KR102482119B1 - 산국추출물 및 그의 발효물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산국추출물 및 산국발효물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 천연물질을 유효성분으로 하여 부작용이 적을 뿐 아니라, 최적의 발효에 따라 피부재생능력 및 콜라겐 합성능력이 우수하여 항노화 효과가 뛰어나고, 모유두 세포 증식능 및 IGF, VEGF의 발현량을 증가시켜 육모에 우수한 효능을 갖는다.

Description

산국추출물 및 그의 발효물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물{The cosmetic composition containing Chrysanthemum boreale extract and its fermentation product}

본 발명은 산국추출물 및 발효물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 상기 성분을 활용하여 우수한 항노화 효과 및 육모 효능을 갖도록 한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 천연물질을 유효성분으로 하여 부작용이 적을 뿐 아니라, 최적의 발효에 따라 피부재생능력 및 콜라겐 합성능력이 우수하여 항노화 효과가 뛰어나고, 모유두 세포 증식능 및 IGF, VEGF의 발현량을 증가시켜 육모에 우수한 효능을 갖는다.

산국(Chrysanthemum boreale)은 들국화의 한 종류로서 개국화라고도 한다. 산지에서 자란다. 높이 약 1m이다. 뿌리줄기는 길게 벋으며 줄기는 모여나고 곧추선다. 흰 털이 나며 가지가 많이 갈라진다. 뿌리에 달린 잎은 꽃이 필 때 마른다. 줄기에 달린 잎은 어긋나고 긴 타원형의 달걀 모양이며 길이 5∼7cm, 너비 4∼7cm이다. 깃꼴로 깊게 갈라지고 가장자리에 날카로운 톱니가 있다. 잎자루는 길이 1∼2cm이다. 꽃은 9∼10월에 노란색으로 피는데, 두화(頭花)는 지름 1.5cm 정도로서 가지와 줄기 끝에 산형(傘形) 비슷하게 달린다. 총포는 길이 약 4mm이고, 포조각은 3∼4줄로 늘어서며 바깥조각은 줄 모양이거나 좁은 긴 타원 모양이다. 화관은 통 모양이며 끝이 5갈래로 갈라진다. 열매는 수과(瘦果)로서 10∼11월에 익으며 길이 1mm 정도이다. 꽃은 진정·해독·소종 등의 효능이 있어 두통과 어지럼증에 사용한다. 관상용으로 심으며 어린순은 나물로 먹는다. 한국, 중국 북부, 일본에 분포한다.

피부노화는 크게 두 종류로 나눌 수 있다. 첫 번째는 내인성 노화(Intrinsic Aging)로 세월이 흘러감에 따라 피할 수 없는 노화 현상을 말한다. 두 번째는 광노화(Photoaging)로서 오랫동안 햇빛에 노출된 얼굴, 손등, 목뒤 등의 피부에서 관찰되는 노화현상을 말하는 것으로 내인성 노화 현상과 자외선에 의한 영향이 합쳐진 결과로 발생한다.

햇빛은 생명을 싹트게 만드는 역할을 하고 인간에게도 생명을 유지하는 데 필수 불가결한 것이며 식물과 동물에게 에너지를 공급하고 우리 피부에서도 Vit-D 합성을 유도하며, 건선이나 백반증 치료에 이용되기도 하는 등 많은 유익한 역할을 하지만, 반복적으로 강한 빛에 노출하게 되면 피부의 노화를 유발하게 된다. 그렇기 때문에 광노화 현상을 예방하기 위해서는 자외선 노출을 피하는 것이 최선이다. 이에 반해 내인성 노화는 햇빛에 노출되지 않은 피부에서 주로 관찰되며 나이가 들어가면서 노화에 의해 발생하기 때문에 노화 방지를 위한 지속적인 케어가 필요하며, 혈관이나 호르몬 등 다양한 원인이 존재하기 때문에 운동, 스트레스 케어, 식습관, 환경 개선 등 일반적인 노화현상을 줄이기 위한 방법과 동일한 방법으로 예방할 수 있다.

내인성 노화의 임상적 특징은 광노화에 비해 잔주름이 많고, 광노화에 비해 피부 색소의 과색소화나 색소가 한 곳으로 집중해서 발생하는 색소 이상의 증상들은 거의 발생하지 않고 오히려 색소가 적어서 피부가 창백한 경우가 많다.

광노화의 임상적 특징은 내인성 노화에 비하여 심하고 일찍부터 관찰된다. 내인성 노화에 비하여 굵고 깊은 주름이 발생하며 잔주름도 많이 발생한다. 햇빛에 노출된 피부에 불규칙한 색소침착이 발생하며 일광흑자(Solar Lentigo) 등의 색소질환이 증가한다. 피부가 매우 거칠고, 건조해지며, 탄력성이 감소하여 심한 경우 피부가 처지게 된다.

여러 연구에서 산화 스트레스, DNA 손상 및 돌연변이, Telomere의 단축, 염증 및 최종당화산물(AGEs, Advanced Glycation End Products) 축적을 포함한 다양한 분자 메커니즘을 통해 피부 노화가 발생한다고 보고되었다. 나아가 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species)은 Collagen, Fibronectin, Elastin, Proteoglycans 등 Extracellular Matrix (ECM) Proteins의 다양한 성분을 분해해 피부 노화를 유발하는 Matrix Metallo-Proteinases (MMPs)의 발현을 자극해 피부 노화를 유발한다.

근래 고령화 인구가 크게 늘면서 안티에이징 제품에 대한 관심이 급증하고 있다. 그 결과, 안티에이징 스킨케어 제품에 대한 관심도가 높아졌으며, 특히 화장품 시장이 점점 번창하고 있다. 따라서 독성도 없고 피부 자극도 없는 천연 성분을 개발하여 기능성 안티에이징 화장품 개발로 이어지는 연구가 활발히 추진되고 있다.

한편, 탈모란 모낭의 성장주기 중 성장기의 모낭에서 자라는 모발보다 퇴행기 또는 휴지기의 모낭에서 자라는 모발의 비율이 높아져 비정상적으로 빠지는 모발이 증가하는 것을 말한다. 탈모증은 크게 두 종류가 있는데 그중 첫째는 남성형 탈모증(male pattern baldness), 장년형 탈모증(alopecia seniles) 또는 남성 호르몬성 탈모증 (androgenic alopecia)이라고 불리는 것으로 중년 남성에게서 흔히 볼 수 있으며 전두부와 두정부에서 시작된다. 둘째로는 원형 탈모증(alopecia areata)이라고 불리는 것으로 원형 내지는 타원형의 비교적 경계가 명확한 탈모를 보이며 청소년기에 발생할 수 있는 탈모증이 있다. 탈모증은 남성에만 있는 질병이 아니고 여성에서도 발생하며, 탈모증의 대부분은 남성형 탈모증으로서 남녀에 상관없이 발생한다. 원형 탈모증 역시 남녀 모두에게 발생하나 여성이 남성에 비하여 발생 빈도가 낮다.

이러한 탈모의 원인으로는 모발 주기 조절과 관련된 모유두세포(dermal papilla cell)와 모모세포(geminal matrixcell)의 기능저하 또는 증식억제, 남성호르몬의 과잉작용, 모포에의 혈류량의 저하, 피지분비 과잉, 과산화물과 세균 등에 의한 두피기능 저하, 유전적 요인, 노화, 스트레스에 따른 신경증 등이 있으며, 다양한 원인들이 단독 혹은 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.

최근 현대인들에게 대기오염과 같은 환경적 요인과 정신적인 스트레스 등으로 인하여 탈모증의 발생이 증가하고 있으며 발생 연령도 점차 낮아지고 있다. 이와 같은 탈모증은 당사자들에게 심각한 스트레스를 유발시키고 대인관계에 지장을 초래할 수 있어 탈모치료 및 예방에 대한 관심은 증대되고 있다.

탈모증의 치료 및 예방에 있어 현재까지 다양한 시도가 이루어져 왔는데 외관적인 방법으로는 두피피판술, 탈모부위축소술 및 조직확장술에 의한 두피성형술과 최근에 발전된 자가모발 이식술 등이 있다. 이러한 외과적 방법은 비록 효과 면에서는 우수하더라도 수술에 대한 환자의 경제적, 정신적 부담이 매우 크므로 널리 사용되기 어렵다는 단점이 있다.

이에 다양한 외용제가 사용되고 있는데 현재 가장 널리 사용되는 것은 미국 FDA의 승인을 받은 업존사의 미녹시딜 함유제제이며 최근에는 머크사에서 Type 2의 5 알파-환원효소 억제효과가 있는 피나스테라이드(finasteride)가 주성분인 프로페시아(Propecia)가 발매되어 사용되고 있다. 그러나 미녹시딜의 경우 가려움증, 자극 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있고, 피나스테라이드의 경우에도 사용을 중단하면 2개월 안에 원상태로 돌아가는 문제점과 성욕감퇴, 발기부전 등의 성기능 감퇴 부작용이 발생하며, 여성은 기형아 출산 위험이 있기 때문에 복용할 수 없다는 단점이 존재한다.

또한, 부작용이 적은 천연물질로 천궁, 상황버섯, 금은화, 캐모마일 등의 추출물, 하수오, 창포, 석류, 은행잎 추출물 등 천연추출물에 기초한 연구들이 진행되고 있으나 이러한 육모제를 실제 임상에서 사용하는 경우 두피에 작용하는 효과가 그다지 탁월하지 못하다. 이에 자극이 적은 천연물을 이용한 탈모 및 육모에 대한 연구가 계속하여 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 피부재생 및 육모에 우수한 효과를 나타내는 유효성분을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 본 발명자들이 주목한 산국 추출물 또는 산국 발효물은 효과적이면서 안전한 피부 재생 및 육모 효능을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 산국추출물 또는 그의 발효물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

산국추출물은 100~150℃의 열수 추출을 통해 얻어지는 것을 특징으로 한다.

또한 산국추출물의 발효물은 Bacillus methylotrophicus와 Bacillus subtilis 두 가지 균주의 복합발효를 통해 얻어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 산국 추출물 또는 산국 발효물을 유효성분으로 하는 항노화용 및 탈모 방지 및 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 천연물질을 유효성분으로 하여 부작용이 적을 뿐만 아니라, 최적의 추출 및 발효에 따른 효능증대를 통해 세포재생능력, 피부 재생능력, 육모 촉진에 우수한 효과를 갖는다.

이하 본 발명을 실시예와 함께 설명한다.

1. 산국추출물 제조

추출물을 제조하기 위해 산국 200g을 정제수(D.I-Water) 2Kg을 첨가하여 아래 Table 1과 같은 조건으로 추출을 진행하여 300mesh로 여과 후 수율 측정을 진행하였다.

120℃, 8hr의 조건에서 가장 높은 72%의 수율을 나타냈으나 수율상 크게 차이가 없어 에너지 절감을 위해 120℃, 6hr을 추출을 위한 기준으로 하였다. 이때 추출물의 Brix는 5~8의 범위로 측정되었다.

2. 산국 발효물 제조

산국 추출물의 발효는 발효 식품에서 분리한 미생물 2종을 이용하여 진행하였다. 본 발명자들에 의해 스크리닝되어 최적의 발효 균주로 선별된 Bacillus methylotrophicus(Apep microrganism S001)와 Bacillus subtilis(Apep microrganism K007) 2종의 미생물을 사용하였다. 전 배양은 Nutrient broth(Difco, Detroit, MI, USA)를 이용하여 2종의 발효 균주에 대해 각각 37℃ 진탕 배양기에서 24시간 배양하였다.

산국 추출물의 발효 시 사용된 조성은 산국 추출물, Glucose 0.6%, Yeast Extract 0.3%, Soytone 0.1%로 하였다. 산국 추출물은 고형분 함량 기준으로 정량하여 발효 시 사용하였으며, 발효를 위한 배지는 발효기에 산국 추출물을 제외한 배지 성분을 넣어 121℃에서 20분간 멸균하여 사용하였고 산국 추출물은 추출방법에 따라 배지 멸균 후 후첨하여 추출물의 성분이 열에 의해 파괴되지 않도록 하였다. 여기에 발효 미생물 2종을 접종하였다. 발효 미생물 농도는 Spectrophotometer로 약 1.0 X 109 cfu/ml의 농도로 측정한 뒤 사용하였으며 접종이 완료되면 37℃에서 3일간 진탕 배양하여 발효를 진행하였다.

발효 완료 후 발효물은 원심분리를 진행하여 미생물을 걸러낸 뒤 0.2 μm 필터로 한번 더 여과하여 미생물을 완벽히 제거하였다.

3. 발효 전후의 물질 변화 비교

추출한 Extract를 유기용매의 유전율에 따라 분획한 후 생리활성이 있는 용매분석을 확인, 다시 농축한 후 화합물의 특성에 따라 TLC용 분리용매를 선정하였다. TLC는 흡착제를 균일한 박층으로 만들어 사용하는 방법으로 흔히 Silica Gel 박층을 사용하며 극성이 매우 높은 화합물인 경우 C18, Polyamide와 Cellulose 박층이 사용되며, C는 분해능이 좋고 분석 소용시간이 짧으며 전개용매와 발색시약에 제한이 없으므로 여러 종류의 물질분석에 이용할 수 있다.

4. 세포 생존율 시험(Cell Viability Assay)

Cell Viability Assay는 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소작용에 의하여 노란색 수용성 기질인 MTT Tetrazolium이 청자색의 비수용성 기질인 Formazan Crystal로 환원되는 것을 이용한 검사법이다. 소재의 안전성 검사 및 세포 증식능 확인을 위해 피부 각질세포(HaCaT), 섬유아세포(Fibroblast), 모유두세포(HDP, Human Dermal Papilla Cell)에 소재를 처리하고 세포증식능 시험을 진행하였다.

5. 피부재생효과 시험(Wound Healing Assay)

피부 세포의 성장을 통한 세포 회복능을 시험하는 Wound Healing Assay를 통해 발효물 유래 펩타이드의 세포 재생유도 효과를 검증하고자 하였다. 6 Well Plate에 100% 차도록 자란 인간 피부 각질 세포주의 중간을 Tip을 이용하여 균일하게 상처를 낸 후 PBS를 이용하여 2회 세척하였다. 실험 시간을 총 12, 24시간을 기준으로 하며, 각각의 시간동안 상처의 회복 정도를 이미지 장비를 통해 확인하고, 이를 Image J 프로그램을 통해 정량적으로 확인하였다.

6. 콜라겐(Collagen) 합성능 시험

10% FBS와 DMEM 배양액으로 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 Serum-free 배지로 바꾸어 TJEs, TJFs, PEP 1 μg/ml과 같이 처리하여 24시간 배양한다. 세포 상층액에서의 콜라겐 합성은 제조업체의 Protocol에 따라 Collagen Type 1 c-Peptide ELISA Kit(TKARA, BioInc.)를 사용하여 정량화하였다.

7. qPCR

1일 동안 배양된 인간상피세포주에 추출물을 처리, 추출물이 처리된 세포에 RiboEX RNA Purification Solution을 첨가하여 Nucleotide를 분리하였다. Chloroform 및 Isopropanol을 첨가하여 냉장원심 분리기를 통해 원심 분리한 후, RNA 만을 분리함. 추출한 RNA는 정량 후 Reverse Transcription PCR 과정을 통해 cDNA를 합성하였다. Specific primer를 이용하여 피부 장벽 손실 관련된 특정 유전자를 Real Time PCR에서 증폭시킨 후, GAPDH 대비 특정 유전자의 발현 정도를 정량적으로 분석하였다.

[시험 결과]

1. 발효 전후의 물질변화 비교

발효 전후의 물질 분석 및 Solvent Fractions별 물질에 대해 분석을 진행한 결과 발효 전에 비해 발효 후 물질의 크기가 비교적 작고 고르게 나오는 것을 확인하였다. 이는 피부 등 외용제로 사용시 보다 효과적으로 피부에 침투할 수 있다는 것을 의미한다. 또한 용매별로 확인시 water fraction과 buthanol fraction에서 주로 많은 물질이 확인되어 유효성분이 수용성일 가능성이 높다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

2. 세포 생존능 시험 결과

산국 추출물 및 발효물에 대해 섬유아세포(Fibroblast Cell), 피부각질세포(HaCaT Cell), 모유두세포(HDP Cell)에서의 세포 증식능 시험을 진행하였다. 결과는 아래 Fig. 3에서와 같이 모든 세포에 대해 세포독성은 나타나지 않았으며, 생포증식능이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히 산국추출물보다 산국 발효물에서 세포증식능이 더 우수한 것으로 나타났다. 특히, 모유두 세포에서의 생존능은 소재가 육모효능을 가지는 것을 나타내므로 산국추출물 및 발효물의 육모효능을 확인할 수 있었다. 이로써 산국추출물과 발효물 모두 피부에 안전하면서 효과적인 소재임을 확인할 수 있다.

3. 피부재생능 시험결과

산국추출물 및 산국발효물에 대해 피부각질세포(HaCaT Cell)에서의 Wound Healing Assay를 통한 상처치유효과 확인시험을 진행하였다. 그 결과 대조군으로 사용한 Vitamin-C와 비교해서 동등 이상의 효과를 확인하였으며, 특히 300 ㎍/㎖의 농도에서는 Vitamin-C 보다 월등히 우수한 효과를 나타내어 피부에 사용시 재생효과가 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다(Fig. 4~5).

4. 콜라겐(Collagen) 합성능 시험결과

산국의 주름개선효과를 확인하기 위해 Collagen 합성능에 대한 시험을 진행하였다. 확인결과 컨트롤 대비 우수한 효능을 나타냈으며, 특히 300 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 양성대조군보다 우수한 효능을 나타냈고, 산국추출물보다는 산국발효물에서 더욱 우수한 효능을 확인하였다.

5. qPCR 시험결과

IGF (Insulin-like Growth Factor)는 모유두세포의 증식을 촉진하여 모발의 성장을 촉진하는 인자로 100 ㎍/㎖의 농도에서 산국추출물은 컨트롤 대비 유효한 효과가 없었지만, 산국발효물은 산국추출물에 비해 8배의 발현량 증가를 나타냈으며, 500 ㎍/㎖의 농도에서는 35배의 발현량의 증가를 나타내어 산국발효물이 산국추출물에 비해 육모에 대한 효과가 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다.

VEGF (Vascular Endotherial Growth Factor)는 신생혈관성장인자로서 혈액순환 개선을 통해 육모 효능을 촉진하는 것으로 알려져 있다. qPCR 결과, 산국추출물에 비해 산국발효물의 경우 100 ㎍/㎖에서는 약 2배, 500 ㎍/㎖에서는 약 4배 이상 발현이 증가하여 혈액순환 개선을 통한 육모효능이 있는 것으로 확인하였다.

위에서 살핀 바와 같이 본 발명에 따른 산국추출물 및 산국발효물은 세포에 대한 독성이 없으면서 세포증식을 촉진하고, 피부재생효과도 우수한 것으로 나타나 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였고, 콜라겐 합성능이 우수하여 주름개선 및 항노화 분야에 적용이 가능하며 모유두세포의 활성 및 IGF, VEGF의 발현량을 증가시켜 육모용 소재로도 우수한 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

1. 산국추출물 또는 그의 발효물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 및 육모용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   산국추출물은 100~150℃의 열수 추출을 통해 얻어지는 것을 특징으로 하는 탈모방지 및 육모용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   산국추출물의 발효물은 Bacillus methylotrophicus와 Bacillus subtilis 두 가지 균주의 복합발효를 통해 얻어지는 것을 특징으로 하는 탈모방지 및 육모용 화장료 조성물.
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