KR102465232B1 - Method and Kit for Analyzing Canine Subject Microsatellite Marker by using Multiplex System - Google Patents

Abstract

본 발명은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 개의 초위성체 마커 마커 분석방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 멀티플렉스 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 14개 초위성체 마커(microsatellite marker)를 동시에 증폭하여 분석함으로써 신속하고 민감하며, 높은 정확도로 개의 객체식별 및 혈족확인을 수행할 수 있는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 개 객체의 유전자 감식방법은 개 유전자 감식에 있어서, 높은 재현성 및 정확도로 유전자 감식이 가능할 뿐만 아니라, 증폭산물의 길이가 짧아 조각난 DNA 샘플에서도 민감도와 정확도가 높으므로 객체식별 및 혈족 확인에 있어서 유용하다.The present invention relates to a method for analyzing canine supersatellite marker markers using multiplex gene amplification, and more particularly, 14 microsatellite markers simultaneously using multiplex polymerase chain reaction (PCR). It relates to a method and kit using the same for rapid, sensitive, and high-accuracy object identification and blood kin identification by amplifying and analyzing. The gene identification method of a dog object according to the present invention not only enables gene identification with high reproducibility and accuracy in dog gene identification, but also has high sensitivity and accuracy even in fragmented DNA samples due to the short length of the amplification product. useful in

Description

초위성체 마커를 이용한 개의 개체식별, 친자확인 방법 및 이를 이용한 분석 키트{Method and Kit for Analyzing Canine Subject Microsatellite Marker by using Multiplex System}Method and Kit for Analyzing Canine Subject Microsatellite Marker by using Multiplex System}

본 발명은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 개의 초위성체 마커 마커 분석방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 멀티플렉스 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 14개 초위성체 마커(microsatellite marker)를 동시에 증폭하여 분석함으로써 신속하고 민감하며, 높은 정확도로 개의 객체식별 및 혈족확인을 수행할 수 있는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다. The present invention relates to a method for analyzing canine supersatellite marker markers using multiplex gene amplification, and more particularly, 14 microsatellite markers simultaneously using multiplex polymerase chain reaction (PCR). It relates to a method and kit using the same for rapid, sensitive, and high-accuracy object identification and blood kin identification by amplifying and analyzing.

최근 반려견 인구가 일천 만에 이를 정도로 급속한 증가와 더불어 유기견의 대량발생 문제 및 인명과 관련한 사고가 매년 급증하고 하고 있다(소방청, 2016). 2015년 농림축산식품부는 '동물복지 5개년 종합계획'에 따라 반려견에 대해 사육자의 인적사항이 포함된 내장형 칩 또는 외장형칩 또는 인식표를 의무적으로 반려견에 장착하게 하였으며, 최근 정부에서는 동물보호법 개정으로 반려견 사육자에 대한 지자체 등록을 의무와 하였다(동물보호법 개정시행, 2018, 03, 22). 이 법률에서는 반려견 사육자의 안전조치 및 사육에 관한 의무를 다하지 않았을 경우 해당사항에 따른 벌칙을 강화적용하고 있다. 하지만 내장형 칩 등 인적사항을 확인할 수 있는 이식표가 없는 유기견이 2015년 59,633 마리, 2016년 62,742마리, 2017년 83,838 마리로 그 발생빈도가 급등하고 있다(농림축산식품부, 2017).Recently, with the rapid increase of the dog population to the extent of 10 million, the problem of mass occurrence of abandoned dogs and accidents related to human life are increasing rapidly every year (Fire Service, 2016). In 2015, the Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs made it compulsory for dogs to be equipped with internal or external chips or identification tags containing the breeder's personal information according to the '5-year comprehensive plan for animal welfare'. Local government registration was mandatory for breeders (Animal Protection Act revision enforcement, 2018, 03, 22). In this Act, if dog breeders do not fulfill their obligations regarding safety measures and breeding, penalties are applied in accordance with the relevant matters. However, the number of abandoned dogs without a transplant tag that can verify personal information such as a built-in chip is 59,633 in 2015, 62,742 in 2016, and 83,838 in 2017, the frequency of occurrence is rapidly increasing (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, 2017).

즉 반려견의 주인을 확인할 수 있는 내장형 칩 또는 인식표가 반려견 유기 시에는 제거되어 유기 된다는 것을 반증하는 증거라 할 수 있다. 이와 같은 반려견 사육자의 추적불가 문제를 극복할 수 있는 방안으로 바로 개의 마이크로새틀라이트 유전자 지문분석(Microsatellite DNA genotyping)이 있다. 반려견을 지자체에 등록할 때 사육자의 인적사항과 함께 해당 반려견의 유전자 지문을 함께 등록하면 유기견 발생 시 인식표가 없다고 하여도 반려견의 유전자검사를 통해 유기견의 주인을 추적할 있는 것이다. 또한 반려견의 마이크로새틀라이트 유전자지문은 어미로부터 정확히 50%, 아비로부터 정확히 50%를 유전받아 형성되는 것으로 이를 분석하면 부모 개체와의 친자확인이 가능해진다. 반려견 인구의 급증과 함께 고가 반려 강아지의 혈통 위변조, 반려견 분실과 원 소유주와 현재 보호자간의 소유권 분쟁 등의 문제 또한 증가하고 있다. 이와 같이 법적으로 민감한 사항에 대해 마이크로새틀라이트 유전자 지문분석(Microsatellite DNA genotyping)을 통한 개체동일성검사 또는 친자확인 검사로 그 법적인 지휘를 명확히 구별해낼 수도 있다. 이를 이루기 위해선 저렴하고 신뢰성 있는 마이크로새틀라이트 유전자 지문분석 기술이 절대적으로 필요한 실정이다. In other words, it can be said that the built-in chip or identification tag that can identify the dog's owner is removed and abandoned when the dog is abandoned. One way to overcome this problem of untraceability of dog breeders is microsatellite DNA genotyping in dogs. When registering a dog with the local government, if you register the dog's genetic fingerprint along with the breeder's personal information, even if there is no identification tag when an abandoned dog occurs, the dog's genetic test can be used to track the dog's owner. In addition, a dog's microsatellite genetic fingerprint is formed by inheriting exactly 50% from the mother and exactly 50% from the father. Along with the rapid increase in the dog population, problems such as forgery of pedigree of expensive companion dogs, loss of dogs, and ownership disputes between original owners and current guardians are also increasing. For such legally sensitive matters, it is also possible to clearly distinguish the legal command through an individual identity test or paternity test through microsatellite DNA genotyping. To achieve this, inexpensive and reliable microsatellite genetic fingerprint analysis technology is absolutely necessary.

하지만 기존의 개의 유전자지문분석법(개체식별 및 친자확인)의 거의 대부분은 염기서열 반복군의 반복단위가 염기 2개로 이루어진 di-nucleotide repeat 마이크로새틀라이트 마커를 사용하여 유전자지문분석을 해왔다. Dinucleotide repeat 마이크로새틀라이트 마커는 PCR 증폭산물에서 stutter 및 nonspecific peak이 다량으로 자주 발생하여 정확한 유전자형 판독에 많은 어려움이 있어 검사결과의 판독 오류의 발생문제가 빈번하게 발생하며, 그 마이크로새틀라이트 마커의 조합 수가 적어 같은 시료에 대해 각기 다른 방법으로 2~3회 반복해야 하거나 또는 그 누적식별력과 누적배제력이 낮아 검사결과를 신뢰할 수 있을 만큼 정확한 검사가 어렵다는 단점이 있다.However, most of the existing genetic fingerprinting methods (identification and paternity) of dogs have been genetically fingerprinted using di-nucleotide repeat microsatellite markers in which the repeating unit of the nucleotide sequence repeat group consists of two bases. Dinucleotide repeat microsatellite markers frequently generate large amounts of stutter and nonspecific peaks in PCR amplification products, making it difficult to accurately read genotypes, which frequently causes errors in the reading of test results, and the combination of the microsatellite markers There are disadvantages in that it is difficult to perform an accurate test enough to be able to trust the test results because the number of samples is small, so the same sample must be repeated 2-3 times by different methods, or the cumulative discrimination and exclusion power are low.

한국등록특허 제10-1156047호에서 개의 마이크로새틀라이트(microsatellite)을 이용한 개의 개체 식별방법을 다루고 있는데, 상기 선행특허에서 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR) 조성물은 마이크로새틀라이트 10좌위 세트, 6좌위 세트, 11좌위 세트로 각각 나누어져 있다. 따라서 국내의 1천만에 이르는 반려견 집단에서 개별 개체를 식별해내 위해서는 누적식별력을 고려해 상기 특허기술 중 최소한 2종 이상의 마이크로새틀라이트 세트를 선택해 2회 이상 분석해 결과를 종합해야 한다는 치명적 단점이 있다. 또한 상기 특허에는 성별을 구분할 수 있는 마커가 포함되어 있지 않기 때문에 암수를 구분할 수 없다는 단점이 있다.Korean Patent Registration No. 10-1156047 deals with a dog individual identification method using canine microsatellite. Each is divided into a set of 11 positions. Therefore, in order to identify individual individuals from the 10 million dog group in Korea, there is a fatal disadvantage that it is necessary to select at least two microsatellite sets from the above patented technologies and analyze them twice or more to synthesize the results in consideration of the cumulative identification power. In addition, since the above patent does not include a marker for distinguishing between sexes, there is a disadvantage in that males and females cannot be distinguished.

더구나 상기의 선행특허는 각 좌위별 식별력, 배제력, 누적식별력, 누적배제력이 제시되지 않아 개의 개체식별 또는 친자확인에 사용할 없을뿐더러 대립유전자의 명명을 증폭된 DNA의 길이(bp)로 하고 있어 실험실 환경 또는 실험자에 따라 그 결과가 달라질 수 있어 상용화할 수 없다는 단점이 있다.In addition, the above-mentioned prior patents do not provide discriminatory power, exclusion power, cumulative discrimination power, and cumulative exclusion power for each locus, so they cannot be used for individual identification or paternity confirmation of dogs. There is a disadvantage in that it cannot be commercialized because the results may vary depending on the laboratory environment or the experimenter.

한국 등록특허 제10-1903334호에서는 VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어진 초위성체 마커를 증폭하여 개체를 식별하는 방법이 기재되어 있으나, 염기서열 해독이 필요하다는 단점이 있다.In Korean Patent Registration No. 10-1903334, VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X and DOG-Y supersatellites consisting of Although a method for identifying an individual by amplifying a marker has been described, there is a disadvantage in that a nucleotide sequence is required.

개의 친자확인 및 개체식별 검사 방법에 관해 국내에서 개발되어 상용화된 기술은 전무하며, 현재 개의 친자확인 및 개체식별에 사용되고 있는 DNA분석은 "Canine ISAG STR Parentage Kit"(Thermo Fisher scientific, USA)라는 수입 제품에 전적으로 의존하고 있는 실정이다.There is no domestically developed and commercialized technology for dog paternity and individual identification testing methods, and the DNA analysis currently used for dog paternity and individual identification is imported as "Canine ISAG STR Parentage Kit" (Thermo Fisher scientific, USA). It is completely dependent on the product.

이 수입제품은 총 22개의 마이크로새틀라이트 DNA 좌위를 multiplex PCR을 통해 동시 증폭하는 방식을 취하고 있는 것이 특징이다. 좌위의 수가 많은 만큼 개체식별력과 배제력이 높을 것으로 예상되지만 아쉽게도 현재까지 국내의 반려견 집단에서의 개체식별력과 배제력이 얼마나 되는지와 각 좌위의 대립유전자 빈도가 어떻게 분포되는지에 대한 연구가 전문한 상태이다.This imported product is characterized by the simultaneous amplification of a total of 22 microsatellite DNA loci through multiplex PCR. As the number of loci is large, it is expected that the individual identification and exclusion power will be high, but unfortunately, until now, research on how much individual identification and exclusion power is in the domestic dog group and how the frequency of alleles at each locus is distributed. to be.

따라서 이 검사방법으로 실제로 개의 개체식별 또는 친자확인에 법과학적 용도로 사용하기에는 집단유전학적 오류의 위험이 따르며, 이 제품을 구성하고 있는 마이크로새틀라이트 좌위 22개중 21개가 디-뉴클레오타이드 반복(di-nucleotide repeat) 마이크로새틀라이트 마커로 이루어져 있어 유전자 분석 시 증폭산물에서 중복밀림현상(stutter) 및 비특이적(nonspecific)인 DNA 증폭 산물이 자주 발생해 정확한 유전자형 판독에 많은 어려움이 있어 검사결과의 판독 오류가 발생할 수 있는 문제점이 있다.Therefore, there is a risk of population genetic errors when using this test method for forensic scientific purposes for individual identification or paternity confirmation in dogs. repeat) is composed of microsatellite markers, so stuttering and nonspecific DNA amplification products frequently occur in the amplification product during gene analysis, making it difficult to accurately read the genotype, and errors in the reading of test results may occur. there is a problem with

또한, 마이크로새틀라이트 좌위는 그 반복 단위를 구성하고 있는 염기의 개수에 따라 모노(mono), 디(di), 트라이(tri), 그리고 테트라-뉴클레오타이드 반복(tetra-nucleotide repeat)으로 분류되는데, 모노, 디, 트라이- 뉴클레오타이드 반복 형태인 마이크로새틀라이트는 PCR을 수행하는 동안 strand slippage현상으로 인해 실제 대립유전자보다 2bp 또는 그 이하로 길이가 짧은 PCR 산물이 다수 생성되어 실제 대립유전자의 결정에 많은 어려움을 준다. 이러한 현상으로 PCR 산물을 전기영동 하였을 때 나타나는 대립유전자의 중복된 밀림 현상을 shutter라고 부른다(Walsh et al., 1996). 마이크로새틀라이트 반복구간의 반복단위가 짧은 디(di)와 트라이-뉴클레오타이드(tri-nucleotide) 형태인 마이크로새틀라이트는 중복밀림현상(stutter)의 비율이 실제 대립유전자의 검출강도와 비교해 40~95%까지 발생하기 때문에 실제 대립유전자와 중복밀림현상(stutter)을 구별하기 힘들며, 특히 한 번의 반복단위 차이로 연접한 이형접합자라면 실제 대립유전자를 정확히 구별하기가 매우 힘들다.In addition, microsatellite loci are classified into mono, di, tri, and tetra-nucleotide repeats according to the number of bases constituting the repeating unit. Microsatellite, which is a repeating form of , D, and tri-nucleotides, produces a large number of PCR products shorter than the actual allele by 2bp or less due to strand slippage during PCR, making it difficult to determine the actual allele give. Due to this phenomenon, the phenomenon of overlapping alleles that appears when PCR products are electrophoresed is called shutter (Walsh et al., 1996). In microsatellites, in which the repeating units of the microsatellite repeat section are short di and tri-nucleotides, the ratio of stuttering is 40-95% compared to the detection intensity of the actual allele. It is difficult to distinguish the actual allele from the stutter, especially in the case of heterozygotes conjoined by a single repeating unit difference, it is very difficult to accurately distinguish the actual allele.

한편, 멀티플렉스 PCR 시스템은 한번의 PCR 반응으로 여러 마커들(loci)의 프라이머를 넣고 한 튜브 내에서 실험반응을 수행하는 것으로서, 멀티플렉스 PCR 시스템을 사용하게 되면 감정인력 및 분석에 사용되는 taq 폴리머라아제(PCR 반응효소) 등 각종의 시약류의 절감 효과와 함께 유전자형 모세관 자동분석기의 가동을 최소화시켜 비용을 줄일 수 있는 큰 장점이 있다. On the other hand, the multiplex PCR system puts primers of several markers (loci) in one PCR reaction and performs an experimental reaction in one tube. There is a great advantage of reducing costs by minimizing the operation of the genotype capillary automatic analyzer along with the effect of reducing various reagents such as lyase (PCR reaction enzyme).

유전자감식에는 상용화된 고가의 반응시약류들이 소모되는 것을 감안할 때 예산상의 절감효과도 상당히 거둘 수 있는 장점을 지니고 있다. 이렇듯 멀티플렉스 PCR 시스템이 가지는 인력, 예산 면에서의 효용가치로 인하여 유전자감식을 선도하는 영국, 미국을 비롯한 선진국가에서는 자국의 현실에 맞는 멀티플렉스 PCR 시스템을 확립하려는 연구가 활발히 이루어져 왔다.Considering that commercialized expensive reaction reagents are consumed for gene identification, it has the advantage of significantly reducing the budget. As such, due to the useful value of the multiplex PCR system in terms of manpower and budget, research to establish a multiplex PCR system suitable for the reality of their country has been actively conducted in developed countries such as the UK and the US, which lead gene identification.

이에 본 발명자들은 민감도와 정확성이 높은 개 유전자 감식을 위한 분석방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 14개좌의 개 초위성체 마커를 본 발명의 프라이머 조합으로 증폭할 경우, 증폭산물의 길이가 400bp까지 짧아질 뿐만 아니라, 샘플의 유전정보를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. As a result, the present inventors made diligent efforts to develop an analysis method for dog gene identification with high sensitivity and accuracy. As a result, when the 14 locus canine supersatellite markers are amplified with the primer combination of the present invention, the length of the amplification product is as short as 400 bp. In addition to quality, it was confirmed that the genetic information of the sample could be detected with high sensitivity and accuracy, and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 개의 유전자 감식방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for dog gene identification using multiplex gene amplification.

본 발명의 다른 목적은 14개 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 개 염색체 상의 초위성체 마커(microsatellite marker) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a multiplex gene amplification kit for analysis of microsatellite markers on dog chromosomes including a primer set capable of amplifying 14 markers.

본 발명의 또다른 목적은 상기 키트를 이용한 객체식별 또는 혈족 확인 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for identifying an object or a blood relative using the kit.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은In order to achieve the above object, the present invention

(a) DNA 시료를 FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX 및 DogY로 구성된 14개의 초위성체 마커(microsatellite marker) 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 이용하여 상기 14개의 초위성체 마커를 멀티플렉스 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭산물을 이용하여 상기 마커의 대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 멀티플렉스 초위성체 마커 유전자 증폭을 이용한 개 유전자 감식방법을 제공한다. (a) DNA sample capable of amplifying each of the 14 microsatellite markers consisting of FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX and DogY multiplex amplifying the 14 supersatellite markers using primers; and (b) determining the allele of the marker using the multiplex amplification product of step (a).

본 발명은 또한 FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX 및 DogY로 구성된 14개의 초위성체 마커(microsatellite marker) 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 포함하는 개 초위성체 마커 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트를 제공한다.The present invention also provides primers capable of amplifying each of the 14 microsatellite markers consisting of FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX and DogY. It provides a multiplex gene amplification kit for analysis of canine supersatellite markers, including

본 발명은 또한 (a) 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 키트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 객체식별 또는 혈족 확인방법을 제공한다.The present invention also comprises the steps of (a) isolating genomic DNA from a sample; (b) using the isolated genomic DNA as a template and amplifying a target sequence using the kit; and (c) detecting the amplification product.

본 발명에 따른 개 객체의 유전자 감식방법은 개 유전자 감식에 있어서, 높은 재현성 및 정확도로 유전자 감식이 가능할 뿐만 아니라, 증폭산물의 길이가 짧아 조각난 DNA 샘플에서도 민감도와 정확도가 높으므로 객체식별 및 혈족 확인에 있어서 유용하다. The gene identification method of a dog object according to the present invention not only enables gene identification with high reproducibility and accuracy in dog gene identification, but also has high sensitivity and accuracy even in fragmented DNA samples due to the short length of the amplification product. useful in

도 1은 본 발명에 따른 멀티플렉스 시스템에서 분석하는 유전좌의 위치를 형광 마커별로 표시한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 멀티플렉스 시스템에서 프라이머 세트를 이용한 샘플 분석 결과이다.1 is a schematic diagram showing the positions of loci analyzed in the multiplex system according to the present invention for each fluorescent marker.
2 is a sample analysis result using a primer set in the multiplex system according to the present invention.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is those well known and commonly used in the art.

본 발명에서 용어 "초위성체(Microsatellites)"란 진핵세포(eukaryotes) 유전자 전역에 걸쳐 분포하는 모노-, 디-, 트리- 및 테트라뉴클레오타이드 형태의 짧은 반복 염기서열을 의미한다. 일반적으로 이러한 반복 서열은 염색체 내에서 10 내지 40 번 정도 단순반복(tandem repeat)된 형태로 존재한다.As used herein, the term “microsatellites” refers to short repeating nucleotide sequences in the form of mono-, di-, tri- and tetranucleotides distributed throughout the gene of eukaryotes. In general, such a repeating sequence exists in the form of 10 to 40 tandem repeats within the chromosome.

본 발명에서 용어 "초위성체 마커(Microsatellite Marker)"란 마이크로새틀라이트를 이용한 DNA 다형검출 마커를 의미한다.As used herein, the term "microsatellite marker" refers to a DNA polymorphism detection marker using microsatellite.

본 발명에서 용어 '증폭'은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), WO 89/06700 및 EP 329,822의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR, WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; MA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR, 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA, 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the term 'amplification' refers to a reaction for amplifying a nucleic acid molecule. Various amplification reactions have been reported in the art, which include polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159), reverse transcription-polymerase chain reaction (hereinafter referred to as RT-PCR). (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), methods of WO 89/06700 and EP 329,822, ligase chain reaction; LCR, WO 90/01069 ), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (MA, WO 88/10315), self-sustained sequence replication (WO 90/06995), Selective amplification of target polynucleotide sequences (US Pat. No. 6,410,276), consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR, US Pat. No. 4,437,975), optional arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR, US Pat. Nos. 5,413,909 and 5,861,245), nucleic acid sequence based amplification (NASBA, US Pat. Nos. 5,130,238, 5,409,818) , 5,554,517, and 6,063,603), strand displacement amplification and loop-mediated amplification isothermal amplification; LAMP), but is not limited thereto.

사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.Other amplification methods that can be used are described in US Pat. Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 and 09/854,317.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, D-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), DL-PCR(PC), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.PCR is the most well-known nucleic acid amplification method, and many modifications and applications thereof have been developed. For example, touchdown PCR, hot start PCR, nested PCR, and booster PCR have been developed by modifying traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR. In addition, real-time PCR, differential display PCR (D-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), DL-PCR (PC), inverse polymerase chain reaction (inverse polymerase chain reaction: IPCR), vectorette PCR, and TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) have been developed for specific applications. For more information on PCR, see McPherson, M. J., and Moller, S. G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000), the teachings of which are incorporated herein by reference.

상기 멀티플렉스 증폭은 멀티플렉스 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 57-61℃의 어닐링(annealing) 온도 조건을 갖고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 58-60℃의 어닐링 온도 조건을 가지며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 58.5-59.5℃의 어닐링 온도 조건을 갖는다.The multiplex amplification is multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification. According to one embodiment of the present invention, the multiplex PCR amplification has an annealing temperature condition of 57-61°C, and according to another embodiment of the present invention, the multiplex PCR amplification is annealing of 58-60°C temperature conditions, and according to a specific embodiment of the present invention, the multiplex PCR amplification has an annealing temperature condition of 58.5-59.5°C.

상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 PCR을 실시하는 데 적정한 싸이클 수가 요구된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 39 싸이클로 실시한다. 본 발명의 멀티플렉스 PCR 증폭을 26 싸이클 이하로 실시하는 경우에 500 RFU 이하의 피크들이 형성되었고, 40 싸이클에서는 2,000 RFU 이상의 피크가 형성되었지만 노이즈가 증가하고 불완전한 A 삽입이 발생하여 적합하지 않다.The multiplex PCR amplification requires an appropriate number of cycles to perform PCR. According to one embodiment of the present invention, the multiplex PCR amplification is carried out in 39 cycles. In the case of performing the multiplex PCR amplification of the present invention for 26 cycles or less, peaks of 500 RFU or less were formed, and at 40 cycles, a peak of 2,000 RFU or more was formed, but noise increases and incomplete A insertion occurs, which is not suitable.

본 발명에서 용어 '프라이머(primer)'는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드트리포스페이트 및 중합 반응 효소 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다. 이러한 프라이머의 디자인은 주형이 되는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들어, 프라이머 디자인용 프로그램(예를 들어, PRIMER 3, VectorNTI 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.In the present invention, the term 'primer' refers to a single that can serve as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and a polymerase enzyme) in a suitable buffer at a suitable temperature. refers to the oligonucleotide of the strand.The suitable length of the primer depends on various factors, such as temperature and the use of the primer, but is typically 15 to 30 nucleotides.Short primer forms a sufficiently stable hybridization complex with the template. The term "forward primer" and "reverse primer" refer to the 3' end and 5 ' means a primer that binds to each end. The sequence of the primer does not need to have a completely complementary sequence to a partial sequence of the template, and it is hybridized with the template to ensure sufficient complementarity within the range to perform the intrinsic action of the primer. Therefore, the primer set according to one embodiment does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence as a template, but it is sufficient if it has sufficient complementarity within the range that can hybridize to this sequence and act as a primer. The design of such a primer can be easily carried out by those skilled in the art by referring to the nucleotide sequence of the polynucleotide as a template, for example, using a primer design program (eg, PRIMER 3, VectorNTI program) can do it

본 발명에서는 개 초위성체 마커(microsatellite marker)의 위치를 멀티플렉스 시스템을 이용하고, 프라이머 세트의 조합을 새롭게 구성하여 분석할 경우, 형광염료를 추가로 사용하지 않으면서, 짧은 길이의 증폭산물을 제작하여 분석 민감도와 정확도가 증가하는 지를 확인하고자 하였다.In the present invention, when the position of the canine microsatellite marker is analyzed using a multiplex system and a new primer set combination is constructed and analyzed, a short-length amplification product is prepared without additionally using a fluorescent dye. Therefore, it was tried to check whether the analysis sensitivity and accuracy were increased.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 개 DNA 시료를 FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX 및 DogY로 구성된 14개의 초위성체 마커(microsatellite marker) 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 이용하여 동시에 상기 14개의 마커를 멀티플렉스 증폭을 실시한 다음, 각 유전좌의 대립유전자형을 결정하여 감식한 결과, 높은 민감도와 정확도로 개 객체의 유전자를 감식할 수 있음을 확인하였다(도 2).That is, in one embodiment of the present invention, a dog DNA sample is analyzed using 14 microsatellite markers consisting of FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX and DogY. ) multiplex amplification of the 14 markers at the same time using primers capable of amplifying each, and as a result of determining the allele of each locus It was confirmed that there is (FIG. 2).

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) DNA 시료를 FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX 및 DogY로 구성된 14개의 초위성체 마커(microsatellite marker) 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 이용하여 상기 14개의 초위성체 마커를 멀티플렉스 증폭하는 단계; 및Accordingly, in one aspect, the present invention provides (a) DNA samples with 14 supersatellite markers consisting of FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX and DogY ( multiplex amplifying the 14 supersatellite markers using primers capable of amplifying each of the microsatellite markers; and

(b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭산물을 이용하여 상기 마커의 대립유전자형을 결정하는 단계;(b) determining the allele type of the marker using the multiplex amplification product of step (a);

를 포함하는 멀티플렉스 초위성체 마커 유전자 증폭을 이용한 개 유전자 감식방법에 관한 것이다.It relates to a dog gene identification method using a multiplex supersatellite marker gene amplification comprising a.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 각 초위성체 마커를 증폭할 수 있고, GC 비율이 40 내지 60% 범위를 유지하며, 종열반복 배열이 없는 유전자 서열과 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the primers can amplify each supersatellite marker, maintain a GC ratio in the range of 40 to 60%, and may be characterized as complementary to a gene sequence without a columnar repeating arrangement.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the primer may be characterized in that it is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 28.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 증폭산물은 120 내지 4000bp인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the amplification product of step (a) may be characterized in that it is 120 to 4000 bp.

본 발명의 프라이머 세트에 따른 증폭산물의 길이는 기존의 제품/특허에 공개된 증폭산물들에 비하여 획기적으로 짧으므로, 샘플이 조각나 있더라도 기존의 제품/특허 대비 높은 정확도와 민감도로 유전자를 감식할 수 있다Since the length of the amplification product according to the primer set of the present invention is remarkably short compared to the amplification products disclosed in existing products/patents, even if the sample is fragmented, it is possible to identify genes with high accuracy and sensitivity compared to existing products/patents. can

본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자의 크기를 크기 표준물(size standard)과 비교/평가하여 실시하며, 상기 크기 표준물은 DNA 마커 또는 초위성체 마커-특이적 대립유전자 래더인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the step (b) is performed by comparing/evaluating the size of the allele amplified in the multiplex amplification product with a size standard, and the size standard is a DNA marker or a supersatellite marker. - It can be characterized as a specific allele ladder.

본 발명에 있어서, 상기 DNA 시료는 혈액, 정액, 털, 타액, 소변, 대변, 구강세포, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수 및 이의 혼합물을을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 분리된 DNA 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the DNA sample is a DNA sample isolated from a tissue selected from the group comprising blood, semen, hair, saliva, urine, feces, oral cells, placental cells or amniotic fluid containing fetal cells, and mixtures thereof. It may be characterized as being

본 발명에 있어서, 개 객체의 유전자 감식은 대립유전자형을 결정하고, 이를 대조군과 비교하여 객체의 유전자 형을 결정하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법으로 친자확인을 수행할 경우, 샘플 객체의 대립유전자형을 결정하고 이를 친부 또는 친모의 대립유전자형을 대조군으로 비교하여 친자 여부를 확인하는 것을 의미한다.In the present invention, genetic identification of a dog object means determining the allele type and comparing it with a control group to determine the genotype of the object. For example, when paternity is confirmed by the method of the present invention, it means to determine the allele of a sample object and compare it with the allele of the parent or the mother as a control to confirm whether the parent is the parent.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 형광염료로 표지될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 둘 이상의 그룹으로 나누어서 서로 상이한 형광염료로 표지되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the primer may be labeled with a fluorescent dye, and more preferably divided into two or more groups and labeled with different fluorescent dyes.

본 발명에 있어서, FH2054, DogY, FH2010 및 DogX로 구성된 초위성체 마커를 증폭할 수 있는 프라이머는 제1형광 염료로 표지되고; FH3372, REN01O23, REN51C16 및 REN277O05로 구성된 초위성체 마커를 증폭할 수 있는 프라이머는 제2형광 염료로 표지되며; FH2201, FH2060, FH2097 및 FH2582로 구성된 초위성체 마커를 증폭할 수 있는 프라이머는 제3형광 염료로 표지되고; 및 FH2712 및 FH2004로 구성된 초위성체 마커를 증폭할 수 있는 프라이머는 제4형광 염료로 표지되며, 상기 제1형광 염료, 제2형광 염료, 제3형광 염료 및 제4형광 염료는 서로 상이한 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, a primer capable of amplifying a supersatellite marker composed of FH2054, DogY, FH2010 and DogX is labeled with a first fluorescent dye; Primers capable of amplifying the supersatellite markers consisting of FH3372, REN01O23, REN51C16 and REN277O05 are labeled with a second fluorescent dye; Primers capable of amplifying supersatellite markers composed of FH2201, FH2060, FH2097 and FH2582 are labeled with a third fluorescent dye; and a primer capable of amplifying a supersatellite marker composed of FH2712 and FH2004 is labeled with a fourth fluorescent dye, and the first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye, and the fourth fluorescent dye are different from each other. can do.

본 발명의 유전자 감식 방법에 이용되는 프라이머는 초위성체 마커에 상보적으로 결합하는 한 쌍의 프라이머 중 하나의 프라이머의 5'말단에 형광염료가 표지된다. 상기 제1형광염료 내지 제4형광염료는 모세관 전기영동을 통해 검출할 수 있도록 한 레인에 3 내지 4개의 마커를 배치하는 구성하기 위한 표지이다.In the primer used in the gene identification method of the present invention, a fluorescent dye is labeled at the 5' end of one of a pair of primers complementary to the supersatellite marker. The first to fourth fluorescent dyes are labels for configuring three to four markers in one lane to be detected through capillary electrophoresis.

본 발명에 있어서, 상기 형광염료는 6-FAM, VIC, NED, PET, ROX, HEX, dR110, dR6G, dTAMRA 및 dROX로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.In the present invention, the fluorescent dye may be one or more selected from the group consisting of 6-FAM, VIC, NED, PET, ROX, HEX, dR110, dR6G, dTAMRA and dROX, but is not limited thereto.

본 발명의 유전자 감식 방법에 이용되는 프라이머는 피크 균형을 맞추기 위한 최적의 배합비를 갖는다.The primers used in the gene identification method of the present invention have an optimal mixing ratio for balancing the peaks.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트에서 FH2054 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 XX-XX μM의 최종 농도를 가지고, DogY 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지며, FH2010 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지고, DogX 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지며, FH3372 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지고, REN01O23 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지고, REN51C16 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지며, REN277O05 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지고, FH2201 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지며, FH2060 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지고, FH2097 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지며, FH2582 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지고, FH2712 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지며, FH2004 마커에 상보적으로 결합하는 프라이머는 μM의 최종 농도를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, in the primer set, the primers complementary to the FH2054 marker have a final concentration of XX-XX μM, and the primers complementary to the DogY marker have a final concentration of μM, The primers complementary to the FH2010 marker had a final concentration of μM, the primers complementary to the DogX marker had a final concentration of μM, and the primers complementary to the FH3372 marker had a final concentration of μM. , the primers complementary to the REN01O23 marker have a final concentration of μM, the primers complementary to the REN51C16 marker have a final concentration of μM, and the primers complementary to the REN277O05 marker have a final concentration of μM. The primers complementary to the FH2201 marker have a final concentration of μM, the primers complementary to the FH2060 marker have a final concentration of μM, and the primers complementary to the FH2097 marker have a final concentration of μM , the primers complementary to the FH2582 marker have a final concentration of μM, the primers complementary to the FH2712 marker have a final concentration of μM, and the primers complementary to the FH2004 marker have a final concentration of μM. It can be characterized as having a concentration.

본 발명의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자를 분리(separate)하기 위한 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 실시한다.It is carried out using electrophoresis to separate the amplified alleles in the multiplex amplification product of the present invention.

전기영동은 분산된 공간적으로 동일한 전기장의 영향 하에 입자의 움직임의 흐름에 관한 것이다(Lyklema, J. (1995). Fundamentals of Interface and Colloid Science. vol. 2. p. 3.208; Hunter, R.J. (1989). Foundations of Colloid Science. Oxford University Press; Dukhin, S.S.; B.V. Derjaguin (1974). Electrokinetic Phenomena. J. Willey and Sons; Russel, W.B.; D.A. Saville and W.R. Schowalter (1989). Colloidal Dispersions. Cambridge University Press; Kruyt, H.R. (1952). Colloid Science. Volu El1, Irreversible systems. Elsevier 및 Dukhin, A.S.; P.J. Goetz (2002). Ultrasound for characterizing colloids. Elsevier). 전기영동의 종류로는 친화성 전기영동(Affinity electrophoresis), 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis) 및 겔 전기영동(Gel electrophoresis) 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.Electrophoresis relates to the flow of motion of particles under the influence of a dispersed spatially equal electric field (Lyklema, J. (1995). Fundamentals of Interface and Colloid Science. vol. 2. p. 3.208; Hunter, R.J. (1989)). Foundations of Colloid Science, Oxford University Press; Dukhin, S.S.; B.V. Derjaguin (1974), Electrokinetic Phenomena, J. Willey and Sons; Russel, W.B.; , H. R. (1952). Colloid Science. Volu El1, Irreversible systems. Elsevier and Dukhin, A. S.; P. J. Goetz (2002). Ultrasound for characterizing colloids. Elsevier). Examples of electrophoresis include affinity electrophoresis, capillary electrophoresis, and gel electrophoresis, but are not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자를 분리하기 위한 모세관 전기영동을 이용하여 실시한다. 상기 모세관 전기영동은 전하를 띄고 있는 이온들에 전기장을 걸어주어 각 이온들은 반대전하를 띤 전극으로 이동하는 데 이때의 이동속도는 각 이온들의 평균 전하, 크기, 모양, 용매의 성질에 따라 달라진다. 모세관 전기영동은 이온들이 가느다란 관을 통하여 존재하도록 한 상태에서 관의 양끝에 전기장을 걸어 줄 때 이온들이 관내에서 그들의 성질에 따라 각기 다른 속도로 일정한 방향성을 가지면서 이동하는 성질을 이용하여 물질을 분리하는 장치이다.According to an embodiment of the present invention, it is carried out using capillary electrophoresis for separating the amplified allele from the multiplex amplification product of the present invention. In the capillary electrophoresis, an electric field is applied to the charged ions, and each ion moves to the oppositely charged electrode. In capillary electrophoresis, when an electric field is applied to both ends of a tube while allowing ions to exist through a thin tube, the It is a device that separates

본 발명은 다른 관점에서, FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX 및 DogY로 구성된 14개의 초위성체 마커(microsatellite marker) 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 포함하는 개 초위성체 마커 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention can amplify each of the 14 microsatellite markers consisting of FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX and DogY. It relates to a multiplex gene amplification kit for analysis of canine supersatellite markers, including primers.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 반응 완충액, DNA 중합 효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 중합 효소는 예를 들어, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합 효소일 수 있다. 또한, 반응 완충액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물로서, 이러한 완충 용액들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Tris, Tricine, MOPS, 또는 HEPES일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 이 외에도, 상기 키트는 필요에 따라, DNA 중합 효소 조인자를 더 포함할 수 있다.In the present invention, the kit may further include a reaction buffer, a DNA polymerase, and dNTP (a mixture containing dATP, dCTP, dGTP and dTTP). The DNA polymerase may be, for example, a thermostable DNA polymerase obtained from Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu). In addition, reaction buffers are compounds added to an amplification reaction that modify the stability, activity, and/or lifetime of one or more components of the amplification reaction by adjusting the pH of the amplification reaction, such buffers are well known in the art, For example, but not limited to, Tris, Tricine, MOPS, or HEPES. In addition to this, the kit may further include a DNA polymerase cofactor, if necessary.

본 발명은 또다른 관점에서, (a) 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;In another aspect, the present invention comprises the steps of (a) isolating genomic DNA from a sample;

(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제9항의 키트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (b) using the isolated genomic DNA as a template and amplifying a target sequence using the kit of claim 9; and

(c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 개 객체식별 또는 혈족 확인방법에 관한 것이다.(c) it relates to a dog object identification or blood relative confirmation method comprising the step of detecting the amplification product.

본 발명에 있어서, 상기 증폭은 멀티플렉스 PCR을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the amplification may be characterized in that it is performed using multiplex PCR.

본 발명에 있어서, 상기 증폭산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the detection of the amplification product may be characterized in that it is performed through a DNA chip, gel electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence measurement, or phosphorescence measurement.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1. 시료에서 DNA 샘플 수득Example 1. Obtaining a DNA sample from a sample

시료가 털 또는 구강상피세포일 경우에는 하기의 방법으로 DNA 샘플을 수득하였다(E-Prep DNA extraction solution, Viagen Biotech):When the sample was hair or oral epithelial cells, a DNA sample was obtained by the following method (E-Prep DNA extraction solution, Viagen Biotech):

시료에 E-Prep Solution(Viagen Biotech) 100-200μl를 첨가한 다음, Porteinase K(20mg/ml, Sigma Aldrich) 10μl를 첨가한 뒤, 섞어 원심분리를 수행한 다음, 튜브 기벽에 모인 시료를 모은 후 63℃ 항온 수조에서 20분간 배양하고, 다시 85℃ 항온수조에서 15분간 배양한 뒤, 13,000rpm/min으로 4분간 원심 분리하여 상등액 50-100μl를 회수하였다.100-200 μl of E-Prep Solution (Viagen Biotech) was added to the sample, and then 10 μl of Porteinase K (20 mg/ml, Sigma Aldrich) was added, mixed and centrifuged. After collecting the samples collected on the tube wall, Incubated in a water bath at 63° C. for 20 minutes, incubated in a water bath at 85° C. for 15 minutes, and centrifuged at 13,000 rpm/min for 4 minutes to recover 50-100 μl of the supernatant.

시료가 모근, 구강 상피세포가 아닌 경우에는 하기의 방법으로 DNA 샘플을 수득하였다(Qiagen human genomic DNA extraction kit, Qiagen, USA): When the sample was not hair root or oral epithelial cells, a DNA sample was obtained by the following method (Qiagen human genomic DNA extraction kit, Qiagen, USA):

시료에 ATL buffer(Qiagen, USA) 350-400μl를 주입한 다음, 56℃ 항온수조에서 1시간 배양하고, 상등액 전체를 회수하여 다른 튜브에 옮겨 담은 후, AL buffer(Qiagen, USA 350-400μl를 첨가한 다음 70℃ 항온수조에서 10분간 배양한 후, 100% 에탄올 200μl를 첨가하였다. 상기 용액을 column에 넣어 13,000rpm 으로 1분간 원심분리하여 collection tube에 담긴 용액은 버리고 column에 AW1 buffer 650μl를 첨가한 뒤, 13,000rpm 으로 1분간 원심분리한 뒤, collection tube에 담긴 용액을 버린 다음, 상기 과정을 2회 반복하였다. 세척된 column을 1.5ml 튜브에 끼운 다음, 3차 증류수 20μl를 첨가하고 상온에서 5분간 배양한 뒤, 13,000rpm으로 1분간 원심부리하여 최종 genomic DNA를 수득하였다.After injecting 350-400 μl of ATL buffer (Qiagen, USA) into the sample, incubating it for 1 hour in a water bath at 56°C, recovering the entire supernatant, transferring it to another tube, and adding 350-400 μl of AL buffer (Qiagen, USA) After incubation for 10 minutes in a water bath at 70° C., 200 μl of 100% ethanol was added. The solution was put into the column, centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute, the solution in the collection tube was discarded, and 650 μl of AW1 buffer was added to the column. After centrifugation at 13,000 rpm for 1 minute, the solution contained in the collection tube was discarded, and then the above process was repeated twice The washed column was inserted into a 1.5 ml tube, then 20 μl of tertiary distilled water was added and 5 at room temperature. After incubation for a minute, the final genomic DNA was obtained by centrifugation at 13,000 rpm for 1 minute.

실시예 2. 멀티플렉스 시스템을 이용한 마커 증폭Example 2. Marker amplification using a multiplex system

FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX 및 DogY의 14개의 초위성체 마커들을 포함하는 세트에서 각각의 마커에 대응되는, 프라이머들 및 형광물질로 표지된 프라이머들을 포함하는 멀티플렉스 PCR 시스템을 사용하여 DNA 샘플 내 서열을 PCR 증폭하였다.Primers and fluorophores, corresponding to each marker in a set containing 14 supersatellite markers: FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX and DogY The sequence in the DNA sample was PCR amplified using a multiplex PCR system including primers labeled with .

PCR 반응물은 27.2μl를 기준으로 10X 버퍼 1.8μl, 시료 DNA 20ng(2.0μ), 10X 프라이머 세트 6.6μl, dNTP 1.2μl, Taq 0.6μl, DW 나머지의 부피로 제작하였다.The PCR reaction was prepared with 27.2 μl of 10X buffer 1.8 μl, sample DNA 20ng (2.0 μl), 10X primer set 6.6 μl, dNTP 1.2 μl, Taq 0.6 μl, and the remaining volume of DW.

각 프라이머 세트별 서열 정보 및 증폭산물 크기는 하기 표 1과 같다.The sequence information and amplification product size for each primer set are shown in Table 1 below.

프라이머 세트 정보Primer Set Information DYEDYE NO.NO. LOCUSLOCUS SEQUENCE (5' → 3')SEQUENCE (5' → 3') 서열번호SEQ ID NO: Size rangesize range
(bp)(bp) FAMFAM
(Blue)(Blue) 1One FH2054-FFH2054-F GCCTTATTCATTGCAGTTAGGGGCCTTATTCATTGCAGTTAGGG 1One 148-180148-180 FH2054-RFH2054-R GTTTCTATGCTGAGTTTTGAACTTTCCCGTTTCTATGCTGAGTTTTGAACTTTCCC 22 22 DogY-FDogY-F AACTGACTGGGAAGGGGACAAACTGACTGGGAAGGGGACA 33 201201 DogY-RDogY-R GTTTCTCACTCCTGTGACTGACTAACCAGTTTCTCACTCCTGTGACTGACTAACCA 44 33 FH2010-FFH2010-F AAATGGAACAGTTGAGCATGCAAATGGAACAGTTGAGCATGC 55 220-248220-248 FH2010-RFH2010-R GTTTCTCCCCTTACAGCTTCATTTTCCGTTTCTCCCCTTACAGCTTCATTTTCC 66 44 DogX-FDogX-F GCACACTACATGAGCTCGGTGCACACTACATGAGCTCGGT 77 323323 DogX-RDogX-R GTTTCTGAGACAGCATGCCCTAGTGGGTTTCTGAGACAGCATGCCCTAGTGG 88 VICVIC
(Green)(Green) 55 FH3372-FFH3372-F AGTGCCTTTGAATGTTAATGCAGTGCCTTTGAATGTTAATGC 99 142-162142-162 FH3372-RFH3372-R GTTTCTACATCAAAATGGTTACACTTGGGTTTCTACATCAAAATGGTTACACTTGG 1010 66 REN01O23-FREN01O23-F TTCCCTGCAGCCCTTCCTCATTCCCTGCAGCCCTTCCTCA 1111 185-203185-203 REN01O23-RREN01O23-R CAGTTCATCCTTCCCCCTCTCCAGTTCATCCTTCCCCCTCTC 1212 77 REN51C16-FREN51C16-F CATTGCAATGTGTATACTCAGAAACCATTGCAATGTGTATACTCAGAAAC 1313 246-264246-264 REN51C16-RREN51C16-R GTTTCTGTGCTAGTCTGGCTGTGCTCAGTTTCTGTGCTAGTCTGGCTGTGCTCA 1414 88 REN277O05-FREN277O05-F CCTCCTCTCACTTGTCCTGCCCTCCTCTCACTTGTCCTGC 1515 320-340320-340 REN277O05-RREN277O05-R GTTTCTAAATGGTGTCTTCAGCTCCGGTTTCTAAATGGTGTCTTCAGCTCCG 1616 NEDNED
(Yellow)(Yellow) 99 FH2201-FFH2201-F ATCAACAATGCATGCCACATATCAACAATGCATGCCACAT 1717 148-191148-191 FH2201-RFH2201-R GTTTCTGAGAACAAATAAATGCAAGCCCGTTTCTGAGAACAAATAAATGCAAGCCC 1818 1010 FH2060-FFH2060-F GTTTTGAGGAAGCCTTGCTGGTTTTGAGGAAGCCTTGCTG 1919 217-229217-229 FH2060-RFH2060-R GTTTCTGAAGGAAGGGGCCAGTATTCGTTTCTGAAGGAAGGGGCCAGTATTC 2020 1111 FH2097-FFH2097-F CAATGTCGAATTCCATGGTGCAATGTCGAATTCCATGGTG 2121 268-300268-300 FH2097-RFH2097-R GTTTCTATGGAGCAAGATGTGTTTGTGGTTTCTATGGAGCAAGATGTTGTTTGTG 2222 1212 FH2582-FFH2582-F TGGAGTGTGTTCCAAGGTCATGGAGTGTGTTCCAAGGTCA 2323 342-386342-386 FH2582-RFH2582-R GTTTCTGTTGTTCCCACAAAAGGCAGGTTTCTGTTGTTCCCACAAAAGGCAG 2424 PETPET
(Red)(Red) 1313 FH2712-FFH2712-F AAGGTAGTCCCACGATCCTCAAGGTAGTCCCACGATCCTC 2525 170-186170-186 FH2712-RFH2712-R GTTTCTGAGCCCTGTTCTCAGGTTGGTTTTCTGAGCCCTGTTCTCAGGTTG 2626 1414 FH2004-FFH2004-F CTAAGTGGGGAGCCTCCTCTCTAAGTGGGGAGCCTCCTCT 2727 236-310236-310 FH2004-RFH2004-R GTTTCTACTGTGACCTACTGAGGTTGCAGTTTCTACTGTGACCTACTGAGGTTGCA 2828

멀티플렉스 PCR 반응은 하기의 조건으로 수행하였다.The multiplex PCR reaction was performed under the following conditions.

Veriti Thermal Cycler (ABI, USA) 혹은 이에 상응하는 성능을 지닌 기기Veriti Thermal Cycler (ABI, USA) or equivalent

(1) 초기반응(predenaturation): 95℃ 15분(1) Initial reaction (predenaturation): 95 ℃ 15 minutes

(2) 증폭반응(denaturation, amplification, extension): 39회 사이클링(2) amplification reaction (denaturation, amplification, extension): 39 cycles

94℃ 1분 →60℃ 1분 15초 →72℃ 1분 -> 9회94℃ 1min →60℃ 1min 15sec →72℃ 1min -> 9 times

94℃ 1분 →59℃ 1분 15초 →72℃ 1분 -> 5회94℃ 1min →59℃ 1min 15sec →72℃ 1min -> 5 times

94℃ 1분 →58℃ 1분 15초 →72℃ 1분 -> 25회94℃ 1min →58℃ 1min 15sec →72℃ 1min -> 25 times

(3) 최종연장(Final extension): 65℃ 30분(3) Final extension: 65℃ 30 minutes

(4) 냉각(Chilling): 4℃ 지속(4) Chilling: 4℃ continuous

실시예 3. 마커 대립 유전자 분석Example 3. Marker Allele Analysis

3130XL Genetic Analyzer (ABI, USA), 3730XL Genetic Analyzer (ABI, USA) 및 3500 or 3500XL Genetic Analyzer (ABI, USA)를 이용하여 모세관(capillary) 전기영동을 이용하여 증폭산물의 크기를 결정하였다.The size of the amplified product was determined by capillary electrophoresis using 3130XL Genetic Analyzer (ABI, USA), 3730XL Genetic Analyzer (ABI, USA), and 3500 or 3500XL Genetic Analyzer (ABI, USA).

실시예 2에서 수득한 증폭 산물 1μl와 allelic ladder 1μl를 준비한 다음, Hi-Di formamide 9.3μl와 GeneScan-500 LIZ(ABI, USA) 0.05μl를 혼합하고, 상기 증폭 산물 및 래더를 각각 첨가하고 95℃에서 3분간 denaturation 시킨 후, 상기 혼합물을 분석 장비의 모세관에 주입하고, 전기영동에 의해 전개가 완료된 증폭산물을 GeneMapper ID v3.2(ABI, USA) 또는 GeneMApper ID-X(ABI, USA)를 이용하여 래더를 기반으로 크기를 결정하였다.1 μl of the amplification product obtained in Example 2 and 1 μl of the allelic ladder were prepared, then 9.3 μl of Hi-Di formamide and 0.05 μl of GeneScan-500 LIZ (ABI, USA) were mixed, and the amplification product and the ladder were added respectively at 95°C. After denaturation for 3 minutes, the mixture was injected into the capillary of the analysis equipment, and the amplification product developed by electrophoresis was used GeneMapper ID v3.2 (ABI, USA) or GeneMapper ID-X (ABI, USA) Therefore, the size was determined based on the ladder.

그 결과 도 2에 개시된 바와 같이 표 1의 프라이머 세트를 사용할 경우, 특정 샘플에 대한 초위성체 마커를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the supersatellite marker for a specific sample could be detected with high sensitivity and accuracy when the primer set of Table 1 was used as shown in FIG. 2 .

실시예 4. 종별 대립유전자 수 식별Example 4. Identification of the number of alleles by species

enotyper Software에 의해 결정된 초위성체 표지인자(Microsaellite Marker)별 대립 유전자들은 마이크로새틀라이트 툴킷 소프트웨어(microsatellite Toolkit software, Pa가, 2000)를 이용하여 각 표지인자의 6품종에 대한 기대 및 관측 이형접합율과 PIC 값을 통하여 표 2와 같이 종별 다양성을 확인하였다.The alleles for each Microsatellite Marker determined by the enotyper Software were analyzed using the microsatellite Toolkit software (Paga, 2000) to predict and observed heterozygosity for each of the six varieties of each marker. Species diversity was confirmed as shown in Table 2 through PIC values.

종별 대립유전자수Number of alleles by species 초위성체 마커Supersatellite markers 대립유전자수
(전체품종)number of alleles
(All varieties) 대립유전자수
(진도개)number of alleles
(Jindogae) 대립유전자수
(동경이개)number of alleles
(Donggyeong-gae) 대립유전자수
(삽살개)number of alleles
(sapsalgae) 대립유전자수
(풍산개)number of alleles
(Poongsan dog) 대립유전자수
(레트리버)number of alleles
(Retriever) 대립유전자수
(세퍼트)number of alleles
(Separt) 이형접합율
총값Heterobonding rate
total value FH2054FH2054 9 9 6 6 7 7 7 7 8 8 4 4 8 8 0.804 0.804 FH2010FH2010 6 6 2 2 4 4 5 5 4 4 3 3 5 5 0.628 0.628 FH3372FH3372 7 7 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 4 4 0.663 0.663 REN01O23REN01O23 6 6 2 2 3 3 4 4 4 4 4 4 3 3 0.557 0.557 REN51C16REN51C16 9 9 3 3 5 5 4 4 5 5 3 3 3 3 0.587 0.587 REN277O05REN277O05 4 4 1 One 2 2 2 2 4 4 3 3 2 2 0.393 0.393 FH2201FH2201 7 7 5 5 3 3 3 3 4 4 5 5 6 6 0.666 0.666 FH2060FH2060 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0.616 0.616 FH2097FH2097 9 9 5 5 5 5 5 5 4 4 5 5 5 5 0.751 0.751 FH2582FH2582 12 12 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 5 5 0.828 0.828 FH2712FH2712 10 10 5 5 7 7 5 5 5 5 4 4 6 6 0.786 0.786 FH2004FH2004 8 8 3 3 4 4 4 4 7 7 2 2 4 4 0.684 0.684

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 구체적인 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those of ordinary skill in the art, it is clear that such a specific description is only a specific embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

SEQUENCE LISTING <110> TNT Research Co., Ltd. <120> Method and Kit for Analyzing Canine Subject Microsatellite Marker by using Multiplex System <130> P19-B334 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> FH2054-F <400> 1 gccttattca ttgcagttag gg 22 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> FH2054-R <400> 2 gtttctatgc tgagttttga actttccc 28 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> DogY-F <400> 3 aactgactgg gaaggggaca 20 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> DogY-R <400> 4 gtttctcact cctgtgactg actaacca 28 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> FH2010-F <400> 5 aaatggaaca gttgagcatg c 21 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> FH2010-R <400> 6 gtttctcccc ttacagcttc attttcc 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> DogX-F <400> 7 gcacactaca tgagctcggt 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> DogX-R <400> 8 gtttctgaga cagcatgccc tagtgg 26 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> FH3372-F <400> 9 agtgcctttg aatgttaatg c 21 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> FH3372-R <400> 10 gtttctacat caaaatggtt acacttgg 28 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> REN01O23-F <400> 11 ttccctgcag cccttcctca 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> REN01O23-R <400> 12 cagttcatcc ttccccctct c 21 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> REN51C16-F <400> 13 cattgcaatg tgtatactca gaaac 25 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> REN51C16-R <400> 14 gtttctgtgc tagtctggct gtgctca 27 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> REN277O05-F <400> 15 cctcctctca cttgtcctgc 20 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> REN277O05-R <400> 16 gtttctaaat ggtgtcttca gctccg 26 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> FH2201-F <400> 17 atcaacaatg catgccacat 20 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> FH2201-R <400> 18 gtttctgaga acaaataaat gcaagccc 28 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> FH2060-F <400> 19 gttttgagga agccttgctg 20 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> FH2060-R <400> 20 gtttctgaag gaaggggcca gtattc 26 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> FH2097-F <400> 21 caatgtcgaa ttccatggtg 20 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> FH2097-R <400> 22 gtttctatgg agcaagatgt gtttgtg 27 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> FH2582-F <400> 23 tggagtgtgt tccaaggtca 20 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> FH2582-R <400> 24 gtttctgttg ttcccacaaa aggcag 26 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> FH2712-F <400> 25 aaggtagtcc cacgatcctc 20 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> FH2712-R <400> 26 gtttctgagc cctgttctca ggttg 25 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> FH2004-F <400> 27 ctaagtgggg agcctcctct 20 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> FH2004-R <400> 28 gtttctactg tgacctactg aggttgca 28 SEQUENCE LISTING <110> TNT Research Co., Ltd. <120> Method and Kit for Analyzing Canine Subject Microsatellite Marker by using Multiplex System <130> P19-B334 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> FH2054-F <400> 1 gccttattca ttgcagttag gg 22 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> FH2054-R <400> 2 gtttctatgc tgagttttga actttccc 28 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> DogY-F <400> 3 aactgactgg gaaggggaca 20 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> DogY-R <400> 4 gtttctcact cctgtgactg actaacca 28 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> FH2010-F <400> 5 aaatggaaca gttgagcatg c 21 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> FH2010-R <400> 6 gtttctcccc ttacagcttc attttcc 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> DogX-F <400> 7 gcacactaca tgagctcggt 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> DogX-R <400> 8 gtttctgaga cagcatgccc tagtgg 26 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> FH3372-F <400> 9 agtgcctttg aatgttaatg c 21 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> FH3372-R <400> 10 gtttctacat caaaatggtt acacttgg 28 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> REN01O23-F <400> 11 ttccctgcag cccttcctca 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> REN01O23-R <400> 12 cagttcatcc ttccccctct c 21 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> REN51C16-F <400> 13 cattgcaatg tgtatactca gaaac 25 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> REN51C16-R <400> 14 gtttctgtgc tagtctggct gtgctca 27 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> REN277O05-F <400> 15 cctcctctca cttgtcctgc 20 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> REN277O05-R <400> 16 gtttctaaat ggtgtcttca gctccg 26 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> FH2201-F <400> 17 atcaacaatg catgccacat 20 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> FH2201-R <400> 18 gtttctgaga acaaataaat gcaagccc 28 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> FH2060-F <400> 19 gttttgagga agccttgctg 20 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> FH2060-R <400> 20 gtttctgaag gaaggggcca gtattc 26 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> FH2097-F <400> 21 caatgtcgaa ttccatggtg 20 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> FH2097-R <400> 22 gtttctatgg agcaagatgt gtttgtg 27 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> FH2582-F <400> 23 tggagtgtgt tccaaggtca 20 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> FH2582-R <400> 24 gtttctgttg ttcccacaaa aggcag 26 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> FH2712-F <400> 25 aaggtagtcc cacgatcctc 20 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> FH2712-R <400> 26 gtttctgagc cctgttctca ggttg 25 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> FH2004-F <400> 27 ctaagtgggg agcctcctct 20 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> FH2004-R <400> 28 gtttctactg tgacctactg aggttgca 28

Claims (14)

(a) DNA 시료를 FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX 및 DogY로 구성된 14개의 초위성체 마커(microsatellite marker) 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 이용하여 상기 14개의 초위성체 마커를 멀티플렉스 증폭하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭산물을 이용하여 상기 마커의 대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는
멀티플렉스 초위성체 마커 유전자 증폭을 이용한 진도개, 동경이개, 삽살개, 풍산개, 레트리버 및 세퍼트로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 개 유전자 감식방법.
(a) DNA sample capable of amplifying each of the 14 microsatellite markers consisting of FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX and DogY multiplex amplifying the 14 supersatellite markers using primers; and
(b) determining the allele of the marker using the multiplex amplification product of step (a);
A method for identifying genes of one or more dogs selected from the group consisting of Jindo dog, Donggyeong dog, Sapsal dog, Poongsan dog, Retriever, and Shepherd using multiplex supersatellite marker gene amplification.
제1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 개 유전자 감식방법.
The dog gene identification method according to claim 1, wherein the primer is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 28.
제1항에 있어서, 상기 프라이머는 형광염료로 표지되는 것을 특징으로 하는 개 유전자 감식방법.
The method of claim 1, wherein the primer is labeled with a fluorescent dye.
제1항에 있어서, 상기 프라이머는 둘 이상의 그룹으로 나누어서 서로 다른 형광 염료로 표지되는 것을 특징으로 하는 개 유전자 감식방법
The method of claim 1, wherein the primers are divided into two or more groups and labeled with different fluorescent dyes.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
FH2054, DogY, FH2010 및 DogX로 구성된 초위성체 마커를 증폭할 수 있는 프라이머는 제1형광 염료로 표지되고; FH3372, REN01O23, REN51C16 및 REN277O05로 구성된 초위성체 마커를 증폭할 수 있는 프라이머는 제2형광 염료로 표지되며; FH2201, FH2060, FH2097 및 FH2582로 구성된 초위성체 마커를 증폭할 수 있는 프라이머는 제3형광 염료로 표지되고; 및 FH2712 및 FH2004로 구성된 초위성체 마커를 증폭할 수 있는 프라이머는 제4형광 염료로 표지되며, 상기 제1형광 염료, 제2형광 염료, 제3형광 염료 및 제4형광 염료는 서로 상이한 것을 특징으로 하는 개 유전자 감식방법.
5. The method according to any one of claims 1 to 4,
Primers capable of amplifying supersatellite markers consisting of FH2054, DogY, FH2010 and DogX are labeled with a first fluorescent dye; Primers capable of amplifying the supersatellite markers consisting of FH3372, REN01O23, REN51C16 and REN277O05 are labeled with a second fluorescent dye; Primers capable of amplifying supersatellite markers composed of FH2201, FH2060, FH2097 and FH2582 are labeled with a third fluorescent dye; and a primer capable of amplifying a supersatellite marker composed of FH2712 and FH2004 is labeled with a fourth fluorescent dye, and the first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye, and the fourth fluorescent dye are different from each other. dog genetic identification method.
제5항에 있어서, 상기 제 1 형광 염료, 상기 제 2 형광 염료, 상기 제 3 형광 염료 및 상기 제 4 형광 염료는 각각 6-FAM, VIC, NED 및 PET로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 개 유전자 감식방법.
6. The method of claim 5, wherein the first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye and the fourth fluorescent dye are each selected from the group consisting of 6-FAM, VIC, NED and PET. Dog genetic identification method.
제1항에 있어서, 상기 DNA 시료는 혈액, 정액, 털, 타액, 소변, 대변, 구강세포, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 분리된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 개 유전자 감식방법.
According to claim 1, wherein the DNA sample is a DNA sample isolated from a tissue selected from the group comprising blood, semen, hair, saliva, urine, feces, oral cells, placental cells or amniotic fluid containing fetal cells, and mixtures thereof. Dog genetic identification method, characterized in that.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 증폭산물은 120-400bp인 것을 특징으로 하는 증폭 산물인 것을 특징으로 하는 유전자 감식방법.
The gene identification method according to claim 1, wherein the amplification product of step (a) is an amplification product characterized in that it is 120-400 bp.
FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX 및 DogY로 구성된 14개의 초위성체 마커(microsatellite marker) 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 포함하는 진도개, 동경이개, 삽살개, 풍산개, 레트리버 및 세퍼트로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 개 초위성체 마커 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트.
14 microsatellite markers including primers capable of amplifying each of FH2054, FH2010, FH3372, REN01O23, REN51C16, REN277O05, FH2201, FH2060, FH2097, FH2582, FH2712, FH2004, DogX and DogY. A multiplex gene amplification kit for analysis of one or more canine supersatellite markers selected from the group consisting of Donggyeongigae, Sapsalgae, Poongsangae, Retriever and Shepherd.
제9항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 개 초위성체 마커 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트.
The multiplex gene amplification kit for analysis of canine supersatellite markers according to claim 9, wherein the primers are represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 28.
(a) 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제9항의 키트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 개 객체 식별방법.
(a) isolating genomic DNA from the sample;
(b) using the isolated genomic DNA as a template and amplifying a target sequence using the kit of claim 9; and
(c) detecting the amplification product, dog object identification method.
(a) 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제9항의 키트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 개 혈족 확인방법.
(a) isolating genomic DNA from the sample;
(b) using the isolated genomic DNA as a template and amplifying a target sequence using the kit of claim 9; and
(c) detecting the amplification product, a dog blood relative identification method.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 증폭은 멀티플렉스 PCR을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 11 or 12, wherein the amplification is performed using multiplex PCR.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 증폭산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 11 or 12, wherein the detection of the amplification product is performed through a DNA chip, gel electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence measurement, or phosphorescence measurement.

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