JP6754202B2 - K-ras gene amplification forward primer set, K-ras gene amplification kit, K-ras gene amplification method, polymorphism analysis method, and drug efficacy determination method - Google Patents

K-ras gene amplification forward primer set, K-ras gene amplification kit, K-ras gene amplification method, polymorphism analysis method, and drug efficacy determination method Download PDF

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本発明は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法に関する。 The present invention relates to a K-ras gene amplification forward primer set, a K-ras gene amplification kit, a K-ras gene amplification method, a polymorphism analysis method, and a drug efficacy determination method.

Ｋ−ｒａｓ遺伝子は、多くの悪性腫瘍において変異が認められる癌関連遺伝子である。大腸癌においては、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異の有無に基づく抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体薬の薬効予測が既に実用化されている。Ｋ−ｒａｓ遺伝子に変異を有する場合には、抗ＥＧＦＲ抗体薬の効果が期待できない可能性が高いと判断され、抗ＥＧＦＲ抗体薬の投与は推奨されない。 The K-ras gene is a cancer-related gene in which mutations are found in many malignant tumors. In colorectal cancer, the efficacy prediction of anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody drug based on the presence or absence of mutation in the K-ras gene has already been put into practical use. If there is a mutation in the K-ras gene, it is highly likely that the effect of the anti-EGFR antibody drug cannot be expected, and administration of the anti-EGFR antibody drug is not recommended.

Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異としては、コドン１２及び１３における変異が特に多い変異として知られている。うち、コドン１３の変異では、配列番号６のＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列において、塩基番号２２４の塩基のグアニン（ｇ）から、アデニン（a）への置換により、Ｋ−Ｒａｓタンパク質の１３番目のグリシン（Ｇ）が、アスパラギン酸（Ｄ）に変異するものが多い（Ｇ１３Ｄ変異）。 As mutations in the K-ras gene, mutations at codons 12 and 13 are known to be particularly common. Among them, in the mutation of codon 13, in the base sequence of the K-ras gene of SEQ ID NO: 6, the 13th K-Ras protein was substituted by replacing the base guanine (g) of base number 224 with adenine (a). Many glycins (G) are mutated to aspartic acid (D) (G13D mutation).

Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２及び１３における変異の検出方法としては、一般的に、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲにより増幅させ、検出対象配列における目的の変異の有無により切断作用が異なる制限酵素によってその増幅産物を切断し、電気泳動することでタイピングを行うＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphisms）解析（非特許文献１）、（２）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）により増幅させ、その全遺伝子配列を解析するダイレクトシークエンス法（非特許文献２）、（３）３’末端領域に目的の変異が位置するアリル特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ（Allele Specific Primer PCR）法（非特許文献３、非特許文献４）、（４）３’末端領域に目的の変異が位置するアリル特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の速度の差異によって変異を判断するアリル特異的リアルタイムＰＣＲ法（特許文献１）、等を挙げることができる。 As a method for detecting mutations in codons 12 and 13 of the K-ras gene, generally, (1) for the target DNA of a sample, the region corresponding to the detection target sequence is amplified by PCR, and the target mutation in the detection target sequence is obtained. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) analysis (Non-Patent Document 1), (2) Detection of target DNA of samples, in which the amplification product is cleaved by a limiting enzyme whose cleaving action differs depending on the presence or absence of Direct sequence method (Non-Patent Document 2) in which the region corresponding to the target sequence is amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) and the entire gene sequence is analyzed, (3) Allyl specificity in which the target mutation is located in the 3'terminal region. The ASP-PCR (Allele Specific Primer PCR) method (Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4), in which PCR is performed using a specific primer and mutation is determined by the presence or absence of amplification, (4) 3'end region of interest Examples thereof include an allyl-specific real-time PCR method (Patent Document 1) in which PCR is performed using an allyl-specific primer in which a mutation is located and the mutation is determined based on the difference in amplification rate.

しかし、これらの方法は、例えば、試料から抽出したＤＮＡの精製、電気泳動、制限酵素処理等多くの工程を要し手間やコストがかかってしまう。また、ＰＣＲを行った後、反応容器を一旦開封する必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入し、解析精度が低下する虞がある。さらに、自動化が困難であるため、大量のサンプルを解析することができない。また、上記（３）及び（４）では、３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーが使用されるが、感度及び特異性が充分ではないという問題もある。 However, these methods require many steps such as purification of DNA extracted from a sample, electrophoresis, and restriction enzyme treatment, which is troublesome and costly. Further, since it is necessary to open the reaction vessel once after performing PCR, the amplification product may be mixed in the next reaction system, and the analysis accuracy may be lowered. Moreover, it is not possible to analyze large numbers of samples due to the difficulty of automation. Further, in the above (3) and (4), a primer in which the target mutation is located in the 3'terminal region is used, but there is also a problem that the sensitivity and specificity are not sufficient.

手間やコストを低減し自動化するためには、近年、点突然変異の検出方法として、標的核酸とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：melting temperature）を解析する方法が実用化されている。このような方法は、例えば、Ｔｍ解析又は融解曲線解析と呼ばれている。これは、以下のような方法である。すなわち、まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡとプローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナルの変動によって検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することにより、点突然変異の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡとプローブとのＴｍ値（測定値）を測定し、得られた測定値が評価基準値と同じであればマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断できる。一方、測定値が評価基準値より低ければミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。そして、この方法によれば、自動化も可能である（特許文献２及び特許文献３）。 In recent years, in order to reduce labor and cost and automate, a method of analyzing the melting temperature (Tm) of a double-stranded nucleic acid formed from a target nucleic acid and a probe has been practically used as a method for detecting a point mutation. It has been transformed. Such a method is called, for example, Tm analysis or melting curve analysis. This is the following method. That is, first, a hybrid (double-stranded DNA) of the target single-stranded DNA of the detection sample and the probe is formed by using a probe complementary to the detection target sequence containing the point mutation to be detected. Subsequently, the hybrid forming body is heat-treated, and the dissociation (melting) of the hybrid due to an increase in temperature is detected by fluctuations in signals such as absorbance. Then, it is a method of determining the presence or absence of a point mutation by determining the Tm value based on the detection result. The Tm value increases as the homology of the hybrid form increases, and decreases as the homology decreases. Therefore, the Tm value (evaluation reference value) of the hybrid form of the detection target sequence containing the point mutation and the probe complementary thereto is obtained in advance, and the Tm value of the target single-stranded DNA of the detection sample and the probe is obtained. (Measured value) is measured, and if the obtained measured value is the same as the evaluation reference value, it can be determined that a match, that is, a point mutation exists in the target DNA. On the other hand, if the measured value is lower than the evaluation reference value, it can be determined that there is no mismatch, that is, no point mutation exists in the target DNA. Then, according to this method, automation is also possible (Patent Document 2 and Patent Document 3).

また、アリル特異的なプライマーの特異性を向上するためには、プライマーの３’末端から数えて３塩基目程度の位置にミスマッチ塩基を導入する、アニーリング温度を上げるなどの方法が取られるが、特異性を高める方法は通常は核酸増幅効率を低くするものである。核酸増幅効率が低くなると、十分な量の増幅産物が得られないため目的遺伝子の検出感度は低下する。
Ｇ１３Ｄ変異型のＫ−ｒａｓ遺伝子を検出する場合、被験検体中のＧ１３Ｄ変異型のＫ−ｒａｓ遺伝子のコピー数が、コドン１３が野生型であるＫ−ｒａｓ遺伝子のコピー数に対して十分に多ければ、このような特異性が高くないプライマーを用いた場合にも正しい判定が行われるかもしれない。
しかし、腫瘍等に由来するＧ１３Ｄ変異型のＫ−ｒａｓ遺伝子のコピー数が、正常組織に由来する野生型のＫ−ｒａｓ遺伝子のコピー数に対して著しく少ない場合には、コピー数が多い野生型のＫ−ｒａｓ遺伝子にＧ１３Ｄ変異型アリルに特異的なプライマーが結合して非特異的な核酸増幅が行われやすい。被験検体中のＧ１３Ｄ変異型のＫ−ｒａｓ遺伝子のコピー数が、コドン１３が野生型のＫ−ｒａｓ遺伝子のコピー数に対して著しく少ない場合としては、例えば、被験検体である腫瘍組織に正常組織が多く混入している場合や、被験検体として循環血中のＤＮＡを使用する場合、などが挙げられる。
一方で、Ｇ１３Ｄ変異型アリルに非特異的な増幅反応を抑制しようとすると、十分なコピー数が存在しないＧ１３Ｄ変異型アリルの核酸増幅は効率的に行われず、偽陰性を生じやすい。 Further, in order to improve the specificity of the allyl-specific primer, a method such as introducing a mismatched base at a position about the third base counting from the 3'end of the primer or raising the annealing temperature is taken. The method of increasing the specificity is usually to reduce the nucleic acid amplification efficiency. When the nucleic acid amplification efficiency is low, a sufficient amount of amplification product cannot be obtained, so that the detection sensitivity of the target gene is lowered.
When detecting the G13D mutant K-ras gene, the number of copies of the G13D mutant K-ras gene in the test sample should be sufficiently larger than the number of copies of the K-ras gene whose codon 13 is wild type. For example, correct judgment may be made even when such a primer with low specificity is used.
However, when the copy number of the G13D mutant K-ras gene derived from a tumor or the like is significantly smaller than the copy number of the wild type K-ras gene derived from normal tissue, the wild type with a large copy number A primer specific to G13D mutant allele binds to the K-ras gene of No. 1 and non-specific nucleic acid amplification is likely to occur. When the number of copies of the G13D mutant K-ras gene in the test sample is significantly smaller than the number of copies of the wild-type K-ras gene in codon 13, for example, normal tissue in the tumor tissue of the test sample. There are cases where a large amount of DNA is mixed, or when DNA in circulating blood is used as a test sample.
On the other hand, if an attempt is made to suppress an amplification reaction that is non-specific to the G13D mutant allele, nucleic acid amplification of the G13D mutant allele, which does not have a sufficient copy number, is not efficiently performed, and false negatives are likely to occur.

以上のように、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異型の検出においては、手間やコストを低減し自動化が可能であって、高い検出感度と特異性を有する技術が求められていた。 As described above, in the detection of a mutant type of K-ras gene, there has been a demand for a technique that can be automated by reducing labor and cost and has high detection sensitivity and specificity.

国際公開第２０１１／１０４６９５号International Publication No. 2011/104695 特許第３９６３４２２号公報Japanese Patent No. 3963422 国際公開第２０１１／０７１０４６号International Publication No. 2011/071046

Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌoｇｙ（１９９３）Ａｕｇ；１４３，ｐｐ５４５−５５４American Journal of Pathology (1993) Aug; 143, pp545-554 Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄ Ｊ.（２００９）Ａｐｒ；５０（２）,ｐp２６６−７２Yonsei Med J. (2009) Apr; 50 (2), pp266-72 日本消化器外科学会雑誌（１９９７）；３０（４）,ｐp８９７〜９００Journal of the Japanese Society of Gastroenterological Surgery (1997); 30 (4), pp897-900 日本大腸肛門病学会雑誌（１９９７）；５０,ｐp３３−４０Journal of Japanese Society of Colorectal and Anal Diseases (1997); 50, pp33-40

Ｇ１３Ｄ変異型のＫ−ｒａｓ遺伝子の検出感度を上げるためには、核酸増幅を行い、変異型及び野生型のコドン１３を含む領域をそれぞれ特異的に増幅する方法が考えられる。このようなアリル特異的な核酸増幅を行う場合、野生型とＧ１３Ｄ変異型の各アリルを特異的に増幅できること、及び、増幅が効率的に行われること、が増幅産物を用いて行う検出系の感度及び特異性の向上に大きく寄与する。前述した通り、アリル特異的な核酸増幅を行う場合には、アリル特異性と増幅効率との両立が課題となっている。
特に、高い検出感度を得るために高い効率で核酸増幅を行う必要がある場合には、アリル特異性と増幅効率との両立が高いレベルで要求されるため一層困難である。 In order to increase the detection sensitivity of the G13D mutant K-ras gene, a method of performing nucleic acid amplification and specifically amplifying the region containing the mutant and wild-type codon 13 can be considered. When such allyl-specific nucleic acid amplification is performed, it is possible to specifically amplify each of the wild-type and G13D mutant alleles, and the amplification is efficiently performed, which is a detection system performed using an amplification product. It greatly contributes to the improvement of sensitivity and specificity. As described above, when allyl-specific nucleic acid amplification is performed, compatibility between allyl-specificity and amplification efficiency is an issue.
In particular, when it is necessary to perform nucleic acid amplification with high efficiency in order to obtain high detection sensitivity, it is more difficult because both allyl specificity and amplification efficiency are required at a high level.

本発明は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域の核酸を、野生型又はＧ１３Ｄ変異型それぞれに特異性高く且つ高効率に増幅するためのフォワードプライマーセット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法を提供することを課題とする。 The present invention is a forward primer set for amplifying a nucleic acid in a region containing codon 13 of the K-ras gene with high specificity and high efficiency for each of the wild type and G13D mutant type, a K-ras gene amplification kit, and K. An object of the present invention is to provide a method for amplifying a -ras gene, a method for polymorphism analysis, and a method for determining drug efficacy.

上記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
＜１＞ 下記（１）、（２）又は（３）のフォワードプライマーセットである、核酸増幅法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅するためのＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセット：
（１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット、
（２）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット、
（３）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット。
＜２＞ ＜１＞に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセットを用いるＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法。
＜３＞ 試料中の核酸を鋳型として、前記Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセットを一反応液中で用いてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅すること、を含む＜２＞に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法。
＜４＞ ＜２＞又は＜３＞に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅することと、
前記増幅の増幅産物から得た一本鎖核酸と、前記増幅産物から得た一本鎖核酸にハイブリダイズするプローブとのハイブリッドを形成することと、
前記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、前記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動を測定することと、
前記シグナルの変動に基づいてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することと、を含む多型解析方法。
＜５＞ 前記増幅することと、前記ハイブリッドを形成することとが同時に進行する、＜４＞に記載の多型解析方法。
＜６＞ 前記プローブがＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域にハイブリダイズするプローブである、＜４＞又は＜５＞に記載の多型解析方法。
＜７＞ 前記プローブが蛍光標識化プローブである、＜４＞〜＜６＞のいずれか一つに記載の多型解析方法。
＜８＞ ＜４＞〜＜７＞のいずれか一つに記載の多型解析方法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することと、
前記解析で得た解析結果に基づいて薬剤の薬効を判定することと、を含む薬効判定方法。
＜９＞ 前記薬剤が抗上皮成長因子受容体抗体薬である、＜８＞に記載の薬効判定方法。
＜１０＞ ＜１＞に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセットを含む、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅するためのＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット。
＜１１＞ Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅するための１以上のリバースプライマーを含む、＜１０＞に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット。
＜１２＞ Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域にハイブリダイズするプローブを含む、＜１０＞又は＜１１＞に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット。
＜１３＞ 前記プローブが蛍光標識化プローブである、＜１２＞に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット。 The means for solving the above problems are as follows.
<1> A forward primer set for K-ras gene amplification for amplifying a region containing codon 13 of the K-ras gene by a nucleic acid amplification method, which is the forward primer set of (1), (2) or (3) below. :
(1) A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and a forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
Forward primer set, including
(2) A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
Forward primer set, including
(3) A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
Forward primer set including.
<2> A method for amplifying a K-ras gene using the forward primer set for amplifying a K-ras gene according to <1>.
<3> In <2>, the nucleic acid in the sample is used as a template, and the region containing the codon 13 of the K-ras gene is amplified by using the forward primer set for K-ras gene amplification in one reaction solution. The K-ras gene amplification method according to the above.
<4> Amplification of the region containing codon 13 of the K-ras gene by the K-ras gene amplification method according to <2> or <3>, and
To form a hybrid of a single-stranded nucleic acid obtained from the amplification product of the amplification and a probe that hybridizes to the single-stranded nucleic acid obtained from the amplification product.
By changing the temperature of the reaction solution containing the hybrid and measuring the fluctuation of the signal based on the dissociation state of the hybrid,
A polymorphism analysis method comprising analyzing a polymorphism of codon 13 of the K-ras gene based on the variation of the signal.
<5> The polymorphism analysis method according to <4>, wherein the amplification and the formation of the hybrid proceed at the same time.
<6> The polymorphism analysis method according to <4> or <5>, wherein the probe hybridizes to a region containing codon 13 of the K-ras gene.
<7> The polymorphism analysis method according to any one of <4> to <6>, wherein the probe is a fluorescently labeled probe.
<8> Analyzing the polymorphism of codon 13 of the K-ras gene by the polymorphism analysis method described in any one of <4> to <7>, and
A method for determining drug efficacy, which comprises determining the efficacy of a drug based on the analysis results obtained in the analysis.
<9> The method for determining efficacy according to <8>, wherein the drug is an anti-epidermal growth factor receptor antibody drug.
<10> A kit for K-ras gene amplification for amplifying a region containing codon 13 of the K-ras gene, which comprises the forward primer set for K-ras gene amplification according to <1>.
<11> The kit for K-ras gene amplification according to <10>, which comprises one or more reverse primers for amplifying a region containing codon 13 of the K-ras gene.
<12> The kit for K-ras gene amplification according to <10> or <11>, which comprises a probe that hybridizes to a region containing codon 13 of the K-ras gene.
<13> The kit for K-ras gene amplification according to <12>, wherein the probe is a fluorescently labeled probe.

本発明によれば、核酸増幅法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅するためのフォワードプライマーセット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法を提供することができる。 According to the present invention, a forward primer set for amplifying a region containing codon 13 of the K-ras gene by a nucleic acid amplification method, a kit for K-ras gene amplification, a K-ras gene amplification method, a polymorphism analysis method, and A method for determining drug efficacy can be provided.

（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は核酸混合物の微分融解曲線の一例である。(A) is an example of a melting curve of a nucleic acid mixture, and (B) is an example of a differential melting curve of a nucleic acid mixture. 野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含むテンプレートを用いて核酸増幅を行ったときのＴｍ値解析によって得た微分融解曲線である。It is a differential melting curve obtained by Tm value analysis when nucleic acid amplification was performed using a template containing a wild-type K-ras gene. 野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子に対してコピー数が０．３％となるようにＧ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含むテンプレートを用いて核酸増幅を行ったときのＴｍ値解析によって得た微分融解曲線である。A differential melting curve obtained by Tm value analysis when nucleic acid amplification was performed using a template containing the G13D mutant K-ras gene so that the number of copies was 0.3% of that of the wild-type K-ras gene. is there.

以下、本発明を実施するための形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, modes for carrying out the present invention will be described. However, the present invention is not limited to the following embodiments.

本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において組成物中のある成分の量について言及する場合、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（融解温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が吸光度全上昇分の５０％に達した時点の温度と定義される。二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度が加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって解離が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。 The numerical range indicated by using "~" in the present specification indicates a range including the numerical values before and after "~" as the minimum value and the maximum value, respectively.
In addition, when referring to the amount of a certain component in the composition in the present specification, when a plurality of substances corresponding to the component are present in the composition, the amount is referred to in the composition unless otherwise defined. It means the total amount of the plurality of substances present in.
Further, in the present specification, the term "process" is used not only for an independent process but also for this term as long as the intended purpose of the process is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other processes. included.
Further, in the present specification, the "Tm value" is the temperature at which the double-stranded nucleic acid is dissociated (melting temperature: Tm), and is generally the temperature at which the absorbance at 260 nm reaches 50% of the total increase in absorbance. Is defined as. As the solution containing double-stranded nucleic acid, for example, double-stranded DNA is heated, the absorbance at 260 nm increases. This is because the hydrogen bonds between the two strands in the double-stranded DNA are unwound by heating and dissociated into the single-stranded DNA (melting of the DNA). Then, when all the double-stranded DNA is dissociated into a single-stranded DNA, the absorbance thereof shows about 1.5 times the absorbance at the start of heating (the absorbance of only the double-stranded DNA), which causes dissociation. It can be judged that it is completed. The Tm value is set based on this phenomenon.

＜Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセット＞
本発明の一実施形態にかかるＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセット（以下、単に「本発明のフォワードプライマーセット」という。）は、下記フォワードプライマーセット（１）、（２）又は（３）であり、核酸増幅法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅するために用いられる。
フォワードプライマーセット（１）
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット、
フォワードプライマーセット（２）
配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット、
フォワードプライマーセット（３）
配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット。 <Forward primer set for K-ras gene amplification>
The forward primer set for K-ras gene amplification according to one embodiment of the present invention (hereinafter, simply referred to as “forward primer set of the present invention”) is the following forward primer set (1), (2) or (3). Yes, it is used to amplify the region containing codon 13 of the K-ras gene by the nucleic acid amplification method.
Forward primer set (1)
A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
Forward primer set, including
Forward primer set (2)
A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4,
Forward primer set, including
Forward primer set (3)
A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5,
Forward primer set including.

詳しくは後述するが、前記フォワードプライマーセット（１）〜（３）は、それぞれＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマーと、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のＧ１３Ｄ変異型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマーとを含む。
このような本発明のフォワードプライマーセットによれば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を野生型又は変異型それぞれについて特異性高く、且つ、高効率に増幅することができる。 As will be described in detail later, the forward primer sets (1) to (3) are a forward primer for specifically amplifying a region containing the wild-type codon 13 of the K-ras gene and a K-ras gene. It includes a forward primer for specifically amplifying the region containing the G13D mutant codon 13.
According to such a forward primer set of the present invention, the region containing the codon 13 of the K-ras gene can be amplified with high specificity and high efficiency for each of the wild type and the mutant type.

上記フォワードプライマーセット（１）〜（３）において、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーは、それぞれＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマーである。
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー及び配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーは、それぞれＫ−ｒａｓ遺伝子のＧ１３Ｄ変異型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマーである。 In the forward primer sets (1) to (3), the forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, are the K-ras genes, respectively. It is a forward primer for specifically amplifying a region containing a wild-type codon 13.
The forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, the forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and the forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, are K-ras, respectively. It is a forward primer for specifically amplifying the region containing codon 13 of the G13D variant of the gene.

Ｋ−ｒａｓ遺伝子において、野生型のコドン１３の塩基配列はＧＧＣであり、グリシン（Ｇ）をコードしている。Ｇ１３Ｄ変異型のコドン１３の塩基配列はＧＡＣであり、アスパラギン酸（Ｄ）をコードしている。 In the K-ras gene, the base sequence of wild-type codon 13 is GGC, which encodes glycine (G). The nucleotide sequence of codon 13 of the G13D variant is GAC, which encodes aspartic acid (D).

配列番号１〜配列番号５として示される塩基配列を以下に記載する。
・配列番号１： CTAGCtagttggagctggtgG
・配列番号２： CTAGCagttggagctggtgG
・配列番号３：TGCTCtggtagttggagctggtgA
・配列番号４： TGCTCggtagttggagctggtgA
・配列番号５： TGCTCgtagttggagctggtgA
配列番号１〜配列番号５において、３’末端の大文字で示されている塩基はＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型部位に対応する塩基である。また、５’末端の大文字で示されている塩基は、各プライマーのＫ−ｒａｓ遺伝子の結合領域には相補性を有さない、人工的に付加した配列である。 The nucleotide sequences shown as SEQ ID NOs: 1 to 5 are described below.
-SEQ ID NO: 1: CTAGCtagttggagctggtgG
-SEQ ID NO: 2: CTAGCagttggagctggtgG
-SEQ ID NO: 3: TGCTCtggtagttggagctggtgA
-SEQ ID NO: 4: TGCTCggtagttggagctggtgA
-SEQ ID NO: 5: TGCTCgtagttggagctggtgA
In SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5, the base indicated by the uppercase letter at the 3'end is the base corresponding to the polymorphic site of codon 13 of the K-ras gene. The base indicated by the uppercase letter at the 5'end is an artificially added sequence having no complementarity in the binding region of the K-ras gene of each primer.

配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーは、それぞれの３’末端の塩基がグアニン（Ｇ）であり、コドン１３野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のアンチセンス鎖の多型部位と相補性を有している。
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー及び配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーは、それぞれ３’末端の塩基がアデニン（Ａ）であり、Ｇ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のアンチセンス鎖の多型部位と相補性を有している。 The forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, each have a guanine (G) base at the 3'end and are codon 13 wild type. It has complementarity with the polymorphic site of the antisense strand of the K-ras gene.
The forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, the forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and the forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, are each at the 3'end. The base of is adenine (A), which is complementary to the polymorphic site of the antisense chain of the G13D mutant K-ras gene.

Ｋ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＧ＿００７５２４において、５００１番目〜５０６７５番目の領域として登録されている。配列番号６は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の部分配列であり、前記アクセッション番号の塩基配列において、１０３５１番目〜１０８５０番目の領域に相当する。前記コドン１３の配列は、前記アクセッション番号の塩基配列における１０５７３番目〜１０５７５番目の領域に相当する。
本発明のフォワードプライマーセットは、組織試料、全血試料等の生体試料におけるＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅する際に使用することが好ましい。 The base sequence of the K-ras gene is, for example, GenBank Accession No. In NG_007524, it is registered as the 5001st to 50675th regions. SEQ ID NO: 6 is a partial sequence of the K-ras gene, and corresponds to the 10351 to 10850th regions in the base sequence of the accession number. The sequence of the codon 13 corresponds to the 10573th to 10575th regions in the base sequence of the accession number.
The forward primer set of the present invention is preferably used when amplifying a region containing codon 13 of the K-ras gene in a biological sample such as a tissue sample or a whole blood sample.

＜Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅方法＞
本発明の一実施形態にかかるＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法（以下、単に「本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法」という。）は、試料中の核酸を鋳型として、前記フォワードプライマーセット（１）〜（３）のいずれか１つを用いて、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を野生型の及びＧ１３Ｄ変異型それぞれに特異的に増幅する方法である。前記Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅方法によれば、野生型のコドン１３又はＧ１３Ｄ変異型のコドン１３それぞれに特異性高く、且つ、高効率にＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅することができる。また、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法においては、本発明のフォワードプライマーセットを一反応液中で用いて核酸増幅を行うこともできる。 <K-ras gene amplification method>
The K-ras gene amplification method according to an embodiment of the present invention (hereinafter, simply referred to as “the K-ras gene amplification method of the present invention”) uses the nucleic acid in the sample as a template and the forward primer set (1) to This is a method of specifically amplifying a region containing the codon 13 of the K-ras gene for each of the wild type and the G13D mutant type by using any one of (3). According to the K-ras gene amplification method, a region containing codon 13 of the K-ras gene can be amplified with high specificity and high efficiency for each of the wild-type codon 13 and the G13D mutant codon 13. .. Further, in the K-ras gene amplification method of the present invention, nucleic acid amplification can also be performed using the forward primer set of the present invention in one reaction solution.

鋳型核酸を含む試料としては、例えば生体試料が挙げられる。生体試料としては、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液、あるいはそれらの懸濁液等が挙げられる。また、生体試料から単離した核酸を鋳型として用いてもよい。例えば、全血からのゲノムＤＮＡの単離には、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを使用することができる。また、生体試料に含まれるＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を鋳型として用いてもよい。あるいは、生体試料に含まれるＲＮＡから逆転写ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を鋳型として用いてもよい。 Examples of the sample containing the template nucleic acid include a biological sample. Biological samples include whole blood, oral cells such as oral mucosa, somatic cells such as nails and hair, germ cells, sputum, sheep water, paraffin-embedded tissue, urine, gastric juice, gastric lavage fluid, or suspensions thereof. Can be mentioned. Further, a nucleic acid isolated from a biological sample may be used as a template. For example, a commercially available genomic DNA isolation kit can be used to isolate genomic DNA from whole blood. Further, an amplification product obtained by amplifying DNA contained in a biological sample by a gene amplification method may be used as a template. Alternatively, a cDNA may be generated from RNA contained in a biological sample by a reverse transcription PCR reaction, and an amplification product obtained by amplifying this cDNA by a gene amplification method may be used as a template.

核酸増幅法は、特に制限されない。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でもＰＣＲ法が好ましい。 The nucleic acid amplification method is not particularly limited. Examples of the nucleic acid amplification method include a PCR method, a NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) method, a TMA (Transcription-Mediated Amplification) method, an SDA (Strand Displacement Amplification) method, and the like, and the PCR method is particularly preferable.

増幅において、増幅反応液における試料の添加割合は特に制限されない。具体例として、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の下限は、０．０１体積％以上であることが好ましく、０．０５体積％以上であることがより好ましく、０．１体積％以上であることがさらに好ましい。また、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の上限は、２体積％以下であることが好ましく、１体積％以下であることがより好ましく、０．５体積％以下であることがさらに好ましい。 In the amplification, the addition ratio of the sample in the amplification reaction solution is not particularly limited. As a specific example, when the sample is a biological sample (for example, a whole blood sample), the lower limit of the addition ratio is preferably 0.01% by volume or more, more preferably 0.05% by volume or more. It is more preferably 0.1% by volume or more. When the sample is a biological sample (for example, a whole blood sample), the upper limit of the addition ratio is preferably 2% by volume or less, more preferably 1% by volume or less, and 0.5% by volume or less. Is more preferable.

また、後述する多型解析方法において、例えば標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、上記反応液における生体試料の添加割合は、例えば、０．１体積％〜０．５体積％に設定することが好ましい。この範囲であれば、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、生体試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。 Further, in the polymorphism analysis method described later, for example, when performing optical detection using a labeled probe, the addition ratio of the biological sample in the reaction solution is set to, for example, 0.1% by volume to 0.5% by volume. It is preferable to do so. Within this range, for example, the influence of the generation of precipitates due to denaturation can be sufficiently prevented, and the measurement accuracy by the optical method can be improved. In addition, since the inhibition of PCR by impurities in the biological sample is sufficiently suppressed, it is expected that the amplification efficiency can be further improved.

また、増幅反応の開始前に、上記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物又は濁りの発生による影響をより一層低減でき、且つ、増幅効率もさらに向上する。
上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％〜２質量％であり、好ましくは０．１質量％〜１質量％であり、より好ましくは０．２質量％〜０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。 Further, it is preferable to further add albumin to the above reaction solution before the start of the amplification reaction. By adding such albumin, for example, the influence of the generation of precipitate or turbidity can be further reduced, and the amplification efficiency is further improved.
The addition ratio of albumin in the above reaction solution is, for example, 0.01% by mass to 2% by mass, preferably 0.1% by mass to 1% by mass, and more preferably 0.2% by mass to 0.8%. It is mass%. Examples of albumin include bovine serum albumin (BSA), human serum albumin, rat serum albumin, horse serum albumin and the like, and are not particularly limited. Any one of these albumins may be used, or two or more of these albumins may be used in combination.

以下、増幅についてＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本発明は、この例に制限されない。 Hereinafter, amplification will be described by taking the PCR method as an example, but the present invention is not limited to this example.

まず、鋳型核酸と本発明のフォワードプライマーセット及びＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の下流の領域にアニーリングするリバースプライマーとを含むＰＣＲ反応液を調製する。
ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。例えば、上記プライマーセット（１）、（２）又は（３）を用いたときの２つのフォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、２つのフォワードプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。リバースプライマーの添加割合は、０．０５μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。 First, a PCR reaction solution containing a template nucleic acid, a forward primer set of the present invention, and a reverse primer annealing to a region downstream of codon 13 of the K-ras gene is prepared.
The addition ratio of various primers in the PCR reaction solution is not particularly limited. For example, when the above primer sets (1), (2) or (3) are used, the total addition ratio of the two forward primers and the reverse primers is preferably 0.01 μmol / L to 50 μmol / L. More preferably, it is 0.5 μmol / L to 5 μmol / L.
The total addition ratio of the two forward primers is preferably 0.01 μmol / L to 10 μmol / L, and more preferably 0.1 μmol / L to 1 μmol / L. The addition ratio of the reverse primer is preferably 0.05 μmol / L to 50 μmol / L, and more preferably 0.5 μmol / L to 5 μmol / L.

ＰＣＲ反応液におけるフォワードプライマーセット及びリバースプライマーの含有比率は特に限定されない。増幅効率及び野生型又は変異型への特異性を高くする観点から、前記フォワードプライマーセット（１）、（２）又は（３）の合計モル量と前記リバースプライマーの合計モル量との比は、１：１〜１：１０であることが好ましく、１：２〜１：５であることがより好ましく、１：３〜１：４．５であることがさらに好ましい。 The content ratio of the forward primer set and the reverse primer in the PCR reaction solution is not particularly limited. From the viewpoint of increasing amplification efficiency and specificity for wild type or mutant type, the ratio of the total molar amount of the forward primer set (1), (2) or (3) to the total molar amount of the reverse primer is determined. It is preferably 1: 1 to 1:10, more preferably 1: 2 to 1: 5, and even more preferably 1: 3 to 1: 4.5.

また、前記フォワードプライマーセットに含まれる、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の野生型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマーと、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のＧ１３Ｄ変異型のコドン１３含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマーとのＰＣＲ反応液における含有比率は特に限定されない。増幅効率及び特異性を高くする観点から、０．５：２〜１：０．５であることが好ましく、０．８〜１．２：１．２〜０．８であることがさらに好ましい。特に好ましくは１：１である。 In addition, the forward primer for specifically amplifying the region containing the wild-type codon 13 of the K-ras gene and the region containing the G13D mutant codon 13 of the K-ras gene contained in the forward primer set are specifically selected. The content ratio in the PCR reaction solution with the forward primer for amplification is not particularly limited. From the viewpoint of increasing the amplification efficiency and specificity, it is preferably 0.5: 2 to 1: 0.5, and more preferably 0.8 to 1.2: 1.2 to 0.8. Especially preferably 1: 1.

ＰＣＲ反応液におけるその他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。他の組成成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチド、溶媒等が挙げられる。ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。 The other composition components in the PCR reaction solution are not particularly limited, and conventionally known components may be mentioned, and the proportion thereof is not particularly limited. Examples of other composition components include DNA polymerase, nucleotides such as nucleoside triphosphate (dNTP), and solvents. In the PCR reaction solution, the order of addition of each composition component is not limited in any way.

ＤＮＡポリメラーゼは特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４８８９８１８号明細書及び米国特許第５０７９３５２号明細書を参照）（Ｔａｑポリメラーゼ（商品名））、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９１／０９９５０号を参照）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９２／９６８９号を参照）（Pfu DNA polymerase；Strategene社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０４５５４３０号明細書を参照）（Ｖｅｎｔ（商標）；New England Biolabs社製）等が商業的に入手可能である。中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。 DNA polymerase is not particularly limited. For example, a conventionally known polymerase derived from a thermostable bacterium can be used. Specific examples include DNA polymerase derived from Thermus aquaticus (see US Pat. No. 4,888,818 and US Pat. No. 5,079,352) (Taq polymerase (trade name)), Thermus thermophilus. ) Derived DNA polymerase (see International Publication No. 91/09950) (rTth DNA polymerase), DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (see International Publication No. 92/9689) (Pfu DNA polymerase; manufactured by Strategene) ), DNA polymerase derived from Thermococcus litoralis (see European Patent No. 0455430) (Vent ™; manufactured by New England Biolabs) and the like are commercially available. Of these, a thermostable DNA polymerase derived from Thermus aquaticus is preferable.
The addition ratio of the DNA polymerase in the PCR reaction solution may be any ratio usually used in the art for the purpose of amplifying the target nucleic acid.

ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等）が挙げられる。ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）等の緩衝液が挙げられ、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が含まれていてもよい。 The nucleoside triphosphate usually includes dNTPs (eg, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP, etc.). The addition ratio of dNTP in the PCR reaction solution may be any ratio usually used in the art for the purpose of amplifying the target nucleic acid.
As the solvent, Tris-HCl, Tricine, MES (2-morpholinoethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), CAPS (N-cyclohexyl-3-). A buffer solution such as aminopropanesulfonic acid) may be mentioned, and a commercially available buffer solution for PCR or a buffer solution attached to a PCR kit may be used as it is.
In addition, the PCR reaction solution, glycerol, heparin, betaine, NaN 3, KCl, may include MgCl 2, MgSO 4, and the like.

ＰＣＲは、通常、（ｉ）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（解離工程）、（ｉｉ）プライマーの鋳型核酸へのアニーリング（アニーリング工程）、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（伸長工程）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程の条件は、例えば、９０℃〜９９℃、１秒間〜１２０秒間が好ましく、９２℃〜９５℃、１秒間〜６０秒間がより好ましい。アニーリング工程の条件は、例えば、４０℃〜７０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜７０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。また、伸長工程の条件は、例えば、５０℃〜８０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜８０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。
例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。 PCR usually involves (i) dissociating a double-stranded nucleic acid into a single-stranded nucleic acid (dissociation step), (ii) annealing a primer to a template nucleic acid (annealing step), and (iii) a nucleic acid from a primer by DNA polymerase. Includes three steps of sequence extension (extension step). The conditions of each step are not particularly limited. The conditions of the dissociation step are, for example, preferably 90 ° C. to 99 ° C. for 1 second to 120 seconds, and more preferably 92 ° C. to 95 ° C. for 1 second to 60 seconds. The conditions of the annealing step are, for example, preferably 40 ° C. to 70 ° C. for 1 second to 300 seconds, and more preferably 50 ° C. to 70 ° C. for 5 seconds to 60 seconds. The conditions of the stretching step are, for example, preferably 50 ° C. to 80 ° C. for 1 second to 300 seconds, and more preferably 50 ° C. to 80 ° C. for 5 seconds to 60 seconds. The number of cycles is not particularly limited. With 3 steps as one cycle, for example, 30 cycles or more are preferable. The upper limit is not particularly limited.
For example, the total is 100 cycles or less, preferably 70 cycles or less, and more preferably 50 cycles or less. The temperature change in each step may be automatically controlled by using, for example, a thermal cycler or the like. The annealing step and the extension step may be set to the same temperature condition, and PCR may be performed in two steps.

以上のようにして、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の野生型のコドン１３及び／又はＧ１３Ｄ変異型のコドン１３を含む領域がアリル特異的に増幅された増幅産物を得ることができる。 As described above, an amplification product in which the region containing the wild-type codon 13 and / or the G13D mutant codon 13 of the K-ras gene is allyl-specifically amplified can be obtained.

−リバースプライマー−
核酸増幅に使用するリバースプライマーは特に制限されず、従来公知の方法によって設定できる。当業者は、本発明の一実施形態にかかるフォワードプライマーセットと組み合わせてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域の核酸を増幅することができるリバースプライマーを得ることができる。
リバースプライマーは、本発明のフォワードプライマーセットに含まれるフォワードプライマーと近いＴｍ値に設定することが好ましい。例えば、フォワードプライマーのＴｍ値との差が１０℃以内に設定することが好ましく、５℃以内に設定することがより好ましい。Ｔｍ値の算出は後述の通りに行うことができる。このようなプライマーの設計手法は当業者に公知である。例えば、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ（http://sg.idtdna.com/calc/analyzer）などの設計ツールが公開されており、これらを用いることもできる。
増幅産物の塩基長は特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒに設定することができる。 -Reverse primer-
The reverse primer used for nucleic acid amplification is not particularly limited and can be set by a conventionally known method. One of ordinary skill in the art can obtain a reverse primer capable of amplifying nucleic acid in the region containing codon 13 of the K-ras gene in combination with the forward primer set according to the embodiment of the present invention.
The reverse primer is preferably set to a Tm value close to that of the forward primer contained in the forward primer set of the present invention. For example, the difference from the Tm value of the forward primer is preferably set within 10 ° C., and more preferably set within 5 ° C. The Tm value can be calculated as described later. Techniques for designing such primers are known to those skilled in the art. For example, design tools such as OligoAnalyzer (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer) are open to the public, and these can also be used.
The base length of the amplified product is not particularly limited, but can be set to, for example, 50 mer to 1000 mer or 80 mer to 200 mer.

本発明のフォワードプライマーセットと組み合わせてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域の核酸を増幅することができるリバースプライマーとして、具体的には以下に示される配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示されるが、これに限定されない。
・配列番号７：ggtcctgcaccagtaatatgca As a reverse primer capable of amplifying a nucleic acid in a region containing codon 13 of the K-ras gene in combination with the forward primer set of the present invention, specifically, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 shown below. Is exemplified, but is not limited to this.
-SEQ ID NO: 7: ggtcctgcaccagtaatatgca

リバースプライマーは、本発明のフォワードプライマーセットに含まれる、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の野生型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマー及びＧ１３Ｄ変異型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマーのそれぞれと組み合わせるリバースプライマーを２種類用いてもよい。しかし、効率性の観点から、野生型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマー及びＧ１３Ｄ変異型のコドン１３を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマーの両方と組み合わせることができる共通のプライマーを１種類用いることが好ましい。 The reverse primer specifically comprises the forward primer for specifically amplifying the region containing the wild-type codon 13 of the K-ras gene and the region containing the G13D mutant codon 13 contained in the forward primer set of the present invention. Two types of reverse primers may be used in combination with each of the forward primers for amplification. However, from the viewpoint of efficiency, it is combined with both a forward primer for specifically amplifying the region containing the wild-type codon 13 and a forward primer for specifically amplifying the region containing the G13D mutant codon 13. It is preferable to use one kind of common primer that can be used.

＜多型解析方法＞
本発明の一実施形態にかかる多型解析方法（以下、単に「本発明の多型解析方法」という。）は、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅する増幅工程と、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブとのハイブリッドを形成するハイブリッド形成工程と、上記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動を測定するシグナル測定工程と、上記シグナルの変動に基づいてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析する解析工程と、を含むものである。本発明の多型解析方法によれば、試料中の核酸を鋳型として、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の遺伝子多型部位が野生型である核酸及びＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の遺伝子多型部位がＧ１３Ｄ変異型である核酸を、同一反応液において同時に高効率且つ野生型又はＧ１３Ｄ変異型それぞれに特異性高く増幅し、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することができる。 <Polymorphism analysis method>
The polymorphism analysis method according to one embodiment of the present invention (hereinafter, simply referred to as “polymorphism analysis method of the present invention”) is a region containing the codon 13 of the K-ras gene by the K-ras gene amplification method of the present invention. And a hybrid of the single-stranded amplified nucleic acid of the amplification product obtained in the above amplification step and a probe capable of hybridizing to the region containing the polymorphic site of codon 13 of the K-ras gene. The hybrid formation step, the signal measurement step of changing the temperature of the reaction solution containing the hybrid and measuring the signal fluctuation based on the dissociation state of the hybrid, and the signal measurement step of measuring the variation of the signal based on the variation of the signal, and the codon 13 of the K-ras gene. It includes an analysis step for analyzing polymorphisms. According to the polymorphism analysis method of the present invention, using the nucleic acid in the sample as a template, the gene polymorphism site of codon 13 of the K-ras gene is a wild type and the gene polymorphism site of codon 13 of the K-ras gene. It is possible to analyze a polymorphism of codon 13 of the K-ras gene by simultaneously amplifying a nucleic acid having a G13D mutant with high efficiency and high specificity for each of the wild type or G13D mutant in the same reaction solution.

上記核酸増幅は、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法における核酸増幅と同様であるため、詳細な説明を省略する。 Since the nucleic acid amplification is the same as the nucleic acid amplification in the K-ras gene amplification method of the present invention, detailed description thereof will be omitted.

次に、上記ハイブリッド形成工程では、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブ（多型解析用プローブ）とのハイブリッドを形成する。上記一本鎖増幅核酸は、例えば、反応液を加熱し、上記増幅工程で得られた増幅産物である二本鎖増幅核酸を解離することで調製することができる。多型解析用プローブの詳細については後述する。 Next, in the hybrid formation step, a probe capable of hybridizing to a region containing the single-stranded amplified nucleic acid of the amplification product obtained in the amplification step and the polymorphism site of codon 13 of the K-ras gene (polymorphism analysis). To form a hybrid with the probe). The single-strand amplification nucleic acid can be prepared, for example, by heating the reaction solution and dissociating the double-stranded amplification nucleic acid which is the amplification product obtained in the amplification step. Details of the probe for polymorphism analysis will be described later.

多型解析用プローブを反応液に添加するタイミングは特に制限されない。例えば、増幅工程前、増幅工程の開始時、増幅工程の途中、及び増幅工程後のいずれであってもよい。中でも、増幅工程前又は増幅工程の開始時に添加することが、増幅反応とハイブリダイゼーションとを連続的に行うことができるため好ましい。すなわち、上記増幅工程と上記ハイブリッド形成工程とが同時に進行することが、処理効率の観点から好ましい。
上記反応液における多型解析用プローブの添加割合は特に制限されない。例えば、多型解析用プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することがより好ましい。 The timing of adding the probe for polymorphism analysis to the reaction solution is not particularly limited. For example, it may be before the amplification step, at the start of the amplification step, during the amplification step, or after the amplification step. Above all, it is preferable to add it before the amplification step or at the start of the amplification step because the amplification reaction and hybridization can be continuously performed. That is, it is preferable that the amplification step and the hybrid forming step proceed at the same time from the viewpoint of processing efficiency.
The addition ratio of the probe for polymorphism analysis in the above reaction solution is not particularly limited. For example, the probe for polymorphism analysis is preferably added in the range of 10 nmol / L to 400 nmol / L, and more preferably added in the range of 20 nmol / L to 200 nmol / L.

上記一本鎖増幅核酸と多型解析用プローブとのハイブリダイゼーションの手法及び条件には、特に制限はない。二本鎖増幅核酸を解離して一本鎖増幅核酸にすること、一本鎖核酸同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。
例えば、解離における加熱温度は、上記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒間〜１０分間であり、好ましくは１秒間〜５分間である。また、解離した一本鎖増幅核酸と多型解析用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば４０℃〜５０℃である。 The method and conditions for hybridization of the single-strand amplification nucleic acid with the probe for polymorphism analysis are not particularly limited. The conditions known in the art may be applied as they are for the purpose of dissociating the double-stranded amplified nucleic acid into a single-stranded amplified nucleic acid and hybridizing the single-stranded nucleic acids with each other.
For example, the heating temperature in dissociation is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, but is, for example, 85 ° C. to 95 ° C. The heating time is also not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes. Further, the hybridization of the dissociated single-strand amplified nucleic acid and the probe for polymorphism analysis can be performed, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation after the dissociation. The temperature conditions are, for example, 40 ° C to 50 ° C.

上記増幅工程において、本発明のフォワードプライマーセットと多型解析用プローブとを共存させる場合、多型解析用プローブがＤＮＡポリメラーゼの反応対象となって多型解析用プローブ自体が伸長することを予防するために、多型解析用プローブの３’末端側に後述する蛍光標識が付加されているか、リン酸基が付加されていることが好ましい。 In the above amplification step, when the forward primer set of the present invention and the probe for polymorphism analysis coexist, the probe for polymorphism analysis becomes a reaction target of DNA polymerase and prevents the probe for polymorphism analysis from extending. Therefore, it is preferable that a fluorescent label, which will be described later, is added to the 3'end side of the probe for polymorphism analysis, or a phosphate group is added.

また、多型解析用プローブは、標識が付されている標識化プローブであることが検出の効率性の観点から好ましい。例えば、野生型のコドン１３の増幅産物とＧ１３Ｄ変異型のコドン１３の増幅産物にそれぞれ特異的なプローブを２種類使用する場合には、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識によって標識化されていることが好ましい。このように異なる標識を使用することによって、同一反応液であっても、検出条件を変えることによって各増幅産物を別個に解析することが可能となる。 Further, it is preferable that the probe for polymorphism analysis is a labeled probe with a label from the viewpoint of detection efficiency. For example, when two probes specific to the wild-type codon 13 amplification product and the G13D mutant codon 13 amplification product are used, they are labeled with different labels, each detected under different conditions. Is preferable. By using different labels in this way, it is possible to analyze each amplification product separately by changing the detection conditions even if the reaction solution is the same.

標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、蛍光色素及び蛍光団が挙げられる。標識化プローブとしては、このような蛍光色素又は蛍光団で標識された蛍光標識化プローブを用いることが好ましい。蛍光標識化プローブの具体例としては、蛍光色素で標識され、単独（相補配列にハイブリダイズしていないとき）で蛍光を示し且つハイブリッド形成（相補配列にハイブリダイズしているとき）により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが挙げられる。 Specific examples of the labeling substance in the labeling probe include fluorescent dyes and fluorescent groups. As the labeled probe, it is preferable to use such a fluorescent dye or a fluorescently labeled probe labeled with a fluorescent group. Specific examples of fluorescently labeled probes include those labeled with a fluorescent dye, which show fluorescence alone (when hybridized to a complementary sequence) and decrease in fluorescence by hybridization (when hybridized to a complementary sequence). Examples include probes (eg, quenching).

このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon）を利用したプローブは、一般に蛍光消光プローブと称される。上記蛍光消光プローブは、オリゴヌクレオチドの３’領域（例えば、３’末端）又は５’領域（例えば、５’末端）の塩基が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される塩基は、シトシン（Ｃ）であることが好ましい。この場合、蛍光消光プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、蛍光消光プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基又は当該対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このような蛍光消光プローブは、一般にグアニン消光プローブと称され、いわゆるＱ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシン（Ｃ）が検出目的配列におけるグアニン（Ｇ）に近づくことによって、蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなグアニン消光プローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。標識物質は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。 A probe utilizing such a fluorescence quenching phenomenon is generally called a fluorescence quenching probe. In the above fluorescent quenching probe, the base of the 3'region (for example, 3'end) or 5'region (for example, 5'end) of the oligonucleotide is preferably labeled with a fluorescent dye, and the labeled base is used. Is preferably cytosine (C). In this case, in the detection target sequence in which the fluorescence quenching probe hybridizes, the base paired with the terminal base C of the fluorescence quenching probe or the base 1 to 3 bases away from the paired base becomes guanine (G). , It is preferable to design the base sequence of the fluorescent quenching probe. Such a fluorescent quenching probe is generally referred to as a guanine quenching probe and is known as a so-called Q Probe®.
When such a guanine quenching probe hybridizes to the detection target sequence, the fluorescent dye-labeled terminal cytosine (C) approaches the guanine (G) in the detection target sequence, thereby weakening the emission of the fluorescent dye ( Fluorescence intensity decreases). By using such a guanine quenching probe, hybridization and dissociation can be easily confirmed by signal fluctuation. The labeling substance can usually be attached to the phosphate group of the nucleotide.

なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、ＲＦＬＰ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法、ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ法等が挙げられる。 In addition to the detection method using Q Probe, a known detection mode may be applied. Examples of such a detection mode include a Taq-man probe method, an RFLP method, a hybridization probe method, a Molecular Beacon method, an MGB probe method, and the like.

上記蛍光色素としては、特に制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）等が挙げられる。複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、異なる条件で検出できればよく、特に制限されないが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長：４５０ｎｍ〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長：５８５ｎｍ〜７００ｎｍ）、及びＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長：５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ）の組み合わせ等が挙げられる。 The fluorescent dye is not particularly limited, and examples thereof include fluorescein, phosphorescent bodies, rhodamine, and polymethine dye derivatives. Examples of commercially available fluorescent dyes include Pacific Blue (registered trademark, manufactured by Molecular Probe), TAMRA (registered trademark, manufactured by Molecular Probe), BODIPY FL (registered trademark, manufactured by Molecular Probe), and FluorePrime (trade name, manufactured by Amasham). Examples thereof include Cy3 and Cy5 (trade name, manufactured by Amasham Pharmacia), Fluoredite (trade name, manufactured by Millipore), FAM (registered trademark, manufactured by ABI) and the like. The combination of fluorescent dyes used for a plurality of probes is not particularly limited as long as it can be detected under different conditions, and is not particularly limited. For example, Pacific Blue (detection wavelength: 450 nm to 480 nm), TAMRA (detection wavelength: 585 nm to 700 nm), and BODIPY FL. Examples thereof include a combination of (detection wavelength: 515 nm to 555 nm).

また、多型解析用プローブが、蛍光色素等の標識物質で標識化された標識化プローブである場合、標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよい。これにより、例えば、検出する蛍光強度等のシグナル強度を調節することができる等の利点が得られる。この未標識プローブは、その３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。 When the probe for polymorphism analysis is a labeled probe labeled with a labeling substance such as a fluorescent dye, an unlabeled probe having the same sequence as the labeled probe may be used in combination. This has the advantage that, for example, the signal intensity such as the fluorescence intensity to be detected can be adjusted. This unlabeled probe may have a phosphate group added to its 3'end.

次に、上記シグナル測定工程では、上記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動を測定する。上記ハイブリッドの解離状態を示すシグナルの測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であることが好ましい。標識物質のシグナル測定とすることによって、検出感度を高めることができる。 Next, in the signal measurement step, the temperature of the reaction solution containing the hybrid is changed, and the fluctuation of the signal based on the dissociation state of the hybrid is measured. The measurement of the signal indicating the dissociated state of the hybrid may be the absorbance measurement at 260 nm, but the signal measurement of the labeling substance is preferable. The detection sensitivity can be increased by measuring the signal of the labeling substance.

上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、上記反応液を加熱し、すなわち、一本鎖増幅核酸と多型解析用プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸とハイブリダイズした状態では蛍光が減少（又は消光）し、解離した状態では蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。なお、標識化プローブを使用する場合、シグナルは、標識化プローブの標識物質に応じた条件で測定することができる。 The fluctuation of the signal based on the dissociation state of the hybrid is performed by changing the temperature of the reaction solution. For example, the reaction solution is heated, that is, the hybrid of the single-strand amplified nucleic acid and the probe for polymorphism analysis is heated, and the fluctuation of the signal with the temperature rise is measured. As described above, for example, when a labeled probe (guanine quenching probe) labeled with a C base at the terminal is used, fluorescence is reduced (or quenched) and dissociated in a state of hybridizing with a single-stranded amplified nucleic acid. In this state, it emits fluorescence. Therefore, for example, the hybrid whose fluorescence is decreasing (or quenching) may be gradually heated, and the increase in fluorescence intensity with increasing temperature may be measured. When a labeled probe is used, the signal can be measured under conditions according to the labeling substance of the labeled probe.

シグナルの変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、好ましくは２５℃〜７０℃であり、終了温度が４０℃〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば０．１℃／秒〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３℃／秒〜５℃／秒である。 The temperature range for measuring the variation of the signal is not particularly limited, but for example, the start temperature is room temperature to 85 ° C., preferably 25 ° C. to 70 ° C., and the end temperature is 40 ° C. to 105 ° C. The rate of temperature rise is not particularly limited, but is, for example, 0.1 ° C./sec to 20 ° C./sec, preferably 0.3 ° C./sec to 5 ° C./sec.

次に、上記解析工程では、上記シグナルの変動に基づいてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析する。その際、上記シグナル測定工程で得られたシグナルの変動を解析してＴｍ値を決定し、このＴｍ値に基づいてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することが好ましい。
Ｔｍ値の決定は、例えば、以下のようにして行うことができる。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、得られた蛍光強度の変動から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。また、変化量を（ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。
なお、標識化プローブとして、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。 Next, in the analysis step, the polymorphism of codon 13 of the K-ras gene is analyzed based on the variation of the signal. At that time, it is preferable to analyze the fluctuation of the signal obtained in the above signal measurement step to determine the Tm value, and to analyze the polymorphism of codon 13 of the K-ras gene based on this Tm value.
The Tm value can be determined, for example, as follows. As described above, for example, when a labeled probe (guanine quenching probe) labeled with a C base at the terminal is used, the amount of change in fluorescence intensity per unit time at each temperature is determined from the obtained fluctuation in fluorescence intensity. calculate. When the amount of change is (−d (amount of increase in fluorescence intensity) / dt), for example, the temperature showing the lowest value can be determined as the Tm value. Further, when the amount of change is (d (amount of increase in fluorescence intensity) / dt), for example, the temperature showing the highest value can be determined as the Tm value.
When a probe that does not show a signal by itself and shows a signal by hybrid formation is used as the labeled probe, on the contrary, the amount of decrease in fluorescence intensity may be measured.

上記解析工程では、このようにして決定されたＴｍ値に基づいて、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することができる。
例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のＧ１３Ｄ変異型のコドン１３を検出する場合、その変異型塩基を含む検出目的配列に完全に相補的な多型解析用プローブを使用し、形成したハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいた完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、目的塩基はＧ１３Ｄ変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいた一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値よりも低い値）であれば、目的塩基は野生型と判断できる。また、両方のＴｍ値が検出された場合には、Ｇ１３Ｄ変異型を示す核酸と野生型を示す核酸とが共存していると決定できる。 In the above analysis step, the polymorphism of codon 13 of the K-ras gene can be analyzed based on the Tm value thus determined.
For example, when detecting codon 13 of the G13D mutant of the K-ras gene, the Tm value of the hybrid formed by using a polymorphism analysis probe completely complementary to the detection target sequence containing the mutant base is determined. If it is the same as the Tm value of the completely complementary hybrid determined in advance as the reference value, it can be determined that the target base is a G13D mutant type. If the Tm value of the formed hybrid is the same as the Tm value of a hybrid that is one base different from the reference value (a value lower than the Tm value of a completely complementary hybrid), the target base is It can be judged as a wild type. When both Tm values are detected, it can be determined that the nucleic acid showing the G13D mutant type and the nucleic acid showing the wild type coexist.

なお、以上の説明では、上記シグナル測定工程においてハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル変動を測定するものとしたが、ハイブリッド形成時におけるシグナルの変動を測定するようにしてもよい。つまり、多型解析用プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、温度降下に伴うシグナルの変動を測定してもよい。 In the above description, the hybrid is heated in the signal measuring step to measure the signal fluctuation with the temperature rise, but the signal fluctuation at the time of hybrid formation may be measured. That is, when the temperature of the reaction solution containing the probe for polymorphism analysis is lowered to form a hybrid, the fluctuation of the signal due to the temperature drop may be measured.

具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発するが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、反応液の温度を徐々に降下させて、温度降下に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖増幅核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発しないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、反応液の温度を徐々に降下させて、温度降下に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。 As a specific example, when a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybrid formation (for example, a guanine quenching probe) is used, fluorescence occurs when the single-stranded amplified nucleic acid and the labeled probe are dissociated. However, when a hybrid is formed due to a decrease in temperature, the fluorescence is reduced (or quenched). Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered to measure the decrease in fluorescence intensity accompanying the temperature drop. On the other hand, when a labeled probe that does not show a signal by itself and shows a signal by hybrid formation is used, it does not fluoresce when the single-stranded amplified nucleic acid and the labeled probe are dissociated, but due to a decrease in temperature. When a hybrid is formed, it becomes fluorescent. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered to measure the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop.

Ｋ−ｒａｓ遺伝子の野生型コドン１３及びＧ１３Ｄ変異型コドン１３の核酸配列が混在している場合に、コドン１３の遺伝子型の判定を行うためには、温度とシグナル強度の微分値との関係で表される融解曲線（微分融解曲線ともいう）において、野生型コドン１３及びＧ１３Ｄ変異型コドン１３それぞれのＴｍ値のピーク面積を算出することによって行うこともできる。 When the nucleic acid sequences of wild-type codon 13 and G13D mutant codon 13 of the K-ras gene are mixed, in order to determine the genotype of codon 13, the relationship between temperature and the differential value of signal intensity is used. It can also be performed by calculating the peak area of the Tm value of each of the wild type codon 13 and the G13D mutant type codon 13 in the represented melting curve (also referred to as a differential melting curve).

まず、例えば、野生型の核酸ＷｔとＧ１３Ｄ変異型の核酸Ｍｔとの核酸混合物を含む試料について、融解曲線解析装置を用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度と吸光度または蛍光強度等の検出信号との関係で表された融解曲線、及び同図（Ｂ）微分融解曲線を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍＷ及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍＭを検出して、ＴｍＷ及びＴｍＭを含む温度範囲の各々を設定する。 First, for example, a melting curve is obtained using a melting curve analyzer for a sample containing a nucleic acid mixture of a wild-type nucleic acid Wt and a G13D mutant nucleic acid Mt.
FIG. 1 (A) shows a melting curve represented by the relationship between the temperature of a certain nucleic acid mixture and a detection signal such as absorbance or fluorescence intensity, and FIG. 1 (B) shows a differential melting curve. By detecting the peak from this differential melting curve, the melting temperature TmW of the nucleic acid Wt and the melting temperature TMM of the nucleic acid Mt are detected, and each of the temperature ranges including TmW and Timm is set.

ＴｍＷを含む温度範囲ΔＴＷとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を下限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍＭを含む温度範囲ΔＴＭとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を上限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。
なお、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴＷが１０℃、温度範囲ΔＴＭが７℃）となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定してもよい。 As the temperature range ΔTW including TmW, for example, a temperature range is set in which the temperature at which the differential value of the detection signal is minimized between TmW and TMM is the lower limit and the temperature corresponding to the peak base of the detection signal is the upper limit. be able to. The temperature range ΔTM including TMM is, for example, a temperature range in which the temperature at which the differential value of the detection signal is minimized between TmW and TMM is the upper limit and the temperature corresponding to the peak base of the detection signal is the lower limit. Can be set.
The temperature range ΔTW and the temperature range ΔTM may be set to have the same width (for example, 10 ° C.) or different widths (for example, the temperature range ΔTW is 10 ° C. and the temperature range ΔTM is 7 ° C.). Further, the temperature range ΔTW and the temperature range ΔTM may be set in the range of plus X ° C. and minus X ° C. (X ° C. is, for example, within 15 ° C., preferably within 10 ° C.) from the respective melting temperatures Tm.

次に、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける検出信号の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。 Next, for each of the temperature range ΔTW and the temperature range ΔTM, the area surrounded by the differential melting curve and the straight line passing through the points corresponding to the lower limit and the upper limit of the temperature range of the differential melting curve (FIG. 1 (FIG. 1). B) The shaded area) is obtained. As an example of how to obtain the area, it can be specifically calculated as follows. The differential value of the detection signal at the temperature T is f (T), and the base value at the temperature T is B (T), which is calculated by the following equation (1).

面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔｓ＋１）−Ｂ（Ｔｓ＋１）｝＋｛ｆ（Ｔｓ＋２）−Ｂ（Ｔｓ＋２）｝＋｛ｆ（Ｔｅ−１）−Ｂ（Ｔｅ−１）｝ ・・・（１）
ただし、Ｔｓは各温度範囲における下限値、Ｔｅは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。 Area S = {f (Ts + 1) -B (Ts + 1)} + {f (Ts + 2) -B (Ts + 2)} + {f (Te-1) -B (Te-1)} ... (1)
However, Ts is a lower limit value in each temperature range, and Te is an upper limit value. The base value B (T) at each temperature T is a value obtained by the following equation (2) and represents a background level included in the detection signal. By subtracting this base value from the differential value of the detection signal, the influence of the background contained in the detection signal is removed.

Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔｓ）＋ｆ（Ｔｓ） ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔｅ）−ｆ（Ｔｓ）｝／（Ｔｅ−Ｔｓ）である。 B (T) = a × (T-Ts) + f (Ts) ... (2)
However, a = {f (Te) -f (Ts)} / (Te-Ts).

上記（１）式及び（２）式に従って、前記核酸混合物について、温度範囲ΔＴＷにおける面積ＳＷ及び温度範囲ΔＴＭにおける面積ＳＭを求め、面積比によって野生型のコドン１３と、Ｇ１３Ｄ変異型のコドン１３の存在の有無を判定することができる。
面積比は、下記（３）式により求めることができる。 For the nucleic acid mixture, the area SW in the temperature range ΔTW and the area SM in the temperature range ΔTM were obtained according to the above equations (1) and (2), and the wild-type codon 13 and the G13D mutant codon 13 were obtained according to the area ratio. The presence or absence can be determined.
The area ratio can be calculated by the following equation (3).

面積比（％）＝（ＳＭ／ＳＷ）×１００ ・・・（３）
例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のＧ１３Ｄ変異型の存在の有無の判定は、上記（３）式の面積比のカットオフ値を１０％と設定し、１０％以上であればＧ１３Ｄ変異型のコドン１３が存在する（陽性）であると判定してもよい。カットオフ値は、希望する検出感度及び特性に応じて適宜設定すればよい。 Area ratio (%) = (SM / SW) x 100 ... (3)
For example, in determining the presence or absence of the G13D mutant of the K-ras gene, the cutoff value of the area ratio in the above equation (3) is set to 10%, and if it is 10% or more, the codon 13 of the G13D mutant is used. It may be determined that it exists (positive). The cutoff value may be appropriately set according to the desired detection sensitivity and characteristics.

試料中のＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型のコドン１３及びＧ１３Ｄ変異型のコドン１３の核酸配列の存在比を定量的に測定する場合には、実際の試料を用いて得られた融解曲線と微分融解曲線から面積比を算出し、予め作成した検量線に基づいて、実際の試料中に含まれる多型を有する塩基配列の存在比を決定してもよい。 When quantitatively measuring the abundance ratio of the nucleic acid sequences of the wild-type codon 13 and the G13D mutant codon 13 of the K-ras gene in the sample, the melting curve and the differential melting obtained using the actual sample are used. The area ratio may be calculated from the curve, and the abundance ratio of the base sequence having a polymorphism contained in the actual sample may be determined based on the calibration curve prepared in advance.

検量線の作成は、例えば、野生型の核酸Ｗｔと変異型の核酸Ｍｔとの２種類の核酸の存在比を各々異ならせた複数の核酸混合物を作製し、複数の核酸混合物の各々について、融解曲線を得る。続いて、上記（１）式及び（２）式に従って、各核酸混合物について、温度範囲ΔＴＷにおける面積ＳＷ及び温度範囲ΔＴＭにおける面積ＳＭを求め、面積比と各核酸混合物の存在比との関係を表す検量線を作成する。例えば、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳＭ／ＳＷ）をとった検量線とすることができる。検量線は、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳＭ／ＳＷ）をとって作成してもよい。なお、面積比はＳＷ／ＳＭで定めてもよい。 To prepare a calibration curve, for example, a plurality of nucleic acid mixtures having different abundance ratios of two types of nucleic acids, a wild-type nucleic acid Wt and a mutant nucleic acid Mt, are prepared, and each of the plurality of nucleic acid mixtures is thawed. Get a curve. Subsequently, for each nucleic acid mixture, the area SW in the temperature range ΔTW and the area SM in the temperature range ΔTM are obtained according to the above equations (1) and (2), and the relationship between the area ratio and the abundance ratio of each nucleic acid mixture is expressed. Create a calibration curve. For example, a calibration curve may be obtained in which the abundance ratio (ratio of nucleic acid Mt to the total amount of nucleic acid mixture) is taken on the horizontal axis and the area ratio (SM / SW) is taken on the vertical axis. The calibration curve may be prepared by taking the abundance ratio (ratio of nucleic acid Mt to the total amount of the nucleic acid mixture) on the horizontal axis and the area ratio (SM / SW) on the vertical axis. The area ratio may be determined by SW / SM.

以下、本発明の多型解析方法で用いられるプローブ（多型解析用プローブ）について詳細に説明する。
多型解析用プローブは、特に制限されず、従来公知の方法によって設定できる。例えば、遺伝子多型部位を含む検出対象配列として、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基づいて設計してもよい。また、遺伝子多型部位を含む領域に結合するよう設計し、野生型及び変異型それぞれとの親和性が異なるように設計してもよい。あるいは、遺伝子多型部位を含まない領域に結合するよう設計してもよい。当業者は、適用する多型解析の方法に応じて、好適なプローブを従来公知の方法によって設計することができる。 Hereinafter, the probe (probe for polymorphism analysis) used in the polymorphism analysis method of the present invention will be described in detail.
The probe for polymorphism analysis is not particularly limited and can be set by a conventionally known method. For example, the detection target sequence containing the gene polymorphism site may be designed based on the sequence of the sense strand of the K-ras gene, or may be designed based on the sequence of the antisense strand. In addition, it may be designed to bind to a region containing a gene polymorphism site, and to have different affinities for the wild type and the mutant type. Alternatively, it may be designed to bind to a region that does not contain a gene polymorphism site. Those skilled in the art can design suitable probes by conventionally known methods, depending on the method of polymorphism analysis to be applied.

例えば、配列番号６における２２４番目の塩基がＧであるのが野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３であり、ＡであるのがＧ１３Ｄ変異型であるので、配列番号６の２２４番目に対応する塩基がＧである検出対象配列、及び配列番号６の２２４番目に対応する塩基がＡである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）、並びにそのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）を使用することができる。 For example, the 224th base in SEQ ID NO: 6 is the codon 13 of the wild-type K-ras gene, and the A is the G13D mutant, so the base corresponding to the 224th base of SEQ ID NO: 6 A probe (probe for detecting the sense strand) complementary to any of the detection target sequence in which is G and the detection target sequence in which the base corresponding to the 224th position of SEQ ID NO: 6 is A, and the sequence of the antisense strand thereof. A probe complementary to (probe for detecting antisense strand) can be used.

プローブの具体例を表１に示すが、これに限定されるものではない。表１のプローブは、Ｇ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のアンチセンス鎖を検出するためのプローブである。配列番号８〜１３として示される塩基配列中、大文字で示されるＡはＧ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型部位に相補的な塩基である。 Specific examples of the probe are shown in Table 1, but the present invention is not limited thereto. The probes in Table 1 are for detecting the antisense strand of the G13D mutant K-ras gene. In the base sequences shown as SEQ ID NOs: 8 to 13, A shown in capital letters is a base complementary to the polymorphic site of codon 13 of the G13D mutant K-ras gene.

表１に示すＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型解析用プローブは、前述のように、蛍光色素等の標識物質で標識化することが好ましい。また、３’末端にリン酸基を付加することが好ましい。多型解析用プローブの具体例としては、表１に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であってもよい。 As described above, the probe for polymorphism analysis of codon 13 of the K-ras gene shown in Table 1 is preferably labeled with a labeling substance such as a fluorescent dye. Further, it is preferable to add a phosphoric acid group to the 3'end. As a specific example of the probe for polymorphism analysis, it may be a complementary strand of the oligonucleotide shown in Table 1.

＜薬効判定方法＞
本発明の一実施形態にかかる薬効判定方法（以下、単に「本発明の薬効判定方法」という。）は、本発明の多型解析方法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することと、上記解析における解析結果に基づいて薬剤の薬効を判定することと、を含むものである。 <Medicinal efficacy judgment method>
The drug efficacy determination method according to an embodiment of the present invention (hereinafter, simply referred to as “the drug efficacy determination method of the present invention”) is to analyze the polymorphism of codon 13 of the K-ras gene by the polymorphism analysis method of the present invention. And, to determine the efficacy of the drug based on the analysis result in the above analysis.

前述のように、本発明の多型解析方法によれば、試料中の核酸を鋳型として、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の遺伝子多型部位を含む領域を同一反応液において同時に高効率且つ野生型又はＧ１３Ｄ変異型それぞれに特異的に増幅し、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することができる。Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３がＧ１３Ｄ変異型である場合、野生型である場合と比べて抗ＥＧＦＲ抗体薬の薬効が低いことが知られている。したがって、本発明の薬効判定方法によれば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型解析結果に基づき、薬効を判定することができる。
得られた判定結果は、薬剤の効果の予測に用いることができるほか、投与量の変更、他の薬剤への切り替え等を含めた治療方針の決定に用いることができる。
例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３がＧ１３Ｄ変異型であった場合、抗ＥＧＦＲ抗体薬の薬効が低いと予測されるため、他の薬剤への切り替えを行うことができる。薬剤の効果の予測、投与量の変更、他の薬剤への切り替え等を含めた治療方針の決定は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の他の変異の有無や、他の関連遺伝子の遺伝子型の判定と組み合わせて行ってもよい。
また、薬剤は抗ＥＧＦＲ抗体薬に限られず、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３が野生型かＧ１３Ｄ変異型かにより薬効に差異がある薬剤であればよい。 As described above, according to the polymorphism analysis method of the present invention, the region containing the gene polymorphism site of codon 13 of the K-ras gene is simultaneously highly efficient and wild-type in the same reaction solution using the nucleic acid in the sample as a template. Alternatively, it can be specifically amplified for each G13D mutant and the polymorphism of codon 13 of the K-ras gene can be analyzed. It is known that when codon 13 of the K-ras gene is a G13D mutant, the efficacy of the anti-EGFR antibody drug is lower than that of the wild type. Therefore, according to the drug efficacy determination method of the present invention, the drug efficacy can be determined based on the polymorphism analysis result of codon 13 of the K-ras gene.
The obtained determination result can be used not only for predicting the effect of the drug, but also for determining the treatment policy including changing the dose and switching to another drug.
For example, when the codon 13 of the K-ras gene is a G13D mutant, the efficacy of the anti-EGFR antibody drug is predicted to be low, so that it is possible to switch to another drug. Determining treatment strategies, including predicting drug effects, changing doses, switching to other drugs, etc., is combined with determining the presence or absence of other mutations in the K-ras gene and genotyping of other related genes. You may go there.
Further, the drug is not limited to an anti-EGFR antibody drug, and any drug may have a difference in efficacy depending on whether the codon 13 of the K-ras gene is a wild type or a G13D mutant type.

＜Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット＞
本発明の一実施形態にかかるＫ−ｒａｓ遺伝子遺伝子増幅用キット（以下、単に「本発明のキット」という。）は、本発明のフォワードプライマーセットを含むものであり、核酸増幅法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む目的領域を増幅するために用いられる。本発明のキットが本発明のフォワードプライマーセットを含むことにより、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の遺伝子多型部位を含む領域を、野生型及びＧ１３Ｄ変異型それぞれに特異的性高く且つ効率的に増幅することができる。 <K-ras gene amplification kit>
The K-ras gene gene amplification kit according to an embodiment of the present invention (hereinafter, simply referred to as “the kit of the present invention”) includes the forward primer set of the present invention, and K-ras by the nucleic acid amplification method. It is used to amplify the region of interest that contains codon 13 of the gene. By including the forward primer set of the present invention, the kit of the present invention amplifies the region containing the gene polymorphism site of codon 13 of the K-ras gene with high specificity and efficiency for each of the wild type and the G13D mutant type. can do.

本発明のキットは、本発明のフォワードプライマーセットを用いた遺伝子増幅法に用いるリバースプライマーを含むことが好ましい。
本発明のキットは、本発明のフォワードプライマーセットを用いた遺伝子増幅法により得られる増幅産物を検出するために、増幅産物にハイブリダイズ可能な各プローブをさらに含むことが好ましい。このプローブは、前述のように、蛍光標識化プローブであることが好ましい。リバースプライマー及びプローブについては、前述したリバースプライマー及びプローブに関する事項をそのまま適用することができる。 The kit of the present invention preferably contains a reverse primer used in a gene amplification method using the forward primer set of the present invention.
The kit of the present invention preferably further contains each probe capable of hybridizing to the amplification product in order to detect the amplification product obtained by the gene amplification method using the forward primer set of the present invention. As described above, this probe is preferably a fluorescently labeled probe. As for the reverse primer and probe, the above-mentioned matters concerning the reverse primer and probe can be applied as they are.

本発明のキットに含まれるフォワードプライマーセット（１）、（２）又は（３）は、各フォワードプライマーセットに含まれる２つのフォワードプライマーが別個に収容されていてもよく、混合物とされていてもよい。また、本発明の一実施形態にかかるフォワードプライマーセットと、リバースプライマー又は上記プローブとは、別個に収容されていてもよく、混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされていればよく、必ずしも独立して取扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。 The forward primer sets (1), (2) or (3) included in the kit of the present invention may contain the two forward primers contained in each forward primer set separately, or may be a mixture. Good. Further, the forward primer set according to the embodiment of the present invention and the reverse primer or the probe may be contained separately or may be a mixture.
In addition, "separately housed" means that each reagent may be classified so as to be able to maintain a non-contact state, and it is not always necessary to be housed in a separate container that can be handled independently.

試薬類は、例えば、緩衝液中に溶解された状態で含まれていてもよいし、凍結乾燥品として含まれていてもよい。試薬類を収容する容器としては、例えば、ガラス製やプラスチック製のバイアル等を用いることができる。 The reagents may be contained, for example, in a state of being dissolved in a buffer solution, or may be contained as a lyophilized product. As the container for containing the reagents, for example, a glass or plastic vial or the like can be used.

本発明のキットは、上記のほかに、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法又は本発明の多型解析方法に必要な各種の試薬類をさらに含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の遺伝子増幅方法又は本発明の多型解析方法について記載された使用説明書、本発明のキットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書等をさらに含んでいてもよい。 In addition to the above, the kit of the present invention may further contain various reagents necessary for the K-ras gene amplification method of the present invention or the polymorphism analysis method of the present invention. In addition, the kit of the present invention relates to an instruction manual describing the gene amplification method of the present invention or the polymorphism analysis method of the present invention, and various reagents contained in or additionally contained in the kit of the present invention. The described instruction manual and the like may be further included.

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３が野生型又は変異型である核酸をそれぞれ特異的に増幅するためのフォワードプライマーとして、表２に示す各プライマーを評価した。これらのプライマーは、いずれも常法に従って作製した。 Each primer shown in Table 2 was evaluated as a forward primer for specifically amplifying a nucleic acid in which codon 13 of the K-ras gene is a wild type or a mutant type, respectively. All of these primers were prepared according to a conventional method.

表２において、「野生型特異的増幅用プライマー」は、コドン１３が野生型であるＫ−ｒａｓ遺伝子を特異的に増幅するためのフォワードプライマーであり、「Ｇ１３Ｄ変異型特異的増幅用プライマー」は、コドン１３がＧ１３Ｄ変異型であるＫ−ｒａｓ遺伝子を特異的に増幅するためのフォワードプライマーである。
野生型特異的増幅用プライマー４種と、Ｇ１３Ｄ変異型特異的増幅用プライマー３種との全ての組み合わせについて評価を行った。 In Table 2, the "wild-type specific amplification primer" is a forward primer for specifically amplifying the K-ras gene whose codon 13 is wild-type, and the "G13D mutant-specific amplification primer" is , Codon 13 is a forward primer for specifically amplifying the K-ras gene, which is a G13D mutant.
All combinations of 4 wild-type specific amplification primers and 3 G13D mutant-specific amplification primers were evaluated.

以下の実施例では、表３に示す反応液を用い、遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ ＩＳ−５３２０、アークレイ社製）によりＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。 In the following examples, PCR and Tm analysis were performed using a gene analyzer (trade name i-densy IS-5320, manufactured by ARKRAY, Inc.) using the reaction solutions shown in Table 3.

プローブは、５ＦＬ−ＫｒａｓＧ１３Ｄｍｔ−Ｆ６（配列番号１２）を使用した。プローブ５ＦＬ−ＫｒａｓＧ１３Ｄｍｔ−Ｆ６の詳細を表４に示す。表４に示す配列において、（ＦＬ）は５’末端のシトシン（Ｃ）が蛍光色素であるＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製、検出波長：５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ）が標識化されていることを示し、Ｐは、３’末端にリン酸基が付加されていることを示す。５’末端の蛍光標識及び３’末端へのリン酸基の付加は定法に従って行った。
また、表４に示す塩基配列中、大文字の塩基は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３のＧ１３Ｄ遺伝子多型部位に対応する塩基であることを示す。 As the probe, 5FL-KrasG13Dmt-F6 (SEQ ID NO: 12) was used. Details of the probe 5FL-KrasG13Dmt-F6 are shown in Table 4. In the sequence shown in Table 4, (FL) is labeled with BODIPY FL (registered trademark, manufactured by Molecular Probe Co., Ltd., detection wavelength: 515 nm to 555 nm) in which cytosine (C) at the 5'end is a fluorescent dye. Shown, P indicates that a phosphoric acid group is added to the 3'end. The fluorescent labeling at the 5'end and the addition of the phosphate group to the 3'end were carried out according to a conventional method.
Further, in the base sequence shown in Table 4, the uppercase base indicates that it is the base corresponding to the G13D gene polymorphism site of codon 13 of the K-ras gene.

核酸増幅の鋳型として、（１）野生型のコドン１３を有するＫ−ｒａｓ遺伝子に対応するテンプレート（野生型テンプレート）（商品名 Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ、ロシュ・ダイアグノスティックスＧｍｂＨ）、（２）野生型プラスミドＤＮＡに、コピー数が０．３％となるようにＧ１３Ｄ変異型プラスミドＤＮＡを添加したテンプレート（０．３％変異型テンプレート）の２種類のテンプレートを用いてプライマーの評価を行った。０．３％変異型テンプレートに使用したプラスミドＤＮＡは Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＧ＿００７５２４， １０３８０−１０６９９の配列を含むｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）である。使用したテンプレートのコピー数は、野生型テンプレートも０．３％変異型テンプレートも１回測定当たり１００００コピーとした。 As a template for nucleic acid amplification, (1) a template corresponding to the K-ras gene having a wild-type codon 13 (wild-type template) (trade name: Human Genetic DNA, Roche diagnostics GmbH), (2) wild-type Primers were evaluated using two types of templates (0.3% mutant template) in which G13D mutant plasmid DNA was added to the plasmid DNA so that the number of copies was 0.3%. The plasmid DNA used in the 0.3% mutant template is Genbank Accession No. It is a pUC57 vector (GenScript) containing the sequence of NG_007524, 10380-1069. The copy number of the template used was 10,000 copies per measurement for both the wild-type template and the 0.3% mutant template.

リバースプライマーは表５に記載のものを使用した。 The reverse primers shown in Table 5 were used.

調製した反応液を用いて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ ＩＳ−５３２０、アークレイ社製）によりＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及び５８℃で１５秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、Ｔｍ解析における蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍである。 Using the prepared reaction solution, PCR and Tm analysis were performed by a fully automatic SNPs inspection device (trade name i-densy IS-5320, manufactured by ARKRAY, Inc.).
PCR was treated at 95 ° C. for 60 seconds, followed by 50 cycles of 95 ° C. for 1 second and 58 ° C. for 15 seconds as one cycle.
In the Tm analysis, the treatment was performed at 95 ° C. for 1 second and 40 ° C. for 60 seconds, and then the temperature was raised from 40 ° C. to 95 ° C. at a temperature rise rate of 1 ° C./3 sec. Was measured. The excitation wavelength of the fluorescent dye BODIPY FL in the Tm analysis is 420 nm to 485 nm, and the detection wavelength is 520 nm to 555 nm.

面積比（％）＝（変異型特異的ピークの面積／野生型特異的ピークの面積）×１００
式中、「野生型特異的ピーク」はＴｍ値解析の微分融解曲線における、コドン１３が野生型であるＫ−ｒａｓ遺伝子に特異的なピークであり、「変異型特異的ピーク」は、コドン１３がＧ１３Ｄ変異型であるＫ−ｒａｓ遺伝子に特異的なピークである。ピークの面積は前述の通り算出した。前述の方法において、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭはいずれもは６°Ｃとした。
上記式によって求められた面積比（％）が１０％以上であった場合にＧ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子が存在する（陽性）、１０％未満であった場合にＧ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子が存在しない（陰性）と判定した。 Area ratio (%) = (area of mutant-specific peak / area of wild-type specific peak) x 100
In the formula, the "wild-type specific peak" is a peak specific to the K-ras gene in which codon 13 is wild-type in the differential melting curve of Tm value analysis, and the "mutant-specific peak" is codon 13 Is a peak specific to the K-ras gene, which is a G13D mutant. The area of the peak was calculated as described above. In the above method, the temperature range ΔTW and the temperature range ΔTM were both set to 6 ° C.
When the area ratio (%) determined by the above formula is 10% or more, the G13D mutant K-ras gene is present (positive), and when it is less than 10%, the G13D mutant K-ras gene is present. It was determined that it does not exist (negative).

野生型テンプレート及び０．３％変異型テンプレートについての各フォワードプライマーセットによる判定結果を表６に示す。総合判定における「偽陽性」は、Ｇ１３Ｄ変異型を有するＫ−ｒａｓ遺伝子が含まれない野生型テンプレートを用いたときにＧ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子が陽性と判定されたことを意味する。「偽陰性」は、野生型テンプレートを用いたときにＧ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子は陰性であると正しく判定されたが、０．３％変異型テンプレートを用いたときにＧ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子の存在を検出できずに陰性と判定されたことを意味する。「正答」は、野生型テンプレートを用いたときにＧ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子が陰性であると正しく判定され、且つ、０．３％変異型テンプレートを用いたときに、Ｇ１３Ｄ変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子が陽性と正しく判定されたことを意味する。
野生型テンプレートを用いたときのＴｍ値解析によって得た微分融解曲線を図２に、０．３％変異型テンプレートを用いたときのＴｍ値解析によって得た微分融解曲線を図３に、それぞれ示す。
Table 6 shows the judgment results of each forward primer set for the wild-type template and the 0.3% mutant template. "False positive" in the overall determination means that the G13D mutant K-ras gene was determined to be positive when a wild-type template containing no K-ras gene having the G13D mutant was used. "Pseudo-negative" was correctly determined to be negative for the G13D mutant K-ras gene when using the wild-type template, but G13D mutant K-ras was correctly determined when the 0.3% mutant template was used. It means that the presence of the gene could not be detected and the result was negative. The "correct answer" is that the G13D mutant K-ras gene is correctly determined to be negative when the wild-type template is used, and the G13D mutant K-ras is used when the 0.3% mutant template is used. It means that the gene was correctly determined to be positive.
FIG. 2 shows the differential melting curve obtained by Tm value analysis when using the wild-type template, and FIG. 3 shows the differential melting curve obtained by Tm value analysis when using the 0.3% mutant template. ..

（１）野生型特異的プライマーＷＴ−Ｆ６及び変異型特異的プライマーＭｔ−Ｆ３、（２）野生型特異的プライマーＷＴ−Ｆ１０及び変異型特異的プライマーＭｔ−Ｆ５又は（３）野生型特異的プライマーＷＴ−Ｆ１０及び変異型特異的プライマーＭｔ−Ｆ８、のフォワードプライマーセットによって、偽陽性を示さず、且つ、野生型テンプレートにわずか０．３％含まれる変異型テンプレートでも検出することができ、正しい判定結果を得られた。
また、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の全コピー数に対して０．３％のコピー数が含まれるコドン１３がＧ１３Ｄ変異型であるＫ−ｒａｓ遺伝子を偽陽性無く検出することができるということは、循環血中に存在する腫瘍由来のコドン１３がＧ１３Ｄ変異型であるＫ−ｒａｓ遺伝子を、臨床上使用できる程度に検出可能であることを示している。 (1) Wild-type specific primer WT-F6 and mutant-specific primer Mt-F3, (2) Wild-type specific primer WT-F10 and mutant-specific primer Mt-F5 or (3) Wild-type specific primer With the forward primer set of WT-F10 and mutant-specific primer Mt-F8, even a mutant template that does not show false positives and contains only 0.3% in the wild-type template can be detected, which is a correct judgment. I got the result.
In addition, the fact that the K-ras gene in which codon 13 containing 0.3% of the total number of copies of the K-ras gene is a G13D mutant can be detected without false positives means that circulating blood can be detected. It shows that the tumor-derived codon 13 present in the K-ras gene, which is a G13D mutant, can be detected to the extent that it can be used clinically.

Claims (12)

下記（１）、（２）又は（３）のフォワードプライマーセットである、核酸増幅法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅するためのＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセット：
（１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット、
（２）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット、
（３）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
を含むフォワードプライマーセット。 The forward primer set for K-ras gene amplification for amplifying the region containing codon 13 of the K-ras gene by the nucleic acid amplification method, which is the forward primer set of (1), (2) or (3) below:
(1) A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and a forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
Forward primer set, including
(2) A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
Forward primer set, including
(3) A forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a forward primer, which is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
Forward primer set including. 請求項１に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセットを用いるＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法。 The K-ras gene amplification method using the forward primer set for K-ras gene amplification according to claim 1. 試料中の核酸を鋳型として、前記Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセットを一反応液中で用いてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅すること、を含む請求項２に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法。 The K according to claim 2, wherein the region containing the codon 13 of the K-ras gene is amplified by using the forward primer set for K-ras gene amplification in one reaction solution using the nucleic acid in the sample as a template. -Ras gene amplification method. 請求項２又は請求項３に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅方法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅することと、
前記増幅の増幅産物から得た一本鎖核酸と、前記増幅産物から得た一本鎖核酸にハイブリダイズするプローブとのハイブリッドを形成することと、
前記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、前記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動を測定することと、
前記シグナルの変動に基づいてＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することと、を含む多型解析方法。 Amplification of the region containing the codon 13 of the K-ras gene by the K-ras gene amplification method according to claim 2 or 3,
To form a hybrid of a single-stranded nucleic acid obtained from the amplification product of the amplification and a probe that hybridizes to the single-stranded nucleic acid obtained from the amplification product.
By changing the temperature of the reaction solution containing the hybrid and measuring the fluctuation of the signal based on the dissociation state of the hybrid,
A polymorphism analysis method comprising analyzing a polymorphism of codon 13 of the K-ras gene based on the variation of the signal. 前記増幅することと、前記ハイブリッドを形成することとが同時に進行する、請求項４に記載の多型解析方法。 The polymorphism analysis method according to claim 4, wherein the amplification and the formation of the hybrid proceed simultaneously. 前記プローブがＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域にハイブリダイズするプローブである、請求項４又は請求項５に記載の多型解析方法。 The polymorphism analysis method according to claim 4 or 5, wherein the probe hybridizes to a region containing codon 13 of the K-ras gene. 前記プローブが蛍光標識化プローブである、請求項４〜請求項６のいずれか一項に記載の多型解析方法。 The polymorphism analysis method according to any one of claims 4 to 6, wherein the probe is a fluorescently labeled probe. 請求項４〜請求項７のいずれか一項に記載の多型解析方法によりＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３の多型を解析することと、
前記コドン１３が野生型である場合と比較して、コドン１３の多型がＧ１３Ｄ変異型であった場合に抗上皮成長因子受容体抗体薬の薬効が低いと判定することと、を含む薬効判定方法。 Analyzing the polymorphism of codon 13 of the K-ras gene by the polymorphism analysis method according to any one of claims 4 to 7.
Judgment of efficacy including determining that the efficacy of an anti-epidermal growth factor receptor antibody drug is lower when the polymorphism of codon 13 is a G13D mutant as compared with the case where the codon 13 is a wild type. Method. 請求項１に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセットを含む、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅するためのＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット。 A kit for amplifying a K-ras gene for amplifying a region containing codon 13 of the K-ras gene, which comprises the forward primer set for amplifying the K-ras gene according to claim 1. Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域を増幅するための１以上のリバースプライマーを含む、請求項９に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット。 The kit for K-ras gene amplification according to claim 9 , which comprises one or more reverse primers for amplifying a region containing codon 13 of the K-ras gene. Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１３を含む領域にハイブリダイズするプローブを含む、請求項９又は請求項１０に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット。 The kit for K-ras gene amplification according to claim 9 or 10 , which comprises a probe that hybridizes to a region containing codon 13 of the K-ras gene. 前記プローブが蛍光標識化プローブである、請求項１１に記載のＫ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット。 The K-ras gene amplification kit according to claim 11 , wherein the probe is a fluorescently labeled probe.
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