KR100874378B1 - Method for identifying hanwoo meat by using single nucleotide polymorphisms - Google Patents

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KR100874378B1
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김관석
윤두학
김종주
김희발
박찬규
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충북대학교 산학협력단
대한민국(관리부서:농촌진흥청)
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Abstract

A polynucleotide or its complementary polynucleotide, and a method for discriminating the Korean beef and the imported beef by using the polynucleotide are provided to allow the Korean beef and the imported beef to be discriminated easily with a high precision. A polynucleotide useful for the discrimination of the Korean beef and the imported beef comprises continuous 8-100 nucleotides which contains the 251th nucleotide of the first sequence, the second sequence, the fourth sequence, the sixth sequence, and the eighth sequence to the 13th sequence, the 256th nucleotide of the third sequence, the 287th nucleotide of the fifth sequence, or the 328th nucleotide of the seventh sequence.

Description

단일염기다형성을 이용한 한우육 판별방법{Method for Identifying Hanwoo Meat by Using Single Nucleotide Polymorphisms} Method for Identifying Hanwoo Meat by Using Single Nucleotide Polymorphisms}

본 발명은 한우육과 수입우육을 판별할 수 있는 단일뉴클레오타이드다형성(single nucleotide polymorphisms, SNP) 마커 및 이를 이용한 한우육과 수입우육의 판별방법 및 판별키트에 관한 것이다. The present invention relates to a single nucleotide polymorphisms (SNP) marker capable of discriminating Korean beef and imported beef, and a method and a discrimination kit of Korean beef and imported beef using the same.

일반적으로 선진국에서는 쇠고기의 부정유통 및 광우병 또는 다른 질병 등을 방지하기 위하여 원산지를 추적할 수 있는 방법이 이용되고 있는데, 유럽의 경우 원산지로부터 개체 식별이 된 소만이 도축되거나 이동될 수 있도록 의무적으로 이표 (귀에 부착된 바코드 표식)를 달도록 제도화 되어 있으며 도축 후에는 생축에서 확인된 바코드 번호가 연계되어 상품에 부착됨으로 인해 유통점에서 쇠고기의 원산지가 추적되는 시스템을 채택하고 있다. 그러나 우리나라 및 일본 등지에서는 외국산 쇠고기와 국내산 쇠고기 및 한우 쇠고기의 가격차이가 매우 높기 때문에, 의도적으로 도축 후에 한우 및 한우이외의 품종임을 증명하는 서류 등을 부정하게 사 용하여 유통질서의 문란을 초래하고 있다. 또한 의도적이지 않는 경우에도 소의 개체 식별체계(이표)의 오류 등의 원인으로 완벽한 한우육 및 수입우육 등의 정보가 연계되지 못하고 있다. 이에 몇몇 나라에서는 유전자 감식 기법의 도입을 통한 소 품종식별 및 원산지 정보의 진위 여부을 시도하고 있다. Generally, in developed countries, a method of tracking the origin is used to prevent illegal distribution of beef and mad cow disease or other diseases.In Europe, only mandatory cattle can be slaughtered or moved. It is institutionalized to attach a bar code marker attached to the ear, and after the slaughter, the bar code number identified in the livestock is attached to the product so that the origin of the beef is tracked in the distribution store. However, in Korea and Japan, the price difference between foreign beef, domestic beef, and Korean beef is very high. Therefore, after slaughter, intentionally using documents that prove that they are varieties of Hanwoo and other Korean beef are causing fraud. . In addition, even if it is not intentional, the information such as perfect beef and imported beef is not linked due to the error of cow's individual identification system. Therefore, some countries are trying to verify the authenticity of cattle breeding and origin information through the introduction of genetic identification techniques.

DNA 분석에 의한 소 품종을 구분할 수 있는 기술개발에 대한 연구보고는 몇몇 국내 연구진들에 의해 보고된 바 있다(1, 2, 3). RAPD 분석방법에 의한 한우와 젖소의 판별기술 개발에 대한 보고가 있었으나 신뢰도가 평균 95%이하였고(2), 이미 보고된 SCAR 마커는 이전 방법보다 신뢰도 및 재현성에서는 비교적 높은 기술임을 인정받았으나 이 역시 정확도에 있어서는 100%에 못미침으로 인하여 만족할 만한 신뢰를 얻지 못하였다(3). 한편 김 등(4)은 소의 모색에 관련하는 유전자로부터 품종구별을 위한 유전자 감식기법을 개발하였으나, 이는 한우와 홀스타인 종의 젖소, 즉 황갈색과 검정색의 모색을 구분할 수 있으나, 한우와 같은 모색의 리무진종이나 모색이 흰색이 샤로레종 등은 구분이 불가능하다.Research reports on technology development that can distinguish cattle breeds by DNA analysis have been reported by several domestic researchers (1, 2, 3). Although there have been reports on the development of discrimination techniques between Korean cattle and cows by RAPD method, the reliability was less than 95% (2), and the previously reported SCAR markers were recognized to be relatively higher in reliability and reproducibility than the previous method, but this is also accurate. In Esau, less than 100% did not yield satisfactory confidence (3). On the other hand, Kim et al. (4) developed a genetic identification method for differentiating breeds from genes related to cow groping, but it is possible to distinguish between cows of Korean cattle and Holstein, ie, tan and black. There is no distinction between white paper and color schemes, such as Charorion.

소의 게놈 상에서 개체 식별이 가능한 도메인(domain)은 소의 품종에 따라 다양하게 나타나기 때문에, 한우의 개체 식별을 위해서는 한우의 특이적인 유전양상에 근거한 DNA　표지인자를 선정하여, 이들을 활용한 유전자 감식 기법을 설정하는 것이 매우 중요하다. 또한, 현재 개발된 일부의 초위성체(microsatellite) 표지인자들은 친자확인과 한우 품종 식별을 위한 방법으로 일부 이용되고 있다. SNP (Single Nucleotide Polymorphisms, 단일염기다형성) 마커들은 최근에 마커로서 활발하게 개발되고 있다. SNPs 는 인간지놈의 경우 가장 많은 변이이며 1.9Kb 당 하 나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다. SNPs는 매우 안정된 유전적 마커이고, 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형규명 시스템에 매우 적합하다. 특히, SNP 마커들은 초위성체 마커들 보다 안정적으로 존재하고, 주요 경제형질과의 연관성 분석과, 대량분석이 용이한 잇점이 있다. 하지만 유용한 SNP 마커 발굴에 많은 비용이 요구되어, 한우육 식별에서 필요한 대량의 SNP 마커 정보는 미흡한 실정이었다. Since the domains that can identify individuals in the cow's genome vary depending on the breed of the cow, DNA identification markers based on the specific genetic characteristics of the cattle are selected for the identification of the cattle, and the genetic identification method is used. It is very important to. In addition, some of the currently developed microsatellite markers have been used as a method for paternity and Korean cattle breed identification. Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) markers have recently been actively developed as markers. SNPs are the most mutated in the human genome and are believed to exist at one SNP rate per 1.9 Kb. SNPs are very stable genetic markers, sometimes directly affecting the phenotype, and are well suited for automated genotyping systems. In particular, SNP markers exist more stably than supersatellite markers, and have an advantage of easy correlation with major economic traits and mass analysis. However, it was very expensive to find useful SNP markers, and the large amount of SNP marker information needed for Korean beef meat identification was insufficient.

당업계에서는 종래부터 한우 독자적인 유전자정보은행의 구축을 통해 한우 품종집단에 맞는 SNP 마커좌위들의 선별과 유전자감식법의 개발이 절실히 요구되어 왔다. 특히, 한우 품종이 특이적으로 가지는 SNP 마커 좌위들의 염기서열들을 확보할 경우, 이들 SNP 좌위들을 대량으로 정확하게 판별할 수 있는 다양한 최신 DNA 분석기법에 적용할 수 있어, 이들 SNP 좌위들의 선정은 본 발명이 속하는 기술분야에서 매우 중요한 의미를 갖고 있다. In the art, there has been an urgent need for the development of genetically sensitive methods for selection of SNP marker loci suitable for the Korean cattle breed group through the establishment of an independent genetic information bank. In particular, when securing the nucleotide sequences of the SNP marker loci that Hanwoo cultivar specifically has, it can be applied to a variety of modern DNA analysis methods that can accurately identify these SNP loci in large quantities, the selection of these SNP loci is the present invention It has a very important meaning in the technical field to which it belongs.

대한민국 등록특허 제10-0653400호에는 한우육을 판별하는 프로브, 프라이머, 이를 이용한 한우육 판별방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 특허 기술은 모색을 지배하는 유전자 중에 하나인 Melanocortin 1 receptor (MC1R) 유전자의 구아닌 (G)이 결여된 부분을 이용하여 검정 모색인 Holstein 품종 젖소나 Angus 육우만을 식별하는 것이다. 따라서 MC1R의 유전자를 이용한 한우육 감별은 정확하게 말하자면 한우와 수입우육간의 비교가 아니라 황갈색과 검정모색의 소고기를 구분하는 것이기 때문에, 수입우육 중에서 황갈색, 흰색, 적갈색 품종에서 유래된 소고기는 MC1R 유전자형이 한우형으로 나올 수 있는 문제점이 있다. Korean Patent No. 10-0653400 discloses a probe, a primer for discriminating Korean beef, and a method for discriminating Korean beef using the same. However, the patent technique uses only the lack of guanine (G) of the Melanocortin 1 receptor (MC1R) gene, one of the genes that control the groping, to identify only black cultivated Holstein breed cows or Angus beef cattle. Therefore, the distinction between Hanwoo beef using the MC1R gene is not exactly a comparison between Hanwoo and imported beef, but the distinction between yellowish brown and black-colored beef. Among the imported beef, the MC1R genotype is Korean beef type. There is a problem that can come out.

또한, 한우육과 다양한 수입우육을 감별하기 위해서는 복수개의 DNA 마커로부터 한우와 연관성이 높은 최적 DNA 표지인자 마커 세트를 선별하여야 하는데 종래의 초위성체 마커를 이용하는 경우에는 DNA 검사에 필요한 비용이 높고, 유전자형 분석에 정확성이 SNP 마커보다 낮고, 상대적으로 분석자동화가 어려운 단점을 가지고 있었다. In addition, in order to discriminate between beef cattle and various imported beef, an optimal DNA marker marker set highly related to Korean cattle is selected from a plurality of DNA markers. When using a conventional supersatellite marker, the cost required for DNA testing is high, and genotyping is performed. Accuracy was lower than that of SNP markers, and analysis automation was difficult.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. Throughout this specification, many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.

본 발명자들은 한우육과 수입우육을 유전자수준의 뉴클레오타이드 변이를 이용하여 용이하게 판별할 수 있는 유전자 마커를 개발하고자 한우와 수입우의 DNA 염기서열을 심도있게 비교 연구한 결과, 수입우 품종 또는 한우 품종에서만 높은 빈도로 나타나는 SNP 마커를 발굴하였고, 이들 SNP 마커들을 이용하면 수입우육과 한우육을 매우 높은 정확도로 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors conducted an in-depth comparison of the DNA sequences of Hanwoo and imported cows to develop genetic markers that can easily distinguish between Korean beef and imported beef using gene-level nucleotide variations. The present invention was completed by confirming that SNP markers appearing in frequency and using these SNP markers can distinguish imported beef and Korean beef with very high accuracy.

따라서 본 발명의 목적은 한우육과 수입우육을 판별하는 데 유용하게 사용되는 SNP 마커를 제공하는 데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a SNP marker useful for discriminating Korean beef and imported beef.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 이용하여 한우육과 수입우육을 판별하는 방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for discriminating Korean beef and imported beef using the SNP marker.

본 발명의 또 다른 목적은 한우육과 수입우육을 판별하는 데 사용되는 SNP 마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다. Still another object of the present invention is to provide a kit for detecting SNP markers used for discriminating Korean beef and imported beef.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. The objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 한우육 - 수입우육 판별에 유용한 폴리뉴클레오타이드 및 이에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. According to an aspect of the present invention, the present invention provides the 251th nucleotide of SEQ ID NO: 1, 2nd, 4th, 6th, 8th to 13th sequence, 256th nucleotide of 3rd sequence, It consists of 8-100 contiguous nucleotides comprising the 287th nucleotide of the 5th sequence, or the 328th nucleotide of the 7th sequence, and provides polynucleotides useful for the discrimination between Korean beef and imported beef and complementary polynucleotides thereof.

본 발명자들은 한우육과 수입우육을 유전자수준의 뉴클레오타이드 변이를 이용하여 용이하게 판별할 수 있는 유전자 마커를 개발하고자 한우와 수입우의 DNA 염기서열을 심도있게 비교 연구한 결과, 수입우 품종과 한우 품종에서만 특이적으로 높은 빈도로 나타나는 SNP 마커를 발굴하였고, 이들 SNP 마커를 조합하면 수입우육과 한우육을 매우 높은 정확도로 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors conducted an in-depth comparison of the DNA sequences of Hanwoo and imported cows to develop genetic markers that can easily distinguish between Korean beef and imported beef using gene-level nucleotide variations. The present invention was completed by confirming that SNP markers appearing at high frequency, and by combining these SNP markers, can identify imported beef and Korean beef with very high accuracy.

본 발명의 SNP 마커는 소(bovine)에 적용되며, 가장 바람직하게는 한우와 수입우에 모두 적용된다. The SNP marker of the present invention is applied to bovine, and most preferably to both Korean cattle and imported cattle.

본 발명의 명세서에서 용어 "한우(韓牛, Korean Cattle, Hanwoo)" 는 종래부터 한반도에서 운반용이나 농경용으로 사육해오던 재래종의 역우(役牛)를 말하는 것으로 한국소(Bos taurus coreanae)를 의미한다. In the present specification, the term "Korean Cattle, Hanwoo" Refers to a reverse cow of a conventional species that has been bred for transportation or farming in the Korean peninsula. It means Korean cattle ( Bos taurus coreanae) .

본 발명의 명세서에서 용어“수입우”는 한우를 제외한 외국으로부터 수입된 모든 외래품종의 소를 의미한다. 수입우 품종의 구체적인 예로는 헤리퍼드(Hereford)종, 홀스타인(Holstein)종, 앵거스(Angus)종, 브라만(Brahman)종, 리무진(Limousin)종, 저지(Jersey)종을 들 수 있다. In the specification of the present invention, the term "imported cow" means cows of all foreign varieties imported from foreign countries except Korean beef. Specific examples of imported cattle breeds include Hereford, Holstein, Angus, Brahman, Limousin, and Jersey.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term "nucleotide" is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide that exists in single- or double-stranded form and includes analogs of natural nucleotides unless otherwise specified (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열의 251번째 뉴클레오타이드 m이 A, 상기 서열목록 제 2 서열의 251번째 뉴클레오타이드 y가 C 또는 T, 상기 서열목록 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드 y가 C, 상기 서열목록 제 4 서열의 251번째 뉴클레오타이드 s가 G, 상기 서열목록 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드 r이 T, 상기 서열목록 제 6 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 G, 상기 서열목록 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드 w가 A, 상기 서열목록 제 8 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 A, 상기 서열목록 제 9 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 G, 상기 서열목록 제 10 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 G, 상기 서열목록 제 11 서열의 251번째 뉴클레오타이드 s가 C, 상기 서열목록 제 12 서열의 251번째 뉴클레오타이드 m이 C, 또는 상기 서열목록 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 G인 상기 SNP 염기를 포함하여 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 한우육-수입우육 판별에 유용한 폴리뉴클레오타이드 및 이에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the present invention provides the 251th nucleotide m of SEQ ID NO: 1, the 251 nucleotide y of the sequence 2 is C or T, the 256th sequence of the third sequence Nucleotide y is C, 251 nucleotide s of the sequence 4th sequence is G, 287 nucleotide r of the sequence 5th sequence is T, 251 nucleotide r of the sequence 6th sequence is G, the sequence list 328 nucleotide w of the seventh sequence is A, 251 nucleotide r of the SEQ ID NO: 8 sequence is A, 251 nucleotide r of the SEQ ID NO: 9 sequence is G, 251 nucleotide r of the SEQ ID NO: 10 sequence Is G, 251 nucleotide s of SEQ ID NO: 11 is C, 251 nucleotide m of SEQ ID NO: 12 is C, or Composed of the 251st nucleotide r 8-100 consecutive nucleotides, including G of the SNP nucleotide in the list of the 13 sequences is hanwooyuk - it provides a useful polynucleotide and thus complementary to the polynucleotide to determine beef imports.

본 발명의 SNP 마커를 한우육과 수입우육의 판별에 사용할 수 있는 것은 SNP 변이 위치에서 특정의 염기가 수입우 또는 한우에서 높은 빈도로 나타나는 것에 근 거한 것이다. 예를 들어, 서열목록 제 1 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP는 A 또는 C 염기인 다형성을 나타내는데, 이 SNP에서 A/A인 동형유전자형이 수입우에서는 92.5 ％의 빈도로 나타나며, 한우에서는 40.3％의 빈도로 나타난다. 따라서, 우육에서 서열목록 제 1 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 마커가 A/A의 동형유전자형으로 나타나면, 한우육이 보다는 수입우육일 확률이 높다고 판단할 수 있다. The use of the SNP marker of the present invention for discriminating between Korean beef and imported beef is based on the high frequency of a specific base in imported or Korean beef at the SNP mutation site. For example, the SNP corresponding to the 251th nucleotide of the first sequence of the sequence listing shows a polymorphism, A or C base, in which the homozygous genotype A / A is 92.5% in imported cattle and 40.3 in Korean cattle. It appears at a frequency of%. Therefore, if the SNP marker corresponding to the 251th nucleotide of the first sequence of the sequence list in the beef cattle is A / A homozygous, it may be determined that the beef cattle are more likely to be imported beef.

본 발명은 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 13 서열에서 각 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다.The present invention relates to base variants of each SNP position in the SEQ ID NO: 1 to 13 sequence, but when such SNP base mutations are found in double stranded genomic DNA (gDNA), complementary to the nucleotide sequence described above It is also interpreted to include polynucleotide sequences. Thus, the base of the SNP position in the complementary polynucleotide sequence also becomes the complementary base.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 한우육과 수입우육의 판별 방법을 제공한다: (a) 한우육 또는 수입우육으로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및 (b) 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP)의 염기타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for discriminating Korean beef and imported beef, comprising the steps of: (a) separating nucleic acid molecules from Korean beef or imported beef; And (b) 251 nucleotides of SEQ ID NO: 1, 2nd, 4th, 6th, 8th to 13th sequences, 256th nucleotide of the 3rd sequence, 287th nucleotide of the 5th sequence, Or identifying the base type of the single nucleotide polymorphism (SNP) corresponding to the 328th nucleotide of the seventh sequence in the isolated nucleic acid molecule.

본 명세서에서 용어 “핵산분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타 이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)) As used herein, the term “nucleic acid molecule” is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides that are the basic building blocks of nucleic acid molecules are naturally occurring nucleotides, as well as sugar or base sites. Also includes analogs modified (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990))

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산분자는 우육의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다.In the method of the invention, the nucleic acid molecule can be obtained from various sources of beef, for example from muscle, epidermis, blood, bone, organs, and most preferably from muscle or blood.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). If the starting material in the process of the invention is gDNA, isolation of gDNA can be carried out according to conventional methods known in the art (Rogers & Bendich (1994)). If the starting material is mRNA, total RNA is isolated and carried out by conventional methods known in the art. See Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press ( Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons (1987); and Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162: 156 (1987)). The isolated total RNA is synthesized into cDNA using reverse transcriptase. Since the total RNA is isolated from animal cells, it has a poly-A tail at the end of the mRNA, and cDNA can be easily synthesized using oligo dT primer and reverse transcriptase using this sequence characteristic (see PNAS). USA, 85: 8998 (1988); Libert F, et al., Science, 244: 569 (1989); and Sambrook, J. et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001) )).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되 는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the method of the present invention, step (b) may be carried out by applying various methods known in the art used to identify specific sequences. For example, techniques applicable to the present invention include fluorescence phosphorylation hybridization (FISH), direct DNA sequencing, PFGE analysis, Southern blot analysis, single-strand conformation analysis (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86: 2776 (1989)), RNase protection assay (Finkelstein et al., Genomics, 7: 167 (1990)), dot blot analysis, denaturation gradient gel electrophoresis (DGGE, Wartell et al., Nucl. Acids Res. 18: 2699 (1990)), methods using proteins that recognize nucleotide mismatches (e.g., mutS protein of E. coli) (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25: 229-253 (1991)), and Allele-specific PCR, including but not limited to.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다. Sequence changes result in differences in base bonds within single-stranded molecules, resulting in different bands of mobility, which SSCA detects. DGGE analysis uses denaturation gradient gels to detect sequences that exhibit mobility different from wild-type sequences. Other techniques generally employ probes or primers that are complementary to sequences comprising the SNPs of the invention. For example, in RNase protection assays riboprobes complementary to the sequences comprising the SNPs of the invention are used. DNA or mRNA isolated from the riboprobe and the plant are hybridized and then cleaved with an RNase A enzyme capable of detecting mismatches. If there is a mismatch and RNase A recognizes, a smaller band is observed.

혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정한다. In assays using hybridization signals, probes complementary to the sequences comprising the SNPs of the invention are used. In this technique, hybridization signals of probes and target sequences are detected to directly determine whether SNP variants are present.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. As used herein, the term “probe” refers to a linear oligomer having naturally occurring or modified monomers or bonds, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides that can hybridize to a particular nucleotide sequence. Preferably, the probe is single stranded for maximum efficiency in hybridization. The probe is preferably deoxyribonucleotide.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다. As the probe used in the present invention, a sequence perfectly complementary to the sequence including the SNP may be used, but a sequence complementarily complementary to a range that does not prevent specific hybridization may be used. It may be. Preferably, the probes used in the present invention are SNP nucleotides 251 nucleotides of the first sequence, the second sequence, the fourth sequence, the sixth sequence, the eighth sequence to the thirteenth sequence, and the 256th sequence of the third sequence. And a sequence capable of hybridizing to a sequence comprising 8-100 consecutive nucleotides comprising a nucleotide, a 287th nucleotide of the fifth sequence, or a 328th nucleotide of the seventh sequence. More preferably, the 3'-end or 5'-end of the probe has a base complementary to the SNP base. In general, since the stability of duplexes formed by hybridization tends to be determined by the consensus of the sequences of the ends, the ends in probes having bases complementary to the SNP base at the 3'- or 5'-ends If the parts are not hybridized, these duplexes can be dismantled under stringent conditions. Conditions suitable for hybridization include Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC Decisions may be made with reference to those disclosed in (1985). Stringent conditions used for hybridization can be determined by adjusting the temperature, ionic strength (buffer concentration), the presence of compounds such as organic solvents, and the like. Such stringent conditions can be determined differently depending on the sequence being hybridized.

본 발명 방법의 단계 (b)는 대립형-특이 유전자 증폭 방법에 의해 실시될 수 있다. SNP가 유전자 증폭 방법에 적용되는 경우, 특히 SNAP (single nucleotide amplified polymophism)라 통칭된다. Step (b) of the method of the invention can be carried out by an allele-specific gene amplification method. When SNPs are applied to gene amplification methods, they are collectively called single nucleotide amplified polymophism (SNAP).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 유전자 증폭은 SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍(primer pair)을 기본적으로 이용한다. According to a preferred embodiment of the invention, such gene amplification is the SNP nucleotides of SEQ ID NO: 1st, 2nd, 4th, 6th, 251th nucleotides of 8th to 13th sequence, 3rd sequence Primer pairs designed to amplify a polynucleotide comprising a 256th nucleotide, a 287th nucleotide of a fifth sequence, or a 328th nucleotide of a seventh sequence are basically used.

본 발명의 명세서에서 “프라이머(primer)”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.A “primer” in the context of the present invention is a single strand of oligonucleotide, suitable conditions (the presence of four different nucleoside triphosphates and polymerases such as DNA or RNA polymerases), suitable temperatures and suitable It is meant to act as an initiation point that can initiate template-directed DNA synthesis under a buffer.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정 확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다. The suitable length of the primer is determined by the nature of the primer to be used, but is usually used as a length of 15 to 30 bp. The primers need not be exactly complementary with the sequence of the template, but must be complementary enough to form a hybrid-complex with the template.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭 (참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다. Amplification techniques that can be used in the methods of the invention include PCR amplification (Miller, HI (WO 89/06700) and Davey, C. et al. (EP 329,822)), ligase chain reactions (LCR, Wu, DY) et al., Genomics 4: 560 (1989)), polymerase ligase chain reaction (Barany, PCR Methods and Applic., 1: 5-16 (1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain Reactions (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86: 1173 (1989)) and NASBA (US Pat. No. 5,130,238). Most preferably according to the PCR amplification step.

증폭기술이 적용되는 경우에, 본 발명의 SNP 염기를 확인하기 위해 적합한 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다. Where amplification is applied, it is important to design suitable primers to identify the SNP bases of the present invention.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 (ⅰ) SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 인접한 서열과 어닐링하며, (ⅱ) 3‘말단의 뉴클레오타이드가 상기 SNP 뉴클레오타이드로부터 -1 위치의 뉴클레오타이드와 매칭되도록 디자인된 지노타이핑(genotyping) 프라이머를 이용하여 SNP 뉴클레오타이드의 염기 타입을 분석하는 방법을 제공한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the present invention relates to (251) 251th nucleotide, 3rd sequence of SEQ ID NO: 1st, 2nd, 4th, 6th, 8th to 13th sequence of SNP nucleotides. Anneal with a sequence adjacent to the 256th nucleotide of the sequence, the 287th nucleotide of the fifth sequence, or the 328th nucleotide of the seventh sequence, and (ii) the nucleotide at the 3 'end matches the nucleotide at position -1 from the SNP nucleotide Provided are methods for analyzing the base type of SNP nucleotides using designed genotyping primers.

상기 본 발명의 바람직한 구현예에서 증폭 반응액 중에 각각 상이한 색의 형광을 나타내도록 표지된 다이데옥시아데노신트리포스페이트(ddATP), 다이데옥시사 이토신트리포스페이트(ddCTP), 다이데옥시구아노신트리포스페이트(ddGTP), 및 다이데옥시티미딘트리포스페이트(ddTTP)를 포함하여 증폭 반응시킨다. In a preferred embodiment of the present invention, a dideoxy adenosine triphosphate (ddATP), a dideoxy cytosine triphosphate (ddCTP), and a dideoxy guanosine triphosphate (ddGTP) labeled so as to show fluorescence of different colors in the amplification reaction solution, respectively. ), And dideoxythymidine triphosphate (ddTTP).

상기와 같이 디자인한 지노타이핑 프라이머와, 반응기질로서 ddATP, ddCTP, ddGTP 및 ddTTP를 반응액에 포함시켜 증폭 반응시키면 지노타이핑 프라이머의 3‘말단으로부터 타깃 SNP 뉴클레오타이드와 매칭되는 1개의 염기만이 익스텐션(extension)되며, 익스텐션된 염기의 타입은 형광에 의해 용이하게 확인할 수 있다(도 2a 및 도 2b 참조). 이러한 방법에 의해 SNP 뉴클레오타이드의 타입을 결정할 수 있다. When amplification reaction was carried out by including the genotyping primer designed as described above and ddATP, ddCTP, ddGTP and ddTTP as a reaction material in the reaction solution, only one base matching the target SNP nucleotide from the 3 'end of the genotyping primer was extended ( The type of the extended base can be easily identified by fluorescence (see FIGS. 2A and 2B). By this method the type of SNP nucleotide can be determined.

PCR에 의한 증폭 반응의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 사용할 수 있다. The conditions of the amplification reaction by PCR and the reagents and enzymes used may be those known in the art.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)에서, 소에서의 서열목록 제 1 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 A/A인 동형 유전자형, 서열목록 제 2 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/C인 동형 유전자형, 서열목록 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/C인 동형 유전자형, 서열목록 제 4 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형 유전자형, 서열목록 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 T/T인 동형 유전자형, 또는 서열목록 제 6 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형 유전자형으로 확인되면 수입우육으로 판별한다. According to a preferred embodiment of the present invention, in step (b), the homologous genotype of the SNP position corresponding to the 251 nucleotide of the first sequence of the sequence in bovine A / A, the 251 nucleotide of the second sequence of the sequence Isotype genotype with S / C position corresponding to C / C, homologous genotype corresponding to 256th nucleotide of sequence 3rd sequence, and SNP position corresponding to 251th nucleotide of sequence 4th sequence as SNP position is C / C Isotype genotype G / G, isotype genotype corresponding to SNP position 287 nucleotide of SEQ ID NO: 5, or isotype genotype corresponding to SNP position corresponding to 251 nucleotide of SEQ ID NO: 6 sequence If it is identified as genotype, it is discriminated as imported beef.

본 발명의 SNP 마커를 한우육과 수입우육의 판별에 사용할 수 있는 근거는 SNP 변이 위치에서 특정의 염기가 수입우 또는 한우에서 높은 빈도로 나타나는 것에 기초한 것이다. 예를 들어, 한우 및 수입우에서 서열목록 제 1 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP는 A 또는 C 염기인 다형성을 나타내는데, 이 SNP에서 A/A인 동형유전자형이 수입우에서는 92.5 ％의 빈도로 나타나며, 한우에서는 40.3％의 빈도로 나타난다. 따라서, 우육에서 서열목록 제 1 서열의 251번재 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 A/A의 동형유전자형으로 나타나면, 한우육 보다는 수입우육일 확률이 높다고 판단할 수 있다. The basis for the use of the SNP marker of the present invention for discriminating between Korean beef and imported beef is based on the high frequency of a specific base in the imported or Korean cattle. For example, in Korean cattle and imported cattle, the SNP corresponding to the 251st nucleotide of the first sequence of the sequence list shows a polymorphism of A or C base, where the homozygous genotype A / A in the SNP is 92.5% in imported cattle. In Korean cattle, the frequency is 40.3%. Therefore, if the SNP corresponding to the 251st nucleotide of the first sequence of the sequence list in the beef cattle is A / A homozygous, it can be determined that the imported beef is more likely than the beef cattle.

한편, 한우와 비교하여 수입우에서 더 많은 빈도로 나타나는 SNP가 더 많은 수로 나타날수록 분석대상이 수입우일 확률이 높아진다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 의하면, 수입우육 판단에 대한 정확도를 높이기 위해, 특정 우육의 SNP 분석결과, 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 6 서열에서 표시되는, 한우와 비교하여 수입우에서 더 많은 빈도로 나타나는 SNP가 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 보다 바람직하게는 4 개 이상 나타나면 수입우육으로 판단한다. On the other hand, the more frequent SNPs appear in imported cattle compared to Korean cattle, the higher the probability of being an imported cattle. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, in order to increase the accuracy of the imported beef, SNP analysis of a specific beef, as shown in the first to sixth sequence of the sequence list, compared to the Korean cattle, If two or more SNPs appearing more frequently, preferably three or more, more preferably four or more, it is judged as imported beef.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 단계 (b)에서, 소에서의 서열목록 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/A, A/A, 또는 A/T의 동형(homozygote) 또는 이형(heterozygote) 유전자형으로 확인되면 수입우육으로 판별한다. According to a preferred embodiment of the present invention, in step (b), the SNP position corresponding to the 328th nucleotide of the seventh sequence in bovine is C / A, A / A, or A / T homozygous ) Or heterozygote genotype is determined as imported beef.

상기 소에서의 서열목록 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치에서 A 뉴클레오타이드가 나타날 빈도는 수입우에서는 9.6％이며, 한우에서는 0％이다. The frequency of occurrence of A nucleotide at the SNP position corresponding to the 328th nucleotide of the seventh sequence in the cattle sequence is 9.6% in imported cattle and 0% in Korean cattle.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 단계 (b)에서, 소에서의 서열목록 제 2 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 T/T인 동형유전자형, 서열목록 제 8 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 A/A인 동형유전자형, 서열목록 제 9 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형유전자형, 서열목록 제 10 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형유전자형, 서열목록 제 11 서열의 287번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/C인 동형유전자형, 서열목록 제 12 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/C인 동형유전자형, 또는 서열목록 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형유전자형이면 한우육으로 판별한다. According to a preferred embodiment of the present invention, in step (b), the homologous of which the SNP position corresponding to the 251 nucleotide of the sequence 2nd sequence in the bovine is T / T, the 251 nucleotide of the sequence 8 sequence Homologous with the SNP position corresponding to A / A, homologous to the 251 nucleotide of SEQ ID NO: 9 sequence, homologous with the G / G homologous type, and SNP position corresponding to the 251 nucleotide of SEQ ID NO: 10 sequence Homozygous for G / G, homologous with SNP position corresponding to 287th nucleotide of SEQ ID NO: 11, C / C homozygous with SNP position corresponding to 251 nucleotide of SEQ ID NO: 12, C / C Or, if the SNP position corresponding to the 251 nucleotide of the 13th sequence is G / G homozygous genotype, it is discriminated as Korean beef.

예를 들어, 한우 및 수입우에서 서열목록 제 2 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치에서 T 또는 C 염기인 다형성을 나타내는데, 이 SNP에서 T/T인 동형유전자형이 한우에서는 85.9 ％의 빈도로 나타나며, 수입우에서는 12.3％의 빈도로 나타난다. 따라서, 우육에서 서열목록 제 2 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 T/T의 동형유전자형으로 나타나면, 수입우육 보다는 한우육일 확률이 높다고 판단할 수 있다. For example, in Korean cattle and imported cattle, a polymorphism of T or C base at the SNP position corresponding to the 251st nucleotide of the second sequence of the sequence listing shows a polymorphism of T / T in the SNP with a frequency of 85.9% in Korean cattle. In imported cattle, the frequency is 12.3%. Therefore, if the SNP corresponding to the 251 th nucleotide of the second sequence in the beef cattle is the homozygous type of T / T, it may be determined that the beef is more likely than the beef cattle.

한편, 수입우와 비교하여 한우에서 더 많은 빈도로 나타나는 SNP가 더 많은 수로 나타날수록 분석대상이 한우일 확률이 높아진다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 의하면, 한우육 판단에 대한 정확도를 높이기 위해, 특정 우육의 SNP 분석 결과, 상기 서열목록 제 2 서열 및 제 8 서열 내지 제 13 서열에서 표시 되는, 수입우와 비교하여 한우에서 더 많은 빈도로 나타나는 SNP가 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 보다 바람직하게는 4 개 이상 나타나면 한우육으로 판단한다.On the other hand, the more frequent SNPs appear in Korean cattle compared to the imported cattle, the more likely the target is Korean cattle. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, in order to increase the accuracy of the determination of the beef cattle, compared to the imported cattle, which is displayed in the second sequence and the eighth to thirteenth sequence of the sequence list, as a result of SNP analysis of specific beef If two or more SNPs appearing more frequently in Korean cattle, preferably three or more, and more preferably four or more, it is judged as Korean beef.

한편, 본 발명의 명세서에서 사용된 용어 SNP 위치에서의 "동형 유전자형 (homozygotic genotype)" 이란 SNP 변이 위치에 해당하는 상동 염색체(homologous chromosome)상의 대립형 염기(allelic base)가 서로 동일한 염기인 경우를 의미하며, SNP 변이 위치에서의 "이형 유전자형 (heterozygotic genotype)" 란 SNP 변이 위치에 해당하는 상동 염색체상의 대립형 염기가 서로 다른 염기인 경우를 의미한다. Meanwhile, the term "homozygotic genotype" at the term SNP position used in the specification of the present invention refers to a case where allelic bases on homologous chromosomes corresponding to SNP mutation positions are the same bases. The term “heterozygotic genotype” at an SNP mutation position refers to a case where allelic bases on homologous chromosomes corresponding to SNP mutation positions are different bases.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 포함하는 한우육과 수입우육의 판별용 키트를 제공한다. According to another aspect of the present invention, SEQ ID NO: 1 sequence, 2nd sequence, 4th sequence, 6th sequence, 251 nucleotides of the 8th to 13th sequence, 256th nucleotide of the third sequence, the fifth sequence Provided are a kit for discriminating Korean beef and imported beef, comprising a pair of primers designed to amplify a polynucleotide comprising a 287th nucleotide or a 328th nucleotide of a seventh sequence.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트에서 (ⅰ) 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 인접한 서열과 어닐링하며, (ⅱ) 3‘말단의 뉴클레오타이드가 상기 SNP 뉴클레오타이드로부터 -1 위치의 뉴클레오타이드와 매칭되는, 지노타이핑 프라이머를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트를 제공한다. According to a preferred embodiment of the present invention, in the kit (iii) the 251 nucleotide of the first sequence, the second sequence, the fourth sequence, the sixth sequence, the eighth to the thirteenth sequence, 256 of the third sequence Annealed with a sequence adjacent to the first nucleotide, the 287th nucleotide of the fifth sequence, or the 328th nucleotide of the seventh sequence, and (ii) the nucleotide at the 3 'end matches the nucleotide at position -1 from the SNP nucleotide. It provides a kit, characterized in that it further comprises a primer.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트에서 각각 상이한 색의 형광을 나타내도록 표지된, 다이데옥시아데노신트리포스페이트(ddATP), 다이데옥시사이토신트리포스페이트(ddCTP), 다이데옥시구아노신트리포스페이트(ddGTP), 다이데옥시티미딘트리포스페이트(ddTTP)를 더욱 포함하는 키트를 제공한다. According to another preferred embodiment of the present invention, dideoxy adenosine triphosphate (ddATP), dideoxycytosine triphosphate (ddCTP), dideoxyguanosine triphosphate, each labeled in the kit to show fluorescence of different colors (ddGTP), dideoxythymidinetriphosphate (ddTTP) is further provided.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. When the kit of the present invention is subjected to a PCR amplification process, the kit of the present invention may optionally contain reagents necessary for PCR amplification, such as buffers, DNA polymerases (eg, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus). filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis or heat stable DNA polymerase obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase cofactors and dNTPs. Kits of the invention can be prepared in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above.

본 발명에서 발굴된 SNP 마커 및 SNP 마커를 확인할 수 있는 키트를 이용하면 한우육과 수입우육을 매우 높은 정확도로 판별하는 것이 가능하여, 한우육과 수입우육의 판별에 용이하게 이용될 수 있다. When using the kit that can identify the SNP markers and SNP markers discovered in the present invention, it is possible to discriminate between the beef cattle and imported beef with a very high accuracy, it can be easily used for discrimination between the beef cattle and imported beef.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예 Example

실험재료 및 실험방법 Experimental Materials and Methods

한우 및 Hanwoo and 수입우의Imported DNADNA 샘플 Sample

한우육과 수입우육을 판별할 수 있는 SNP 마커를 발굴하기 위해, 한우 보증종모우 24두의 혈액 샘플을 준비하였고, 수입우로서 헤리퍼드(Hereford) 24두, 리무진(Limousin) 24두의 혈액샘플을 준비하였다. In order to identify SNP markers that can distinguish between Korean beef and imported beef, blood samples of 24 Korean bovine bovine cattle were prepared, and blood samples of 24 Hereford and 24 limousin were used as imported cattle. Ready.

서열분석 및 SNP 발굴Sequencing and SNP Discovery

Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)에 개시된 방법에 따라, 한우 및 수입우(헤리퍼드 품종 및 리무진 품종)의 혈액샘플로부터 DNA를 분리하였다. Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. DNA was isolated from blood samples of Korean cattle and imported cattle (Hereford varieties and limousine varieties) according to the method disclosed in Cold Spring Harbor Press (2001).

훼스트 다이-기초 프로토콜에 따라 형광 스펙트로포토미터를 이용하여 DNA 농도를 측정하였다 (모델 F-4500, Hitachi Ltd., Ibaragi, 일본). Tris-EDTA 완충액 (pH 8.0)으로 DNA 용액을 실험 농도까지 희석하고 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. DNA concentration was measured using a fluorescence spectrophotometer according to the pest die-based protocol (Model F-4500, Hitachi Ltd., Ibaragi, Japan). DNA solution was diluted to experimental concentration with Tris-EDTA buffer (pH 8.0) and stored at -20 ° C until use.

한우 및 수입우를 판별할 수 있는 SNP 발굴용 PCR 프라이머는 Bovine Genome Sequence (Baylor College of Medicine의 Human Genome Sequencing Center) 연구 결과로부터, 헤리퍼드(Hereford) 종의 암소의 염기서열을 주형(template, reference) 서열로 하여, 홀스타인(Holstein)종, 앵거스(Angus)종, 브라만(Brahman)종, 리무진(Limousin)종, 저지(Jersey)종의 염기서열과 비교하여 얻은 SNP를 근거로 하여 선정하였다. PCR primers for SNP discovery that can discriminate between Korean and imported cows are based on the Bovine Genome Sequence (Human Genome Sequencing Center of Baylor College of Medicine) study. As a reference) sequence, it was selected based on the SNP obtained by comparing the nucleotide sequences of Holstein, Angus, Brahman, Limousin, and Jersey.

증폭반응물은 지놈 DNA 50 ng, 전방향 및 역방향 프라이머 각각 3.2 pmol, 각각의 dNTP 200 μM, 1.5 mM MgCl2, 1 x 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl) 및 AmpliTaq Gold DNA 중합효소 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 1 U를 포함하며, 총 50 ㎕이었다. 반응 혼합물을 94 ℃에서 4분 동안 변성한 다음, 94 ℃ 30초, 50-65 ℃ 30초 어닐링 및 72 ℃ 1분으로 총 30사이클을 증폭하였다. PCR 생성물을 1.0% 에티늄 브로마이드-염색 아가로스 젤에서 전기영동 하였다. 단일 단편으로 증폭된 PCR 생성물은 서열결정에서 주형으로 이용되었다. PCR 반응물을 NucleoSpin Extract kit (MACHEREY-NAGEL Inc., Easton City, PA, 미국)로 정제하고, BigDye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 서열결정 반응을 실시한 다음, ABI PRISM 3700 DNA sequencer로 최종적으로 서열을 결정하였다. Amplification reactions were 50 ng of genome DNA, 3.2 pmol each of forward and reverse primers, 200 μM of each dNTP, 1.5 mM MgCl 2 , 1 × reaction buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl) and AmpliTaq Gold DNA polymerization Enzyme (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA) 1 U, total 50 μl. The reaction mixture was denatured at 94 ° C. for 4 minutes and then amplified a total of 30 cycles at 94 ° C. 30 seconds, 50-65 ° C. 30 seconds annealing and 72 ° C. 1 minute. PCR products were electrophoresed on 1.0% ethinium bromide-stained agarose gel. PCR products amplified into single fragments were used as templates in sequencing. Purify the PCR reaction with NucleoSpin Extract kit (MACHEREY-NAGEL Inc., Easton City, PA, USA), perform sequencing reaction with BigDye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), and then ABI PRISM The sequence was finally determined by 3700 DNA sequencer.

프라이머primer 디자인 및  Design and SNaPshotSNaPshot

SNP 분석을 위한 SNP 위치 포함 DNA 단편을 얻기 위해 PCR 프라이머와, ABI SNaPshot 분석을 위한 SNP 지노타이핑 프라이머(SNP Genotyping primer)를 디자인 하였다. PCR은 주형 DNA 10-100 ng, 전방향 및 역방향 프라이머 각각 5 μM, 각각의 dNTP 100μM, 1.5 mM MgCl2, 1 x 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl) 및 Taq DNA 중합효소 (AmpliTaq Gold 중합효소, Applied Biosystems, Foster City, CA, 미국) 1 U를 포함하는 총 20 ㎕의 반응물에, ABI SNaPshot 분석을 위해, 각각 상이한 색깔의 형광물질로 표지된 4개의 ddNTP (ddATP=green, ddCTP=black, ddGTP=blue, ddTTP=red)를 첨가하여 실시하였다. 써머 사이클러(ABI PRISM 3100 DNA analyzer)를 이용하여 주형 DNA를 우선 95℃에서 5분 동안 변성한 다음, 다음 조건으로 PCR 증폭 30 사이클을 실시하였다: 96℃ 10초, 50℃ 5초 및 60℃ 30초. SNP의 염기 타입은 피크 컬러에 의해 확인하였다. PCR primers and SNP Genotyping primers for ABI SNaPshot analysis were designed to obtain SNP site-containing DNA fragments for SNP analysis. PCR was performed using 100-100 ng of template DNA, 5 μM each of forward and reverse primers, 100 μM of each dNTP, 1.5 mM MgCl 2 , 1 × reaction buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl) and Taq DNA polymerase. (AmpliTaq Gold Polymerase, Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA) A total of 20 μl of the reaction containing 1 U, four ddNTPs (ddATP = green), each labeled with different colored phosphors for ABI SNaPshot analysis. , ddCTP = black, ddGTP = blue, ddTTP = red). Template DNA was first denatured at 95 ° C. for 5 minutes using an ABI PRISM 3100 DNA analyzer, followed by 30 cycles of PCR amplification under the following conditions: 96 ° C. 10 seconds, 50 ° C. 5 seconds, and 60 ° C. 30 seconds. The base type of SNP was confirmed by the peak color.

실험결과 Experiment result

PCR 프라이머를 이용한 한우 및 수입우 사이의 SNP 발굴Discovery of SNPs between Hanwoo and Imported Cows Using PCR Primers

본 발명의 SNP는 헤리퍼드(Hereford) 종의 암소의 염기서열을 템플레이트 (reference) 서열로 하여 홀스타인(Holstein)종, 앵거스(Angus)종, 브라만(Brahman)종, 리무진(Limousin)종, 저지(Jersey)종의 염기서열과 비교하여 얻은 SNP를 기초로하여 발굴하였다. 우선, 브라만 품종과 헤리퍼드 품종 사이에서 발견된 SNP를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(BR 프라이머, 30개)와, 리무진 품종과 헤리퍼드 품종 사이에서 발견된 SNP를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(LM 프라이머, 74개)를 선정하였다. BR 프라이머 30개를 사용하여 헤리퍼드종 24두와 한우종 24두 를 PCR 증폭하여 PCR 생성물을 직접 서열분석함으로써 69개의 SNP들을 발견할 수 있었다. 또한, LM 프라이머 74개를 사용하여 리무진종 24두와 한우종 24두에 대해 PCR 증폭하여 PCR 생성물을 직접 서열분석함으로써 204개의 SNP 들을 발굴하였다.The SNP of the present invention is a Holstein species, Angus species, Brahman species, Limousin species, jersey, using the base sequence of Cow of Hereford species as a template sequence. Excavation was performed based on SNPs obtained by comparison with the nucleotide sequence of (Jersey) species. First, PCR primers for amplifying SNPs found between Brahman and Hereford varieties (BR primers, 30) and PCR primers for amplifying SNPs found between limousine and Hereford varieties ( LM primers, 74) were selected. 69 SNPs were found by PCR amplification of 24 Hereford species and 24 Hanwoo species using 30 BR primers. In addition, 204 SNPs were identified by PCR sequencing the PCR products by PCR amplification of 24 limo species and 24 Korean cattle species using 74 LM primers.

염기서열분석을 통해 발굴된 SNP 들에 대한 대립유전자 빈도분포를 살펴보면 다음 [표 1]과 같다. An allele frequency distribution for SNPs discovered through sequencing is shown in Table 1 below.

[표 1] : BR 및 LM 프라이머에서 SNP 대립유전자의 빈도분포Table 1: Frequency distribution of SNP alleles in BR and LM primers

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Figure 112007056608679-pat00001

한우육과Korean Beef 수입우육을Imported beef 판별할 수 있는  Discernible SNPSNP 마커Marker 발굴 excavation

한우와 수입우에서 나타나는 SNP의 빈도차를 이용하여 한우육과 수입우육을 판별할 수 있는 SNP 마커들을 발굴하였다. SNP 마커들의 빈도차는 다음 표 2와 같았다. SNP markers for discriminating Korean beef and imported beef were identified by using the difference in the frequency of SNPs in Korean and imported cattle. The frequency difference between the SNP markers is shown in Table 2 below.

[표 2] : BR 및 LM 프라이머들에서 SNP 대립유전자들의 빈도차이 Table 2: Frequency Differences of SNP Alleles in BR and LM Primers

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Figure 112007056608679-pat00002

SNP 염기 분석을 위한 SNaPshot 분석SNaPshot analysis for SNP base analysis

한우와 수입우 사이에서 빈도차가 큰 SNP 마커 21개를 선별한 후, PCR 프라이머와 SNP 지노타이핑 프라이머를 디자인하여 한우육과 수입우육의 DNA 샘플 480 점에 대해 Multiplex SNaPshot 분석을 행하였다. 실험에 사용한 PCR 프라이머와 SNP 지노타이핑 프라이머는 하기의 표 3 내지 표 6에 나타내었다. After selecting 21 SNP markers with a large difference in frequency between Korean cattle and imported cattle, PCR primers and SNP genotyping primers were designed, and multiplex SNaPshot analysis was performed on 480 DNA samples of Korean cattle and imported cattle. PCR primers and SNP genotyping primers used in the experiments are shown in Tables 3 to 6 below.

[표 3]: Multiplex SNaPshot Assay Kit 1 Table 3: Multiplex SNaPshot Assay Kit 1

Figure 112007056608679-pat00003
Figure 112007056608679-pat00003

[표 4]: Multiplex SNaPshot Assay Kit 2 Table 4: Multiplex SNaPshot Assay Kit 2

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Figure 112007056608679-pat00004

[표 5]: Multiplex SNaPshot Assay Kit 3 Table 5: Multiplex SNaPshot Assay Kit 3

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[표 6]: Multiplex SNaPshot Assay Kit 4 Table 6: Multiplex SNaPshot Assay Kit 4

Figure 112007056608679-pat00006
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한우와 수입우육에서 추출된 DNA 샘플들에 대해 SNaPshot 기법을 이용하여 분석한 결과를 이용하면 다음의 표 7와 같다. The DNA samples extracted from Korean beef and imported beef are analyzed using SNaPshot.

[표 7]: 한우-수입우에서 Snapshot 분석에 의한 대립유전자의 빈도Table 7: Frequency of alleles by Snapshot analysis in Hanwoo-imported cattle

Figure 112007056608679-pat00007
Figure 112007056608679-pat00007

상기 Multiplex SNaPshot 분석 결과 21개의 SNP 마커중에서 총 13개의 SNP 마커가 한우와 수입우의 DNA 샘플사이에서 유의적인 차이를 나타내었다. SNaPshot 방법으로 분석된 21개 SNP좌위를 이용하여 한우 및 수입우육의 품종식별에 대한 통계분석은 본 자료 특성과 품종 분별의 정확도 및 신뢰도를 높이기 위하여 베이지안방법 (Rannala & Mountain, 1997)과 Monte Carlo resampling method (Paetkau et al. 1994)을 적용한 Geneclass2 프로그램을 이용하여 수행하여 품종할당력(inclusion power)이란 통계량을 추정하였고, 그 결과는 다음 표 8와 같다. In the Multiplex SNaPshot analysis, a total of 13 SNP markers among 21 SNP markers showed a significant difference between the DNA samples of Korean cattle and imported cattle. Statistical analysis on the breed identification of Korean cattle and imported beef using 21 SNP loci analyzed by SNaPshot method was carried out using Bayesian method (Rannala & Mountain, 1997) and Monte Carlo resampling to improve the accuracy and reliability of this data. By using the Geneclass2 program to which the method (Paetkau et al. 1994) was applied, the statistics of the inclusion power were estimated. The results are shown in Table 8.

[표 8] : SNP를 이용한 한우 및 수입우육의 품종식별 통계분석[Table 8]: Statistical Analysis of Breed Identification of Korean Beef and Imported Beef Using SNP

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Figure 112007056608679-pat00008

한우 및 Hanwoo and 수입우육Imported beef 판별을 위한  For discrimination SNPSNP 마커의Of marker 조합 Combination

상기 결과를 바탕으로 SNP 대립유전자 유전자형을 이용하여 한우육과 수입우육의 판별에 사용하기 위한 SNP 마커는 다음 표 9과 같다. Based on the results, SNP markers for use in discriminating between Korean beef and imported beef using the SNP allele genotype are shown in Table 9 below.

[표 9] : 수입우육을 판별하기 위한 SNP 마커 및 유전자형 Table 9: SNP markers and genotypes for discriminating imported beef

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상기 6개의 마커 유전자형중 4개 이상이 수입우에서 높게 나타나는 동형유전자형을 갖는 경우 수입우육으로 판별한다. LM104 마커의 경우 A 대립유전자형을 갖는 경우 수입우육으로 판별한다. When four or more of the six marker genotypes have homozygous genotypes that are high in imported cattle, they are determined as imported beef. In the case of the LM104 marker, if it has the A allele type, it is determined as imported beef.

[표 10] : 한우육을 판별하기 위한 SNP 마커 및 유전자형 Table 10: SNP markers and genotypes for discriminating Korean beef

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Figure 112007056608679-pat00010

7개의 SNP 마커 유전자형 가운데 4개 이상이 한우육에서 높게 나타나는 동형유전자형을 갖는 경우 한우육으로 판별한다. If four or more of the seven SNP marker genotypes have homozygous genotypes that are high in Korean beef, they are identified as Korean beef.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

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22. Paetkau, D., and C. Strobeck Microsatellite analysis of genetic variation in black bear populations. Mol. Ecol. 3: 489-495(1994). 22. Paetkau, D., and C. Strobeck Microsatellite analysis of genetic variation in black bear populations. Mol. Ecol. 3: 489-495 (1994).

도 1은 한우 품종에 특이적인 SNP 마커 발굴을 위하여 이용한 헤리퍼드(Hereford)와 리무진(Limousin) 품종간에 염기서열 분석을 단계를 개략적으로 묘사한 것이다. FIG. 1 schematically illustrates the sequence analysis between Hereford and Limousin varieties used to discover SNP markers specific to Hanwoo cultivar.

도 2a는 ABI SNaPshot 방법에서 지노타이핑 프라이머(Geno-typing primer)에 의해 SNP 염기의 타입을 확인하는 방법의 원리를 도식하는 도면이다. Figure 2a is a diagram illustrating the principle of the method for identifying the type of SNP base by the geno-typing primer (Geno-typing primer) in the ABI SNaPshot method.

도 2b는 1 염기 익스텐션(one-base-extension) 방법에 의해 생성된 형광물질 표지된 생성물을 분석하는 원리를 설명하는 도면이다.FIG. 2B is a diagram illustrating the principle of analyzing fluorophore labeled products produced by the one-base-extension method.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Method for Idenfifying Hanwoo Meat by Using Single Nucleotide Polymorphisms <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 501 <212> DNA <213> Bovine <400> 1 tggagtttag tttagaaagg gtaacagaca ttctttaaat ttaagggtag taggtactac 60 aaagtgtgtt gtgaaagtgc acaataaaga atttaaccta gtctggggtt taatttgagt 120 tttccaagat ttaaagggtg agaatcatat ggccaggcta acagtggagg aatgatcttt 180 tccaggcaaa gagaatacca tatacaaagc ttaaaagaga aagaaatctc tcatgtggcc 240 taaaaggtcc mtccaactca aggggccacc agagaataac tgagaagtac agtggataaa 300 gaagagtggg ttattggtaa agctctaact acatgcaata ctgtagaaat actaaaaatt 360 gttcattgct tatctgaact tcaaatgtaa ccgagaattc ttgattttct acttgctaga 420 tctggcaacc cctgtaacta gggatgtcaa gagtagaaaa tatttcaagg aaagcacaac 480 aattacaaat cctatttaaa a 501 <210> 2 <211> 501 <212> DNA <213> Bovine <400> 2 atctgcaaaa tgcccatgcc ttttcagact gggagtgatc agaacacaga ggacagtcta 60 ggaggaccaa ggtgtgtttg tcaggagttt attaaaagga tggttgccaa 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actgatagaa tctggttgaa aacccaccag gtaagaattg tgtggaagat gacaaacaag 480 ctttgctgca gagaaaaagt c 501 <210> 4 <211> 501 <212> DNA <213> bovine <400> 4 ttaaaaaaat ttttatagta ttttagatga gttctaggtt catagccccc acatacacag 60 attctcccca cgtccatatc ccacaccaga tggtacatgt attattatca gtgcacctgt 120 gctgacatca ttgtcatcca aagcccctag ttcatgttcg ggttcaccct tggtatcgta 180 ccttctgagt tcaggtaaac gtatgatgac atatacccac tgccatagtg tcacgaaaag 240 tctctctgcc staaagtcct ctgtgccctg ctgatttttc cctccctcct cctcagcttc 300 tgtcaagtac agggccgttt gctatctcca ttgttttgct ttttcctgaa tctcgtacag 360 ctggaatcat acagcctcac cacagtggct tctttcagtt agtaatatac cctaagattc 420 ctccacatct tcgtgatttg agacctcatt tctttttagt gctgagtaat atttcagtgt 480 ctatatggac cacagttcat t 501 <210> 5 <211> 501 <212> DNA <213> Bovine <400> 5 tgtgaccttg atgagtcctg tagttgttct caggttctgt ttcaaaatag caaaaaaaaa 60 aaaaaaaaat tactgatacc tgccttgcag ggttttagat tgccaataac gtgtataaaa 120 tgtatagaac cgtgctggca tcttgtgctg cccaatgtgc atgtcatcat tatttatgta 180 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gaggagtcac ccaatgacaa aaaggtcata tctcccaacc 120 tgttcaagct gtttattgtt catgatgacc aggaaaatga ggtgctgaat gacacacaca 180 gcatcctgag cccacagaac tgaggtctat acatcaatcc catccctgga aagagaagag 240 atcttggcat rtcagctcag caactgagag gctgcttctc actgatcagg gcttgactta 300 tgctcaaatc tatcaatatt ttacctcaga gctgctatga gaaaaacagt ttcaaggttc 360 caggtatacc cctgacctta gctagatccc ttgcaaatgt atggtcttgg ttatttccta 420 ccaagggaaa taactcaaaa tttgccccaa taaccaaggg ttagtcaaag tacacacaaa 480 acaagagaaa aagcatgtcc a 501 <110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Method for Idenfifying Hanwoo Meat by Using Single Nucleotide          Polymorphisms <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 501 <212> DNA <213> Bovine <400> 1 tggagtttag tttagaaagg gtaacagaca ttctttaaat ttaagggtag taggtactac 60 aaagtgtgtt gtgaaagtgc acaataaaga atttaaccta gtctggggtt taatttgagt 120 tttccaagat ttaaagggtg agaatcatat ggccaggcta acagtggagg aatgatcttt 180 tccaggcaaa gagaatacca tatacaaagc ttaaaagaga 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<213> Bovine <400> 3 atctgcaaaa tgcccatgcc ttttcagact gggagtgatc agaacacaga ggacagtcta 60 ggaggaccaa ggtgtgtttg tcaggagttt attaaaagga tggttgccaa tcacatttct 120 agttggtctc taaatctctt ttcatgtttt ctggtcattg ggaccttttc aagtgagtca 180 ttgggtgagt aatagttcat tatttgtgac acagtgataa agaatctata gaagatgtgg 240 gttcaatccc ygtgtyggga agatcccctg gagaagggaa tgactaccca ctccagtatt 300 cttgcctggg agatcccacg gacagaagag cctgcaacct acaatccatg aggttgcaaa 360 gagtagggca tgattgagca ctcagcactt aagatcataa tggggatgta agatagcata 420 actgatagaa tctggttgaa aacccaccag gtaagaattg tgtggaagat gacaaacaag 480 ctttgctgca gagaaaaagt c 501 <210> 4 <211> 501 <212> DNA <213> bovine <400> 4 ttaaaaaaat ttttatagta ttttagatga gttctaggtt catagccccc acatacacag 60 attctcccca cgtccatatc ccacaccaga tggtacatgt attattatca gtgcacctgt 120 gctgacatca ttgtcatcca aagcccctag ttcatgttcg ggttcaccct tggtatcgta 180 ccttctgagt tcaggtaaac gtatgatgac atatacccac tgccatagtg tcacgaaaag 240 tctctctgcc staaagtcct ctgtgccctg ctgatttttc cctccctcct 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tatggtgttt ttcagggttt ttatcatcct tgaccttctt gaggttaagt gaccagaagt 180 aatccctgcc gtcccttcat tctttctgga gttatttctc cactgatctc cagtagcata 240 ttgggcactt rccgacctgg ggacttcctc tctcaatatc ctatcatttt gccttttcat 300 acttttcatg gggttctcca ggcaagaata tttaagtggt ttaccactcc cttctccagt 360 ggaccacatt ctgactcatt ggaaaagacc ctgatgctgg gaggaattgg gggcaggagg 420 agaaggggac gacagagaat gagatggctg gatggcatca ctgactcaat ggacatgagt 480 ttgagtgaac tccgggagtt g 501 <210> 10 <211> 501 <212> DNA <213> Bovine <400> 10 ctttatccag gtaacctcgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnna cactgcagag ggaggagtcc cttttcctgg agcagagctg tcatctgaat 120 tttgccatat agtgaagtcc ctttagtctt tacctaagaa acaaattaac agggagggag 180 ctatgtcttg ttatactttt tactcaagac ttgaatgaat atattagttt taagacttta 240 aatcagaaag rtcagcagtg ataaagttcc ttagcagttc aattattttt gtatatattt 300 taattgtgct taacagaaat tgctcctgtt ctgtcttgtt tgttataatt atgttttaaa 360 aacagacaca cccattgata cttggttaac atttgaatcc aatattgaga atgttctctg 420 tacagattac tttaaattgg atagtacaat tgagaagcag ttctgatgta cacttacatc 480 tcaggctctt ccagaacgtg c 501 <210> 11 <211> 501 <212> DNA <213> Bovine <400> 11 gtccatcacc aactcccaga gtttacccaa actcacgtcc cttagagttc ttagttctct 60 ttaatagccc agtcttcttc tgtttttcaa gatttgtttt cattttgact gttaactgcc 120 ccctcaactc caaaccttgc tttctttttt ctcagcagta ctattagctg ataattctag 180 ttttaataat tggtttaaaa tatttctagt cttttttatt tacaaggtat gtattgagcc 240 cttattagca sagagaatat agaaatgatt ttgaaagatg ttactctttt caaaatgcta 300 cttttcaaaa tcaggagcct gttaaatgtt ataagccaat ttacttgaaa aaatgatttg 360 gacctcaagg aaagaatata acgcccttag aaagaaattg accattcaaa aactttccct 420 atatttggat atgaactgaa atttggatat ggactgaaat cagtttttta aattttttgt 480 ttttgttttc catgttttca g 501 <210> 12 <211> 501 <212> DNA <213> Bovine <400> 12 ggtcctggtg cacacaagat tctgtttatg ccctccaaga gtctatttcc cagtcctgtg 60 taagttctgg cagctctatt gtggggttaa tggcgacctc ctccaagagg gcttatgcca 120 taccaagtct gctgcaccca gagcccctgt ccctgtggcc aaactgaccc atacctccac 180 aggagatgct caaacacagt tctgtctctg tggggtccct gggtcctggt gcgcacaagg 240 tttgtttgag mcttctgagc atctctggcg ggaatagggt ttgattctaa acatgaatga 300 ggtggttata cttggagaag gcattttcat ggagttttgg ttgacaggta agattttaat 360 aagcaaagtg aatgagaggg tccaagaagt gcattacatg agggggaaag aacaggataa 420 aggtacagag agagtccact gactttttca gaggagaagg caaacattcc agggtagaga 480 catgtgctcc aaggtgatat t 501 <210> 13 <211> 501 <212> DNA <213> Bovine <400> 13 gctgatttct tatctttggt tttctcattt cctttcctta agggttttgc tagtatcagt 60 gcattcctcc tgaagctggt gaggagtcac ccaatgacaa aaaggtcata tctcccaacc 120 tgttcaagct gtttattgtt catgatgacc aggaaaatga ggtgctgaat gacacacaca 180 gcatcctgag cccacagaac tgaggtctat acatcaatcc catccctgga aagagaagag 240 atcttggcat rtcagctcag caactgagag gctgcttctc actgatcagg gcttgactta 300 tgctcaaatc tatcaatatt ttacctcaga gctgctatga gaaaaacagt ttcaaggttc 360 caggtatacc cctgacctta gctagatccc ttgcaaatgt atggtcttgg ttatttccta 420 ccaagggaaa taactcaaaa tttgccccaa taaccaaggg ttagtcaaag tacacacaaa 480 acaagagaaa aagcatgtcc a 501  

Claims (12)

서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 한우육-수입우육 판별에 유용한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드. SEQ ID NO: 1st, 2nd, 4th, 6th, 251th nucleotides of the 8th to 13th sequences, 256th nucleotide of the 3rd sequence, 287th nucleotide of the 5th sequence, or 7th sequence A polynucleotide consisting of 8-100 contiguous nucleotides comprising the 328 th nucleotide of and useful for the determination of beef-import beef, or a complementary polynucleotide thereof. 제 1 항에 있어서, The method of claim 1, 상기 서열목록 제 1 서열의 251번째 뉴클레오타이드 m이 A, 251 nucleotide m of the first sequence in the sequence listing is A, 상기 서열목록 제 2 서열의 251번째 뉴클레오타이드 y가 T, The 251th nucleotide y of the sequence 2nd sequence is T, 상기 서열목록 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드 y가 C, The 256th nucleotide y of the third sequence in the sequence listing is C, 상기 서열목록 제 4 서열의 251번째 뉴클레오타이드 s가 G, The 251th nucleotide s of the SEQ ID No. 4 sequence is G, 상기 서열목록 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드 r이 A, 287th nucleotide r of SEQ ID NO: 5 is A, 상기 서열목록 제 6 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 G, 251 nucleotide r of the SEQ ID NO: 6 is G, 상기 서열목록 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드 w가 A, The 328th nucleotide w of the seventh sequence is SEQ ID NO: 상기 서열목록 제 8 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 A, 251 nucleotide r of the SEQ ID NO: 8 sequence is A, 상기 서열목록 제 9 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 G, The 251th nucleotide r of the ninth sequence is G, 상기 서열목록 제 10 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 G, 251 nucleotide r of the SEQ ID NO: 10 sequence is G, 상기 서열목록 제 11 서열의 251번째 뉴클레오타이드 s가 C, The 251th nucleotide s of the 11th sequence is C, 상기 서열목록 제 12 서열의 251번째 뉴클레오타이드 m이 C, 또는 The 251th nucleotide m of the 12th sequence is C, or 상기 서열목록 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드 r이 G인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드. The nucleotide nucleotide r of the thirteenth sequence of SEQ ID NO: 13 is a polynucleotide, characterized in that G. 다음의 단계를 포함하는 한우육과 수입우육의 판별 방법: The method of discriminating Korean beef and imported beef includes the following steps: (a) 한우육 또는 수입우육으로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및 (a) separating nucleic acid molecules from Korean beef or imported beef; And (b) 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP)의 염기타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계. (b) 251 nucleotides of SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8-13, 256 nucleotides of 3rd sequence, 287 nucleotides of 5th sequence, or Identifying the base type of the single nucleotide polymorphism (SNP) corresponding to the 328th nucleotide of the seventh sequence in the isolated nucleic acid molecule. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산 분자를 증폭하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법. 4. The method of claim 3, wherein step (b) comprises: 251 nucleotides of SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 13, 256, nucleotide 3, And amplifying the isolated nucleic acid molecule using a primer pair designed to amplify a polynucleotide comprising a 287th nucleotide of a fifth sequence or a 328th nucleotide of a seventh sequence. 제 4 항에 있어서, (ⅰ) SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 인접한 서열과 어닐링하며, (ⅱ) 3´ 말단의 뉴클레오타이드가 상기 SNP 뉴클레오타이드로부터 -1 위치의 뉴클레오타이드와 매칭되는 지노타이핑(genotyping) 프라이머를 이용하여 SNP 뉴클레오타이드의 염기 타입을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법. The method according to claim 4, wherein (iii) the 251 nucleotide of SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8 to 13 of the sequence listing SNP nucleotides, 256 nucleotides of the third sequence, A genotyping primer that anneals with a 287th nucleotide of the fifth sequence, or a sequence adjacent to the 328th nucleotide of the seventh sequence, and (ii) a nucleotide at the 3 ′ end matches a nucleotide at position −1 from the SNP nucleotide. Method for characterizing the base type of the SNP nucleotides using. 제 5 항에 있어서, 증폭반응액 중에 각각 상이한 색의 형광을 나타내도록 표지된 다이데옥시아데노신트리포스페이트(ddATP), 다이데옥시사이토신트리포스페이트(ddCTP), 다이데옥시구아노신트리포스페이트(ddGTP), 및 다이데옥시티미딘트리포스페이트(ddTTP)를 첨가하여 증폭 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법. 6. The method according to claim 5, wherein the adenosine solution is labeled with dideoxyadenosine triphosphate (ddATP), dideoxycytosine triphosphate (ddCTP), dideoxyguanosine triphosphate (ddGTP), And adydeoxythymidine triphosphate (ddTTP) to amplify the reaction. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, 서열목록 제 1 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 A/A인 동형유전자형, 서열목록 제 2 서열의 251 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/C인 동형유전자형, 서열목록 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/C인 동형유전자형, 서열목록 제 4 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형유전자형, 서열목록 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 A/A인 동형유전자형, 또는 서열목록 제 6 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형유전자형으로 확인되면 수입우육으로 판별하는 것을 특징으로 하는 방법. 4. The homologous genotype according to claim 3, wherein in step (b), the SNP position corresponding to 251 nucleotide of SEQ ID NO: 1 is A / A, the SNP position corresponding to 251 nucleotide of SEQ ID NO: 2 is Isotype C / C, homologous with SNP position corresponding to 256th nucleotide of SEQ ID NO: 3 sequence, isotype with SNP position corresponding to 251th nucleotide of SEQ ID NO: 4, G / G Imported beef when the SNP position corresponding to 287th nucleotide of SEQ ID NO: 5 is A / A, or the homozygous type SNP position corresponding to 251 nucleotide of SEQ ID NO: 6 is G / G The method characterized in that for determining. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, 서열목록 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/A, A/A, 또는 A/T의 동형 또는 이형 유전자형으로 확인되면 수입우육으로 판별하는 것을 특징으로 하는 방법. 4. The imported beef meat according to claim 3, wherein in step (b), if the SNP position corresponding to the 328th nucleotide of SEQ ID NO: 7 is identified as C / A, A / A, or A / T isotype or heterozygous genotype The method characterized in that for determining. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, 서열목록 제 2 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 T/T인 동형유전자형, 서열목록 제 8 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 A/A인 동형유전자형, 서열목록 제 9 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형유전자형, 서열목록 제 10 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형유전자형, 서열목록 제 11 서열의 287번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/C 인 동형유전자형, 서열목록 제 12 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 C/C인 동형유전자형, 또는 서열목록 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP 위치가 G/G인 동형유전자형으로 확인되면 한우육으로 판별하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 3, wherein in step (b), the SNP position corresponding to the 251 nucleotide of the sequence 2nd sequence is T / T isotype, the SNP position corresponding to the 251 nucleotide of the sequence 8 sequence Homozygous for A / A, SNP position corresponding to 251 nucleotide of SEQ ID NO: 9 Sequence G / G Homozygous for S / L position corresponding to 251 nucleotide of SEQ ID NO: 10 Sequence, G / G , Isotype with an SNP position corresponding to 287th nucleotide of SEQ ID NO: 11 sequence C / C, isotype with a SNP position corresponding to 251th nucleotide of SEQ ID NO: 12 sequence, or SEQ ID NO: 13 If the SNP position corresponding to the 251 nucleotide of the sequence is identified as a homozygous type of G / G, characterized in that it is discriminated as Korean beef. 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 포함하는 한우육과 수입우육의 판별용 키트. SEQ ID NO: 1st, 2nd, 4th, 6th, 251th nucleotides of the 8th to 13th sequences, 256th nucleotide of the 3rd sequence, 287th nucleotide of the 5th sequence, or 7th sequence Kit for the determination of Korean beef and imported beef comprising a primer pair produced to amplify a polynucleotide containing the 328 nucleotide of the. 제 10 항에 있어서, (ⅰ) 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 4 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 내지 제 13 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 제 7 서열의 328번째 뉴클레오타이드에 인접한 서열과 어닐링하며, (ⅱ) 3‘말단의 뉴클레오타이드가 상기 SNP 뉴클레오타이드로부터 -1 위치의 뉴클레오타이드와 매칭되는 지노타이핑 프라이머를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트. The method of claim 10, wherein (iii) the 251 nucleotide of the first sequence, the second sequence, the fourth sequence, the sixth sequence, the eighth to thirteenth sequence, the 256th nucleotide of the third sequence, the fifth sequence Anneal with a sequence adjacent to the 287th nucleotide of, or the 328th nucleotide of the seventh sequence, and (ii) the nucleotide at the 3 'end further comprises a genotyping primer that matches the nucleotide at position -1 from the SNP nucleotide Kit made with. 제 11 항에 있어서, 각각 상이한 색의 형광을 나타내도록 표지된, 다이데옥시아데노신트리포스페이트(ddATP), 다이데옥시사이토신트리포스페이트(ddCTP), 다이데옥시구아노신트리포스페이트(ddGTP), 다이데옥시티미딘트리포스페이트(ddTTP)를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트. 12. Dideoxyadenosine triphosphate (ddATP), dideoxycytosine triphosphate (ddCTP), dideoxyguanosine triphosphate (ddGTP), and dideoxy, each labeled to fluoresce different colors. Kit comprising a thymidine triphosphate (ddTTP) further.
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