 긍정적으로 반응할 것으로 예측된 환자의 한 집단 또는 부분 모집단에 속하는지를 구별하는데 사용된다. 따라서, 그의 무독성 변종을 포함한 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자를 사용하는 환자 식별, 환자 계층화, 및 진단을 위한 관련된 방법은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
[286] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 퓨린 및/또는 퓨린-유형 단백질 분해효소가 골지체, 엔도솜 및 소포체로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 세포의 준세포 구획에 존재하도록 퓨린 및/또는 퓨린-유형 단백질 분해효소를 발현하는 표적세포를 수반한 방법(예: 세포 사멸, 부가적인 외인성 물질 전달, 및/또는 특정 세포 유형의 특정 준세포 구획 검출 방법)에 사용된다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자는 퓨린 발현 세포를 사멸하는데 사용된다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자는 퓨린-결핍 세포를 사멸하는데 사용되고, 척추동물에 투여됐을 때 향상된 체내 내성을 보인다.
IV. 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 분자의 폴리펩티드 서열에서의 변형
[287] 숙련자는 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 구성요소 및 분자(예: 세포독성 분자 및 본 발명의 세포-표적화 분자에 더하여 앞서 명시된 어느 것도 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)에, 그의 생물학적 활동의 감소 없이, 예를 들어 하나 이상의 시가 독소 작동체 기능, 세포-표적화 기능(들), 표적 생체분자 결합, 표적화된 세포독성 활동, 향상된 체내 내성, 향상된 안정도, 및/또는 외인성 물질(들)을 표적 세포로 전달하는 능력과 같은 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 세포-표적화 분자의 전체적인 구조 및 기능을 유지함으로써, 변형을 시킬 수 있다.
[288] 예를 들어, 어떤 변형은 발현, 정제, 및/또는 약동학적 특성, 및/또는 면역원성을 가능하게 한다. 그러한 변형은 숙련자에게 자명하며, 예를 들어, 개시 사이트를 제공하기 위하여 아미노산 말단에 부가된 메티오닌, 편리하게 위치한 제한 사이트 또는 종말 코돈을 생성하기 위해 각 말단에 위치한 부가적인 아미노산, 및 편리한 검출 및/또는 정제를 제공하기 위하여 각 말단에 융합된 생화학 친화성 태그를 포함한다.
[289] 또한 본 발명에서는, 항원결정기 태그 또는 다른 모이어티에 대한 서열과 같은, 아미노 및/또는 카르복시 말단에 부가적인 아미노산 잔기 포함여부도 고려된다. 상기 부가적인 아미노산 잔기는, 예를 들어, 클로닝, 발현, 번역 후 변형, 합성, 정제, 검출, 및/또는 투약을 가능하게 하는 것과 같은 다양한 목적을 위하여 사용된다. 항원결정기 태그 및 모이어티의 비제한적인 예로는 다음이 있다: 키틴질 결합 단백질 도메인, 엔테로펩티다아제 절단 사이트, 인자 Xa 절단 사이트, FIAsH 태그, FLAG 태그, 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타치온-S-트렌스퍼라제 모이어티, HA 태그, 말토즈 결합 단백질 도메인, myc 태그, 폴리히스티딘 태그, ReAsH 태그, 연쇄상 구균-태그(strep-tags), 연쇄상 구균-태그 II, TEV 단백질 분해효소 사이트, 티오레독신 도메인, 트롬빈 절단 사이트, 및 V5 항원결정기 태그.
[290] 상기 구체예 중 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 구성요소의 폴리펩티드 서열은 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 유지하는 한, 그리고 시가 독소 작동체 폴리펩티드가, 단독으로 그리고/또는 세포-표적화 분자의 구성요소로, 세포내 경로화, 촉매 활성, 및/또는 세포독성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시가 독소 작동체 기능을 보이는 한, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 따라 다르다. 상기 구체예 중 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자의 폴리펩티드 서열은 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역이 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 유지하고 결합 영역이 세포외 표적 생체분자 결합 특이성을 유지하는 한, 폴리펩티드 영역에 도입된 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 따라 다르다.
[291] 본 명세서에 명시된 "보존적 치환"은 하나 이상의 아미노산이 다른, 생물학적으로 유사한 아미노산 잔기에 의해서 대체되는 것을 뜻한다. 실시예는, 예를 들어, 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산 및 방향성 아미노산(예를 들어, 하기 표 B 참조)과 같이, 유사한 특성을 가진 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로 내인성 포유류 펩티드 및 단백질에서 찾을 수 없는 잔기를 가진 보존적 치환의 예로는, 예를 들어 오르니틴, 카나바닌, 아미노에틸시스테인, 또는 다른 염기성 아미노산을 가진, 아르기닌 또는 라이신 잔기의 보존적 치환이다. 펩티드 및 단백질에서의 표현형적으로 잠재적인 치환에 관한 더 많은 정보는, 예를 들어, Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)에서 얻을 수 있다.
[292] 하기 표 B의 보존적 치환에서, 아미노산의 모범적인 보존적 치환은 다음과 같은 물리화학적 성질에 의해 분류된다 - I: 중성, 친수성; II: 산성 및 아미드; III: 염기성; IV: 소수성; V: 방향성, 벌키 아미노산, VI 친수성 비전하성, VII 지방족 비전하성, VIII 비극성 비전하성, IX 싸이클로알케닐-연관, X 소수성, XI 극성, XII 작은, XIII 회전-허용, 및 XIV 신축성. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 다음과 같은 것을 포함한다: 1)S는 C를 대체할 수 있다; 2) M 또는 L은 F를 대체할 수 있다; 3) Y는 M을 대체할 수 있다; 4) Q 또는 E는 K를 대체할 수 있다; 5) N 또는 Q는 H를 대체할 수 있다; 및 6) H는 N을 대체할 수 있다.
[표 B]
보존적 아미노산 치환의 예들
[293] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 분자는, 1) 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 유지하는 한 그리고 시가 독소 작동페 폴리펩티드가, 단독으로 그리고/또는 세포-표적화 분자의 구성요소로서, 세포내 경로화, 촉매 활성, 및/또는 세포독성과 관련된 합당한 레벨의 시가 독소 작동체 기능(들)을 보이는 한; 그리고 2) 세포-표적화 분자가 세포외 표적 생체분자 결합 특이성을 유지한 결합영역을 포함하는 한, 본 명세서에 나열된 폴리펩티드 서열과 비교해 많아야 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 아미노산 치환(들)을 가진 본 발명의 폴리펩티드 영역의 기능적인 단편 또는 변종을 포함할 수 있다. 본 발명의 분자의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 구성요소 및/또는 본 발명의 세포-표적화 분자의 변종은, 예를 들어 변화된 세포독성, 변화된 세포분열억제 효과, 변화된 면역원성, 및/또는 변화된 혈청 반감기와 같은 바람직한 성질을 얻기 위해, 세포-표적화된 결합영역 또는 시가 독소 작동체 폴리펩티드 내에서 하나 이상의 아미노산의 변형 또는 제거 또는 삽입에 의해, 본 발명의 분자의 폴리펩티드를 변화시키는 결과로서 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 분자는 신호 서열과 함께 또는 신호 서열 없이 존재할 수 있다.
[294] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 구성요소는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 붕괴된 퓨린 절단 모티프를 유지하는 한 그리고 시가 독소 작동체 폴리펩티드가, 단독으로 그리고/또는 세포-표적화 분자의 구성요소로, 예를 들어, 준세포 경로화, 세포독성, 효소 촉매작용, 및/또는 촉매 리보솜 불활성화 같은, 측정 가능한 생물학적 활성을 유지하는 한, 본 명세서에 나열된 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역이 붕괴된 퓨린 절단 모티프를 유지하는 한 그리고 세포-표적화 분자가, 예를 들어, 준세포 경로화, 세포독성, 세포외 표적 생체분자 결합, 세포 내재화, 효소 촉매작용, 및/또는 촉매 리보솜 불활성화 같은, 측정 가능한 생물학적 활성을 유지하는 한, 본 명세서에 나열된 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진다.
[295] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 구성요소는, 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 유지하는 한 그리고 단독으로 그리고/또는 세포-표적화 분자의 구성요소로 세포내 경로화, 촉매 활성, 및/또는 세포 활성으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 시가 독소 작동체 기능을 보이는 한, 효소 활성 및/또는 세포독성을 변화시키기 위하여 변형될 수 있다. 이러한 변화는, 결과적으로, 개조된 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 구성요소인 시가 독소 작동체 폴리펩티드 또는 세포독성 분자의 세포독성의 변화를 야기하거나 또는 야기하지 않을 수도 있다. 가능한 변형은 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 유지하는 한 그리고 시가 독소 작동체 폴리펩티드가, 단독으로 그리고/또는 세포-표적화 분자의 구성요소로, 세포내 경료화, 촉매 활성, 및/또는 세포독성으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 시가 독소 작동체 기능을 유히하는 한, 절단, 제거, 도치, 삽입, 재배열, 및 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대한 돌연변이를 포함한다.
[296] 본 발명의 분자는 각각 시가 독소 작동체 기능(예: 시토졸으로의 세포내 경로화)을 유지한 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역을 포함하지만, 어떤 구체예에서는, 예를 들어 효소 활성의 핵심적인 잔기를 하나 이상 돌연변이 시키는 것으로 세포증식억제 유발, 외인성 물질의 전달, 및/또는 세포 유형의 검출과 같은, 비-세포독성 기능을 위해 세포독성 부모분자로부터 감소된 또는 제거된 세포독성을 가진 분자로 가공할 수 있다.
[297] 시가 독소군 개체의 A 서브유닛의 촉매 및/또는 세포독성 활성은 돌연변이 또는 절단에 의해 감소 또는 제거된다. 시가 독소 A 서브유닛의 효소 활성 및/또는 세포독성에 가장 중요한 잔기들은 아스파르긴-75, 티로신-77, 글루탐산염-167, 아르기닌-170, 및 아르기닌-176 등의 잔기-위치로 표지(mapped)되었다(Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). 특히, 글루탐산염-E167에서-라이신 및 아르기닌-176에서-라이신 돌연변이를 포함한 Stx2A의 이중-돌연변이 구조물(double-mutant construct)은 완전히 불활성화되었지만; Stx1 및 Stx2의 많은 단일 돌연변이는 세포독성에 있어 10배 감소를 보였다. 티로신-77, 글루탐산염-167, 아르기닌-170, 티로신- 114, 및 트립토판-203으로 표지된 위치는 Stx, Stx1, 및 Stx2의 촉매 활성에 중요한 것으로 나타났다(Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). 글루탐산염-167 및 아르기닌-170 양자의 돌연변이는 무세포 리보솜 비활성 분석 내에서 Slt-I A1의 효소 활성을 제거하였다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). 소포체 내에서 Slt-I A1의 드 노보(de novo) 발현을 사용한 다른 접근에서, 글루탐산염-167 및 아르기닌-170 양자의 돌연변이는 그 발현 레벨에서 Slt-I A1 단편 세포독성을 제거하였다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
[298] SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)로부터 유도되었거나 그로부터 유도된 구성요소를 포함하는 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/E또는 세포-표적화 분자의 어떤 구체예에서는, 시가 독소 작동체는 야생형 시가 독소 서열로부터의 변경(alteration)을 포함하고, 예로는, 하나 이상의 다음의 치환(들)이 있다: 위치 75에 있는 아스파라긴, 위치 77에 있는 티로신, 위치 114에 있는 티로신, 167에 있는 글루탐산염, 위치 170에 있는 아르기닌, 위치 176에 있는 아르기닌, 및/또는 위치 203에 있는 트립토판의 치환. 이러한 치환의 예는 숙련자라면, 예를 들어 붕괴된 퓨린-절단 모티프가 붕괴된 대로 있고 시가 독소 작동체 폴리펩티드가, 단독으로 또는 세포-표적화 분자의 구성요소로, 세포내 경로화, 촉매 활성, 및/또는 세포독성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시가 독소 작동체 기능을 유지하는 한, 위치 75에 있는 아스파라긴에서 알라닌으로, 위치 77에 있는 티로신에서 세린으로, 위치 114에 있는 티로신의 알라닌으로의 치환, 위치 167에 있는 글루탐산염의 아스파르트산염으로의 치환, 위치 170에 있는 아르기닌의 알라닌으로의 치환, 위치 176에 있는 아르기닌의 라이신으로의 치환, 및 또는 위치 203에 있는 트립토판의 알라닌으로의 치환과 같은, 선행기술에 근거하여 알고 있을 것이다. 시가 독소 효소 활성 및/또는 세포독성을 강화하거나 또는 감소하는 다른 돌연변이는 본 발명의 범위내에 있고 본 명세서에 명시된 널리 알려진 기술 및 분석법을 사용하여 알 수 있다.
[299] 본 발명의 분자의 어떤 구체예에서는, 붕괴된 퓨린-절단 모티프가 붕괴된 대로인 한, 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역의 효소 활성을 증가시키기 위해 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이, 삽입, 또는 제거할 수 있다. 예를 들어, Stx1A의 잔기-위치 알라닌-231을 글루탐산염으로 돌연변이 시키는 것은 그의 시험관 내 효소 활성을 증가시켰으나(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)), 퓨린-절단 민감성을 회복하지는 않았다.
[300] 본 발명의 분자는 본 명세서에 기술된 제제(agents)을 포함해 당업계에 알려진 치료 및/또는 진단 제제를 포함하는 하나 이상의 부가적인 제제에 선택적으로 접합될 수 있다.
V. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드 및 이를 포함하는 세포-표적화 분자의 생산, 제조, 및 정제
[301] 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 구성요소 및 세포-표적화 분자는 당업계에 널리 알려진 생화학 공학 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 세포-표적화 분자는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템의 사용, 또는 다른 적절한 방법으로 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 세포-표적화 분자는 다음과 같은 과정을 포함한 다양한 경로로 합성될 수 있다: (1) 표준 고상 또는 액상 방법론, 단계적 또는 단편 조합, 및 최종 펩티드 또는 단백질 생성물(product)의 격리 및 정제를 사용한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 구성요소 합성; (2) 숙주 세포 내에서 본 발명의 분자(예: 폴리펩티드 또는 단백질)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 발현 및 숙주 세포 또는 숙주 세포 배지로부터 상기 발현의 생성물 회수(recovering); 또는 (3) 본 발명의 분자(예: 세포-표적화된 폴리펩티드 또는 단백질)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 무세포 시험관 내 발현, 및 상기 발현의 생성물 회수; 또는 펩티드 구성요소의 단편을 얻은 다음에 펩티드 구성요소를 얻기 위하여 상기 단편을 연결시키고(예: 결찰(ligating)), 펩티드 구성요소를 회수하기 위한 (1), (2) 또는 (3)의 방법의 조합. 예를 들어, 폴리펩티드 및/또는 펩티드 구성요소는, 예를 들어 N,N'-디사이클로헥시카르보다이미드(dicyclohexycarbodiimide) 및 N-에틸-5-페닐-이소자졸리엄(isoxazolium)-3'-술폰산염(우드워드 시약 K).
[302] 본 발명의 분자의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 구성요소(예: 세포-표적화 분자)를 고체상 또는 액체상 펩티드 합성으로 합성하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 세포-표적화 분자는 표준 합성 방법으로 적합하게 제조할 수 있다. 따라서, 펩티드는, 예를 들어 표준 고체상 또는 액체상 방법, 단계적 또는 단편 조합, 및 최종 펩티드 생성물 격리 및 정제에 의한 상기 펩티드를 합성하는 것을 포함한 방법으로 합성할 수 있다. 이러한 맥락에서, 참고문헌은 WO 1998/11125 또는, 그 중에서도, Fields G et al, Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis(Synthetic Peptides, Grant G, ed., Oxford University Press, U.K., 2nd ed., 2002) 및 그에 따른 합성 예들로 이루어졌다.
[303] 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및 세포-표적화 분자는 당업계에 널리 알려진 재조합 기술을 사용하여 조제(생산 및 정제)할 수 있다. 일반적으로, 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포 배양 및 세포 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 것으로 폴리펩티드를 조제하는 방법은, 예를 들어 Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989); Dieffenbach C et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)에 기술되어 있다. 적합한 숙주 세포라면 어느 것이라도 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 분자(예: 세포-표적화된 단백질)를 생산하는데 사용할 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 분자의 폴리펩티드의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터로 인하여 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염될 수 있다. 더하여, 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 분자(예: 세포-표적화된 단백질)는, 변화된 세포독성, 변화된 세포분열억제 효과, 변화된 면역원성, 및/또는 변화된 혈청 반감기와 같은, 바람직한 성질을 얻기 위해서 하나 이상의 아미노산 변형 또는 하나 이상의 아미노산의 제거 또는 삽입 결과를 야기하는, 본 발명의 분자(예: 세포-표적화된 단백질)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변형하는 것으로 생산할 수 있다.
[304] 본 발명의 분자(예: 시가 독소 작동체 폴리펩티드 또는 세포-표적화된 단백질)를 생산하기 위해 선택될 수 있는 광범위하고 다양한 발현 시스템이 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 발현을 위한 숙주 유기체는 대장균 및 B. 서브틸리스와 같은 원핵생물 및 효모 및 곰팡이(예를 들어 S. cerevisiae, P. pastoris, A. awamori, 및 K. lactis)같은 진핵세포, 조류(algae)(예를 들어 C. reinhardtii), 곤충 세포주, 포유류 세포(예를 들어 CHO 세포), 식물 세포주, 및 형질전환 식물(A. thaliana 및 N. benthamiana)과 같은 진핵세포 유기체를 포함한다.
[305] 따라서, 본 발명은 앞서 언급된 방법 및 (i) 본 발명의 분자 또는 그의 폴리펩티드 구성요소를 부분적으로 또는 전부 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, (ii) 적합한 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에 도입되었을 때 본 발명의 분자 또는 그의 폴리펩티드 구성요소를 부분적으로 또는 전부 인코딩할 수 있는 최소 하나의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터, 및/또는 (iii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함한 숙주세포를 사용하여 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 분자를 생산하는 방법 또한 제공한다.
[306] 폴리펩티드 또는 단백질이 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 재조합 기술을 사용하여 발현될 때, 고순도 또는 실질적으로 균질의(homogeneous) 제제를 얻기 위하여 숙주 세포 인자와 같은 다른 구성요소로부터 바람직한 폴리펩티드 또는 단백질을 분리(또는 정제)하는 것이 유리하다. 정제는 원심분리 기술, 추출 기술, 크로마토그라픽 및 분별 기술(예를 들어, 겔 여과에 의한 크기 분리, 이온-교환 칼럼에 의한 전하 분리, 실리카 및 DEAE등과 같은 양이온-교환 수지 상 크로마토그라피, 크로마토포커싱, 및 오염물질 제거를 위한 단백질 A 세파로오스 크로마토그라피), 및 침전 기술(예를 들어, 에탄올 침전 또는 황산 암모늄 침전)과 같은 당업계에 널리 알려진 방법에 의해 실행될 수 있다. 수많은 생화학적 정제 기술은 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 분자(예: 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 세포-표적화된 단백질, 또는 다른 세포-표적화 분자)의 순도를 증가시키기 위해 사용할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자는 선택적으로 호모-다중결합 형태(즉, 두 가지 이상의 동일한 단백질 또는 본 발명의 세포-표적화 분자의 단백질 복합체) 또는 헤테로-다중결합 형태(즉, 두 가지 이상의 다른 단백질 또는 본 발명의 세포-표적화 분자의 단백질 복합체)로 정제될 수 있다.
[307] 하기의 실시예는 본 발명의 분자 생산 방법의 비제한적인 예를 설명하며, 또한 모범적인 본 발명의 분자(예: 단쇄의 융합 폴리펩티드) 생산을 위한 상세하지만 비제한적인 측면이다.
VI. 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 약학적 및 진단 조성물
[308] 본 발명은 약학적 조성물 내에서, 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 치료 제제와 함께, 증상, 질병, 장애, 또는 하기에 상세히 기재된 증상(예를 들어, 암, 악성 종양, 비-악성 종양, 성장 이상, 면역 장애, 및 미생물 감염)의 치료 또는 예방을 위한 용도로 사용되는 분자를 제공한다. 나아가 본 발명은, 본 발명의 분자, 예를 들어 본 발명의 세포-표적화 분자, 또는 약학적으로 적용 가능한 염 또는 그의 용매화합물과, 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 약학적으로 적용 가능한 담체, 부형체, 또는 매개체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 분자 또는 세포-표적화 분자의 호모-다중결합 및/또는 헤테로-다중결합 형태를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질병, 증상, 장애, 또는 하기에 상세히 기재된 이상징후에 대한 치료, 개선, 또는 예방의 방법에 용이하다. 그러한 각각의 질병, 증상, 장애, 또는 징후는 본 발명에 따른 약학적 조성물 용도에 대해서 분리된 구체예로 구상된다. 나아가, 본 발명은 하기에 더욱 상세히 기술되는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 치료 방법에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
[309] 본 명세서에 명시된, "환자(patient)" 및 "피험체(subject)"라는 용어는, 적어도 하나의 질병, 장애, 또는 증상의 징후, 신호, 및/또는 조짐을 보이는 어느 유기체라도, 일반적으로 인간 및 동물과 같은 척추동물을 나타내기 위하여 교대해서 사용된다. 이 용어는 영장류, 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 애완 동물(예를 들어, 고양이, 개 등) 및 실험 동물(예를 들어, 생쥐, 토끼, 쥐 등)의 비제한적 예의 포유류를 포함한다.
[310] 본 명세서 명시된, "치료", "처치" 또는 "치료법" 및 그와 유사한 단어는 유용하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근방법을 뜻한다. 상기 용어는 증상, 질병 또는 장애의 발병 또는 발달을 늦추고, 그것과 관련된 증상을 감소시키거나 약화시키고, 상기 증상의 완전하거나 부분적인 퇴행을 생성하거나, 상기 언급된 방법의 몇몇 조합을 뜻할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 유용하거나 바람직한 임상 결과들은, 검출 가능하던 가능하지 않던, 증상의 감소 또는 약화, 질병 규모의 감소, 질병 상태의 안정화(예를 들어, 악화가 아닌), 질병 진행의 지연 또는 속도 감소, 상기 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 차도(부분적 또는 전체적)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "치료", "처치", 또는 "치료법"은 또한 만약 치료를 받지 않을 경우, 예상 생존기간에 상대적인 생명연장을 의미할 수도 있다. 치료가 필요한 피험체(예를 들어, 인간)는 따라서 상기 질병 또는 장애를 가진 피험체다. 상기 "치료", "처치", 또는 "치료법"은 병적 상태 또는 치료의 부재에 상대적인 증상의 강도의 증가를 억제하거나 감소하는 것을 포함하며, 반드시 상기 관련된 질병, 장애, 또는 증상의 완벽한 중단을 의미하는 것은 아니다. 종양 및/또는 암과 관련하여, 치료는 전체적인 종양 덩어리(burden) 및/또는 개별 종양 크기에서의 감소를 포함한다.
[311] 본 명세서에 명시된, "방지" 또는 "예방" 및 그와 유사한 단어는 증상, 질병, 또는 장애의 발달을 예방하거나 병리학적으로 변형시키기 위한 접근 방법을 뜻한다. 따라서, "예방"은 예방적인 조치를 뜻할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유용하거나 바람직한 임상 결과들은, 검출 가능하던 가능하지 않던, 질병의 증상, 진행 또는 발전의 예방 또는 속도 감소를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예방이 필요한 피험체(예를 들어, 인간)는 따라서 상기 질병 또는 장애가 아직 없는 피험체다. 상기 "예방"은 치료의 부재에 상대적인 발병을 늦추는 것을 포함하며, 반드시 관련된 질병, 장애, 또는 증상의 영구적인 예방을 의미하는 것은 아니다. 따라서 증상의 "방지" 또는 "예방"은 어떤 문맥에서는 상기 증상 발생의 위험도를 감소시키거나, 상기 증상과 연관된 징후의 발전을 방지하거나 지연하는 것을 뜻할 수 있다.
[312] 본 명세서에 명시된, "효과적인 용량" 또는 "치료적으로 효과적인 용량"은, 표적 증상을 예방하거나 치료하고 또는 상기 증상과 연관된 징후를 이롭게 완화하는 것과 같은, 피험체에 적어도 하나의 바람직한 치료 효과를 생산하는 조성물(예를 들어, 치료적 조성물 또는 제제)의 용량 또는 복용량이다. 가장 바람직한 치료적으로 효과적인 용량은, 주어진 필요로 하는 피험체에 따라서 당업계의 숙련자가 선택한 특정한 치료의 바람직한 효험을 보이는 용량이다. 이 용량은, 치료 분자 또는 조성물의 특성(활성, 약리성, 약력학, 및 생물학적 이용가능성 포함), 피험체의 생리학적 조건(연령, 성별, 질병 유형, 질병 단계, 일반적인 신체적 조건, 주어진 복용량에 반응 정도, 및 약물 유형 포함), 배합(formulation)에 있는 약학적으로 적용가능한 담체 또는 담체의 성질(nature), 및 투약 경로를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 숙련자가 이해하는 다양한 요인에 따라 다를 것이다. 임상 및 약학 분야의 숙련자는 일정한 실험, 즉 화합물의 투여에 대한 피험체의 반응 모니터 및 그에 따른 복용량 조정을 통하여 치료적으로 효과적인 용량을 결정할 수 있을 것이다(예: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995) 참조).
[313] 본 발명의 진단 조성물은 본 발명의 분자 및 하나 이상의 검출 촉진제를 포함한다. 당업계에는, 예를 들어 동위원소, 염료, 비색 제제, 조영 강화 제제, 형광 제제, 생물발광제, 및 자기 제제와 같은, 다양한 검출 촉진제가 알려져 있다. 이러한 제제들은 어떠한 위치에서도 본 발명의 분자 내로 합체될(incorporated) 수 있다. 상기 제제의 합체는 본 발명의 세포독성 분자의 아미노산 잔기를 통해 또는 링커(linkers) 및/또는 킬레이터를 포함해 당업계에 알려진 어떤 유형의 연쇄(linkage)를 통해서일 수 있다. 상기 제제의 합체는 검진(screen), 분석, 진단 과정, 및/또는 영상 기술에서 상기 진단 조성물 제제의 검출을 가능하게 하는 방법이다.
[314] 본 발명의 진단 조성물을 생성 또는 제조할 때, 본 발명의 분자(예: 세포-표적화된 문자)는 직접적으로 또는 간접적으로 하나 이상의 검출 촉진제와 연쇄될 수 있다. 숙련자들에게는, 예를 들어 유기체의 질병, 장애, 또는 증상에 대한 진단 및/또는 예측 적용과 같은 것을 위한 정보 수집을 위해 본 발명의 분자에 연결될 수 있는 수많은 검출 촉진제들이 알려져 있다(예: Cai W et al., J Nucl Med 48: 304-10 (2007); Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem 20: 825-41 (2009); Paudyal P et al., Oncol Rep 22: 115-9 (2009); Qiao J et al., PLoS ONE 6: e18103 (2011); Sano K et al., Breast Cancer Res 14: R61 (2012) 참조). 예를 들어, 검출 촉진제는 다음을 포함한다: 형광 색소(예: 알렉사680, 인도시아닌녹색, 및 Cy5.5)와 같은 영상 조영제; 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 73Se, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 110In, 111In, 120I, 123I, 1241, 125I, 131I, 154Gd, 155Gd, 156Gd, 157Gd, 158Gd, 177Lu, 186Re, 188Re, 및 223R과 같은 동위원소 및 방사성 핵종; 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐 (II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 또는 에르븀(III)과 같은 상자성 이온; 라타늄(III), 금(III), 납(II), 및 창연(III)과 같은 금속; 리포솜과 같은 초음파-조영제; 바리움, 갈리움 및 탈리움 화합물과 같은 방사선 불투과성 제제. 검출 촉진제는 2-벤질 DTPA, PAMAM, NOTA, DOTA, TETA, 그의 유사체와 같은 킬레이터, 및 상기 언급한 것들과 기능적 균등체와 같은, 매개체 기능 그룹(intermediary functional group)을 사용하는 것으로 직접적으로 또는 간접적으로 합체할 수 있다(Leyton J et al., Clin Cancer Res 14: 7488-96 (2008) 참조).
[315] 당업계의 숙련자들에게는, 단백질에, 특히 면역글로불린 및 면역글로불린-유래 도메인에, 다양한 검출 촉진제를 합체, 접착, 및/또는 접합(conjugate)하는 수많은 표준 기술들이 알려져 있다(Wu A, Methods 65: 139-47 (2014)). 유사하게, 숙련자에게 알려진, 의학 분야에 흔히 사용되는 비침습적인 체내 영상 기술과 같은, 수많은 영상 접근법이 있으며, 예로는: 컴퓨터 토모그라피 화상 분석기(CT 스캐닝), 광학 촬영(직접 촬영, 형광 촬영, 및 생물발광 촬영 포함), 자기 공명 화상법(MRI), 양전자 방사 단층 촬영(PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 초음파, 및 x-선 전산화 단층 촬영이 있다(Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111 (2012) 참조).
프로테아제 절단-저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 약학적 및/또는 진단 조성물 생성 또는 제조
[316] 본 발명의 분자의, 예를 들면 본 발명의 세포-표적화 분자의, 약학적으로 적용가능한 염 또는 용매화합물은 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 있다.
[317] 본 발명의 내용 중 “용매 화합물”이라는 용어는 용질(본 발명의 분자 또는 그의 약학적으로 적용가능한 염) 및 용매 사이에 형성된 정의된 화학량론의 복합체(complex of defined stoichiometry)를 말한다. 이 연결에서 상기 용매는, 예를 들어, 물, 에탄올 또는 다른 약학적으로 적용가능한, 아세트산 또는 젖산과 같은 하지만 이에 제한되지 않는, 전형적으로 소형-분자의 유기 종류일 수 있다. 상기 용매가 물인 경우, 그러한 용매화합물은 일반적으로 하이드레이트(hydrate)라 불린다.
[318] 본 발명의 분자는, 또는 그의 염은, 약학적으로 허용가능한 담체 내에 본 발명의 분자 또는 그의 염의 일반적으로 치료적으로 효과적인 용량을 포함한, 보존 및 투약을 위한 약학적 조성물로 형성(formulated)될 수 있다. 상기“약학적으로 허용가능한 담체”는 표준 약학적 담체를 모두 포함한다. 치료용의 약학적으로 허용가능한 담체는 약학 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985)에 기술되어 있다. 본 명세서 명시된, “약학적으로 허용가능한 담체”는 예를 들어, 호환성의, 용매, 분산매, 코팅제, 항미생물제, 등장성의, 및 흡수지연제, 및 그와 유사한 것과 같은, 모든 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 경구용, 항문용, 비강용 또는 비경구용(피하조직, 근육, 정맥, 피부 내, 및 경피 포함) 투약에 적절한 배합에 사용된 것을 포함한다. 모범적인 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 주사액 또는 분산제의 임기 조제(extemporaneous preparation)를 위한 멸균 수용액 또는 분산제 및 멸균 분말을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 쓸 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 유사체), 및 그에 따른 적정 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 올레산에틸과 같은 주사가능한 유기의 에스테르를 포함한다. 적정한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용, 분산제의 경우 필요 입자 크기를 유지, 그리고 계면활성제를 사용하는 것으로 유지할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 상기 담체는 정맥, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투약(예를 들어, 주사 또는 주입(infusion)에 의해)에 적절하다. 선택된 투약 경로에 따라서, 세포-표적화 분자 또는 다른 약학적 구성요소는 특정 투약 경로로 환자에게 투약했을 때 활성 분자가 겪을 수 있는 낮은 pH 및 다른 자연적 불활성 조건으로부터 상기 분자를 방어하기 위한 목적의 물질로 코팅될 수 있다.
[319] 본 발명에 따른 약학적 조성물의 배합은 편리하게 단위 투약 제제의 형태로 낼 수 있으며, 약학 분야에서 널리 알려진 방법으로 만들 수 있다. 그러한 형태에서는, 조성물은 적량의 유효 성분을 포함한 단위 투약 제제로 나눠진다. 상기 단위 투약 제제는 패키지된(packaged) 제제일 수 있으며, 상기 패키지는, 예를 들어, 포장된 타블렛형, 캡슐형, 및 병 또는 앰플 분말형과 같이 제제의 분리량을 담는다. 상기 단위 투약 제제는 캡슐형, 카시에형, 또는 정제형 그 자체일 수도 있고, 또는 이러한 패키지된 형태 중 적절한 어느 것이라도 될 수 있다. 이는 펜 형태와 같은, 단일 투약량을 주사 가능한 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 투약의 어느 적절한 경로 및 수단을 위해서라도 배합될 수 있다. 피하 또는 경피 투약 방법은 본 명세서에 기술된 본 발명의 약학적 조성물 및 치료 분자에 특히 적합할 수 있다.
[320] 본 발명의 약학적 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제 또한 포함할 수 있다. 미생물이 생기지 않도록 하는 예방은 멸균 과정 및, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산, 및 그와 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 포함하는 것으로 보장될 수 있다. 설탕, 염화나트륨 등과 같은 등장액 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사 가능한 약제 형태의 장기 지속형 흡수는 알루미늄 스테아린산염 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 제제를 포함함으로써 유발될 수 있다.
[321] 본 발명의 약학적 조성물은 선택적으로 약학적으로 적용가능한 산화방지제 또한 포함한다. 모범적인 약학적으로 적용가능한 산화방지제는 아스코르브산, 염화수소 시스테인, 황산수소나트륨, 메티중아황산 나트륨, 아황산 나트륨과 같은 수용성 산화방지제; 아스코르빌 팔미트산염, 부틸히드록시아니솔(BHA), 부틸 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 산화방지제; 및 구연산, 에틸렌디아민 티트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 주석산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제 등이 있다.
[322] 다른 측면에서는, 본 발명은 하나의 또는 본 발명의 다른 분자, 또는 앞서 기재된 것의 에스테르, 염 또는 아미드, 및 최소 하나의 약학적으로 적용가능한 담체의 조합을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
[323] 치료 조성물은 일반적으로 멸균상태이며 제조 및 보존의 환경하에서 안정적이다. 상기 조성물은 용액, 마이크로 에멀젼, 리포솜, 또는 고농도의 약물에 적합한 다른 정돈된 구조로서 배합할 수 있다. 담체는 예를 들어, 물 또는, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 알코올, 또는 어느 적합한 혼합물이라도 포함하는 용매 또는 분산제일 수 있다. 적정한 유동성은 당업계에 잘 알려진 배합 화학(formulation chemistry)에 따라, 예를 들어, 레세틴과 같은 코팅을 사용, 분산제의 경우 필요 입자 크기를 유지, 그리고 계면활성제를 사용하는 것으로 유지할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 예를 들어 설탕, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 또는 염화 나트륨과 같은 등장액이 조성물에 바람직할 수 있다. 주사 가능한 조성물의 지속적인 흡수는 스테아린산 염(monostearate salts) 및 젤라틴과 같은 조성물 내에서 흡수를 지연시키는 제제를 포함함으로써 유발할 수 있다.
[324] 피내 또는 피하 적용을 위하여 사용되는 용액 또는 현탁액은 일반적으로 다음과 같은 물질을 하나 이상 포함한다: 주사용 증류수, 식염수, 불휘발성유(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르빅산 또는 황산수소나트륨과 같은 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 구연산염, 또는 인산염과 같은 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로즈와 같은 긴장성 조절제(tonicity adjusting agents). pH는, 예를 들어 염산, 수산화 나트륨과 같은 산성 또는 염기성, 또는 구연산염, 인산, 아세트산 및 그와 유사한 것을 가진 완충제로 조절할 수 있다. 그러한 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 주사액 병에 밀봉될 수 있다.
[325] 멸균된 주사 가능한 용액은, 본 발명의 분자를 필요한 만큼 적절한 용매에 앞서 기술된 재료 하나와 또는 그의 조합을 필요한 만큼 더하고, 뒤이어 멸균 여과 과정(sterilization microfiltration)을 거치는 것으로 제조할 수 있다. 분산제는 앞서 기술된 것과 같은 분산매 및 그 외 재료를 함유한 멸균 전파체에 활성 분자를 합하는 것으로(incorporating) 제조할 수 있다. 무균의 주사 가능액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 멸균-여과된 용액으로부터의 바람직한 첨가 성분에 더불어 활성 성분의 분말을 내는, 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)하는 것이다.
[326] 본 발명의 분자의 치료적으로 효과적인 용량이, 예를 들어, 정맥, 피부 또는 피하 주사로 투여되도록 설계되었을 때, 결합제제(binding agent)는 무발열원(pyrogen-free), 비경구적으로 허용가능한 수용성 용액의 형태일 것이다. 적정 pH, 등장도, 안정도 등을 고려한 비경구적으로 허용가능한 단백질 용액 제조 방법은 당업계에 포함된 기술이다. 정맥, 피부 또는 피하 주사에 바람직한 약학적 조성물은 결합제제와 더불어, 염화 나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로즈 주사, 덱스트로즈 및 염화 나트륨 주사, 유산을 가한 링거 주사(lactated Ringer's injection)와 같은 등장성 전파체, 또는 당업계에 알려진 다른 전파체를 함유할 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 안정제, 보존제, 완충에, 산화방지제, 또는 당업계에 널리 알려진 다른 첨가제 또한 포함할 수 있다.
[327] 본 명세서의 다른 부분에 기술된 바와 같이, 본 발명의 분자 또는 그의 조성물(예: 약학적 또는 진단 조성물)은 임플란트, 경피 패치, 및 미립캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 방출조절제와 같은 급속 방출로부터 상기 분자를 보호할 담체를 포함하여 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오소에스테르, 및 폴리 유산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용할 수 있다. 그러한 제제의 수많은 제조 방법은 특허를 받았거나 당업계의 숙련자들에게 일반적으로 알려져 있다(예: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(Robinson J, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978) 참조).
[328] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 조성물(예: 약학적 또는 진단 조성물)은 생체 내에서 바람직한 분포(distribution)를 보장하기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 혈액 뇌관문은 많은 크고 그리고/또는 소수성 화합물을 배제한다. 생체 내 특정 위치에서 본 발명의 치료 분자 또는 조성물을 표적화 하기 위해서는, 예를 들어, 특정 세포 또는 기관에 특이적으로 운반되는 하나 이상의 모이어티(moieties)를 포함할 수 있는 리포솜 내에서 제조될 수 있고, 따라서 표적화된 약물 전달을 강화한다. 모범적인 표적 모이어티는 엽산 또는 비오틴; 메노사이드; 항체; 계면활성제 단백질 A 수용체; p120 카테닌 및 그의 유사체를 포함한다.
[329] 약학적 조성물은 임플란트 또는 미립자 시스템으로 사용하기 위하여 설계된 비경구적인 제제를 포함한다. 임플란트의 예는 유탁액, 이온 교환 수지, 및 용해성 염 용액과 같은 고분자 또는 소수성 구성요소로 이루어진 데포(depot) 제제이다. 미립자 시스템의 예는 마이크로스피어, 극미립자, 나노캡슐, 나노스피어, 및 나노입자다(예: Honda M et al., Int J Nanomedicine 8: 495-503 (2013); Sharma A et al., Biomed Res Int 2013: 960821 (2013); Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv 3: 1429-45 (2012) 참조). 방출조절제는 리포솜, 폴락사머 407, 및 수산화인회석과 같은 이온에 민감한 폴리머를 사용하여 제조될 수 있다.
[330] 본 발명의 약학적 조성물은, 생산된 조성물이 유탁액, 리포솜, 니오솜(niosomes), 고분자 나노입자, 및/또는 고형 지질 나노입자(SLNs)를 포함하도록, 당업계에 알려진 기술로 생산될 수 있다(예: Lakshmi P et al., Venereal Leprol 73: 157-161 (2007); A Revolution in Dosage Form Design and Development, Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems (Sezer A, ed., InTech, 2012) 참조).
[331] 일반적으로, 리포솜을 포함하는 약학적 조성물은 수성 매체에 분산된 리포솜을 포함한다(예: Li S et al., J Control Release 126: 77-84 (2008); Li S et al., Mol Ther 16: 163-9 (2008); Chen Y et al., J Invest Dermatol 130: 2790-8 (2010); Chen Y et al., J Biol Chem 285:22639-50 (2010) 참조). 리포솜 및 나노입자는 그들의 생산 과중 중에 면역글로불린 도메인, 수용체, 및/또는 리간드를 합하는 것으로 세포-표적화될 수 있다(예: Khan D et al., Chemical Biology and Drug Design 71: 3-7 (2008); Rezler E et al., Journal of the American Chemical Society 129: 4961-72 (2007); Khan D, Journal of Cancer Science and Therapy 2: 58-62 (2010); van der Meel R et al., J Control Release 159: 281-9 (2012); Sada S et al., Curr Cancer Crug Targets 15: 71-86 (2015) 참조).
[332] 일반적으로, SLN는 파라핀 왁스 및 생분해성의 글리세라이드와 같은 지질을 포함한다(예: Attama A et al., Int J Pharm 304: 4-10 (2005) 참조). SLN은, 예를 들어서, 나노입자의 형태에서 지질-치료 복합방법을 사용하는 것과 같은, 본 발명이 속한 분야의 전문가에게 널리 알려진 방법을 사용한, 본 발명의 분자(예를 들어, 세포-표적화 분자)가 충분히 있을 수 있다(Muller R et al., Eur J Pharm Biopharm 41: 62-9 (1995); Friedrich I et al., Int J Pharm 305: 167-75 (2005); Schubert MA et al., Eur J Pharm Sci 27: 226-36 (2006); Attama A et al., Eur J Pharm Biopharm 64: 294-306 (2006); Attama A, Muller-Goymann C, Int J Pharm 322: 67-78 (2006); Attama A et al., Int J Pharm 355: 307-13 (2008); Attama A et al., J Drug Deliv Sci Technol 18: 181-8 (2008); Attama A et al., Current Eye Res 34: 698-705 (2009); U.S. 특허 제8,663,692호). 특히, SLN는 세포-표적화, 결합 영역에 링크된 시가 독소-유도된 폴리펩티드를 포함한 친수성 화합물을 통합할 수 있다(Muller R et al., Eur J Pharm Biopharm 41: 62-9 (1995)). HPMA 공중합체를 포함하는 SLN는 세포 내재화 이후에 준세포 구획을 표적화하게 고안될 수 있다(Jensen K et al., J Control Release 87: 89-105 (2003)).
VII. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 및 숙주 세포
[333] 본 발명의 분자 외에, 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그에 따른 기능적 부분은 모두 본 발명의 범위 내에 존재한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 용어 "핵산"에 상응하는 용어로서, 양자는 모두 디옥시리보 핵산(DNA)의 폴리머, 리보 핵산(RNA), 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 이러한 DNA 또는 RNA 유사체들, 및 그에 따른 유도체, 단편 및 동족체를 포함한다. 본 발명의 상기의 폴리뉴클레오티드는 단일- , 이중-, 또는 삼중-가닥 일 수 있다. 개시된 폴리뉴클레오티드는 표본적인 세포-표적화 분자를 인코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 기재되어 있지만, 아직까지 다른 RNA 코돈으로서 동일한 아미노산을 인코딩하는, 예를 들어서, RNA 코돈의 세 번째 위치에서 내재된 것으로 알려진 상기의 워블(wobble)을 고려할 수 있을 따름인 것이다(Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)).
[334] 하나의 관점에서, 본 발명은, 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 분자(예를 들어서, 폴리펩티드 또는 단백질), 또는 단편 또는 그에 따른 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 상기의 단백질의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 폴리펩티드와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 분자(예를 들어서, 폴리펩티드 또는 단백질), 또는 단편 또는 그에 따른 유도체, 또는 그러한 서열 중 하나의 역배열 또는 보체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 엄격한 조건하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
[335] 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드의 유도체 또는 유사체(또는 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 단백질)는 그 중에서도, 본 발명의 상기의 폴리뉴클레오티드, 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 또는 단백질에 실질적으로 상동하는 영역을 가진, 폴리뉴클레오티드(또는 폴리펩티드) 분자를 포함하는데, 상기의 상동 정도는 예를 들어, 본 기술 분야에서 알려진 컴퓨터 상동 관계 프로그램을 통해 이루어진 정렬된 서열과 비교하는 경우 또는 동일 사이즈의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 약 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98% 나아가 99% 동일성(바람직한 동일성은 80-99%)을 의미한다. 표준 프로그램은 디폴트 세팅을 가진 GAP 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, U.S.)이며, 상기 프로그램은 Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math. 2: 482-9 (1981)에서의 알고리즘을 사용한다. 본 발명은 또한 엄격한 조건 및 그 이하에서 본 발명의 단백질을 인코딩하는 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다(Ausubel F et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993)). 엄격한 조건은 본 발명이 속한 분야의 전문가들에게 널리 알려져 있으며 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989))에서 발견할 수도 있다.
[336] 본 발명은 또한 본 발명의 범위 내에 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 단백질을 인코딩할 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터를 생산하기 위하여 본 발명이 속한 기술 분야에서 널리 알려진 물질 및 방법을 사용하여, 세균성 플라스미드, 바이러스성 벡터 및 파아지 벡터를 포함하여 공지된 벡터 속으로 삽입될 수 있다. 그러한 발현 벡터는 선택 또는 무세포 발현 시스템의 어떠한 숙주 세포 내로 고려된 본 발명의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 단백질의 생산을 지원하기 위하여 필요한 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다(예: pTxb1 및 pIVEX2.3). 특이적 유형의 숙주 세포 또는 무세포 발현의 사용을 위한 발현 벡터를 포함한 상기의 특이적인 폴리뉴클레오티드는 본 발명이 속한 기술 분야에서 널리 알려져 있으며, 규칙적인 실험을 통하여 결정될 수 있거나, 혹은 구매될 수 있다.
[337] 본문에 기재된 용어인 "발현 벡터"는 하나 이상의 유닛을 포함한 선형 또는 원형 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 용어, "발현 벡터"는 흥미있는 폴리펩티드를 인코딩하고 숙주 세포 내에서 핵산 부분의 발현을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드 부분을 표시한다. 발현 유닛은 전형적으로, 작동가능한 구성에 있는 모든, 전사 프로모터, 흥미있는 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임, 및 전사 종결자를 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 발현 유닛을 포함한다. 따라서, 본 발명의 내용에서 , 단일 폴리펩티드 사슬을 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 단백질을 인코딩하는 발현 벡터는 단일 폴리펩티드 사슬에 대한 적어도 하나의 발현 유닛을 포함하는 반면, 예를 들어서 두 가지 이상의 폴리펩티드 사슬(예를 들어서, VL 도메인을 포함하는 하나의 사슬 및 붕괴된 퓨린-절단 모티프로 이루어진 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 링크된 VH 도메인을 포함하는 두번째 사슬)로 이루어진 단백질은 적어도 두 가지 발현 유닛, 즉 상기 단백질의 두 가지 폴리펩티드 사슬 각각을 포함한다. 본 발명의 다중-사슬 단백질의 발현을 위하여, 각 폴리펩티드 사슬에 대한 발현 유닛은 또한 개별적으로 다른 발현 벡터가 포함될 수 있다(예를 들어서, 발현은 단일 숙주 세포에서 달성될 수 있는데 이것은 각 폴리펩티드 사슬에 대한 발현 벡터 속으로 도입되었다).
[338] 폴리펩티드 및 단백질의 일시적 또는 안정한 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터는 본 발명이 속한 기술 분야에서 널리 알려져 있다. 상기의 발현 벡터는 일반적으로 하기에 열거되는 인자 중 하나 이상을 포함하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다: 이형 신호 서열 또는 펩티드, 복제의 개시, 하나 이상의 마커 유전자, 촉진자, 프로모터, 및 전사 종결 서열, 이들 각각은 본 기술 분야에서 널리 알려져 있다. 사용될 수 있는 선택적인 조절에 관여하는 서열, 통합 서열, 및 유용한 마커들이 본 기술 분야에서 알려져 있다.
[339] 용어 "숙주 세포"는 상기의 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지할 수 잇는 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 E. coli 같은 원핵 세포일 수도 있고, 또는 진핵 세포(예를 들어, 효모, 곤충, 양서류, 조류, 또는 포유류 세포)일 수도 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 본 발명의 분자(예를 들어, 폴리펩티드 또는 단백질)를 생산할 수 있는 숙주 세포주를 만들고 분리하는 것은 본 기술 분야에서 알려진 표준 기술을 사용하여 완성될 수 있다.
[340] 본 발명의 범위 내에 있는 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 및/또는 단백질은 여기에 기재된 상기의 폴리펩티드의 변종 또는 유도체일 수 있으며, 상기의 폴리펩티드는, 하나 이상의 아미노산을 치환하거나 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입함에 의하여 폴리펩티드 및/또는 단백질을 인코딩하는 상기의 폴리뉴클레오티드를 변경함에 의해 생산되며, 그것은 숙주 세포에 의한 더욱 선택적인 발현과 같은 바람직한 성질을 달성하는데 더욱 적합하게 제공된다.
VIII. 고체 기질 상에 고정된 본 발명의 분자
[341] 본 발명의 어떤 구체예는 고체 기질 상에 고정된 본 발명의 분자(예를 들어, 세포독성 분자 또는 세포-표적화 분자) 또는 이에 따른 어떤 작동체 단편을 포함한다. 여기에서 고려된 고체 기질은 마이크로베드, 나노입자, 폴리머, 매트릭스 물질, 마이크로어레이, 마이크로타이터(microtiter) 플레이트, 또는 본 기술 분야에서 알려진 어떠한 고체 표면을 포함하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다(예를 들어 US 제7,771,955호). 이러한 구체예에 따라서, 본 발명의 분자는 본 기술 분야의 전문가들에게 알려진 기술을 사용하여, 예를 들어, 비드(bead), 입자, 또는 플레이트 같은, 고체 기질에 공유적으로나 비공유적으로 링크될 수 있다. 본 발명의 고정화된 분자는 본 기술 분야에서 알려진 기술을 사용하여 출원을 스크리닝하기 위하여 사용될 수 있다(Bradbury A et al., Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011); Sutton C, Br J Pharmacol 166: 457-75 (2012); Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013); Houlihan G et al., J Immunol Methods 405: 47-56 (2014)).
[342] 본 발명의 분자가 고정될 수 있는 비-제한적인 고체 기질은 하기의 예들을 포함한다: 마이크로비드, 나노입자, 폴리머, 나노폴리모, 나노튜브, 마그네틱 베드, 파라마그네틱 베드, 수퍼파라마그네틱 베드, 스트렙타아비딘 마그테틱 베드, 역상 마그네틱 베드, 카르복시 말단 베드, 히드라진 말단 베드, 실리카(소디움 실리카) 베드 및 이미노디아세트산(IDA)-변형된 베드, 알데하이드-변형된 베드, 에폭시-활성화된 베드, 디아미노디프로필아민(DADPA)-변형된 베드(프라이머리 아민 표면 그룹 베드), 생분해성 고분자 베드, 폴리스티렌 기질, 아미노-폴리스티렌 입자, 카르복실-폴리스티렌 입자, 에폭시-폴리스티렌 입자, 디메틸아미노-폴리스티렌 입자, 히드록시-폴리스티렌 입자, 색 입자, 유동 혈구 입자, 술폰산염-폴리스티렌 입자, 니트로셀룰로스 표면, 강화 니트로셀룰로스막, 나일론 막, 유리 표면, 활성화된 유리 표면, 활성화된 콸츠 표면, 폴리비닐이덴 디플로라이드(PVDF) 막, 폴리아크릴아미드-기반 기질, 폴리-비닐 클로라이드 기질, 폴리-메틸 메타아크릴레이트 기질, 폴리(디메틸 실록산) 기질, 및 광반응성 족(니트렌, 카르벤, 및 케틸 라디칼과 같은)을 포함하고 공유 결합을 형성할 수 있는 광폴리머. 본 발명의 분자가 고정될 수 있는 고체 기질의 다른 실시예들은 일반적으로 예를 들어,셀룰로오스 표면, 파아지, 및 바이러스와 같은 분자 디스플레이 시스템에서 사용된다.
IX. 전달 수단 및 키트
[343] 어떤 구체예에서, 본 발명은 피험체로의 전달을 위하여, 약학적 조성물과 같은 하나 이상의 본 발명의 물질의 조성물을 포함한 수단과 관련된다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 조성물을 포함한 전달 수단은 다음과 같은 다양한 전달 방법에 의해서 본 발명의 물질의 조성물은 피험체에 투여하는데 사용될 수 있다: 정맥, 피하, 근육 또는 복강내 주사; 경구 투여; 경피 투여; 폐 또는 경점막 투여; 이식, 삼투 펌프, 카트리지 또는 마이크로 펌프에 의한 투여; 또는 본 기술이 속한 분야의 전문가에 의해 자명한 방법에 의해 전달되는 수단.
[344] 또한 본 발명의 범위 내에는 본 발명의 물질의 적어도 하나의 조성물을 포함하는 키트가 있으며, 선택적으로 포장 및 사용에 대한 지시서가 포함된다. 키트는 약물 투약 및/또는 진단적 정보 수집을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 적어도 하나의 부가적인 시약(예를 들어서, 표준, 마커 등과 같은)을 선택적으로 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 상기 키트의 내용물의 사용 목적을 지시하는 라벨을 포함한다. 상기의 키트는 샘플 또는 피험체 내에서 세포 유형(예를 들어서, 종양 세포) 검출을 위하거나 또는 여기에 기재된 바와 같이 본 발명의 분자, 조성물, 또는 관련 방법을 사용하게 하는 피험체가 치료적 전략에 대응하는 그룹에 속하는지 여부를 진단하기 위한 시약 및 다른 툴을 포함한다.
X. 본 발명에 따른 분자의 사용을 위한 방법- 본 발명의 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 세포-표적화 분자, 약학적 조성물, 및 진단적 조성물을 포함한다.
[345] 일반적으로, 본 발명의 목적은 어떠한 암, 종양, 성장 이상, 면역 장애, 또는 여기에서 언급된 병리 증상과 같은 그러한 질병, 장애 및 증상의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는, 약학적으로 활성화된 시약 및 그 시약을 포함한 조성물을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 분자(절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드, 세포-표적화 분자, 약학적 조성물, 및 진단적 조성물을 포함한)를 세포의 표적화된 사멸을 위하여, 표적화된 세포 속으로 부가적인 외인성 물질의 전달을 위하여, 표적화된 세포의 내부 라벨링을 위하여, 진단적 정보 수집을 위하여, 및 여기에서 기재된 질병, 장애 및 증상의 치료를 위하여 사용하는 방법을 제공한다.
[346] 특히, 본 발명의 목적은 본 기술 분야에서 현재까지 알려진 약학적으로 활성화된 제제, 조성물, 및/또는 방법과 비교하여 장점을 가지는 그러한 제제, 조성물, 및/또는 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 특이적인 폴리펩티드 서열 및 그에 따른 약학적 조성물에 의한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 단백질로 구성되는 본 발명에 따른 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어서, SEQ ID NO: 4-61에서의 폴리펩티드 서열 중 어떤 것은 하기의 방법에서 사용되는 세포-표적화 분자의 구성성분으로서 특이적으로 유용될 수 있다.
[347] 본 발명은 본 발명에 따른 분자 또는 약학적 조성물로, 시험관 내 또는 체내에서 세포를 접촉하는 단계를 포함하고 세포를 사멸하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 분자 및 약학적 조성물은 청구된 물질의 조성물로 하나의 세포 또는 복수의 세포들과 접촉하고 특이적인 세포 유형을 사멸시키는데 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명에 따른 세포독성 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물은 암세포, 감염된 세포, 및/또는 혈액 세포를 포함한 혼합물과 같은 다른 유형의 세포의 혼합물 속에서 특이적인 세포 유형을 사멸시키는데 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서는, 본 발명에 따른 세포독성 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물은 다른 유형의 세포의 혼합물 속에서 암 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서는, 본 발명에 따른 세포독성 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물은 이식 전 조직 세포와 같은 다른 유형의 세포의 혼합물 속에서 특이적인 세포 유형을 사멸시키는데 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명에 따른 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물은 치료적인 목적을 위하여 이식 전 조직 세포 물질과 같은 다른 유형의 세포의 혼합물 속에서 특이적인 세포 유형을 사멸시키는데 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명에 따른 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물은 바이러스 또는 미생물에 의해 감염된 세포를 선택적으로 사멸시키는데 사용될 수 있으며, 세포 표면 생체분자와 같은 특정한 세포 외 표적 생체분자를 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시키는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 분자 또는 약학적 조성물은, 생체 외 또는 생체 내 조직 세포로부터 원하지 않는 세포 유형 제거, 이식편대숙주병에 대한 면역 반응 변형, 항바이러스제, 항 기생충제, 및 원하지 않는 세포 유형의 이식 조직세포의 제거 등과 같은, 다양한 분야에 적용되었다.
[348] 어떤 구체예에서, 본 발명에 따른 세포독성 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물은 독자적으로 또는 다른 화합물 또는 약학적 조성물과 함께 결합하여 치료의 필요가 있는 환자와 같은 피험체의 시험관내 또는 체내 세포군에 대하여 투여되는 경우 강력한 세포-사멸 활성을 나타낼 수 있다. 암 세포 유형에 대한 고-친화성 결합 영역을 사용한 효소적으로 활성화된 시가 독소 영역의 전달을 표적화함에 의하여, 이러한 강력한 세포-사멸 활성은 특이적으로 제한될 수 있으며, 어떠한 암 세포, 종양 세포, 악성 세포, 비-악성 종양 세포, 또는 감염된 세포와 같은, 기관 내에 있는 어떠한 세포 유형을 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
[349] 본 발명은 환자의 필요에 따라서 세포를 사멸시키는 방법을 제공하고, 상기의 방법은 본 발명에 다른 적어도 하나의 세포독성 분자 또는 그에 따른 약학적 조성물을 상기의 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
[350] 세포독성 세포-표적화 분자의 어떤 구체예 또는 그에 따른 약학적 조성물은 암 및/또는 종양 세포와 물리적으로 결합되어 발견되는 세포 외 생체분자를 표적화함에 의해 환자 내에 있는 암 및/또는 종양 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있다. 용어 "암(cancer) 세포" 또는 "암의(cancerous) 세포"는 비정상적인 속도로 그리고/또는 통제 없이(unregulated) 성장하고 분열되는 다양한 종양 세포에 관한 것으로서 본 기술 분야의 전문가들에게는 명확한 용어이다. 용어 "종양 세포"는 악성 및 비-악성 세포를 모두 포함하는데, 그들 자신에게는 전이될 수 없지만 악성 종양 및/또는 암 세포가 되는 딸 세포를 발생시킬 수 있는, 예를 들어서, 비-암의, 양성 종양 세포, 비-암의 "암(cancerous)" 줄기 세포, 종양 줄기 세포, 전-악성 암-초기 세포, 종양-초기 세포, 또는 종양 형성 세포 모두를 예로 들 수 있다(Martinez-Climent J et al., Haematologica 95: 293-302 (2010)). 일반적으로, 암 및/또는 종양은 치료 및/또는 예방을 받아들일 수 있는 질병, 장애 또는 증상으로서 정의될 수 있다. 신생종양 세포는 종종 하나 이상의 하기의 예들과 관련이 있다: 비규칙적인 성장, 분화의 결핍, 국소 조직 침입, 혈관형성, 및 전이. 본 발명에 따른 방법 및 조성물로부터 혜택을 볼 수 있는 암 세포 및/또는 종양으로 이루어진, 상기의 암 및 종양(악성이거나 비-악성이거나)은 본 기술 분야의 전문가들에게 자명하다 할 것이다.
[351] 본 발명은 암 줄기 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있으며, 이것은 화학요법 및 방사선 치료와 같은 일반적인 암 치료 방법과는 다른 분야를 제시한다. 예를 들어서, 급성 골수성 백혈병(AML)은 AML 줄기 세포 및/또는 휴면 AML 간 세포를 사멸시킴에 의해 본원 발명으로 치료될 수 있는 것이다(Shlush L et al., Blood 120: 603-12 (2012)). 암 줄기 세포는 종종 CD44 및 CD200과 같은, 세포 표면 표적을 과하게 발현하는데, 이것은 본 발명에 따른 표적 치료적 분자에 사용될 수 있다(Kawasaki B et al., Biochem Biophys Res Commun 364:778-82 (2007); Reim F et al., CancerRes 69: 8058-66 (2009)).
[352] 본 발명에 따른 상기의 세포독성 분자의 어떤 구체예 또는 그에 따른 약학적 조성물은 면역 세포와 물리적으로 결합 되어 발견된 세포 외 생체분자를 표적화함에 의해 환자 내에 있는 면역 세포(그것이 건강한 세포이거나 악성 종양 세포이거나 간에)를 사멸시키는데 사용할 수 있다.
[353] 본 발명에 따른 상기의 세포독성 분자의 어떤 구체예 또는 그에 따른 약학적 조성물은 감염된 세포와 물리적으로 결합 되어 발견된 세포 외 생체분자를 표적화함에 의해 환자 내에 있는 감염된 세포를 사멸시키는데 사용할 수 있다.
[354] 본 발명에 따른 상기의 세포독성 분자 또는 그에 따른 약학적 조성물을 환자로부터 척출해 분리된 세포 집단으로부터 T-세포 및/또는 B-세포를 생체 외에서 제거하는데에 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 하나의 비 제한적인 예에서는, 본 발명에 따른 상기의 세포독성 분자는 기관 이식 거부의 예방을 위한 방법에서 사용할 수 있는데, 공여 기관으로부터 원치않는 공여 T-세포 및/또는 B-세포를 제거하기 위하여 이식 전에 공여 기관에 본 발명에 따른 상기의 세포독성 분자 또는 그에 따른 약학적 조성물이 주입된다.
[355] 또한 본 발명에 따른 상기의 세포독성 분자 또는 그에 따른 약학적 조성물을 환자 세포 집단(예를 들어, 골수)에서 감염된 악성, 종양, 또는 다른 원치않는 T-세포 및/또는 B-세포를 제거하고 B-세포 및/또는 T-세포가 제거된 물질을 환자에게 재주입하는 데에 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
[356] 골수 및 줄기 세포 이식이 진행될 환자에 있어서 이식편대숙주 질환에 대한 예방 및 내성의 유도로서, 공여 세포군으로부터 B-세포, NK세포 및/또는 T-세포를 제거하기 위하여 본 발명의 분자 또는 그에 따른 약학적 조성물을 이용하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있다(Sarantopoulos S et al., Biol Blood Marrow Transplant 21: 16-23 (2015)).
[357] 본 발명의 분자 또는 그에 따른 약학적 조성물의 몇몇 구체예는 감염된 세포와 물리적으로 결합된 세포 외 생체분자를 표적화하여 환자 내의 감염된 세포를 사멸시키는데 사용할 수 있다.
[358] 나아가, 본 발명은 최소 하나의 본 발명의 분자 또는 그에 따른 약학적 조성물을 치료적으로 효과적인 용량만큼 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한 질병, 장애, 또는 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법을 사용하여 치료할 수 있는 것으로 고려되는 질병, 장애, 및 증상은 암, 악성 종양, 비악성 종양, 성장 이상, 면역 장애, 및 미생물 감염을 포함한다. 본 발명의 화합물의 "치료적으로 효과적인 용량(dosage)"의 투약은 질병 증상의 강도(severity)를 감소시킬 수 있으며, 질병의 증상이 없는 기간 및 빈도 수를 증가시키거나, 상기 질병의 영향에 기인한 손상 또는 장애를 예방할 수 있다.
[359] 본 발명의 화합물의 상기의 치료적으로 효과적인 용량은 투약의 경로, 치료받는 포유동물의 유형, 및 고려되는 특정 환자의 신체적인 특징에 따라 정해질 것이다. 이 복용량을 결정하기 위한 이러한 요소 및 그들의 관계는 의학 분야의 전문가들에게는 널리 알려져 있는 사실이다. 이러한 용량 및 투약 방법은 최상의 효율성을 달성하기 위하여 맞출 수 있는데, 무게, 식습관, 동시 복용하는 약물 및 기타 요소와 같은 요소들에 의해서 결정될 수 있으며, 의학 분야 전문가들에게 이러한 사실은 널리 알려져 있다. 인간에게 가장 적절한 사용을 위한 복용량 및 복용 형태는 본 발명에서 얻은 결과를 참고할 수 있고, 적절히 설계된 임상 시험으로 확정지을 수 있다. 효과적인 복용 및 치료 방침은 관례적인 수단에 의해 결정될 수 있는데, 실험실의 동물에게 소량을 적용하고 효과를 모니터하면서 그 복용량을 증가시키고, 복용 방법 역시 체계적으로 변화시킬 수 있다. 주어진 개체를 위한 선택적인 복용량을 결정함에 있어서, 임상의는 다양한 요소들을 고려할 수 있다. 그러한 고려들은 숙련자들에 있어서는 자명한 사실이다.
[360] 본 기술 분야에서 알려진, 허용되는 투약의 경로는 분무제(aerosol), 장내, 비강, 눈, 경구, 비경구, 직장, 질내, 또는 경피(예를 들어, 크림, 젤 또는 연고의 국소 투약, 또는 경피 패치로)를 통한 투약을 포함하지만 이에 한정되는 것을 아니다. "비경구 투약"은 전형적으로 주사와 연관되어 있거나 또는 눈 아래, 주입, 동맥 내, 관절낭 내(intracapsular), 심장 내, 피(皮) 내, 근육 내, 복강 내, 폐 내, 척수 내, 흉골 내, 척추 강내, 자궁 내, 정맥 내, 지주막 아래, 피막 밑, 피하, 경점막, 또는 경기관 투약을 포함한 의도된 활성(intended site of action)과 관련되어 있다.
[361] 본 발명의 약학적 조성물 투약을 위하여, 복용 범위는 일반적으로 약 1 킬로그램 당 0.0001에서 100 밀리그램(mg/kg)까지, 및 더 흔하게는 숙주의 몸무게 1 킬로그램 당 0.01에서 5 밀리그램(mg/kg)일 것이다. 표본적인 복용량은 몸무게 1 킬로그램 당 0.25 밀리그램, 1 밀리그램, 3 밀리그램, 5 밀리그램 또는 10 밀리그램, 또는 1-10 밀리그램(mg/kg)의 범위 내가 될 수 있다. 표본적인 치료 요법(regime)은 하루 한번 또는 두 번의 투약, 또는 일주일에 한번 또는 두 번의 투약, 2주에 한번, 3주에 한번, 4주에 한번, 한 달에 한번, 2 또는 3달에 한번 또는 3달에서 6달에 한번 투약할 수 있다. 복용량은 특정한 환자를 위하여 치료적인 효과를 극대화하기 위해서 필요에 따라 건강관리 전문가에 의해 선택되고 재조정될 수 있다.
[362] 본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 여러 차례 동일한 환자에 투여될 것이다. 단일 복용 사이의 간격은, 2-5일, 한 주, 한 달, 2 또는 3달, 6달, 또는 1년을 예로 들 수 있다. 투약 사이의 간격은 피험체나 환자 내의 규칙적인 혈중 농도 또는 마커에 따라 불규칙적일 수도 있다. 본 발명의 화합물의 복용 요법은 2주에서 4주마다 몸무게 1 킬로그램당 1 밀리그램 또는 3 밀리그램을 정맥에 총 6번 투여하고, 이후 3달마다 몸무게 1 킬로그램마다 3 밀리그램 또는 1 밀리그램을 투여하는 것을 포함한다.
[363] 본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 여러 차례 동일한 환자에 투여될 것이다. 단일 복용 사이의 간격은, 2-5일, 한 주, 한 달, 2 또는 3달, 6달, 또는 1년을 예로 들 수 있다. 투약 사이의 간격은 피험체나 환자 내의 규칙적인 혈중 농도 또는 마커에 따라 불규칙적일 수도 있다. 본 발명의 화합물의 복용 요법은 2주에서 4주마다 몸무게 1 킬로그램당 1 밀리그램 또는 3 밀리그램을 정맥에 총 6번 투여하고, 이후 3달마다 몸무게 1 킬로그램마다 3 밀리그램 또는 1 밀리그램을 투여하는 것을 포함한다.
[364] 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 기술 분야에서 잘 알려진 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투약 경로를 통해 투약할 수 있다. 상기의 투약 경로 및/또는 방식은 얻고자하는 결과에 따라 다를 것이며, 이는 전문가도 인정할 것이다. 본 발명의 분자, 그에 따른 약학적 조성물, 및 진단적 조성물의 투약 경로는 예를 들어서, 정맥 내, 근육 내, 피 내, 복강 내, 피하, 척추, 또는 다른 비경구 투약 경로를 포함하고, 주사 또는 주입(infusion)과 같은 방법에 의해 투여될 수 있다. 다른 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물은 국소, 상피 또는 비강 내, 경구로, 질 동맥으로, 직장으로, 혀 밑으로, 또는 국소적인 점막 경로와 같은 비-비경구 경로로 투약할 수 있다.
[364] 본 발명의 치료적 분자 또는 약학적 조성물은 본 기술 분야에서 알려진 하나 이상의 다양한 의료기기로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서는, 본 발명의 약학적 조성물은 무바늘 피하 주사기로 투여할 수 있다. 본 발명이 속한 기술 분야에서 널리 알려진 임플란트 및 모듈의 예들은, 제어된 속도의 전달을 위한 매몰식 미세-주입 펌프; 피부를 통한 투약 수단; 정확한 주입 속도의 전달을 위한 주입 펌프; 연속적인 약물 전달을 위한 가변 유량 임플란트 주입; 및 삼투 약물 전달 시스템 등을 포함한다. 상기 및 기타 다른 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈은 본 기술 분야의 숙련자들에게 널리 알려져 있다.
[365] 본 발명의 분자, 세포-표적화 분자, 또는 약학적 조성물은 하나 이상의 치료적 또는 진단 제제와 병용하거나 단독으로 투여할 수 있다. 병용 요법은 치료할 특정 환자, 질병 또는 증상에 따라 선택된 최소 하나의 다른 치료 제제와 병용된 본 발명의 세포독성 분자 또는 그에 따른 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 다른 제제의 예로는, 그 중에서도, 세포독성, 항암 또는 화학요법제, 소염제 또는 항증식제, 항균제 또는 항바이러스제, 성장인자, 시토카인, 진통제, 치료적으로 활성화된 소분자 또는 폴리펩티드, 단일 사슬 항체, 고전적(classical) 항체 또는 그에 따른 단편, 또는 하나 이상의 신호 경로(signaling pathways)를 조절하는 핵산 분자, 및 치료적 또는 예방적 치료 요법에서 보충적이거나 이로움을 줄 수 있는 유사한 조절 치료법(modulating therapeutics)을 포함한다.
[366] 본 발명의 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물로 환자를 치료하는 것은 바람직하게는 표적화된 세포의 세포 사멸 및/또는 표적화된 세포의 성장 억제를 유도하는 것으로 이어진다. 예를 들어, 본 발명의 세포독성 분자, 및 그것을 포함하는 약학적 조성물은 표적 세포를 사멸시키거나 제거하는 것이 이로운 다양한 병리적 장애를, 그중에서도 암, 종양, 성장 이상, 면역 장애, 및 감염된 세포를, 치료하는데 유용할 것이다. 본 발명은, 과활동 B-세포, 및 과활동 T-세포를 포함한 세포 장애 치료, 및 세포 증식 억제를 위한 방법을 제공한다.
[367] 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 분자 및 약학적 조성물은 암, 종양(악성 및 비악성), 성장 이상, 면역 장애, 및 미생물 감염을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있다. 나아가, 상기의 생체 외 방법은, 골수 이식 수용자 내에서 거부현상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하기 위하여, 그리고 면역글로불린 내성을 달성하기 위하여, 상기의 체내 방법과 병용될 수 있다.
[368] 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명은 악성 종양 또는 신생 종양 및 인간과 같은 포유동물 개체 내의 그외 혈액 세포 관련 암을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 필요로 하는 피험체에게 본 발명의 세포독성 분자 또는 약학적 조성물을 치료적으로 효과적인 용량만큼 투여하는 단계를 포함한다.
[369] 본 발명의 분자 및 약학적 조성물은, 원치 않는 B-세포 및/또는 T-세포 제거 용도, 이식편대숙주 질환을 치료하기 위한 면역 반응을 조절하는 용도, 항바이러스제로서의 용도, 항균제로서의 용도, 및 원치 않는 세포 유형을 이식 조직으로부터 제거하는 용도 등을 포함한 다양한 응용 방법이 있다. 본 발명의 분자 및 약학적 조성물은 흔히 항종양제이며, 이는 암 또는 종양 세포의 성장을 저해 및/또는 사멸을 유도하여 종양 또는 악성 세포의 성장, 변이, 또는 증식을 치료하고/하거나 예방할 수 있다는 것을 의미한다.
[370] 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물은 예를 들어 백혈병, 림프종, 골수종, 아밀로이드증, 강직척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 하시모토 갑상선염, 용혈요독증후군, HIV-관련 질병, 홍반 루푸스, 다발경화증, 결절다발동맥염, 다관절염, 건선, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈쇼크, 쇼그렌 증후군, 궤양성대장염, 및 혈관염과 같은, B-세포-, 형질 세포-, T-세포, 또는 항체-매개 질환 또는 장애를 치료하는데 사용된다.
[371] 다른 관점에서는, 본 발명의 분자 및 약학적 조성물의 몇몇 구체예는 항균제이며, 이는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 프리온, 또는 원생동물로 인한 미생물학적 병원성 감염의 시작, 성장, 또는 결과를 치료하고/하거나 예방할 수 있다는 것을 의미한다.
[372] B-세포 및/또는 T-세포를 매개로한 질병 또는 증상의 예방 또는 치료, 환자 내의 T-세포 또는 B-세포를 사멸시킬 목적으로, 필요로 하는 환자에게 본 발명의 분자, 또는 그에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 제공하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 사용은, 예를 들어, 인간 또는 비-인간이냐 하는 이식된 물질의 원천에 상관없이, 골수 이식, 줄기 세포 이식, 조직 이식, 또는 기관 이식을 위하여 환자를 준비시키거나 조정(conditioning)하는 데 적합하다.
[373] 골수 수용자에게 본 발명의 세포독성 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물을 사용한 숙주 B-세포, 및/또는 T-세포의 표적화된 세포 사멸을 통해 이식편대숙주 질환의 예방 또는 치료를 제공하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
[374] 본 발명의 분자, 세포-표적화 분자 및 약학적 조성물은 필요로 하는 환자에게 본 발명의 분자, 세포-표적화 분자 또는 약학적 조성물의 치료적으로 효과적인 용량을 투약하는 과정을 포함하는 암을 치료하는 방법에 사용할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 몇몇 구체예에서는, 다음과 같이 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하는 방법을 제공한다: 골수암(다발성 골수종 또는 유잉 육종), 유방암, 중앙/말초 신경계 암(뇌암, 신경섬유종증, 또는 교아종), 위장암(위암 또는 대장암), 생식 세포암(난소암 및 고환암), 선암(췌장암, 부갑상선암, 크롬친화세포종, 침샘암, 또는 갑상선암), 두경부암(비인두암, 구강암, 또는 인두암), 혈액암(백혈병, 림프종, 또는 골수종), 신장-요로암(신장암 및 방광암), 간암, 폐/흉막암(흉막중피증, 폐소세포암종, 또는 비소세포성폐암), 전립선암, 육종(혈관 육종, 섬유 육종, 카포시 육종, 또는 활막 육종), 피부암(기저 세포암, 편편세포암종, 또는 흑색종), 및 자궁암.
[375] 본 발명의 분자 및 약학적 조성물은 필요로 하는 환자에게 본 발명의 분자 또는 약학적 조성물의 치료적으로 효과적인 용량을 투약하는 과정을 포함한 면역 장애를 치료하는 방법에 사용할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 몇몇 구체예에서는, 다음과 같이 이루어진 군으로부터 선택된 질병과 연관된 염증과 관련된 면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다: 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식편거부반응, 이식편대숙주질환, 하시모토 갑상선염, 용혈요독증후군, HIV-관련 질병, 홍반 루푸스, 다발경화증, 결절다발동맥염, 다관절염, 건선, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈쇼크, 쇼그렌 증후군, 궤양성대장염, 및 혈관염.
[376] 본 발명에 따른 몇몇 구체예 중에는 본 발명의 분자를 암, 종양, 성장 이상, 면역 장애. 및/또는 미생물 감염의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 또는 약제의 구성 성분으로서 사용한다. 예를 들어, 환자의 피부 위에서 나타나는 면역 장애는 염증을 감소시키기 위하여 상기 약제로 치료할 수 있다. 다른 예에서는, 피부 종양은 종양의 크기를 감소시키거나 완전하게 제거하기 위하여 상기 약제로 치료할 수 있다.
[377] 본 발명의 어떤 세포독성 분자, 약학적 조성물, 및 진단적 조성물은 면역병변(immunolesioning) 및 신경 추적과 같은 분자 신경외과학 적용에 사용될 수 있다(Wiley R, Lappi D, Adv Drug Deliv Rev 55: 1043-54(2003) 참고). 예를 들어서, 표적 도메인은, 뉴런 회로(neuronal circuit) 특이 G-단백질과 연결된 수용체와 같은 뉴런 표면 수요에와 결합하여 특정 뉴런 세포 유형을 표적화하는 신경 전달 물질 및 신경 펩티드와 같은 다양한 리간드로부터 선택하거나 유도할 수 있다. 유사하게, 상기의 표적 도메인은 뉴런 표면 수용체를 결합하는 항체로부터 선택되거나 유도될 수 있다. 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 자신들의 역행성 축삭운반을 강하게 지시하기 때문에, 본 발명의 어떤 세포독성 분자는 세포체로부터 떨어진 세포독성 분자 주사부위에서 세포외 표적을 발현하는 뉴런을 사멸시키는데 사용할 수 있다(Llewellyn-Smith I et al., J Neurosci Methods 103: 83-90(2000) 참조). 이러한 신경 세포-유형-특이적-표적 세포독성 분자는 감각 메커니즘(Mishra S, Hoon M, Science 340: 968-71(2013) 참조) 및 파킨슨병 및 알츠하이머와 같은 퇴행성 질환의 생성 모델 시스템(Hamlin A et al., PLoS One e53472(2013) 참조)을 설명하기 위함과 같은 신경과학 연구에 사용된다.
[378] 본 발명의 구체예 중에서 어떤 것은, 예를 들어, 종양성 신생 세포 및/또는 면역 세포 유형과 같은 세포 유형의 내부 감별 또는 라벨을 하기 위하여 본 발명의 세포-표적화 분자 약학적 조성물, 및/또는 진단 조성물을 사용하는 방법이다. 본 발명의 어떤 분자의 역행성 세포간 이동을 경유하는 루트 및 특이적 세포 유형 속으로 들어가는 능력에 근거하여, 상기의 특이적 세포 유형의 내부 구성성분은 감별용으로 라벨될 수 있다. 이것은 환자의 유기체 내의 장소에 위치한 체내 세포상에서 실행될 수 있고 또한 생체 조직 검사 물질과 같이 유기체로부터 제거된 체외 세포 및 조직상에서 행해질 수도 있다.
[379] 본 발명의 몇몇 구체예는 질병, 증상 및/도는 장애에 관한 정보 수집용 세포 유형의 존재를 검출하기 위하여 본 발명에 따른 분자(예를 들어서, 세포독성 분자 또는 세포-표적화 분자), 폴리펩티드, 단백질, 약학적 조성물, 및/또는 진단 조성물을 사용하는 방법이다. 상기의 방법은 분석 또는 진단 기술로 상기의 세포독성 분자를 검출하기 위해 진단적으로 충분한 양의 세포독성 분자가 세포에 접촉하는 것을 포함한다. 상기의 "진단적으로 충분한 양"은 사용되는 특정 분석법 또는 진단 기술로 정보수집을 할 때 충분한 검출 및 정확한 측정치를 제공하는 양을 뜻한다. 일반적으로, 체내 진단적 사용에서 유기체 전체를 위한 진단적으로 충분한 양은 피험체 당 피험체의 무게 1kg 당 세포-표적화 분자와 연결된 검출 촉진제 0.1 mg에서 100 mg 사이의 비-누적 복용일 것이다. 전형적으로, 이러한 정보 수집 방법에서 사용되는 본 발명의 분자의 양은 진닥적으로 충분한 양이되 가능한 적은 양일 것이다. 예를 들어, 유기체 안에서의 체내 검출을 위해서 피험체에 투여되는 본 발명의 세포독성 분자, 세포-표적화 분자, 약학적 조성물, 또는 진단적 조성물의 양은 실행 가능한 최소의 양일 것이다.
[380] 검출 촉진제와 결합된 본 발명 분자의 세포-유형 특이적 표적화는 본 발명 분자의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포를 검출하고 촬영하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 분자 및/또는 진단적 조성물을 사용한 세포 영상화는 본 기술 분야에서 알려진 적합한 기술로 시험관 내 또는 체내에서 시행될 수 있다. 진단적 정보는 유기체로부터 얻어진 시험관 내 샘플를 사용하거나 유기체의 전신 영상을 포함한, 본 기술 분야에서 알려진 다양한 방법을 사용하여 수집될 수 있다. 상기의 샘플이라는 용어는 혈액, 소변, 혈청, 림프, 타액, 항문 분비물, 질 분비물, 및 정액, 및 생체 조직 검사로 얻은 조직과 같은 수많은 것들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 다양한 검출 촉진제는 자기 공명 촬영(MRI), 광학적 방법(직접, 형광, 및 생물 발광 촬영과 같은), 양전자 방사 단층 촬영(PET), 단일광자방출단층촬영(SPECT), 초음파, x-선 컴퓨터 단층 촬영, 및 상기 언급한 것들의 조합과 같은 기술로 비침습적 체내 종양 촬영에 사용할 수 있다(Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111(2012) 참조).
[381] 본 발명의 구체예 중에서 어떤 것은, 암, 종양, 및/또는 면역 세포 유형과 같은 세포 유형의 내부 감별 또는 라벨을 하기 위하여 진단적 조성물로서 본 발명의 분자 또는 약학적 조성물을 사용하는 방법이다(Koyama Y et al., Clin Cancer Res 13: 2936-45 (2007); Ogawa M et al., Cancer Res 69: 1268-72 (2009); Yang L et al., Small 5: 235-43 (2009)). 특이적 세포 유형 속으로 들어가고 역행성 세포간 이동을 경유하여 세포 내로 이동할 수 있는 본 발명의 어떤 분자, 세포-표적화 분자 및 약학적 조성물의 능력에 근거하여, 상기의 특이적 세포 유형의 내부 구성성분은 감별용으로 라벨될 수 있다. 이러한 방법은 질병의 발생 장소와 같이 특정 위치에 있는 세포 상에서 실행되거나 또는 동시에 생체 조직 검사 물질과 같이 유기체로부터 제거된 시험관 내의 세포 상에서 행해질 수도 있다.
[382] 본 발명의 진단적 조성물은 본 발명의 약학적 조성물로 치료 가능성이 있는 질병, 장애, 또는 증상의 특징을 짓는데 사용할 수 있다. 본 발명의 어떤 물질의 조성물은 환자가 이 명세서에 설명된 본 발명의 분자, 조성물 또는 관련된 방법을 사용하거나 본 발명의 전달 수단을 사용하는데 있어서 적절한 치료 전략에 반응하는 그룹에 속하는지 여부를 결정하는데 사용할 수 있다.
[383] 본 발명에 따른 진단적 조성물은 암과 같은 질병이 검출된 후에 원격전이, 이종성, 및 암의 진행 단계를 모니터하는 것과 같은 것으로 질병을 더 잘 특징 지을 수 있도록 사용할 수 있다. 질병 장애 또는 감염에 대한 표현형 평가는 치료적 의사 결정이 이루어지는 동안 진단 및 예측에 도움을 줄 수 있다. 질병 재발에 있어서, 본 발명의 어떤 방법은 문제가 국소적(local) 문제인지 계통의 (systemic) 문제인지 알아내는데 사용할 수 있다.
[384] 본 발명의 진단적 조성물은 소분자 약물, 생물학적 약물, 또는 세포기반 치료와 같은 치료 유형과 무관하게 치료에 대한 반응을 평가하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 진단법의 몇몇 구체예는 종양 크기 변화, 항원 양성 세포 집단의 수와 분포를 포함한 변화를 측정, 그리고/또는 환자에게 이미 투약되고 있는 치료에 의해 표적화된 항원 이외의 마커를 모니터하는데에 사용할 수 있다(Smith- Jones P et al., Nat. Biotechnol 22: 701-6(2004); Evans M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108: 9578-82(2011) 참조).
[385] 세포 유형의 존재를 감별하는데 사용되는 상기 방법의 몇몇 구체예는 다음과 같은 질병, 장애, 및 증상에 관한 정보를 수집하는데 사용된다: 골육종(다발성 골수종 또는 유잉 육종), 유방암, 중앙/말초 신경계 암(뇌암, 신경섬유종증, 또는 교아종), 위장암(위암 또는 대장암), 생식 세포암(난소암 및 고환암), 선암(췌장암, 부갑상선암, 크롬친화세포종, 침샘암, 또는 갑상선암), 두경부암(비인두암, 구강암, 또는 인두암), 혈액암(백혈병, 림프종, 또는 골수종), 신장-요로암(신장암 및 방광암), 간암, 폐/흉막암(중피종, 폐소세포암종, 또는 비소세포성폐암), 전립선암, 육종(혈관 육종, 섬유 육종, 카포시 육종, 또는 활막 육종), 피부암(기저 세포암, 편편세포암종, 또는 흑색종), 자궁암, AIDS, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 자폐증, 심장발생, 크론병, 당뇨병, 홍반성, 위염, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 용혈요독증후군, HIV-관련 질환, 홍반 루푸스, 림프증식성 질환, 다발성 경화증, 중증근무력증, 신경세포염증, 다발동맥염, 다관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 경피증, 패혈 쇼크, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 혈관염, 세포 증식, 염증, 백혈구 성숙, 백혈구 이동, 신경분화, 급성 림프구성 백혈병(ALL), T 급성 림프구성 백혈병/림프종(ALL), 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), B-세포 만성 림프구 백혈병(B-CLL), B-세포 전림프구성 림프종, 버키트 림프종(BL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML-BP), 만성 골수성 백혈병(CML), 대세포성 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 털세포백혈병(HCL), 호지킨스 림프종(HL), 혈관 대형 B-세포 림프종, 림프종양육아종증, 림프구 형질세포의 림프종, MALT 림프종, 외투세포 림프종, 다발성 골수종(MM), 자연살해세포백혈병, 림프절외변연 B-세포 림프종, 비-호지킨스 림프종(NHL), 형질 세포성 백혈병, 형질세포종, 소림프구 림프종, 비장변연부 림프종, T-세포 림프종(TCL), 중쇄병, 단세포군감마글로불린병증, 단세포군 면역글로불린 퇴적 병, 골수형성이상증후군(MDS), 연쇄 다발성 골수증, 및 발덴스트롬 고대글로불린혈증.
[386] 어떤 구체예에서는, 본 발명의 분자 또는 그에 따른 약학적 및/또는 진단 조성물은 진단 및 치료 모두를 위하여 사용되거나, 또는 진단만을 위하여 사용된다.
[387] 본 발명은 시가 독소군 개체의 A 서브유닛으로부터 유도된 프로테아제 -절단 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 작동체 영역 및 특이적 세포 유형과 물리적으로 결합된 세포외 표적 생체분자를 결합할 수 있는 결합 영역을 각각 포함하는, 선택적 세포독성 세포-표적화 분자의 하기 비제한적인 실시예에 의해서 더 설명된다.
실시예
[388] 다음 예들은 본 발명에 따른 구체적인 실시예들을 제공한다. 그러나, 이러한 실시예들은 단지 입증 목적을 위한 것으로서 반드시 이에 한정되지 않으며 본 발명의 범위 및 조건을 제한하기 위한 것은 아니다. 실시예들은 표준 기술을 사용하여 실시되었으며, 상세하게 기술된 다른 부분을 제외하고 본 발명이 속한 기술 분야에서 자명한 기술을 사용하였다.
[389] 다음 실시예들은 시가 독소 A1 프레임이 상대적으로 큰 사이즈, 즉 사이즈 면에서 28 킬로달톤(kDa)보다 더 큰, 분자 모이어티에 대한 그것의 카르복시 말단에 공유적으로 링크되어있음에도 불구하고, 상기 시가 독소 A1 프레임의 카르복시 말단에서 보존된 퓨린 절단 모티프의 붕괴가 상기의 세포-표적화된 시가 독소 A 서브 유닛의 세포독성을 감소시키지 않았다는,예상치못한 발견을 기술한다. 이것은 상기의 시가 독소 중독 과정이 예를 들어서, 상기의 시가 독소 A2 프레임 및 시가 독소 B 서브유닛의 오량체와 같은, 모든 다른 커다란 분자 모이어티로부터 상기 시가 독소 A1 프레임의 분리를 요구하기 위한 것이라고 여겨졌기 때문에 놀라운 것이었다. 이것은 상기의 시가 독소 중독 과정이 그것의 표적 서브유닛으로부터 상기의 촉매적 시가 독소 A1 프레임의 분리를 요구하기 위한 것이라고 여겨졌기 때문에 놀라운 것이었다. 이것은 상기의 선택적 시가 독소 중독 과정이, 소포체로부터 숙주 세포 리보좀이 촉매적으로 불활성화된 장소인 시토졸까지, 분리된 A1 프레임을 효과적으로 역전위하기 위하여 상기 ERAD 시스템에 의해 인식된 소수성 카르복시 말단 도메인을 발현하기 위하여, 모든 다른 커다란 분자 모이어티로부터 상기 시가 독소 A1 프레임의 분리를 요구하기 위한 것이라고 여겨졌기 때문에 놀라운것이었다.
[390] 하기의 기재된 실시예와 같이, 세포를 표적화하기 위한, 세포독성 퓨린-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역을 포함하는, 실험적인 세포-표적화 분자의 세포독성은 퓨린-절단 민감성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역을 포함하는 세포-표적화 분자의 세포독성과 등가이다. 유사하게, 그들의 결합 영역의 세포 외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포를 선택적으로 사멸하는 것에 대한 상기의 퓨린-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 모범적인 세포-표적화 분자의 선택적인 세포독성은 퓨린-절단 민감성 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포-표적화 분자의 세포독성과 등가이다. 본 발명에 따른 상기의 모범적인 세포독성 세포-표적화 분자는 효과적으로 1) 표적 세포 속으로 들어가고; 2) 그들의 퓨린-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 시토졸까지 인도하고; 3) 리보솜을 불활성화시키고; 그리고 4) 상기의 표적 세포를 사멸시킨다. 나아가, 포유류에 투약 후, 상기의 모범적인 세포-표적화 분자는 퓨린-절단 민감성 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함한 세포-표적화 분자와 비교하여 체내 독성이 증가된 것을 보여준다.
[391] 하기의 실시예들은, 표준적인 세포독성 세포-표적화 분자의 폴리펩티드를 유도한 시가 독소 A 서브유닛에서 보존적 퓨린-절단 사건(event)을 붕괴시키는 것이, 세포-표적화에 대한 상대적으로 커다란 카르복시-말단 면역글로불린-유형 결합 영역의 존재임에도 불구하고, 이들의 세포-표적화 분자의 세포독성을 손상시키지 않다는 것을 보여준다. 이러한 상대적으로 커다란 카르복시-말단 모이어티들은 상기의 시가 독소 A1 단편 작동체 폴리펩티드 영역의 카르복시 말단을 물리적으로 커버하였고 그리고 상기의 시가 독소 A1 단편 작동체 폴리펩티드를 소포체 막에 있는 표적 생체분자에 묶어두기 위하여 유해하게 작동하거나 그렇지 않다면 상기의 A1 작동체 폴리펩티드가 중독되는 세포의 시토졸까지 효율적인 세포간 경로화를 할 수 있도록 분자 메커니즘의 임계치로 간섭을 할 수도 있다. 하기의 실시예들은 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드 내에 있는 상기의 프로테아제-절단 민감성 표면-노출 루프의 퓨린 절단을 붕괴하는 돌연변이가, 시가 독소의 세포독성이 야생형 시가 독소 A1 단편 영역을 포함한 세포-표적화 분자만큼의 잠재성과 효율성을 보유한 동시에, 향상된 체내 내성을 가지고 세포-표적화 분자를 설계하는 것을 가능하게 하는 것을 보여준다.
실시예 1. 퓨린 내성, 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2)
[392] 퓨린 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드는 세포-표적화 분자의 구성성분으로서 만들어지고 실험되었으며, 상기의 세포-표적화 분자는 또한 각각 세포-표적화, 면역글로불린-유형, 결합 영역을 더 포함하고 있다. 시가 독소 작동체 폴리펩티드 속으로 프로테아제 저항성을 가공하기 위하여 두 가지 아미노산 잔기 치환, R248A 및 R251A이 SLT-1A의 아미노산 1-251을 포함하는 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도된 시가 독소 작동체 폴리펩티드 속으로 도입되었다. 이러한 퓨린-절단 저항성의 R248A 및 R251A 이중 돌연변이 구조는 "SLT-1A-FR"(SLT-1A 퓨린 저항성을 의미)으로서 본문에 기재되고 있다. 두 번째 퓨린-절단 저항성의 돌연변이 구조는 본문에서 "SLT-1A-FR-2"로 기재되고 있는데, 이것은 단일 잔기 치환 R248A로 생성되었다. 세 번째 퓨린-절단 저항성의 돌연변이 구조는 본문에서 "SLT-1A-FR-3"로 기재되고 있는데, 이것은 단일 잔기 치환 R251A를 포함한다. 상기의 퓨린 공통 모티프 영역 240-256의 코어에서 최소 퓨린 프로테아제 절단 사이트 R-x-x-R의 돌연변이는 퓨린 및 프로단백질 전환효소 및 다양한 프로테아제 같은, 다른 프로테아제에 의한 단백질 가수분해에 대한 이러한 영역의 민감도를 붕괴하는 것으로 예측되었다. 상기의 퓨린-절단 사이트의 R248A/R251A 붕괴를 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드 SLT-1A-FR는 표준적인 세포-표적화 분자를 생성하는데 사용되었다.
[393] 상기의 표준적인 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2은 붕괴된 퓨린-절단 사이트 및 세포-표적화 결합 영역을 포함한 촉매 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드 각각을 포함하고 있는 그러한 구조이다. SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2 내에서 상기의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 상대적으로 큰 사이즈인 카르복시-말단 결합 영역과 융합되었다. SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2는 박테리아 시스템 내에서 생산되었고 컬럼 크로마토그라피에 의해 정제되었다. 상기의 결합 영역 scFv-1 및 scFv-2은 단일-사슬의 다양한 단편으로서, 각각은 어떠한 인간 암 세포와 마찬가지로 어떠한 인간 암 세포의 표면과 물리적으로 결합된 어떠한 세포-표면, 표적 생체분자와 고-친화력을 가지고 결합된다.
SLT-1A-FR을 포함하는 표준적인 세포-표적화 분자의 퓨린 단백질 가수 분해 민감도 실험
[394] 퓨린 절단을 붕괴하기 위하여 상기의 프로테아제 절단 민감 영역 240-256을 돌연변이시킨 이후 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 퓨린-절단 민감도는 카르복시-말단, 세포-표적화 결합 영역을 포함한 융합 단백질의 분자의 구성에서 실험되었다. SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2를 절단하는 퓨린의 능력을 평가하기 위하여 인산 완충 식염수 내에 정제된 단백질 샘플이 퓨린과 함께 배양되었으며, 퓨린 절단 완충액(100 밀리몰(mM) HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid), pH 7, 1 mM CaCl2)내에서 샘플 단백질 마이크로그램(μg)당 0.5 퓨린 활성 유닛(U)으로 30-37(°C)에서 25-30 시간 동안 배양되었 다. 조절 샘플은 상기와 동일한 완충액 내에서 4, 30, 또는 37°C에서 퓨린을 배제하고 배양되었다. 상기의 다양한 단백질 샘플은 쿠마시로 염색되는 변색 조건하에서 도데실황산나트륨(SDS), 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기 영동되었다(도 2 및 3).
[395] 도 2 및 3은, 번호가 붙은 레인을 가진 겔 및 어느 레인이 어느 단백질 샘플로 부가되었는지를 나타내는 설명표(figure legend)를 포함한 사진을 도시하는데, 상기 단백질 샘플은 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드(SLT-1A-WT) 또는 붕괴된 퓨린-절단 사이트 시가 독소 작동체 폴리펩티드(SLT-1A-FR 또는 SLT-1A- FR-2) 어느 하나를 포함하는 세포-표적화된 단백질이다. "L"으로 표시된 상기 레인은, 번호가 붙은 레인에서의 단백질 사이즈의 예상을 허용하는 내부적인 분자 무게 참조로서 사용을 위하여 kDa 내에서의 각각의 사다리 단백질 밴드의 대략적인 크기와 함께, 단백질 분자 무게 사다리의 이동 패턴을 보여준다. 상기 도면 설명표는 섭씨 온도(℃) 내에서 상기 단백질의 전-처리 조건, 지속기간 및 마이크로그램 당 퓨린 활성도의 양("U/μg 퓨린"으로 라벨됨)을 표시하거나 또는 제로 유닛에 대하여는 "no furin"을 표시함에 의하여 어떠한 퓨린이 부가되는지를 보여준다.
[396] 도 2 및 3은 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2 이 인간 퓨린에 의한 절단에 저항력이 있음을 보여준다. 이러한 분석에 있어서 실험된 상기의 세포-표적화된 단백질의 크기는 약 55-57 kDa이며 대략 모두 28-29 kDa 사이즈를 가지는 카르복시-말단 링커 및 결합 영역에 링크된 약 28 kDa의 시가 독소 작동체 폴리펩티드(모두 동일한 사이즈인 SLT-1A-WT 및 SLT-1A-FR)를 포함한다. 만약 퓨린 절단이 상기의 노출된 표면인, SLT-1A의 연장된 루프 242-251에서 발생하였다면, 각각 약 28kDa와 거의 등가의 분자 무게를 가진 두 개의 단백질 밴드가 되는 결과가 될 것이다. 만약 퓨린 절단이 SLT-1A-WT::scFv-1 또는 SLT-1A-WT ::scFv-2 내에 있는 WT 스캐폴드의 251 위치에서의 아르기닌의 카르복시 펩티드 결합에서 정확하게 발생한다면, 두 개의 결과적인 단백질 밴드 SLT-1A(WT이거나 FR이거나)는 27.5 kDa 분자 무게 및 SLT-1A-FR::scFv-1은 28.8 kDa 또는 SLT-1A-FR:: scFv-2는 27.6 kDa의 두 번째 밴드를 가지게 된다.
[397] 도 2는 SLT-1A-FR::scFv-1이 실험된 조건하에서 이러한 분석에 있어서 인간 퓨린에 의해 시험관 내에서 단백질 가수분해되지 않았다는 것을 보여 준다. 예상되는 바와 같이, 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드로 이루어진 상기의 조절 단백질 SLT-1A-WT::scFv-1은 인간 퓨린에 의해 절단되었지만(도 2); SLT-1A-FR:: scFv-1은 저항력이 있었다(도 2의 레인 3 및 6 비교).
[398] SLT-1A-FR::scFv-2는 또한 여러 가지 다른 온도에서의 이러한 분석에 있어서 퓨린 절단에 대하여 저항력이 있었다(도 3). 도 3은 SLT-1A-FR::scFv-2가 4℃에서부터 37℃까지 온도 범위를 달리하여 진행된 실험 조건하에서의 분석에서 인간 퓨린에 의해 서험관 내에서 단백질 가수분해되지 않았음을 보여준다.
[399] 나아가, 세포-표적화된 융합 단백질 SLT-1A-FR-2::scFv-2는 4℃에서의 이러한 분석에서 퓨린 절단에 대하여 저항력이 있었다.
[400] 이러한 시험관 내 퓨린 절단 분석법을 사용하여, 세포-표적화된 융합 단백질의 어떠한 퓨린 단백질 가수분해가, 220-223 영역 내에 선천적으로 위치한 퓨린-절단 사이트에서 SLT-1A 구성요소 내와 같은, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역내에 있는 248-251 근위 어떠한 퓨린-절단 사이트에서도 관찰되지 않음을 발견할 수 있었다.
[401] 따라서, 퓨린 공통 모티프의 코어에 있는 최소의, 퓨린 프로테아제, 절단 사이트 R-x-x-R의 돌연변이는 체외에서 인간 퓨린에 의한 단백질 가수분해에 대한 이러한 영역의 민감성을 붕괴시켰다.
SLT-1A-FR을 포함하는 세포-표적화 분자의 리보솜 억제 활성도 실험
[402] 본 발명의 분자는 모두 적어도 하나의 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유도된 촉매 도메인을 포함한다. 상기 퓨린-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 SLT-1A-FR의 효소 활성도는 시험관 내에서 리보솜 억제 분석법을 사용하여 실험되었다. SLT-1A-FR의 리보솜 불활성 활성도는 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2를 사용한 카르복시 말단 세포-표적화 결합 영역의 분자 구조에서 실험되었다.
[403] SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2의 상기 리보조옴 불활성도는 TNT® 신속 결합 전사/번역 키트를 사용한, 무세포, 시험관 내, 단백질 번역 분석법으로 결정되었다(L1170 Promega Madison, WI, U.S.). 상기의 키트는 루시퍼라아제 T7 조절 DNA(L4821 Promega Madison, WI, U.S.) 및 TNT® Quick Master Mix를 포함한다. 상기의 리보솜 활성 반응은 제조자의 지시에 따라서 준비되었다. 실험을 위한 세포-표적화 분자의 10배 희석액 시리즈는 적당한 완충액 내에서 제조되었으며 동일한 TNT 반응 혼합물 성분의 시리즈는 각각의 희석액을 위하여 생성되었 다. 희석액 시리즈 내에서의 각 샘플은 루시퍼라아제 T7 조절 DNA와 함께 TNT 반응 혼합물 각각과 결합되었다. 상기의 실험 샘플은 30°C에서 1.5시간 동안 배양되었다. 배양 후, 발광효소 분석 시약(E1483 Promega, Madison, Wl, U.S.)이 모든 실험용 샘플에 첨가되었고 루시퍼라아제 단백질 번역 용량은 제조자의 지시에 따라서 발광으로 측정되었다.
[404] 상기의 번역 억제 레벨은 전체 단백질에 대한 비교 발광 단위의 로그-변형된 농도의 비-선형 회귀 분석에 의하여 측정되었다. 통계 소프트웨어(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)를 사용한, 상기의 반 최고치 억제 농도(IC50)값이, 상기의 헤딩 용량-반응-억제 하에서, 프리즘 소프트웨어의 로그(저해제) 대 반응(세개 변수)[Y = Bottom + ((Top-Bottom)/(l+10^(X-LogIC50)))] 함수를 사용하여 각 샘플에 대하여 계산되었다.
[405] 하나 이상의 실험으로부터 구한, 퓨린-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드(SLT-1A-FR) 영역 및 야생형(WT) 조절 단백질을 포함하는 각각의 단백질에 대한 IC50는 표 1에서 나타내고 있다. 퓨린-절단 저항성 SLT-1A-FR를 포함하는 상기의 구조는 야생형 SLT-1 A1 단편(SLT-1A1-WT)과 같은 야생형 조절에 비교할 수 있는 강력한 리보솜 억제를 발현하였다. SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR:: scFv-2 양자 모두 야생형 시가 독소 A1 단편에 비교할 수 있는 시험관 내 리보솜 불활성도를 발현하였다.
폴리펩티드 | 리보솜 억제 IC50 (pM) |
SLT-1A1-WT only | 158 |
SLT-1A-WT::scFv-1 | 107 |
SLT-1A-FR::scFv-1 | 131 |
SLT-1A-WT::scFv-2 | 101 |
SLT-1A-FR::scFv-2 | 187 |
퓨린-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 프로테아제-절단 민감성 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 대하여 시험관 내에서 등가의 리보소옴 억제를 발현하였다.
모범적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2의 세포독성 실험
[406] 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 SLT-1A-FR를 포함하는 모범적인 세포-표적화 분자의 세포독성은 본 발명이 속한 기술분야의 전문가들에 널리 알려진 세포 사멸 분석법을 사용하여 측정되었다. 특이적인 세포독성은 표적 발현 세포에 대한 표준적인 세포-표적화 분자의 세포독성 대 표적화되지않은 야생형 시가 독소 작동체 조절(SLT-1A-WT)의 세포독성을 비교해 측정되었다. 선택적인 세포독성은 표적 발현 세포 대 세포-표적화 분자의 결합 영역의 표적 분자를 발현하지 않았던 세포에 대한 세포독성을 비교해 측정되었다. 적어도 하나의 세포 표면에서 scFv-1 또는 scFv-2의 세포 외 표적 생체분자의 상당한 양을 발현하도록 세포는 선택되었다. 즉 세포는 결합-영역 표적 생체분자에 양성이었다(세포주 A, B, C, 및 D는 scFv-1의 표적에 대하여 양성이었고, 세포주 E, F, 및 G는 scFv-2의 표적에 대하여 양성이었다). 세포는 어떠한 세포 표면에서 scFv-1의 어떠한 세포외 표적 생체분자 및/또는 어떠한 세포 표면에서 scFv-1의 어떠한 세포외 표적 생체분자의 상당한 양을 발현하지 않도록 선택되었다. 즉, 세포는 결합 영역인 scFv-1 및 scFv-2 중 하나 또는 양자 모두의 어떠한 표적에 대하여서도 표적 생체분자 음성이었다.
[407] 야생형 SLT-1A(SLT-1A-WT) 또는 퓨린-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드(SLT-1A-FR) 중 어느 것을 포함하는 거의 동일한 세포-표적화된 단백질의 세포독성은 직접적으로 두 개의 점 돌연변이에 의해 야기된 세포독성에 있어서의 차이점을 분리하기 위하여 비교되었으며, 그것은 퓨린-절단 저항성을 제공하였다. 카르복시 말단이 상대적으로 큰 모이어티에 의해 커버된 SLT-1A-FR을 포함하는 세포-표적화 분자의 세포독성은 SLT-1A-WT를 포함하는 세포-표적화 분자의 세포독성과 비교해서 감소될 것으로 예상되었으며, 그것은 특히 엔도프로테아제 퓨린에 의한 단백질 가수분해 절단에 의해 카르복시-말단 모이어티로부터 유리될 수 있다(Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999)).
[408] 표준적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR:: scFv-2 에 대한 세포독성, 특이적 세포독성, 및 상대적 세포독성은 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포-표적화 분자와 비교되었다.
[409] 특정 인간 종양 세포(상기의 세포주 A-G의 세포를 포함하는)는 384-웰(well) 플레이트 내 세포 배양 배지 20μL 내에 플레이트되었다(부착세포에 대하여 웰 하나당 2 x 103 세포가 단백질 첨가 전날에 플레이트되거나 현탁 세포에 대하여 웰 하나당 7.5 x 103 세포가 단백질 첨가와 동일자에 플레이트되었다). 상기의 세포-표적화 분자의 10배 희석 시리즈가 적당한 완충액에서 제조되었고, 희석액 5 μL 또는 완충 조절제가 상기 세포에 첨가되었다. 세포 배양 배지만을 함유한 조절 웰(well)이 베이스라인 수정을 위하여 사용되었다. 상기 세포 샘플은 세포-표적화 분자, 또는 적정한 완충액과 함께 5% C02 대기에서 37°C로 3일간 배양되었다. 어떤 구체예에서, 상기 세포 샘플은 세포-표적화 분자 또는 적정 완충액과 함께 1시간 또는 2시간 동안 배양되었다. 그리고 나서, 세포-표적화 분자는 완충 세척제를 사용하여 세척되었다. 전체 세포 생존 또는 생존율은 제조자의 지시에 따라서 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석법(G7573 Promega Madison, WI, U.S.)을 사용한 발광 출력법을 사용하여 측정되었다.
[410] 상기의 실험 웰(well)의 생존율 %는 하기의 방정식:(Test RLU - Average Media RLU) / (Average Cells RLU - Average Media RLU) * 100을 사용하여 계산되었다. 로그 폴리펩티드 농도 대 생존율 %는 프리즘(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)에 표시되었고 로그(저해제) 대 반응(3 매개 변수) 분석은 상기의 실험된 단백질에 대한 반-최고치 세포독성 농도(CD50) 값을 측정하기 위하여 사용되었다. 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 또는 야생형 조절 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 각각의 세포-표적화된 단백질에 대한 CD50이 계산되었다.
[411] 다양한 표적-발현 인간 종양 세포주에 대한 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2의 세포독성은 나노 몰(nM)에서의 세포-표적화된 단백질 농도에서 반-최고치 세포독성 값(CD50)으로서 표 2에서 보여준다. 놀랍게도, SLT-1A-WT 및 SLT-1A-FR를 포함하는 세포-표적화된 단백질은, 상기의 시가 독소 A1 단편이 효율적으로, 세포-표적화 결합 영역 및 4.5kDa A2 단편과 같은 모든 다른 모이어티로부터 유리될 수 없을 때마다 결과적으로 기대되는 SLT-1AFR를 포함하는 세포-표적화된 단백질에 대한 세포독성에서의 현저한 감소 대신, 양자 모두 유사한 세포독성(도 4-5; 표 2)을 나타낸다(Garred et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
표적 양성 세포주 | 세포독성 CD 50 (nM) | |||||
결합 영역
표적 |
SLT-1A-WT only | SLT-1A-WT::scFv-1 | SLT-1A-FR::scFv-1 | SLT-1A-WT::scFv-2 | SLT-1A-FR::scFv-2 | |
A | scFv-1 | 905.0 | 0.24 | 0.29 | N/T | N/T |
B | scFv-1 | 1800.0 | 0.47 | 0.29 | N/T | N/T |
C | scFv-1 | 37.0 | 0.22 | 0.41 | N/T | N/T |
D | scFv-1 | 4740.0 | 0.55 | 0.37 | N/T | N/T |
E | scFv-2 | 11050.0 | N/T | N/T | 0.920 | 1.30 |
F | scFv-2 | 32200.0 | N/T | N/T | 16.10 | 13.60 |
G | scFv-2 | 506.0 | N/T | N/T | 0.120 | 0.240 |
"N/T"는 실험되지 않았음을 나타냄 |
상기의 퓨린-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 퓨린-절단가능한 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드와 등가의 세포독성을 나타낸다.
[412] SLT-1A-FR을 포함하는 세포-표적화된 단백질에 대한 CD50 값은 SLT-1A-WT를 포함하는 세포-표적화된 단백질에 대한 CD50 값에 비교할 만하다(표 2). SLT-1A-WT 및 SLT-1A-FR를 포함하는 세포-표적화된 단백질은 양자 모두 강력하게 표적 발현 세포를 사멸시켰지만 동일한 복용량에서 표적 음성적인 세포는 비슷한 백분율만큼 사멸시키지 않았다(실험된 최고 농도에서의 세포 생존율에서 상당한 감소가 없었을 때 정확한 곡선은 생성될 수 없었기에, 이러한 자료에 대하여, 표적 음성 세포에 대한 CD50 값은, 충분한 정보를 알려주지 않았다). 표 2에서 요약된 결과는 세포-표적화 분자의 구성성분으로서 SLT-1A-FR 및 SLT-1A-WT의 비슷한 세포독성을 보여준다. SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2 양자는 퓨린-절단 민감성 야생형 시가 독소 A1 단편 영역을 포함하는 세포-표적화 분자에 관련된 세포독성과 동일하다. 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 SLT-1A-FR을 포함하는 특이적인 세포독성 단백질의 한 가지 예는 그래프로 보여진다: 세포독성은 표적 음성 인간 종양 세포가 아니라(도 5), 표적 발현 인간 종양 세포에 직접적으로 나타난다(도 4).
실험실 동물을 사용한 표준적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2의 체내 내성 실험
[413] 상기의 내성은 상기의 모범적인 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR::scFv-2의 다른 복용량에 대하여 실험되었으며, 각각은 퓨린-절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드 영역을 포함하고 있다. 쥐는 명시적인 역효과가 표준적인 세포-표적화 분자의 다양한 복용량에서 용인되는 정도를 측정하기 위하여 사용되었다. 치료적인 내성은 체내 효율성 연구를 위한 개시 복용량을 알려주기 위하여 최대치 내성 복용량을 측정하는 것을 목표로 뮤린 복용법을 사용하여 측정되었다. 상기의 내성 연구는 표 3에 기재된 4개의 분리된 연구로 찰리스 리버 연구실(Charles River Laboratories Internation al, Inc., Morrisville, NC, U.S.)에서 실행되었다. 각 연구를 위하여, 중증 복합형 면역 부전증(SCID)을 가진 암컷 쥐 C.B-17 SCID를 유사 평균 체중을 가진 그룹으로 분류하였다. 실험 시약 또는 매개체 조절은 주사당 체중 킬로그램당 0.25에서 5.00 밀리그램 범위의 복용량으로 투여되었으며(mg/kg/inj), 주사는 일주일 또는 2 주일 동안 일주일에 세 번 투여되었다. 체중 및 임상 증상들은 연구가 진행되는 동안 계속해서 모니터되었다. 실험실 동물을 사용한 체내 내성 연구 결과는 표 3에서 요약되었다. 표 3은 그룹당 쥐의 개체수, 투약되는 샘플, 주사 복용량, 한 마리 쥐당 체중 1 kg당 축적된 복용량 밀리그램(mg/kg/mouse), 관측된 사멸에 관련된 치료의 숫자, 및 그룹당 평균적인 사멸일을 나타낸다.
연구 | 샘플 | 복용량 (mg/kg/inj) | 복용량 | 축적된 복용량 (mg/kg/ mouse) |
그룹당 쥐 개체수 | 사멸 | 그룹당 평균적인 사멸일 |
#1 | 매개체 제어 |
0.00 | 3 | 0.00 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
SLT-1A-WT::scFv-1 | 1.25 | 3 | 3.75 | 4 | 4 | 8.5 | |
SLT-1A-WT::scFv-1 | 2.50 | 3 | 7.50 | 4 | 4 | 7.3 | |
#2 | SLT-1A-WT::scFv-1 | 1.25 | 3 | 3.75 | 5 | 5 | 7.4 |
SLT-1A-WT::scFv-1 | 2.50 | 2 | 5.00 | 5 | 5 | 5.2 | |
SLT-1A-WT::scFv-1 | 5.00 | 2 | 10.00 | 5 | 5 | 4.4 | |
#3 | 매개체 제어 |
0.00 | 3 | 0.00 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
SLT-1A-FR::scFv-1 | 0.25 | 3 | 0.75 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
|
SLT-1A-FR::scFv-1 | 1.25 | 3 | 3.75 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
|
SLT-1A-FR::scFv-1 | 2.50 | 3 | 7.5 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
|
#4 | 매게체 제어 |
0.00 | 6 | 0.00 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
SLT-1A-FR::scFv-2 | 0.25 | 6 | 1.50 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
|
SLT-1A-FR::scFv-2 | 1.00 | 6 | 6.00 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
|
SLT-1A-FR::scFv-2 | 2.00 | 6 | 12.00 | 4 | 0 | 연구 끝까지 모두 생존 |
뮤린 내성 연구는 표준적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A-FR:: scFv-2가 0.25-2.50 mg/kg/inj 범위의 복용량으로 체내에서 우수한 내성을 가지는 것을 나타내고 있다.
[414] 연구 #1에서, 상기의 세포-표적화 분자 SLT-1A-WT::scFv-1는 매개체 조절과 함께 실험되었다. 쥐들은 1.25, 또는 2.50 mg/kg/inj SLT-1A-WT::scFv-1로 매개체 조절과 함께 1일, 3일, 및 5일 복용시켰다. 연구 1에서, SLT-1A-WT::scFv-1로 처리된(treated) 모든 쥐들은 시작 2일 세 번째 복용 후 사멸 관련 치료를 받았다. 연구 #1에서, 1.25 mg/kg/inj의 SLT-1A::WT-scFv-1를 투여받은 그룹의 쥐들은 7, 8, 9 및 10 연구일에 죽었으며(하루당 한 마리의 쥐), 2.50 mg/kg/inj의 SLT-1A-WT:: scFv-1를 투여받은 그룹의 쥐들은 7일(세 마리의 쥐들) 또는 8일( 한 마리의 쥐)에 죽었다. 매개체 조절을 투여받은 그룹 내에 있는 모든 쥐들은 연구가 끝날 때까지 생존하였다.
[415] 연구 #2에서, 쥐들은 연구 #1과 동일한 SLT-1A-WT::scFv-1가 투여되었지만 5.00 mg/kg/inj의 더 높은 용량이 투여되었다. 연구 #2에서, 연구 #1과 동일한 SLT-1A-WT::scFv-1가 투여된 쥐들에게는 유사한 결과를 얻을 수 있었다; 그러나, 연구 #2에서는, 단지 가장 높은 용량을 두 가지 주사로 받는 두 개의 그룹 내에 있는 쥐들만이 그러한 그룹 내에 있는 쥐들에 대한 처치(treatment)-관련 사멸에 이르게 되었다. 도 6은 카플란-마이어 곡선을 사용하여 SLT-1A-WT::scFv-1를 투여받은(연구 #1) 쥐들과 비교한 2.50 mg/kg/inj의 SLT-1A-FR::scFv-1를 투여받은(연구 #2) 그룹으로부터 생존한 쥐들의 비교를 보여준다.
[416] 연구 3에서, 쥐들은 연구 #1에 대한 매개체 조절 또는 상기의 모범적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1를 투여받았으나, 용량은 0.25 mg/kg/in으로 줄여서 투여되었다. 쥐들은 0.25, 1.25, 또는 2.50 mg/kg/inj의 SLT-1A-FR:: scFv-1을 연구가 진행되는 1, 3, 및 5일에 복용하였다. SLT-1A-FR::scFv-1가 투여된 모든 쥐들이 연구 #3이 끝날 때까지 생존하였다. 체중에 있어서 용량-의존성 감소가 관측되었다; 그러나, 최대 내성 용량은 연구 #3에서 SLT-1A-FR::scFv-1에 대하여 관측되지 않았다. 실험군 중에서 최고 용량 그룹(2.50 mg/kg/inj의 SLT-1A- FR::scFv-1 투여)은 최악의 순간에도 단지 13.1% 체중 손실을 보여주었다. 이러한 결과는 SLT-1A-FR::scFv-1이 0.25-2.50 mg/kg/inj 범위 내의 반복된 복용에서 체내에서 높은 내성을 가진다는 사실을 입증하는 것이다. 이러한 결과는 또한 실험된 조건하에서 SLT-1A-FR::scFv-1이 SLT-1A-WT::scFv-1보다 더욱 우수한 내성을 가진다는 사실을 입증하는 것이다.
[417] 연구 4에서, 쥐들은 매개체 조절 또는 상기의 모범적인 세포-표적화 분자 0.25, 1.00, 또는 2.00 mg/kg/injection의 SLT-1A-FR::scFv-2를 2주일 동안 일주일에 세 번(전체 6 번) 투여받았다. SLT-1A-FR::scFv-2가 투여된 모든 쥐들은 연구 #4가 끝날 때까지 생존하였으며 어떠한 반대 임상 관측도 상기 연구의 전 과정동안 보고되지 않았다. 연구 #4는 32일까지 연장되었으며, 평균 체중은 SLT-1A- FR::scFv-2이 투여된 쥐들을 포함한 전체 그룹에 대하여 시작 체중의 약 80%로 관측되었다. 이러한 결과는 SLT-1A-FR::scFv-2가 0.25-2.50 mg/kg/inj 범위 내의 반복된 복용에서 체내에서 높은 내성을 가진다는 사실을 입증하는 것이다.
[418] 프로테아제-민감성 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포-표적화 분자에 대한 내성(연구 #1 및 #2)과 비교하여, 퓨린-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 상기의 모범적인 세포-표적화 분자가 0.25-2.50 mg/kg/inj 범위 내의 반복된 용량을 적용하는 복용에서 향상된 내성(연구 #3 및 #4)을 발현한다는 사실을 입증하는 것이다.
[419] 본 발명의 이러한 두 가지의 모범적인 세포-표적화 분자에 대한 상기의 향상된 체내 내성은 퓨린-절단 민감성 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 비교할 때 본 발명에 따른 세포독성 분자의 높은 복용량이 포유류에 대하여 안전하게 투여될 수 있음을 시사한다.
[420] 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포-표적화 분자와 거의 동일한 등가의 세포독성을 보유함에도 불구하고, 퓨린-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 상기의 모범적인 세포-표적화 분자는 향상된 내성 포유류를 발현하였다. 즉, 향상된 독성 프로파일은 유해한 효과에 있어서 감소에 기인하는 것이다. 상기의 향상된 독성 프로파일은 상기 분자의 일반적으로 향상된 프로테아제 저항성에 관련된 비-특이적 독성에서의 감소에 기인하는 것일 수 있다. 또한 이러한 결과는 퓨린-절단 모티프를 붕괴하는 것이 상기의 전체 세포-표적화 분자에 대한 증가된 안정성을 부여할 수 있는 것을 시사한다. 나아가, 단백질 가수분해에 대한 분자의 저항성은 유기체에 그것의 약동학적 프로파일 적용을 향상시킬 수 있다.
동물 모델을 사용한 체내에서 모범적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR:: scFv-2의 표적화된 세포독성 및 효율성 실험
[421] 인간 종양에 대한 다발성 이종 이식 모델은 인간 종양 보유 쥐 내에서 상기의 모범적인 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-2의 체내 효율성을 측정하는데 사용되었다. 구조적으로 루시퍼라제를 발현하고 scFv-2의 표적에 대한 세포-표면 발현을 나타내는 인간 종양 세포는 이러한 이종 이식 모델에 사용되었다.
[422] 연구 과정에서 중증 복합성 면역 부전증(SCID)을 가진 CB.17 SCID 쥐들은 200 μL PBS 내에서 2.5 x 106 hTum-Luc 종양 세포와 함께 정맥주사로 도전되었다(Molecular Imaging, Ann Arbor, MI, U.S.). 확증적인 생물발광 촬영(BLI)이 세포 주사 후 5분간 촬영되었고, 쥐들은 각 열 마리씩(N=10 mice) 네 개의 그룹으로 나누어졌다. 0(주입 후 1 시간 경과), 2, 4, 7, 9, 및 11일에 종양 세포 도전이 뒤따랐고, 상기의 네 개의 그룹에 있는 쥐들은 매개체 조절(0 mg/kg/inj) 또는 0.05, 0.50, 또는 2.00 mg/kg/inj의 SLT-1A-FR::scFv-2가 복강을 경유하여 주입되었다. 생물발광은 칼리퍼 IVIS 50 광학 촬영 시스템을 사용하여 14, 18, 및 21일에 측정되었다(Perkin Elmer, Waltham, MA, U.S.).
[423] 상기의 모범적인 세포독성 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-2는 모든 복용량 레벨에서 인간 종양 덩어리를 감소시켰다. 이러한 연구 결과는 도 7 및 표 4에서 보고된다. 이러한 연구에서, 상기의 샘플 사이즈(n)은 모든 네 개의 그룹에 대하여 한 그룹당 10 마리의 쥐들이었다. 도 7은 상기 루시퍼라아제 보고의 인간 종양 세포의 발현에 근거하여 초과 시간 개개의 마우스당 생체발광에 의해 분석된 종양 덩어리를 보여준다. 각각의 쥐는 상기 그래프 상에 도표된 각 기호에 의해 대표되는데, 즉, 그 기호는 흰 삼각형, 검은 삼각형, 흰 원, 또는 검은 사각형이다. Y-축은 개개 마우스의 전체 생체발광 신호이며, 그것은 초당 수백만 광자에서(photons/sec) 상기 종양 덩어리를 대표하고, X-축은 주사당 체중 kg당 SLT-1A-FR::scFv-2의 0에서 2mg까지 범위에 대한 주사 용량이다. 표 4는 다른 시간 포인트에서(연구일 14, 18, 21, 및 28) 각 그룹 내 마우스들 중의 표준에러평균 (SEM) 및 평균 BLI을 보고한다.
일 | 매개체 제어 |
0.05 mg SLT-1A-FR::scFv-2 /kg/inj | 0.50 mg SLT-1A-FR::scFv-2 /kg/inj | 2.00 mg SLT-1A-FR::scFv-2 /kg/inj | ||||
평균 | SEM | 평균 BLI | SEM | 평균 BLI | SEM | 평균 BLI | SEM | |
14 | 235 | 28 | 24 | 7 | 1.02 | 0.05 | 1.07 | 0.07 |
18 | 1900 | 201 | 251 | 80 | 1.36 | 0.18 | 0.90 | 0.04 |
21 | 5850 | 658 | 744 | 296 | 3.47 | 1.03 | 1.09 | 0.10 |
28 | 23700 | 2310 | 6960 | 1670 | 99.30 | 38.0 | 4.13 | 2.98 |
뮤린 이종 이식 연구는 모범적인 세포독성 분자 SLT-1A-FR::scFv-2가 체내에서 효과적이라는 사실을 입증한다.
[424] 이러한 결과는 SLT-1A-FR::scFv-2가 인간 종양 세포를 가진 SCID 내 상기의 인간 종양 덩어리를 현저하게 감소할 수 있다는 것을 보여준다. 상기의 모범적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-2가 투여된 쥐들로 이루어진 모든 그룹은 매개체 조절과 비교하여 전체 생체발광이 현저하게 적음을 보여준다(도 7 및 표 4). 이러한 효과는 0.05에서 2.00mg/kg/inj까지 범위의 SLT-1A-FR::scFv-2를 복용한 쥐들에서 관측되었다(도 7 및 표 4). 상기 관측된 종양-억제 효과는 용량 의존적인데 그것은, 0.50 또는 2.00 mg/kg/inj의 SLT-1A-FR::scFv-2가 투여된 쥐들이 종양 성장을 나타내지 않았던 반면, 0.05 mg/kg/inj의 SLT-1A-FR::scFv-2가 투여된 쥐들은 BLI에 의해 측정된 바와 같이 종양 성장을 나타내고 있기 때문이었다(도 7 및 표 4).
[425] 이러한 결과는 상기의 모범적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR:: scFv-2가 1) 체내 종양 성장을 억제하는데 효과적이고, 나아가 2) 퓨린-절단 민감성 SLT-1A-WT를 포함하는 세포-표적화 분자와 등가의 세포독성을 발현하고; 그리고 3) SLT-1A-WT를 포함하는 세포-표적화 분자와 거의 동일하게 비교되는 높은 용량에서 향상된 내성을 가진다는 사실을 입증한다.
요약
[426] 상기의 모범적인 세포-표적화 분자 SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A- FR::scFv-2는, 최소 퓨린-절단 모티프 R/Y-x-x-R 내 돌연변이를 포함하고, 야생형 시가 독소 A 서브유닛 영역을 포함한 세포-표적화된 단백질과 비교하여 인간 퓨린에 의해 단백질 가수분해되지 않았지만 특이적인 세포독성을 발현하였다. 상기의 모범적인 세포-표적화 분자 SLT-1A- FR::scFv-2은 포유동물 모델 내에서 인간 종양 성장을 효과적으로 억제시켰다. 나아가, SLT-1A-FR::scFv-1 및 SLT-1A- FR:: scFv-2은 양자 모두 야생형 시가 독소 A 서브유닛 영역을 포함한 부모 분자와 비교하여 향상된 내성을 발현하였다.
[427] 퓨린-절단 붕괴 돌연변이(R248A 및/또는 R251A)를 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 포함하는 SLT-1A-FR::scFv-1, SLT-1A-FR::scFv-2, 및 SLT-1A- FR-2::scFv-2의 각 성질은 시가 독소 A 서브유닛 내 보존적인 표면-노출된 루프 내 상기 퓨린-절단 모티프의 다른 붕괴를 시사하고, 체내 향상된 독성 프로파일 및 야생형 시가 독소 A 서브유닛을 포함하는 분자와 같은 등가의 세포독성과 같은 동일한 성질을 제공할 수 있다.
[428] 시가 독소 A 서브유닛 작동체 폴리펩티드를 포함하는 세포-표적화 분자 내 R248A 및 R251A와 유사한 돌연변이는 유사한 구조 및 기능을 제공한다. 예를 들어서, 시가 독소 A 서브유닛 내 상기의 보존된 퓨린-절단 공통 모티프 S-R/Y-x-x-R를 혼란시키는 어떤 돌연변이는 결과적으로 퓨린-절단 저항성을 야기시키지만 세포독성을 혼란시키지는 않았다. 특히, A, G, P, S, T, D, E, Q, N, C, I, L, M, V, F, W, 및 Y와 같이 양 전하가 결핍된 어떤 비-염기성 아미노산 잔기에 아르기닌의 아미노산 잔기 치환은 본 발명에 따른 분자의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 창출할 수 있다. 유사하게, 상기의 최소 퓨린-절단 모티프 R/Y-x-x-R를 혼란시키는 상기의 퓨린-절단 모티프 내에 내부적 결실 및 상기 시가 독소 A의 절단은 유사한 구조 및 기능을 가진 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 창출할 수 있다.
[429] 요약컨대, 세포독성 분자는 세포독성에 있어서 어떠한 감소 없이 28 kDa보다 더 큰 카르복시-말단 근위 모이어티들 및 퓨린-절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 유래된 폴리펩티드를 사용하여 창출될 수 있다. 이것은 시가 독소가 최적의 세포독성을 위하여 적절한 준세포 구획 내 이러한 퓨린-절단 사이트에서 진행되는 단백질 가수분해를 필요로하기 때문에 놀라운 발견인 것이다(Garred Ø et al., Exp Cell Res 218: 39-49 (1995); Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Lea N et al., Microbiology 145: 999-1004 (1999); Kurmanova A et al., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
실시예 2. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 CD20에 대한 특이적 카르복시-말단 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(αCD20와 링크된 SLT-1A-FR)
[430] 이러한 실시예에서, 상기의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 상기의 시가-유사 독소 1(SLT-1A)로부터 유도된 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 면역글로불린-유형 결합 αCD20-항원은 인간 CD20을 인식하는 면역글로불린-유형 도메인으로부터 유도되며(Haisma H et al., Blood 92: 184-90 (1999); Geng S et al., Cell Mol Immunol 3: 439-43 (2006); Olafesn T et al., Protein Eng Des Sel 23: 243-9 (2010)), 그것은 CD2의 세포외 부분을 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함하고 있다. CD20은 B-세포 림프종 세포, 모발성 백혈병 세포, B-세포 만성 림프종 백혈병 세포, 및 흑색종 세포와 같은 다양한 암 세포 유형 상에 발현된다. 나아가, CD20은 과활동성 B-세포가 참여하는 증상, 장애 및 자기면역 질환을 치료하기 위한 치료법을 위한 주목받는 대상이다.
세포독성 세포-표적화 분자 "SLT-1A-FR::αCD20"의 구성, 생산, 및 정제
[431] 상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 αCD20 및 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 서로 링크된다. 예를 들어서, 융합 단백질은 CD20-항원-결합 단백질 SLT-1A-FR ::αCD20(SEQ ID NO: 50, 51, 52, 및 53)을 인코딩하는 폴리펩티드를 발현함에 의해 생산된다. SLT-1A-FR::αCD20 세포독성 분자의 발현은 전 실시예에 기재된 바와 같이, 박테리아 및/또는 무세포 단백질 번역 시스템을 사용하여 완성된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "SLT-1A-FR::αCD20"의 체내 특징 측정
[432] CD20+ 세포 및 CD20- 세포에 대한 이러한 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 본 발명이 속한 기술 분야에서 널리 알려진 형광-기반, 유동-세포 분석법에 의해 측정된다. 프리즘 소프트웨어를 사용하여(GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.), 결합-포화도 제목(heading)하에서 프리즘 소프트웨어의 한-부위 결합의 함수[Y=Bmax*X/(KD+X)]를 사용하여, Bmax 및 KD가 계산되었다. Bmax는 MFI 내에서 보고된 최대 특이적 결합이다. KD 는 nM 내에서 보고된, 평형 결합 상수이다. CD20+ 세포에 대한 SLT-1A-FR::αCD20의 Bmax는 0.01-100 나노몰(nM) 범위 내의 KD를 가진 약 50,000-200,000 MFI로 측정되었으며, 이에 반하여 CD20- 세포에 대한 값은 이러한 분석에 있어서 그다지 현저한 결합 값을 보여주지 않았다.
[433] SLT-1A-FR::αCD20 세포독성 분자의 리보솜 불활성 능력은 상기에서 실시된 예에 기재된 바와 같이 체내 단백질 번역, 무세포 분석으로 측정되었다. 무세포 단백질 합성 상 이러한 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 상당했다.
이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A-FR::αCD20의 IC5O은 약 0.1-100 pM 이었다.
CD20+ 세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "SLT-1A-FR::αCD20"의 세포독성 측정
[434] SLT-1A-FR::αCD20의 상기 세포독성 특성은 CD20+ 세포를 사용한 상기 전에 실시된 예들에 기재된 바와 같은 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 측정되었 다. 나아가, SLT-1A-FR::αCD20의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 CD20+ 세포와 비교해서 CD20- 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석에 의해 측정되었다.
이러한 실시예의 상기 세포독성 분자의 CD50은 세포주에 의존적인 CD20+ 세포에 대하여 약 0.01-100 nM이다. 세포 표면상에서 CD20를 발현하는 세포와 비교할 때 세포 표면상에서 CD20를 발현하지 않는 세포에 대한 상기 세포독성 분자의 CD50값은 약 10-10,000 배 더 크다(세포독성이 적다).
동물 모델을 사용한 세포독성 분자 "SLT-1A-FR::αCD20" 의 체내 효과 측정
[435] 동물 모델은 종양성 신생 세포(neoplastic cells) 상 세포독성 분자 SLT-1A-FR::αCD20의 체내 효과를 측정하는데 사용된다. 다양한 쥐 균주(strains)는 세포 표면에서 CD20을 발현하는 인간 종양성 신생 세포를 쥐에게 투여하여 생겨난 이종이식 종양에 정맥내 투여 후 세포독성 분자의 효과를 시험하기 위해 사용된다.
실시예 3. 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 작동체 영역 및 HER2에 대한 특이적 카르복시-말단 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR )
[436] 이러한 실시예에서, 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 상기의 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도되었다. 상기의 면역글로불린-유형 결합 영역은 미국 특허 출원 공보 제2011/0059090호에 기재된 바와 같이, 낙타과 항체 (VHH) 단백질 5F7의 단일-도메인 가변 영역으로부터 유래된 αHER2-VHH이다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[437] 상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 및 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 세포독성 세포-표적화 분자(SEQ ID NO:54)를 형성하기 위하여 서로 링크된다. 이러한 실시예에서, 단백질 5F7로부터 유도된 상기의 αHER2- VHH 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:22의 아미노산을 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 프레임 내에서 그리고 본 기술 분야에서 알려진 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 프레임 내에서 클로닝 된다. "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 변종은 상기의 결합 영역이 상기의 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 아미노-말단에 근위적으로 선택적 위치하고 상기 KDEL 군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 카르복시-말단 소포체 신호 모티프를 선택적적으로 포함하게 하기 위하여 창출되었다. "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 변종의 발현은 전 실시예에 기재된 바와 같이, 박테리아 및/또는 무세포 단백질 번역 시스템을 사용하여 완성된다.
세포독성 분자 "αHER2-V
H
H와 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특징 측정
[438] HER2+ 세포 및 HER2- 세포에 대한 이러한 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 본 발명이 속한 기술 분야에서 널리 알려진 형광-기반 유동-세포 분석법에 의해 측정된다. HER2+ 세포에 대한 "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR" 변종의 Bmax는 0.01-100 nM 범위 내의 KD를 가진 약 50,000-200,000 MFI로 측정되었으며, 이에 반하여 HER2- 세포에 대한 값은 이러한 분석에 있어서 그다지 현저한 결합 값을 보여주지 않았다.
[439] "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR" 세포 독성 분자의 리보솜 불활성 능력은 상기에서 실시된 예에 기재된 바와 같이 무세포, 시험관 내 단백질 번역 분석으로 측정되었다. 무세포 단백질 합성 상 이러한 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR" 변종의 IC5O은 약 0.1-100 pM 이었다.
HER2+ 세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[440] "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR" 변종의 상기 세포독성 특성은 HER2+ 세포를 사용한 상기 전에 실시된 예들에 기재된 바와 같은 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 측정되었다. 나아가, "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 HER2+ 세포와 비교해서 HER2- 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석에 의해 측정되었다. 이러한 실시예의 상기 세포독성 분자의 CD50값은 세포주에 의존적인 HER2+ 세포에 대하여 약 0.01-100 nM이다. 세포 표면상에서 HER2를 발현하는 세포와 비교할 때 세포 표면상에서 HER2를 발현하지 않는 세포에 대한 상기 세포독성 분자의 CD50값은 약 10-10,000 배 더 크다(세포독성이 더 적다).
동물 모델을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR"의 체내 효과 측정
[441] 동물 모델은 세포독성 분자 "αHER2-VHH와 링크된 SLT-1A-FR"가 종양성 신생 세포에 미치는 체내 효과를 측정하기 위하여 사용된다. 다양한 쥐 균주가 세포독성 분자가 세포 표면에 HER2를 발현하는 인간 종양성 신생 세포를 쥐에 주사해 야기한 쥐의 이종 이식 종양에 정맥 주사 이후 미치는 영향을 실험하기 위해 사용된다.
실시예 4. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 항체 α엡스타인바-항원으로부터 유도된 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR)
[442] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도된 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 면역글로불린-유형 결합 영역 α엡스타인바-항원은 엡스타인바 항원에 대응하는 단일클론성 항체로부터 유도되었고(Fang C et al., J Immunol Methods 287: 21-30 (2004)), 상기 결합 영역은 엡스타인바 바이러스에 감염된 인간 세포 또는 엡스타인바 항원을 발현하는 형질전환 세포를 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함한다. 상기 엡스타인바 항원은 엡스타인바 바이러스에 감염된 세포 및 암 세포(예: 림프종 및 비인두암 세포)와 같은 다양한 세포에 발현된다. 또한, 엡스타인바 감염은, 예를 들어 다발성 경화증과 같은, 다른 질병과 관련되어있다.
세포독성 세포-표적화 분자 "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[443] 면역글로불린-유형 결합 영역 α엡스타인바-항원 및 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 함께 연결되어있고, 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 카르복시-말단 KDEL(SEQ ID NO: 62)이 부가된다. 예를 들어, 융합 단백질은 α엡스타인바-항원-결합 단백질 "SLT-1A-FR::α엡스타인바::KDEL"(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. "SLT-1A-FR::α엡스타인바::KDEL" 세포독성 분자(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 발현은 앞선 실시예에 기술된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[444] 엡스타인바 항원 양성 세포 및 엡스타인바 항원 음성 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 당업계에 알려진 형광성-기반의 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 엡스타인바 항원 양성 세포에 대한 "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"의 Bmax는 약 50,000-200,000 MFI에 0.01-1OO nM 범위 내의 KD인 반면, 이 분석에서는 엡스타인바 항원 음성 세포에 대한 유의미한 결합이 없다.
[445] "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 상당하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[446] "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 특성은 앞선 실시예에 기술된 엡스타인바 항원 양성 세포를 사용한 통상의 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 또한, "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 엡스타인바 항원 양성 세포의 비교대상으로 엡스타인바 항원 음성 세포를 사용한 동일한 통상의 세포-사멸 분석법으로 측정된다. 이 실시예의 세포독성 분자의 CD50은 세포주에 따라 엡스타인바 항원 양성 세포에 대해 약 0.01-100 nM이다. 세포독성 분자의 CD50은 세포 표면에 엡스타인바 항원을 발현하는 세포와 비교해 세포 표면에 엡스타인바 항원을 발현하지 않는 세포에 대해 약 10-10,000배 크다(세포 독성이 덜하다).
동물 모델을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"의 체내 효과 측정
[447] 동물 모델은 세포독성 분자 "α엡스타인바와 링크된 SLT-1A-FR"가 종양성 신생 세포에 미치는 체내 효과를 측정하기 위하여 사용된다. 다양한 쥐 균주에 세포독성 분자가 세포 표면에 엡스타인바 항원을 발현하는 인간 종양성 신생 세포를 쥐에 주사해 야기한 쥐의 이종 이식 종양에 정맥 주사 이후 미치는 영향을 실험하기 위해 사용된다.
실시예 5. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 항체 α리슈만편모충-항원로부터 유도된 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR)
[448] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도된 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 면역글로불린-유형 결합 영역 α리슈만편모충(Leishmania)-항원은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 세포내 트리파노소마티드 원생동물(trypanosomatid protozoa)을 가지는 인간 세포에 나타나는 세포-표면 리슈만편모충 항원에 대해 발생한 항체로부터 유도되었다(Silveira T et al., Int J Parasitol 31: 1451-8 (2001); Kenner J et al., J Cutan Pathol 26: 130-6 (1999); Berman J and Dwyer, Clin Exp Immunol 44: 342-348 (1981)).
세포독성 세포-표적화 분자 "α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[449] 면역글로불린-유형 결합 영역 α-리슈만편모충-항원 및 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 함께 연결되어있고, 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 카르복시-말단 KDEL(SEQ ID NO: 62)이 부가된다. 예를 들어, 융합 단백질은 리슈만편모충-항원-결합 단백질 SLT-1A-FR::α리슈만편모충::KDEL(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A-FR::α리슈만편모충::KDEL 세포독성 분자(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 발현은 앞선 실시예에 기술된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[450] 리슈만편모충 항원 양성 세포 및 리슈만편모충 항원 음성 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 당업계에 알려진 형광성-기반의 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 리슈만편모충 항원 양성 세포에 대한 "α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR"의 Bmax는 약 50,000-200,000 MFI에 0.01-1OO nM 범위 내의 KD인 반면, 이 분석에서는 리슈만편모충 항원 음성 세포에 대한 유의미한 결합이 없다.
[451] "α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 현저하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[452] "α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 특성은 앞선 실시예에 기술된 리슈만편모충 항원 양성 세포를 사용한 통상의 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 또한, "α리슈만편모충과 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 리슈만편모충 항원 양성 세포의 비교대상으로 리슈만편모충 항원 음성 세포를 사용한 동일한 통상의 세포-사멸 분석법으로 측정된다. 이 실시예의 세포독성 분자의 CD50은 세포주에 따라 리슈만편모충 항원 양성 세포에 대해 약 0.01-100 nM이다. 세포독성 분자의 CD50은 세포 표면에 리슈만편모충 항원을 발현하는 세포와 비교해 세포 표면에 리슈만편모충 항원을 발현하지 않는 세포에 대해 약 10-10,000배 크다(세포 독성이 덜하다).
실시예 6. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 면역글로불린-유형 결합 영역 α뉴로텐신-수용체로부터 유도된 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR)
[453] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도된 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 면역글로불린-유형 결합 영역 α뉴로텐신R(NeurotensinR)은 인간 뉴로텐신 수용체에 결합하는 DARPin™(GenBank Accession: 2P2C_R) 또는 단일클론성 항체(Ovigne J et al., Neuropeptides 32: 247-56 (1998))로부터 유도되었다. 상기 뉴로텐신 수용체는, 예를 들어 유방암, 대장암, 폐암, 흑색종, 및 췌장암 세포와 같은 다양한 암세포에 의해 발현된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[454] 면역글로불린-유형 결합 영역 α뉴로텐신R 및 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 함께 연결되어있고, 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 카르복시-말단 KDEL(SEQ ID NO: 62)이 부가된다. 예를 들어, 융합 단백질은 뉴로텐신-수용체-결합 단백질 SLT-1A-FR::α뉴로텐신R::KDEL(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A-FR::α뉴로텐신R::KDEL 세포독성 분자(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 발현은 앞선 실시예에 기술된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[455] 뉴로텐신 수용체 양성 세포 및 뉴로텐신 수용체 음성 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 당업계에 알려진 형광성-기반의 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 뉴로텐신 수용체 양성 세포에 대한 "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"의 Bmax는 약 50,000-200,000 MFI에 0.01-1OO nM 범위 내의 KD인 반면, 이 분석에서는 뉴로텐신 수용체 음성 세포에 대한 유의미한 결합이 없다.
[456] "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 상당하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[457] "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 특성은 앞선 실시예에 기술된 뉴로텐신 수용체 양성 세포를 사용한 통상의 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 또한, "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 뉴로텐신 수용체 양성 세포의 비교대상으로 뉴로텐신 수용체 음성 세포를 사용한 동일한 통상의 세포-사멸 분석법으로 측정된다. 이 실시예의 세포독성 분자의 CD50은 세포주에 따라 뉴로텐신 수용체 양성 세포에 대해 약 0.01-100 nM이다. 세포독성 분자의 CD50은 세포 표면에 뉴로텐신 수용체를 발현하는 세포와 비교해 세포 표면에 뉴로텐신 수용체를 발현하지 않는 세포에 대해 약 10-10,000배 크다(세포 독성이 덜하다).
동물 모델을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"의 체내 효과 측정
[458] 동물 모델은 세포독성 분자 "α뉴로텐신R과 링크된 SLT-1A-FR"가 종양성 신생 세포에 미치는 체내 효과를 측정하기 위하여 사용된다. 다양한 쥐 계통에 세포독성 분자가 세포 표면에 뉴로텐신 수용체를 발현하는 인간 종양성 신생 세포를 쥐에 주사해 야기한 쥐의 이종 이식 종양에 정맥 주사 이후 미치는 영향을 실험하기 위해 사용된다.
실시예 7. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 면역글로불린-유형 결합 영역 αEGFR으로부터 유도된 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR)
[459] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도된 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 면역글로불린-유형 결합 영역 αEGFR은 하나 이상의 인간 표피성장인자와 결합하는 AdNectin™(GenBank Accession: 3QWQ_B), Affibody™(GenBank Accession: 2KZI_A; U.S. patent 8,598,113), 또는 항체로부터 유도되었다. 표피성장인자 수용체의 발현은, 예를 들어 폐암, 유방암, 및 직장암 세포와 같은, 인간 암 세포와 관련되어있다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[460] 면역글로불린-유형 결합 영역 αEGFR 및 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 함께 연결되어있고, 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 카르복시-말단 KDEL(SEQ ID NO: 62)이 부가된다. 예를 들어, 융합 단백질은 αEGFR 결합 단백질 SLT-1A-FR::αEGFR::KDEL(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A-FR::αEGFR::KDEL 세포독성 분자(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 발현은 앞선 실시예에 기술된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[461] EGFR+ 세포 및 EGFR- 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 당업계에 알려진 형광성-기반의 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. EGFR+ 세포에 대한 "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"의 Bmax는 약 50,000-200,000 MFI에 0.01-1OO nM 범위 내의 KD인 반면, 이 분석에서는 EGFR- 세포에 대한 유의미한 결합이 없다.
[462] "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역(translation)에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 현저하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[463] "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 특성은 앞선 실시예에 기술된 EGFR+ 세포를 사용한 통상의 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 또한, "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 리슈마니아 항원 양성 세포의 비교대상으로 EGFR- 세포를 사용한 동일한 통상의 세포-사멸 분석법으로 측정된다. 이 실시예의 세포독성 분자의 CD50은 세포주에 따라 EGFR+ 세포에 대해 약 0.01-100 nM이다. 세포독성 분자의 CD50은 세포 표면에 EGFR을 발현하는 세포와 비교해 세포 표면에 EGFR을 발현하지 않는 세포에 대해 약 10-10,000배 크다(세포 독성이 덜하다).
동물 모델을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"의 체내 효과 측정
[464] 동물 모델은 세포독성 분자 "αEGFR과 링크된 SLT-1A-FR"가 종양성 신생 세포에 미치는 체내 효과를 측정하기 위하여 사용된다. 다양한 쥐 계통에 세포독성 분자가 세포 표면에 EGFR(들)을 발현하는 인간 종양성 신생 세포를 쥐에 주사해 야기한 쥐의 이종 이식 종양에 정맥 주사 이후 미치는 영향을 실험하기 위해 사용된다.
실시예 8. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 항체 αCCR5로부터 유도된 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR)
[465] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도된 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 면역글로불린-유형 결합 영역 αCCR5는 인간 CCR5에 대응하는 단일클론성 항체로부터 유도되었다(Bernstone L et al., Hybridoma 31: 7-19 (2012)). CCR5는 대부분 T-세포, 대식세포, 수지상세포, 및 소교세포에 발현된다. 또한, CCR5는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)의 발병 및 확산시키는 역할을 한다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[466] 면역글로불린-유형 결합 영역 αCCR5 및 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 함께 연결되어있고, 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 카르복시-말단 KDEL(SEQ ID NO: 62)이 부가된다. 예를 들어, 융합 단백질은 αCCR5-결합 단백질 SLT-1A-FR::αCCR5::KDEL(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A-FR::αCCR5::KDEL 세포독성 분자(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 발현은 앞선 실시예에 기술된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[467] CCR5+ 세포 및 CCR5- 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 당업계에 알려진 형광성-기반의 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. CCR5+ 세포에 대한 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 Bmax는 약 50,000-200,000 MFI에 0.01-1OO nM 범위 내의 KD인 반면, 이 분석에서는 CCR5- 세포에 대한 유의미한 결합이 없다.
[468] "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 현저하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[469] "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 특성은 앞선 실시예에 기술된 CCR5+ 세포를 사용한 통상의 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 또한, "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 CCR5+ 세포의 비교대상으로 CCR5- 세포를 사용한 동일한 통상의 세포-사멸 분석법으로 측정된다. 이 실시예의 세포독성 분자의 CD50은 세포주에 따라 CCR5+ 세포에 대해 약 0.01-100 nM이다. 세포독성 분자의 CD50은 세포 표면에 CCR5를 발현하는 세포와 비교해 세포 표면에 CCR5를 발현하지 않는 세포에 대해 약 10-10,000배 크다(세포 독성이 덜하다).
동물 모델을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 체내 효과 측정
[470] 동물 모델은 세포독성 세포-표적화 분자 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"이 도너 물질(donor material)로부터 T-세포를 제거하는데 미치는 체내 효과를 측정하는데 사용된다(Tsirigotis P et al., Immunotherapy 4: 407-24 (2012) 참조). 비-인간 영장류는 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 체내 효과를 측정하기 위하여 사용된다. "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"으로 전처리된(pre-treated) 간 이식 후 히말라야 원숭이의 이식편대숙주 질환이 분석된다(Weaver T et al., Nat Med 15: 746-9 (2009) 참조). "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 다양한 투여량의 비경구 투약 이후 게먹이 원숭이에서 말초혈 T 림프구의 체내 감소가 관측되었다. HIV 감염을 억제하기 위한 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"의 사용은 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)에 노출되었을 때 순환하는 T-세포를 대폭 감소시키기 위하여 비-인간 영장류에 격심한(acute) 양의 "αCCR5와 링크된 SLT-1A-FR"을 주는 것으로 실험된다(Sellier P et al., PLoS One 5: e10570 (2010) 참조).
실시예 9. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 항-Env 면역글로불린 도메인으로부터 유도된 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(αEnv와 링크된 SLT-1A-FR)
[471] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가 독소의 A 서브유닛(StxA)으로부터 유도된 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 면역글로불린-유형 결합 영역 αEnv는 GP41, GP120, GP140, 또는 GP160과 같이 HIV 외피 당단백질(Env)을 결합하는 이미 존재하는 항체(예: Chen W et al., J Mol Bio 382: 779-89 (2008); Chen W et al., Expert Opin Biol Ther 13: 657-71 (2013); van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102 (2013) 참조) 또는 표준적인 기술을 사용하여 생성된 항체로부터 유도되었다(Prabakaran P et al., Front Microbiol 3: 277 (2012) 참조). Env는 HIV 복제 과정 동안 HIV-감염된 세포의 세포 표면상에서도 나타나는 HIV 표면 단백질이다. Env는 대부분 엔도조말 구획 내의 감염된 세포 내에서 발현되지만, 세포 표면상에 본 발명의 매우 강력한, 세포독성 세포-표적화 분자에 의해 표적화 될 수 있는 충분한 양의 Env가 있을 수 있다. 또한, Env-표적화 세포독성 분자는 HIV 바이러스 입자를 결합하여 숙주세포와 바이러스의 융합과정 동안 새롭게 감염된 세포 속으로 들어갈 수 있다.
[472] HIV는 매우 높은 돌연변율을 나타내기 때문에, 복수의 HIV 균주로부터의 Env를 결합하는 광범위한 중화항체가 나타내는 것과 같은, Env의 기능적인 제한 부분을 결합하는 면역글로불린 도메인을 사용하는 것이 바람직하다(van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102 (2013)). 감염된 세포의 표면상에 존재하는 Env는 입체적으로(sterically) 제한된 항원결정기를 나타내는 것으로 생각되기 때문에(Chen W et al., J Virol 88: 1125-39 (2014)), sdAb 또는 VHH 도메인과 같이, 100 kD보다 작은, 이상적으로는 25 kD보다 것을 사용하는 것이 바람직하다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[473] 면역글로불린-유형 결합 영역 αEnv 및 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 함께 연결되어있고, 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 카르복시-말단 KDEL(SEQ ID NO: 62)이 부가된다. 예를 들어, 융합 단백질은 αEnv-결합 단백질 SLT-1A-FR::αEnv::KDEL(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A-FR::αEnv::KDEL 세포독성 분자(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 발현은 앞선 실시예에 기술된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[474] Env+ 세포 및 Env- 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 당업계에 알려진 형광성-기반의 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. Env+ 세포에 대한 "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"의 Bmax는 약 50,000-200,000 MFI에 0.01-1OO nM 범위 내의 KD인 반면, 이 분석에서는 Env- 세포에 대한 유의미한 결합이 없다.
[475] "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 상당하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[476] "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 특성은 앞선 실시예에 기술된 Env+ 세포를 사용한 통상의 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 또한, "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 Env+ 세포의 비교대상으로 Env- 세포를 사용한 동일한 통상의 세포-사멸 분석법으로 측정된다. 이 실시예의 세포독성 분자의 CD50은 세포를 Env+으로 만들기 위해 세포를 감염시키는데 사용된 세포주 및/또는 HIV 균주에 따라 Env+ 세포에 대해 약 0.01-100 nM이다. 세포독성 분자의 CD50은 세포 표면에 Env를 발현하는 세포와 비교해 세포 표면에 Env를 발현하지 않는 세포에 대해 약 10-10,000배 크다(세포 독성이 덜하다).
동물 모델을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"의 체내 효과 측정
[477] HIV 감염을 억제하기 위한 "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"의 사용은 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)에 감염된 비-인간 영장류에 "αEnv와 링크된 SLT-1A-FR"을 투여하는 것으로 실험된다(Sellier P et al., PLoS One 5: e10570 (2010) 참조).
실시예 10. 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 항체 αUL18으로부터 유도된 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(αUL18과 링크된 SLT-1A-FR)
[478] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도된 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 면역글로불린-유형 결합 영역 αUL18은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 시토메갈로 바이러스에 감염된 인간 세포에 존재하는 세포-표면 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18에 대해 발생한 항체로부터 유도되었다(Yang Z, Bjorkman P, Proc Natl Acad Sci USA 105: 10095-100 (2008)). 인간 시토메갈로 바이러스 감염은 다양한 암 및 염증 질환과 관련되어있다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[479] 면역글로불린-유형 결합 영역 αUL18 및 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 함께 연결되어있고, 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 카르복시-말단 KDEL(SEQ ID NO: 62)이 부가된다. 예를 들어, 융합 단백질은 αUL18-결합 단백질 SLT-1A-FR::αUL18::KDEL(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A-FR::αUL18::KDEL 세포독성 분자(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 발현은 앞선 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성한다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[480] 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18 양성 세포 및 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18 음성 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 당업계에 알려진 형광성(fluorescence)-기반의 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18 양성 세포에 대한 "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR"의 Bmax는 약 50,000-200,000 MFI에 0.01-1OO nM 범위 내의 KD인 반면, 이 분석에서는 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18 음성 세포에 대한 유의미한 결합이 없다.
[481] "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 상당하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[482] "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 특성은 앞선 실시예에 기술된 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18 양성 세포를 사용한 통상의 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 또한, "αUL18과 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18 양성 세포의 비교대상으로 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18 음성 세포를 사용한 동일한 통상의 세포-사멸 분석법으로 측정된다. 이 실시예의 세포독성 분자의 CD50은 세포주에 따라 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18 양성 세포에 대해 약 0.01-100 nM이다. 세포독성 분자의 CD50은 세포 표면에 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18을 발현하는 세포와 비교해 세포 표면에 시토메갈로 바이러스 단백질 UL18을 발현하지 않는 세포에 대해 약 10-10,000배 크다(세포 독성이 덜하다).
실시예 11. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 연충(helminth) 창자 항원에 대한 항체로부터 유도된 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR)
[483] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 α연충-창자-항원(αhelminth-intestinal-antigen)은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 인간 트랜스페린 수용체의 연충 오르소로그(ortholog)에 대해 발생한 항체로부터 유도되었다(예: 선충(nematode) 유전자 gcp-2.1 UniProt G8JYE4_CAEEL; Rosa B et al., Mol Cell Proteomics M114.046227 (2015) 참조).
세포독성 단백질 "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[484] 면역글로불린-유형 결합 영역 α연충-창자-항원 및 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 함께 연결되어있고, 선택적으로 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 KDEL 군(SEQ ID NO: 62로 명시된 'KDEL')의 카르복시-말단 소포체 신호 모티프가 함께 링크된다. 예를 들어, 융합 단백질은 SLT-1A-FR::α연충-창자-항원 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A-FR::α연충-창자-항원 세포독성 단백질의 발현은 앞선 실시예에 기술된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성된다.
세포독성 세포-표적화 분자 "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[485] 이 실시예의 세포독성 세포-표적화 분자의 결합 특성은 정제된 재조합 표적 단백질을 사용하는 당업계에 알려진 분자 결합 분석법에 의해 측정되었다. 표적 단백질에 대한 "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR"의 KD는 약 1OO nM으로 측정된 반면, 이 분석에서는 음성제어 단백질(예: 정제된, 재조합, 인간 트랜스페린 수용체)에 대한 유의미한 결합이 없다.
[486] "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 단백질의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 상당하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
연충을 사용한 세포독성 단백질 "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR"의 독성 측정
[487] 연중에 대한 "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR"의 독성은 연충 모델(model helminthes)을 사용하여 측정된다(예: Iatsenko I et al., Toxins 2050-63 (2014) 참조). 상기 연충에 소킹(soaking) 또는 예를 들어 SLT-1A::α연충-창자-항원 융합 단백질을 발현하는 박테리아를 피딩(feeding)하는 것으로 정제된 "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR"을 투여할 수 있다.
[488] 또한, 연충을 갖고 있고/또는 연충과 관련된 질병을 보이는 실험실 동물에 "α연충-창자-항원과 링크된 SLT-1A-FR"을 투여하고, 예를 들어 연충 사멸, 무균 증가(increased sterility), 번식력 감소, 및 성장 억제와 같은 연충 및/또는 기생 연충으로 인한 관련 증상의 감소 또는 제거에 대해 모니터한다.
실시예 12. 감염원으로부터의 펩티드를 가진 인간, 주조직 적합성 복합체를 표적화하는 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자(αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR)
[489] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 시가 독소의 A 서브유닛(StxA)으로부터 유도된 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 특정 펩티드와 복합된(complexed with) 인간, 주조직 적합성 복합체(MHC)를 결합하는 면역글로불린-유형 결합 영역은 기술자에게 알려진 표준 기술을 사용하여 항체 및/또는 면역글로불린-유형 라이브러리 스크린(screened)으로 부터 얻거나 설계되었다(Tohidkia M et al., J Drug Target 20: 195-208 (2012); de Marco A, Crit Rev Biotechnol 33: 40-8 (2013); Wen F, Zhao H, Methods Mol Biol 1061: 245-64 (2013) 참조).
[490] 예를 들어, 말라리아에 감염된 인간 세포는 세포 표면에, 예를 들어 TLDEMRHFY(SEQ ID NO: 137) 펩티드와 복합된 HLA-A와 같은, P. falciparum 정단막 항원-1(AMA1)으로부터의 항원과 복합된 MHC 클래스 I 분자를 보일 수 있다(예: Lal A et al., Infect Immun 64: 1054-9 (1996); Sedegah M et al., Malar J 9: 241 (2010); Schwenk R et al., Malar J 12:376 (2013) 참조). 유사하게, 결핵에 감염된 인간 세포는 세포 표면에, 예를 들어 CFP10, PE/PPE, Rv0288, Rv1886c, Rv3875, and TB10.4와 같은, M. tuberculosis 인자로부터의 항원과 복합된 MHC 클래스 I 분자를 보일 수 있다(Axelsson-Robertson R et al., Immunology 129: 496-505 (2010); Axelsson-Robertson R et al., Clin Vaccine Immunol 18: 125-34 (2011); Wang M et al., Immunology 132: 482-91 (2011); Axelsson-Robertson R et al., PLoS One 8: e58309 (2013)).
세포독성 세포-표적화 분자 "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"의 구성, 생산, 및 정제
[491] 면역글로불린-유형 결합 영역 αMHC-펩티드 및 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 세포독성 세포-표적화 분자를 형성하기 위하여 함께 연결되어있다. 예를 들어, 융합 단백질은 SLT-1A-FR::αMHC-펩티드 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산되고, 상기 결합 영역은 M. tuberculosis 또는 P. falciparum으로부터의 항원성의 펩티드와 복합된 특정 인간 HLA 서브타입 MHC 분자를 결합한다. SLT-1A-FR::αMHC-펩티드 단백질 세포독성 분자의 발현은 앞선 실시예에 기술된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 달성된다. 말라리아 항원 또는 마이코박테리아 항원에 복합된 다른 HLA 유형에 특이적인 결합 영역은 인간 모집단의 더 나은 적용범위를 제공하기 위하여 설계되고 테스트되었다.
세포독성 세포-표적화 분자 "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"의 시험관 내 특성의 측정
[492] 감염된 인간 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 결합 특성은 당업계에 알려진 형광성-기반의 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 항원제공세포에 대한 "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"의 Bmax는 약 50,000-200,000 MFI에 0.01-1OO nM 범위 내의 KD인 반면, 이 분석에서는 음성제어 세포에 대한 유의미한 결합이 없다.
[493] "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR" 세포독성 분자의 리보솜 비활성화 능력은 앞선 실시예에 기술된 대로 무세포 시험관 내 단백질 번역에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 분자의 억제 효과는 상당하다. 이 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 측정
[494] "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"의 세포독성 특성은 앞선 실시예에 기술된 감염된 세포 및/또는 특정 MHC 분자-펩티드 복합체에 대해 양성인 세포를 보이는 항원을 사용한 통상의 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 또한, "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"의 선택적인 세포독성 특성은 동일한 통상의 세포-사멸 분석법으로 측정된다. 이 실시예의 세포독성 분자의 CD50은 세포주에 따라 MHC-펩티드+ 세포에 대해 약 0.01-100 nM이다. 세포독성 분자의 CD50은 세포 표면에 특이적으로 표적화된 MHC-펩티드를 보이는 세포와 비교해 세포 표면에 동일한 MHC-펩티드를 발현하지 않는 세포에 대해 약 10-10,000배 크다(세포 독성이 덜하다).
동물 모델을 사용한 세포독성 세포-표적화 분자 "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"의 체내 효과 측정
[495] 열원충(plasmodium) 또는 마이코박테이라 감염을 억제하기 위한 "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR" 사용은 말라리아 감염, 마이코박테리아, 종충 감염, 및 간 단계의(liver stage) 열원충 기생충 감염의 동물 모델에 "αMHC-펩티드와 링크된 SLT-1A-FR"을 투여하는 것으로 테스트된다. 이 유형의 MHC-펩티드 복합체-표적화된 치료법은, 예를 들어 무비증(asplenia), T-세포 결핍, 및/또는 HIV-감염 환자와 같은, 면역계가 손상된데다가(immuno-compromised), 마이코박테리아 또는 열원충에 감염된 환자에게 특히 용이하다.
실시예 13. 다양한 세포 유형을 표적화하는 프로테아제-절단 저항성의 시가 독소 작동체 영역 및 결합 영역을 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자
[496] 이 실시예에서는, 시가 독소 작동체 폴리펩티드 영역은 SLT-1A 및 StxA의 248-251, 또는 SLT-2A의 247-250에 자연적으로 발생하는 아미노산에 교란된 프로테아제 민감성 부위를 가진 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A), 시가 독소(StxA), 및/또는 시가-유사 독소 2의 A 서브유닛(SLT-2A)으로부터 유도된 프로테아제 저항성의 시가 독소 작동체 폴리펩티드다. 결합 영역은 표 5의 세로열 2가 명시한 세포외 표적 생체분자를 결합하는 표 5의 세로열 1로부터 선택된 분자의 면역글로불린 도메인으로부터 유도된다. 이 실시예의 모범적인 세포-표적화 분자는 당업계에 알려진 시약 및 기술을 사용해 카르복시-말단 KDEL-유형 신호 모티프 및/또는 검출 촉진제(들)로 선택적으로 생성된다. 이 실시예의 모범적인 세포독성 세포-표적화 분자는 전 실시예에 기술된 것과 같이 적절한 세포 외 표적 생체분자를 발현하는 세포를 사용하여 테스트된다. 이 실시예의 모범적인 세포-표적화 분자는, 예를 들어 표 5의 세로열 3에 명시된 질병, 증상, 및/또는 증상을 진단하고 치료하는데 사용될 수 있다.
결합영역의 원천 | 세포외 표적 | 적용 |
alemtuzumab | CD52 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포 관련 면역 장애 |
basiliximab | CD25 | 장기이식 거부 예방과 같은 T-세포 질환, 및 몇 B-세포 직계성 암 |
brentuximab | CD30 | 혈액암, B-세포 관련 면역 장애, 및 T-세포 관련 면역 장애 |
catumaxomab | EpCAM | 난소암, 복수 종양, 위암과 같은 각종 암 |
cetuximab | EGFR | 직장암 및 두경부암과 같은 각종 암 |
daclizumab | CD25 | 장기이식거부와 같은 B-세포 직계성 암 및 T-세포 질환 |
daratumumab | CD38 | 혈액암, B-세포 관련 면역 장애, 및 T-세포 관련 면역 장애 |
dinutuximab | 강글리오시드 GD2 | 유방암, 골수암, 및 신경모세포증과 같은 각종 암 |
efalizumab | LFA-1(CD11a) | 건선과 같은 자가면역질환 |
ertumaxomab | HER2/neu | 유방암 및 직장암과 같은 각종 암 및 종양 |
gemtuzemab | CD33 | 골수암 또는 면역 장애 |
ibritumomab | CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포 암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포 관련 면역 장애 |
ipilimumab | CD152 | 백혈병, 흑색종 같은T-세포 관련 질환 및 각종 암 |
muromonab | CD3 | 장기이식 거부 예방 |
natalizumab | 인테그린 α4 | 다중 경화증 및 크론병과 같은 자가면역질환 |
obinutuzumab | CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 |
ocaratuzumab | CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 |
ocrelizumab | CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 |
ofatumumab | CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 |
palivizumab | 호흡기 세포융합 바이러스의 F 단백질 | 호흡기 세포융합 바이러스 치료 |
panitumumab | EGFR | 직장암 및 두경부암과 같은 각종 암 |
pertuzumab | HER2/neu | 유방암 및 직장암과 같은 각종 암 및 종양 |
pro 140 | CCR5 | HIV 감염 및 T-세포 질환 |
ramucirumab | VEGFR2 | 고형종양과 같은 각종 암 및 암 관련 질환 |
rituximab | CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 |
tocilizumab 또는 atlizumab | IL-6 수용체 | 류마티스 관절염과 같은 자가면역질환 |
tositumomab | CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 |
trastuzumab | HER2/neu | 유방암 및 직장암과 같은 각종 암 및 종양 |
ublituximab | CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 |
vedolizumab | 인테그린 α4β7 | 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 자가면역질환 |
CD20 결합 항체 및 scFv(s) |
CD20 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 (예: Geng S et al., Cell Mol Immunol 3: 439-43 (2006); Olafesn T et al., Protein Eng Des Sel 23: 243-9 (2010) 참조) |
CD22 결합 scFv(s) |
CD22 | B-세포 암 또는 B-세포 관련 면역 장애(예: Kawas S et al., MAbs 3: 479-86 (2011) 참조) |
CD25 결합 scFv(s) |
CD25 | B-세포 혈통의 각종 암 및 T-세포 관련 면역 장애 (예: Muramatsu H et al., Cancer Lett 225: 225-36 (2005) 참조) |
CD30 결합 단일클론성 항체(들) | CD30 | B-세포 암 또는 B-세포/T-세포 관련 면역 장애 (예: Klimka A et al., Br J Cancer 83: 252-60 (2000) 참조) |
CD33 결합 단일클론성 항체(들) |
CD33 | 혈액암 또는 면역 장애 (예: Benedict C et al., J Immunol Methods 201: 223-31 (1997) 참조) |
CD38 결합 면역글로불린 도메인 | CD38 | 혈액암, B-세포 관련 면역 장애, 및 T-세포관련 면역 질환 (예: 미국 특허 8,153,765 참고) |
CD40 결합 scFv(s) |
CD40 | 각종 암 및 면역 장애 (예: Ellmark P et al., Immunology 106: 456-63 (2002) 참조) |
CD52 결합 단일클론성 항체(들) |
CD52 | 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포암, 및 자가면역질환과 같은 B-세포관련 면역 장애 (예: 미국 특허 U.S. 7,910,104 B2 참조) |
CD56 결합 단일클론성 항체(들) |
CD56 | 폐암, 메르켈세포 상피성 암, 골수종과 같은 각종 암 및 면역 장애 (예: Shin J et al., Hybridoma 18: 521-7 (1999) 참조) |
CD79 결합 단일클론성 항체(들) |
CD79 | B-세포 또는 B-세포 관련 면역 장애 (예: Zhang L et al., Ther Immunol 2: 191- 202 (1995) 참조) |
CD133 결합 단일클론성 항체 및 scFv(s) | CD133 | 각종 암, 혈액암, 및 면역 장애 (예: Bidlingmaier S et al., J Mol Med 86: 1025-32 (2008); Pavlon L et al., J Microsc 231: 374-83 (2008); Rappa G et al., Stem Cells 26: 3008-17 (2008); Swaminathan S et al., J Immunol Methods 361: 110-5 (2010); Wang J et al., Hybridoma 29: 241-9 (2010); Zhu X et al., Mol Cancer Ther 9: 2131-41 (2010); Xia J et al., Sci Rep 3: 3320 (2013) 참조) |
CD248 결합 scFv(s) |
CD248 | 맥관 형성 억제와 같은 각종 암 (예: Zhao A et al., J Immunol Methods 363: 221-32 (2011) 참조) |
EpCAM 결합 단일클론성 항체(들) |
EpCAM | 난소암, 복수종양, 위암과 같은 각종 암 (예: Schanzer J et al., J Immunother 29: 477-88 (2006) 참조) |
PSMA 결합 단일클론성 항체(들) |
PSMA | 전립선암 (예: Frigerio B et al., Eur J Cancer 49: 2223-32 (2013) 참조) |
Eph-B2 결합 단일클론성 항체(들) |
Eph-B2 | 직장암 및 전립선암과 같은 각종 암 (예: Abengozar M et al., Blood 119: 4565-76 (2012) 참조) |
엔도글린 결합 단일클론성 항체(들) |
Endoglin | 유방암 및 직장암과 같은 각종 암 (예: Volkel T et al., Biochim Biophys Res Acta 1663: 158-66 (2004) 참조) |
FAP 결합 단일클론성 항체(들) |
FAP | 육종 및 골암과 같은 각종 암 (예: Zhang J et al., FASEB J 27: 581-9 (2013)) |
CEA 결합 항체(들) 및 scFv(s) |
CEA | 위암, 췌장암, 폐암 및 유방암과 같은 각종 암 (예: Neumaier M et al., Cancer Res 50: 2128-34 (1990); Pavoni E et al., BMC Cancer 6: 4 (2006); Yazaki P et al., Nucl Med Biol 35: 151-8 (2008); Zhao J et al., Oncol Res 17: 217-22 (2008) 참조) |
CD24 결합 단일클론 항체(들) |
CD24 | 방광암과 같은 각종 암 (예: Kristiansen G et al., Lab Invest 90: 1102-16 (2010) 참조) |
LewisY 항원 결합 scFv(s) |
LewisY 항원 | 자궁암과 같은 각종 암 (예: Power B et al., Protein Sci 12: 734-47 (2003); monoclonal antibody BR96 Feridani A et al., Cytometry 71: 361-70 (2007) 참조) |
adalimumab | TNF-α | 류마티스관절염, 크론병, 판형건선, 건선 류마티스, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염, 신생아 용혈성 질환과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
afelimomab | TNF-α | 각종 암 및 면역 장애 |
ald518 | IL-6 | 류마티스 관절염과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
anrukinzumab 또는 -ima638 | IL-13 | 각종 암 및 면역 장애 |
briakinumab | IL-12, IL-23 | 건선, 류마티스관절염, 염증성 장 질환, 다중 경화증과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
brodalumab | IL-17 | 염증성 질환과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
canakinumab | IL-1 | 염증성 질환과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
certolizumab | TNF-α | 크론병과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
fezakinumab | IL-22 | 류마티스 관절염, 건선과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
ganitumab | IGF-I | 각종 암 |
golimumab | TNF-α | 류마티스 관절염, 건선성 관절염 강직성 척추염과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
infliximab | TNF-α | 류마티스 관절염, 강직성 척수염, 건선성 관절염, 건선, 크론병 고니 양성 대장염 같은 각종 암 및 면역 장애 |
ixekizumab | IL-17A | 자가면역질환과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
mepolizumab | IL-5 | B-세포 암과 같은 각종 면역 장애 및 암 |
nerelimomab | TNF-α | 각종 암 및 면역 장애 |
olokizumab | IL6 | 각종 암 및 면역 장애 |
ozoralizumab | TNF-α | 염증 |
perakizumab | IL17A | 관절염과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
placulumab | 인간 TNF | 각종 면역 장애 및 암 |
sarilumab | IL6 | 류마티스 관절염, 각직성 척수염과 같은 각종암 및 면역 장애 |
siltuximab | IL-6 | 각종 암 및 면역 장애 |
sirukumab | IL-6 | 류마티스 관절염과 같은 각종암 및 면역 장애 |
tabalumab | BAFF | B-세포 암 |
ticilimumab 또는 tremelimumab | CTLA-4 | 각종 암 |
tildrakizumab | IL23 | 면역 중재 염증 질환 |
tnx-650 | IL-13 | B-세포 암과 같은 각종암 및 면역 장애 |
tocilizumab 또는 atlizumab | IL-6 수용체 | 류마티스 관절염과 같은 각종 암과 면역 장애 |
ustekinumab | IL-12,IL-23 | 다중 경화증, 건선, 건선성 관절염과 같은 각종 암 및 면역 장애 |
각종 성장인자: VEGF, EGF1, EGF2, FGF | VEGFR,EGFR,FGFR | 유방암, 대장암과 같은 각종 암 및 혈관화 억제 |
각종 시토카인: IL-2, IL-6, IL-23, CCL2, BAFFs, TNFs, RANKL | IL-2R, IL-6R, IL-23R, CD80/CD86, TNFRSF13/TNFRSF17, TNFR | 각종 면역 장애 및 암 |
환자샘플로부터 식별된 광범위 중화항체 |
인플루엔자 표면항원 (예: 적혈구응집소 및 바탕질단백질 2) | 바이러스 감염 (예: Prabakaran et al., Front Microbiol 3: 277 (2012) 참조) |
환자샘플로부터 식별된 광범위 중화항체 |
코로나바이러스 표면항원 | 바이러스 감염 (예: Prabakaran et al., Front Microbiol 3: 277 (2012) 참조) |
각종 항체 | 필로바이러스 표면항원 (예: VP35, VP40, 및 당단백질) | 바이러스 감염 (예: Olinger G et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109: 18030-5 (2012); Pettitt J et al., Sci Transl Med 5: 199ra113 (2013); Stahelin R, Expert Opin Ther Targets 18: 115-20 (2014); Becquart P et al., PLoS One 9: e96360 (2014); Stahelin R, Fron Microbiol 5: 300 (2014); Tran E et al., J Virol 88: 10958-62 (2014); Murin C et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 111: 17182-7 (2014) 참조) |
환자샘플로부터 식별된 광범위 중화항체 |
헤니파바이러스 표면항원 | 바이러스 감염 (예: Prabakaran et al., Front Microbiol 3: 277 (2012) 참조) |
광범위 중화항체 및 scFv를 포함하는 각종 항체 |
HIV 표면 항원 (예: 바탕질단백질 Map17) | 바이러스 감염 (예: Kitidee K et al., BMC Biotechnol 10: 80 (2010); Yu L, Guan Y, Front Immunol 5: 250 (2014)) |
퓨린-절단 저항성의 시가 독소 A 서브유닛 유래 폴리펩티드의 세포-표적화를 위한 다양한 결합 영역
[497] 본 발명의 몇몇 구체예가 실례로서 기술되었지만, 본 발명은 다양한 변경, 변형 및 조정되어 실행될 수 있고, 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 청구범위를 넘지 않는 한도 내에서 본 발명이 속한 기술 분야의 전문가에 의한 수많은 균등체 또는 선택적인 해결책의 사용으로 실행될 수 있다.
[498] 모든 공개된 간행물, 특허, 및 특허 출원은 만약 개인적인 공개, 특허 또는 특허 출원이 특별하게 개인적으로 그것의 전체에서 선행기술로 기술될 수 있다면 동일한 범위에 대하여 선행기술로 여기에서 기술된다. 국제 특허 출원 공개 WO 제2014164680 A1호 및 WO 제2014164693 A2호는 각각 그것의 전체로 선행기술로서 본 발명에 기술되었다. 미국 특허 출원 2007/0298434 A1, 2009/0156417 A1, 및2013/0196928 A1은 각각 그것 전체로 선행기술로서 본 발명에 기술되었다. 특허 출원 US62/010918은 그것 전체로 선행기술로서 본 발명에 기술되었다. 국제 PCT 특허 출원 번호 WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/120058, WO 2015/138435, 및 WO 2015/138452는 각각 전체로서 선행기술로 참증되었다. 본 발명에서 인용된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 대해서 GenBank(National Center for Biotechnology Information, U.S.)로부터의 모든 전자적으로 허용가능한 생물학적 서열 정보의 완벽한 개재가 각각 참증자료로서 본문에 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> MOLECULAR TEMPLATES, INC.
<120> PROTEASE-CLEAVAGE RESISTANT, SHIGA TOXIN A SUBUNIT EFFECTOR
POLYPEPTIDES AND CELL-TARGETED MOLECULES COMPRISING THE SAME
<130> 14-07PCT
<140> PCT/US2015/035179
<141> 2015-06-10
<150> PCT/US2015/012970
<151> 2015-01-26
<150> 62/010,918
<151> 2014-06-11
<160> 137
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 293
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp Asn
35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe
50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly
65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser
85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser
100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met
115 120 125
Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser
130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg
145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg
165 170 175
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reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 81
Lys Arg Glu Leu
1
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 82
Lys Ser Glu Leu
1
<210> 83
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 83
Lys Val Glu Leu
1
<210> 84
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 84
Lys Trp Glu Leu
1
<210> 85
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 85
Lys Tyr Glu Leu
1
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 86
Lys Glu Asp Leu
1
<210> 87
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 87
Lys Ile Glu Leu
1
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 88
Asp Lys Glu Leu
1
<210> 89
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 89
Phe Asp Glu Leu
1
<210> 90
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 90
Lys Asp Glu Phe
1
<210> 91
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 91
Lys Lys Glu Leu
1
<210> 92
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 92
His Ala Asp Leu
1
<210> 93
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 93
His Ala Glu Leu
1
<210> 94
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 94
His Ile Glu Leu
1
<210> 95
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 95
His Asn Glu Leu
1
<210> 96
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 96
His Thr Glu Leu
1
<210> 97
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 97
Lys Thr Glu Leu
1
<210> 98
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 98
His Val Glu Leu
1
<210> 99
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 99
Asn Asp Glu Leu
1
<210> 100
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 100
Gln Asp Glu Leu
1
<210> 101
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 101
Arg Glu Asp Leu
1
<210> 102
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 102
Arg Asn Glu Leu
1
<210> 103
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 103
Arg Thr Asp Leu
1
<210> 104
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 104
Arg Thr Glu Leu
1
<210> 105
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 105
Ser Asp Glu Leu
1
<210> 106
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 106
Thr Asp Glu Leu
1
<210> 107
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 107
Ser Lys Glu Leu
1
<210> 108
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 108
Arg Val Lys Arg
1
<210> 109
<211> 6
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 109
Ala Leu Glu Asp Glu Leu
1 5
<210> 110
<211> 6
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 110
His Ala Glu Asp Glu Leu
1 5
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 111
His Leu Glu Asp Glu Leu
1 5
<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 112
Lys Leu Glu Asp Glu Leu
1 5
<210> 113
<211> 6
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 113
Ile Arg Ser Asp Glu Leu
1 5
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 114
Glu Arg Ser Thr Glu Leu
1 5
<210> 115
<211> 6
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Endoplasmic
reticulum retention/retrieval signal motif peptide"
<400> 115
Arg Pro Ser Thr Glu Leu
1 5
<210> 116
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 116
Ala Met Gly Arg Ser Gly Gly Gly Cys Ala Gly Asn Arg Val Gly Ser
1 5 10 15
Ser Leu Ser Cys Gly Gly Leu Asn Leu Gln Ala Met
20 25
<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 117
Ala Ser Gly Gly Pro Glu
1 5
<210> 118
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(6)
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<223> /replace=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(54)
<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(52)
<223> /note="This region may encompass 1 to 10 'Gly Gly Gly
Gly Ser' repeating units, wherein some positions may
be absent"
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 118
Ala Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Ala Met
50
<210> 119
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(6)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(13)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(20)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (23)..(27)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (30)..(34)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (37)..(41)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(48)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(55)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (58)..(62)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (65)..(69)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (72)..(76)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (79)..(83)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (86)..(90)
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<220>
<221> VARIANT
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<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (100)..(104)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (107)..(111)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (114)..(118)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (121)..(125)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (128)..(132)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (135)..(139)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (142)..(146)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (149)..(153)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (156)..(160)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (163)..(167)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (170)..(174)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (177)..(181)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (184)..(188)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (191)..(195)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (198)..(202)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (205)..(209)
<223> /replace=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(210)
<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(210)
<223> /note="This sequence may encompass 1 to 30 'Gly Gly Gly
Gly Gly Gly Ser' repeating units, wherein some positions
may be absent"
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 119
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser
210
<210> 120
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(6)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(13)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(20)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (23)..(27)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (30)..(34)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (37)..(41)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(48)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(55)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (58)..(62)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (65)..(69)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (72)..(76)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (79)..(83)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (86)..(90)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (93)..(97)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (100)..(104)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (107)..(111)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (114)..(118)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (121)..(125)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (128)..(132)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (135)..(139)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (142)..(146)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (149)..(153)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (156)..(160)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (163)..(167)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (170)..(174)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (177)..(181)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (184)..(188)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (191)..(195)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (198)..(202)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (205)..(209)
<223> /replace=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(210)
<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(210)
<223> /note="This sequence may encompass 1 to 30 'Ser Ser Ser
Ser Ser Ser Gly' repeating units, wherein some positions
may be absent"
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 120
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser
35 40 45
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
85 90 95
Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155 160
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser
165 170 175
Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
195 200 205
Ser Gly
210
<210> 121
<211> 150
<212> PRT
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polypeptide"
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<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
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Gly Ser' repeating units, wherein some positions
may be absent"
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<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 121
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150
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<211> 30
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polypeptide"
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preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
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wherein some positions may be absent"
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<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 122
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 123
<211> 12
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Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
1 5 10
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Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly
1 5 10
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
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Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
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<211> 18
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Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 127
<211> 14
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<400> 127
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe
1 5 10
<210> 128
<211> 5
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<400> 128
Ser Arg Ser Ser Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Ser Gly Ser Ser Cys
1 5
<210> 130
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 130
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 131
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide"
<400> 131
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
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<220>
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peptide"
<400> 132
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 133
<211> 8
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peptide"
<400> 133
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 134
<211> 7
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peptide"
<400> 134
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 135
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 135
Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 136
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide"
<400> 136
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<400> 137
Thr Leu Asp Glu Met Arg His Phe Tyr
1 5
Claims (68)
- i) 한 세포의 표면에 물리적으로 결합된 하나의 세포외 표적 생체분자와 특이적으로 결합하는 결합 영역으로, 단쇄 가변성 단편 또는 낙타류 VHH 단편을 포함하는 결합 영역; 및
ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 251에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 하나의 아미노산 서열을 포함하는 시가 독소 작동체 폴리펩티드;
를 포함하는 세포독성 세포-표적화 분자로서,
상기 아미노산 서열은 돌연변이 R248A 및 R251A를 특징으로 하는 붕괴된 퓨린-절단 모티프를 갖고, 그리고
상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 위치 75에 상응하는 아미노산 잔기에서 아스파르긴, SEQ ID NO: 1의 위치 77에 상응하는 아미노산 잔기에서 티로신, SEQ ID NO: 1의 위치 114에 상응하는 아미노산 잔기에서 티로신, SEQ ID NO: 1의 위치 167에 상응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산염, SEQ ID NO: 1의 위치 170에 상응하는 아미노산 잔기에서 아르기닌, SEQ ID NO: 1의 위치 176에 상응하는 아미노산 잔기에서 아르기닌, 및 SEQ ID NO: 1의 위치 203에 상응하는 아미노산 잔기에서 트립토판을 포함하고,
상기 결합 영역은 상기 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 카르복시 말단에 융합되어 단일의 연속 폴리펩티드를 형성하는,
것을 특징으로 하는 세포독성 세포-표적화 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 결합 영역은 CD20, CD22, CD40, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, 전립선-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen), 크립토(Cripto), 엔도글린/CD105, 섬유아세포 활성화 단백질, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/SLAMF7, CD33, CD52, CD133, gpA33, 뮤신, TAG-72, 탄산 탈수효소 IX, 엽산 구속 단백질, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2, 강글리오시드 Lewis-Y2, VEGFR, Alpha Vbeta3, Alpha5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, 테나신, CD64, 메소텔린, BRCA1, MART-1/MelanA, gp100, 티로시나제, 인간 티로시나제-관련 단백질 1, 인간 티로시나제-관련 단백질 2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, 베타-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, 암태아성 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원, 인간 아스파르틸(아스파라긴일) 베타-수산화효소, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, 티로시나제 관련 항원, HPV-E7, 엡스타인-바 바이러스 항원, Bcr-Abl, 알파-태아단백질 항원, 17-A1, 방광 종양 항원, CD38, CD15, CD23, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, FceRIa, 갈렉틴-9, mrp-14, Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD68, CD80, CD86, CD115, F4/80, ILT-3, 갈렉틴-3, CD11a-c, GITRL, MHC 클래스 II, CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c, CD117, 및 CTLA-4로부터 선택된 세포외 표적 생체분자와 결합하는 것을 특징으로 하는 세포독성 세포-표적화 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 세포독성 세포-표적화 분자는 프로테아제 민감성 링커, 환경 산화환원 전위 민감성 링커, pH 민감성 링커, 산 절단성 링커, 광 절단성 링커, 및 열 민감성 링커로부터 선택된 링커 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포독성 세포-표적화 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 세포독성 세포-표적화 분자는 아미노산 서열 (GxS)n을 갖는 링커 펩티드를 포함하고, 상기 x는 1 내지 6이고 n은 1 내지 30인 것을 특징으로 하는 세포독성 세포-표적화 분자.
- 제4항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 아미노산 서열 GGGGS를 갖는 것을 특징으로 하는 세포독성 세포-표적화 분자.
- 제4항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 아미노산 서열 EFPKPSTPPGSSGGAP를 갖는 것을 특징으로 하는 세포독성 세포-표적화 분자.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포독성 세포-표적화 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 환자의 질병, 장애, 또는 증상의 치료를 위한 약학적 조성물로서,
상기 질병, 장애, 또는 증상은 암, 종양, 면역 장애, 및 미생물 감염으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포독성 세포-표적화 분자를 암호화하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보체.
- 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제9항의 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
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IL268443B2 (en) | 2018-04-17 | 2024-07-01 | Molecular Templates Inc | HER2-targeted molecules containing Shiga toxin subunit A scaffolds, without vaccination |
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WO2020154475A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains |
CA3127660A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors |
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US11918649B2 (en) | 2019-09-18 | 2024-03-05 | Molecular Templates, Inc. | PD-L1-binding molecules comprising Shiga toxin a subunit scaffolds |
JP2022548078A (ja) * | 2019-09-18 | 2022-11-16 | モレキュラー テンプレーツ,インク. | 志賀毒素aサブユニット足場を含むpd-l1結合分子 |
WO2021102445A1 (en) | 2019-11-24 | 2021-05-27 | Molecular Templates, Inc. | Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents |
EP4107187A4 (en) | 2020-02-21 | 2024-07-03 | Pandion Operations Inc | TISSUE-TARGETED IMMUNOTOLERANCE WITH A CD39 EFFECTOR |
AU2021268885A1 (en) * | 2020-05-06 | 2022-10-27 | Navicure Biopharmaceuticals Limited | Fusion proteins for immunotherapy against cancer and infectious diseases |
EP4308242A1 (en) | 2021-03-17 | 2024-01-24 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002521019A (ja) | 1998-07-22 | 2002-07-16 | オスプレイ・ファルマシューティカルズ・リミテッド | 二次的組織損傷ならびにその他の炎症症状および疾患を治療する方法および組成物 |
WO2008080218A1 (en) | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Osprey Pharmaceuticals Usa, Inc. | Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins and uses thereof |
WO2013080147A2 (en) | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer fusion protein |
Family Cites Families (91)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5080898A (en) | 1982-05-12 | 1992-01-14 | The University Hospital | Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand |
US4894443A (en) | 1984-02-08 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Toxin conjugates |
US5668255A (en) | 1984-06-07 | 1997-09-16 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
US6022950A (en) | 1984-06-07 | 2000-02-08 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
US5091178A (en) | 1986-02-21 | 1992-02-25 | Oncogen | Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5135736A (en) | 1988-08-15 | 1992-08-04 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
JPH05502880A (ja) * | 1989-12-22 | 1993-05-20 | セラジェン・インコーポレーテッド | トランスロケーション領域および細胞結合領域を有するハイブリッド分子 |
US5635384A (en) | 1990-06-11 | 1997-06-03 | Dowelanco | Ribosome-inactivating proteins, inactive precursor forms thereof, a process for making and a method of using |
US6146850A (en) | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
WO1994026910A1 (en) | 1993-05-12 | 1994-11-24 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising gelonin and an antibody |
US5621083A (en) | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
US5612474A (en) | 1994-06-30 | 1997-03-18 | Eli Lilly And Company | Acid labile immunoconjugate intermediates |
WO1996006641A1 (en) | 1994-08-29 | 1996-03-07 | Prizm Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents |
WO1996030043A1 (en) | 1995-03-24 | 1996-10-03 | Ophidian Pharmaceuticals | Treatment for verotoxin-producing escherichia coli |
US5667786A (en) | 1995-06-07 | 1997-09-16 | Novavax, Inc. | Method for treating tumors with a toxin |
CA2265900C (en) | 1996-09-09 | 2007-07-31 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis |
AU4184597A (en) | 1996-09-10 | 1998-04-02 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Histidine-tagged shiga toxins, toxoids, and protein fusions with such toxins and toxoids, methods for the purification and preparation thereof |
US6306393B1 (en) | 1997-03-24 | 2001-10-23 | Immunomedics, Inc. | Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies |
CA2222993A1 (en) | 1998-02-04 | 1999-08-04 | The Ontario Cancer Institute | A method for using a ribosome-inactivating protein complex as a structural template and a molecular search engine in the design, construction and screening of combinatorial protein libraries |
CA2329940A1 (en) | 1998-06-05 | 1999-12-09 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Use of genetically engineered antibodies to cd38 to treat multiple myeloma |
US7157418B1 (en) | 1998-07-22 | 2007-01-02 | Osprey Pharmaceuticals, Ltd. | Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders |
AU2004202331A1 (en) * | 1998-07-22 | 2004-06-24 | Osprey Pharmaceuticals Limited | Methods and Compositions for Treating Secondary Tissue Damage and Other Inflammatory Conditions and Disorders |
US6770456B1 (en) | 1998-07-29 | 2004-08-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Endogenous retrovirus tumor associated nucleic acids and antigens |
US8663692B1 (en) | 1999-05-07 | 2014-03-04 | Pharmasol Gmbh | Lipid particles on the basis of mixtures of liquid and solid lipids and method for producing same |
US7527787B2 (en) | 2005-10-19 | 2009-05-05 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies |
US6492498B1 (en) | 1999-11-15 | 2002-12-10 | Regents Of The University Of Minnesota | Multimeric immunotoxins |
US20010031485A1 (en) | 2000-03-22 | 2001-10-18 | Sibtech, Inc. | Recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor fragments |
US7267973B2 (en) | 2000-03-22 | 2007-09-11 | Sibtech, Inc. | Nucleic acids encoding recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor |
EP1272647B1 (en) | 2000-04-11 | 2014-11-12 | Genentech, Inc. | Multivalent antibodies and uses therefor |
US20050163807A1 (en) | 2002-02-04 | 2005-07-28 | Xiaoyan Liu | Anticancer agents using vero toxin variants |
ATE292144T1 (de) * | 2002-08-02 | 2005-04-15 | Inst Curie | Shiga-toxin-untereinheit b als vektor zur diagnose von tumoren und zur arzneimittelverabreichung an gb3-exprimierenden tumoren |
EP1572744B1 (en) | 2002-12-16 | 2010-06-09 | Genentech, Inc. | Immunoglobulin variants and uses thereof |
WO2004058158A2 (en) | 2002-12-20 | 2004-07-15 | The Johns Hopkins University | Treatment of metastatic cancer with the b-subunit of shiga toxin |
WO2005000902A1 (en) | 2003-06-30 | 2005-01-06 | Mu-Hyeon Choe | The dimer of chimeric recombinant binding domain-functional group fusion formed via disulfide-bond-bridge and the processes for producing the same |
US8147832B2 (en) | 2003-08-14 | 2012-04-03 | Merck Patent Gmbh | CD20-binding polypeptide compositions and methods |
EP1687016A4 (en) | 2003-11-25 | 2009-07-29 | Anjin Corp | GENETIC VARIANT OF DIPHTHERIC TOXIN |
JP4813364B2 (ja) | 2003-11-25 | 2011-11-09 | アメリカ合衆国 | 突然変異型抗cd22抗体および免疫複合体 |
CA2559536A1 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-06 | Jean Gariepy | Library of toxin mutants, and methods of using same |
US7829673B2 (en) | 2005-03-23 | 2010-11-09 | Genmab A/S | Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma |
US7771955B2 (en) | 2005-06-09 | 2010-08-10 | University Of Maryland | Affinity membrane for capture of a target biomolecule and formation thereof by site-directed immobilization of a capture biomolecule |
CN104356236B (zh) | 2005-07-01 | 2020-07-03 | E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 | 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体 |
FI20055417A0 (fi) | 2005-07-20 | 2005-07-20 | Glykos Finland Oy | Syöpäpesifiset glykaanit ja niiden käyttö |
EP1919505A2 (en) | 2005-07-25 | 2008-05-14 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Single dose use of cd20-specific binding molecules |
CA2619048A1 (en) * | 2005-08-15 | 2007-02-22 | The Regents Of The University Of California | Vegf-activated fas ligands |
EP1945660B1 (en) | 2005-09-26 | 2014-05-07 | Molecular Templates, Inc. | Library from toxin mutants, and methods of using same |
GB0524788D0 (en) | 2005-12-05 | 2006-01-11 | Affibody Ab | Polypeptides |
AU2006329208B2 (en) | 2005-12-23 | 2012-03-08 | Viventia Bio Inc. | Methods for generating and screening fusion protein libraries and uses thereof |
CA2642451C (en) | 2006-02-16 | 2016-12-20 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Shiga toxoid chimeric proteins |
US8252897B2 (en) | 2007-06-21 | 2012-08-28 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified toxins |
AU2008282729B2 (en) | 2007-08-01 | 2015-07-16 | Scott & White Healthcare | A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use |
WO2009032954A1 (en) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Deletions in domain ii of pseudomonas exotoxin a that reduce non-specific toxicity |
EP2215247B1 (en) | 2007-11-13 | 2014-09-24 | The Scripps Research Institute | Production of cytotoxic antibody-toxin fusion in eukaryotic algae |
WO2009068630A1 (en) | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Ablynx N.V. | Immunoglobulin constructs |
US8315343B2 (en) | 2007-12-17 | 2012-11-20 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) | Multi-antenna receiver interference cancellation method and apparatus |
EP2268297A4 (en) | 2008-02-29 | 2011-11-16 | Angelica Therapeutics Inc | MODIFIED TOXINS |
KR20110033233A (ko) | 2008-07-21 | 2011-03-30 | 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 | 개선된 치료 특성을 갖는 항체의 구조 변이체 |
WO2010033229A2 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Calmune Corporation | Methods and vectors for display of molecules and displayed molecules and collections |
ES2614803T3 (es) * | 2009-01-23 | 2017-06-02 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Métodos y composiciones basadas en proteína tipo 2 de la toxina Shiga |
KR20110139292A (ko) | 2009-04-20 | 2011-12-28 | 화이자 인코포레이티드 | 단백질 글리코실화의 제어 및 그와 관련된 조성물 및 방법 |
WO2011009624A1 (en) | 2009-07-22 | 2011-01-27 | Cenix Bioscience Gmbh | Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes |
EP2371864A1 (en) | 2010-03-23 | 2011-10-05 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
CN107253992B (zh) | 2010-05-27 | 2022-03-11 | 根马布股份公司 | 针对her2的单克隆抗体 |
GB201013989D0 (en) | 2010-08-20 | 2010-10-06 | Univ Southampton | Biological materials and methods of using the same |
PL219845B1 (pl) | 2011-01-05 | 2015-07-31 | Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością | Przeciwnowotworowe białko fuzyjne |
EP2476441A1 (en) * | 2011-01-13 | 2012-07-18 | Universitat Autònoma De Barcelona | Methods and reagents for efficient and targeted delivery of therapeutic molecules to CXCR4 cells |
JP2014505064A (ja) | 2011-01-26 | 2014-02-27 | セニックス バイオサイエンス ゲーエムベーハー | 自然に存在する細胞内輸送経路を介して化合物を送達するための送達システム及びコンジュゲート |
US9540433B2 (en) * | 2011-02-01 | 2017-01-10 | Genmab A/S | Human antibodies and antibody-drug conjugates against CD74 |
US8895006B2 (en) | 2011-03-04 | 2014-11-25 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Ricin ribosome binding protein compositions and methods of use thereof |
PE20141454A1 (es) | 2011-05-06 | 2014-10-23 | Us Gov Health & Human Serv | Inmunotoxina recombinante dirigida a la mesotelina |
WO2013126690A1 (en) | 2012-02-23 | 2013-08-29 | President And Fellows Of Harvard College | Modified microbial toxin receptor for delivering agents into cells |
ES2808726T3 (es) | 2013-03-12 | 2021-03-01 | Molecular Templates Inc | Inmunotoxinas de unión a CD20 para inducir la internalización celular y procedimientos que usan las mismas |
GB2519786A (en) | 2013-10-30 | 2015-05-06 | Sergej Michailovic Kiprijanov | Multivalent antigen-binding protein molecules |
US20210138076A2 (en) | 2014-01-27 | 2021-05-13 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes |
US20160177284A1 (en) | 2014-01-27 | 2016-06-23 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeted molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal shiga toxin a subunit effector regions |
IL285403B2 (en) | 2014-01-27 | 2023-10-01 | Molecular Templates Inc | Polypeptides that remove an epitope for MHC group I |
WO2015120058A2 (en) | 2014-02-05 | 2015-08-13 | Molecular Templates, Inc. | Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity |
US11142584B2 (en) | 2014-03-11 | 2021-10-12 | Molecular Templates, Inc. | CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same |
CN106604934A (zh) | 2014-06-11 | 2017-04-26 | 分子模板公司 | 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子 |
JP2017525385A (ja) | 2014-06-18 | 2017-09-07 | ケモテラペウティシェス フォルシュングインスティトゥート ゲオルグ−シュパイヤー−ハウス | 細胞治療物質としてのcar発現nk−92細胞 |
CN105713087B (zh) | 2014-11-12 | 2020-05-08 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 人***瘤病毒58型单克隆抗体及其应用 |
JP6444486B2 (ja) | 2015-02-05 | 2018-12-26 | モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. | 志賀毒素aサブユニットエフェクター領域を含む多価cd20結合分子及びそれらの強化組成物 |
DK3265575T3 (da) | 2015-03-04 | 2021-05-31 | Igm Biosciences Inc | Cd20-bindende molekyler og anvendelser deraf |
CN113381994B (zh) | 2015-04-07 | 2023-05-02 | 安博科技有限公司 | 在云端的多边界防火墙 |
MX2017015493A (es) | 2015-05-30 | 2018-02-09 | Molecular Templates Inc | Andamiajes de la subunidad a de la toxina shiga desinmunizados y moleculas con direccion a las celulas que los comprenden. |
JP6884133B2 (ja) | 2015-07-26 | 2021-06-09 | モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. | 志賀毒素aサブユニットエフェクター及びcd8+t細胞エピトープを含む細胞標的化分子 |
WO2017189959A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
KR102543323B1 (ko) | 2016-10-30 | 2023-06-14 | 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. | 항-pd-l1 항체 및 변이체 |
IL293710B1 (en) | 2016-12-07 | 2024-06-01 | Molecular Templates Inc | Shiga toxin A subunit activator polypeptides, Shiga toxin activator scaffolds and cell-targeting molecules for site-specific conjugation |
WO2018124642A2 (ko) | 2016-12-26 | 2018-07-05 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 치수줄기세포의 상아 모전구세포로의 분화용 조성물 및 상아모전구세포 표면에 특이적으로 결합하는 IgG 또는 IgM 타입 단일 클론 항체 |
US20200024312A1 (en) | 2017-01-25 | 2020-01-23 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes |
-
2015
- 2015-06-10 CN CN201580040778.8A patent/CN106604934A/zh active Pending
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2016
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2019
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2020
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- 2022-03-29 JP JP2022052815A patent/JP2022088518A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002521019A (ja) | 1998-07-22 | 2002-07-16 | オスプレイ・ファルマシューティカルズ・リミテッド | 二次的組織損傷ならびにその他の炎症症状および疾患を治療する方法および組成物 |
WO2008080218A1 (en) | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Osprey Pharmaceuticals Usa, Inc. | Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins and uses thereof |
WO2013080147A2 (en) | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer fusion protein |
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---|---|---|
AU2020260425B2 (en) | Protease-cleavage resistant, Shiga toxin A Subunit effector polypeptides and cell-targeted molecules comprising the same | |
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KR20220011792A (ko) | 포유류에 적용하기 위한 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 작동체 폴리펩티드 |
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