KR102457668B1 - 저분자량 실크 조성물 및 안정화 실크 조성물 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 특정한 특징 및/또는 특성을 갖는 특정 실크-피브로인 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 저분자량 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 활성 (예를 들어, 생물학적) 작용제 또는 성분을 포함하는 실크 피브로인 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 활성 (예를 들어, 생물학적) 작용제 또는 성분을 포함하는 저분자량 실크 피브로인 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 활성제는, 예를 들어 소정 시간의 기간 동안 및/또는 특정 조건 또는 경우에 대하여 실크 조성물 중에서 안정화된다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물 중에 존재하는 성분은 분석 및/또는 특성화 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물 중에 존재하는 성분은 조성물로부터 회수될 수 있다.

Description

저분자량 실크 조성물 및 안정화 실크 조성물 {LOW MOLECULAR WEIGHT SILK COMPOSITIONS AND STABILIZING SILK COMPOSITIONS}

정부 지원

본 발명은 DARPA에 의해 수여된 보조금 SB112-005 및 NIH에 의해 수여된 보조금 P41 EB002520 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.

배경기술

활성 제제 및/또는 생물학적 샘플의 안정화 및 차후의 회수는 많은 적용에서의 중요한 특징으로, 이는 활성 제제 및/또는 생물학적 샘플이 일반적으로 주변 조건, 예를 들어, 온도, 습도 및/또는 빛의 변화에 민감하고 불안정하기 때문이다. 활성 제제 또는 생물학적 샘플이 소정의 반응에 유용한 것으로 확인될지라도, 그것의 적용은 종종 제조 조건하에서 장기간 안정성의 부족으로 방해받는다.

활성 제제(예를 들어, 효소, 백신을 비롯한 치료 단백질) 및/또는 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액 및/또는 혈액 성분)을 안정화시키는 다양한 방법이 이용 또는 연구되어 왔으며, 이는 콜드-체인(cold-chain) 저장, 동결건조, 공유 고정화(covalent immobilization), 및 셀룰로오스-기반 기술을 포함한다. 그러나, 이러한 모든 방법들은 강렬한 에너지 요구 또는 활성 제제 및/또는 생물학적 샘플의 열악한 회수와 같은 결점들을 갖는다. 이러한 결점들은 주문형(on-demand) 또는 현장형(point-of-care) 적용에서 선택을 더욱 제한한다. 따라서, 활성 제제 및/또는 생물학적 샘플을 (예를 들어, 주위 조건에서) 안정화시킬 수 있고, 치료, 진단, 검출 및/또는 분석을 위해 안정화된 샘플로부터 충분한 양으로 다양한 분해물질의 회수를 가능하게 하는 개선된 기술 및/또는 제품 또는 새로운 물질에 대한 요구가 있다.

개요

본 개시내용은 신규하고/하거나 예상치못한 구조적 및/또는 기능적 특징 및/또는 특성을 갖는 특정 실크 피브로인 조성물들을 제공한다. 본 개시내용은 그러한 조성물들을 제조 및/또는 사용하는 방법 뿐만이나라 그들로 또는 그들로부터 이루어진 물품을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제공된 조성물들은 활성(예를 들어, 생물학적) 제제 또는 성분을 제공한다. 일부 실시양태에서, 활성 제제 또는 성분은 예를 들어, 실크 피브로인 및/또는 특정한 구조적 및/또는 기능적 특징 및/또는 특성의 결핍과 같은 다른 비교가능한 조건들과 비교했을 때 조성물 내에서 안정화된다.

다른 것들 중에서, 본원에 서술된 다양한 측면의 실시양태들은 저분자량 실크 피브로인계 실크 물질들이 많은 적용에 적합한 독특한 물질 특성을 제공한다는 발견으로부터 유래한다. 하기 상세하게 서술되는 바와 같이, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 조성물들은 통상의 실크 피브로인계 물질과 비교할 때 구분되는 또는 개선된 특정한 물질 특징들을 제공한다. 따라서, 한 측면에서, 다양한 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편들의 집단을 포함하는 저분자량 실크 피브로인 조성물이 본원에 제공되며, 상기 실크 피브로인 단편들의 집단은 집단 내 실크 피브로인 단편들의 총 수의 15% 이하가 200 kDa을 초과하는 분자량을 가지고, 집단 내 실크 피브로인 단편들의 총 수의 적어도 50%가 특정한 범위 내의 분자량을 가지며, 여기서 특정한 범위는 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa인 것을 특징으로 한다.

환언하면, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 조성물은 다양한 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편들의 집단을 포함할 수 있으며, 상기 실크 피브로인 단편들의 집단은 집단 내 실크 피브로인 단편들의 총 몰의 15% 이하가 200 kDa을 초과하는 분자량을 가지고, 집단 내 실크 피브로인 단편들의 총 몰의 적어도 50%가 특정한 범위 내의 분자량을 가지며, 여기서 특정한 범위는 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa인 것을 특징으로 한다.

저분자량 실크 피브로인 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 수용액이다. 본 발명자들은 놀랍게도 그 중에서 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 용액에 혼입된 또는 혼합된 제제(예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질, DNA, RNA 및/또는 이들의 변형과 같은 핵산, 치료제, 백신) 또는 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플)이 광범위한 온도하에서 일정 기간 동안 안정화될 수 있다는 것을 발견했다. 일부 실시양태에서는, 저분자량 실크 피브로인 용액에 혼입된 또는 혼합된 제제 또는 샘플은 예를 들어, 주위 조건(예를 들어, 실온) 및/또는 고온 조건(예를 들어, 60℃)을 비롯한 다양한 임의의 조건하에서 일정 기간, 예를 들어, 24시간 이상 동안 안정화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 고체 상태 형태, 예를 들어, 실크 피브로인 물품일 수 있다. 실크 피브로인 물품의 예는 필름, 시트, 겔 또는 히드로겔, 메쉬, 매트, 부직 매트, 직물, 스캐폴드, 튜브, 슬래브 또는 블록, 섬유, 입자, 분말, 3차원 구조물, 임플란트, 발포체 또는 스폰지, 바늘, 동결건조 물품, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 물품들은 생체흡수성 임플란트, 조직 스캐폴드, 봉합선, 강화 물질, 의료 기기, 코팅, 건축 재료, 상처 드레싱, 조직 실란트, 직물, 텍스타일 제품, 및 이들의 임의의 조합일 수 있다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 추가 가공을 위해 저분자량 실크 피브로인 용액 내로 쉽게 재구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품은 수용액 중 5% 이상의 용해도를 가질 수 있다. 즉, 저분자량 실크 피브로인 물품의 총 중량 또는 용적의 5% 이상이 수용액 중에 용해 또는 재구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품은 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상을 포함하여, 5% 이상의 용해도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품은 실온에서 가용화 또는 재구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품은 실온에서 탈이온수와 같은 물에 가용화 또는 재구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 주문형 적용에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품은 참조 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 통상의 실크-피브로인계 물질)에 비하여 수용액 중에서 향상된 용해도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용액 중의 저분자량 실크 피브로인 물품의 용해도는 참조 실크 피브로인 조성물과 비교할 때, 약 5% 이상 향상될 수 있다. 예를 들어, 수용액 중의 저분자량 실크 피브로인 물품의 용해도는 참조 실크 피브로인 조성물의 용해도와 비교할 때, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상을 포함하여, 5% 이상 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용액 중의 저분자량 실크 피브로인 물품의 용해도는 참조 실크 피브로인 조성물의 용해도와 비교할 때, 약 1.1배 이상 향상될 수 있다. 예를 들어, 수용액 중의 저분자량 실크 피브로인 물품의 용해도는 참조 실크 피브로인 조성물과 비교할 때, 예를 들어, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배 또는 그 이상을 포함하여, 1.1배 이상 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용액은 물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용액은 완충 용액, 예를 들어, 이제 제한되는 것은 아니지만 포스페이트 완충 용액일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품은 제제 또는 샘플의 안정화 및 이들의 차후 회수를 위해 적어도 하나의 제제 도는 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플)을 트랩핑하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 또는 샘플의 부분적 또는 원래의 부하는 수용액 중에 저분자량 실크 피브로인 물품의 일부 또는 분취량을 용해시킴으로써 저분자량 실크 피브로인 물품의 적어도 일부 또는 분취량으로부터 회수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품의 일부 또는 분취량은 실온에서 수용액(예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 탈이온수 또는 완충용액과 같은 물) 중에 용해될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품 내에 트랩핑된 활성 제제 또는 샘플(예를 들어, 생물학적 샘풀)은 수용액 중에서 5% 이상의 회수를 가질수 있다. 즉, 활성 제제 또는 샘플의 원래의 부하의 5% 이상은 용액 또는 액체 형태의 저분자량 실크 피브로인 물품으로부터 회수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품 내에 트랩핑된 활성 제제 또는 샘플(예를 들어, 생물학적 샘풀)은 수용액 중에서 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상을 포함하여, 5% 이상의 회수를 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 참조 실크 피브로인 조성물 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수에 비하여 그 안에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 향상된 회수를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수는 참조 실크 피브로인 조성물 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수와 비교할 때, 약 5% 이상 향상될 수 있다. 예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 물품 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수는 참조 실크 피브로인 조성물 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수와 비교할 때, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상을 포함하여 5% 이상 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수는 참조 실크 피브로인 조성물 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수와 비교할 때, 약 1.1배 이상 향상될 수 있다. 예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 물품 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수는 참조 실크 피브로인 조성물 내에 트랩핑된 제제 또는 샘플의 회수와 비교할 때, 예를 들어, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배 또는 그 이상을 포함하여 1.1배를 초과하여 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용액은 완충 용액, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 포스페이트 완충 용액일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 물품을 재구성하기 위한 완충 용액(예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 포스페이트 완충 용액)의 사용은 비-완충 용액(예를 들어, 물)의 사용가 비교할 때, 저분자량 실크 피브로인 물품에 혼입된 활성 제제 또는 샘플의 회수를 증가시킬 수 있다.

본원에 서술된 상이한 측면의 다양한 실시양태들에서, 참조 실크 피브로인 조성물은 약 60분 이하, 예를 들어, 60분 미만, 50분 미만, 40분 미만, 30분 미만, 20분 미만, 10분 미만 또는 더 짧게 동안 대기압 비등 온도에서 누에고치(silk cocoon)을 정련함으로써 생성된 조성물 또는 혼합물일 수 있다. 한 실시양태에서, 참조 실크 피브로인 조성물은 약 60분 이하, 예를 들어, 60분 미만, 50분 미만, 40분 미만, 30분 미만, 20분 미만, 10분 미만 또는 더 짧게 동안 수성 탄산나트륨 용액 중 대기압 비등 온도에서 누에고치를 정련함으로써 생성된 조성물 또는 혼합물일 수 있다.

본원에 제공된 또 다른 측면은 실크 피브로인 물품을 포함하는 보관-안정성 조성물에 관한 것으로, 여기서 실크 피브로인 물품은 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보관-안정성 조성물은 실크 피브로인 물품의 물질 특성이 한 달 이상 동안 안정하게 유지되는 보관-안정성이 있다. 일부 실시양태에서, 보관-안정성 조성물은 분말을 비롯한 입자의 형태로 존재하는 저분자량 실크 피브로인 조성물을 포함할 수 있다.

일반적으로, 본 개시내용은 특정 실크 피브로인 조성물이 활성(예를 들어, 생물학적) 및/또는 불안정한 개체의 혼입에 특히 유용하다는 인식을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 또는 그의 성분들과 같은 활성 및/또는 불안정한 제제를 포함하는 실크 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 제공되는 실크 조성물들(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물을 포함)은 활성 및/또는 불안정한 제제를 안정화시킨다(예를 들어, 생물학적 샘플 또는 그의 성분들을 안정화시킨다).

분말을 비롯한 저분자량 실크 피브로인 입자는 임의의 관련 분야에 인지된 방법에 의해 생성될 수 있는 반면에, 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 입자들은 저분자량 실크 피브로인 용액을 동결건조 시키고, 그렇게 함으로써 동결건조된 저분자량 실크 피브로인 물질 또는 입자를 형성하는 것을 포함하는 공정에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 저분자량 실크 피브로인 물질 또는 입자는 더 작은 입자로 추가로 축소될 수 있다. 한 실시양태에서, 동결건조된 저분자량 실크 피브로인 물질 또는 입자는 더 작은 입자 또는 분말을 생성하기 위해 추가로 분쇄될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 또 다른 측면은 저분자량 실크 피브로인 분말을 포함하는 보관-안정성 시약이다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 분말은 동결건조된 분말일 수 있다. 보관-안정성 시약은 키트의 일부 또는 용기, 예를 들어, 바이알, 시린지, 또는 샘플 수집 용기, 예를 들어 혈액 수집 용기, 또는 멀티-웰 플레이트로 제공될 수 있다.

본원에 서술된 다양한 실시양태들은 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태 및 안정화되는 것이 바람직한 제제를 포함하는 보관-안정성 조성물을 제공하며, 여기서 상기 제제는 저분자량 실크 피브로인 조성물 내에 혼입 또는 섞여있다. 일부 실시양태에서, 안정화되는 것이 바람직한 제제는 활성 제제일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질, 펩타이드, 핵산 분자, 및/또는 변형된 핵산 분자는 저분자량 실크 피브로인 조성물에서 안정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화되는 것이 바람직한 제제는 치료제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화되는 것이 바람직한 제제는 질병 또는 장애에 대한 진단 마커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화되는 것이 바람직한 제제는 샘플에 존재하는 하나 이상의 성분을 위해 분석되어야 하는 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플일 수 있다.

본원에 제공되는 또 다른 측면은 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태들 및 기질을 포함하는 실크 피브로인 물품에 관한 것이다. 저분자량 실크 피브로인 조성물은 기질에 분산, 기재 상에 침착, 또는 이들의 조합일 수 있다.

본원에 제공되는 또 다른 측면은 액체 중에 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태들을 용해시키는 것을 포함하는 실크 피브로인 용액을 형성하는 방법이며, 여기서 실크 피브로인 용액은 균질의 용액이다. 한 실시양태에서, 액체는 물, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 탈이온수이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "균질 용액" 일반적으로 용액 전체에 걸쳐 균일한 외관 또는 조성을 갖는 용액을 나타낸다. 예를 들어, 균일한 실크 피브로인 용액 중의 실크 피브로인 단편들 또는 입자들의 사이즈는 일반적으로 너무 작아서 예를 들어, 육안으로, 관찰 또는 검출할 수 없다. 환언하면, 균일한 실크 피브로인 용액은 실크 피브로인 응집물(예를 들어, 불용성 실크 피브로인 단편들, 실크 피브로인 입자들 및/또는 무리들)이 실질적으로 없다. 실크 피브로인 응집물의 예는 전장 실크 피브로인 분자, 더 큰 실크 피브로인 단편들, 더 작은 실크 피브로인 단편들의 집결 또는 응집에 의해 형성된 실크 피브로인 입자들 또는 무리들 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에 제공되는 또 다른 측면은 본원에 서술된 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태들에서 특정 조건하에 일정 기간 동안 제제를 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제제는 주위 조건하에서 안정화될 수 있다.

본원에 제공되는 추가 측면은 다음을 포함하는 적어도 하나의 활성 제제를 회수하는 방법이다: (a) 본원에 서술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태들, 본원에 서술된 보관-안정성 조성물의 하나 이상의 실시양태들, 또는 본원에 서술된 저장-안정성 조성물의 하나 이상의 실시양태들을 제공하는 것, 여기서 적어도 하나의 활성 제제는 조성물 내에서 안정화되고; 및 (b) 조성물의 적어도 일부분을 물에 용해시키고, 그렇게 함으로써 실크 피브로인 및 검출가능한 또는 측정가능한 양의 적어도 하나의 활성 제제를 포함하는 샘플 용액을 형성하는 것.

본원에 제공되는 또 다른 측면은 실크 피브로인 조성물 내에서 200 kDa을 초과하는 분자량을 갖는 조성물 내의 실크 피브로인 단편 대 특정한 범위 내의 분자량을 갖는 조성물 내의 실크 실크 피브로인 단편의 중량비를 변화시키는 것을 포함하는 실크 피브로인 조성물의 적어도 하나의 특성을 조절하는 방법이고, 여기서 특정한 범위는 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa이다.

본원에 제공되는 또 다른 측면은 두 단계를 포함하는 실크 피브로인 입자의 크기를 조절하는 방법이다: (a) 실크 피브로인 용액 내에서 200 kDa을 초과하는 분자량을 갖는 용액 내의 실크 피브로인 단편 대 특정한 범위 내의 분자량을 갖는 용액 내의 실크 피브로인 단편의 중량비를 변화시키는 것, 여기서 특정한 범위는 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa이고; 및 (b) 실크 피브로인 용액으로부터 실크 피브로인 입자를 형성시키는 것.

실크 피브로인은 베타-시트 2차 구조를 취할 수 있는 아미노산 서열의 일부분 또는 부분들을 갖는 폴리펩티드의 예이다. 예를 들어, 실크 피브로인 구조는 일반적으로 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열의 일부분 또는 부분들은 일반적으로 글리신 및 알라닌, 또는 알라닌만을 계속 교대하는 특징이 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 배위는 피브로인 분자가 베타-시트 입체구조로 자가 조립하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 또 다른 측면에서, 글리신 및 알라닌, 또는 알라닌만을 계속 교대하는 특징이 있는 아미노산 서열의 일부분 또는 부분들을 가지며, 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa 범위의 다양한 분자량을 갖는 폴리펩티드 단편들의 집단을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 다음을 특징으로 한다: 집단 내 폴리펩티드 단편들의 총 수의 15% 이하가 200 kDa을 초과하는 분자량을 가지고, 집단 내 폴리펩티드 단편들의 총 수의 적어도 50%가 특정한 범위 내의 분자량을 가지며, 여기서 특정한 범위는 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa이다.

또 다른 측면에서, 본원에 서술된 조성물 및/또는 방법에서의 실크 피브로인은 베타 시트 구조를 포함하는 또는 아미노산 서열을 기초로 하는 그러한 구조를 형성하는 성향을 갖는 다른 비-실크 폴리펩티드로 대체 또는 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 베타-시트 형성 폴리펩티드 단편들의 집단을 포함하는 폴리펩티드 조성물 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 서술된 베타-시트 형성 폴리펩티드 단편들의 집단은 다음을 특징으로 하는 다양한 분자량을 가질 수 있다: 집단 내 베타-시트 형성 폴리펩티드 단편들의 총 수의 15% 이하가 200 kDa을 초과하는 분자량을 가지고, 집단 내 베타-시트 형성 폴리펩티드 단편들의 총 수의 적어도 50%가 특정한 범위의 분자량을 가지며, 여기서 특정한 범위는 약 3.5kDa 내지 약 120 kDa 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "베타-시트 형성 폴리펩티드"는 베타-시트 2차 구조를 취하는 아미노산 서열의 일부분 또는 부분들을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 베타 시트 구조 또는 아미노산 서열을 기초로 하여 그러한 구조를 형성하는 성향을 갖는 것에 근거하여 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 친양쪽성 본질(즉, 친수성 및 소수성 특성 둘 다 및/또는 부분을 갖는 것)을 가질 수 있다. 친양쪽성 폴리펩티드는 단일 공급원(예를 들어, 자연 발생 단백질)으로부터 수득될 수 있고, 폴리펩티드 내에 소수성 모듈 또는 구역 및 친수성 모듈 또는 구역 둘 다를 포함할 수 있어, 단일 폴리펩티드 자체는 잔연 발생적으로 친양쪽성이다. 일부 실시양태에서, 소수성 모듈 또는 구역 및 친수성 모듈 또는 구역은 함께 융합 또는 커플링되어 친양쪽성 개체를 형성할 수 있다. 그러한 "융합" 또는 "키메라" 폴리펩티드는 재조합 기술, 화학적 커플링, 또는 둘 다를 사용하여 생성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 다음의 목록으로부터 선택된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부분 또는 부분들을 포함할 수 있다: 피브로인, 액틴, 콜라겐, 카테닌, 클라우딘, 코일린, 엘라스틴, 엘라닌, 익스텐신, 피브릴린, 라민, 라미닌, 케라틴, 튜블린, 바이러스의 구조 단백질, 제인 단백질 (종자 저장 단백질) 및 이들의 임의의 조합.

일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 천연 공급원으로부터 재생된(예를 들어, 정제된) 단백질, 이종 시스템에서 생성된 재조합 단백질, 합성적 또는 화학적으로 생성된 펩티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 네이티브 또는 야생형 대조물과 비교할 때, 하나 이상의 서열 변이를 갖는 또는 갖지 않는, 상기 제공된 목록의 임의의 하나에 상응하는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부분 또는 부분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 그러한 변이들은 야생형 서열과 비교할 때, 적어도 85%의 전체적인 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 전체적인 서열 동일성을 보일 수 있다.

본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 만들어진 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 이 특허 또는 특허 출원 공보는 요청 및 필요한 수수료를 지불하면 오피스에 의해 제공될 것이다.
도 1은 10, 20, 30, 또는 60분 동안 정련된 실크의 용해도 연구의 공정 흐름도를 보여준다. 동결-건조 조건 및 가용화 비율 또한 제공된다.
도 2는 4개의 분자량 밴드(200kDa 초과, 200 내지 116.3 kDa, 116.3 내지 66.3 kDa, 및 66.3 내지 36.5 kDa)의 백분율을 계산하기 위해 사용된 방법을 보여준다. 이 겔을 위해, 용액 중 7.5 ㎍의 단백질을 마크12(Mark12)™ 언스테인드 스탠다드(범위 31-200 kDa, 인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여, NuPAGE® 노벡스(Novex)® 3-8% 트리스-아세테이트 겔(인비트로젠) 상에서 환원 조건하에 흐르게 하였다. 도 2a는 10, 20, 30, 60분, 또는 오토클레이빙된 60분 동안 제련된 실크에 대한 SDS-PAGE 분석의 대표적인 이미지를 보여준다. 도 2b는 전기영동 겔 상에서 수행된 대표적인 밀도 이미지 분석을 보여준다. 처리되지 않은 픽셀 강도는 분자량에 따라 도시된다. 각 분자량 밴드의 백분율은 특정한 분자량 밴드의 합산된 강도를 모든 분자량 밴드의 총 합산된 강도로 나눔으로써 계산될 수 있다.
도 3a는 4℃에서 저장된 실크 발포체로부터 생성된 실크 피브로인 용액에 대한 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. 도 3b는 도 3a의 겔 데이터로부터 1차 건조를 겪은 실크 피브로인의 분자량 분포를 보여준다. 도 3c는 도 3a의 겔 데이터로부터 1차 및 2차 건조를 겪은 실크 피브로인의 분자량 분포를 보여준다.
도 4a는 22℃에서 저장된 실크 발포체로부터 생성된 실크 피브로인 용액에 대한 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. 도 4b는 도 4a의 겔 데이터로부터 1차 건조를 겪은 실크 피브로인의 분자량 분포를 보여준다. 도 4c는 도 4a의 겔 데이터로부터 1차 및 2차 건조를 겪은 실크 피브로인의 분자량 분포를 보여준다.
도 5a는 37℃에서 저장된 실크 발포체로부터 생성된 실크 피브로인 용액에 대한 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. 도 5b는 도 5a의 겔 데이터로부터 1차 건조를 겪은 실크 피브로인의 분자량 분포를 보여준다. 도 5c는 도 5a의 겔 데이터로부터 1차 및 2차 건조를 겪은 실크 피브로인의 분자량 분포를 보여준다.
도 6은 실크 발포체 용해도 대 부하를 보여준다. 다양한 고치 비등 시간(10-60분 비등, MB)으로부터 생성된 실크 피브로인 용액은 도 1에서 보여진 처리 흐름도에 따라 정제된 상태 그대로의 용액(a, b) 및 오토클레이빙된 용액(c, d)을 사용하여 동결건조되었다. 분쇄된 분말의 20, 40, 또는 80 mg 중 하나를 탈이온수에 가하여 1 mL의 최종 부피가 되게 하였다. 1000 rpm에서 이 혼합물을 원심분리한 후에, 불용성 단백질을 펠렛화하고, 상청액을 제거하였으며, 부피 당 질량(w/v%) 농도 측정을 위해 필름을 캐스팅하였다. 도 6a 및 6c는 다양한 비등 시간 및 질량 부하에 대한 w/v%를 보여준다. 점선은 완전한 이론적 용해도(각각, 2, 4, 및 8%)를 기초로 한 가능한 최대 w/v% 농도를 나타낸다. 도 6b 및 6d는 동결건조에 사용된 해당하는 용액의 분자량을 보여주며, 여기서 용액 중 7.5 ㎍의 단백질을 하이마크(HiMark)™ 프리-스테인드 단백질 스탠다드(범위 30-460 kDa, 인비트로젠)를 사용하여, NuPAGE® 노벡스® 3-8% 트리스-아세테이트 겔(인비트로젠) 상에서 환원 조건하에 흐르게 하였다. 도 6e는 도 6a 및 6c의 데이터를 상이한 방식으로 나타내며, 재구성된 실크 피브로인 용액 농도 (mg/mL) 및 용해도의 백분율을 보여준다.
도 7은 무정형에서 β-시트로 전환을 확인하게 해 주는 FTIR 스펙트럼을 보여준다. 회수된 정제된 상태 그대로의 것(왼쪽) 또는 오토클레이빙된 것(오른쪽)으로부터 생성된 필름은 1시간 동안의 90% 메탄올 처리 전후에 측정되었다. 다양한 고치 비등 시간(10-60 MB, 위-아래)으로부터 형성된 필름은 모두 4 세트의 그래프에 걸쳐 보여지며, 여기에는 상이한 질량 부하(20, 40, 80 mg)를 갖는 모든 것이 포함되었다.
도 8은 6개월의 건조 저장 후 오직 1차 건조 주기를 사용하여 형성된 실크 발포체의 용해도를 보여준다. 다양한 고치 비등 시간(10-60분 비등, MB)으로부터 생성된 실크 피브로인 용액은 (오직) 1차 건조 프로토콜을 사용하여 동결건조되었다. 동결건조의 완료 및 지정된 온도(4℃, 22℃, 37℃)에서의 6개월 저장 후에, 발포체의 15 mg의 분쇄된 분말은 이어서 985 μL의 탈이온수에 재가용화되었다. (a) 무시해도 될 정도의 용해도 손실을 가정할 때, 각 재구성된 용액으로부터의 7.5 ㎍의 단백질 부하를 하이마크™ 프리-스테인드 단백질 스탠다드(범위 30-460 kDa, 인비트로젠)를 사용하여, NuPAGE® 노벡스® 3-8% 트리스-아세테이트 겔(인비트로젠) 상에서 환원 조건하에 흐르게 하였다. 1000 rpm에서 이 혼합물을 원심분리한 후에, 불용성 단백질을 펠렛화하고 (b), 상청액을 제거하였으며, 부피 당 질량(w/v%) 농도 측정을 위해 필름을 캐스팅하였다 (c). 점선은 완전한 이론적 용해도(1.5%)를 기초로 한 가능한 최대 w/v% 농도를 나타낸다.
도 9는 6개월의 건조 저장 후 1차 및 2차 건조 주기 둘 다를 사용하여 형성된 실크 발포체의 용해도를 보여준다. 다양한 고치 비등 시간(10-60분 비등, MB)으로부터 생성된 실크 피브로인 용액은 1차 + 2차 건조 프로토콜을 사용하여 동결건조되었다. 동결건조 주기의 완료 및 지정된 온도(4℃, 22℃, 37℃)에서의 6개월 저장 후에, 각 발포체의 15 mg의 분쇄된 분말은 이어서 985 μL의 탈이온수에 재가용화되었다. (a) 무시해도 될 정도의 용해도 손실을 가정할 때, 각 재구성된 용액으로부터의 7.5 ㎍의 단백질 부하를 하이마크™ 프리-스테인드 단백질 스탠다드(범위 30-460 kDa, 인비트로젠)를 사용하여, NuPAGE® 노벡스® 3-8% 트리스-아세테이트 겔(인비트로젠) 상에서 환원 조건하에 흐르게 하였다. 1000 rpm에서 이 혼합물을 원심분리한 후에, 불용성 단백질을 펠렛화하고 (B), 상청액을 제거하였으며, 부피 당 질량(w/v%) 농도 측정을 위해 필름을 캐스팅하였다 (C). 점선은 완전한 이론적 용해도(1.5%)를 기초로 한 가능한 최대 w/v% 농도를 나타낸다.
도 10은 (a) 두꺼운 및 (b) 얇은 필름에 대한 모의의 에이징 조건에서의 실크 필름 용해도를 보여준다. 다양한 비등 시간의 필름들(오토클레이빙된 용액으로부터 형성된 60MB 필름 또한)은 0일과 비교할 때, 초순수에서 40 mg의 샘플을 용해시키기 전에 4℃, 22℃, 및 37℃에서 6개월 동안 보관되었다. 점선은 완전한 이론적 용해도(4%)를 기초로 한 가능한 최대 w/v% 농도를 나타낸다.
도 11은 용액 및 필름 디자인을 기초로 조율된 실크 회수를 보여준다. 표 1에서 보여지는 ELISA 키트를 사용하여, 40 mg 중량의 실크 필름들이 1 mL(최종 부피)의 PBS에 용해되었고, 필름들로부터의 샘플 회수는 동결된 혈장 분취물을 기초로 이론적 최대 부하 값으로 정상화되었다. 상이한 비등 시간(10-60분 비등, MB)을 사용하여 형성된 실크 용액은 혈장 또는 혈액 중 하나와 혼합되었고, 필름은 두 가지 두께(두꺼운 대 얇은) 중 하나로 캐스팅되었다. 선은 이원 변량 분석(two-way ANOVA) 시험에서 α=0.05의 유의성 수준으로 그룹들 간의 유의차를 나타낸다. 도 11a 및 11b는 (a) 실크-혈장 필름 및 (b) 실크-혈액 필름으로부터 피브리노겐 회수를 보여준다. 도 11c 및 11d는 (c) 실크-혈장 필름 및 (d) 실크-혈액 필름으로부터 C-반응성 단백질(CRP) 회수를 보여준다.
도 12는 (a) 정제된 상태 그대로의 실크 피브로인 용액 및 (b) 오토클레이빙된 실크 피브로인 용액으로부터 bFGF 회수를 보여준다. PBS의 첨가는 비등 시간, 농도, 또는 정제된 그대로의 것 대 오토클레이빙된 것과 관계 없이 bFGF를 개선시킨다. 용액은 PBS의 첨가에 의해 최종 pH 7.2로 완충되었다. bFGF는 4% 용액보다 1% 용액에서 더 안정하였다. 60MB 실크 용액은 정제된 상태 그대로의 조건 및 오토클레이빙된 조건 둘 다에 대해 bFGF의 가장 높은 회수를 가졌다. 점선은 대조 조건으로서 PBS 단독을 나타낸다. 정제된 상태 그대로의 실크, 37℃에서 개선된 bFGF 회수는 겔화된 10 MB 그룹이 전체적으로 가장 나쁜 bFGF 회수를 갖는다는 점에서 도 13a의 흡광도 데이터와 연관될 수 있다.
도 13a 및 13b는 일주일 동안 37℃에서 저장된 정제된 상태 그대로의 및 오토클레이빙된 실크 피브로인 용액에 대한 겔화 결과를 각각 보여준다. 도 13a의 별표는 겔화를 나타내며, 오직 1% 및 4% 10 MB 용액만이 겔화된 것을 보여준다. 도 13b에서, 60 MB 그룹으로부터의 신호는 샘플 내의 백색 착색의 결과로, 흡광도 판독에서 겔화에 대한 거짓양성을 제공하며, 이들 샘들은 겔화되지 않았다. 도 13은 오토클레이빙된 샘플의 어느 것도 일주일 후 겔화되지 않았으며, 60 MB 그룹의 어느 것도 일주일 후 겔화되지 않았음을 보여준다.
도 14a는 2주의 기간 동안 4℃, 22℃, 및 37℃에서의 정제된 상태 그대로의 실크 피브로인 용액에 대한 겔화 상태를 각각 보여준다. 별표는 겔화를 나타낸다. 별표 없이 기준선 위로 올라와 있는 샘플은 아직 겔화 전 용액이다. 10 MB 그룹으로부터의 샘플들은 더 긴 비등 시간을 갖는 샘플들보다 더 빨리 겔화하는 경향이 있다. 4% 농도의 그룹은 1% 그룹보다 더 빨리 결화하는 경향이 있다. PBS-함유 그룹은 비-완충된 샘플들보다 더 느리게 결화한다. 도 14b는 2주의 기간 동안 4℃, 22℃, 및 37℃에서의 오토클레이빙된 실크 피브로인 용액에 대한 겔화 상태를 각각 보여준다. 별표는 겔화를 나타낸다. 60 MB 그룹으로부터의 신호는 샘플 내의 백색 착색의 결과로, 흡광도 판독에서 겔화에 대한 거짓양성을 제공하며, 이들 샘들은 겔화되지 않았다. 10 MB 그룹으로부터의 샘플들은 더 긴 비등 시간을 갖는 샘플들보다 더 빨리 겔화하는 경향이 있다. 4% 농도의 그룹은 1% 그룹보다 더 빨리 결화하는 경향이 있다. PBS-함유 그룹은 비-완충된 샘플들보다 더 느리게 결화한다.
도 15는 두꺼운 및 얇은 실크 필름의 제조를 보여주는 계략적인 도해이다. 다양한 고치 비등 시간(10-60분 비등, MB)으로부터 생성된 실크 피브로인 용액들은 동시에 정제되었고, 각각은 4% wt/v 농도로 희석되었으며, 1.5 mL는 두꺼운 필름(3 x 2.5cm 직경 캐스팅 표면) 또는 얇은 필름(3 x 표면 상에 7.5cm 직경 캐스팅) 중 하나로 캐스팅되었다. 얇은 필름들은 피펫 팁을 사용하여, 가능한 넓게 1.5 mL 부피로 펼침으로써 생성되었다.
도 16은 완전한 용해를 위한 실크 필름의 최적화를 보여주는 막대 그래프이다. 다양한 고치 비등 시간(10-60분 비등, MB)으로부터 생성된 실크 피브로인 용액은 두꺼운 필름(2.5cm 직경 캐스팅 표면) 또는 얇은 필름(7.5cm 직경 캐스팅 표면) 중 하나로 캐스팅되었다. 밤새 공기 건조 후에, 각 필름들의 40mg 쿠폰(coupon)은 그리고 나서 1 mL의 탈이온수에 재가용화되었고, 그 결과로 생긴 용액의 중량%가 측정되었다. 점선은 완전한 이론적 용해도(4%)를 기초로 한 가능한 최대 w/v% 농도를 나타낸다.
도 17은 완전한 용해를 위한 실크 발포체의 최적화를 보여주는 막대 그래프이다. 다양한 고치 비등 시간(10-60분 비등, MB)으로부터 생성된 실크 피브로인 용액은 1차 또는 1차 + 2차 건조 프로토콜을 사용하여 동결건조되었다. 동결건조 주기의 완료 후에, 각 발포체의 15 mg 분쇄된 분말은 1 mL의 탈이온수에 재가용화되었으며, 그 결과로 생긴 용액의 중량%가 측정되었다. 점선은 완전한 이론적 용해도(1.5%)를 기초로 한 가능한 최대 w/v% 농도를 나타낸다.
도 18은 모의의 에이징 조건에서 두꺼운 실크 필름 용해도를 보여주는 막대 그래프이다. 다양한 비등 시간의 필름들(오토클레이빙된 용액으로부터 형성된 60MB 필름 또한)은 도 16(0일)으로부터의 데이터와 비교할 때, 초순수(UPW)에 40 mg의 샘플을 용해시키기 전에 6개월 동안 4℃, 22℃, 및 37℃에서 보관되었다. 점선은 완전한 이론적 용해도(4%)를 기초로 한 가능한 최대 w/v% 농도를 나타낸다.
도 19는 모의의 에이징 조건에서 실크 필름 용해도를 보여주는 막대 그래프이다. 다양한 비등 시간의 필름들(오토클레이빙된 용액으로부터 형성된 60MB 필름 또한)은 도 2(0일)로부터의 데이터와 비교할 때, UPW 물에 40 mg의 샘플을 용해시키기 전에 6개월 동안 4℃, 22℃, 및 37℃에서 보관되었다. 점선은 완전한 이론적 용해도(4%)를 기초로 한 가능한 최대 w/v% 농도를 나타낸다.
도 20은 본원에 서술된 한 실시양태에 따른 필름 제조 및 필름 용해를 보여주는 일련의 사진들이다.
도 21은 혈액-안정화 실크 필름로부터 회수된 ELISA에 의한 바이오마커의 측정을 보여주는 일련의 데이터 그래프들이다. 30 MB 피브로인으로부터 생성된 실크 용액은 전혈과 혼합된 후에 필름으로 형성되었고, 그 후에 "얇은" 샘플에서 공기 건조되었다. 10 mg 또는 40 mg 중량의 쿠폰은 1 mL PBS에 용해되었고(각각, 1% 및 4% w/v 부하) 농도 전환은 이론적인 부하량(1mL 혈액 중 50 μL: 실크 비율)을 기초로 한다. 검정 표준 곡선이 오른 쪽에 보여진다. 블랭크(비-부하) 실크 필름들이 또한 음성 검정 대조로 사용되었다.
도 22는 혈액- 및 혈장-안정화 실크 필름로부터 회수된 루미넥스(Luminex)™에 의한 다양한 바이오마커의 측정을 보여주는 일련의 데이터 그래프들이다. 20 mg 중량의 실크 필름 쿠폰은 1 mL PBS에 용해되었고, 25 μL 분취물은 3 개의 분리된 CVD 바이오마커 키트를 사용하여 루미넥스 200™ 장치에서 실행되었다. 샘플들(측정된 혈장 쿠폰 및 혈액 쿠폰)은 1:200 및 1:2000 희석 후에 취해졌고, 1:2,000 희석 후에 동결된 공여자-일치의 혈장 분취물과 비교되었다. 내부 표준은 절대절인 정량화를 제공하였고, 혈장 및 혈액 쿠폰의 이론적 부하량을 계산하기 위해 필요한 전환은 상기 계산을 기초로 하였다. 블랭크(비-부하) 실크 필름들이 또한 가용화되었고, 음성 검정 대조로 사용되었다. 모든 샘플들은 3 중으로 수행되었고 평균 ± SD로 보여진다. *은 공여자 2 & 3과 비교할 때 검출되는 유의차를 나다낸다(p < 0.05 수준). 막대는 동결된 혈장 분취물 및 일치되는 쿠폰 회수를 기초로 계산된 부하 값 사이의 일치를 나타낸다.
도 23은 루미넥스 및 ELISA 검정 방식에 의해 결정된 혈장 농도를 포함하는 일련의 막대 그래프들이다. 동결된 혈장 분취물들은 1:200 배 희석에서 루미넥스 200 시스템 및 밀리포어 EMD CVD1 패널에서 실행되었고(표 5 참조) 절대적인 검출 수준을 비교하기 위해 1:10 배 희석에서 R&D 시스템즈(R&D Systems)에 의해 생산된 ELISA 키트에서 실행되었다(표 2 참조). CRP 검정을 위해서는 로그 축이 사용되었고(왼쪽), PAI-1 검정을 위해서는 선형 축이 사용되었음(오른쪽)을 주목한다.
도 24는 상이한 온도에 노출시킨 후 30 일째의 혈액- 및 혈장-안정화 실크 필름으로부터, 루미넥스™에 의해 검출되는, 다양한 바이오마커의 회수의 백분율을 보여주는 일련의 막대 그래프들이다. 20 mg 중량의 실크 필름 쿠폰은 1 mL PBS에 용해되었고, 25 μL의 분취물은 N=3 공여자들에 대해 루미넥스 200™ 기기에서 수행되었다. 동일한 조건에서 저장된 액체 혈장 분취물은 유사하게 분석되었다. 내부 표준은 절대적인 정량화를 제공하였고, 혈장 및 혈액 쿠폰의 이론적 부하량을 계산하기 위해 필요한 전환은 이전 계산(4월 보고서)을 기초로 하였다. 세 공여자의 회수 값%는 평균되었고, ± SD로 나타냈다. 분해물질 수준에 의해 정의된 회수%는 0 일차 혈장 수준 x 100%으로 나누어졌다. 막대는 그룹들 사이의 유의차를 나타낸다(p < 0.05 수준). 점선은 -20C 저장된 30일 값을 나타낸다. $는 100%로부터 벗어나는 쿠폰 값을 나타낸다. *는 루미넥스 시스템으로부터 20-30% 범위의 CV%값을 나타낸다.
도 25는 상이한 온도에 노출시킨 후 4개월째에 혈액- 및 혈장-안정화 실크 필름으로부터, 루미넥스™에 의해 검출되는, 다양한 바이오마커의 회수의 백분율을 보여주는 일련의 막대 그래프들이다. 20 mg 중량의 실크 필름 쿠폰은 1 mL PBS에 용해되었고, 25 μL의 분취물은 N=3 공여자들에 대해 루미넥스 200™ 기기에서 수행되었다. 모든 조건은 30 일에서와 동일하다. 동일한 조건에서 저장된 액체 혈장 분취물은 유사하게 분석되었다. 내부 표준은 절대적인 정량화를 제공하였다. 세 공여자의 회수 값 %는 평균되었고, ± SD로 나타냈다. 분해물질 수준에 의해 정의된 회수%는 0 일차 혈장 수준 x 100%으로 나누어졌다. 막대는 그룹들 사이의 유의차를 나타낸다(p < 0.05 수준). 점선은 -20C 저장된 30일 값을 나타낸다. $는 100%로부터 벗어나는 쿠폰 값을 나타낸다. *는 루미넥스 시스템으로부터 20-30% 범위의 CV%값을 나타낸다.
도 26은 동결건조된 실크 조성물의 형성 및 가용화를 보여주는 일련의 사진들이다. (위쪽) TE 완충제(EDTA)를 첨가하여 또는 첨가 없이, 6% 내지 1% 농도에서, 20 MB 실크 피브로인으로부터 형성된 실크 용액들은 1차 및 2차 건조를 사용하여 동결건조되었다. 용액들은 그들의 1.5 mL 저장 원추형에 부합하는 형상 프로파일을 생산했다. (아래쪽) 물을 동결건조된 용액에 첨가하여, 소용돌이로 혼합한 후에, 실크를 재가용화되었고, 작은 잔유물 발포체 단편들이 남았으며, 이의 질량은 실크 부하의 질량에 의존한다.
도 27은 다양한 농도에서 동결건조된 실크 용액으로부터, 리보그린(RiboGreen)™ 검정에 의해 측정된 mRNA 회수를 보여주는 막대 그래프이다. 2% 내지 0.05% 농도 범위의 20 MB 실크 피브로인으로부터 형성된 실크 용액 뿐만아니라 비-실크-부하된 그룹(0%)은 리보그린 시약과의 혼합 및 형광분석 전에 1차 및 2차 건조를 사용하여 동결건조되고 초순수에 가용화되었다. 회수된 샘플들은 mRNA의 동결된 모액(-80℃)과 비교되었다. 이중 검정 판독은 모든 샘플에 대해 수행되었다. 절대적인 정량화는 리보솜 RNA(제조업자에 의해 제공)에 의해 생성된 표준 곡선과 비교하여 수행되었고, 데이터는 N=3 샘플의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
도 28은 RNAse 억제제를 함유하는 동결건조된 실크 용액의 다양한 농도로부터, 리보그린™ 검정에 의해 측정된, mRNA 회수를 보여주는 막대 그래프이다. 2% 내지 0.05% 농도 범위의 20 MB 실크 피브로인으로부터 형성된 실크 용액 뿐만아니라 비-실크-부하된 그룹(0%)은 리보그린 시약과의 혼합 및 형광분석 전에 슈퍼라제(SUPERase)·InTM RNAse 억제제와 혼합되고, 1차 및 2차 건조를 사용하여 동결건조되었으며, 초순수에 재가용화되었다. 회수된 샘플들은 mRNA의 동결된 모액(-80℃)과 비교되었다. 이중 검정 판독은 모든 샘플에 대해 수행되었다. 절대적인 정량화는 리보솜 RNA(제조업자에 의해 제공)에 의해 생성된 표준 곡선과 비교하여 수행되었고, 데이터는 N=3 샘플의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
도 29는 스템펙트(Stemfect)™ 형질감염 키트로 동결 및 회수된 mRNA를 사용하여 섬유모세포 형질감염을 보여주는 일련의 형광 이미지이다. 도 28에서 사용된 실크 용액은 또한 스템펙트™ 형질감염 키트의 시약과 혼합되었다. 형질감염 시약은 동결된 모액(-80℃) 또는 회수된 mRNA 중 하나와 합해졌고, GFP 필터를 갖는 형광 이미지화 전에 12시간 처리를 위해 세포에 첨가되었다. 흰색 화살표는 양성 GFP 발현을 나타낸다.
도 30은 본원에 서술된 바와 같이 진단을 위한 실크 단백질-기반 안정화의 한 실시양태의 개요를 나타낸다.

특정 정의

달리 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 내포되지 않는 한, 하기 용어 및 어구는 이하에 제공되는 의미를 포함한다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 이하의 용어 및 어구는 그 용어 또는 어구가 적용되는 관련 기술 분야에서 습득한 의미를 제외하지 않는다. 정의는 특정한 실시양태들을 서술하는 것을 돕기 위해 제공되며, 청구된 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니며, 이는 본 발명의 범위는 오직 청구범위에 의해 제한되는 것이기 때문이다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.

하나의: 단수 용어 "하나의", "한", 및 "그"는 문맥이 달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다. 유사하게, 용어 "또는"은 문맥이 달리 명시적으로 나타내지 않는 한, "및"을 포함하는 것을 의도한다.

약: 실시예 외에 또는 달리 언급이 있는 경우, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 언급되는 값의 ± 5%를 의미할 수 있다. 예를 들어, 약 100은 95 내지 105를 의미한다.

주위: 본원에서 사용되는 바와 같이, "주위" 조건은 능동 냉각, 가열 등이 없는 주변 조건이다. 전형적으로, 상기 용어는 실온을 언급하고, 이는 일반적으로 보통의 실내 온도, 종종 20-25℃(68-77°F)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 주위 온도는 0℃ 내지 60℃, 0℃ 내지 50℃, 또는 0℃ 내지 40℃이다. 일부 실시양태에서, 주위 온도는 냉장고 온도(예를 들어, 0℃ 내지 15℃, 포함)이다. 일부 실시양태에서 주위 온도는 실온, 예를 들어 20℃ 내지 35℃이고, 이는 지리적 조건에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 따듯한-기후 지역, 예를 들어, 아프리카의 실온은 일반적으로 차가운-기후 지역, 예를 들어, 미국 또는 영국의 실온보다 일반적으로 더 따듯할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저장 온도는 적어도 약 37℃ 또는 37℃ 초과일 수 있다.

항원: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원"은 항체와 같은 선택적인 결합제에 의해 결합되어질 수 있고, 추가적으로 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체들의 생산을 끌어내기 위해 동물에 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 나타낸다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 용어 "항원"은 또한 항체, 또는 MHC 분자에 의해 제시되는 경우 T 세포 수용체(TCR)에 의해 결합되어질 수 있는 분자를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "항원"은 또한 T-세포 에피토프를 포함한다. 항원은 추가적으로 면역 시스템에 의해 인지될 수 있으며/있거나 B- 및/또는 T-림프구의 활성화를 야기하는 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 하지만, 이는 적어도 특정 경우들에서, 항원이 Th 세포 에피트포를 포함하거나 이에 연결되고 아주반트로 주어지는 것이 요구된다. 항원은 하나 이상의 에피토프(B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 상기 언급된 특정한 반응은 항원이 전형적으로 매우 선택적인 방식으로, 다른 항원에 의해 인지될 수 있는 다른 항체 또는 TCR들의 다수가 아닌, 그에 대응하는 항체 또는 TCR과 양호하게 반응할 것이라는 것을 나타내는 것이 의도된다. 본원에 사용된 항원은 또한 여러 개별 항원의 혼합물일 수 있다.

생물활성: 활성 제제와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "생물활성"은 일반적으로 생물학적 표적과 상호작용하는/하거나 생물학적 표적에 영향을 생산하는 활성 제제의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 생물활성은 생물학적 표적에 자극, 억제, 조절, 독성 또는 치사 반응의 유발을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생물학적 표적은 분자 또는 세포일 수 있다. 예를 들어, 생물활성은 효소의 효과/활성을 조절하고, 수용체를 차단하고, 수용체를 자극하고, 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하고, 세포 증식을 조절하고, 세포 분할을 조절하고, 세포 형태를 조절하고, 또는 이들의 임의의 조합을 하는 활성 제제의 능력을 언급할 수 있다. 일부 경우들에서, 생물활성은 세포에 독성 효과를 생성하는 화합물의 능력을 나타낼 수 있다. 예시적인 세포 반응은 용해, 세포사멸, 성장 억제, 및 성장 촉진; 세포에 의해 단백질 또는 다른 관심있는 분자의 생성, 분비, 및 표면 발현; 수용체 활성화를 포함하는 막 표면 분자 활성화; 막횡단 이온 수동; 전사 조절; 세포 생존 능력의 변화; 세포 형태의 변화, 세포의 세포내 성분의 존재 또는 발현의 변화; 유전자 발현 또는 전사체의 변화; 세포 내에 생성된 효소의 활성도의 변화; 및 리간드 및/또는 수용체의 존재 또는 발현의 준비(예를 들어, 단백질 발현 및/또는 결합 활성)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상이한 세포 반응을 평가하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 세포의 내인성 단백질의 존재 또는 발현에서의 변화를 결정하는 웨스턴 블롯, 또는 활성 제제에 대한 반응으로 세포 형태를 관찰하는 현미경 검사, 또는 핵산 변화의 검출 및 정량을 위한 FISH 및/또는 qPCR이 있다. 생물활성은 일부 실시양태에서, 예를 들어, 세포 반응을 평가함으로써 결정될 수 있다.

항체와 관련하여, 용어 "생물활성"은 에피토프 또는 항원 결합 친화도, 항체의 생체내 및/또는 시험관내 안정성, 예를 들어, 인간 대상체에 투여되었을 때의 항체의 면역원성 특성, 및/또는 생체내 또는 시험관내 표적 분자의 생물활성을 상쇄 또는 무력화시키는 능력을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 언급된 특성 또는 특징은 관련 기술 분야의 알려진 기술을 사용하여 관찰 또는 측정될 수 있고, 이는 섬광 근접 검정, ELISA, ORIGEN 면역검정(IGEN), 형광 켄칭, 형광 ELISA, 경쟁적 ELISA, 비아코어(BIAcore) 바이오센서를 사용하는 SPR 분석을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 SPR 분석, 시험관내 및 생체내 중화 검정(예를 들어, 국제 공보 제WO 2006/062685호 참조), 수용체 결합, 및 인간, 영장류, 또는 필요에 따라 다른 공급원을 포함하는 상이한 공급원으로부터 조직 절편의 면역조직화학을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 면역원과 관련하여, 용어 "생물활성"은 면원원성을 포함하며, 이의 정의는 후에 상세하게 설명된다. 바이러스와 관련하여, 용어 "생물활성"은 감염성을 포함하여, 이의 정의는 후에 상세하게 설명된다. 조영제, 예를 들어, 염료와 관련하여, 용어 "생물활성"은 대상체에 투여될 때 대상체의 몸체에서 구조 또는 유체의 콘트라스트를 향상시키는 조영제의 능력을 나타낸다. 조영제의 생물활성은 또한 특정 조건 하에서 또 다른 분자의 반응에 영향을 주고/주거나 생물학적 환경과 상호작용하는 그것의 능력을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

콜드 체인: 어구 "콜드 체인"은 온도-조절된 공급 체인을 나타낸다. 손상되지 않은 콜드 체인은 소정의 온도 범위를 유지하는 일련의 연속된 저장 및 분배 활동이다. 이는 화학물질, 생물제제 및 의약품과 같은 제품의 보관 수명을 연장하고 보장하는 것을 돕기 위해 사용된다. 콜드 체인은 식품 및 제약 산업 및 또한 일부 화학물질 운송에서 흔하다. 제약 산업에서의 콜드 체인의 전형적인 온도 범위는 2 내지 8℃이다. 일부 경우들에서, 구체적인 온도(및 온도에서의 시간) 내성은 저장 및/또는 운송될 실제 제품에 의존한다.

성분: 본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 샘플의 "한 성분"은 검출 또는 분석될 수 있는 샘플에 존재하는 물리적, 화학적 또는 생물학적 개체(예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질, 펩티드, 핵산, 세포, 성장 인자, 및/또는 치료제)를 나타낸다.

포함한다: 본원에 서술된 것에 유사 또는 동등한 방법들 및 물질들이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 적합한 방법들 및 물질들은 이하에 서술된다. 용어 "포함하다"는 "비롯하다"를 의미한다. 약어 "예를 들어(e,g,)"는 라틴어 exempli gratia로부터 유래된 것이고, 이는 비-제한적인 예를 나타내기 위해 본원에 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어(e,g,)"는 용어 "예를 들어"와 동의어이다.

포함하는: 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 조성물, 방법, 및 이의 대표적인 성분(들)과 관련하여 사용되고, 이는 유용하던지 아니던지, 구체화되지 않은 요소들을 포함할 여지가 있는 실시예에 유용하다.

감소: 용어 "감소", "축소된", "축소", "감소하다" 또는 "억제하다"는 모두 일반적으로 통계학적으로 유의한 양의 감소를 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 그러나, 의문을 방지하기 위해, "축소된", "축소", "감소하다" 또는 "억제하다"는 참조 수준과 비교할 때 적어도 10%의 감소, 예를 들어, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 감소 또는 100% 이하의 감소(예를 들어, 참조 샘플과 비교할 때 부재하는 수준), 또는 참조 수준과 비교할 때 10-100%의 임의의 감소를 의미한다.

필수적으로: 본원에 교환적으로 사용되는 바와 같이, 용어 "필수적으로" 및 "실질적으로"는 적어도 약 60%, 또는 바람직하게는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99% 또는 그 이상, 또는 70% 내지 100%의 임의의 정수의 비율을 의미한다. 일부 실시양태에서, 용어 "필수적으로"는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 그 이상, 또는 90% 내지 100%의 임의의 정수의 비율을 의미한다. 일부 실시양태에서, 용어 "필수적으로"는 100%를 포함할 수 있다.

피브로인: 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "피브로인"은 누에 실크 피브로인 및 곤충 또는 거미 실크 단백질을 포함한다. 임의의 유형의 실크 피브로인이 본 발명의 측면에 따라 사용될 수 있다(문헌 [Lucas et al., Adv. Protein Chem 13: 107-242(1958)]). 광범위한 종에 의해 생성된 많은 상이한 유형의 실크가 있으며, 이는 제한 없이 다음을 포함한다: 안테레아 밀리타(Antheraea mylitta); 안테레아 페른니(Antheraea pernyi); 참나무산누에나방(Antheraea yamamai); 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella); 누에나방(Bombyx mori); 멧누에나방(Bombyx mandarina); 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella); 네필라 클라비페스(Nephila clavipes); 네필라 세네갈렌시스(Nephila senegalensis); 가스테라칸타 맘모사(Gasteracantha mammosa); 아르기오페 아우란티아(Argiope aurantia); 아라네우스 디아데마투스(Araneus diadematus); 라트로덱투스 게오메트리쿠스(Latrodectus geometricus); 아라네우스 비센테나리우스(Araneus bicentenarius); 테트라그나타 베르시콜로르(Tetragnatha versicolor); 산왕거미(Araneus ventricosus); 돌로메데스 테네브로수스(Dolomedes tenebrosus); 유그러스 치소세우스(Euagrus chisoseus); 플렉트레우리스 트리스티스(Plectreurys tristis); 아르기오페 트리파스키아타(Argiope trifasciata); 및 네필라 마다가스카리엔시스(Nephila madagascariensis). 일부 실시양태에서, 피브로인은 용해된 누에 실크 또는 거미 실크를 함유하는 용액으로부터 수득된다. 누에 실크 단백질은 예를 들어 누에나방으로부터 수득되고, 거미 실크는 네필라 클라비페스로부터 수득된다. 다른 실크는 박테리아, 효모, 포유동물 세포, 형질전환 동물, 또는 형질전환 식물 및 그의 변이들과 같은 형질전환 실크, 유전자 조작된 실크(재조합 실크)를 포함한다. 예를 들어, 제WO 97/08315호 및 미국 특허 제5,245,012호를 참조하며, 이 두 문헌의 내용은 전체로서 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 거미, 기타 누에, 벌, 합성된 실크-유사 펩티드, 및 그의 생명공학적 변이체와 같은 다른 공급원으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 누에 또는 형질전환 누에의 샘으로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 제WO2007/098951호를 참조하며, 이의 내용은 전체로서 본원에 참조로 포함된다. 비록 상이한 종 실크-생성 유기체 및 상이한 유형의 실크가 상이한 아미노산 조성물을 가질지라도, 다양한 실크 단백질은 특정 구조적 특징을 공유한다. 실크 피브로인 구조에서의 일반적인 경향은 일반적으로 글리신 및 알라닌, 또는 알라닌만을 반복 교대하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 서열이다. 그러한 배위는 피브로인 구조가 베타-시트 입체구조로 자가-조립하는 것을 가능하게 한다. 이러한 "알라닌-풍부한" 및 "글리신-풍부한" 소수성 블록은 부피 큰 사이드 그룹을 갖는 아미노산의 절편(예를 들어, 친수성 스페이서)에 의해 전형적으로 분리된다. 일부 실시양태에서, 피브로인의 소수성 블록의 코어 반복 서열은 다음의 아미노산 서열 및/또는 화학식으로 나타내어질 수 있다: (GAGAGS)5-15 (서열 1); (GX)5-15 (X=V, I, A) (서열 2); GAAS (서열 3); (S1-2A11-13) (서열 4); GX1-4 GGX (서열 5); GGGX (X=A, S, Y, R, D V, W, R, D) (서열 6); (S1-2A1-4)1-2 (서열 7); GLGGLG (서열 8); GXGGXG (X=L, I, V, P) (서열 9); GPX (X=L, Y, I); (GP(GGX)1-4 Y)n (X=Y, V, S, A) (서열 10); GRGGAn (서열 11); GGXn (X=A, T, V, S) ; GAG(A)6-7GGA (서열 12); and GGX GX GXX (X=Q, Y, L, A, S, R) (서열 13). 일부 실시양태에서, 피브로인 펩티드는 펩티드 내에 복수의 소수성 블록, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 소수성 블록을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 피브로인 펩티드는 4 내지 17 소수성 블록을 함유할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 피브로인 펩티드는 약 4-50 아미노산 길이인 적어도 하나의 친수성 스페이서 서열("친수성 블록")을 포함한다. 친수성 스페이서 서열의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: TGSSGFGPYVNGGYSG (서열 14); YEYAWSSE (서열 15); SDFGTGS (서열 16); RRAGYDR (서열 17); EVIVIDDR(서열 18); TTIIEDLDITIDGADGPI (서열 19) and TISEELTI (서열 20). 특정 실시양태에서, 피브로인 펩티드는 상기 목록된 대표적인 스페이서 서열의 임의의 하나의 유도체인 친수성 스페이서 서열을 함유할 수 있다. 그러한 유도체는 상기 친수성 스페이서 서열의 임의의 하나에 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 피브로인 펩티드는 스페이서를 함유하지 않는다. 실크는 일반적으로 섬유성 단백질이며, 고분자량을 형성하기 위해 함께 연결된 모듈러 유닛, 상당히 반복적인 단백질로 특징된다. 각각 특정한 아미노산 서열 및 화학을 갖는 이러한 모듈러 유닛 또는 도메인은 특정한 기능을 제공하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 폴리-알라닌(polyA) 및 폴리-알라닌-글리신(폴리-AG)과 같은 서열 모티프는 베타-시트를 형성하는 경향이 있고; GXX 모티프는 31-헬릭스 형성에 기여하며; GXG 모티프는 강성을 제공하고; 및, GPGXX (서열 22)는 베타-나선 형성에 기여한다. 이들은 위치 및 배열이 실크계 물질의 최종 물질 특성과 관련이 있는 다양한 실크 구조에서의 상이한 성분들의 예이다(문헌 [Omenetto and Kaplan (2010) Science 329: 528-531]에서 검토됨). 또한, 제WO 2011/130335 (PCT/US2011/032195)호를 참조하며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

증가: 용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "증진시키다" 또는 "활성화시키다"는 모두 일반적으로 통계적으로 유의한 양의 증가를 의미하도록 본원에 사용되며; 임의의 의문을 피하기 위해, 용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "증진시키다" 또는 "활성화시키다"는 참조 수준에 비해 적어도 10%의 증가, 예를들어 참조 수준에 비해 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 이들까지의 증가 (및 100% 증가 포함) 또는 10-100%의 임의의 증가, 또는 참조 수준 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 또는 그 초과의 임의의 증가를 의미한다.

억제: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제하다"는 사건으로부터 어떤 일을 방지하는 것, 어떤 사건의 발생을 지연시키는 것, 및/또는 어떤 사건의 정도 또는 가능성을 감소시키는 것을 의미한다.

유지: 본원에서 사용되는 용어 "유지하는", "유지하다" 및 "유지"는 조성물 또는 활성화제에서 참조되는 경우, 활성화제가 특정 조건에 놓였을 때 실크 피브로인 매트릭스의 하나 이상의 활성화제의 생활성을 유지, 지속 또는 함유시키는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 매트릭스에 분포된 하나 이상의 활성화제는 그의 원래 활성의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 그 초과를 비롯하여, 그의 원래 활성의 적어도 약 30%를 유지한다.

나노패턴: 본원에서 사용된 용어 "나노패턴" 또는 "나노패턴화된"은 실크 피브로인 기재 매트릭스에서 제공된 작은 패터닝, 예컨대 필름 또는 발포체, 또는 이러한 실크 피브로인 기재 매트릭스를 포함하는 조성물을 의미한다. 일반적으로 크기의 구조적 특징을 갖는 패터닝은 적절하게는 나노 스케일(즉, 10^-9 미터), 예를 들어 1 나노미터부터 밀리미터까지 범위의 크기로 측정될 수 있다.

핵산: 본원에 사용된 용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 본원에서의 문법적 동의어는 서로 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오티드(그의 유사체 또는 유도체를 포함)을 의미한다. 예시 핵산은 제한되지는 않지만, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 유전자, 조절 및 말단 부위를 포함하는 유전자, 바이러스 또는 플라스미드 DNA와 같은 자체 복제 시스템, 유전체 DNA, cDNA, mRNA, pre-mRNA, 단일-가닥 및 이중-가닥 siRNA 및 기타 RNA 간섭 시약(RNAi 시약 또는 iRNA 시약), shRNA(짧은 헤어핀 RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 리보자임, 마이크로RNA(miRNA), pre-miRNA, 및 변형된 RNA(예를 들어, 잠금 핵산)를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 DNA, RNA 또는 핵산이 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 임의의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌의 임의의 조합을 함유하는 것인 하이브리드일 수 있다. 핵산은 하나 이상의 백본 변형, 예를 들어 포스포로아미드(phosphoramide)(문헌 [Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993) 및 이들의 참조 문헌들; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970)]), 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포포로아미디트(O-methylphophoroamidite) 연결 (문헌 [Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press] 참조), 또는 펩티드 핵산 연결(문헌 [Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); 및 Nielsen, Nature, 365:566 (1993)] 참조)를 포함할 수 있으며, 이들 문헌의 모든 내용은 본원에 참조로 포함된다. 핵산은 핵염기 및/또는 뉴클레오티드의 당 잔기의 변형체를 포함할 수도 있다. 당 잔기에서의 예시적인 당 변형체는 할로겐(예를 들어, 플루오로), O-메틸, O-메톡시에틸, NH₂, SH 및 S-메틸로 치환된 2'-OH를 포함한다.

폴리에틸렌 글리콜: "PEG"는 약 20 내지 약 2000000개의 연결된 단량체, 전형적으로 약 50-1000개의 연결된 단량체, 보통 약 100-300개를 함유하는 에틸렌 글리콜 중합체를 의미한다. 폴리에틸렌 글리콜은 다양한 수의 연결된 단량체를 함유하는 PEG, 예를 들어, PEG20, PEG30, PEG40, PEG60, PEG80, PEG100, PEG115, PEG200, PEG 300, PEG400, PEG500, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG2000, PEG3350, PEG4000, PEG4600, PEG5000, PEG6000, PEG8000, PEG11000, PEG12000, PEG2000000 및 이들의 임의의 혼합물을 포함한다.

예방: 본원에서 사용된 바와 같이, 경과(예를 들어, 발병기전, 질환 진행, 등)에서의 작용제의 작용을 참조하기 위해 사용되는 경우의 용어 "예방하는"은 제제(예컨대, 치료제)가 경과와 관련된 하나 이상의 증상 또는 특질의 진전 전에 투여될 때 이러한 경과의 정도를 경감시키고/거나 그 시작을 지연시키는 것을 의미한다.

바로 사용가능한(Ready-to-use): "바로 사용가능한 제형"에서의 문구 "바로 사용가능한"은 최종 사용자에게 의한 사용전에 추가적인 공정(예컨대, 제조 공정)을 필요로 하지 않는 조성물 또는 제품을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 바로 사용가능한 제형은 주사 가능한 제형(즉, 주사제)를 포함한다. 본원의 내용 중 바로 사용가능한 제형은 투여 전에 희석되도록 설계되어 있는 농축된 제형, 예컨대 원액 제형을 포괄한다.

참조: 본원에서 사용된 용어 "참조"는 예를 들어 참조 조성물 또는 조건의 세트, 등을 지칭한다. 통상의 기술자는 문맥으로부터 특정 상황에서의 적절한 "참조"가 무엇일지 이해할 것이다. 일반적으로 "참조"는 의미있는 대조를 가능하게 하는 관심 조성물 또는 조건의 세트와의 충분한 유사성을 공유한다. 많은 실시양태에서, 본원에서 "참조 조성물"은 통상적인 실크-피브로인 조성물(예컨대, 저분자량 실크 피브로인 조성물이 아닌 것)이다.

짧은 헤어핀 RNA: 본원에 사용된 용어 "shRNA"는 RNAi 및/또는 siRNA 종과 같이 기능하지만 shRNA 종이 안정성 증가를 위한 이중가닥 헤어핀-유사 구조인 점에서 상이한 짧은 헤어핀 RNA를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "RNAi"는 간섭 RNA를 지칭하거나, 또는 RNA 간섭 분자는 유전자 발현을 억제하는 핵산 분자 또는 그의 유사체, 예를 들어 RNA-기재 분자이다. RNAi는 선택적 전사후 유전자 침묵의 수단을 지칭한다. RNAi는 특정한 mRNA의 파괴, 또는 RNA, 예컨대 mRNA의 처리 또는 번역의 방해를 초래할 수 있다.

짧은 간섭 RNA: 용어 "짧은 간섭 RNA" (siRNA) (또한 본원에서 "소형 간섭 RNA"로서 지칭됨)는 예를 들어 RNAi에 의해 표적 유전자의 발현을 억제하는 기능을 하는 작용제로서 정의된다. siRNA는 화학적으로 합성될 수 있으며, 이는 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있거나, 또는 이는 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다. siRNA 분자는 또한 이중 가닥 RNA의 절단에 의해 생성될 수 있으며, 여기서 1개의 가닥은 불활성화되는 메세지와 동일하다. 용어 "siRNA"는 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 유도하는 작은 억제 RNA 듀플렉스를 지칭한다. 이들 분자는 길이가 다양할 수 있으며(일반적으로 18-30개 염기 쌍), 안티센스 가닥에 그의 표적 mRNA에 대해 다양한 정도의 상보성을 가질 수 있다. 전부는 아니지만 몇몇 siRNA는 센스 60 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 쌍을 형성하지 않은 돌출된 염기를 갖는다. 용어 "siRNA"는 2개의 개별 가닥의 듀플렉스, 뿐만 아니라 듀플렉스 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일 가닥을 포함한다.

용액: 용어 "용액"은 1개의 상으로 구성된 균질 혼합물을 폭넓게 지칭한다. 전형적으로, 용액은 용질 또는 용매 또는 용매들에 용해된 용질을 포함한다. 이것은 혼합물의 특성(예컨대, 농도, 온도 및 밀도)이 부피를 통해 균일하게 분포될 수 있는 것을 특징으로 한다. 따라서 본 출원의 내용에서, "실크 피브로인 용액"은 용매, 예컨대 물에 용해된 가용성 형태의 실크 피브로인 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 고체상 실크 피브로인 물질(즉, 실크 매트릭스), 예를 들어 실크 필름 또는 다른 스캐폴드로부터 제조될 수 있다. 전형적으로 고체상 실크 피브로인 물질은 수용액, 예를 들어 물 및 완충제 내에서 재구성된다. 균질하지 않은 액체 혼합물, 예를 들어 콜로이드, 현탁액, 에멀젼은 용액으로 고려되지 않는다는 점을 유념해야 한다. 다만 한가지 예를 제시하자면, 용액에 현탁된 실크 피브로인 마이크로구체 또는 입자는 그 자체는 실크 피브로인 용액을 구성하지 않는다.

안정화: 본원에서 사용된 바와 같이, 가용성 실크 피브로인에 의해 유발된 작용제의 "안정화"는 작용제가 분해, 잘못된 폴딩, 변성, 응집 및/또는 불활성화에 덜 민감하도록 구조의 완전성(예컨대, 확정) 및 작용제의 상응하는 기능 또는 활성을 지지, 촉진, 용이하게 하고/거나 유지하는 실크 피브로인 폴리펩티드의 임의의 효과를 지칭한다. 실크 피브로인 매트릭스의 안정화 효과에 대한 더 구체적인 논의는 PCT/US12/34643(2012년 4월 23일 출원) 및 문헌 [Zhang et al. (2012) Proc.Nat'l.Acad.Sci. U.S.A. 109(30): 11981-6]에서 제공되며, 이들 문헌의 내용은 전체로서 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 기술된 다양한 측면의 실시양태에 따라, 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 적어도 하나의 특성은 임의의 기간 동안 저분자량 실크 피브로인 조성물 내에 안정화될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정화하다", "안정화하는" 또는 "안정화"는 생물학적 샘플의 성분의 하나 이상의 특성(예를 들어, 활성, 완전성 및/또는 양)이 기간에 걸쳐 저분자량 실크-기재 물질에서 부분적으로 또는 완전히 유지되거나 보유되는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 활성의 안정화와 관련하여, 생물학적 샘플에 원래 존재하는 성분의 적어도 약 30% 이상(적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100% 이하를 비롯하여)이 기간에 걸쳐 적어도 부분 또는 완전한 활성을 보유할 수 있다. 환언하면, 성분은 기간에 걸쳐 그의 원래 활성의 적어도 약 30% 이상(적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100% 이하를 비롯하여)를 보유할 수 있다. 완전성의 안정화와 관련하여, 생물학적 샘플에 원래 존재하는 성분의 적어도 약 30% 이상(적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100% 이하를 비롯하여)이 기간에 걸쳐 온정성을 보유할 수 있다. 양의 안정화와 관련하여, 생물학적 샘플에 원래 존재하는 성분의 적어도 약 30% 이상(적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100% 이하를 비롯하여)이 성분이 활성 또는 비활성, 또는 무손상 또는 비무손상인지와 무관하게, 기간에 걸쳐 보유될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 성분의 원래의 존재 또는 원래의 활성에 관하여 사용되는 용어 "원래" 또는 "원래의"는 생물학적 샘플이 대상체로부터 얻어진 직후에 측정되거나, 또는 별법으로 생물학적 샘플을 실크-기재 물질 내에 혼합시키거나 혼입시킨 직전 또는 직후에 측정된 성분의 수준을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 성분의 원래의 존재 또는 원래의 활성은 대조군, 예를 들어 비-실크 접근에 의해 안정화된 대조군, 예컨대 동결 대조군 내 성분의 수준을 지칭한다.

통계적으로 유의한: 용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게는"은 통계적 유의성을 지칭하며, 일반적으로 2 표준 편차 (2SD)의 기준 수준 미만 또는 초과를 의미한다. 용어는 차이가 존재한다는 통계상의 증거를 지칭한다. 이는 귀무 가설이 실제로 참인 경우에 귀무 가설에 반하는 결정을 할 수 있는 확률로서 정의된다.

대상체: 본원에 사용된 바와 같은 "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 통상적으로 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥 동물이다. 영장류는 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미 원숭이 및 마카크, 예를 들어 레서스를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 우드척, 페릿, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예를 들어 집고양이, 개 종, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어 닭, 에뮤, 타조 및 어류, 예를 들어 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 환자 또는 대상체는 앞서 말한 것의 임의의 하위 집단, 예컨대 상기 전부나 하나 이상의 군집 또는 종, 예를 들어 인간, 영장류 또는 설치류를 제외한 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예컨대 인간이다. 용어 "환자" 및 "대상체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

민감한: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "민감한"은 일반적인 인구 전체에서 관찰되는 것보다 어떤 것, 예를 들어, 질병, 장애 또는 상태(예를 들어, 암과 같은)에 대한 상승된 위험성 및/또는 그에 대한 성향(전형적으로, 유전적 소인, 환경적 요인, 개인 이력 또는 이들의 조합)을 갖는 것을 의미한다. 이 용어는 상태에 대한 개별적인 "민감함"이 절대로 상태를 진단하지 않는다는 것을 고려한다.

튜브: 여기서 용어 "튜브"은 루멘을 갖는 신장된 샤프트를 지칭한다. 이 튜브는 전형적으로 신장 중공 실린더일 수 있으나, 다른 단면 형상의 중공 샤프트일 수도 있다.

바람직한 실시양태가 본원에 상세하기 묘사되고 기술되었지만, 관련 기술의 숙련자는 다양한 변형, 추가, 대체 등이 본 발명의 취지를 벗어남 없이 이뤄질 수 있고 따라서 이것이 하기의 청구항에 정의된 본 발명의 범위 내에서 고려될 수 있음을 명백히 알 것이다. 또한, 이미 지적된 정도까지, 본원에 기술되고 설명된 다양한 실시양태 중 어느 하나가 본원에 개시된 다른 임의의 실시양태에서 보여지는 특징을 도입하여 추가로 변형될 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.

본 개시내용은 제한되어 해석되어서는 안되는 하기 예시에 의해 추가로 설명된다. 이러한 예시는 설명을 위한 것일 뿐, 본원에 기술된 임의의 방식, 임의의 측면으로 제한하고자 하는 것은 아니다. 하기 예시는 본원발명을 어떠한 방법으로도 제한하지 않는다.

특정 실시양태의 상세한 기재

본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 한정되지 않으며, 따라서 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 전문용어는 특정한 실시양태만을 설명하기 위한 목적을 가지며, 오로지 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범주를 제한할 의도는 없다.

본원과 청구항에서 사용된 바와 같이 단수 형태는 문맥에서 명확하게 지시하지 않는 한 복수 참조 및 그 역도 포함한다. 작동예에서 외에 또는 달리 지시가 있는 곳에서는, 본원에서 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 경우에 변형됨을 이해해야 한다.

확인된 모든 특허 및 기타 간행물은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 이같은 간행물에 기술된 방법론을 예를 들어 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 명확하게 참고로 포함된다. 이들 간행물은 본원의 출원일 전에 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 어느 것도 본 발명자들은 종래 발명으로 인한 또는 임의의 다른 이유 때문에 상기 개시보다 선행할 권리를 가지지 않는 인정으로서 해석되어서는 안된다. 이들 문헌의 일자에 대한 모든 진술, 또는 이들 문헌의 내용에 관한 설명은 본 출원인에게 가용한 정보에 기초되고, 이들 문헌의 일자 또는 내용의 정확함에 관한 인정으로서 성립되지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속하는 기술의 통상의 기술자에게 이해되는 일반적인 것과 동일한 의미를 갖는다. 임의의 알려진 방법, 장치 및 물질이 본원의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이와 관련된 이 방법, 장치 및 물질은 본원에 기술된다.

저분자량 조성물

본원에 제공된 하나의 측면은 저분자량 실크 피브로인 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 한가지 측면에 따르면, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 집단 중 실크 피브로인 단편 총 수의 15% 이하가 200 kDa 초과의 분자량을 갖고, 집단 중 실크 피브로인 단편 총 수의 50% 이하가 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa인 특정 범위 내의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 분자량 범위를 갖는 실크 피브로인 단편의 집단을 포함한다.

환언하면, 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 집단 중 실크 피브로인 단편 총 몰수의 15% 이하가 200 kDa 초과의 분자량을 갖고, 집단 중 실크 피브로인 단편 총 몰수의 50% 이하가 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa인 특정 범위 내의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 분자량 범위를 갖는 실크 피브로인 단편의 집단을 포함한다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 집단 중 실크 피브로인 단편 총 중량의 15% 이하가 200 kDa 초과의 분자량을 갖고, 집단 중 실크 피브로인 단편 총 중량의 50% 이하가 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa인 특정 범위 내의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 분자량 범위를 갖는 실크 피브로인 단편의 집단을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 문구 "실크 피브로인 단편"은 실크 피브로인 단백질 또는 이들의 변이체로부터 유래된 단편에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 사슬 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 기재의 내용에서, 실크 피브로인 단편은 일반적으로 자연 발생 전장 실크 피브로인보다 작은 실크 피브로인 펩티드 사슬 또는 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 집단 또는 조성물 내의 하나 이상의 실크 피브로인 단편이 300 kDa 이하, 250 kDa 이하, 200 kDa 이하, 175 kDa 이하, 150 kDa 이하, 120 kDa 이하, 100 kDa 이하, 90 kDa 이하, 80 kDa 이하, 70 kDa 이하, 60 kDa 이하, 50 kDa 이하, 40 kDa 이하, 30 kDa 이하, 25 kDa 이하, 20 kDa 이하, 15 kDa 이하, 10 kDa 이하, 9 kDa 이하, 8 kDa 이하, 7 kDa 이하, 6 kDa 이하, 5 kDa 이하, 4 kDa 이하, 3.5 kDa 이하 등이 된다.

일부 실시양태에서, "실크 피브로인 단편의 집단을 포함하는 조성물"은 실크 피브로인 폴리펩티드의 더 짧은 단편외에 비-단편화된(즉, 전장) 실크 피브로인 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포괄한다. 본원에 기술된 실크 피브로인 단편은 재조합 단백질로 생성될 수 있거나 천연 실크 피브로인 단백질 또는 누에고치로부터 유래되거나 단리될(예컨대, 정제될) 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편은 특정된 조건하에서 누에고치를 정련하여 원하는 범위의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편을 생성함으로써 유래될 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편은 적어도 약 60분 또는 그 이상(예컨대 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분, 적어도 110분, 적어도 약 120분 또는 그 이상을 포함) 동안 대기 비등 온도 내외에서 누에고치를 정련하여 유래될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대기 비등 온도"는 대기압하에서 액체가 비등하는 온도를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편은 적어도 60분 또는 그 이상(예컨대 적어도 70분 또는 그 이상을 포함) 동안 약 90℃ - 약 110℃의 수용액에서 누에고치를 정련하여 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편은 더 긴 기간, 예컨대 60분 초과 또는 그 이상(예컨대 70분 초과, 80분 초과, 90분 초과, 100분 초과, 110분 초과, 120분 초과, 130분 초과, 140분 초과, 150분 초과, 또는 그 이상을 포함) 동안 대기 비등 온도 이하에서 누에고치를 정련하여 유래될 수 있다.

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 실크 피브로인 단편은 적어도 60분 또는 그 이상(예컨대 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분 또는 그 이상을 포함) 동안 약 70℃의 온도에서 누에고치를 정련하여 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편은 특정된 조건하에서 누에고치를 정련하고 생성된 실크 피브로인 용액을 고온 및/또는 고압에서 추가로 처리하는 것을 포함하는 공정에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 실크 피브로인 단편은 약 10분 동안 비등 온도 주변에서 누에고치를 정련하고 이어서 생성된 실크 피브로인 용액을 고온 및/또는 고압(예를 들어, 오토클레이빙)에서 처리하는 것을 포함하는 공정에 의해 생성될 수 있다.

한 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물의 예는 하기와 같이 생성될 수 있다: 실크 피브로인 제조는 예를 들어 SDS 겔 전기 이동에 의해 측정된 바와 같이 실크 피브로인 제조에 존재하는 총 실크 피브로인의 적어도 50 중량%가 감소된 중량, 즉 전장 실크 피브로인보다 작은(예를 들어, 실크 피브로인 단편) 중량을 보여주는 것을 특징으로 하는, 실크 피브로인 폴리펩티드의 단편화를 달성할 수 있는 충분한 양으로 진행된다(예를 들어, 가열 및/또는 비등). 예를 들어, 출발 물질로 총 1.0 그램 전장 실크 피브로인을 함유하는 실크 피브로인 제조에 대해 설명하자면, 가열 및/또는 비등 단계 후에, 적어도 0.5 그램의 실크 피브로인을 이제 출발 물질(예를 들어, 전장 폴리펩티드)에 비해 감소된 형태(더 작은 단편)로 만든다. 그 결과, 이 제조 내에서 실크 피브로인 폴리펩티드의 평균 중량은 저분자량 실크 피브로인 조성물의 형성시 감소할 것이다.

일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물에서 실크 피브로인 단편에는 실질적으로 세리신이 없을 수 있다. 일부 실시태양에서, 실크 피브로인 단편은 실크 단백질 조성물의 총 중량 중 5 중량% 이하 또는 그 미만의 세리신을 함유할 수 있다. 예를 들어, 실크 피브로인 단편은 실크 피브로인 단편은 실크 단백질 조성물의 총 중량 중 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.5 중량% 이하의 세리신을 함유할 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편은 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 작용기를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편은 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 펩티드, 단백질, 핵산 분자, 조영제, 치료제, 표적 결합 리간드, 세포 결합 리간드, 친양쪽성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 작용제에 공유결합으로 또는 비공유결합으로 연결되거나 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서,실크 피브로인 단편의 아미노산 서열은 세포 결합 리간드 및/또는 친양쪽성 펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인 단편의 아미노산 서열은 RGD 서열을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 실시양태에서, 집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 15% 이하가 200 kDa를 초과하는 분자량을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "200 kDa를 초과하는"은 200 kDa보다 큰 실크 피브로인 단편의 분자량을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 어구 "200 kDa를 초과하는"은 약 200 kDa인 실크 피브로인 단편의 분자량을 포괄할 수 있다. 일부 실시양태에서, 200 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편은 실크 피브로인의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 10% 이하(예를 들어 실크 피브로인의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하를 포함)의 양으로 집단에 존재한다. 한 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물에는 200 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편이 실질적으로 없다.

본원에 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물에서, 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 50%는 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa인 특정 범위 내의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 50%(예를 들어, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상을 포함)는 특정된 범위 내의 분자량을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa의 분자량을 실질적으로 갖는 실크 피브로인 단편의 군집을 가질 수 있다.

집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 50%에 존재하는 실크 피브로인 단편의 분자량 분포의 특정된 범위는 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa로 달라질 수 있다. 일부 실시태양에서, 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 약 50%의 분자량 분포는 하한 3.5 kDa 또는 그 이상, 그러나 120 kDa 미만을 가질 수 있다. 예를 들어, 특정된 범위의 하한은 3.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 또는 115 kDa일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 약 50%의 분자량 분포의 특정된 범위는 상한 10 kDa 또는 그 이상(120 최대 kDa를 포함)을 가질 수 있다. 단지 예로서, 특정된 범위의 상한은 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120 kDa일 수 있다. 특정된 범위의 예는 제한은 없지만, (i) 약 5-120kDa 사이; (ii) 약 10-120kDa 사이; (iii) 약 15-120kDa 사이; (iv) 20-120kDa 사이; (v) 20-110kDa 사이; (vi) 약 20-100kDa 사이; (vii) 약 20-90kDa 사이; (viii) 약 20-80kDa 사이; (ix) 약 30-120kDa 사이; (x) 약 30-100kDa 사이; (xi) 약 30-90kDa 사이; (xii) 약 30-80kDa 사이; (xiii) 약 40-120kDa 사이; (xiv) 약 40-110kDa 사이; (xv) 약 40-100kDa 사이; (xvi) 약 40-90kDa 사이; 및 (xvii) 약 40-80kDa 사이를 포함할 수 있다.

상기 기술된 특정된 범위의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인 단편은 연속적이거나 이산적인 분자량 분포를 나타낼 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연속적으로 분자량 분포"는 특정된 범위 사이의 임의의 하위 범위를 갖는 분자량의 분포를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이산적으로 분자량 분포"는 특정된 범위 사이의 특정 하위 범위를 갖는 분자량의 분포를 지칭한다. 단지 예로서, 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa의 특정된 범위의 이산적인 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인 단편은 실크 피브로인 단편 중 일부는 약 3.5 kDa 내지 약 10 kDa의 분자량을 갖지만, 실크 피브로인 단편의 적어도 일부 또는 나머지가 약 110 kDa 내지 약 120 kDa의 분자량을 갖는 것인 실크 피브로인 단편의 집단을 지칭한다.

이에 따라, 일부 실시양태에서, 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa의 특정 범위 내의 분자량을 갖는 집단에서 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 약 50% 또는 그 이상은 실크 피브로인 단편의 집단으로 특징될 수 있으며, 여기서 특정 범위 내의 분자량을 갖는 집단에서 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 약 50% 또는 그 이상은 하기 하위 범위 (i)-(x), (i) 20 kDa 내지 30 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (ii) 30 kDa 내지 40 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (iii) 40 kDa 내지 50 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (iv) 50 kDa 내지 60 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (v) 60 kDa 내지 70 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (vi) 70 kDa 내지 80 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (vii) 80 kDa 내지 90 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (viii) 90 kDa 내지 100 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (ix) 100 kDa 내지 110 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; 및 (x) 110 kDa 내지 120 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인을 포함하는 것 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)에 포함될 수 있다.

분자량 하위 범위 (i)-(x)를 갖는 실크 피브로인 단편의 조합된 중량이 조성물 내 모든 실크 피브로인의 총 수(또는 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 50% 또는 그 이상을 구성한다면, 분자량 하위 범위 (i) 내지 (x)를 갖는 실크 피브로인 단편의 양은 본원에서 기술된 조성물 내 모든 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 몰수) 또는 총 중량 중 0% 내지 100%로 달라질 수 있다. 이에 따라, 본원에 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물은 분자량 하위 범위 (i) 내지 (x)를 갖는 실크 피브로인 단편의 임의의 조합을 갖도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 본원에 정의된 하나의 특정 분자량 하위 범위에 상응하는 실크 피브로인 단편을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 본원에 정의된 두 개 이상의 특정 분자량 하위 범위에 상응하는 실크 피브로인 단편의 혼합물을 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 76 kDa의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편 대 18 kDa의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편의 비율은 5:1 내지 1.5:1이 아니다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 몰수) 또는 총 중량 중 15% 이하가 200 kDa를 초과하는 분자량을 갖고, 집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 몰수) 또는 총 중량 중 적어도 50%가 76 kDa의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편 대 18 kDa의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편의 비율은 5:1 내지 1.5:1이 아닌 경우에, 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa인 특정 범위 내의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 분자량 범위를 갖는 실크 피브로인 단편의 집단을 포함한다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 120 kDa 내지 200 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 몰수) 또는 총 중량 중 35% 이하를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 120 kDa 내지 200 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 몰수) 또는 총 중량 중 35% 미만(예컨대, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 1% 이하를 포함)이 본원에 기술된 조성물에 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물에는 120 kDa 내지 200 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인 단편이 실질적으로 없을 수 있다.

조성물이 120 kDa 내지 200 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인 단편을 포함하는 일부 실시태양에서, 이 실크 피브로인 단편은 하위 범위 (xi)-(xviii), (xi) 120 kDa 내지 130 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (xii) 130 kDa 내지 140 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (xiii) 140 kDa 내지 150 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (xiv) 150 kDa 내지 160 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (xv) 160 kDa 내지 170 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (xvi) 170 kDa 내지 180 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; (xvii) 180 kDa 내지 190 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인; 및 (xviii) 190 kDa 내지 200 kDa의 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인을 포함하는 것 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)에 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 참조 실크 피브로인 조성물과 비교해서 본원에 정의된 특정 하위 범위 (i)-(xviii) 내의 적어도 하나 이상의 실크 피브로인 단편에서 우세할 수 있다. 일부 실시양태에서, 참조 실크 피브로인 조성물은 약 60분 동안 대기 비등 온도에서 누에고치를 정련하여 생성된 조성물 또는 혼합물일 수 있다. 한 실시양태에서, 참조 실크 피브로인 조성물은 약 60분 동안 수용성 탄산나트륨 용액 내에서 대기 비등 온도에서 누에고치를 정련하여 생성된 조성물 또는 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 참조 실크 피브로인 조성물과 비교해서 본원에 정의된 특정 하위 범위 (i)-(xviii) 내의 적어도 두 개 이상의 실크 피브로인 단편(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)에서 우세할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나 이상의 실크 피브로인 단편은 참조 실크 피브로인 조성물과 비교해서, 적어도 약 10% 또는 그 이상(예컨대, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상을 포함)만큼 조성물에서 우세할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나 이상의 실크 피브로인 단편은 참조 실크 피브로인 조성물과 비교해서, 적어도 약 1.1배 또는 그 이상(예컨대, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 그 이상을 포함)만큼 조성물에서 우세할 수 있다.

본원에 기술된 다양한 실시양태에 따라, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 소위 "가수분해된 실크"와는 구별된다. 가수분해된 실크는 일반적으로 실크 단백질을 더 작은 단백질 사슬, 예컨대 1 kDa 이하의 분자량을 갖는 것 및/또는 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 구성 아미노산으로 가수분해하거나 붕괴시켜 생성된다. 이에 따라, 본원에서 사용된 용어 "가수분해된 실크"는 2 kDa 미만, 1 kDa 미만, 500 Da 미만 또는 그 이하의 분자량을 갖는 실크 펩티드 사슬 또는 아미노산을 지칭한다. 환언하면, 가수분해된 실크에는 일반적으로 적어도 3.5 kDa 또는 그 이상(예를 들어, 적어도 5 kDa, 적어도 10 kDa, 적어도 15 kDa, 적어도 20 kDa, 적어도 25 kDa, 적어도 30 kDa, 적어도 40 kDa, 적어도 50 kDa, 적어도 60 kDa, 적어도 70 kDa, 적어도 80 kDa, 적어도 90 kDa, 적어도 100 kDa 또는 그 이상을 포함)의 분자량을 갖는 실크 피브로인 펩티드 사슬이 없다.

본원에 기술된 실크 피브로인 단편의 분자량은 예컨대 제한되지는 않지만, SDS-PAGE 겔, 크기 배제 겔 크로마토그래피, 질량 분광분석법, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본 기술에서 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물 내 본원에 참조된 실크 피브로인 단편의 분자량은 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 결정될 수 있다. 단지 예로서, 각각의 저분자량 피브로인 조성물에 대해, 조성물 또는 실크 피브로인 단백질의 적절한 양(예컨대, 약 7.5 μg)은 용액에서 제조되고, 이어서 3-8% 트리스-아세테이트 겔(예를 들어, 인비트로젠으로부터 수득한 NuPAGE® 노벡스® 3-8% 트리스-아세테이트 겔)과 같은 겔 내에 로드될 수 있습니다. 단백질 표준 또는 래더(ladder)도 참조 분자량을 제공하기 위해 겔 내에 로드된다. 단백질 표준의 예는 제한되지는 않지만, 하이마크™ 프리-스테인드 단백질 스탠다드 (30-460 kDa 범위, 인비트로젠) 및 마크12™ 단백질 표준 (30-200kDa 범위, 인비트로젠)을 포함할 수 있다. 이 겔은 제작자의 지시에 따른 감소 조건하에서 작동될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 겔은 약 45분 동안 약 ~200 V에서 작동되고, 이어서 단백질 밴드의 시각화를 위해 착색될 수 있다. 일부 실시양태에서, 겔은 예를 들어 인비트로젠으로부터 수득된 콜로이드성 청색 염색 키트로 착색될 수 있다. 이어서, 저분자량 실크 피브로인 조성물에 존재하는 실크 피브로인 단편의 분자량 분포는 임의의 인정된 기술 방법을 사용, 예를 들어, 겔의 샘플 래인의 길이를 따라 단백질 밴드의 농도계 측정법을 취하여 정량화될 수 있다. 한 실시양태에서, 이미지제이(ImageJ)(NIH, 미국 메릴랜드주 베데스다)는 겔에 대한 단백질 밴드의 농도계 측정법을 결정하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이미지제이 소프트웨어 내의 "겔 분석기" 도구는 농도계 분석을 수행하는데 사용될 수 있다.

제한 없이, 본원에 사용된 분자량은 피크 평균 분자량 (Mp), 수 평균 분자량 (Mn), 또는 중량 평균 분자량 (Mw)일 수 있다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 적어도 하나 이상의 활성화제를 더 포함할 수 있고, 이들의 예시는 아래 기술된다. 활성화제는 본 기술에 알려진 임의의 방법에 의해 본원에 기술된 조성물에 확산될 수 있다. 예를 들어, 활성화제는 본원에 기술된 조성물에 균질하게 또는 불균질하게(예컨대, 활성화제의 구배를 형성하며) 확산될 수 있다(미국 출원 공개 번호 US20070212730 A1 참조, 이것의 내용은 전체로서 본원에 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물에 포함된 작용제는 액체 또는 고체 형태로이든 이러한 조성물에 저장되고/거나 이러한 조성물로부터 방출되거나 회수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포함된 작용제는 예컨대, 이러한 방출 또는 회수 전에, 그동안 또는 그 후에 분석될 수 있다.

저분자량 용액:

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 저분자량 실크 피브로인 조성물은 용액(임의적으로 작용제, 예컨대 본원에 기술된 안정화되거고/거나 분석될 작용제를 포함)일 수 있다. 이에 따라, 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태를 포함하는 수용성 실크 피브로인 용액이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 수용성 실크 피브로인 용액은 물에 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용성 실크 피브로인 용액은 완충된 용액에서 제형화될 수 있다. 완충된 용액의 예시는 제한되지는 않지만, 포스페이트 완충 용액을 포함한다.

실크 피브로인은 필요, 예컨대, 실크 피브로인 용액의 주입력에 맞는 임의의 농도로 용액에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용성 실크 피브로인 용액은 약 0.1% wt/v 내지 약 90% wt/v, 0.1% wt/v 내지 약 75% wt/v, 또는 0.1% wt/v 내지 약 50% wt/v의 농도로 실크 피브로인을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용성 실크 피브로인 용액은 약 0.1% wt/v 내지 약 10% wt/v, 약 0.1% wt/v 내지 약 5% wt/v, 약 0.1% wt/v 내지 약 2% wt/v, 또는 약 0.1% wt/v 내지 약 1% wt/v의 농도로 실크 피브로인을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 수용성 실크 피브로인 용액은 약 10% wt/v 내지 약 50% wt/v, 약 20% wt/v 내지 약 50% wt/v, 약 25% wt/v 내지 약 50% wt/v, 또는 약 30% wt/v 내지 약 50% wt/v의 농도로 실크 피브로인을 갖는다.

일부 실시양태에서, 수용액은 적어도 약 3일 또는 그 이상(예를 들어, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주 또는 그 이상을 포함) 동안 특정 조건하에서 안정하게 유지될 수 있다. 특정 조건은 제한되지는 않지만 온도, 빛, 습도, 온도, 압력, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 환경적인 파라미터 중 하나 이상에 의해 특징될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용성 실크 용액은 적어도 약 3일 또는 그 이상(예를 들어, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 2주 또는 그 이상을 포함) 동안 약 실온 내지 적어도 약 37℃ 또는 그 이상에서 안정하게 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용액은 적어도 약 3일 또는 그 이상(예를 들어, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주 또는 그 이상) 동안 특정 조건에의 수용성 실크 피브로인 용액의 노출시 겔이 아니다. 일부 실시양태에서, 수용성 실크 용액은 적어도 약 3일 또는 그 이상(예를 들어, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주 또는 그 이상) 동안 적어도 실온 또는 그 이상(예컨대, ~15℃, ~20℃, ~25℃, ~30℃, ~35℃, ~40℃ 또는 그 이상)의 온도에의 수용성 실크 피브로인 용액의 노출시 겔이 아니다.

일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 저분자량 실크 피브로인 용액은 본원에서 정의된 참조 실크 피브로인 용액보다 더 느리게 겔 상태가 된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 저분자량 실크 피브로인 용액 통상적인 실크 피브로인 용액보다 더 느리게 겔 상태가 된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정하게 유지한다"는 기간 동안 특정 조건에의 노출시 실질적으로 동일하게 유지하는 수용성 실크 피브로인 용액의 물질 특성을 지칭한다. 물질 특성의 예는 제한되지는 않으나, 점도, 입자 크기, 불투명함, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정한 수용성 실크 용액은 기간 동안 특정 조건에의 노출시 점도의 실질적인 변화가 없는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정한 수용성 실크 용액은 본원에서 정의된 균질 용액을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 균질한 수용성 실크 피브로인 용액은 기간 동안 특정된 조건에의 노출시 실크 피브로인 응집체(예컨대, 불용성 실크 피브로인 단편, 육안으로 가시가능한 실크 피브로인 입자 및/또는 클러스터)가 실질적으로 없는 수용성 실크 피브로인 용액을 특징으로 할 수 있다. 실크 피브로인 응집체의 예는 제한되지는 않지만, 전장 실크 피브로인 분자, 더 긴 실크 피브로인 단편, 실크 피브로인 입자 또는 더 작은 실크 피브로인 단편의 어샘블리 또는 응집체에 의해 형성된 클러스터, 및 이들의 임의의 조합)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 응집체는 제한되지는 않지만, 침전, 겔화, 및/또는 클럼핑을 포함하는 공정에 의해 형성된 실크 피브로인 입자 또는 클러스터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 응집체는 약 1 mm 또는 그 이상을 갖는 실크 피브로인 입자 또는 클러스터일 수 있다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인 입자 또는 클러스터는 용액에 존재하는 실크 피브로인 입자의 어샘블리 또는 응집체에 의해 형성될 수 있다.

저분자량 물품:

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 저분자량 실크 피브로인 조성물은 고체 실크 피브로인 물품을 형성할 수 있다. 이러한 고체 실크 피브로인 물품의 예는 제한되지는 않지만, 필름, 시트, 겔 또는 히드로겔, 메쉬, 매트, 부직 매트, 직물, 스캐폴드, 튜브, 블록, 섬유, 입자, 분말, 3차원 구조물, 임플란트, 발포체, 바늘, 동결건조 물품, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 고체 실크 피브로인 물품의 다양한 형태를 형성하는 방법은 본 기술에 공지되어 있고, 일부 예시적인 방법은 본원의 이하에 기술된다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 적어도 1개월 동안 저장 안정할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "저장 안정성"은 기간 동안 저장시 실질적으로 동일하게 유지하는 실크 피브로인 입자의 물질 특성을 지칭한다. 실크 피브로인 물품의 물질 특성은 제한되지는 않지만, 경도, 기공률, 용해도, 입자 크기, 건도, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 물에서 재용해되어 실크 피브로인 응집체가 실질적으로 없는 실크 피브로인 용액을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품 중 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상이 물에서 재용해되어 실크 피브로인 응집체가 실질적으로 없는 실크 피브로인 용액을 형성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 가열 및/또는 염 첨가는 본원에서 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태를 사용하여 제조된 저분자량 실크 피브로인 물품을 용해하는데 필요하지 않다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 물품은 실온에서 수용액 내로 재용해되어 실크 피브로인 용액을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 물품은 용해된 실크 피브로인의 농도가 포화 미만인 경우에는 실온에서 물 내로(예컨대, 탈이온수) 완전히 용해시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용액(예컨대, 물) 내의 저분자량 실크 피브로인 조성물의 포화점은 적어도 30% w/v, 적어도 40% w/v, 적어도 50% w/v, 적어도 60% w/v, 적어도 70% w/v, 적어도 80% w/v 또는 그 이상일 수 있다.

일부 실시양태에서, 수용액(예컨대, 물) 내의 저분자량 실크 피브로인 조성물의 포화점은 약 30% w/v 내지 약 80% w/v, 약 40% w/v 내지 약 70% w/v, 약 50% w/v 내지 약 60% w/v 범위일 수 있다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 적어도 약 10 mg/mL 또는 그 이상(예를 들어, 적어도 약 20 mg/mL, 적어도 약 30 mg/mL, 적어도 약 40 mg/mL, 적어도 bout 50 mg/mL, 적어도 약 60 mg/mL, 적어도 약 70 mg/mL, 적어도 약 80 mg/mL, 적어도 약 90 mg/mL, 적어도 약 100 mg/mL, 적어도 약 200 mg/mL, 적어도 약 400 mg/mL, 적어도 약 600 mg/mL, 적어도 약 800 mg/mL, 적어도 약 1000 mg/mL 또는 그 이상을 포함)의 수용해도를 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 적어도 0.01　mg/s 내지 약 100 mg/s 또는 약 0.1 mg/s 내지 약 90 mg/s, 또는 약 1 mg/s 내지 약 80 mg/s의 용해 속도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 약 0.01　mg/s 내지 약 100 mg/s 또는 약 0.1 mg/s 내지 약 90 mg/s, 또는 약 1 mg/s 내지 약 80 mg/s의 속도로 실온에서 수용액(예컨대, 탈이온수와 같은 물)에 용해될 수 있다.

일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품은 온디맨드 또는 필드 진단 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용자(예컨대, 대상체 또는 의료 제공자)는 임의의 장소(예들 들면, 레지던스, 벽촌, 전장)에서 실크 피브로인 물품을 적용하거나 자기 투여할 수 있다. 진단용으로, 일부 실시양태에서, 사용자는 실크 피브로인 물품을 병원, 클리닉 또는 임의의 분석 시설로 보낼 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 일부 실시태양에서, 저분자량 피브로인 물품은 저장된 샘플(예를 들어, 저장된 혈액 샘플)을 생성하는데 사용될 수 있고, 일부 실시양태에서, 저장된 샘플은 적어도 특정 기간(예컨대, 수일, 수 주, 수 달, 수년 등)에 걸쳐 안정할 수 있고/거나 (예를 들어 후에 얻어진 샘플 등과 실시예의 비교를 가능하게 하기 위해) 시간에 걸쳐 재-시험 또는 샘플링될 수 있다.

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 일부 실시양태에서, 재용해도(즉, 용액 또는 액체 형태내로 용해되거나 재구성될 저분자량 실크 피브로인 조성물의 고체 형태의 능력)는 누에고치를 정련하기 위한 시간의 길이 및/또는 온도에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용해가능한 실크 피브로인 물품은 저분자량 실크 피브로인 용액으로부터 형성될 수 있고, 이것은 적어도 60분 또는 그 이상, 예컨대 적어도 90분 또는 그 이상 동안 대기 비등 온도 내외에서 누에고치를 정련하여 얻어진다. 다른 실시양태에서, 용해가능한 실크 피브로인 물품은 저분자량 실크 피브로인 용액으로부터 형성될 수 있고, 이것은 적어도 90분 또는 그 이상, 예컨대 적어도 120분 또는 그 이상 동안 더 저온, 예컨대 약 60-90℃에서 누에고치를 정련하여 얻어진다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 고체 형태는 매우 용해가능하다. 따라서, 한 측면에서, 본원발명은 저분자량 실크 피브로인 단편을 포함하는 고체 실크 피브로인 조성물의 매우 용해가능한 고체를 제공한다. 이미 기술된 통상적인 실크 피브로인 조성물에 비해, 본원에서 기술된 고체 실크 피브로인 조성물의 매우 용해가능한 형태는 이것의 높은 수용해도, 높은 용해 속도뿐 아니라 넓은 범위의 작용제(예컨대, 제한되지는 않지만 생물학적 작용제)와의 생체 적합성을 특징으로 한다. 재료 과학 관점에서 보면, 본원에 기술된 저분자량 실크 피브로인 조성물은 더 큰 가요성, 조화 가능성 및 액체-고체 또는 고체-액체 전환을 더 잘 조절하는 능력으로 인한 부분적 처리 및 변성의 용이성을 제공한다. 이것은 적어도 부분적으로 실크 피브로인의 용해도는, 조성물은 실크 피브로인의 더 작은 단편(즉, 저분자량 실크 피브로인 단편)으로 대부분 구성되어 있는 경우 정교하게 조절될 수 있다는 점에 기초한다. 이 추가된 가요성은 더 고분자량 실크 피브로인을 포함하거나 또는 이루어진 통상적인 실크 물질로는 불가능한 방식으로 실크기재 물질을 활용가능하게 한다. 따라서, 저분자량 실크 피브로인 물질의 독특한 물질 특성은 제한되지는 않지만, 수용액에 용이하게 용해될 수 있는 고체 형태 실크 피브로인 조성물; 및 거기에 포함되거나 또는 연관된 작용제에 대한 원하는 안정화 효과를 제공하는 동안 원하지 않는 자가조립 또는 겔화를 저지하는 액체 형태 실크 피브로인 조성물(예컨대, 실크 피브로인 용액)을 포함한다.

이에 따라, 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 구체적으로 제형화되어 완전히 용해가능한 형태로 거동할 수 있고, 이것은 물(예컨대, 증류수 또는 탈이온수) 또는 특정 용도에 적합한 임의의 다른 물 기재의 용액, 예컨대 완충제에서 용이하고 빠르게 재구성될 수 있다. 이 실시양태에서, 본원에서 기술된 고체 형태 내 저분자량 실크 피브로인 조성물은 수용액 내로 손쉽게 용해가능하기 때문에, 거기에 도입된 하나 이상의 작용제는 고체 저분자량 실크 피브로인 조성물의 가용성 형태로부터 손쉽게 회수될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 작용제, 예를 들어 생물학적 샘플은 고체 형태로 저분자량 실크 피브로인 조성물과 공동으로 "저장"될 수 있고, 이것은 이어서 수용액으로 방출되어 작용제의 거의 완전한 회수를 달성할 수 있다. 방출되면, 이러한 작용제는 임의의 적합한 수단, 예컨대 분석 도구에 의해 용이하게 분석(예컨대, 검출, 측정, 분석(assay), 식별, 단리 등)될 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 포함된 작용제(예컨대, 생물학적 작용제)는 실크 피브로인 조성물로부터 방출되지 않고 분석될 수 있다.

안정화 조성물

활성화제 및/또는 생물학적 샘플은 보통 주위 조건, 예컨대, 온도, 습도 및/또는 빛에서의 변화에 불안정하고 민감하기 때문에, 안정화될 원하는 작용제의 안정화 및 후속 회수(예컨대, 활성화제 및/또는 생물학적 샘플)은 많은 용도의 중대한 특징이다. 다수의 이미 기술된 방법에서, 활성화제 또는 생물학적 샘플이 주어진 반응에 유용하게 식별되더라도, 그 용도는 공정 조건하에서 장기간 저장성의 부족 및/또는 낮은 회수에 의해 종종 방해된다. 추가로 하기에서 기술된 바와 같은, 본원에 기술된 본원발명의 다양한 실시양태는 선행 기술에 존재하는 이 결점을 해결한다.

예를 들어, 불리한 온도 프로파일에 대한 안정화된 샘플을 보호할 수 있는 기술은 글로벌 스케일에 중심화된 시험 시스템의 범위를 확장할 수 있다. 이 때문에, 발명자는 그 중에서도 특정 실크 기재의 물질은 구조적 및/또는 기능적 특징의 저하로부터 활성화제(예컨대, 생물학적 샘플 도는 그의 성분, 치료 및/또는 진단 시약 등)를 보호할 수 있다는 것을 발견하였다. 용어 "활성화제"는 생물학적 샘플(예컨대, 조직 또는 예를 들어 피와 같은 체액의 샘플) 또는 이의 성분을, 및/또는 생물학적 활성 독립체 또는 화합물을, 및/또는 구조적으로 또는 기능적으로 불안정한 독립체를 지칭하는데 본원에서 사용된다.

일부 실시양태에서, 활성화제/생물학적 샘플의 생물활성의 안정화가 매우 중요하다. 다른 실시양태에서, 안정화 활성 또는 생물활성은 항상 요구되지 않는다. 예를 들어, 생물활성의 유지는 종종 안정화된 생물학적 샘플을 분석하고 정량화에 대한 요건이 아니다.

일부 특정 실시양태에서, 본 기재는 그 중에서도 실크 기재의 물질은 장기간에 걸쳐서 그리고 불리한 환경 조건의 맥락에서 인간 전체 혈액 및 RNA와 같은 혈액 성분을 보호할 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 본 기재는 전체 혈액 및/또는 공여체-적합 플라스마가 주형 또는 공기 건조에 의해 실크 기재의 물질, 예컨대 필름 및 물과의 단순한 혼합 프로토콜에 의해 회수된 각각의 플라스마 단백질에서 안정화될 수 있다는 것을 입증한다.

본 개시내용은 본원에서 기술된 바와 같이, 포함된 작용제의 안정화 용도에 대한 저분자량 실크 조성물의 다양한 특정 유리한 특징도 구체적으로 입증한다. 예를 들어, 다른 것들 중에서, 본 기재는 저분자량 실크 조성물이 더 고분자량의 실크 조성물보다 덜 빠르게 겔화하는 경향이 있다는 것을 입증한다. 다른 것들 중에서, 이러한 지연된 겔화 속성은 일부 실시양태에서 연장된 저장 수명에 기여할 수 있다. 추가적으로, 본 기재는 저분자량 실크 조성물이 오토클레이브에 대해 조차도 샘플 손실을 보호한다는 것을 입증한다. 일부 실시양태에서, 본원발명은 예를 들어 포함된 작용제를 포함하는, 오토클레이빙된 저분자량 실크 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원발명은 오토클레이빙된 이러한 조성물을 비롯하여, 저분자량 실크 조성물(예를 들어, 고체 형태 저분자량 실크 조성물)을 재구성하기 위한 시스템을 제공하고, 여기서 조성물은 포함된 작용제의 높은 회수를 특징으로 한다. 특성 실시양태에서, 이러한 조성물 및/또는 시스템은 조성물의 대형 스케일 제작 및/또는 공정(예를 들어, 선적)에 적절하다.

본원에서 입증하는 것과 같은 실크 피브로인 조성물의 안정화 효과는, 예를 들어 필드에서 수득한 샘플(예를 들어, 혈액 샘플)의 유지, 저장, 및/또는 운반에 대한 것을 포함한 폭넓은 영향을 갖는다. 그러므로 다수의 실시양태에서, 제공되는 기술은, 샘플(예를 들어, 채혈된 혈액)이 수득한 제한된 자원으로 수득된 환경에서 및/또는 하류 분석이 현장 진단 기술이 미치는 범위 밖에 있는 환경에서 특히 유용하다.

본 개시내용은 일단 실크-기재 물질로부터 회수된 다양한 공여자로부터의 혈액 분석물(또는 혈액 성분)의 절대 다수를 측정하는 데에 사용할 수 있는 임상-관련 분석 도구의 폭을 구체적으로 입증한다. 본원에서 보고하는 연구는 본원에 기재된 다양한 실시양태의 조성물 및 방법을 사용함으로써, 회수된 분석물 수준(또는 회수된 성분 수준)이 임상적 후처리를 위한 황금 표준(gold standard)으로 현재 사용되는 형식인 공여자-일치된 신선하거나 동결된 혈장에 대해 수행된 측정과 일치한다는 것을 입증한다. 일부 실시양태에서, 실크-안정화된 분석물 수준(또는 실크-안정화된 성분 수준)은 그의 동결된 대응물보다 높아, 실크-기재 물질이 특정 응용에 대해 현재의 황금 표준을 능가할 수 있다는 것을 나타냈다. 본 발명자들은 상이한 기술, 예컨대 동결건조가, 단순한 수성 재구성 방법을 사용하여 후속 회수를 위해 동일한 실크 제제의 존재하에서 생물학적 샘플, 예를 들어, RNA를 안정화하는 데에 사용될 수 있다는 것을 또한 입증했다. 회수된 RNA는 동결된 대조물과 일치하는 수준에서 사용가능했고 모델 세포주를 형질감염시킬 수 있다.

다양한 형태의 실크-기재 물질이 생물학적 샘플을 폭넓게-변동하는 온도 프로파일로부터 및 운송 도중 만나는 기계적 교란으로부터 보호할 수 있다 . 실크-기재 물질은 물에(예를 들어, 순수한 물 또는 샘플 상호작용에 적합한 완충제에) 재구성함으로써 완전히 용해된 시스템으로 기능하도록 특별히 제제되어, 다양한 임상-관련 분석 도구에 의해 분석될 트랩핑된 성분 또는 바이오마커의 완전한 회수를 제공할 수 있다. 본 개시내용 이전에, 관련 기술분야에 이들 독특한 속성, 즉 i) 샘플 조달의 용이성, ii) 인상적인 열적/기계적 안정성 프로파일, iii) 재구성/회수의 단순성을 조합하는 기술은 존재하지 않았다. 그러나, 본원에서 입증하는 대로, 본 개시내용은, 다른 것들 중에서도, i) 샘플 조달의 용이성, ii) 인상적인 열적/기계적 안정성 프로파일, iii) 재구성/회수의 단순성을 제공하는 조성물 및 방법을 제공한다.

실크 피브로인은 효소적/열적/UV 분해에 대해 매우 저항성이므로, 전체 인구범위에 대한 종단 데이터 세트를 수집하거나 개인화된 의약을 개선하기 위해, 냉장/동결할 필요 없이 중앙화된 시설에서 트랩핑된 생물학적 샘플이 장기간 저장(즉 수개월-수년의 기간)을 위해 보관될 수 있을 것으로 믿어진다.

따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 실크 용액(예를 들어, 바람직한 용해도 특성을 가진 실크-기재 물질을 생성하도록 조절된) 및 이들 용액으로 만들어진 실크-기재 물질의, 생물학적 샘플, 예를 들어, 전혈 및 혈액 성분 트랩핑 및 안정화를 위한 용도를 제공한다. 실크 정제 및 트랩핑 계획은 트랩핑된 혈액 성분(예를 들어, 세포, 및/또는 핵산 예컨대 순환 DNA 또는 RNA)를 완전히 재구성하는 능력을 제공한다. 한 실시양태에서, 손가락을 찔러 얻는 부피에 해당하는 채혈된 혈액은, 예를 들어, 본원의 실시예 부분에 기술된 것과 같은 실크 용액과 혼합될 수 있고, 그 후, 적어도 부분적으로 건조된 실크-기재 물질이 안정화된 혈액 성분을 포함하여 용이하게 입수될 수 있다.

본원에서 기술하는 실크 트랩핑/안정화 플랫폼은 기본적으로 예를 들어, 액체 실크 피브로인 조성물은 조성물 내의 생물학적 샘플에 대해 즉시 통상적인 액체 검정을 할 수 있고 신선한 전혈 또는 동결 샘플에 사용되는 것과 동일한 평가 및 품질 관리(QC) 절차를 받을 수 있다. 용액 조성물은 실크 피브로인 물품 내에 적어도 부분적으로 건조되거나 형성될 수 있다. 건조된 조성물 또는 물품 내의 실크 피브로인은 분해됨으로써 생물학적 샘플 또는 성분의 검출을 위해 통상적인 액체 검정을 할 수 있는 용액을 제공할 수 있다.

반대로, DBS 분석물은 보호되기 위해 건조될 때 종이 기질과 일정 수준의 화학적 상호작용을 요하기 때문에, 매트릭스 내의 부분적 샘플 체류 및/또는 분석물의 손상이 표준 DBS 회수 절차를 사용할 때 예상된다. 그 결과, 이는 손실 및 추출간의 불균일성을 감시하기 위해 DBS 후처리에 독특한 평가 프로토콜 및 QC 매트릭스을 가한다. 둘째로, 종이 기질의 두께에 걸친 및 이를 통한 반점의 불균일성(사용자 간 변동성 및 적혈구용적률 샘플 간 변동성으로부터의)으로 인해 샘플 부피를 정의하고 이어서 종이-기재 DBS 샘플을 적절히 나누는 것이 어려울 수 있다. 이는 연령대가 매우 다르거나 비정상적 적혈구용적률 수준(신장애, 종양학 환자 등)을 겪는 환자 집단에 대해 특히 문제가 된다. 반대로, 본원에서 기술하는 실크-기재 물질(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물)은 원하는 경우에 완전한 회수를 제공(예를 들어, 전체 부피, 예컨대 전체 50 μL 부피가 재구성될 수 있다)할 수 있거나, 실크/혈액 복합체가 균일하게 혼합되거나 건조되기 때문에 분취물이 중량으로 용이하게 준비될 수 있다.

따라서, 본원에서 기술하는 다양한 측면의 실시양태는 또한 이후의 성분의 검출을 가능하게 하는, 혼합된 되거나 트랩핑된 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 안정화를 위한 실크-기재 물질, 및 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

한 측면에서, 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 특성이 일정기간 동안 안정화되고/되거나 생물학적 샘플/활성제의 하나 이상의 성분이 일정기간 후에 검출 가능한, 실크 피브로인(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물) 및 생물학적 샘플/활성제를 포함하는 실크-기재 물질이 본원에서 제공된다

실크-기재 물질 내에 안정화된 하나 이상의 활성제(예를 들어, 생물학적 샘플 또는 성분)의 특성은 물리적 또는 구조적 특성, 화학적 특성, 및/또는 생물학적 특성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 특성은 작용제의 활성 또는 생물활성, 구조적 완전성, 구조적 입체형태, 및/또는 양을 포함할 수 있다. 상이한 응용(예를 들어, 진단 목적 대 치료 목적)에 따라, 실크 피브로인 및/또는 실크 실크-기재 물질은 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 특성을 안정화하도록 처리될 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 성분의 안정화 활성 또는 생물활성이 항상 요구되는 것은 아니다. 예를 들어, 진단 용도를 위해, 검출될 성분의 활성은 생물학적 샘플 내에 안정화된 성분의 완전성 및/또는 양만큼 중요하지 않을 수 있다. 이들 실시양태에서, 성분이 무손상으로 유지되고/되거나 성분의 양이 유지되는 한, 검출될 성분은 불활성일 수 있다. 본원에서 호환하여 사용되는 용어 "활성" 및 "생물활성"은 성분의 하나 이상의 구조적 및/또는 기능적 특성, 예컨대, 예를 들어 그의 생물학적 표적과 상호작용하고/하거나 생물학적 표적에 대해 효과를 발휘하는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 생물활성은, 제한 없이, 생물학적 표적에서 자극, 억제, 조절, 독성 또는 치사 반응의 발휘를 포함할 수 있다. 생물학적 표적은 분자 또는 세포일 수 있다. 예를 들어, 생물활성은 성분(예를 들어, 단백질 또는 핵산 분자)이 세포 또는 효소의 효과/활성을 조절하고, 수용체를 차단하고, 수용체를 자극하거나, 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 조절하거나, 세포 증식을 조절하거나, 세포 분열을 조절하거나, 세포 형태을 조절하거나, 세포를 감염 또는 형질감염시키는 능력, 또는 그의 임의의 조합을 나타낼 수 있다. 일부 경우에서, 생물활성은 성분이 세포에서 독성 효과를 발생시키는 능력을 나타낼 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 성분의 활성을 추가로 안정화하는 것이 바람직할 수 있다. 단지 예로서, 생물학적 샘플 내에 존재하는 단백질은 활성 또는 불활성 상태일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 실크-기재 물질은 생물학적 샘플 내에 존재하는 단백질을 그의 활성 또는 자연적 형태, 예를 들어, 인산화 단백질, 또는 글리코실화 단백질로 안정화할 수 있다. 이러한 실시양태는 성분의 활성이 질환 또는 장애의 진단에서 역할을 하는 경우에 유용할 수 있다.

본원에서 기술하는 다양한 측면의 실시양태에 따르면, 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 특성이 임의의 기간 동안 실크-기재 물질 내에서 안정화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "안정화하다", "안정화하는", 또는 "안정화"는 생물학적 샘플의 성분의 하나 이상의 특성(예를 들어, 활성, 완전성 및/또는 양)이 일정 기간 동안 실크-기재 물질 내에 부분적으로 또는 완전히 유지되거나 보유되는 것을 나타낸다. 활성의 안정화와 관련하여, 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내에 원래 존재하는 성분의 적어도 약 30% 이상(적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100%까지를 포함하여)이 일정 기간 동안 적어도 부분적인 또는 완전한 활성을 보유할 수 있다. 환언하면, 성분은 일정 기간 동안 적어도 약 30% 이상(적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100%까지를 포함하여)의 그의 원래 활성을 보유할 수 있다. 완전성의 안정화와 관련하여, 생물학적 샘플 내에 원래 존재하는 성분의 적어도 약 30% 이상(적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100%까지를 포함하여)이 일정 기간 동안 완전성을 보유할 수 있다. 양의 안정화와 관련하여, 생물학적 샘플 내에 원래 존재하는 성분의 적어도 약 30% 이상(적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100%까지를 포함하여)이, 성분이 활성 또는 불활성인지, 또는 무손상 또는 비-무손상인지에 관계 없이, 일정 기간 동안 보유될 수 있다. 성분의 원래의 존재 또는 원래의 활성과 관련하여 사용될 때 본원에서 사용되는 용어 "원래" 또는 "원래의"는 생물학적 샘플이 대상체로부터 수득된 직후에 측정되거나, 다르게는, 생물학적 샘플이 실크-기재 물질 내에 혼합되거나 트랩핑되기 직전 또는 직후에 측정된 성분의 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 성분의 원래의 존재 또는 원래의 활성은, 대조물, 예를 들어, 비-실크 접근에 의해 안정화된 대조물, 예를 들어, 동결된 대조물 내의 성분의 수준을 나타낸다.

하나 이상의 활성제/생물학적 샘플/그의 성분의 하나 이상의 특성은 일정 기간 동안, 예를 들어, 성분이 검출을 위해 추출되거나 회수될 때까지 실크-기재 물질 내에 안정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특성은 적어도 약 3시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 24시간 이상 동안 안정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특성은 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일 이상 동안 안정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특성은 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 1년, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년, 적어도 약 6년 이상 동안 안정화될 수 있다.

아래에서 추가로 논의하는 대로, 본원에서 기술하는 실크-기재 물질은 임의의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 실크-기재 물질은 용액, 필름, 섬유, 입자, 겔, 하이드로겔, 발포체, 스폰지, 매트, 메쉬, 직물, 분말, 코팅층 형태, 그의 동결건조 형태, 또는 임의의 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서,실크-기재 물질은 박막일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 동결건조될 수 있다.

생물학적 샘플의 하나 이상의 성분은 그를/그들을 실크-기재 물질로부터 단리하지 않고 검출될 수 있지만, 측정 가능하거나 검출 가능한 수준의 성분(들)은 후속 처리, 분석 및/또는 특성화를 위해 실크-기재 물질로부터 대안적으로 추출되거나 또는 회수될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "측정 가능하거나 검출 가능한 수준"은 검출 하한치를 나타내고, 이는 일반적으로 검출의 검출 감수성 및/또는 특정한 성분에 대해 선택된 특성화 방법 또는 검정에 따라 달라진다. 예를 들어, 검출될 성분이 핵산 분자(예를 들어, RNA 또는 DNA)이고 증폭-기반 검출 방법 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 성분 검출을 위해 선택되었을 때, 약 0.0001%의 핵산 분자(예를 들어, 한 카피의 RNA 분자)가 증폭 및 검출을 위해 실크-기재 물질로부터 추출 또는 회수될 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 측정 가능하거나 검출 가능한 수준의 성분(들)이 후속 처리, 분석 및/또는 특성화를 위해 접근 가능하거나 사용 가능하게 되도록 분해성일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "분해성" 유체 내의 실크-기재 물질의 용해도, 용해 또는 분해를 일반적으로 나타낸다. 분해성 실크-기재 물질은 일정 시간에 걸쳐 유체에 부분적으로 또는 완전히 분해 또는 용해될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100%까지의 실크-기재 물질을 포함한, 적어도 약 5% 이상의 실크-기재 물질은 수 초, 수 분, 수 시간, 내지 수 일 범위의 일정 기간에 걸쳐 유체(예를 들어, 수성 유체)에 분해 또는 용해될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 부분적으로 또는 완전히(예를 들어, 적어도 약 5% 또는 그 이상의 실크-기재 물질) 유체(예를 들어, 수성 유체)에 적어도 약 10초, 적어도 약 20초, 적어도 약 30초, 적어도 약 40초, 적어도 약 50초, 적어도 약 60초 또는 그 이상 이내에 분해 또는 용해될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 부분적으로 또는 완전히(예를 들어, 적어도 약 5% 또는 그 이상의 실크-기재 물질) 유체(예를 들어, 수성 유체)에 적어도 약 1분, 적어도 약 5분, 적어도 약 10분, 적어도 약 15분, 적어도 약 30분, 적어도 약 1시간 또는 그 이상 이내에 분해 또는 용해될 수 있다. 환언하면, 분해성 실크-기재 물질은 그 안에 존재하는 하나 이상의 활성제/샘플/성분을 회수 또는 추출하기 위해 유체(예를 들어, 수성 유체)에 그의 충분한 부분을 분해 또는 용해할 수 있는 실크-기재 물질이다.

실크-기재 물질의 분해도 또는 용해도는, 실크-기재 물질의 조성(예를 들어, 생물학적 샘플 대 실크 피브로인의 비, 실크 피브로인과 혼합 또는 트랩핑된 생물학적 샘플의 유형(예를 들어, 소변, 혈액, 및/또는 귀지, 그러나 이에 제한되지 않음), 및/또는 생물학적 샘플의 안정화를 보조하기 위해 사용되는 완충제/부형제의 유형 및/또는 하나 이상의 그의 성분, 실크 정제 방법(예를 들어, 정련 조건 예컨대 비등 시간), 본원에서 기술하는 실크-기재 물질의 형성 방법, 멸균 방법, 및 임의의 그의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 인자에 따라 달라질 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크-기재 물질의 분해도 또는 용해도는 실크의 분자 중량/쇄 길이에 의해 제어될 수 있다. 일반적으로, 저급 분자 중량/쇄 길이의 실크 피브로인을 포함하는 실크-기재 물질은 더 높은 분자 중량/쇄 길이의 실크 피브로인을 포함하는 것보다 수성 용매에의 용해도가 더 높을 수 있다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인의 분자 중량/쇄 길이는 정련 조건에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 누에고치는 염 용액(예를 들어, Na₂CO₃)에서, 예를 들어, 약 1분 내지 약 3시간, 약 5분 내지 약 2시간, 약 10분 내지 약 1.5시간, 또는 약 15분 내지 약 1시간 범위의 사전 정의된 기간 동안 비등될 수 있다. 일부 실시양태에서, 누에고치는 염 용액(예를 들어, Na2CO3)에서 적어도 약 1분, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분, 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간 또는 그 이상 동안 비등될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 비등하는 시간이 길수록 저급 분자 중량/쇄 길이의 실크 피브로인을 얻을 수 있다. 분자량, 점도, 확산성 및 분해 거동을 포함한 실크 물질 특성에 대한 정련의 효과와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Pritchard EM et al. “Effect of Silk Protein Processing on Drug Delivery from Silk Films” Macromol Biosci. Epub 2013 Jan 24]을 참조하기 바란다. 안정화될 생물학적 샘플 및 그의 성분(들)의 유형에 따라, 예를 들어 실시예에 기술한 것과 같이, 최적 정련 시간이 실크-기재 물질의 원하는 용해도 및 따라서 성분의 회수를 위해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서 본원에서 기술하는 실크-기재 안정화 조성물은 저분자량 실크 조성물이다.

정말로, 본 발명자들은 다양한 형태의 저분자량 실크 피브로인 조성물이 그 안에 관련 또는 포함된 보호 및/또는 안정화제(예를 들어, 생물학적 샘플)를 위해 특히 이로운 특성을 제공한다는 것을 발견했다. 예를 들어, 본원에서 기술하는 저분자량 실크 조성물은 폭넓게 변동하는 환경 요인, 예컨대 변동하는 온도 프로파일로부터 및/또는 예를 들어, 운반, 저장, 및/또는 취급 도중 만나는 기계적 교란으로부터 생물학적 샘플을 보호하는 "분자 안정화제"의 역할을 할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 본원에서 기술하는 저분자량 실크 피브로인을 포함하는 조성물이 물에 완전히 재구성될 수 있다는 것을 발견했다. 반면, 고분자량 실크 피브로인은 유사한 조건에서 물에 완전히 재구성되지 않는다. 고분자량은 유사한 조건에서 물에 재구성될 때 응집체를 형성한다.

지금까지, 관련 기술분야에서 이들 독특한 속성, 즉 i) 샘플 조달의 용이성, ii) 인상적인 열적/기계적 안정성 프로파일, iii) 재구성/회수의 단순성 및 수율을 조합하는 기술은 기재되지 않았다. 그러나, 본원에서 입증하는 대로, 본 개시내용은 i) 샘플 조달의 용이성, ii) 인상적인 열적/기계적 안정성 프로파일, iii) 재구성/회수의 단순성 및 수율을 제공하는 조성물 및 방법을 제공한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 실크 피브로인은 효소적/열적/UV 분해에 대해 매우 저항성이고, 실크 피브로인 조성물 내에 트랩핑된 작용제(예를 들어, 활성제 및/또는 생물학적 샘플)가 냉장/동결할 필요 없이 중앙화된 시설에서 장기간 저장(즉 수개월-수년 기간)을 위해 보관될 수 있고, 이후에 작용제가 사용 및/또는 분석을 위해 준비되었을 때 언제나 용이하게 회수될 수 있을 것으로 믿어진다. 따라서, 본원에서 제공되는 실크 피브로인 조성물, 및 특히 저분자량 실크 피브로인 조성물은, 전체 인구범위에 대한 종단 데이터 세트의 수집 또는 개인화된 의약의 개선을 가능하게 할 수 있다.

본 발명자들은 특히 생물학적 샘플을 본원에서 기술하는 저분자량 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태에 혼입하는 것은 특정 조건하에서 일정 기간 동안 생물학적 샘플 내에 존재하는 검출 가능한 모이어티를 안정화한다는 것을 발견했고, 이는 결과적으로 이후, 예를 들어 성분의 후속 분석 및/또는 특성화를 위해, 종래의 실크 피브로인-기재 물질로부터의 검출 가능한 모이어티의 회수에 비해검출 가능한 모이어티의 더 높은 회수를 가능하게 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에서 기술하는 저분자량 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 바람직한 특성 예컨대 개선된 용해도(종래의 실크 피브로인-기재 물질에 비해), 첨가제의 개선된 회수(종래의 실크 피브로인-기재 물질에 비해) 등을 갖는 다양한 가용성 또는 고체 형태의 저분자량 실크 피브로인-기재 물질, 예컨대 용액, 필름, 입자 또는 분말, 스캐폴드, 메쉬 및/또는 섬유를 생성하도록 조절된)의 샘플의 트랩핑, 안정화, 및 후속 회수를 위한 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다.

본원에서 기술하는 실크 피브로인 조성물 내의 활성제/생물학적 샘플에 대한 실크 피브로인의 양은, 예를 들어, 생물학적 샘플의 부피 및/또는 유형, 실크 피브로인 농도, 생성된 실크-기재 물질의 용해도, 안정화되고/되거나 검출될 표적 성분의 풍부한 정도, 생물학적 샘플 내에 존재하는 성분의 회수 효율, 특정한 성분에 대해 선택된 검출/특성화 방법의 검출 감수성에 제한되지 않는 다양한 인자에 대해 조절될 수 있다.

일부 실시양태에서, 활성제/샘플/성분에 대한 실크 피브로인의 비(예를 들어, 질량 비, 부피 비 또는 몰비)는 약 1:10000 내지 약 10000:1, 또는 약 1:1000 내지 약 1000:1 범위 내이다. 일부 실시양태에서, 비(예를 들어, 질량 비, 부피 비 또는 몰비)는 약 1:1 내지 약 1000:1이다. 일부 실시양태에서, 비는 약 1:1000 내지 약 1000:1, 약 1:500 내지 약 500:1, 약 1:250 내지 약 250:1, 약 1:125 내지 약 125:1, 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 약 1:3 내지 약 3:1, 또는 약 1:1이다. 단지 예로서, 일부 실시양태에서, 혈액 샘플에 대한 실크 피브로인의 부피 비는 약 1:1 내지 약 1000:1, 또는 약 1:1 내지 약 100:1, 또는 약 1:1: 내지 약 50:1, 또는 약 1:1 내지 약 25:1의 범위 내일 수 있다.

활성제/샘플/성분에 대한 실크 피브로인 매트릭스의 비는 활성제의 선택, 저장 조건 및 기간, 실크 피브로인 매트릭스의 농도 및 실크 매트릭스의 형태를 포함한 여러 인자에 따라 달라질 수 있다. 통상의 기술자는, 예를 들어, 정의된 조건, 예를 들어, 0℃ 초과의 온도에서 사전 정의된 기간 동안 본원에 기술된 다양한 비율로 유지된 활성제의 생물활성을 측정함으로써 활성제에 대한 실크 피브로인 매트릭스의 적절한 비를 결정할 수 있다. 본원에서 기술하는 다양한 활성제, 예를 들어, 효소, 백신, 단백질, 항체 및 핵산의 생물활성을 측정하는 방법은 관련 기술분야에서 공지되어 있다. 예로서, 실크 피브로인 내의 소정의 활성제의 안정성 또는 생물활성은 시간 및 온도의 조합에 기초하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 안정화 연구가 6개월 동안 수행될 수 있다. 활성 검정이, 예를 들어, 2주, 4주 후, 이어서 매달 수행될 수 있다. 샘플은 각 시점에 대해 N=3을 제공하도록 제조할 수 있다. 평가될 온도 저장 조건의 범위는 4℃(냉장)에서, 25℃(실온), 37℃(체온), 45℃ 및/또는 50℃까지를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 활성은 1, 2, 3 이상의 동결-해동 주기 후 검정될 수 있다. 이들 변수는 활성제(들)의 장기간 안정성을 위한 최적 제제를 완전히 특성화하기 위해 완전히 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-관련 활성제 안정성의 결과는 동결건조된 활성제 제조의 제조자-권장 저장 조건(예를 들어, 4℃)의 안정성 개선 목적으로, 예를 들어, 동일한 저장 조건의 동결건조된 활성제 제조와 비교할 수 있다.

본원에서 기술하는 안정화 실크 피브로인 조성물은 양이 일정 기간 동안 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 특성을 안정화하고, 일정 기간 후 활성제/샘플/성분의 검출을 가능하게 하기에 충분하다면, 임의의 양의 실크 피브로인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 내의 실크 피브로인의 양은, 예를 들어, 본원에서 기술하는 작용제/샘플/성분의 유형 및/또는 부피 크기, 실크-기재 물질의 형태(예를 들어, 필름 대 폼), 형성될 임의의 실크-기재 물질의 제작 방법(예를 들어, 공기 건조 대 동결건조) 및/또는 초기 실크 피브로인 조성물 형성에 사용되는 실크 피브로인 농도에 따라 달라진다.

몇 가지 예를 들어, 실크-기재 안정화 물질은 약 0.25% 내지 약 50%(w/v), 또는 약 0.5% 내지 약 30%(w/v), 또는 약 0.5% 내지 약 15%(w/v), 또는 약 0.5% 내지 약 10%(w/v)의 실크 피브로인을 포함하는 작용제-함유 실크 용액으로부터 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 생물학적 샘플을 포함하는 실크 용액일 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 실크-기재 필름은 약 1% 내지 약 15%(w/v)의 실크 피브로인 및 활성제 또는 생물학적 샘플/성분을 포함하는 실크 용액으로 제조할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 실크-기재 폼은 약 0.1% 내지 약 5%(w/v)의 실크 피브로인 및 활성제/ 생물학적 샘플/성분을 포함하는 실크 용액으로 제조할 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 생물학적 샘플을 포함하는 실크 용액으로 형성된 고체-상태 실크-기재 물질일 수 있다.

일부 실시양태에서, 작용제/샘플/성분은 실크 조성물(예를 들어, 저분자량 기재 조성물에)에 일정 범위의 저장 온도에서 본원에 기술하는 일정 기간 동안 안정화될 수 있고 분석을 위해 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 회수 및/또는 검출을 가능하게 할 수 있다. 생물학적 샘플에 대해 요구되는 통상적인 영하의 저장 온도와 달리(예를 들어, -80℃ 동결기 내 또는 액체 질소 내), 본원에서 기술하는 실크-기재 물질은 0℃ 초과 또는 그 이상의 저장 온도에서 생물학적 샘플이 그 안에 안정화되도록 한다. 일부 실시양태에서, 저장 온도는 약 0℃ 내지 약 상온 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 저장 온도는 약 40℃ 이상 또는 40℃ 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 저장 온도는 약 45℃ 이상 또는 45℃ 초과일 수 있다.

일부 실시양태에서, 작용제/샘플/성분은 본원에 기술하는 일정 기간 동안 광 노출하에서 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물 내에 안정화될 수 있고 분석을 위해 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 회수 및/또는 검출을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물 내에 존재하는 작용제/샘플/성분은 광, 예를 들어, 상이한 파장의 및/또는 상이한 공급원으로부터의 광에 노출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질 내에 존재하는 작용제/샘플/성분은 UV 또는 적외선 조사에 노출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질 내에 존재하는 작용제/샘플/성분은 가시광선에 노출될 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 본원에서 기술하는 일정 기간 동안 일정 범위의 상대 습도에서 제공되는 실크 피브로인 조성물 내에 안정화될 수 있고 분석을 위해 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 회수 및/또는 검출을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상대 습도는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 또는 그 이상일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "상대 습도" 는 공기 및 수증기의 혼합물 내의 수증기의 양의 측정이다. 이는 일반적으로 공기-물 혼합물 내의 수증기의 분압으로 정의되고, 그 조건하에서의 포화 증기압의 퍼센티지로 주어진다.

일부 실시양태에서, 기술되는 안정화 실크 피브로인 조성물은, 예를 들어 저장 중위 잔류 수분을 감소시키기 위해, 동결건조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 잔류 수분은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 감소된다.

일부 실시양태에서, 본원에서 기술하는 조성물은 임의의 공기 압력에 유지되거나 노출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술하는 조성물은 약 대기압, 또는 그 이상, 예를 들어, 약 1 atm, 약 2 atm, 약 3 atm, 약 4 atm, 약 5 atm, 약 6 atm, 약 7 atm, 약 8 atm, 약 9 atm 또는 약 10 atm에 유지되거나 노출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 본원에서 기술하는 조성물은 진공에 유지되거나 노출될 수 있다.

필수적이지는 않지만, 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 실크-기재 용액)이 영하의 온도에서 저장되는 일부 실시양태에서, 작용제/샘플/성분은 적어도 하나 또는 그 이상의 동결-해동 주기(예를 들어, 동결된 실크-기재 용액 내지 해동된 실크-기재 용액) 시 조성물 내에 안정화될 수 있고 및 분석을 위해 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 회수 및/또는 검출을 가능하게 할 수 있다. 용어 "동결-해동 주기"는 일련의 교대되는 동결 및 해동을 기술하고 또한 일련의 교대되는 동결(고체) 및 유체 상태를 포함하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, 한 동결-해동 주기는 동결(고체) 상태와 유체 상태 사이의 상태 변화를 수반한다. 동결과 해동, 또는 동결과 유체 상태 사이의 시간 간격은, 임의의 기간, 예를 들어, 수 시간, 수일, 수주 또는 수개월일 수 있다. 예를 들어, 일단 실크-기재 용액이 동결되거나 동결 상태에 있으면, 이는 후의 사용을 위해 해동될 필요가 있을 때까지 영하의 온도, 예를 들어, 약 -20℃ 내지 -80℃에서 연속적으로 저장될 수 있다. 조성물의 동결은 급속하게, 예를 들어, 액체 질소에서, 또는 서서히, 예를 들어, 동결 온도, 예를 들어, 약 -20℃ 내지 -80℃에서 수행될 수 있다. 동결 조성물의 해동은 0℃ 초과의 임의의 온도에서 급속하게, 예를 들어, 실온에서, 또는 서서히, 예를 들어, 얼음 위에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 비-실크 피브로인 매트릭스 내의 생물학적 샘플의 성분, 예를 들어, 단백질 및/또는 핵산은 그의 활성 또는 완전성을 하나 이상의 동결-해동 주기에서 상실할 수 있다. 본원에서 기술하는 대로, 실크 피브로인 매트릭스 내에 생물학적 샘플을 분포시키는 것은 그의 하나 이상의 성분의 안정성을 향상시키고 따라서 하나 이상의 동결-해동 주기 도중 그의 활성 또는 완전성을 보유하게 할 수 있다.

한 실시양태에서, 작용제/샘플/성분은 본원에서 기술하는 일정 기간 동안 위에서 기술한 둘 이상의 조건하에서 제공된 실크 피브로인 조성물 내에 안정화될 수 있고 분석을 위해 작용제/샘플/성분의 하나 이상의 성분의 회수 및/또는 검출을 가능하게 할 수 있다..

본원에 제공된 또 다른 측면은 활성제의 생물활성을 유지 또는 안정화하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 방법은 일정 기간 동안 조성물을 유지하는 것을 포함하고, 여기에서 조성물은 실크 피브로인 매트릭스 및 그 안에 분포, 혼합, 또는 매립된 하나 이상의 활성제를 포함하고, 조성물이 활성제의 생물활성을 저해 또는 감소시키는 명시된 조건에 노출될 때 하나 이상의 활성제가 약 30% 이상의 그의 원래 생물활성을 보유 또는 안정화한다. 이러한 조건은, 상태-변화 주기, 온도, 공기 압력, 습도, 및 광 노출을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "상태-변화 주기"는, 고체 상태에서 유체 상태, 또는 유체 상태에서 고체 상태를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 물질 상태의 변화를 나타낸다. 유체 상태는, 액체, 기체, 슬러리, 유동성 페이스트, 플라즈마, 및 임의의 그의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 고체 상태는 유동성이 아닌 상태를 나타내고, 또한 반고체, 예를 들어, 겔을 포함할 수 있다. 본원에서 기술하는 조성물은 다른 상태로 변화하기 전에 임의의 기간, 예를 들어, 초, 분, 시간, 주, 개월, 또는 년 동안 특성 상태로 유지될 수 있다. 상태-변화 주기는 본원에서 기술하는 환경 조건, 예를 들어, 온도 변화, 주위 기압 변화, 광 조건, 습도, 또는 임의의 그의 조합의 하나 이상의 변화로 인한 것일 수 있다.

한 실시양태에서, 상태-변화 주기는 동결-해동 주기를 나타낸다. 이러한 실시양태에서, 본원에서 기술하는 조성물은 저장되거나 운반될 때 하나 이상의 동결-해동 주기, 둘 이상의 동결-해동 주기, 셋 이상의 동결-해동 주기, 넷 이상의 동결-해동 주기, 다섯 이상의 동결-해동 주기, 여섯 이상의 동결-해동 주기, 일곱 이상의 동결-해동 주기, 여덟 이상의 동결-해동 주기, 아홉 이상의의 동결-해동 주기, 열 이상의 동결-해동 주기 또는 그 이상이 가해질 수 있다. 용어 "동결-해동 주기"는 일련의 교대되는 동결 및 해동을 기술하기 위해 본원에서 사용되고, 또한 일련의 교대되는 동결(고체) 및 유체 상태를 포함한다. 예를 들어, 하나의 동결-해동 주기는 동결(고체) 상태와 유체 상태 사이의 상태 변화를 수반한다. 동결과 해동, 또는 동결과 유체 상태 사이의 시간 간격은, 임의의 기간, 예를 들어, 시간, 일, 주 또는 개월일 수 있다. 예를 들어, 일단 활성제 조성물이 동결되거나 동결 상태에 있으면, 다시 사용을 위해 해동될 필요가 있을 때까지 영하의 온도, 예를 들어, 약 -20℃ 내지 -80℃에서 동결 상태로 연속적으로 저장될 수 있다. 조성물의 동결은 급속하게, 예를 들어, 액체 질소에서, 또는 서서히, 예를 들어, 동결 온도, 예를 들어, 약 -20℃ 내지 -80℃에서 수행될 수 있다. 동결 조성물의 해동은 0℃ 초과의 임의의 온도에서 급속하게, 예를 들어, 실온에서, 또는 서서히, 예를 들어, 얼음 위에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 비-실크 피브로인 매트릭스 내의 활성제는 하나 이상의 동결-해동 주기에서 그의 생물활성을 상실할 수 있다. 본원에서 기술하는 대로, 실크 피브로인 매트릭스 내에 활성제를 분포시키는 것은 활성제의 안정성을 향상시킬 수 있고 따라서 하나 이상의 동결-해동 주기 도중 그의 생물활성을 유지하도록 할 수 있다.

본원에서 기술하는 다양한 측면의 실시양태는 활성제의 안정화가 본원에서 기술하는 실크 피브로인 조성물 내에 활성제를 분포, 혼합, 또는 매립시킴으로써 달성되는, 안정화된 활성제를 제공한다. 실크 피브로인은 실크 피브로인 용액 또는 고체-상태 실크 피브로인 매트릭스, 예를 들어, 실크 피브로인 물품일 수 있다. 이러한 접근법은 냉장 유통 및/또는 활성제가 저장 및/또는 운반되는 환경 조건에 관계 없이 활성제가 생물활성을 보유할 수 있도록 한다. 예시적인 환경 조건은, 온도, 공기 압력, 습도, 및 광 노출을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 냉장 유통은 제약 업계에서 활성제를 안정화시키는 표준 관계이다: 냉장 유통을 유지하는 것은 활성제가 사용될 때까지 제조업체의 권장되는 온도 범위(예를 들어, 2℃ 내지 8℃ 또는 영하 온도)에 따라 운반 및 저장되는 것을 담보한다.

일부 실시양태에서, 활성제를 포함하는 실크 피브로인 조성물은 이식물 또는 이식 가능한 약물 전달 장치의 형태이다. 이러한 조성물 내의 활성제는 일정 시간 동안 30% 이상(약 40% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상 또는 그 이상을 포함)의 그의 원래 생물활성 또는 그 이상을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이식 가능한 약물 장치 형태의 실크 피브로인 조성물 내의 활성제는 약 30% 이상의 그의 원래 생물활성 또는 그 이상을 이식 후 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월, 또는 적어도 1년 또는 그 이상 후에 보유할 수 있다.

일부 실시양태에서, 주사가능한 실크 피브로인 조성물에 캡슐화된 하나 이상의 활성제는, 활성제(예를 들어, 백신)가, 창고로부터 연속적으로 또는 간헐적으로, 장기간 동안, 예를 들어, 수 시간, 수일, 수주, 또는 수개월 동안 방출될 수 있도록, 활성제의 창고(예를 들어, 백신 창고)로 대상체(예를 들어, 주사 예컨대 피하 주사에 의해)에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성제(예를 들어, 백신)는h 약 1% 이상의( 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 이상을 포함)의 캡슐화된 활성제가 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간 또는 그 이상 동안 방출되는 비율로 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성제(예를 들어, 백신)는 약 10% 이상의(적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 이상을 포함) 캡슐화된 활성제가 5일의 기간, 1주의 기간, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월 또는 그 이상 동안 방출되는 비율로 방출될 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물 내의 활성제는 적어도 약 30%의 그의 원래 생물활성 예를 들어, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%의 원래 생물활성 또는 더 높은 활성을 약 4℃에서, 약 25℃에서, 약 37℃에서, 약 45℃에서, 또는 그 이상에서, 적어도 6개월까지 동안 보유한다. 일부 실시양태에서, 활성제는 적어도 약 8%의 원래 생물활성을 약 37℃ 이상의 온도에서, 적어도 6개월 동안 보유한다.

본원에서 기술하는 특정한 측면은, 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물) 및 그 안에 분포, 혼합 또는 매립된 활성제를 포함하고, 조성물이 하나 이상의 상태-변화 주기에 노출되고/되거나 본원에서 명시된 하나 이상의 조건 하에서 일정 시간 동안 유지될 때 활성제가 약 이상의 30% 그의 원래 생물활성(예를 들어, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 등)을 보유하는, 저장-안정한 조성물이다. 일부 실시양태에서, 활성제는 조성물 내의 실크 피브로인 단편에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 융합 또는 결합될 수 있다. 한 실시양태에서, 상태-변화 주기는 동결-해동 주기이다. 한 실시양태에서, 활성제를 유지하기 위한 기간은 약 24시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 명시된 조건은 활성제가 저장 및/또는 운반되는 환경 조건일 수 있다. 환경 조건의 비제한적 예는 온도, 공기 압력, 습도, 및 광 노출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술하는 조성물은 면역원성일 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 활성제는 면역원이다. 일부 실시양태에서, 활성제는 백신이다.

일부 측면에서, 본원에서 기술하는 대로, 본 발명은 생물학적 샘플 또는 활성제의 안정화 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 방법은 생물학적 샘플 또는 활성제를 본원에서 기술하는 실크 피브로인 조성물과 접촉, 조합, 또는 혼합함으로써 실크 피브로인 및 생물학적 샘플 또는 활성제를 포함하는 혼합물을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 혼합물로부터 실크-기재 물질(예를 들어, 실크 피브로인 물품)을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 또는 활성제의 안정화 방법은 생물학적 샘플 또는 활성제를 포함하는 저분자량 실크 피브로인 조성물을 제공하는 단계 및 조성물로부터 실크-기재 물품을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성제/샘플/성분을 포함하는 실크 피브로인 조성물이 고체 상태일 때, 이는 실크 피브로인내에 베타-시트 2차 구조 형성을 유도하도록 추가로 처리될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제공되는 방법은 생물학적 샘플 또는 활성제를 분말 형태의 실크 피브로인 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이의 일부 추가 실시양태에서, 본 방법은 조성물로부터 용액을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 생물학적 샘플 또는 활성제를 용액 형태의 실크 피브로인 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 또는 활성제를 포함하는 용액 조성물은 실크 피브로인 물품으로 형성될 수 있다. 생성된 물품은 수용액(예를 들어, 물, 완충 용액, 또는 그의 조합)에 가용성일 수 있다.

본원에서 기술하는 조성물 내의 생물학적 샘플에 대한 실크 피브로인의 양은, 예를 들어, 생물학적 샘플의 부피 및/또는 유형, 실크 피브로인 농도, 생성된 실크-기재 물질의 용해도, 안정화 및/또는 검출될 표적 성분의 풍부한 정도, 생물학적 샘플 내에 존재하는 성분의 회수 효율, 특정한 성분에 대해 선택된 검출/특성화 방법의 검출 감수성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 인자를 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 이미 기술한 대로, 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에 대한 실크 피브로인의 비(예를 들어, 질량 비, 부피 비 또는 몰비)는 약 1:10000 내지 약 10000:1, 또는 약 1:1000 내지 약 1000:1 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에 대한 실크 피브로인의 비(예를 들어, 질량 비, 부피 비 또는 몰비)는 약 1:1 내지 약 1000:1이다. 단지 예로서, 일부 실시양태에서, 혈액 샘플에 대한 실크 피브로인의 부피 비는 약 1:1 내지 약 1000:1, 또는 약 1:1 내지 약 100:1, 또는 약 1:1: 내지 약 50:1, 또는 약 1:1 내지 약 25:1 범위일 수 있다.

활성제/성분

실크 조성물(예를 들어, 본원에서 기술하는 저분자량 실크 피브로인 조성물)은 임의의 다양한 활성 및/또는 불안정성 작용제를 포함/함유할 수 있다.

본원에서 기술하는 실크 피브로인 조성물로부터 저장, 안정화, 분석, 및/또는 회수될 수 있는 생물학적 샘플의 비제한적 예는: 체액 샘플 예컨대 혈액 샘플, 예를 들어, 전혈 샘플, 혈장 샘플, 및 혈청 샘플; 소변 샘플; 뇌척수액 샘플, 타액 샘플, 및 임의의 그의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 샘플은 의료 또는 임상 목적을 위해 환자로부터 수집될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 샘플은 법의학 목적으로 수집될 수 있다.

일부 실시양태에서, 예를 들어, 작용제 혼입, 안정화 및 회복의 맥락에서 본원에서 기술하는 제공되는 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 저분자량 실크 조성물)의 독특한 특성은, 다양한 트랩핑된 혈액 성분(예를 들어, 세포, 순환 인자 예컨대 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 항체 및 다른 단백질, 핵산 예컨대 DNA 또는 RNA 등)의 완전한 재구성을 가능하게 한다. 예를 들어, 손가락을 찔러 얻어지는 부피에 대응하는 채혈된 혈액은 실크 피브로인 용액과 혼합되어 적어도 부분적으로 건조된 실크-기재 물질을 형성할 수 있고, 그 후, 적어도 부분적으로 건조된 실크-기재 물질은 안정화된 혈액 성분을 함유하여 용이하게 입수될 수 있고, 이는 사용 및/또는 분석을 위해 준비될 때까지 보관될 수 있다.

혈액 샘플에 더하여, 예를 들어, 소변, 혈액, 분변, 귀지, 핵산 (예를 들어, DNA/RNA, 변형된 핵산) 항체, 전세포, 치료제를 포함하나 이에 제한되지 않는, 진단 목적으로 사용되는 다른 생물학적 샘플은 성능 요구 및 샘플 입수 가능성에 따라 유사한 방식으로 실크 피브로인과 접촉될 수 있다. 생물학적 샘플을 포함하는 제공되는 실크 피브로인 조성물은 일정 기간 동안 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분을 안정화할 수 있고, 이는 생물학적 샘플 또는 그의 성분의 후속 분석 및/또는 특성화를 가능하게 한다. 따라서, 본원에서 기술하는 다양한 측면의 실시양태는 또한, 이후에 성분의 검출을 가능하게 하는, 혼합되거나 트랩핑된 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분의 안정화를 위한 실크 피브로인 기재 조성물, 및 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

다양한 본원에 기재된 실시양태에 따르면, 저분자량 실크 피브로인 내에 혼합되거나 트랩핑될 생물학적 샘플은 하나 이상의 성분을 위해 안정화되고/되거나 성분의 존재에 대해 평가되도록 의도되는 임의의 유체 또는 시편(처리되거나 처리되지 않은)을 포함한다. 생물학적 샘플은 액체, 초임계 유체, 용액, 현탁액, 기체, 겔, 슬러리, 고체, 및 그의 조합일 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 수성 유체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "수성 유체"는 임의의 유동성 물-함유 물질을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대상체, 예를 들어, 포유동물 대상체 예컨대 인간 대상체로부터 수득할 수 있다. 대상체로부터 수득한 예시적인 생물학적 샘플은, 생물학적 세포, 조직, 혈액 (전혈, 혈장, 제대혈 및 혈청을 포함함), 수유 생성물(예를 들어, 밀크), 양수, 객담, 타액, 소변, 정액, 뇌척수액, 기관지 흡인물, 발한, 점액, 액화 분변, 활액, 림프액, 눈물, 기관 흡인물, 및 이들의 분획을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 조직 시편(예를 들어, 생검)의 균질물을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고체 기관 또는 그의 단편으로부터 수득한 고체 샘플의 균질화로 수득한 현탁액을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 생물학적 샘플 유형에 따라 달라질 수 있는 임의의 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해 대상체로 부터 수득할 수 있다. 단지 예로서, 혈액 샘플은 손가락 찌르기, 미세바늘, 정맥 채혈, 또는 혈액 샘플 수집을 위한 임의의 공지된 방법에 의해 대상체로부터 수득할 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 살아있거나 죽은 세포(원핵 및 진핵, 포유동물 포함), 바이러스, 박테리아, 진균, 효모, 원충, 미생물, 및 기생충으로 이루어지는 군에서 선택되는 생물학적 세포를 포함할 수 있다. 생물학적 세포는 정상 세포 또는 발병 세포, 예를 들어, 암 세포일 수 있다. 포유동물 세포는, 제한 없이; 영장류, 인간 및 제한 없이; 마우스, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 조류, 가축, 예컨대 말, 소, 뮤린, 양, 개, 및 고양이를 포함하는 임의의 동물로부터의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 대상체로부터 유래할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 사육되는 동물, 예를 들어, 개 또는 고양이로부터 유래할 수 있다. 예시적인 포유동물 세포는, 줄기 세포, 암 세포, 전구 세포, 면역 세포, 혈액 세포, 태아 세포, 및 임의의 그의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포는 다양한 조직 유형, 제한 없이 예컨대; 조혈, 신경, 중간엽, 피부, 점막, 기질, 근육, 비장, 세망내피, 상피, 내피, 간, 신장, 위장, 폐, 심혈관, T-세포, 및 태아로부터 유래할 수 있다. 제한 없이, 조혈, 신경, 기질, 근육, 심혈관, 간, 폐, 및 위장 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포, 배아 줄기(ES) 세포, ES- 유도된 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 및 줄기 세포 전구세포 또한 포함된다. 효모 세포 또한 본원에 기재된 일부 실시양태에서 세포로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 체 외 또는 배양된 세포, 예를 들어 시험관 내일 수 있다. 예를 들어, 체 외 세포의 경우, 세포는 건강하고/하거나 질환이 발병한 대상체로부터 수득할 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은, 예를 들어, 하나 이상의 기관(피부 포함), 근육, 부리, 갈퀴, 깃털, 날개, 및/또는 꼬리에 제한되지 않는 동물 부분으로부터 유도된 조직을 포함할 수 있다 .

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은, 예를 들어, 실험실, 동물 콜로니, 범죄 현장, 세포 은행 또는 보관소, 혈액 은행, 조직 은행, 생물학적 시편 보관소, 진단 시험 시설, 임상 환경, 및/또는 임의의 그의 조합에 제한되지 않는 공급원으로부터 수득한 유체 또는 시편을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 유체(예를 들어, 배양 배지) 및/또는 생물학적 배지로부터의 세포를 포함할 수 있다. 유체(예를 들어, 배양 배지) 및/또는 생물학적 배지로부터 수득한 세포의 예는, 예를 들어, 원핵생물(예를 들어, 박테리아) 및 진핵생물(예를 들어, 동물 세포, 식물 세포, 효모, 진균), 및 그의 분획을 포함한, 단일- 또는 복수-세포 유기체의 배양 또는 발효로부터 수득한 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 하나 이상의 성분 또는 성분의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 후속 검출 및/또는 특성화를 위해 안정화될 수 있는 성분의 예는, 펩티드, 단백질, 항체, 효소, 항원, 아미노산, 핵산(예를 들어, DNA, RNA, siRNA, miRNA, 비-코딩 RNA, 또는 대상체에서 내재적으로 발견할 수 있는 RNA의 임의의 변이체), 뉴클레오티드, 대사물, 지질, 당, 당단백질, 펩티도글리칸, 미생물, 세포, 및 임의의 그의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 기술하는 조성물 및/또는 방법을 사용하여, 예를 들어, 적어도 2 성분, 적어도 3 성분, 적어도 4 성분, 적어도 5 성분, 또는 그 이상을 포함한 하나 이상의 성분이 일정 기간 동안 안정화되고 일정 기간 후 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 적어도 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) 생물학적 샘플 내의 단백질(예를 들어, 혈액 샘플 내의 혈장 또는 혈청 단백질)을 안정화 할 수 있고, 이는 이후에 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 적어도 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) 혈액 샘플 내의 무-세포 또는 순환 DNA 또는 RNA를 안정화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 적어도 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) 생물학적 샘플 내에 존재하는 진단성 바이오마커를 안정화할 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 RNA의 활성 및/또는 완전성을 안정화할 수 있고, 본원에서 기술하는 실크 피브로인 조성물 및 방법이, DNA, RNA, 및 변형된 DNA 또는 RNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 핵산을 안정화하기 위해 사용될 수 있을 것으로 여겨진다. 일부 예시적인 핵산은 펩티드 플라스미드 DNA, 게놈 DNA, mRNA, siRNA, 전-miRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, 활성화 RNA, 디코이 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 올리고뉴클레오티드, 및/또는 치료 목적으로 대상체에 투여될 수 있는 임의의 핵산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 기술하는 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태로 생물학적 샘플을 혼입할 때, 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분(예를 들어, 하나 이상의 검출 가능한 주체)의 상태를 안정화하는 것이 바람직할 수 있다. 단지 예로서, 생물학적 샘플 내에 존재하는 단백질은 활성 또는 불활성 상태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성 또는 원래 상태, 예를 들어, 생물학적 샘플의 단백질의 인산화 단백질, 또는 글리코실화 단백질은 실크 피브로인 물질 내에 안정화 또는 유지될 수 있다. 이들 실시양태는, 예를 들어, 성분의 활성 또는 상태가 질환 또는 장애 진단에서 역할을 할 때 유용할 수 있다. 예를 들어, 특정 상태 또는 수준의 번역후 변형이 질환 상태와 상관관계가 있어 진단에 도움이 될 수 있다. 일부 실시양태에서, 번역후 변형은: 인산화, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화 또는 프레닐화, 파르네실화, 게라닐게라닐화, 글리피에이션, 글리코실포스포티딜이노시톨 앵커 형성, 리포일화, 플라빈 모이어티의 부착, 헴 C의 부착, 포스포판테테이닐화, 레티닐리덴 쉬프 염기 형성, 디프타미드 형성, 에탄올아민 포스포글리세롤 부착, 히퓨신 형성, 아실화, 아세틸화, 포르밀화, 알킬화, 메틸화, 아미드 결합 형성, C-말단 아미드화, 아미노산 첨가, 아르기닐화, 폴리글루타밀화, 폴리글리실화, 부티릴화, 감마-카르복실화, 글리코실화, 폴리시알릴화, 말로닐화, 히드록실화, 아이오딘화, 뉴클레오티드 첨가, 산화, 포스페이트 에스테르 또는 포스포르아미데이트 형성, 인산화, 아데닐릴화, 프로피오닐화, 피로글루타메이트 형성, S-글루타티오닐화, S-니트로실화, 숙시닐화, 황산화, 셀레노일화, 당화, 비오티닐화, 페길화, ISG화, SUMO화, 유비퀴틴화, 네딜레이션, PUP화, 시트룰린화, 탈아미드화, 엘리미닐화, 카르바밀화, 디술피드 가교, 단백질분해적 절단, 및 프롤린의 라세미화를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일반적으로, 실크 피브로인 물품 내에 생물학적 샘플 또는 작용제를 포함시키기 위해, 실크 피브로인 물품 제조에 사용되는 실크 피브로인 용액에 생물학적 샘플 또는 활성제가 포함될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 사전형성된 실크 피브로인 물품이 생물학적 샘플 또는 활성제를 포함하는 용액에 첨가되어 생물학적 샘플(또는 그의 성분) 또는 활성제가 실크 피브로인 물품 내에/위에 흡착되도록 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플/작용제는 실크-기재 물질에, 균질하게 또는 비-균질하게(예를 들어, 구배로) 분포할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 실크-기재 물질에 실크 피브로인에 의해 캡슐화 또는 트랩핑될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 실크-기재 물질 내의 실크 피브로인과 혼합되거나 블렌딩될 수 있다.

실크-기재 물질 형성 후, 이 물질은 처리되어, 예를 들어, 실크 피브로인 내에 베타-시트 2차 구조의 형성을 유도할 수 있다. 실크 피브로인 내에 베타-시트 2차 구조 형성을 유도하는 방법은 본원의 다른 곳에 기술한다.

본원에서 기술하는 다양한 측면의 실시양태에 따르면, 생물학적 샘플을 포함하는 실크 피브로인 조성물은 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분을 안정화할 수 있고, 이는 이후의 성분 검출 및/또는 분석을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플을 포함하는 이들 실크-기재 물질은, 인간 건강의 진단 평가를 위해 샘플 품질을 유지/보유하도록 생물학적 샘플을 현재 저장 및 취급하는 통상적인 방법인 냉장 또는 동결을 필요로 하지 않고 저장 및/또는 운반될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서 기술하는 실크-기재 물질 및 방법은 진단 용도에 유용할 수 있다. 예를 들어, 실크-기재 물질 및 방법은 저장 및/또는 운반 도중, 또는 일부 개발 도상국에서 또는 연속적인 냉장 저장을 지원하는 최소 기반시설이 존재하지 않는 원거리 필드 조건에서 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분이 진단 용도를 위해 검정될 수 있도록 생물학적 샘플의 품질 유지 및/또는 보유에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술하는 실크-기재 물질 및 방법은 앞에서 기술한 하기 조건, 즉: (a) 저장 및/또는 운반 중의 0℃ 초과의 온도(예를 들어, 적어도 약 실온 또는 그 이상); (b) 저장 및/또는 운반 중의 광 노출 (예를 들어, UV, 적외선, 및/또는 가시광선); 및 (c) 저장 및/또는 운반 중의 적어도 약 10% 또는 그 이상의 상대 습도 중 하나 이상 또는 그의 임의의 조합에서 생물학적 샘플의 품질 유지 및/또는 보유에 사용될 수 있다.

따라서, 본원에서 제공되는 또 다른 측면은 본원에서 기술하는 실크-기재 물질의 사용 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 활성제/샘플.성분을 포함하는 실크 피브로인 조성물의 하나 이상의 실시양태(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인)를 제공하는 단계; 및 (b) 적어도 일부의 조성물을 물에 용해시킴으로써 실크 피브로인 및 검출가능한 양의 하나 이상의 활성제를 포함하는 샘플 용액을 형성하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 질환 또는 장애의 진단을 필요로 하는 대상체 또는 환자는 생물학적 샘플을 제공하고 생물학적 샘플을 실크 피브로인 조성물과 접촉시킬 수 있고, 이는 이어서 분석을 위해 진단 시험 실험실로 보내진다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 임상 환경에서 숙련된 진료의에 의해 대상체로부터 수집될 수 있고, 여기에서 생물학적 샘플은 이어서 실크 피브로인 (예를 들어, 저분자량 실크 피브로인)과 접촉되고 분석을 위해 진단 시험 실험실로 보내질 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분이 생물학적 샘플로부터 성분을 단리하지 않고 검출 및/또는 분석될 수 있지만, 대안적 실시양태에서, 성분은 임의의 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 검출 및/또는 분석 전에 적어도 일부의 실크 피브로인 조성물로부터 추출 또는 회수될 수 있다. 본원에서 기술하는 실크-기재 물질의 일부 실시양태에 따르면, 조성물은 수용액(예를 들어, 물, 완충 용액, 또는 그의 조합)에 가용성일 수 있다. 셀룰로스-기재 기술, 예를 들어, 혈액이 여과지 위에 흡착되고 그 후 회수되기 어려운 건조된 혈액 반점과 다르게, 적어도 일부의 본원에서 기술하는 실크 피브로인 조성물은 수용액 (예를 들어, 물, 완충 용액, 또는 그의 조합)에 용해될 수 있다. 최종 실크/생물학적 샘플 용액은 이어서 추가적인 정제 없이, 통상적인 액체 검정, 예를 들어, 실시예에서 기술하는 ELISA 및 루미넥스™ 검정을 할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법은 생물학적 샘플의 상기 하나 이상의 성분을 하나 이상의 분석을 시키기 전에 적어도 일부의 실크 피브로인 조성물을 수용액(예를 들어, 물, 완충 용액, 또는 그의 조합)과 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

예를 들어, 표적 성분의 성질에 따라 다양한 유형의 분석이 생물학적 샘플의 표적 성분에 수행될 수 있다. 분석의 비제한적 예는, 유전자형 결정, 핵산 서열분석, 발현 분석(예를 들어, 단백질 수준, 또는 전사체 수준), 결합 친화도, 효소적 활성, 형질감염 효율, 세포 계수, 세포 식별, 세포 생존율, 면역원성, 감염성, 대사물 프로파일링, 및 임의의 그의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 하나 이상의 성분은 하나 이상의 유전자형 결정 또는 핵산 서열분석 분석, 발현 분석(예를 들어, 단백질 수준 및/또는 전사체 수준), 대사물 프로파일링, 또는 임의의 그의 조합이 가해질 수 있다. 이들 분석을 수행하는 다양한 방법은, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 실시간 정량적 PCR, 마이크로어레이, 웨스턴 블롯, 면역조직화학적 분석, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 질량 분광측정법, 핵산 서열분석, 유동 세포측정법, 기체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 핵 자기 공명(NMR) 분광분석법, 또는 임의의 그의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, DNA 서열분석, RNA 서열분석, 신생 서열분석, 차세대 서열분석 예컨대 초 병렬 서명 서열분석(MPSS), 폴로니 서열분석, 파이로시퀀싱, 일루미나(솔렉사) 서열분석, 고체 서열분석, 이온 반도체 서열분석, DNA 나노공 서열분석, 헬리스코프 단일 분자 서열분석, 단일 분자 실시간(SMRT) 서열분석), 나노포어 DNA 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석, 질량 분광측정법을 사용한 서열분석, 마이크로유체 생어 서열분석, 현미경검사-기반 서열분석 기술, RNA 폴리머라제(RNAP) 서열분석, 또는 임의의 그의 조합에 제한되지 않는 핵산 서열분석을 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고 핵산 또는 유전자 발현 측정을 밝히기 위해 성분을 검정하는 데에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 분석은 판독 기기 또는 시스템과 접속할 수 있는 형식으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 분석은 시스템 상에서 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 분석 또는 성분을 포함하는 생물학적 샘플을 수용액과 접촉시키기 전에, 성분은 더 작은 부분으로 나뉘거나 감소될 수 있는데, 예를 들어, 그의 일부는 이후의 분석을 위해 보관될 수 있고/있거나 상이한 표적 성분(예를 들어, 단백질, 핵산, 및/또는 대사물)에 대해 분석될 수 있다. 더 작은 부분으로 나누는 것은 중량으로 또는 부피로 될 수 있다.

실크 피브로인 조성물로부터의 하나 이상의 작용제의 회수는, 부분적으로, 작용제가 캡슐화되는 실크 피브로인 조성물의 용해도, 실크 피브로인 조성물에 존재할 때의 작용제의 안정성, 및/또는 후속 분석을 위한 작용제 함유 실크 피브로인 용액의 처리 용이성에 따라 일반적으로 달라진다. 본원에서 언급하는 대로, 본 발명자들은 놀랍게도, 200 kDa을 초과하는 분자량을 갖는 큰 부분의 실크 피브로인 단편이 있는 다른 실크 조성물(예를 들어, 누에고치를 30분 미만 동안 정련함으로써 수득한 실크 용액으로부터 생성된 실크 조성물)과 다르게, 본원에서 기술하는 저분자량 실크 피브로인 조성물은, 임의의 첨가제(예를 들어, 염) 또는 가열 없이, 상온에서 물에 용이하게 용해되거나 분해되어 실크 피브로인 용액을 형성한다는 것을 발견했다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에서 기술하는 실크 피브로인 입자(분말 포함) 및 필름은 실온에서 탈이온수에 용이하게 용해되거나 분해될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생성된 실크 피브로인 용액은 다른 경우에는 보통 필요한 임의의 후속 투석 없이 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명자들은 본원에서 기술하는 저분자량 실크 피브로인 조성물로부터 재구성한 실크 피브로인 용액은 후속 분석을 위해 유체공학-기반 분석 기계에 직접 주입될 수 있다는 것을 확인했다. 또한, 생성된 실크 피브로인 용액은 또한 본원에서 기술하는 다른 저분자량 실크 피브로인 조성물을 재구성하는 데에 사용할 수 있다.

분해성 및 생성된 실크 용액으로부터 물품을 재형성하는 능력의 그의 독특한 특징에 더하여, 본원에서 기술하는 저분자량 실크 피브로인 조성물은 또한, 실크 피브로인 조성물이 없는 경우의 작용제의 안정성에 비해, 예를 들어, 국제 출원 번호 PCT/US12/34643 및 미국 가출원 번호 61/792,161 및 61/830,950에 기술된 것과 같이, 장기간 동안 샘플 내의 적어도 하나 이상의 작용제를 안정화할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서 기술하는 저분자량 실크 피브로인 조성물은 작용제 또는 샘플이 이후의 사용 및/또는 분석을 위해 회수되거나 회복되기 위해 일정 기간 동안 안정화될 필요가 있는 임의의 응용에 적합하다. 단지 예로서, 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 물품, 예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 필름 또는 분말의 하나 이상의 실시양태에 캡슐화된 작용제 또는 샘플은 사용 및/또는 분석을 위해 준비될 때까지 일정 기간 동안 냉장 없이 실온에서 저장될 수 있다. 이들 실시양태에서, 작용제 또는 샘플을 포함하는 적어도 일부의 저분자량 실크 피브로인 물품은 실온에서 물에 용해되어 작용제 또는 샘플을 사용 가능한 형태로 회복할 수 있고, 한편 나머지 샘플은 이후의 사용 및/또는 다른 분석을 위해 남겨질 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 저분자량 실크 피브로인 조성물 내 캡슐화된 작용제 또는 샘플의 적어도 바람직한 또는 검출가능한 양이 사용가능한 형태로 회수될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사용가능한 형태"는 특정한 용도에 부합하는 작용제 또는 샘플의 형태를 지칭한다. 예를 들어, 작용제 또는 샘플은 검정 분석을 위해 용액에서 회수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "사용가능한 형태"는, 예를 들어, 임의의 인정된 관련 기술분야 정제 방법에 의해, 용액으로부터 분리된 작용제 또는 샘플을 포함할 수 있다. 저분자량 실크 피브로인 조성물이 작용제를 안정화하고 쉽게 용해가능하게 할 수 있기 때문에, 저분자량 실크 피브로인 조성물의 더 적은 분취물은, 비-실크 피브로인 조성물로부터의 작용제 또는 샘플의 회수에 비교할 때, 일반적으로 작용제 또는 샘플의 바람직한 또는 검출가능한 양을 제공하는데 충분할 수 있다. 환언하면, 작용제 또는 샘플의 동일한 부하를 함유하는 분취물과 함께, 본원에 기재된 저분자량 실크 피브로인 조성물로부터의 작용제 또는 샘플의 회수는, 비-실크 피브로인 조성물로부터의 회수에 비해, 예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 그 이상을 포함하는, 적어도 약 10% 이상으로 증가될 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 저분자량 조성물) 내 작용제 또는 샘플의 원래 부하의 적어도 약 50% 이상이 회수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 이상을 포함하는, 50%를 초과하는 저분자량 실크 피브로인 조성물 내 작용제 또는 샘플의 원래 부하가 회수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제 또는 샘플은 저분자량 실크 피브로인 물품을 용해시키고 이를 실온 물(예를 들어, 탈이온수)에서 캡슐화함으로써 회수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제 또는 샘플을 포함하는 용해된 실크 피브로인 물품은 추가의 처리, 예를 들어, 실크 피브로인 용액으로부터 작용제의 분석, 및/또는 작용제의 정제에 놓일 수 있다.

본원에 기재된 저분자량 실크 피브로인 조성물의 조작 및/또는 취급의 용이성으로 인해, 본원에 기재된 조성물은 응급 수송 동안 및/또는 가정용으로, 군사 필드 환경에서, 임상 환경에서 적용될 수 있다. 단지 예로서, 혈액 샘플을 안정화하기 위해서, 예를 들어, 가정 또는 원거리 필드 지역으로부터 실험실 시설을 운송하기 위해, 가정 사용자 또는 군 인사는 보관-안정성 저분자량 실크 피브로인 조성물을 실크 피브로인 용액으로 만들고, 혈액 샘플이 이어서 함께 혼합될 수 있다. 실크 피브로인의 존재 하에 안정화된 혈액 샘플의 성분의 샘플 용액 혼합물은 이어서 실험실 시설로 보내질 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈액 샘플을 포함하는 실크 피브로인 용액은 물품, 예를 들어, 혈액 샘플의 성분이 주위 온도에서, 더 긴 시간의 기간, 예를 들어, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주 또는 그 이상 동안 안정화될 수 있는 필름을 형성하도록 공기-건조될 수 있다. 본원에 기재된 저분자량 실크 피브로인 조성물 및/또는 방법을 사용하여 샘플 내 하나 이상의 바람직한 성분의 활성 및/또는 수준을 보존하는 것은 질환 또는 장애를 위한 신규한 바이오마커의 발견을 돕고, 진단 시험의 민감성을 증가시키고/거나 더 정확한 진단 시험 판독을 제공할 수 있다.

실크 피브로인을 사용한 생물학적 샘플을 안정화시키는 조성물 및 방법은 본 발명자들의 2013년 3월 15일 출원된 US 가출원 제61/792,161호 및 2013년 6월 4일 출원된 제61/830,950호에 기재되고, 이들은 모두 그 전체로 본원에 참조로 포함된다.

예시적인 조성물 형식

제한 없이, 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물 및/또는 안정화를 위한 생물학적 샘플 또는 활성제를 포함하는 실크 피브로인 조성물)은 임의의 형태, 형상 또는 크기일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 용액, 섬유, 필름, 시트, 섬유, 매트(mat), 부직포 매트, 메쉬, 직물, 스폰지, 발포체, 겔, 히드로겔, 튜브, 입자(예를 들어, 나노- 또는 마이크로-입자, 겔-유사 입자), 분말, 스캐폴드, 3D 구축물, 기질 위 코팅 층, 또는 임의의 그의 조합일 수 있다.

실크-기재 물질의 상이한 형식을 생성하기 위한 방법은, 예를 들어, 건조, 용액 캐스팅, 염 침출, 동결-건조, 기체 형성, 전기방사, 겔화(예를 들어, 전자겔화), 전단 응력, 초음파처리, pH 환원, 물 어닐링, 수증기 어닐링, 알콜 침지, 섬유 인출, 코팅, 분무, 미분화(micronizing), 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에서 공지되어 있다. 일부 특정한 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 저분자량 조성물 및/또는 안정화 조성물)은, 임의로 활성제/샘플/성분과 함께, 실크 피브로인의 용액을 드루잉(druing)하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된다; 일부 실시양태에서 건조는 동결건조 또는 공기-건조를 포함한다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 실크-기재 물질에 남아있는 물 함량에 따라, 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질(예를 들어, 고체-상태)은 적어도 약 10 중량% 이상의 실크 피브로인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 실크-기재 물질(예를 들어, 고체-상태)은 적어도 약 20 중량%, 적어도 약 30 중량%, 적어도 약 40 중량%, 적어도 약 50 중량%, 적어도 약 60 중량%, 적어도 약 70 중량%, 적어도 약 80 중량%, 적어도 약 90 중량%, 적어도 약 95 중량% 이상의 실크 피브로인을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물 및/또는 안정화 실크 조성물)은 입자의 형태이다. 예를 들어, 실크 피브로인 물품은 실크 나노구체 또는 실크 마이크로구체의 형태일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "입자"는 구; 막대; 쉘; 프리즘; 및 분말을 포함하고, 일부 실시양태에서, 이들 입자는 네트워크 또는 응집체의 부분일 수 있다. 제한 없이, 입자는 나노미터(nm) 내지 밀리미터(mm)의 임의의 크기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자는 약 0.01 ㎛ 내지 약 1000 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 0.25 ㎛ 내지 약 200 ㎛, 또는 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 크기를 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "나노입자"는 약 0.1 nm 내지 약 1000 nm의 입자 크기를 가지는 입자를 지칭한다. 마이크로- 내지 나노-규모 실크 피브로인 입자 및 관련 기술의 특정 실시양태는 또한 여기 동시에 출원된 제목 "SYNTHESIS OF SILK FIBROIN MICRO- AND SUBMICRON SPHERES USING A CO-FLOW METHOD"의 U.S. 가출원에서 제공된다.

입자는 주로 상기 "크기" 주위에 입자 크기의 분포를 나타낸다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "입자 크기"는 입자의 크기 분포의 모드, 즉 대부분 크기 분포에서 발생하는 값을 지칭한다. 입자 크기를 측정하기 위한 방법은, 예를 들어, 동적 광 산란(예컨대 광상관관계(photocorrelation) 분광분석법, 레이저 회절, 저-각 레이저광 산란(LALLS), 및 중간-각 레이저광 산란(MALLS), 광 차폐 방법(예컨대 쿨터 분석 방법), 또는 다른 기술(예컨대 레올로지, 및 광 또는 전자 현미경검사)에 의해, 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 입자는 실질적으로 구형일 수 있다. "실질적으로 구형"은 입자 단면의 가장 긴 것 대 가장 짧은 수직 축의 길이의 비가 약 1.5 이하임을 의미한다. 실질적으로 구형은 대칭의 라인을 필요로 하지 않는다. 추가로, 입자는 표면 텍스처링, 예컨대 입자의 전체 크기와 비교할 때 작은 규모이고 실질적으로 여전히 구형인 라인 또는 압입자국(indentation) 또는 돌출부분(protuberance)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자의 가장 긴것과 가장 짧은 축 사이의 길이의 비는 약 1.5 이하, 약 1.45 이하, 약 1.4 이하, 약 1.35 이하, 약 1.30 이하, 약 1.25 이하, 약 1.20 이하, 약 1.15 이하, 약 1.1 이하이다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 표면 접촉은 실질적으로 구형인 입자로 최소화되고, 이는 저장 시 입자의 바람직하지 않은 응집을 최소화한다. 많은 결정 또는 박편은, 응집이 이온성 또는 비-이온성 상호작용으로 일어날 수 있는 큰 표면 접촉 지역을 허용할 수 있는 평평한 표면을 갖는다. 구는 훨씬 더 작은 지역에 접촉을 허용한다.

일부 실시양태에서, 입자는 실질적으로 동일한 입자 크기를 갖는다. 상대적새로운크고 작은 입자가 모두 있는 넓은 크기 분포를 갖는 입자는 더 작은 입자가 더 큰 입자 사이의 공간을 채우도록 함으로써, 새로운 접촉 표면을 생성하도록 한다. 넓은 크기 분포는 결합 응집에 대해 많은 접촉 기회를 제공함으로써 그 결과 더 큰 구가 된다. 본원에 기재된 입자는 좁은 크기 분포 내에 있음으로써, 접촉 응집에 대한 기회를 최소화시킨다. "좁은 크기 분포"란 10 백분위수의 부피 직경에 대한 작은 구형 입자의 90 백분위수 5 이하인 부피 직경의 비를 갖는 입자 크기 분포이다. 일부 실시양태에서, 10 백분위수의 부피 직경에 대한 작은 구형 입자의 90 백분위수의 부피 직경이 4.5 이하, 4 이하, 3.5 이하, 3 이하, 2.5 이하, 2 이하, 1.5 이하, 1.45 이하, 1.40 이하, 1.35 이하, 1.3 이하, 1.25 이하, 1.20 이하, 1.15 이하, 또는 1.1 이하이다.

기하 표준 편차(GSD) 또한 좁은 크기 분포를 나타내도록 사용될 수 있다. GSD 계산은 백분율 15.9% 및 84.1% 미만인 누적에서 실효 차단 직경(ECD)을 결정하는 것을 포함한다. GSD는 15.9% 미만인 ECD에 대한 84.17% 미만인 ECD의 비의 제곱근과 같다. GSD가 2.5 미만일 때, GSD는 좁은 크기 분포를 갖는다. 일부 실시양태에서, GSD는 2 미만, 1.75 미만, 또는 1.5 미만이다. 한 실시양태에서, GSD는 1.8 미만이다.

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 입자 크기는 최종 생성물의 미시적인 및 거시적인 특성을 크게 결정할 수 있다. 입자 크기는, 사용된 세라믹 볼의 크기, 각 볼 밀 컵에 놓여진 실크의 양, 기계의 회전 속도(RPM) 및 볼 밀링의 지속기간을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 공정 파라미터의 수에 의존한다. 분말 내 입자 크기는 일부 이들 공정 파라미터, 예를 들어, 상관관계를 결정하는 수학적 모델링 및/또는 실험을 바탕으로 예측될 수 있다. 예를 들어, 이는 다양한 볼 밀 속도 및 지속기간에 대해 실크 피브로인의 소정의 부피를 밀링함으로써 행해질 수 있다. 스캐닝 전자 현미경검사(SEM)는 입자 크기를 측정하기 위해 각 실험으로부터의 대표 샘플에 대해 수행될 수 있다. 추가의 실험은 생성된 구축물의 색, 분자량, 용액 내 점도, 및 수 용해도에 미치는 공정 파라미터의 영향을 측정하기 위해 각 샘플에 대해 실행될 수 있다.

실크 입자(예를 들어, 나노입자 및 마이크로입자)를 생성하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 실크 입자는, 예를 들어, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 번호 WO 2011/041395에 기재된 폴리비닐 알콜(PVA) 상 분리 방법에 의해 생성될 수 있다. 실크 피브로인 입자를 생성하는 다른 방법은, 예를 들어, 이의 모든 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 공보 제 U.S. 2010/0028451 및 PCT 출원 공개 번호 WO 2008/118133(실크 마이크로구체 또는 나노구체를 만들기 위한 주형으로서 지질을 사용함), 및 문헌 [Wenk et al., J Control Release, 2008; 132: 26-34](실크 마이크로구체 또는 나노구체를 생성하기 위해 분무 방법을 사용함)에 기재된다.

제한 없이, 실크 피브로인 및 첨가제 또는 활성제/샘플과 제제화될 수 있는 적어도 6 유형의 입자가 있다: (1) 첨가제/작용제/샘플이 입자 코어 상의 코팅을 흡수/흡착 또는 형성하는, 실크 피브로인에 의해 형성된 코어를 포함하는 입자; (2) 하나 이상의 층의 실크 피브로인으로 코팅된 첨가제/작용제/샘플에 의해 형성된 코어를 포함하는 입자; (3) 실크 피브로인의 일반적으로 균질 혼합물 및 첨가제/작용제/샘플을 포함하는 입자; (4) 실크 피브로인의 코어의 코팅이 있는 첨가제/작용제/샘플 및 실크 피브로인의 혼합물을 포함하는 코어를 포함하는 입자; (5) 생물학적 샘플 또는 실크 피브로인 또는 생물학적 샘플 및 실크 피브로인의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 층으로 코팅된, 실크 피브로인 또는 생물학적 샘플 외 다른 물질의 코어를 포함하는 입자; (6) (1)-(5)의 임의의 입자를 포함하고, 실크 피브로인 또는 생물학적 샘플, 예를 들어, 중합체 외 다른 물질의 하나 이상의 층을 더 포함하는, 입자. 실크 피브로인 입자(예를 들어, 마이크로구체, 나노구체, 또는 겔 유사 입자) 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 제8,187,616호; 및 미국 특허 출원 공보 US 2008/0085272, US 2010/0028451, US 2012/0052124, US 2012/0070427, US 2012/0187591에 기재된다. 제한 없이, 생물학적 샘플은 필름의 실크 피브로인 매트릭스에 분포되거나, 필름의 표면 상에 존재하거나, 필름에 코팅되거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 입자는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2012년 10월 26일 출원된 미국 가출원 제61/719,146호에 기재된 동결-건조 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 구체적으로, 실크 발포제는 실크 용액을 동결-건조함으로써 생성될 수 있다. 발포체는 그 다음 입자로 환원될 수 있다. 예를 들어, 실크 용액은 액체 담체가 다수의 고체 결정 또는 입자로 변형되는 온도로 냉각되고 적어도 일부의 다수의 고체 결정 또는 입자를 제거하여 기공성 실크 물질(예를 들어, 실크 발포체)을 남기도록 할 수 있다. 냉각 후, 액체 담체는, 적어도 부분적으로, 승화, 증발, 및/또는 동결건조에 의해 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 액체 담체는 감압 하에 제거될 수 있다. 형성 후, 실크 피브로인 발포체는 분쇄, 절단, 파쇄 또는 그의 임의의 조합에 놓여져 실크 입자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 실크 피브로인 발포체는 종래의 블렌더로 블렌딩되거나 또는 볼 밀로 밀링되어 목적 크기의 실크 입자를 형성할 수 있다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물은 동결건조 분말의 형태이다.

일부 실시양태에서, 제공된 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 물품)은 겔 또는 히드로겔의 형태일 수 있다. 용어 "히드로겔"은 용해 없이 그의 구조 내에서 물 또는 다른 액체의 상당한 부분을 유지하는 능력을 보여주는 실크-기재 물질을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 실크 피브로인 겔 및 히드로겔을 제조하는 예시적인 방법은, 초음파처리, 볼텍싱, pH 적정, 전기장에의 노출, 용매 침지, 물 어닐링, 수증기 어닐링 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 실크 피브로인 겔 및 히드로겔을 제조하는 예시적인 방법은, 예를 들어, 이 모든 내용이 그 전체로 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 제WO 2005/012606, 제WO 2008/150861, 제WO 2010/036992, 및 제WO 2011/ 005381에 기재된다. 전기장에의 노출에 의해 형성된 겔은 또한 본원에서 e-겔로 지칭된다. e-겔을 형성하는 방법은, 예를 들어, 이 내용 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 출원 공개 제US2011/0171239에 기재된다. 제한 없이, 첨가제/작용제/샘플은 겔 또는 히드로겔의 실크 피브로인 매트릭스에 분포되거나, 겔 또는 히드로겔 또는 스폰지의 표면 상에 흡수되거나, 겔 또는 히드로겔의 기공 내에 존재하거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 물품)은 스폰지 또는 발포체의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 발포체 또는 스폰지는 패턴화된 발포체 또는 스폰지, 예를들어, 나노패턴화된 발포체 또는 스폰지일 수 있다. 실크 발포체 및 스폰지를 제조하는 예시적인 방법은, 예를 들어, 모든 내용이 그 전체로 본원에 참조로 포함되는, PCT 출원 공개 제WO 2004/000915, 제WO 2004/000255, 및 제WO 2005/012606에 기재된다. 제한 없이, 첨가제/활성/샘플은 발포체 또는 스폰지의 실크 피브로인 매트릭스에 분포되거나, 발포체 또는 스폰지의 표면 상에 흡수되거나, 발포체 또는 스폰지의 기공 내에 존재하거나, 또는 그의 임의의 조합이 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 물품)은 섬유의 형태이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "섬유"는 상대적으로 유연한, 그의 길이에 수직인 그의 횡-단면을 가로지르는 폭에 대한 길이의 높은 비를 갖는 물질의 단위를 의미한다. 실크 피브로인 섬유를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 섬유는 실크 용액을 전기방사하고, 실크 용액을 드로잉하는 등에 의해 제조될 수 있다. 전기방사된 실크 물질, 예컨대 섬유, 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어 이의 내용 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2011/008842에 기재된다. 마이크로미터-크기 실크 섬유(예를 들어, 10-600 ㎛ 크기) 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어, 그 전체 모든 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Mandal et al., PNAS, 2012, doi: 10.1073/pnas.1119474109]; 2012년 4월 6일 출원된, 미국 가출원 제61/621,209호; 및 2013년 4월 5일 출원된 PCT 출원 제PCT/US13/35389호에 기재된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 물품)은 필름, 예를 들어, 실크 필름의 형태일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "필름"은 실질적으로 평평한 구조를 지칭하고, 또한 실질적으로 평평한 구조로부터 형성된 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용어 "필름"은, 실질적으로 평평한 필름을 목적 형태로 조작(예를 들어, 롤링 업 및/또는 폴딩)함으로써 형성될 수 있는 관상 구조 또는 임의의 구조를 포함할 수 있다. 용어 "필름"은 웹, 시트, 라미네이트 등을 포함하는 포괄적 관점으로 사용되었다. 일부 실시양태에서, 필름은 패턴화된 필름, 예를 들어, 나노패턴화된 필름이다. 실크 피브로인 필름을 제조하기 위한 예시적인 방법은, 예를 들어, 둘다 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 공개 제WO 2004/000915 및 제WO 2005/012606에 기재된다. 일부 실시양태에서, 첨가제 및/또는 작용제/샘플이 포함될 때, 이는 필름에 분포되거나, 필름의 표면 상에 존재하거나, 필름에 코팅되거나 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.

필름은 임의의 목적 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 필름 두께는 약 1nm 내지 약 10mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 필름은 약 1 nm 내지 약 1000nm 또는 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛ 범위의 두께를 갖는다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물은 코팅 층의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 코팅 층은 기질 표면 상에 있을 수 있다. 제한 없이, 실크 피브로인 코팅 층은 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 추가로, 2 이상의 층이 존재한다면, 각 층은 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인) 또는 다수의 층을 포함하는 단일 층일 수 있고 ,여기서 적어도 하나 이상의 층은 저분자량 실크 피브로인 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 층은 아주 얇은 코팅 층이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 실크 피브로인 조성물은 일부분의 기질을 형성할 수 있다.

기질의 예는 계량봉(dipstick), 셀룰로스-기재 생성물, 마이크로-타이터 플레이트, 시편 용기(제한 없이 예를 들어, 혈액 수집 용기), 의료 기기, 이식편 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지는 않는다. 실크 피브로인을 포함하는 코팅 층을 형성하는 방법은 그 내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 제11/997,193호에 기재된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 물품)은 실린더형 매트릭스, 예를 들어 실크 튜브의 형태일 수 있다. 실크 관은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 관은 성형, 침지, 전기방사, 겔 방사 등을 사용하여 만들어질 수 있다. 겔 방사는 두 내용 모두 그 전체가 참조로 본원에 포함되는, 문헌 [Lovett et al., Biomaterials 2008, 29(35):4650-4657]에 기재되고 겔-방사된 실크 관의 구조체는 2009년 4월 8일 출원된 PCT 출원 제PCT/US2009/039870에 기재된다. 딥-코팅 방법을 사용한 실크 관의 구조체는 그 내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 2008년 8월 11일 출원된 PCT 출원 제PCT/US2008/072742에 기재된다. 필름-방사 방법을 사용한 실크 피브로인 관의 구조체는, 두 내용 모두 그 전체가 참조로 본원에 포함되는, 2013년 3월 11일 출원된 PCT 출원 제PCT/US2013/030206; 2012년 3월 20일 출원된 미국 가출원 제61/613,185; 및 PCT 출원 공고 제WO 2013126799에 기재된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 실크 튜브의 내부 및 외부 직경은 딥-코팅 기술보다 필름-방사 또는 겔-방사를 사용하여 더 쉽게 조절될 수 있다고 여겨진다.

일부 실시양태에서, 제공된 실크-기재 물질은 그 안에 루멘 또는 공동을 포함하는 매트릭스의 형태이다. 일부 이러한 실시양태에서, 적어도 일부 양의 첨가제 및/또는 활성제/샘플이 실크 피브로인 네트워크에 분포된다. 일부 실시양태에서, 이는 루멘 또는 공동에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 그 안에 루멘 또는 공동을 포함하는 매트릭스의 형태이고, 적어도 일부 양의 첨가제/작용제/샘플이 실크 피브로인 네트워크 그 자체에 분포된다. 일부 실시양태에서, 매트릭스가 루멘 또는 공동을 포함할 때, 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%)의 첨가제 또는 작용제가 루멘 또는 공동에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 양이 루멘/공동에 존재한다. 일부 실시양태에서, 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%)가 매트릭스의 실크 피브로인 네트워크(예를 들어, 비-루멘 부분의 실크-기재 물질)에 존재할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 물품)이 기공성(예를 들어, 기공성 매트릭스 또는 스캐폴드)일 수 있다. 예를 들어, 다공성 스캐폴드가 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 이상의 기공률을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기공률"은 0 내지 100% 백분율로(또는 0 내지 1), 물질 내 공동 공간의 측정이고 총 부피에 걸친 공동의 부피의 분획이다. 기공률의 측정은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들어, 표준화된 기술, 예컨대 수은 세공측정법 및 기체 흡착, 예를 들어, 질소 흡착을 사용하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기공률"은 0 내지 100% 백분율로(또는 0 내지 1), 물질 내 공동 공간의 측정이고 총 부피에 걸친 공동의 부피의 분획이다. 기공률의 측정은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들어, 표준화된 기술, 예컨대 수은 세공측정법 및 기체 흡착, 예를 들어, 질소 흡착을 사용하는 것이다.

다공성 스캐폴드는 임의의 세공 크기를 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세공 크기"는 기공의 횡-단면의 직경 또는 유효 직경을 지칭한다. 용어 "세공 크기"는 또한, 다수의 기공의 측정을 바탕으로 한, 기공의 횡-단면의 평균 직경 또는 평균 유효 직경을 지칭할 수 있다. 횡-단면의 유효 직경은, 비-원형 횡-단면의 것과 동일한 단면적을 갖는 원형 횡-단면의 직경과 동일한 원형이 아니다.

일부 실시양태에서, 실크-기재 물질의 기공은 약 50 nm 내지 약 1000 nm, 약 250 nm 내지 약 500 nm, 약 500 nm 내지 약 250 nm, 약 1 nm 내지 약 200 nm, 약 10 nm 내지 약 150 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm 범위의 크기 분포를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 수화될 때, 팽윤성일 수 있다. 기공의 크기는 그 다음 실크-기재 물질 내 물 함량에 따라 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기공은 유체 예컨대 물 또는 공기로 채워질 수 있다.

실크 피브로인-기재 스캐폴드 내 기공을 형성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되고, 기공 유도물질(porogen)-침출 방법, 동결-건조 방법, 및/또는 기체-형성 방법을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 실크-기재 물질 내 기공을 형성하는 예시적인 방법은, 예를 들어, 그 모든 내용 전체가 참조로 본원에 포함되는, U.S. 특허 출원 공보 제US 2010/0279112 및 제US 2010/0279112; US 특허 제7,842,780; 및 WO2004062697에 기재된다.

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 다공성 스캐폴드의 기공률, 구조, 및 기계적 특성은 상이한 이후-스피닝 방법, 예컨대, 증기 어닐링, 열 처리, 알콜 처리, 공기-건조, 동결건조 등을 통해 조절될 수 있다. 추가로, 매트릭스 내에 캡슐화된 분자의 임의의 바람직한 방출 속도, 프로파일 또는 동역학은 처리 파라미터, 예컨대 매트릭스 두께, 실크 분자량, 매트릭스 내의 실크 농도, 베타-시트 입체형태 구조, 실크 II 베타-시트 결정화도, 또는 기공률 및 세공 크기를 변화시키는 것에 의해 변화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 스캐폴드는 원하는 시간동안 (예를 들어, 한달 또는 그 이상)에 걸쳐서 스캐폴드가 분해되는 것이 가능하면서도 임플란트 부위에서 충분한 기계적 겅도/안정성을 제공할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질의 기공률은 목적하는 용해 속도를 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 실크-기재 물질의 더 높은 기공률은 일반적으로 수용액이 실크-기재 물질 속으로 더 빠르게 투과하도록 할 수 있으며, 따라서, 용해 과정을 가속화시킨다. 통상의 기술자는 수 개의 요인들, 이에 한정되지는 않지만 예컨대, 목적하는 용해 속도; 실크-기재 물질 내에 존재하는 성분의 분자 크기 및/또는 확산 계수, 및/또는 실크-기재 물질 내의 실크 피브로인의 농도, 양, 및/또는 실크-기재 물질의 목적하는 물리적 또는 기계적 특성을 기초로 적절히 기공률을 조절할 수 있다.

실크 피브로인 매트릭스 내로 첨가제/작용제/샘플을 혼입하기 위해서, 이것들은 실크-기재 물질을 생산하는 데 사용되는 실크 피브로인 용액에 포함될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 미리 성형된 실크-기재 물질이 첨가제/작용제/샘플을 포함하는 용액에 첨가되어, 첨가제/작용제/샘플이 실크-기재 물질 안으로/위로 흡수되도록 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 첨가제/작용제/샘플은 실크-기재 물질 내에 균일하게 또는 불균일하게 (예를 들어, 구배를 가지도록) 분산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제/작용제/샘플은 실크-기재 물질 안에 실크 피브로인에 의해 캡슐화되거나 밀봉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제/작용제/샘플은 실크-기재 물질 내의 실크 피브로인과 혼합되거나 블렌딩될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 실크 피브로인 조성물은 골전도성이다. 골전도성은 일반적으로 물질이 임플란드 된 후 즉시 생성되는 피브린 응괴를 통해 스캐폴드의 표면으로의 골형성 세포의 이동을 용이하게 하는 물질의 능력으로 정의된다. 물질의 기공률이 그 물질의 골전도성에 영향을 미친다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 실크 피브로인 조성물은 골유도성이다. 골유도성은 일반적으로 골 (뼈) 조직의 성분인 미분화 줄기 세포 또는 골조상 세포 (골모세포)를 골모세포로 분화하기 위해 유도하는 능력으로 정의된다. 골유도성의 가장 간단한 시험은 일반적으로 골을 형성하지 않는 조직 부위, 예컨대 근육 내에 골의 형성을 유도하는 능력이다 (정상 골 성장). 본 발명에 개시된 제조 물품은 이들에 성장 인자, 예컨대, rhBMP-2 (재조합 인간 골 형태발생 단백질-2)을 그에 첨가하는 것에 의해 골유도성으로 만들어질 수 있다는 것이 일반적으로 이해된다. 무기질화 및 성장 인자의 첨가는 물질의 골유도성에 영향을 미칠 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 실크 피브로인 조성물은 골 형성성이고, 생체 내 임플란트 후에 신규한 골 형성을 나타냈다. 골형성은 골모세포를 사용하여 신규한 골 물질을 래잉 다운(laying down)하는 과정이다. 골모세포는 골을 생성하여 주로 유형 I 콜라겐으로 구성된 유골 매트릭스를 형성하는 것에 의해 골을 만든다. 골조직은 유골 매트릭스 및 칼슘 히드록시아파타이트라고 불리는 화학적 배열을 형성하는 미네랄 (대부분 인산칼슘과 함께)을 포함한다. 골모세포는 전형적으로 유골 매트릭스를 무기질화하여 골조직을 형성하기 위한 것을 전담한다. 이론에 얽매이기를 원하지 않지만, 물질의 골전도성 및 골유도성은 골형성에 영향을 미친다. 물질은 생체 내 임플란트 후 6개월 이내에 신규한 골 형성을 나타낼 수 있고, 일부 실시양태에서 생체 내 임플란트 후 8주 이내에 신규한 골 형성을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 실크 피브로인 물품은 통상적인 멸균 과정, 예컨대, 방사선계 멸균 (즉, 감마선), 화학물질계 멸균 (에틸렌 옥시드), 오토클레이빙, 또는 다른 적절한 절차를 사용하여 살균될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멸균 과정은 약 52℃ 내지 약 55℃ 사이의 온도에서 8시간 이하의 시간 동안 에틸렌 옥시드를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 실크 피브로인 물품은 또한 무균화 처리될 수 있다. 본 발명에 개시된 멸균 실크 피브로인 물품은 운송을 위해 적절한 살균 수분 내성 패키지에 포장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성제를 함유하는 실크 피브로인 조성물은 활성제를 현저하게 위해하거나 분해하는 멸균은 거치지 않는다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물은 멸균 위해로부터 활성제를 보호한다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 실크 피브로인 물품은 임플란트 또는 임플란트 가능한 약물 전달 장치의 형태이다.

일부 실시양태에서, 제공된 실크 피브로인 조성물은 주사가능한 조성물의 형태이다. 본원에서 사용되는 용어 "주사가능한 조성물"은 일반적으로 최소한의 침습 절차로 조직 내로 전달 또는 투여될 수 있는 조성물을 의미한다. 용어 "최소한의 침습 절차"는 대상체의 몸체 내지 피부 또는 내지 체강 또는 해부학적 노출부(opening)에 진입하되 가장 적은 가능한 손상(예를 들어, 작은 절개, 주사)으로 수행되는 절차를 의미한다. 일부 실시양태에서, 주사가능한 조성물은 주사에 의해 조직 내부로 투여 또는 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 주사가능한 조성물 바늘, 캐뉼라, 및/또는 배관, 예를 들어, 카테터의 삽입에 이어 피부 상의 작은 절개부위를 통해 조직 내로 투여 또는 전달될 수 있다. 이로 한정되기를 원하지 않지만, 주사가능한 조성물은 수술, 예를 들어, 이식에 의해 조직 내에 투여 또는 위치될 수 있다. 약간의 예시적인 주사가능한 조성물로는 이에 한정되지는 않지만, 용액, 히드로겔, 겔-유사 입자, 및/또는 마이크로구체를 들 수 있다.

명확히는, "주사가능한 제제" 및 "주사제"에서 용어 "주사가능한"은 바늘 또는 임의의 다른 적합한 수단을 통과하기에 충분한 유량의 용액이 있고, 이러한 유량이 사용자에 의해 합리적으로 편리하게 생성될 수 있어 주사에 의해 투여하기에 적합한 용액(예를 들어, 제제)의 물리적 특성을 의미한다. 시린지는 대상체에 주사약을 전달하기 위해 통상적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 주사가능한 제제는 사전-충전 시린지로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 주사가능한 제제는 바로 사용가능한 제제로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 주사가능한 제제는 키트로 제공될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제공된 조성물, 예컨대, 주사가능한 조성물은 추가로 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 잇다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 주사에 적합한 조성물은 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 담체는 용매 또는 예를 들어, 물, 세포 배양 배지, 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수), 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물을 포함하는 분산 배지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 담체는 완충 용액 (예를 들어, PBS) 일 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 완충제 등의 다양한 첨가제 주사가능한 조성물의 안정성, 멸균성, 및 등장성을 증가시킬 수 있는 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장할 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물은 또한 제조 목적에 따라 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 염료 등을 함유할 수 있다.

제공된 액체 조성물 (예를 들어, 주사가능한 조성물)의 점도는 분자량 서브-범위 (i) 내지 (xviii)을 가지는 실크 피브로인 단편 중량 백분율을 조절하는 것에 의해 조절가능하다. 일부 실시양태에서, 조성물의 점도는 추가로 제약상 허용되는 증점제를 사용하여 선택된 수준으로 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 메틸셀룰로스가 사용될 수 있는데, 왜냐하면 이는 쉽고 경제적으로 입수가능하고, 작업하기가 용이하기 때문이다. 다른 적합한 증점제는, 예를 들어, 크산탄 검, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 카르보머 등을 포함한다. 증점제의 바람직한 농도는 선택된 작용제 및 주사를 위해 바람직한 점도에 따라 달라질 수 있다. 중요한 것은 선택된 점도를 달성할 수 있는 양을 사용, 예를 들어, 이러한 증점제를 일부 실시양태의 주사가능한 조성물에 첨가하는 것이다.

일부 실시양태에서, 제공된 실크 피브로인 조성물은 분사가능한 조성물의 형태이다.

일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공된 실크 피브로인 조성물 (예를 들어, 저분자량 실크 조성물) 에어로겔 또는 에어로겔-유사 물질의 형태일 수 있다. 예를 들어, 실크 피브로인을 포함하는 에어로겔 또는 에어로겔-유사 물질을 형성하는 방법은 본원에서 전체 내용이 참고되고 있는 2013년 11월 8일 출원되고 명칭 "펩티드계 나노피브릴 물질"인 미국 특허 가출원 번호 US 61/902,145에 설명되어 있다.

이론에 얽매이기를 원하지 않지만, 실크-기재 물질의 특성 (이에 제한되지는 않지만 예를 들어, 용해도) (본 발명에서 설명된 활성제 또는 생물학적 샘플을 포함하는 것 등)은 실크-기재 물질 내의 실크 피브로인 단편의 분자량을 변화시키는 것에 의해 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 분자량의 실크 피브로인은 고치를 정련하는데 상이한 시간 주기를 사용하여 정련된 피브로인을 제공하는 것에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 저분자량 실크 피브로인 조성물을 생산하기 위한 일부 실시양태에서, 고치는 약 1분 내지 2시간, 약 5분 내지 약 2시간, 약 10분 내지 약 60분, 약 60분 내지 4시간, 약 60분 내지 3시간, 약 60분 내지 2시간, 약 60분 내지 90분, 또는 약 4시간 또는 그 이상의 기간 동안 (예를 들어, 염 용액, 예컨대 Na₂CO₃에서) 비등된다. 일부 실시양태에서, 고치는 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 90분, 약 100분 또는 그 이상 (예를 들어, 염 용액, 예컨대 Na₂CO₃에서) 비등될 수 있다. 정련 시간을 조절하는 것에 의해, 실크-기재 물질의 용해도는 (예를 들어, 수용액 내에서) 저분자량 실크 피브로인 조성물 내에 존재하는 작용제의 추출 또는 회수에 최적화될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 더 긴 비등 시간은 일반적으로 저급 분자량 (MW)/쇄 길이의 실크 피브로인을 수득하게 하고, 따라서, 저급 MW 실크 피브로인에서 생성된 실크-기재 물질은 고급 MW 실크 피브로인에서 생선된 것보다 일반적으로 더 가용성 (예를 들어, 수용액에서) 일 수 있다.

일부 실시양태에서, 용해가능한 실크-기재 물질은 고치가 그 안에서 저급 MW 실크 피브로인을 수득하기에 충분한 시간 기간, 예를 들어, 적어도 약 30분, 적어도 약 60분, 또는 적어도 약 90분 또는 그 이상 동안 비등되거나 정련된 실크 용액으로부터 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해가능한 실크-기재 물질은 고치가 그 안에서 적어도 약 30분, 적어도 약 60분, 또는 적어도 약 90분 또는 그 이상 동안 비등되거나 정련된 실크 용액으로부터 생성된 동결건조된 실크-기재 물질이다. 일부 실시양태에서, 용해가능한 실크-기재 물질은 고치가 그 안에서 적어도 약 30분, 적어도 약 60분, 또는 적어도 약 90분 또는 그 이상 동안 비등되거나 정련된 실크 용액으로부터 생성된 실크-기재 필름이다. 실크-기재 물질은 본 발명에서 설명된 임의의 다른 형태, 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 전기방사, 겔화 또는 다른 고속 응고 기술에 의해 생성될 수 있다. .

본 발명에서 설명된 실크-기재 물질의 용해도를 변경하기 위한 다른 방법은 또한 단독으로 사용되거나 정련 시간 조절과 조합하여 사욜될 수 있다. 예를 들어, 실크-기재 물질의 용해도는 실크-기재 물질의 건조 속도를 가속하는 방법, 예를 들어, 가압된 공기, 감소된 습도 (주위보다 낮은), 및/또는 증가된 온도, 등에 의해 향상될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 실크-기재 물질의 용해도는 실크-기재 물질을 동결건조 조건에 놓고/놓거나 실크 피브로인 내의 결정화도를 유도할 수 있는 조건에 노출하는 시간을 감소시키는 것에 의해 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질의 용해도는 예를 들어, 효소적 소화, 여과, 크로마토그래피를 통한 정제 동안 실크의 고분자량 분획(예를 들어, 중쇄 및/또는 긴 소수성 서열)을 선택적으로 제거하는 것에 의해 향성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질의 용해도는 분자량을 계속 감소시키고/시키거나 불용성 미립자를 제거하는 기능을 하는 예를 들어, 오토클레이빙 및 멸균 여과 등의 멸균 수단에 의해 향상될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인 조성물 중(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물 중 및/또는 안정화 조성물 중)의 실크 피브로인의 적어도 일부는 상이한 용도, 예를 들어, 생의학 출원, 및/또는 상이한 원하는 기계적 또는 화학적 특성를 위해 변형될 수 있다. 통상의 기술자는, 예를 들어, 실크 피브로인의 측기, 실크 피브로인에서 목적하는 반응성 및/또는 실크 피브로인 상의 목적 전하 밀도에 따라 실크 피브로인을 변형하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있다.

예를 들어, 조직 엔지니어링 또는 약물 전달 목적으로 생체 내 임플란트된 경우, 실크 피브로인 조성물에 분산된 활성제의 안정성을 유지하기 위해서, 실크 피브로인의 적어도 일부가 유전적으로 변형될 수 있으며, 이는 실크의 추가적인 변형, 예컨대 유기-무기 복합물을 형성하는데 사용될 수 있는 섬유성 단백질 도메인 및 무기질화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드의 포접을 제공한다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로서 포함된 WO 2006/076711을 참조한다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 화학적으로 변형, 예를 들어 내지 디아조늄 또는 카르보디이미드 커플링 반응, 아비딘-비오틴 상호작용, 또는 유전자 변형 등이 되어서 실크 단백질의 물리적 특성 및 기능성이 변화될 수 있다. 화학적으로 변형된 실크 피브로인 및 그들의 제조 방법은, 그 전문이 본원에 참조로서 포함된 예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO　2011/011347 및 번호 WO　2010/057142; 및 미국 특허 출원 번호 12/192,588에 설명된다.

한 실시양태에서, 실크 피브로인의 변형은 아미노산 측쇄 화학, 예컨대 화학적 변형 내지 공유 결합, 또는 변형 내지 전하-전하 상호작용을 사용할 수 있다. 예시적인 화학적 변형 방법은 이에 제한되지는 않지만, 카르보디이미드 커플링 반응 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 US 2007/0212730 참조), 디아조늄 커플링 반응 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 US 2009/0232963 참조), 아비딘-비오틴 상호작용 (예를 들어, 국제 출원 번호: WO 2011/011347 참조) 및 PEG 중합체의 화학적 활성 또는 활성화된 유도체를 사용한 PEG화 (예를 들어, 국제 출원 번호 WO 2010/057142 참조)을 들 수 있다. 실크 피브로인은 또한 실크 단백질의 기능성을 변경하기 위한 유전자 변형을 통해 변형될 수 있다. (예를 들어, 국제 출원 번호 WO 2011/006133 참조). 예를 들어, 실크 피브로인은 유전적으로 변형될 수 있으며, 이는 실크의 추가적인 변형, 예컨대 유기-무기 복합물을 형성하는데 사용될 수 있는 섬유성 단백질 도메인 및 무기질화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드의 포접을 제공한다. WO 2006/076711을 참조한다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 유전적으로 변형되어서 단백질, 예를 들어, 치료 단백질과 융합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 설명된 조성물 중의 실크 피브로인의 적어도 부분은 양으로/음으로 하전된 분자로 유도 또는 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 양으로/음으로 하전된 펩티드 또는 폴리펩티드, 이러한 폴리-리신 및 폴리-글루탐산으로 변형될 수 있다. 가능하기는 하지만, 조성물 중의 모든 단일 실크 피브로인 분자가 양으로/음으로 하전된 분자로 변형될 것이 요구되지는 않는다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로서 포함된 PCT 출원 공개 번호 WO2011109691A2에 하전된 분자로 실크 피브로인을 유도 또는 변형시키는 방법에 설명된다.

변형된 실크 피브로인 대 비변형된 실크 피브로인의 비는 저분자량 실크 피브로인 조성물 또는 그로부터 형성된 물품에 목적하는 하나 이상의 특성을 최적화하기위해 조절될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조서물 중의 변형된 실크 피브로인 대 비변형된 실크 피브로인의 비는 약 1000:1 (w/w) 내지 약 1:1000 (w/w), 약 500:1 (w/w) 내지 약 1:500 (w/w), 약 250:1 (w/w) 내지 약 1:250 (w/w), 약 200:1 (w/w) 내지 약 1:200 (w/w), 약 25:1 (w/w) 내지 약 1:25 (w/w), 약 20:1 (w/w) 내지 약 1:20 (w/w), 약 10:1 (w/w) 내지 약 1:10 (w/w), 또는 약 5:1 (w/w) 내지 약 1:5 (w/w) 범위일 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들어, 적어도 1000:1, 적어도 900:1, 적어도 800:1, 적어도 700:1, 적어도 600:1, 적어도 500:1, 적어도 400:1, 적어도 300:1, 적어도 200:1, 적어도 100:1, 적어도 90:1, 적어도 80:1, 적어도 70:1, 적어도 60:1, 적어도 50:1, 적어도 40:1, 적어도 30:1, 적어도 20:1, 적어도 10:1, 적어도 7:1, 적어도 5:1, 적어도 3:1, 적어도 1:1, 적어도 1:3, 적어도 1:5, 적어도 1:7, 적어도 1:10, 적어도 1:20, 적어도 1:30, 적어도 1:40, 적어도 1:50, 적어도 1:60, 적어도 1:70, 적어도 1:80, 적어도 1:90, 적어도 1:100, 적어도 1:200, 적어도 1:300, 적어도 1:400, 적어도 1:500, 적어도 600, 적어도 1:700, 적어도 1:800, 적어도 1:900, 또는 적어도 1:100의 변형된 실크 피브로인 대 비변형된 실크 피브로인의 몰 비를 포함한다.

일부 실시양태에서, 조성물은, 예를 들어, 최대 1000:1, 최대 900:1, 최대 800:1, 최대 700:1, 최대 600:1, 최대 500:1, 최대 400:1, 최대 300:1, 최대 200:1, 100:1, 최대 90:1, 최대 80:1, 최대 70:1, 최대 60:1, 최대 50:1, 최대 40:1, 최대 30:1, 최대 20:1, 최대 10:1, 최대 7:1, 최대 5:1, 최대 3:1, 최대 1:1, 최대 1:3, 최대 1:5, 최대 1:7, 최대 1:10, 최대 1:20, 최대 1:30, 최대 1:40, 최대 1:50, 최대 1:60, 최대 1:70, 최대 1:80, 최대 1:90, 최대 1:100, 최대 1:200, 최대 1:300, 최대 1:400, 최대 1:500, 최대 1:600, 최대 1:700, 최대 1:800, 최대 1:900, 또는 최대 1:1000의 변형된 실크 피브로인 대 비변형된 실크 피브로인의 몰 비를 포함한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들어, 약 1000:1 내지 약 1:1000, 약 900:1 내지 약 1:900, 약 800:1 내지 약 1:800, 약 700:1 내지 약 1:700, 약 600:1 내지 약 1:600, 약 500:1 내지 약 1:500, 약 400:1 내지 약 1:400, 약 300:1 내지 약 1:300, 약 200:1 내지 약 1:200, 약 100:1 내지 약 1:100, 약 90:1 내지 약 1:90, 약 80:1 내지 약 1:80, 약 70:1 내지 약 1:70, 약 60:1 내지 약 1:60, 약 50:1 내지 약 1:50, 약 40:1 내지 약 1:40, 약 30:1 내지 약 1:30, 약 20:1 내지 약 1:20, 약 10:1 내지 약 1:10, 약 7:1 내지 약 1:7, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 3:1 내지 약 1:3, 또는 약 1:1의 변형된 실크 피브로인 대 비변형된 실크 피브로인의 몰 비를 포함한다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 실질적으로 그의 원래 세리신 함량보다 결핍(예를 들어, 최종 추출된 실크 내의 5% (w/w) 이하 잔류 세리신)된다. 대안적으로, 추출 후에 더 농축된 잔류 세리신이 실크 위에 남거나 추출 단계가 생략될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세리신 결핍된 실크 피브로인은, 예를 들어, 약 1% (w/w) 잔류 세리신, 약 2% (w/w) 잔류 세리신, 약 3% (w/w) 잔류 세리신, 약 4% (w/w), 또는 약 5% (w/w) 잔류 세리신을 가진다. 일부 실시양태에서, 세리신-결핍된 실크 피브로인은, 예를 들어, 최대 1% (w/w) 잔류 세리신, 최대 2% (w/w) 잔류 세리신, 최대 3% (w/w) 잔류 세리신, 최대 4% (w/w), 또는 최대 5% (w/w) 잔류 세리신을 가진다. 일부 다른 실시양태에서, 세리신 결핍된 실크 피브로인은, 예를 들어, 약 1% (w/w) 내지 약 2% (w/w) 잔류 세리신, 약 1% (w/w) 내지 약 3% (w/w) 잔류 세리신, 약 1% (w/w) 내지 약 4% (w/w), 또는 약 1% (w/w) 내지 약 5% (w/w) 잔류 세리신을 가진다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인에는 그의 원래 세리신 함량이 완전히 유리된다. 본원에서 사용되는 용어 "완전히 유리" (즉 "구성된" 용어)는 것은 기기의 검출 범위 또는 사용된 과정 내에서, 물질이 검출될 수 없거나 그의 존재가 확인되지 않은 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인에는 원래 세리신 함량이 실질적으로 유리된다. 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 유리" (또는 "실질적으로 구성된")은 단지 미량의 물질이 검출될 수 있고, 검출되는 양 미만으로 존재하거나 없는 것을 의미한다.

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 제공된 실크 피브로인 조성물의 특성은 실크 세리신의 제어된 부분 제거 또는 공급원 실크에의 세리신의 의도된 농축에 의해 변형될 수 있다. 이것은 실크 정련 과정에서의 조건, 예컨대, 시간, 온도, 농도 등을 변형시키는 것에 의해 달성될 수 있다.

정련된 실크는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 통상의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 누에나방 고치는 소정의 시간 기간 동안 수용액 내에서 비등된다. 일반적으로, 더 긴 정련 시간은 저분자량 실크 피브로인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 누에고치는 적어도 60분, 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분, 적어도 110분, 적어도 120분, 또는 그 이상 동안 비등되어 저분자량 실크 피브로인 단편을 발생시킨다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 누에고치는 승온에서 가열되거나 비등될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약 101.0℃에서, 약 101.5℃에서, 약 102.0℃에서, 약 102.5℃에서, 약 103.0℃에서, 약 103.5℃에서, 약 104.0℃에서, 약 104.5℃에서, 약 105.0℃에서, 약 105.5℃에서, 약 106.0℃에서, 약 106.5℃에서, 약 107.0℃에서, 약 107.5℃에서, 약 108.0℃에서, 약 108.5℃에서, 약 109.0℃에서, 약 109.5℃에서, 약 110.0℃에서, 약 110.5℃에서, 약 111.0℃에서, 약 111.5℃에서, 약 112.0℃에서, 약 112.5℃에서, 약 113.0℃에서, 113.5℃에서, 약 114.0℃에서, 약 114.5℃에서, 약 115.0℃에서, 약 115.5℃에서, 약 116.0℃에서, 약 116.5℃에서, 약 117.0℃에서, 약 117.5℃에서, 약 118.0℃에서, 약 118.5℃에서, 약 119.0℃에서, 약 119.5℃에서, 약 120.0℃에서, 또는 그 초과에서 누에고치는 가열되거나 비등될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 승온은 압력 하에서 가열 과정 (예를 들어, 비등하는 과정)을 적어도 일부 수행하는 것에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명한 실크 피브로인 단편이 생성될 수 있는 적합한 압력은 전형적으로 약 10-40 psi 사이, 예를 들어, 약 11 psi, 약 12 psi, 약 13 psi, 약 14 psi, 약 15 psi, 약 16 psi, 약 17 psi, 약 18 psi, 약 19　psi, 약 20 psi, 약 21 psi, 약 22 psi, 약 23 psi, 약 24 psi, 약 25 psi, 약 26　psi, 약 27 psi, 약 28 psi, 약 29 psi, 약 30 psi, 약 31 psi, 약 32 psi, 약 33　psi, 약 34 psi, 약 35 psi, 약 36 psi, 약 37 psi, 약 38 psi, 약 39 psi, 또는 약 40 psi이다.

한 실시양태에서, 누에고치를 정련하는 과정에서 사용되는 수용액은 약 0.02M Na₂CO₃이다. 고치를 예를 들어 물로 세척하여 세리신 단백질을 추출한다. 정련된 실크는 실크 분말을 제조하기 위해 건조되고 사용될 수 있다. 대안적으로, 추출된 실크는 수성 염 용액에 용해될 수 있다. 이 목적을 위해 유용한 염으로는 브로민화리튬, 리튬 티오시아네이트, 질산칼슘 또는 실크를 용해할 수 있는 다른 화학물질을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 추출된 실크는 약 8M -12M LiBr 용액에 용해될 수 있다. 염은 예를 들면, 투석을 사용하여 결과적으로 제거된다.

필요하다면, 그 후 용액은 예를 들어, 흡습성 중합체, 예를 들어, PEG, a 폴리에틸렌 옥시드, 아밀로스 또는 세리신에 대한 투석을 사용하여 농축될 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG는 분자량 8,000-10,000 g/mol이고 약 10% 내지 약 50% (w/v)의 농도를 가진다. 슬라이드-에이-라이저(Slide-a-Lyzer) 투석 카세트 (피어스(Pierce), MW CO 3500)가 사용될 수 있다. 그러나, 임의의 투석 시스템이 사요될 수 있다. 투석은 약 10% 내지 약 30%의 수성 실크 용액 최종 농도가 얻어지기에 충분한 시간 주기 동안 수행될 수 있다. 대부분의 경우에서, 2 - 12시간의 투석은 충분할 수 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2005/012606을 참조한다.

농축된 실크 용액을 생성하는 또 다른 방법은 묽은 실크 용액을 건조시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 증발 또는 동결건조를 통해). 묽은 용액은 부분적으로 건조되어 부피가 감소되어 이에 의해 실크 농도가 증가할 수 있다. 묽은 용액은 완전히 건조된 후 건조된 실크 피브로인을 묽은 실크 용액에 비교하여 더 적은 부피의 용매에 용해시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 임의로, 적합한 지점에서, 여과 및/또는 원심분리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 임의로 여과 및/또는 원심분리된 후에 가열 또는 비등하는 단계를 거칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 임의로 여과 및/또는 원심분리 된 다음에 투석 단계를 거칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 임의로 여과 및/또는 원심분리 된 다음 농도 조절 단계를 거칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 임의로 여과 및/또는 원심분리 된 다음 재구성 단계를 거칠 수 있다. 임의의 이러한 실시양태에서, 여과 및/또는 원심분리 단계(들)은 불용성 물질을 제거하기 위해 수행될 수 있다. 임의의 이러한 실시양태에서, 여과 및/또는 원심분리 단계(들)은 선택적으로 특정 분자량의 실크 피브로인 단편(들)의 농도를 진하게 하기 위하여 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 유기 용매를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 방법이, 예를 들어, 그의 모든 내용이 본원에 참조로서 포함된 문헌 [Li, M., et al., J. Appl. Poly Sci. 2001, 79, 2192-2199]; [Min, S., et al. Sen'I Gakkaishi 1997, 54, 85-92]; [Nazarov, R. et al., Biomacromolecules 2004 5,718-26]에 설명되어 왔다. 실크 용액을 생산하는데 사용될 수 있는 예시적인 유기 용매로는 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP)을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 국제 출원 번호 WO2004/000915을 참조한다. 일부 실시양태에서, 실크 용액은 유기 용매로부터 완전히 유리 또는 실질적으로 유리된다; 일부 실시양태에서 이는 물 외의 다른 용매로부터 실질적으로 유리된다.

본원에서 개시된 실크 피브로인 조성물은 임의의 실크 피브로인 대 조성물의 총 부피/중량의 양/비를 포함할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 실크 피브로인 조성물 (예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물 및/또는 안정화 조성물)을 만드는데 사용된 용액 내의 실크 피브로인의 양, 그 자체는 변화되어서 실크 피브로인 조성물의 특성을 변화시킬 수 있다. 일반적으로, 임의의 양의 실크 피브로인이 실크 피브로인 조성물을 만드는데 사용된 용액에 존재할 수 있다. 예를 들어, 용액 내의 실크 피브로인의 양은 약 0.1% (w/v) 내지 약 90% (w/v)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용액 내의 실크 피브로인의 양은 약 1% (w/v) 내지 약 75% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 70% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 65% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 60% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 55% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 50% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 35% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 30% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 20% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 15% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 약 5% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 약 5% (w/v) 내지 약 20% (w/v), 약 5% (w/v) 내지 약 15% (w/v)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용액 중의 실크 피브로인은 약 25% (w/v)이다. 일부 실시양태에서, 용액 중의 실크 피브로인은 약 0.5 (w/v) 내지 약 30% (w/v), 약 4% (w/v) 내지 약 16% (w/v), 약 4% (w/v) 내지 약 14% (w/v), 약 4% (w/v) 내지 약 12% (w/v), 약 4% (w/v) 내지 약 0% (w/v), 약 6% (w/v) 내지 약 8% (w/v)이다. 실크 용액 중의 실크의 정확한 양은 공지된 양의 실크 용액을 건조하고 남은 것의 질량을 측정하여 용액 농도를 계산하여 결정될 수 있다.

제공된 조성물 또는 물품 (예를 들어, 저분자량 실크 조성물 및/또는 안정화 조성물 내의) 중의 실크 피브로인의 양은 약 1% (w/v) 내지 약 90% (w/v)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물 중의 실크 피브로인의 양은 약 0.1% (w/v) 내지 약 75% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 70% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 65% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 60% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 55% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 50% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 45% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 40% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 35% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 30% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 20% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 15% (w/v), 약 1% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 약 5% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 약 5% (w/v) 내지 약 20% (w/v), 약 5% (w/v) 내지 약 15% (w/v)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물 내의 실크 피브로인은 약 25% (w/v)이다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물 중의 실크는 약 0.5 (w/v) 내지 약 30% (w/v), 약 2% (w/v) 내지 약 8% (w/v), 약 2% (w/v) 내지 약 7% (w/v), 약 2% (w/v) 내지 약 6% (w/v), 약 2% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 약 3% (w/v) 내지 약 4% (w/v)이다.

일부 실시양태에서, 용액은 약 0.25% 내지 약 50% (w/v) 또는 약 0.5% 내지 약 15% (w/v), 또는 약 0.5% 내지 약 10% (w/v)의 실크 피브로인 농도를 가진다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 약 10% 내지 약 40% 또는 15% 내지 약 35% (w/v)의 실크 피브로인 농도를 가진다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 약 20% 내지 약 30% (w/v)의 실크 피브로인 농도를 가진다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 약 30% (w/v)의 실크 피브로인 농도를 가진다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 약 0.1% 내지 약 30% (w/v), 약 0.5% 내지 약 15% (w/v), 약 1% 내지 약 8% (w/v), 또는 약 1.5% 내지 약 5% (w/v)의 실크 피브로인 농도를 가진다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 약 5% 내지 약 30% (w/v), 약 10% 내지 약 25% (w/v), 또는 약 15 내지 약 20% (w/v)의 실크 피브로인 농도를 가진다. 일부 실시양태에서, 실크 용액은 약 0.5% 내지 10% (w/v)의 실크 피브로인 농도를 가진다.

일부 실시양태에서의 적용에 따라, 제공된 조성물에서 실크 피브로인 내에 입체형태 변화가 유발되어 실크 피브로인 조성물/물품의 용해도가 제어될 수 있다. 일부 실시양태에서, 입체형태 변화는 실크 피브로인을 적어도 부분적으로 불용성이 되도록 유도할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 유도된 입체형태 변화는 실크 피브로인의 결정성, 예를 들어 실크 II 베타-시트 결정성을 변화시킨다. 입체형태 변화는, 알콜 침지(예컨대 에탄올, 메탄올), 수 어닐링, 전단 응력, 초음파(예를 들어 초음파 처리), pH 감소(예를 들어 pH 적정 및/또는 전기장으로의 노출) 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 입체형태 변화는 저속 건조(문헌 [Lu et al., Biomacromolecules 2009, 10, 1032]); 수 어닐링(문헌 [Jin et al., 15 Adv. Funct. Mats. 2005, 15, 1241], [Hu et al., Biomacromolecules 2011, 12, 1686)]; 연신(문헌 [Demura & Asakura, Biotech & Bioengin. 1989, 33, 598]); 가압; 메탄올(문헌 [Hofmann et al., J Control Release. 2006, 111, 219]), 에탄올(문헌 [Miyairi et al., J. Fermen. Tech. 1978, 56, 303]), 글루타르알데히드(문헌 [Acharya et al., Biotechnol J. 2008, 3, 226]), 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)(문헌 [Bayraktar et al., Eur J Pharm Biopharm. 2005, 60, 373])을 포함하는 용매 침지; pH 조정, 예를 들어 pH 적정 및/또는 전기장으로의 노출(예를 들어 미국 특허출원 US2011/0171239호 참조); 열처리; 전단 응력(예를 들어 국제출원 WO2011/005381호 참조), 초음파, 예를 들어 초음파 처리(예를 들어 미국 특허출원 공개 U.S. 2010/0178304호 및 국제 출원 WO2008/150861호 참조); 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 방법으로 유도될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 모든 참고 문헌의 내용은 그의 전체가 참조로 본원에 포함된다.

일부 실시양태에서, 물질은 어닐링에 의해 처리될 수 있다. 본원에서 사용된 어닐링 과정은 실크 피브로인 내의 베타-시트 2차 구조의 형성의 유도를 포함한다. 이는 실크 피브로인의 향상된 비-공유 상호작용에 기인한 것일 수 있다. 이러한 비-공유 상호작용은 분자내 상호작용, 분자간 상호작용, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. 전형적으로, 비-공유 상호작용은 향상된 베타 시트 형성을 유도하는 수소 결합에 의해 조정될 수 있다. 베타 시트 2차 구조의 특정 임계 수준에 도달하면, 실크 피브로인은 예를 들어 수성 환경에 불용성이 된다. 이러한 현상은 일반적으로 결정화도로 지칭되며, 이러한 실크 피브로인의 상태는 실크 II로 지칭된다. 따라서, "어닐링"은 실크 피브로인의 베타-시트 우세(실크 II) 입체형태로의 입체형태 변화를 포함하며, 이에 따라 실크 피브로인은 결정화되고 이에 따라 불용성이다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 입체형태 변화는 실크 피브로인의 보다 높은 베타 시트 함량으로의 수소-결합 및/또는 소수성 상호작용으로 조정된 구조 변화에 기인한 것으로 생각된다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인의 입체형태는 수 어닐링에 의해 변화될 수 있다. 수 어닐링에는 많은 상이한 방법이 있다. 수 어닐링의 한 방법은 고화되었지만 가용성인 형태의 실크 피브로인을 수증기로 처리하는 것을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 물 분자는 가소제로서 작용함으로써 피브로인 분자의 쇄 운동성을 가능하게 하여 수소 결합의 형성을 촉진하여, 향상된 베타 시트 2차 구조를 유도하는 것으로 생각된다. 이러한 과정은 본원에서 또한 "수증기 어닐링"으로도 지칭된다.

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 물리적 온도-조절된 수증기 어닐링(TCWVA)은 실크 생물질의 분자 구조의 개선된 조절을 얻는 단순하고 효과적인 방법을 제공하는 것으로 생각된다. 실크 물질은 4℃에서의 조건을 이용한 낮은 베타-시트 함량으로부터(α헬릭스 우세 실크 I 구조) 100℃에서 약 60% 결정화도의 보다 높은 베타-시트 함량으로(β-시트 우세 실크 II 구조) 결정화도를 조절하여 제조할 수 있다. 이러한 물리적 접근법은 실크 물질의 제작 도중 결정화를 지배하는 것으로 이미 보고된 구조의 범위를 포함하지만, 재현성을 정밀하게 조절하면서 보다 간단한 녹색 화학 접근법을 제공한다. 수 어닐링 또는 수증기 어닐링은 예를 들어 PCT 출원번호 PCT/US2004/011199(출원일: 2004년 4월 12일) 및 동 PCT/US2005/020844호(출원일: 2005년 6월 13일); 및 문헌 [Jin et al., Adv. Funct. Mats. 2005, 15: 1241] 및 [Hu et al., Biomacromolecules, 2011, 12(5): 1686-1696]에 기술되어 있으며, 이들 모두의 내용은 그의 전체가 본원에 참조로 포함된다.

어닐링의 또 다른 방식은 실크 물질/매트릭스 내 실크 피브로인으로부터의 물의 느리고 조절된 증발에 의한 것이다. 느리고 조절된 건조는 예를 들어 문헌 [Lu et al., Acta. Biomater. 2010, 6(4): 1380-1387]에 기술되어 있다.

어닐링 단계는 예컨대 수증기로 채워진 챔버 내와 같은 수증기 환경 내에서 상이한 시간의 기간 동안 수행될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 어닐링 길이는 실크-기재 물질 내 실크 피브로인에서 얻어지는 베타-시트 결정화도의 양에 영향을 준다. 따라서, 전형적인 어닐링 기간은 수 초 내지 수 일 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 어닐링은 수 초 내지 수 시간의 기간 동안 행해진다. 예를 들어, 어닐링 시간은 수 초(예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60초) 내지 약 2, 6, 12, 24, 36, 또는 48시간의 범위일 수 있다.

어닐링 과정에서 사용되는 수증기의 온도는 얻어지는 베타-시트 결정화도의 양에 영향을 준다(문헌 [HU et al., Biomacromolecules, 12: 1686-1696] 참조). 따라서, 어닐링은 임의의 목적 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 어닐링은 약 4℃ 내지 약 120℃의 수증기 온도에서 수행될 수 있다. 실크-기재 물질 중 실크 피브로인 내 요구되는 양의 베타-시트 결정화도를 얻기 위한 최적의 수증기는 하기 방정식 (I)에 따라 계산할 수 있다.

C=a(1-exp(-kT)) (I)

(여기서, C는 베타-시트 결정화도이고, a는 62.59이고, k는 0.028이고, T는 어닐링 온도이다; 문헌 [HU et al., Biomacromolecules, 12: 1686-1696] 참조).

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 어닐링이 일어나는 압력은 또한 베타-시트 결정화도의 정도 또는 양에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 접촉은 진공 환경 하에 수행될 수 있다.

어닐링이 일어나는 상대 습도 또한 베타-시트 결정화도의 정도 또는 양에 영향을 줄 수 있다. 실크-기재 물질이 물 또는 수증기와 접촉하는 상대 습도는 약 5% 내지 100% 범위일 수 있다. 예를 들어, 상대 습도는 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 또는 약 15% 내지 약 85%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상대 습도는 90% 이상이다.

실크 피브로인을 어닐링하는 또 다른 유용한 방법은 유기 용매, 예컨대 알콜, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 이소프로필, 아세톤 등을 사용하여 실크-기재 물질을 탈수시키는 것이다. 이러한 용매는 실크 피브로인을 탈수시키는 효과를 갖고, 이는 실크 피브로인 분자의 베타 시트 구조로의 "조밀화"를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 알콜, 예를 들어 메탄올, 에탄올 등으로 처리될 수 있다. 알콜 농도는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 알콜 농도는 약 90%이다.

따라서, 일부 실시양태에서, 실크 피브로인의 입체형태의 변화는 알콜, 예를 들어 메탄올, 에탄올 등에 침지시킴으로써 유도될 수 있다. 알콜 농도는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 알콜 농도는 100%이다. 입체형태의 변화가 용매 중 침지에 의한 것인 경우, 실크 조성물은 예를 들어 용매/물 구배에 의해 세척되어, 침지에 사용된 임의의 잔류 용매를 제거할 수 있다. 세척은 반복 세척일 수 있고, 예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 보다 많은 횟수일 수 있다.

대안적으로, 실크 피브로인의 입체형태의 변화는 전단 응력으로 유도될 수 있다. 전단 응력은 예를 들어 실크 조성물을 바늘을 통해 통과시킴으로써 적용될 수 있다. 입체형태 변화를 유도하는 다른 방법은 전기장 인가, 압력 인가, 또는 염 농도 변화를 포함한다.

입체형태 변화를 유도하기 위한 처리 시간은 목적하는 실크 II(베타-시트 결정화도) 함량을 제공하는 임의 시간의 기간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 처리 시간은 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 5시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 또는 약 1시간 내지 약 3시간의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 소결 시간은 약 2시간 내지 약 4시간 또는 2.5시간 내지 약 3.5시간의 범위일 수 있다.

입체형태 변화의 유도가 용매 침지에 의한 것인 경우, 처리 시간은 수 분 내지 수 시간의 범위일 수 있다. 예를 들어, 용매 중 침지는 적어도 약 15분, 적어도 약 30분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 3시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 또는 적어도 약 14일의 기간 동안일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용매 중 침지는 약 12시간 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 2 내지 약 5일, 또는 약 3 내지 약 4일의 기간 동안일 수 있다.

입체형태 변화를 유도하기 위한 처리 후, 실크 피브로인은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%이지만 100%(즉, 모든 실크가 실크 II 베타-시트 입체형태로 존재)는 아닌 실크 II 베타-시트 결정화도 함량을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질 내 실크 피브로인은 적어도 10%, 예를 들어, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 70%, 85%, 90%, 95% 이상이지만 100%는 아닌(즉, 모든 실크 피브로인이 베타-시트 입체형태로 존재하는 것은 아님) 베타-시트 결정화도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 실크는 완전히 실크 II 베타-시트 입체형태, 즉 100% 실크 II 베타-시트 결정화도로 존재한다.

채용된 어닐링 방법과 관계 없이, 어닐링 과정의 최종 결과는 흔히 어닐링된 실크 피브로인이 높은 결정화도를 가져서 불용성이 되는 것이다. 일부 실시양태에서, "높은 결정화도"는 약 20% 내지 약 70%, 예를 들어, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65% 및 약 75%의 베타 시트 함량을 지칭한다.

일부 실시양태에서, 어닐링 과정은 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%이지만 100%(즉, 모든 실크가 실크 II 베타-시트 입체형태로 존재)는 아닌 실크 II 베타-시트 결정화도 함량을 포함할 수 있는 실크-기재 물질을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 100%의 실크 II 베타-시트 결정화도를 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 제공된 실크 피브로인 조성물 중 실크 피브로인은 실질적으로 β-턴 및 β-가닥 영역을 포함하는 단백질 구조를 갖는다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 실크 β 시트 함량은 조성물의 겔 기능 및 생체내 수명에 영향을 줄 수 있다. 비-β 시트 함량을 포함하는 조성물(예를 들어, e-겔) 또한 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이들 실시양태의 측면에서, 제공된 조성물 중 실크 피브로인은 예를 들어 약 5% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 10% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 20% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 30% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 40% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 50% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 60% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 70% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 80% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 90% β-턴 및 β-가닥 영역, 또는 약 100% β-턴 및 β-가닥 영역을 포함하는 단백질 구조를 갖는다. 상기 실시양태의 다른 측면에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물 중 실크 피브로인은 예를 들어 적어도 10% β-턴 및 β-가닥 영역, 적어도 20% β-턴 및 β-가닥 영역, 적어도 30% β-턴 및 β-가닥 영역, 적어도 40% β-턴 및 β-가닥 영역, 적어도 50% β-턴 및 β-가닥 영역, 적어도 60% β-턴 및 β-가닥 영역, 적어도 70% β-턴 및 β-가닥 영역, 적어도 80% β-턴 및 β-가닥 영역, 적어도 90% β-턴 및 β-가닥 영역, 또는 적어도 95% β-턴 및 β-가닥 영역을 포함하는 단백질 구조를 갖는다. 이들 실시양태의 또 다른 측면에서, 저분자량 실크 피브로인 조성물 중 실크 피브로인은 예를 들어 약 10% 내지 약 30% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 20% 내지 약 40% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 30% 내지 약 50% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 40% 내지 약 60% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 50% 내지 약 70% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 60% 내지 약 80% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 70% 내지 약 90% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 80% 내지 약 100% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 10% 내지 약 40% β-턴 β-가닥 영역, 약 30% 내지 약 60% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 50% 내지 약 80% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 70% 내지 약 100% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 40% 내지 약 80% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 50% 내지 약 90% β-턴 및 β-가닥 영역, 약 60% 내지 약 100% β-턴 및 β-가닥 영역, 또는 약 50% 내지 약 100% β-턴 및 β-가닥 영역을 포함하는 단백질 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 10% 미만 내지 약 55%의 실크 β 시트 함량이 본원에 개시된 실크 피브로인 조성물에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 실크 피브로인 조성물 중 실크 피브로인은 실질적으로 α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역을 갖지 않는 단백질 구조를 갖는다. 이들 실시양태의 측면에서, 실크 피브로인은 예를 들어, 약 5% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 10% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 15% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 20% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 25% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 30% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 35% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 40% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 45% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 또는 약 50% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역을 포함하는 단백질 구조를 갖는다. 이들 실시양태의 다른 측면에서, 실크 피브로인은 예를 들어 최대 5% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 최대 10% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 최대 15% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 최대 20% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 최대 25% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 최대 30% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 최대 35% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 최대 40% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 최대 45% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 또는 최대 50% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역을 포함하는 단백질 구조를 갖는다. 이들 실시양태의 또 다른 측면에서, 실크 피브로인은 예를 들어 약 5% 내지 약 10% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 5% 내지 약 15% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 5% 내지 약 20% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 5% 내지 약 25% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 5% 내지 약 30% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 5% 내지 약 40% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 5% 내지 약 50% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 10% 내지 약 20% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 10% 내지 약 30% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 15% 내지 약 25% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 약 15% 내지 약 30% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역, 또는 약 15% 내지 약 35% α-헬릭스 및 랜덤 코일 영역을 포함하는 단백질 구조를 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 실크 피브로인 물품 또는 제조 물품의 하나 이상의 특성의 변경 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 방법은 실크 피브로인 물품 또는 제조 물품 중 저분자량 실크 중 다양한 실크 피브로인 단편의 중량비를 변화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa의 제1 소정 범위 내의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편의 중량비를 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa의 제2 소정 범위 내의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편으로 변화시키는 것을 포함한다(여기서 제1 및 제2 소정 범위는 중첩되지 않는다). 일부 실시양태에서, 상기 방법은 200 kDa 초과의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편의 중량비를 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa의 소정 범위 내의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편으로 변화시키는 것을 포함한다.

제한 없이, 본원에 기술된 방법을 이용하여 변경될 수 있는 특성은, 물품 내 존재하는 제제의 방출 속도, 물품 내 존재하는 제제의 방출 동역학, 재용해성, 분해, 기계적 특성, 광학적 특성, 기공률, 세공 크기, 점도, 생체 적합성, 생체 재흡수성, 물품의 알짜 전하, 입자 크기, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 실크 입자의 크기를 조절하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 용액 중 저분자량 실크의 다양한 실크 피브로인 단편의 중량비를 변화시키고 용액으로부터 실크 입자를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa의 제1 소정 범위 내의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편의 중량비를 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa의 제2 소정 범위 내의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편으로 변화시키는 것을 포함한다(여기서 제1 및 제2 소정 범위는 중첩되지 않는다). 일부 실시양태에서, 상기 방법은 200 kDa 초과의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편의 중량비를 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa의 소정 범위 내의 중량비를 갖는 실크 피브로인 단편으로 변화시키는 것을 포함한다. 실크 입자의 제조 방법은 예를 들어 국제출원 WO2011/041395호; 국제출원공개 WO2008/118133호; 미국 출원 공개 US2010/0028451호; 미국 가출원 일련 번호 61/719,146(출원일: 2012년 10월 26일); 및 문헌 [Wenk et al. J Control Release, 2008; 132: 26-34]에 기재되어 있으며, 이들 모두의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

본원에 기재된 모든 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 단편은 전장 실크 피브로인 폴리펩티드의 부분 또는 부분들로부터 유도될 수 있으며, 이에 따라 저분자량 실크 피브로인의 아미노산 서열은 집합적으로 100% 미만의 전장 실크 피브로인 폴리펩티드를 나타낸다. 예를 들어, 하나 이상의 재조합적으로 생성된 실크 피브로인 폴리펩티드는 본원에 기술된 임의의 측면의 일부 실시양태를 수행하는 데 사용될 수 있다. 이러한 재조합 실크 피브로인 폴리펩티드는 전장 카운터파트의 단편 또는 단편들을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전장 카운터파트의 단편 또는 단편들에 상응하는 실크 피브로인 폴리펩티드가, 그러한 단편을 제조하도록 트랜스진을 보유한 트랜스제닉 유기체로부터 생성될 수 있다.

본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 저분자량 실크 피브로인 단편은 하나 이상의 실크 피브로인의 자연 발생(예를 들어, 야생형) 서열에 비해 하나 이상의 돌연변이 및/또는 변형을 포함할 수 있다. 실크 피브로인 단편의 이러한 돌연변이 및/또는 변형은 자연적으로 발생하거나 설계에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 단편 중 이러한 돌연변이 및/또는 변형은 재조합 기술, 화학적 변형 등을 이용하여 도입될 수 있다.

실크 피브로인은 베타-시트 2차 구조를 취할 수 있는 아미노산 서열의 부분 또는 부분들을 갖는 폴리펩티드의 예이다. 예를 들어, 실크 피브로인 구조는 일반적으로 서열의 부분 또는 부분들이 일반적으로 글리신 및 알라닌이 교호하거나 또는 알라닌 단독을 특징으로 하는 아미노산의 서열을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 배위는 피브로인 분자가 베타-시트 입체형태로 자가 조립되는 것을 허용한다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본원에는 글리신 및 알라닌이 교호하거나 알라닌 단독을 특징으로 하는 아미노산 서열의 부분 또는 부분들을 갖고 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa 범위의 분자량 범위를 갖는 폴리펩티드 단편의 집단을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은, 집단 중 폴리펩티드 단편의 총 수의 15% 이하가 200 kDa 초과의 분자량을 갖고, 집단 중 폴리펩티드 단편의 총 수의 50% 이상이 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa의 소정 범위 내의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법 중 실크 피브로인은 베타 시트 구조를 포함하거나 아미노산 서열에 기초하여 그러한 구조를 형성하는 경향을 갖는 다른 비-실크 폴리펩티드로 대체되거나 그와 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본원에는 베타-시트 형성 폴리펩티드 단편의 집단을 포함하는 폴리펩티드 조성물이 또한 포함되어 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 베타-시트 형성 폴리펩티드 단편의 집단은 넓은 범위의 분자량을 가질 수 있고, 집단 중 베타-시트 형성 폴리펩티드 단편의 총 수의 15% 이하의 분자량이 200 kDa 초과이고, 집단 중 베타-시트 형성 폴리펩티드 단편의 총 수의 50% 이상이 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa의 소정 범위 내의 분자량을 갖는다.

본원에 사용된 용어 "베타-시트 형성 폴리펩티드"는 베타-시트 2차 구조를 취하는 아미노산 서열의 부분 또는 부분들을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 베타 시트 구조 또는 아미노산 서열에 기초하여 그러한 구조를 형성하는 경향을 갖는 것에 기초하여 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 친양쪽성 특성을 가질 수 있다(즉, 친수성 및 소수성 부분 둘 다를 가짐). 친양쪽성 폴리펩티드는 단일 공급원(예를 들어, 자연 발생 단백질)으로부터 수득될 수 있으며, 폴리펩티드 내에 소수성 모듈 또는 스트레치 및 친수성 모듈 또는 스트레치 양쪽 모두를 가짐으로써, 단일 폴리펩티드 자체가 고유하게 친양쪽성이다. 일부 실시양태에서, 소수성 모듈 또는 스트레치 및 친수성 모듈 또는 스트레치는 서로 융합 또는 커플링되어 친양쪽성 독립체를 형성할 수 있다. 이러한 "융합" 또는 "키메라" 폴리펩티드는 재조합 기술, 화학적 커플링, 또는 이들 둘 다를 이용하여 생성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 다음의 목록: 피브로인, 액틴, 콜라겐, 카테닌, 키토산, 클라우딘, 콜린, 엘라스틴, 엘라우닌, 익스텐신, 피브릴린, 라민, 라미닌, 케라틴, 튜블린, 바이러스성 구조 단백질, 제인 단백질(종자 저장 단백질) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 부분 또는 부분들을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 천연 공급원으로부터의 재생된(예를 들어, 정제된) 단백질, 이종 시스템에서 생성된 재조합 단백질, 합성 또는 화학적으로 생성된 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 베타-시트 형성 폴리펩티드는 상기 제공된 리스트 중 어느 하나에 상응하는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 부분 또는 부분들을 포함할 수 있고, 천연형 또는 야생형의 카운터파트에 비해 하나 이상의 서열 변이를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 야생형 서열에 비해 적어도 85%의 전체 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 전체 서열 동일성을 나타낼 수 있다..

특정의 예시적인 제조 방법

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 최종 목적 형상으로 처리하기 전에 열 또는 고압으로 처리함으로써, 실크 피브로인을 포함하는 물품의 형성에 관련된 다수의 문제를 감소시키거나 제한할 수 있다. 이는 상당한 버블, 수축, 및 변형 없이 일정한 기하구조를 갖는 물품을 제조하는 능력을 제공한다. 이는 시험 및 임플란트를 위해 일정한 샘플을 재현 가능하게 제공한다. 게다가, 물품을 기계처리할 수 있으며, 이는 생물학적 기하구조의 정확한 복제, 예를 들어 컴퓨터 수치 제어(CNC) 밀링하여 목적 구축물로 실크 블랭크를 기계처리할 수 있다. 최종의 목적 형상으로 실크 피브로인 물품을 처리하기 전 열 또는 고압으로 처리하는 것을 포함하는 방법은 예를 들어 미국 가출원 61/808,768호(출원일: 2013년 4월 5일), 동 61/719,146호(출원일: 2012년 10월 26일), 동 61/809,535호(출원일: 2013년 4월 8일), 및 동 61/881,653호(출원일: 2013년 9월 24일)에 기재되어 있으며, 이들 모두의 내용은 본원에 그의 전체가 참조로 포함된다.

따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 실크 피브로인 물품의 제조 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 승온 및/또는 승압 하에 실크 피브로인 조성물(예를 들어, 저분자량 실크 피브로인 조성물)을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 조성물 중 실크 피브로인은 적어도 부분적으로 불용성 상태일 수 있다. 인큐베이션 후, 조성물을 목적하는 최종 형상으로 처리할 수 있다. 제한 없이, 제조 물품을 제조하기 위한 실크 피브로인 조성물은 용액, 슬러리, 현탁액, 콜로이드, 혼합물, 분산액, 페이스트 등의 형태일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "불용성 상태"는 실크 피브로인에 관하여 사용된 경우 실질적으로 무정형인, 1차 베타-시트 입체형태의 형상 또는 상태를 지칭한다. 용어 "불용성 상태로 형성"은 실크 단량체의 실크 중합체로의 중합을 나타내도록 의도되지 않는다. 그보다는, 가용성 실크 피브로인의 수용성 상태로의 전환을 나타내도록 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 실크 피브로인이 원심분리에 의해 펠렛화될 수 있거나 37℃ 이하에서 물에 침지 또는 물에 의한 세정에 의해 용해되지 않는 경우 실크 피브로인은 "불용성 상태"이다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물은 유기 용매를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 유기 용매는 헥사플루오로이소프로판올(HFIP)일 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물은 유기 용매를 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않으며, 즉 물 외의 용매는 함유하지 않는다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 실크 피브로인 조성물 중 유기 용매는 조성물의 보다 균일한 건조를 가능하게 하여 최종 실크 피브로인 제조 물품에 보다 균일한 기계적 및 구조적 특성을 유도한다. 또한, 유기 용매의 사용은 최종 형상으로 처리하기 위한 더 나은 기계적 및 구조적 특성 또한 제공한다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 실크 피브로인이 적어도 부분적으로 불용성 상태인 실크 피브로인을 제공하고; (ii) 조성물을 승온 및/또는 승압 하에 인큐베이션하고; (iii) 임의로 단계 (ii)를 반복하고; (iv) 조성물을 목적 형상으로 처리하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "인큐베이션"은 조성물을 승온 및/또는 승압시키는 것을 의미한다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물은 금형 내이다. 본원에 사용된 용어 "금형"은 실크 피브로인 조성물을 성형, 유지 또는 지지할 수 있는 임의의 금형, 용기 또는 기재를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 가장 단순한 형태의 금형은 단지 지지 표면을 포함할 수 있다. 금형은 임의의 목적 형상일 수 있으며, 중합체(예컨대 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌), 금속(예컨대 스테인레스 스틸, 티타늄, 코발트 크롬), 세라믹(예컨대 알루미나, 지르코니아), 유리 세라믹, 및 유리(예컨대 보로실리케이트 유리)를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 금형은 단순한 기하구조의 스캐폴드를 제공할 수 있고, 이는 최종 목적 형상으로 처리될 수 있고, 즉 금형은 최종 형상으로 처리될 수 있는 블랭크를 제공하는 데 사용될 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 조성물 중 실크 피브로인이 적어도 부분적으로 불용성 상태인 실크 피브로인 조성물을 포함하는 금형을 제공하고; (ii) 조성물을 승온 또는 가압 하에 인큐베이션하고; (iii) 임의로 단계 (ii)를 1회 이상 반복하고; (iv) 조성물을 목적 형상으로 처리하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물을 포함하는 금형을 제공하는 단계는 실크 피브로인을 포함하는 용액을 금형으로 이송하여 실크 피브로인 중 입체형태 변화를 유도하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "승온"은 실온보다 높은 온도를 의미한다. 일반적으로, 승온은 약 25℃ 초과의 온도이다. 예를 들어, 승온은 약 30℃ 이상, 약 35℃ 이상, 약 40℃ 이상, 약 45℃ 이상, 약 50℃ 이상, 약 55℃ 이상, 약 60℃ 이상, 약 65℃ 이상, 약 70℃ 이상, 약 75℃ 이상, 약 80℃ 이상, 약 85℃ 이상, 약 90℃ 이상, 약 95℃ 이상, 약 100℃ 이상, 약 105℃ 이상, 약 110℃ 이상, 약 115℃ 이상, 약 120℃ 이상, 약 125℃ 이상, 약 130℃ 이상, 약 135℃ 이상, 약 140℃ 이상, 약 145℃ 이상, 또는 약 150℃ 이상의 온도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 승온은 약 121℃ 이상이다.

본원에서 사용된 용어 "승압"은 약 0.05 bar, 약 0.1 bar, 약 0.15 bar, 약 0.2 bar, 약 0.25 bar, 약 0.3 bar, 약 0.35 bar, 약 0.4 bar, 약 0.45 bar, 약 0.5 bar, 약 0.55 bar, 약 0.6 bar, 약 0.65 bar, 약 0.7 bar, 약 0.75 bar 이상의 압력을 의미한다. 예를 들어, 승압은 약 1 bar, 1.25 bar, 1.5 bar, 1.75 bar, 2 bar, 2.25 bar, 2.5 bar, 2.75 bar, 3 bar, 3.25 bar, 3.5 bar, 3.75 bar, 4 bar, 4.25 bar, 4.5 bar, 4.75 bar, 5 bar, 5.25 bar, 5.5 bar, 5.75 bar, 6 bar, 7.25 bar, 7.5 bar, 7.75 bar, 8 bar, 8.25 bar, 8.5 bar, 8.75 bar, 9 bar, 9.25 bar, 9.5 bar, 9.75 bar, 10 bar, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 승압은 약 1 bar 이상이다. 일부 실시양태에서, 상기 인큐베이션은 진공 하이다.

일부 실시양태에서, 상기 인큐베이션은 수증기의 존재 하이다.

제한 없이, 인큐베이션은 임의의 목적 시간의 기간일 수 있다. 예를 들어, 인큐베이션은 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 6분, 약 7분, 약 8분, 약 8분, 약 10분 이상의 기간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 약 10분 내지 약 5시간, 약 15분 내지 약 2.5시간, 약 20분 내지 약 2시간, 약 25분 내지 약 1.5시간의 기간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 인큐베이션은 약 25분 동안이다.

다수의 제조 물품의 특성(예를 들어, 강도,분자량, 분해 프로파일, 팽윤성, 밀도, 색 등)을 인큐베이션 단계를 반복함으로써 조절할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계는 반복된 것일 수 있고, 예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그보다 많은 횟수일 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물은 인큐베이션 단계를 반복하기 전에 임의로 건조될 수 있다. 제한 없이, 건조는 임의의 목적 시간의 기간일 수 있다. 예를 들어, 건조는 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분 또는 그 이상의 기간 동안일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 약 5분 내지 약 5시간, 약 10분 내지 약 2.5시간, 약 15분 내지 약 2시간, 약 20분 내지 약 1.5시간의 기간 동안일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 건조는 약 15분 동안일 수 있다. 또한, 상기 건조는 실온 또는 승온 하일 수 있다. 예를 들어, 이러한 건조는 약 4℃ 내지 약 100℃, 약 10℃ 내지 약 95℃, 약 15℃ 내지 약 90℃, 약 20℃ 내지 약 85℃, 약 25℃ 내지 약 80℃, 약 30℃ 내지 약 75℃, 약 35℃ 내지 약 60℃, 또는 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도에서일 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 인큐베이션은 오토클레이빙을 포함한다. "오토클레이빙"은 초대기압에서 수증기(예를 들어 포화 스팀)의 존재 또는 부재 하에서의 열처리를 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 오토클레이빙이라는 용어는 충분한 압력 하에 충분한 기간 동안 조성물의 온도를 상승시키는 과정을 나타낸다. 일반적으로, 오토클레이빙은 이하의 파라미터: 120℃ 이상으로 15분 이상의 기간 동안 가압 하에 가열을 특징으로 하는 표준화 열적 가열 절차에 관한다. 오토클레이빙 온도는 120 내지 150℃, 보다 바람직하게는 120 내지 140℃의 범위일 수 있고; 압력은 1 내지 20 bar, 보다 바람직하게는 1 내지 10 bar, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 bar의 범위일 수 있다. 필요 시간은 15 내지 120분, 보다 바람직하게는 15 내지 60분의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 오토클레이빙은 반복된 것일 수 있으며, 예를 들어 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그보다 많은 횟수일 수 있다.

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 스팀, 높은 열 및/또는 압력은 오토클레이빙 동안 물을 샘플로 가압하며, 여기서 물이 가소제로서 작용하여 쇄의 이동성을 허용하는 것으로 생각된다. 건조 주기 동안, 이동성 쇄가 압밀되어 보다 조밀하고 더 강한 물질을 생성한다. 시간이 경과하고 열이 가해지면 단백질 쇄는 분해될 수 있다. 이것은 일부 쇄 엉킴을 피해 보다 단단한 패킹을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 오토클레이빙 과정의 파라미터에 있어서의 변화, 예컨대 느린 또는 빠른 벤팅, 온도, 압력 및 지속 기간은 생성된 물질의 기계적, 물리적 또는 구조적 특성에 영향을 줄 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물은 인큐베이션 후, 그러나 목적 형상 또는 기하구조로의 처리 전에 임의로 건조될 수 있다. 제한 없이, 목적 형상으로의 처리 전 건조는 임의의 목적 시간의 기간 동안일 수 있다. 예를 들어, 건조는 대략 수 분 내지 수 일의 기간 동안일 수 있다. 일부 실시양태에서, 건조는 대략 적어도 12시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 또는 적어도 14일의 기간 동안일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 최종 형상으로의 처리 전 건조는 대략 적어도 7일 동안일 수 있다. 또한, 상기 건조는 실온 또는 승온 하일 수 있다. 예를 들어, 이러한 건조는 약 4℃ 내지 약 100℃, 약 10℃ 내지 약 95℃, 약 15℃ 내지 약 90℃, 약 20℃ 내지 약 85℃, 약 25℃ 내지 약 80℃, 약 30℃ 내지 약 75℃, 약 35℃ 내지 약 60℃, 또는 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도 하일 수 있다. 일부 실시양태에서, 건조는 약 60℃의 온도 하이다.

실크 피브로인 조성물을 임의로 건조한 후, 조성물을 최종 목적 형상으로 가공할 수 있다. 목적 형상으로 처리하는 것에 관하여 본원에 사용된 용어 "가공"은 최종 형상의 제조 물품을 제공하는 데 사용되는 임의의 방법 또는 과정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 제한 없이, 이러한 가공은 기계적 및 화학적 수단을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 가공은 기계가공, 터닝(선반), 롤링, 나사 전조, 드릴링, 밀링, 샌딩, 펀칭, 다이커팅, 블랭킹, 브로칭, 압출, 화학적 에칭 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "기계가공"은 CNC 기계가공, 커팅, 밀링, 터닝, 드릴링, 성형, 플래닝, 브로칭, 쏘잉, 버니싱, 그라인딩 등(이에 제한되지 않음)을 포함하는 모든 유형의 기계가공 조작을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 하나 이상의 처리 방법을 조합하여 사용하여 보다 복잡하고 난해한 기하구조를 얻을 수 있다. 용어 "기계가공 가능한"은 물질이 쉽게 기계가공을 행할 수 있음을 의미한다.

목적 형상으로 가공 후, 제조 물품에 추가로 후-처리할 수 있다. 예를 들어, 제조 물품을 승온 또는 가압 하에 인큐베이션할 수 있다. 물품의 후-처리는 제조된 물품의 다수의 특성(예를 들어, 강도, 분자량, 분해 프로파일, 팽윤성, 밀도, 색 등)을 조절하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 후-처리는 물품을 그의 최종 형상으로 1회 이상, 예를 들어 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 오토클레이빙하는 것을 포함한다.

상기 논의된 바와 같이, 실크 피브로인 조성물은 인큐베이팅 단계 후에 임의로 건조될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 실크 피브로인 조성물을 포함하는 금형을 제공하며, 조성물 중의 실크 피브로인은 적어도 부분적으로 불용성 상태이고; (ii) 조성물을 승온에서 또는 압력하에 인큐베이팅하고; (iii) 조성물을 건조시키고; (iv) 임의로, 단계 (ii) 및 (iii)을 1회 이상 반복하고; (iv) 조성물을 목적하는 형상으로 가공하는 단계를 포함한다.

본 개시는 또한, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 실크 피브로인 물품을 제공한다. 제한 없이, 상기 물품은 의료 적용, 예를 들어 의료 기기에 사용될 수 있거나, 또는 상기 물품은 비의료 적용에 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "의료 기기"라는 용어는, 포유동물의 외부 또는 내부 치료와 결합하여 사용되는 것들을 포함한, 모든 유형의 의료 기기를 포괄하기 위한 것이다. 포유동물의 외부 치료에 사용되는 의료 기기는, 상처 드레싱, 화상 드레싱 또는 다른 피부 커버링, 및 외과용 실을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 포유동물의 내부 치료에 사용되는 의료 기기는 혈관 이식편, 스텐트, 카테터, 밸브, 인공 관절, 인공 기관, 외과용 실 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

예시적인 의료 기기는, 정형외과 임플란트, 안면 임플란트, 코 임플란트 (예를 들어, 코 재구성물), 봉합 앵커, 치과 임플란트, 스완슨(Swanson) 보철물, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 제조 물품은 연속식 1-상 봉합 앵커이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "정형외과 임플란트"라는 용어는 근골격계, 특히 관절 및 골의 기능의 보존 및 복구 및 이들 구조의 통증 완화를 위해 척추동물, 특히 포유동물, 예컨대 인간의 신체에 이식하기 위한 임의의 장치를 그의 범위 내에 포함한다. 예시적인 정형외과 임플란트는 정형외과 스크류, 정형외과 판(plate), 정형외과 막대(rod), 정형외과 튤립(tulip), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 제조 물품은 탭핑 스크류, 예를 들어, 셀프-탭핑 스크류일 수 있다.

일부 실시양태에서, 제조 물품은 봉합 앵커일 수 있다. 봉합 앵커는 앵커, 아일렛 및 봉합사(suture)로 구성된다. 앵커는 골에 삽입되며 스크류 메카니즘 또는 죔쇠 끼워맞춤(interference fit)일 수 있고, 아일렛은 봉합사가 통과하는 앵커 내의 구멍 또는 루프이다.

일부 실시양태에서, 제조 물품은 치과 임플란트일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치과 임플란트"라는 용어는 치아 복구 절차에서 척추동물, 특히 포유동물, 예컨대 인간의 구강에 이식하기 위한 임의의 장치를 그의 범위 내에 포함한다. 치과 임플란트는 또한 치과 보철 장치로서 표현될 수 있다. 일반적으로, 치과 임플란트는 하나 또는 여러 개의 임플란트 부분으로 구성된다. 예를 들어, 치과 임플란트는 통상 제2 임플란트 부분, 예컨대 받침대(abutment) 및/또는 치과 복구부, 예컨대 크라운, 브릿지 또는 의치에 커플링된 치과 픽스츄어(fixture)를 포함한다. 그러나 이식을 위한 임의의 장치, 예컨대 치과 픽스츄어는 단독으로, 심지어 다른 부분이 그에 연결될 때에도, 임플란트로서 지칭될 수 있다. 치과 임플란트는 현재 바람직한 실시양태이다.

일부 실시양태에서, 치과 임플란트는 크라운 및 스크류 임플란트로 구성된다. 임플란트는 크라운의 안정화를 위해 스크류 메커니즘을 이용하여 골에 삽입된다.

일부 실시양태에서, 제조 물품은 골 스크류 및/또는 골 판일 수 있다. 골 스크류는 나사산(thread) 부분, 및 연관 장치, 예컨대 골 판의 삽입 및 안정화에 이용되는 머리로 구성된다.

일부 실시양태에서, 제조 물품은 스완슨 보철물일 수 있다. 스완슨 핑거 조인트 임플란트(Swanson Finger Joint Implant)는 류머티스성, 퇴행성 또는 외상성 관절염에 의해 장애가 있는 손 및 손목 기능의 회복을 돕는 가요성 수질내-줄기형 1-조각 임플란트이다. 이것은 실리콘 엘라스토머로 구성되며, 그의 주 기능은 적당한 관절 공간의 유지 및 우수한 측방향 안정성 및 최소량의 굴신-운동 제한을 갖는 얼라인먼트를 돕는 것이다. 이들 임플란트는 대부분의 압축 하중이 골에 분포되기 때문에 최소량의 하중을 받는다.

일부 실시양태에서, 제조 물품은 코 재구성에 사용될 수 있다. 코 재구성은 미적으로 거슬리지 않으면서 기능을 유지하는 코를 생성하기 위해 수행된다. 구조 이식편은 흔히 측벽에 강성을 제공하고 측방향 붕괴에 저항하며 코 윤곽 및 돌출을 확립할 필요가 있다. 기존 물질은 알로플라스트(alloplast), 예컨대 실리콘 및 다공성 고밀도 폴리에틸렌 뿐 아니라, 동종이식편, 예컨대 알로덤(alloderm) 또는 늑연골을 포함한다.

본원에 개시된 방법은 각종 상이한 형상으로 제조될 수 있는 실크의 능력으로 인해 실크를 상기 적용에 사용될 수 있게 한다. 예를 들어, 실크를 막대로 압출한 후 깎아서 (선반) 임의의 변형을 제거하고 목적하는 크기를 얻을 수 있다. 또한, 구조물은 코의 고유한 기하학적 구조에 일치하도록 현장에서(in-situ) 성형될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제조 물품은 귀 성형술에 사용될 수 있다. 귀 성형술은 전형적으로 선천성 발육부전, 외상, 암 절제, 및 돌출귀에 기인하는 부분 또는 전체 귀 결손을 재구성하는 과정이다. 귀는 흉곽으로부터의 연골을 사용하여 재구성하거나, 또는 인공 귀를 생성할 수 있다. 늑연골을 미세 스테인리스강 와이어를 이용하여 조각하고 함께 연결하여 매우 섬세한 프레임워크를 생성한다.

본원에 개시된 방법은 실크를 새로운 귀의 프레임워크 생성에 사용될 수 있는 미세 와이어 네트워크로 현장에서 압출, 연신 및 성형할 수 있게 한다. 또한, 복잡한 기하학적 구조를 생성할 수 있는 수많은 공정으로 인해, 실크는 환자의 특정 필요에 기초하여 제조될 수 있다.

상기 논의된 특정 의료 기기 및 임플란트 외에, 본 명세서에 개시된 방법은 안면 임플란트 (피부 충진, 뺨 임플란트, 안와), 눈성형(occuloplasty), 입술 개선(lip enhancement), 생식 기관 성형수술 (음경 임플란트, 질성형(vaginaplasty), 성전환), 둔부 확대(buttock augmentation), 및 다른 연부 조직 "성형(plasty)"에 사용될 수 있다.

비의료용 적용은 주사위, 압정, 총알, 소아용 장난감 (예를 들어, 빌딩 블록, 레고, 체커스(Checkers) 등), 및 생분해성 플라스틱 대체물의 제조를 포함한다.

첨가제

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 실크 피브로인 조성물은 적어도 1종의 첨가제를 포함할 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 논의된 활성제/샘플/성분을 대체하거나 또는 그에 추가됨; 또는 일부 실시양태에서 그 용어가 본 명세서에서 사용될 때는 활성제/샘플/성분이 "첨가제"일 수도 있음). 본 명세서에 기재된 다양한 측면의 일부 실시양태에서, 실크 조성물은 하나 또는 그 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 첨가제는 하나 또는 그 이상의 바람직한 특성, 예를 들어, 강도, 가요성, 처리 및 취급 용이성, 생체적합성, 생체재흡수성(bioresorability), 표면 모폴로지, 방출 속도 및/또는 조성물에 존재하는 1종 이상의 활성제의 동역학 등을 제공할 수 있다. 첨가제는 실크 피브로인과 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있고, 실크 조성물 내에 균일하게 또는 불균일하게 내재할 수 있다.

예를 들어, 실크 물질은 하나 또는 그 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 첨가제를 포함하는 피브로인 용액으로부터 제조될 수 있다.

제한 없이, 첨가제는 작은 유기 또는 무기 분자; 사카라이드; 올리고사카라이드; 폴리사카라이드; 중합체; 단백질; 펩티드; 펩티드 유사체 및 유도체; 펩티드모방체; 핵산; 핵산 유사체; 등으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 면역원; 항원; 생물학적 물질, 예컨대 박테리아, 식물, 진균, 또는 동물 세포로부터 제조된 추출물; 동물 조직; 천연 또는 합성 조성물; 및 이들의 임의의 조합이거나, 또는 이들을 포함한다. 또한, 첨가제는 임의의 물리적 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 첨가제는 입자, 섬유, 필름, 겔, 메쉬, 매트, 부직 매트, 분말, 액체, 또는 이들의 임의의 조합의 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 입자이다.

한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 첨가제는 조성물, 및/또는 조성물에 포함된 활성제/샘플/성분의 하나 이상의 안정화 및/또는 실크 피브로인의 가용성 증가에 사용될 수 있는 안정화제이다. 생물학적 샘플에 존재하는 적어도 RNA 또는 단백질의 안정화를 위해 첨가될 수 있는 안정화제의 한 예는 각각 뉴클레아제 억제제(예를 들어, RNAse 억제제) 또는 프로테이나제 억제제를 포함한다.

안정화제의 추가 예는 아미노산, 예컨대 나트륨 글루타메이트, 아르기닌, 리신, 및 시스테인; 모노사카라이드, 예컨대 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 및 만노스; 디사카라이드, 예컨대 수크로스, 말토스, 및 락토스; 당 알콜, 예컨대 소르비톨 및 만니톨; 폴리사카라이드, 예컨대 올리고사카라이드, 전분, 셀룰로스, 및 그의 유도체; 인간 혈청 알부민 및 소 혈청 알부민; 젤라틴, 및 젤라틴 유도체, 예컨대 가수분해된 젤라틴; 및 항산화제인 아스코르브산; 및 이온(예를 들어, 양이온성 또는 음이온성 안정화제); 및 계면활성제; 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 이들 물질은 간행물, 예를 들어 ["Toketsu-Kanso To Hogo Busshitsu (Lyophilization And Protective Materials)" Nei 저, p. 1-176, Tokyo Daigaku Shuppan Kai 간행(Publishing Association of the University of Tokyo), 1972년 일본; 및 "Shinku Gijutsu Koza (8): Sinku Kanso (Lecture on Vacuum Technology (8): Vacuum Drying)" Ota 등 저, p.176-182, Nikkan Kogyo Shimbun Co., Ltd. 간행, 1964년 일본]에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 생체적합성 중합체이다. 예시적인 생체적합성 중합체는 폴리-락트산(PLA), 폴리-글리콜산(PGA), 폴리-락티드-코-글리콜리드 (PLGA), 폴리에스테르, 폴리(오르토 에스테르), 폴리(포스파진), 폴리(포스페이트 에스테르), 폴리카프로락톤, 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 케라틴, 폴리아스파르트산, 알기네이트, 키토산, 키틴, 히알루론산, 펙틴, 폴리히드록시알카노에이트, 덱스트란, 및 폴리무수물, 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 삼블록 공중합체, 폴리리신, 알기네이트, 폴리아스파르트산, 그의 임의의 유도체 및 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 본 개시물에 따른 용도에 적합한 다른 예시적인 생체적합성 중합체는 예를 들어, US 특허 6,302,848호; 6,395,734호; 6,127,143호; 5,263,992호; 6,379,690호; 5,015,476호; 4,806,355호; 6,372,244호; 6,310,188호; 5,093,489호; US 387,413호; 6,325,810호; 6,337,198호; US 6,267,776호; 5,576,881호; 6,245,537호; 5,902,800호; 및 5,270,419호에 기재된 것을 포함하며, 모든 내용은 본원에 참조로 포함된다.

한 실시양태에서, 첨가제는 실크-기재 물질의 가요성 및/또는 용해도에 영향을 줄 수 있는 글리세롤이다. 실크-기재 물질, 예를 들어 글리세롤을 포함하는 실크 필름은 WO 2010/042798에 기재되어 있고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

다른 첨가제의 예는 세포 부착에 영향을 주는 것으로 공지된 세포 부착 매개체, 예컨대 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 프로테오글리칸, 또는 공지된 인테그린 결합 도메인, 예를 들어 "RGD" 인테그린 결합 서열을 함유하는 펩티드, 또는 그의 변형물(문헌 [Schaffner P & Dard 2003 Cell Mol Life Sci. Jan;60(1):119-32; Hersel U. et al. 2003 Biomaterials. Nov;24(24):4385-415]); 생물학적 활성 리간드; 및 세포 또는 조직 내성장의 특정 변형을 강화하거나 제외하는 물질을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 증식 또는 분화를 강화하는 첨가제의 다른 예는 골유도 물질, 예컨대 골 형태발생 단백질(BMP); 시토카인, 성장 인자, 예컨대 표피 성장 인자(EGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I 및 II) TGF-β1 등을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

조성물 중 첨가제의 총량은 총 실크 조성물의 약 0.01 중량% 내지 약 99 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 70 중량%, 약 5 중량% 내지 약 60 중량%, 약 10 중량% 내지 약 50 중량%, 약 15 중량% 내지 약 45 중량%, 또는 약 20 중량% 내지 약 40 중량%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 실크 피브로인 대 첨가제의 비는 약 1000:1 (w/w) 내지 약 1:1000 (w/w), 약 500:1 (w/w) 내지 약 1:500 (w/w), 약 250:1 (w/w) 내지 약 1:250 (w/w), 약 200:1 (w/w) 내지 약 1:200 (w/w), 약 25:1 (w/w) 내지 약 1:25 (w/w), 약 20:1 (w/w) 내지 약 1:20 (w/w), 약 10:1 (w/w) 내지 약 1:10 (w/w), 또는 약 5:1 (w/w) 내지 약 1:5 (w/w) 범위일 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크-기재 물질 중 첨가제의 총량은 실크-기재 물질 중 총 실크 피브로인의 약 0.1 중량% 내지 약 70 중량%, 약 5 중량% 내지 약 60 중량%, 약 10 중량% 내지 약 50 중량%, 약 15 중량% 내지 약 45 중량%, 또는 약 20 중량% 내지 약 40 중량%일 수 있다. 통상의 기술자는 실크 피브로인 대 첨가제의 적절한 비를, 예를 들어 본원에 기재된 다양한 비율로 첨가제를 첨가함으로써 영향을 받는 성분 또는 실크-기재 물질의 특성을 측정함으로써 결정할 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 실크 피브로인 대 첨가제의 몰비가 예를 들어 적어도 1000:1, 적어도 900:1, 적어도 800:1, 적어도 700:1, 적어도 600:1, 적어도 500:1, 적어도 400:1, 적어도 300:1, 적어도 200:1, 적어도 100:1, 적어도 90:1, 적어도 80:1, 적어도 70:1, 적어도 60:1, 적어도 50:1, 적어도 40:1, 적어도 30:1, 적어도 20:1, 적어도 10:1, 적어도 7:1, 적어도 5:1, 적어도 3:1, 적어도 1:1, 적어도 1:3, 적어도 1:5, 적어도 1:7, 적어도 1:10, 적어도 1:20, 적어도 1:30, 적어도 1:40, 적어도 1:50, 적어도 1:60, 적어도 1:70, 적어도 1:80, 적어도 1:90, 적어도 1:100, 적어도 1:200, 적어도 1:300, 적어도 1:400, 적어도 1:500, 적어도 1:600, 적어도 1:700, 적어도 1:800, 적어도 1:900, 또는 적어도 1:100이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 실크 피브로인 대 첨가제의 몰비가 예를 들어 최대 1000:1, 최대 900:1, 최대 800:1, 최대 700:1, 최대 600:1, 최대 500:1, 최대 400:1, 최대 300:1, 최대 200:1, 100:1, 최대 90:1, 최대 80:1, 최대 70:1, 최대 60:1, 최대 50:1, 최대 40:1, 최대 30:1, 최대 20:1, 최대 10:1, 최대 7:1, 최대 5:1, 최대 3:1, 최대 1:1, 최대 1:3, 최대 1:5, 최대 1:7, 최대 1:10, 최대 1:20, 최대 1:30, 최대 1:40, 최대 1:50, 최대 1:60, 최대 1:70, 최대 1:80, 최대 1:90, 최대 1:100, 최대 1:200, 최대 1:300, 최대 1:400, 최대 1:500, 최대 1:600, 최대 1:700, 최대 1:800, 최대 1:900, 또는 최대 1:1000이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 실크 피브로인 대 첨가제의 몰비가 예를 들어, 약 1000:1 내지 약 1:1000, 약 900:1 내지 약 1:900, 약 800:1 내지 약 1:800, 약 700:1 내지 약 1:700, 약 600:1 내지 약 1:600, 약 500:1 내지 약 1:500, 약 400:1 내지 약 1:400, 약 300:1 내지 약 1:300, 약 200:1 내지 약 1:200, 약 100:1 내지 약 1:100, 약 90:1 내지 약 1:90, 약 80:1 내지 약 1:80, 약 70:1 내지 약 1:70, 약 60:1 내지 약 1:60, 약 50:1 내지 약 1:50, 약 40:1 내지 약 1:40, 약 30:1 내지 약 1:30, 약 20:1 내지 약 1:20, 약 10:1 내지 약 1:10, 약 7:1 내지 약 1:7, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 3:1 내지 약 1:3, 또는 약 1:1이다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 생물학적 활성제이다. 본원에 사용된 용어 "생물학적 활성제"는 체내에서 한 가지 이상의 생물학적 효과를 발휘하는 임의의 분자를 지칭한다. 예를 들어, 생물학적 활성제는 대상체의 질환 상태 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 치료제일 수 있다. 생물학적 활성제는 제한 없이 유기 분자, 무기 물질, 단백질, 펩티드, 핵산(예를 들어, 유전자, 유전자 단편, 유전자 조절 서열, 및 안티센스 분자), 핵단백질, 폴리사카라이드, 당단백질, 및 지단백질을 포함한다. 본원에 기재된 조성물에 포함될 수 있는 생물학적 활성 화합물의 종류는 제한 없이 항암제, 항생제, 진통제, 항염증제, 면역억제제, 효소 억제제, 항히스타민제, 항경련제, 호르몬, 근육 이완제, 진정제, 안약, 프로스타글란딘, 항울제, 항-정신성 물질, 영양 인자, 골유도 단백질, 성장 인자, 및 백신을 포함한다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 치료제이다. 본원에 사용된 용어 "치료제"는 유기체에 진단, 치료, 예방 의학, 또는 수의학적 목적으로 투여되는 분자, 분자 집단, 착물, 또는 물질을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "치료제"는 "약물" 또는 "백신"을 포함한다. 이 용어는 외적으로 및 내적으로 투여되는 인간 및 동물의 국소, 국부 및 전신 의약품, 치료제, 치료법, 기능식품, 약용화장품, 생물제제, 장치, 진단 및 피임제를 포함하며, 이는 임상적 및 수의학적 스크리닝, 예방, 예방법, 치유, 건강, 검출, 이미지화, 진단, 요법, 수술, 모니터링, 화장품, 보철학, 법의학 등에 유용한 제제를 포함한다. 이 용어는 또한 세포 수용체, 막 수용체, 호르몬 수용체, 치료용 수용체, 미생물, 바이러스 또는 식물, 동물 및/또는 인간을 포함하거나 이들과 접촉할 수 있는 선택된 표적을 인지할 수 있는 선택된 분자 또는 선택된 핵산 서열을 포함하는 농업제약, 직장, 군대, 산업 및 환경 치료제 또는 치료법에 참조로 사용될 수 있다. 이 용어는 또한 구체적으로 치료 효과를 발휘하는 핵산 및 핵산을 포함하는 화합물, 예를 들어 DNA 나노플렉스, siRNA, 마이크로RNA, shRNA, 압타머, 리보자임, 디코이 핵산, 안티센스 핵산, RNA 활성화제 등을 포함하는, 예를 들어 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 핵산 유사체 (예를 들어, 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), xeno 핵산(XNA)), 또는 혼합물 또는 그의 조합을 포함한다. 일반적으로, 임의의 치료제가 본원에 기재된 조성물에 포함될 수 있다.

용어 "치료제"는 또한 이것이 적용되는 생물학적 시스템에 국부 또는 전신 생물학적, 생리적, 또는 치료적 효과를 제공할 수 있는 작용제를 포함한다. 예를 들어, 치료제는 여러 기능 중 특히 감염 또는 염증 제어, 세포 성장 및 조직 재생 강화, 종양 성장 제어, 진통 작용, 항-세포 부착 증진, 및 골 성장 강화 작용을 할 수 있다. 다른 적합한 치료제는 항바이러스 작용제, 호르몬, 항체, 또는 치료 단백질을 포함할 수 있다. 다른 치료제는 투여되는 경우 생물학적으로 활성이 아니지만, 대상체에 투여하면 대사 또는 일부 다른 메카니즘을 통해 생물학적 활성제로 전환되는 작용제인 전구약물을 포함한다. 추가로, 실크-기재 약물 전달 조성물은 1종의 치료제 또는 2종 이상의 치료제의 조합을 함유할 수 있다.

치료제는 화합물 및 화합물의 혼합물을 포함하는 매우 다양한 상이한 화합물, 예를 들어 작은 유기 또는 무기 분자; 사카린; 올리고사카라이드; 폴리사카라이드; 생물학적 거대분자, 예를 들어 펩티드, 단백질, 및 펩티드 유사체 및 유도체; 펩티드 모방체; 항체 및 그의 항원 결합 단편; 핵산; 핵산 유사체 및 유도체; 생물학적 물질, 예컨대 박테리아, 식물, 진균, 또는 동물 세포로부터 제조된 추출물; 동물 조직; 자연 발생 또는 합성 조성물; 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 소분자이다.

본원에 사용된 용어 "소분자"는 "천연 생성물-유사" 화합물을 지칭할 수 있으나, 용어 "소분자"는 "천연 생성물-유사" 화합물에 국한되지 않는다. 오히려, 소분자는 전형적으로 몇 개의 탄소―탄소 결합을 함유하고, 5000 달톤(5 kDa) 미만, 바람직하게는 3 kDa 미만, 보다 더 바람직하게는 2 kDa 미만, 가장 바람직하게는 1 kDa 미만의 분자량을 갖는다는 점을 특징으로 한다. 일부 경우에서는, 700 달톤 이하의 분자량을 갖는 소분자가 바람직하다.

예시적인 치료제는 문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, 13^th Edition, Eds. T.R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NY; Physicians' Desk Reference, 50^th Edition, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics, 8^th Edition, Goodman and Gilman, 1990; United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990]에서 찾을 수 있는 것을 포함하나 이에 국한되지 않으며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.

치료제는 본원에 개시된 카테고리 및 구체적 예를 포함한다. 카테고리는 특정 예로 제한되는 것을 의도하지 않는다. 또한, 통상의 기술자는 카테고리 내에 속하고 본 개시물에 따른 유용한 많은 다른 화합물을 인지할 것이다. 예는 방사선 감지제, 스테로이드, 크산틴, 베타-2-효능제 기관지확장제, 항염증제, 진통제, 칼슘 길항제, 안지오텐신-전환 효소 억제제, 베타-차단제, 중심 활성 알파-효능제(centrally active alpha-agonist), 알파-1-길항제, 항콜린성/진경성 작용제, 바소프레신 유사체, 항부정맥제, 항파킨슨병제, 항협심증제/항고혈압제, 항응고제, 항혈소판제, 진정제, 안시올리틱 작용제(ansiolytic agent), 펩티드성 작용제, 생물 고분자성 작용제, 항신생물제(antineoplastic agent), 완하제, 항설사제, 항미생물제, 항진균제, 백신, 단백질, 또는 핵산을 포함한다. 추가 측면에서, 제약 활성제는 쿠마린, 알부민, 스테로이드, 예컨대 베타메타손, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론, 부데소니드, 히드로코르티손, 및 제약상 허용되는 히드로코르티손 유도체; 크산틴, 예컨대 테오필린 및 독소필린; 베타-2-효능제 기관지확장제, 예컨대 살부타몰, 펜테롤, 클렌부테롤, 밤부테롤, 살메테롤, 페노테롤; 항천식 항염증제, 항관절염 항염증제, 및 비-스테로이드성 항염증제를 포함하는 항염증제, 예를 들어 술피드, 메살라민, 부데소니드, 살라조피린(salazopyrin), 디클로페낙, 제약상 허용되는 디클로페낙 염, 니메술리드, 나프록센, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 케토프로펜 및 피록시캄; 진통제, 예컨대 살리실레이트; 칼슘 채널 차단제, 예컨대 니페디핀, 암로디핀, 및 니카르디핀; 안지오텐신-전환 효소 억제제, 예컨대 캅토프릴, 베나제프릴 히드로클로라이드, 포시노프릴 나트륨, 트란돌라프릴, 라미프릴, 리시노프릴, 에날라프릴, 퀴나프릴 히드로클로라이드, 및 모엑시프릴 히드로클로라이드; 베타-차단제 (즉, 베타 아드레날린성 블로킹제), 예컨대 소탈롤 히드로클로라이드, 티몰롤 말레에이트, 에스몰롤 히드로클로라이드, 카르테올롤, 프로파놀롤 히드로클로라이드, 베탁솔롤 히드로클로라이드, 펜부톨롤 술페이트, 메토프롤롤 타르트레이트, 메토프롤롤 숙시네이트, 아세부톨롤 히드로클로라이드, 아테놀롤, 핀돌롤, 및 비소프롤롤 푸마레이트; 중심 활성 알파-2-효능제, 예컨대 클로니딘; 알파-1-길항제, 예컨대 독사조신 및 프라조신; 항콜린제/진경성 작용제, 예컨대 디시클로민 히드로클로라이드, 스코폴라민 히드로브로마이드, 글리코피롤레이트, 클리디늄 브로마이드, 플라복세이트(flavoxate), 및 옥시부티닌; 바소프레신 유사체, 예컨대 바소프레신 및 데스모프레신; 항부정맥제, 예컨대 퀴니딘, 리도카인, 토카이니드 히드로클로라이드, 멕실레틴 히드로클로라이드, 디곡신, 베라파밀 히드로클로라이드, 프로파페논 히드로클로라이드, 플레카이니드 아세테이트, 프로카인아미드 히드로클로라이드, 모리시진 히드로클로라이드, 및 디소피라미드 포스페이트; 항파킨슨병제, 예컨대 도파민, L-도파/카르비도파, 셀레길린, 디히드로에르고크립틴, 페르골리드, 리수리드, 아포모르핀, 및 브로모크립틴; 항협심증제 작용제 및 항고혈압제, 예컨대 이소소르비드 모노니트레이트, 이소소르비드 디니트레이트, 프로프라놀롤, 아테놀롤 및 베라파밀; 항응고제 및 항혈소판제, 예컨대 쿠마딘, 와파린, 아세틸살리실산, 및 티클로피딘; 진정제, 예컨대 벤조디아자핀 및 바르비투레이트; 안시올리틱 작용제(ansiolytic agent), 예컨대 로라제팜, 브로마제팜, 및 디아제팜; 펩티드성 및 생물 고분자성 작용제, 예컨대 칼시토닌, 류프롤리드 및 다른 LHRH 효능제, 히루딘, 시클로스포린, 인슐린, 소마토스타틴, 프로티렐린(protirelin), 인터페론, 데스모프레신, 소마토트로핀, 티모펜틴, 피도티모드(pidotimod), 에리트로포이에틴, 인터류킨, 멜라토닌, 과립구/대식세포-CSF, 및 헤파린; 항신생물제, 예컨대 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 독소루비신, 시스플라틴, 히드록시우레아, 류코보린 칼슘, 타목시펜, 플루타미드, 아스파라기나제, 알트레타민, 미토탄, 및 프로카르바진 히드로클로라이드; 완하제, 예컨대 센나 농축물, 카산트라놀(casanthranol), 비사코딜, 및 나트륨 피코술페이트; 항설사제 작용제, 예컨대 디페녹신 히드로클로라이드, 로페라미드 히드로클로라이드, 푸라졸리돈, 디페녹실레이트 히드로클로라이드, 및 미생물; 백신, 예컨대 박테리아 및 바이러스 백신; 항균제, 예컨대 페니실린, 세팔로스포린, 및 마크롤리드, 항진균제, 예컨대 이미다졸성 및 트리아졸릭성(triazolic) 유도체; 및 핵산, 예컨대 생물학적 단백질, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드에 인코딩된 DNA 서열을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

항암제는 알킬화제, 백금 작용제, 항대사물, 토포이소머라제 억제제, 항종양 항생제, 항유사분열제, 아로마타제 억제제, 티미딜레이트 신타제 억제제, DNA 길항제, 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 펌프 억제제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 리보뉴클레오시드 리덕타제 억제제, TNF 알파 효능제/길항제, 엔도텔린A 수용체 길항제, 레티노산 수용체 효능제, 면역-조절제, 호르몬 및 항호르몬 작용제, 광역학적 작용제, 및 티로신 키나제 억제제를 포함한다.

항생제는 아미노글리코시드 (예를 들어, 겐타미신, 토브라마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신, 아미카신, 네오마이신), 바시트라신, 코르바페넴(corbapenems) (예를 들어, 이미페넴/시슬라스타틴(cislastatin), 세팔로스포린, 콜리스틴, 메텐아민, 모노박탐 (예를 들어, 아즈트레오남), 페니실린 (예를 들어, 페니실린 G, 페니실린V, 메티실린, 나트실린(natcillin), 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 암피실린, 아목시실린, 카르베니실린, 티카르실린, 피페라실린, 메즐로실린, 아즐로실린), 폴리믹신 B, 퀴놀론, 및 반코마이신; 및 정박테리아제, 예컨대 클로람페니콜, 클린단얀(clindanyan), 마크롤리드 (예를 들어, 에리트로마이신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신), 린콤얀(lincomyan), 니트로푸란토인, 술폰아미드, 테트라시클린 (예를 들어, 테트라시클린, 독시시클린, 미노시클린, 데메클로실린(demeclocyline), 및 트리메토프림을 포함한다. 또한, 메트로니다졸, 플루오로퀴놀론, 및 리탐핀(ritampin)이 포함된다.

효소 억제제는 효소 반응을 억제하는 물질이다. 효소 억제제의 예는 에드로포늄 클로라이드, N-메틸피소티그민, 네오스티그민 브로마이드, 피소스티그민 술페이트, 타크린, 타크린, 1-히드록시 말레에이트, 이오도튜베르시딘, p-브로모테트라미솔, 10-(알파-디에틸아미노프로피오닐)-페노티아진 히드로클로라이드, 칼미다졸륨 클로라이드, 헤미콜리늄-3,3,5-디니트로카테콜, 디아실글리세롤 키나제 억제제 I, 디아실글리세롤 키나제 억제제 II, 3-페닐프로파질라민, N°-모노메틸-L아르지닌 아세테이트, 카르비도파, 3-히드록시벤질히드라진, 히드랄라진, 클로르길린, 데프레닐, 히드록실아민, 이프로니아지드 포스페이트, 6-MeO-테트라히드로-9H-피리도-인돌, 니알아미드, 파르길린, 퀴나크린, 세미카르바지드, 트라닐시프로민, N,N-디에틸아미노에틸-2,2-디페닐발러레이트 히드로클로라이드, 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 파파베린, 인도메타신드(indomethacind), 2-시클로옥틸-2-히드록시에틸아민 히드로클로라이드, 2,3-디클로로-a-메틸벤질아민(DCMB), 8,9-디클로로-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀 히드로클로라이드, p-아미노 글루테티미드, p-아미노글루테티미드 타르트레이트, 3-이오도티로신, 알파-메틸티로신, 아세타졸아미드, 디클로르페나미드, 6-히드록시-2-벤조티아졸술폰아미드, 및 알로퓨리놀을 포함한다.

항히스타민제는 특히 피릴아민, 클로르페니라민, 및 테트라히드라졸린을 포함한다.

항염증제는 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 항염증 약물 (예를 들어, 아스피린, 페닐부타존, 인도메타신, 술린닥, 톨메틴, 이부프로펜, 피록시캄, 및 페나메이트), 아세트아미노펜, 페나세틴, 금 염, 클로로퀸, D-페니실라민, 메토트렉세이트 콜키신, 알로퓨리놀, 프로베네시드, 및 술핀피라존을 포함한다.

근육 이완제는 메페네신, 메토카르보말(methocarbomal), 시클로벤자프린 히드로클로라이드트리헥실페니딜 히드로클로라이드, 레보도파/카르비도파, 및 비페리덴을 포함한다.

항-연축성제는 아트로핀, 스코폴라민, 옥시페노늄, 및 파파베린을 포함한다.

진통제는 아스피린, 페닐부타존, 이도메타신(idomethacin), 술린닥, 톨메틱(tolmetic), 이부프로펜, 피록시캄, 페나메이트, 아세트아미노펜, 페나세틴, 모르핀 술페이트, 코데인 술페이트, 메페리딘, 날로르핀, 오피오이드 (예를 들어, 코데인 술페이트, 펜타닐 시트레이트, 히드로코돈 비타르트레이트, 로페라미드, 모르핀 술페이트, 노스카핀, 노르코데인, 노르모르핀, 테바인, 노르바이날토르피마인, 부프레노르핀, 클로말트렉사민, 푸날트렉사미온, 날부핀, 날로르핀, 날록손, 날록손아진, 날트렉손, 및 날트린돌), 프로카인, 리도카인, 테트라카인 및 디부카인을 포함한다.

안약은 나트륨 플루오레세인, 로즈 벵갈, 메타콜린, 아드레날린, 코카인, 아트로핀, 알파-키모트립신, 히알루로니다제, 베타크살올(betaxalol), 필로카르핀, 티몰롤, 티몰롤 염, 및 그의 조합을 포함한다.

프로스타글란딘은 당 업계에 공지되어 있으며, 다양한 생물학적 효과를 갖는 자연발생하는 화학적으로 관련된 장쇄 히드록시 지방산의 종류이다.

항-진정제는 우울증을 예방 또는 완화할 수 있는 물질이다. 항-진정제의 예는 이미프라민, 아미트립틸린, 노르트립틸린, 프로트립틸린, 데시프라민, 아목사핀, 독세핀, 마프로틸린, 트라닐시프로민, 페넬진, 및 이소카르복스아지드를 포함한다.

영양 인자는 계속 존재하면 세포의 생존 능력 또는 수명을 향상시키는 인자이다. 영양 인자는 제한 없이 혈소판-유래 성장 인자(PDGP), 호중구-활성화 단백질, 단핵구 화학유인물질 단백질, 대식세포-염증성 단백질, 혈소판 인자, 혈소판 염기성 단백질, 및 활성을 자극하는 흑색종 성장; 표피 성장 인자, 형질전환 성장 인자 (알파), 섬유모세포 성장 인자, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 신경교 유도된 성장 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자, 신경 성장 인자, 골 성장/연골-유도 인자 (알파 및 베타), 골 형태발생 단백질, 인터류킨 (예를 들어, 인터류킨 1 내지 인터류킨 10을 포함하는 인터류킨 억제제 또는 인터류킨 수용체), 인터페론 (예를 들어, 인터페론 알파, 베타 및 감마), 에리트로포이에틴을 포함하는 조혈 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자; 종양 괴사 인자, 및 베타-1, 베타-2, 베타-3, 인히빈, 및 액티빈을 포함하는 형질전환 성장 인자 (베타)를 포함한다.

호르몬은 에스트로겐 (예를 들어, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 디에틸스티베스트롤(diethylstibestrol), 퀴네스트롤, 클로로트리아니센, 에티닐 에스트라디올, 메스트라놀), 항에스트로겐 (예를 들어, 클로미펜, 타목시펜), 프로게스틴 (예를 들어, 메드록시프로게스테론, 노르에틴드론, 히드록시프로게스테론, 노르게스트렐), 항프로게스틴 (미페프리스톤), 안드로겐(예를 들어, 테스토스테론 시피오네이트, 플루옥시메스테론, 다나졸, 테스토락톤), 항안드로겐 (예를 들어, 시프로테론 아세테이트, 플루타미드), 갑상선 호르몬 (예를 들어, 트리이오도티론(triiodothyronne), 티록신, 프로필티오우라실, 메티마졸, 및 이오딕소드(iodixode)), 및 뇌하수체 호르몬 (예를 들어, 코르티코트로핀, 수무토트로핀(sumutotropin), 옥시토신, 및 바소프레신)을 포함한다. 호르몬은 호르몬 대체 요법 및/또는 산아 제한용 목적에 일반적으로 채용된다. 또한, 스테로이드 호르몬, 예컨대 프레드니손은 면역억제제 및 항염증제로 사용된다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 조직 형성 및/또는 천연 조직의 회복 및 재성장, 및 그의 임의의 조합을 자극하는 작용제이다. 주사한 부위에 신규 조직의 형성을 증가시키고/거나 자연 조직의 회복 또는 재성장을 자극하는 작용제는 섬유모세포 성장 인자(FGF), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 결합 조직 활성화된 펩티드(CTAP), 골 형태발생 단백질을 포함하는 골형성 인자, 헤파린, 안지오텐신 II(A-II) 및 그의 단편, 인슐린-유사 성장 인자, 종양 괴사 인자, 인터류킨, 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 신경 성장 인자, 인터페론, 생물학적 활성 유사체, 이러한 성장 인자의 단편 및 유도체, 및 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 실크 조성물은 유연 조직 증진 용의 적어도 1종의 추가 물질, 예를 들어 피부 충전 물질을 추가로 포함할 수 있고, 이는 폴리(메틸 메타크릴레이트) 마이크로구체, 히드록실아파타이트, 폴리(L-락트산), 콜라겐, 엘라스틴, 및 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 상업용 피부 필러 생성물 예컨대 보톡스(BOTOX)®(앨러간(Allergan) 제품), DYSPORT®, COSMODERM®, EVOLENCE®, RADIESSE®, RESTYLANE®, JUVEDERM®(앨러간 제품), SCULPTRA®, PERLANE®, 및 CAPTIQUE®, 및 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 상처 치유제이다. 본원에 사용된 "상처 치유제"는 상처 치유 과정을 활발히 증진시키는 화합물 또는 조성물이다. 예시적인 상처 치유제는 덱스판테놀; 성장 인자; 효소, 호르몬; 포비돈-아이오다이드; 지방산; 항염증제; 항생제; 항미생물제; 방부제; 시토카인; 트롬빈; 안갈제식(angalgesic); 오피오이드; 아미녹실; 푸록산; 니티르소티올; 질산염 및 안토시아닌; 뉴클레오시드, 예컨대 아데노신; 및 뉴클레오티드, 예컨대 아데노신 디포스페이트(ADP) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP); 뉴토트랜스미터(neutotransmitter)/뉴로모듈레이터(neuromodulator), 예컨대 아세틸콜린 및 5-히드록시트립타민(세로토닌/5-HT); 히스타민 및 카테콜아민, 예컨대 아드레날린 및 노르아드레날린; 지질 분자, 예컨대 스핑고신-1-포스페이트 및 리소포스파티드산; 아미노산, 예컨대 아르기닌 및 리신; 펩티드 예컨대 브라디키닌, 물질 P 및 칼슘 유전자-연관 펩티드(CGRP); 산화질소; 및 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 활성제는 면역원이다. 한 실시양태에서, 면역원은 백신이다. 대부분의 백신은 저장 및/또는 운송되는 환경 조건에 민감하다. 예를 들어, 동결은 리액토게니시티(reactogenicity) (예를 들어, 면역학적 반응을 야기하는 능력) 및/또는 일부 백신 (예를 들어, HepB, 및 DTaP/IPV/HIB)에 대한 효력의 손실을 증가시킬 수 있거나, 또는 용기에 가느다란 금(hairline crack)을 야기하여 오염을 유도할 수 있다. 또한, 일부 백신(예를 들어, BCG, 바리셀라, 및 MMR)은 열에 민감하다. 다수의 백신 (예를 들어, BCG, MMR, 바리셀라, 메닌고코컬(Meningococcal) C 접합체, 및 대부분의 DTaP-함유 백신)은 빛에 민감하다. 예를 들어, 문헌 [Galazka et al., Thermostability of vaccines, in Global Programme for Vaccines & Immunization (World Health Organization, Geneva, 1998); Peetermans et al., Stability of freeze-dried rubella virus vaccine (Cendehill strain) at various temperatures, 1 J. Biological Standardization 179 (1973)]을 참조한다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 또한 콜드 체인 및/또는 다른 환경 조건에 관계 없이 백신의 안정화를 제공한다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 세포, 예를 들어 생물학적 세포이다. 조성물 내로 혼입하기 용이한 세포는 임의의 공급원, 예를 들어, 포유동물, 곤충, 식물 등에서 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간, 래트 또는 마우스 세포일 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 조성물과 함께 사용될 세포는 어떠한 유형의 세포도 될 수 있다. 일반적으로, 세포는 조성물 내에 캡슐화된 경우 생존 가능하여야 한다. 일부 실시양태에서, 조성물과 함께 사용될 수 있는 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 영장류 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포 등), 조류 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 박테리아 세포, 및 하이브리드 세포를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물과 함께 사용될 수 있는 예시적인 세포는 혈소판, 활성화 혈소판, 줄기 세포, 전능 세포, 만능 세포, 및/또는 배아 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 내에 캡슐화될 수 있는 예시적인 세포는 임의의 조직으로부터의 1차 세포 및/또는 세포주를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 심근세포, 근세포, 간세포, 각질세포, 멜라닌세포, 뉴런, 성상세포, 배아 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 세포 (예를 들어, 단핵구, 호중구, 대식세포 등), 에나멜 모세포(ameloblast), 섬유모세포, 연골세포, 골모세포, 파골세포, 뉴런, 정자 세포, 난자 세포, 간 세포, 폐의 상피 세포, 소화관의 상피 세포, 장의 상피 세포, 간, 피부의 상피 세포 등, 및/또는 그의 복합물이 본원에 개시된 실크/혈소판 조성물에 포함될 수 있다. 통상의 기술자는 본원에 열거된 세포가 예시적이며, 포괄적이지 않은 세포의 목록을 나타냄을 인지할 것이다. 세포는 공여자(타생) 또는 수용자(자가 유래)로부터 수득될 수 있다. 세포는 비제한적인 예로서, 통상의 기술자에게 공지된 생검 수단 또는 다른 외과적 수단으로써 수득될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포는 유전적으로 변형된 세포이다. 세포는 유전적으로 변형되어 목적 화합물, 예를 들어 생물활성제, 성장 인자, 분화 인자, 시토카인 등을 배출하고 분비할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포가 관심 화합물을 배출 및 분비하도록 하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 통상의 기술자에 의해 쉽게 조정될 수 있다.

또한, 줄기 세포 내로 리프로그래밍된(reprogrammed) 분화 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 피부 세포는 Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4의 형질도입에 의해 배아 줄기 세포 내로 리프로그래밍된다(문헌 [Junying Yu, et. al., Science, 2007, 318, 1917-1920 및 Takahashi K. et. al., Cell, 2007, 131, 1-12]).

일부 실시양태에서, 첨가제는 실크 피브로인 입자일 수 있다. 실크 피브로인 입자 및 그의 제조 방법은 상기 본원에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 실크-기재 물질일 수 있다. 실크-기재 물질은 실크 섬유, 미세 크기 실크 섬유, 미가공 실크 섬유, 실크 입자, 및 그의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 실크 섬유이다. 실크 섬유의 용도는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US20110046686에 개시되어 있으며, 그 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 실크 섬유는 마이크로섬유 또는 나노섬유이다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 마이크로미터 크기(10-600 μm)의 실크 섬유이다. 마이크로미터 크기의 실크 섬유는 정련된 실크 피브로인을 가수분해함으로써 또는 정련 과정의 비등 시간을 증가시킴으로써 수득될 수 있다. 마이크로미터 크기의 실크 섬유를 수득하기 위한 실크 피브로인의 알칼리 가수분해는 예를 들어, 문헌 [Mandal et al., PNAS, 2012, doi: 10.1073/pnas.1119474109]; 2012년 4월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 61/621,209; 및 2013년 4월 5일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US13/35389에 개시되어 있으며, 이들 모두의 내용 전문이 본원에 참조로 포함된다. HFIP 실크 용액으로부터 제조된 재생 실크 섬유는 기계적으로 강하므로, 재생 실크 섬유는 첨가제로 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 실크 섬유는 미가공 실크 섬유, 예를 들어, 원료 실크 또는 원료 실크 섬유이다. 용어 "원료 실크" 또는 "원료 실크 섬유"는 세리신을 제거하도록 처리되지 않은 실크 섬유를 지칭하며, 따라서 예를 들어, 고치로부터 직접 채취된 실크 섬유를 망라한다. 따라서, 미가공 실크 섬유는 견사선(silk gland)으로부터 직접 수득한 실크 피브로인을 의미한다. 견사선으로부터 직접 수득한 실크 피브로인이 건조가 허용되는 경우, 그 구조는 고체 상태에서 실크 I으로 지칭된다. 따라서, 미가공 실크 섬유는 대부분 실크 I 입체형태인 실크 피브로인을 포함한다. 다른 한편으로, 재생 또는 가공 실크 섬유는 상당한 실크 II 또는 베타-시트 결정화도를 갖는 실크 피브로인을 포함한다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 생체적합성 중합체이다. 예시적인 생체적합성 중합체는 폴리-락트산(PLA), 폴리-글리콜산(PGA), 폴리-락티드-코-글리콜리드(PLGA), 폴리에스테르, 폴리(오르토 에스테르), 폴리(포스파진), 폴리(포스페이트 에스테르), 폴리카프로락톤, 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 케라틴, 폴리아스파르트산, 알기네이트, 키토산, 키틴, 히알루론산, 펙틴, 폴리히드록시알카노에이트, 덱스트란, 및 폴리무수물, 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 삼블록 공중합체, 폴리리신, 알기네이트, 폴리아스파르트산, 그의 임의의 유도체 및 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 본 개시물에 따라 사용할 수 있는 다른 예시적인 생체적합성 중합체는 예를 들어 US 특허 6,302,848호; 6,395,734호; 6,127,143호; 5,263,992호; 6,379,690호; 5,015,476호; 4,806,355호; 6,372,244호; 6,310,188호; 5,093,489호; US 387,413호; 6,325,810호; 6,337,198호; US 6,267,776호; 5,576,881호; 6,245,537호; 5,902,800호; 및 5,270,419호에 개시된 것을 포함하며, 이들의 모든 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 사용된 용어 "생체적합성"은 숙주 내에 실질적인 면역반응을 유도하지 않는 물질을 지칭한다.

일부 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 PEG 또는 PEO이다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 약 20 내지 약 2000000 결합형 단량체, 전형적으로 약 50 내지 1000 결합형 단량체, 일반적으로는 약 100 내지 300을 함유하는 에틸렌 글리콜 중합체이다. PEG는 그 분자량에 따라 폴리에틸렌 옥시드(PEO) 또는 폴리옥시에틸렌(POE)으로서 또한 알려져 있다. 일반적으로 PEG, PEO, 및 POE는 화학적으로 같은 것을 나타내지만 역사적으로 PEG는 20,000 g/mol 미만의 분자 질량을 갖는 중합체 및 올리고머를 의미하는 경향이 있고, PEO는 20,000 g/mol 초과의 분자 질량을 갖는 중합체를 의미하는 경향이 있고, POE는 임의의 분자 질량을 갖는 중합체를 의미하는 경향이 있다. PEG 및 PEO는 그 분자량에 따라 액체 또는 저융점 고체이다. PEG는 에틸렌 옥시드의 중합에 의해 제조되고 300 g/mol 내지 10,000,000 g/mol의 넓은 범위의 분자량에 걸쳐 상업적으로 입수가능하다. 상이한 분자량을 갖는 PEG 및 PEO는 상이한 응용에서의 용도를 찾고, 쇄 길이 효과에 의해 상이한 물리적 특성(예를 들어 점도)을 갖지만, 그 화학적 특성은 거의 동일하다. 중합 공정을 위하여 사용된 개시제 - 대부분의 공통 개시제는 일관능성 메틸 에테르 PEG, 또는 메톡시폴리(에틸렌 글리콜), 단축형 mPEG임 - 에 따라 상이한 형태의 PEG를 또한 입수가능하다. 더 낮은 분자량 PEG는 단분산으로서 지칭된 더 순수한 올리고머로서 또한 입수가능하거나, 균일 또는 이산 PEG는 상이한 기하학적 구조로 또한 입수가능하다.

본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 PEG는 배제되는 것이 아니라 포함되도록 의도되고 있다. 용어 PEG는 알콕시 PEG, 이관능성 PEG, 멀티아암형(multiarmed) PEG, 포크형(forked) PEG, 분지형 PEG, 펜던트(pendent) PEG(즉, 중합체 백본에 매달린 하나 이상의 관능기를 갖는 관련 중합체 또는 PEG), 또는 분해성 결합을 갖는 PEG를 포함하는, 임의의 형태로 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 또한, PEG 백본은 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 중합체 백본은 일반적으로 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중앙 분지 코어 모이어티 및 중합 분지 코어에 결합된 복수의 선형 중합체 사슬을 갖는다. PEG는 통상적으로 에틸렌 옥시드를 다양한 폴리올, 예컨대 글리세롤, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 첨가함으로써 제조할 수 있는 분지형 형태로 사용되고 있다. 중앙 분지 모이어티는 다수의 아미노산, 예컨대 리신으로부터 또한 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 R(-PEG-OH)m의 일반적인 형태로 표현될 수 있는데, 여기서 R은 코어 모이어티, 예컨대 글리세롤 또는 펜타에리트리톨을 나타내고, m은 아암의 수를 나타낸다. 멀티아암형 PEG 분자, 예컨대 그 전문이 본원에 참조로서 포함되어 있는 미국특허번호 5,932,462에 기술되어 있는 것을 생체적합성 중합체로서 또한 사용할 수 있다.

몇몇 예시적인 PEG는 PEG20, PEG30, PEG40, PEG60, PEG80, PEG100, PEG115, PEG200, PEG 300, PEG400, PEG500, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG2000, PEG3350, PEG4000, PEG4600, PEG5000, PEG6000, PEG8000, PEG11000, PEG12000, PEG15000, PEG 20000, PEG250000, PEG500000, PEG100000, PEG2000000 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, PEG는 MW 10,000 달톤이다. 일부 실시양태에서, PEG는 MW 100,000, 즉 MW 100,000의 PEO이다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 실크 피브로인을 가수분해하는 효소이다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 효소는 제조 물품의 분해를 제어하는 데 사용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 첨가제는 가소제이다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 가소제의 포함은 실크-기재 물품, 예를 들어 실크 피브로인 필름의 가요성 및/또는 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 한 실시양태에서, 가소제는 글리세롤이다. 실크-기재 물질, 예를 들어, 글리세롤을 포함하는 실크 필름은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있는 WO 2010/042798에 기술되어 있다.

기타 첨가제의 실시예는 세포 부착에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는(문헌 [Schaffner P & Dard, Cell Mol Life Sci., 2003, 60(1): 119-32 and Hersel U. et al., Biomaterials, 2003, 24(24):4385-415]) 세포 부착 매개체, 예컨대 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 프로테오글리칸, 또는 공지된 인테그린 결합 도메인, 예를 들어 "RGD" 인테그린 결합 서열, 또는 그의 변형을 함유하는 펩티드; 생물학적 활성 리간드; 및 세포 또는 조직 내성장의 특정 변종을 강화 또는 제외하는 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 실크 피브로인 조성물로부터의 활성제의 방출은 실크 피브로인과 활성제 간의 상호작용을 방해할 수 있는 첨가물을 조성물에 첨가함으로써 제어할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 첨가제는 단백질-활성제 상호작용을 방해, 억제, 또는 감소시키는 작용제이다. 예를 들어, 실크 피브로인은 순수 음 전하를 갖는다. 따라서, 순수 양 전하를 갖는 활성제는 이온성/정전기적 상호작용을 통해 실크 피브로인과 상호작용할 수 있고 조성물 내에 유지될 수 있다. 이온성/정전기적 상호작용을 변경하여 조성물로부터 인자의 방출 속도를 바꿀 수 있다. 이온성/정전기적 상호작용을 변경하는 한 방식은 양이온성 분자를 조성물에 첨가하는 것일 수 있다. 몇몇 기타 작용제는 소수성 상호작용을 통해 실크 피브로인과 상호작용할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 인자는 비-이온성 상호작용을 방해, 억제 또는 감소시키는 첨가제를 사용하여 방출될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 첨가제는 계면활성제일 수 있다. 본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "계면활성제"는 천연 또는 합성 친양쪽성 화합물을 의미한다. 계면활성제는 비-이온성, 쌍성 이온성, 또는 이온성일 수 있다. 계면활성제의 비제한적인 예는 폴리소르베이트 예컨대 폴리소르베이트 20 (트윈® 20), 폴리소르베이트 40 (트윈® 40), 폴리소르베이트 60 (트윈® 60), 폴리소르베이트 61 (트윈® 61), 폴리소르베이트 65 (트윈® 65), 폴리소르베이트 80 (트윈® 80), 및 폴리소르베이트 81 (트윈® 81); 폴록사머 (폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체), 예컨대 폴록사머 124 (플루로닉® L44), 폴록사머 181 (플루로닉® L61), 폴록사머 182 (플루로닉® L62), 폴록사머 184 (플루로닉® L64), 폴록사머 188 (플루로닉® F68), 폴록사머 237 (플루로닉® F87), 폴록사머 338 (플루로닉® L108), 폴록사머 407 (플루로닉® F127), 폴리옥시에틸렌글리콜 도데실 에테르, 예컨대 브리즈® 30, 및 브리즈® 35; 2-도데콕시에탄올 (LUBROL®-PX); 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르 (트리톤® X-100); 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS); 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트 (CHAPSO); 수크로스 모노라우레이트; 및 콜산나트륨을 포함한다. 계면활성제 부형제의 다른 비제한적인 예는 예를 들어 문헌 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7^th ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20^th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10^th ed. 2001); 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)]에서 발견할 수 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로서 포함되어 있다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 양이온성 중합체이다. 한 실시양태에서, 양이온성 중합체는 폴리리신, 예를 들어, ε-폴리-L-리신이다. 대안적 실시양태에서, 계면활성제는 음이온성 중합체이다. 한 실시양태에서, 음이온성 중합체는 폴리글루타메이트, 예를 들어, 폴리-L-글루타메이트이다.

대상체에의 투여를 위하여, 제공된 실크 피브로인 조성물은 본원에서 개시한 실크 피브로인 조성물을 포함하는 제약상 허용되는 조성물에서 조제될 수 있고, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께 조제될 수 있다. 대상체에의 투여를 위하여, 제약 조성물은 일반적으로 단위 투여 형태로 조제될 수 있다. 또한, 제약 조성물은 투여를 위하여 고체 또는 액체 형태, 예컨대, (1) 국소 적용, 예를 들어, 피부에 적용된 크림, 연고, 제어형-방출 패치, 또는 스프레이; (2) 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 또는 경막외 주사에 의한 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속성-방출 제제; (3) 경구 투여, 예를 들어, 혀에 적용하기 위한 드렌치(수성 또는 비-수용액 또는 현탁액), 로진지, 당의정, 캡슐, 환제, 정제(예를 들어, 구강, 설하, 및 전체 흡수를 목적으로 한 것), 볼루스, 분말, 과립, 페이스트; (4) 질내로 또는 직장내로, 예를 들어, 페사리, 크림 또는 발포체; (5) 설하로; (6) 안구로; (7) 경피로; (8) 경점막으로; 또는 (9) 비강으로 적용하기 위하여 구성된 것을 포함하는 정제, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액, 또는 에멀젼으로 구체적으로 조제될 수 있다. 또한, 조성물은 환자 내에 임플란트될 수 있거나 약물 전달 조성물을 사용하여 주입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981)]; 미국 특허 번호 3,773,919; 및 미국 특허 번호 35 3,270,960을 참조한다.

본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는"은 타당한 의학적 판단 범위 내에 있고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 혹은 복잡성 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기 적합하고, 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 의미한다.

본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "제약상-허용되는 담체"는 몸체의 한 기관 또는 부분으로부터 몸체의 또 다른 기관 또는 부분으로 표제 화합물을 운반 또는 전달 시 포함된, 제약상-허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 활석 마그네슘, 칼슘 또는 스테아르산아연, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 환자에게 해롭지 않은 제제의 다른 성분과 화합될 수 있다는 점에서 "허용가능"해야 한다. 제약상-허용되는 담체로서의 역할을 하는 물질의 일부 예는 (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거(Ringer's) 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 벌킹제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (23) 제약 제제에 채택된 다른 비-독성 상용성 물질을 포함한다. 습윤제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제, 퍼퓸제, 보존제 및 항산화제는 제제에 또한 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "제약상 허용되는 담체" 등의 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 있다.

제약상-허용되는 항산화제는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 오일-가용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 렉티씬, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "투여되는"은 목적 부위에서 제약 활성제의 적어도 부분 국재화를 야기하는 경로 또는 방법에 의한 약물 전달 조성물의 대상체에게로의 배치를 의미한다.

조성물은 대상체에서의 유효 치료를 야기하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있고, 즉 투여는 제약 활성제의 적어도 일부가 전달되고 있는 대상체에서의 원하는 위치로의 전달을 야기한다. 투여의 예시적인 모드는 국소, 임플란트, 주사, 주입, 점적주입, 이식 또는 섭취를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "주사"는, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 뇌실내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 대뇌 내부 척추, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.

주사제는 조성물이 주사에 의한 투여에 적합한 특정 물리적 기준을 충족하는 것을 요구한다. 예를 들어, 이러한 제제는 소위 주사바늘통과(syringeability)의 충분한 수준을 요구한다. 주사바늘통과란 용어는 수동 주사에 요구되는 시간 및 힘(또는 자기주사기를 사용하는 주사에 요구되는 시간)을 의미하는데, 이는 최종 사용자에 의한 생성물의 유용성에 영향을 줄 수도 있기 때문에 중요한 파라미터이고 따라서 준수해야 한다. 사전설정된 게이지 및 길이의 바늘을 통해 소정의 주사 비율로 용액을 주사하는 데 요구되는 힘이 주사바늘통과로서 지칭되고 있다(문헌 [Burckbuchler, V et al., Eur. J.Pharm. Biopharm. 2010, 76 (3): 351-356)]. 하겐-포아젤 방정식은 다음과 같이 표현될 수 있는 이동(또는 글라이드) 힘을 추정하는 데 이용할 수 있다.

F = 8QμL/πR4 x A (방정식 1)

(여기서, Q = 체적 유량; μ = 유체 점도; L = 바늘 길이; R = 바늘 내부 직경; A = 시린지 플런저의 단면적; F = 마찰없는 이동 힘).

용액의 점도는 단백질 자체, 단백질 농축, 온도 및 제제, 예를 들어 pH, 부형제의 유형 및 부형제 농도에 좌우된다. 단백질 자체 외에, 단백질 농축은 점도를 위한 또 다른 중요한 인자이다. 피하 주사는 일반적으로 대략 ＜ 1.5 mL의 주입 부피로 제한되어 있다(예를 들어 문헌 [Adler (2012) Am. Pharmaceutical Rev. pp. 1-9] 참조).

일부 실시양태에서, 본원에서 개시한 실크 피브로인 조성물은 대상체에 임플란트될 수 있다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "임플란트된" 및 문법적으로 관련된 용어는 조성물의 대상체 내 특정 위치에의 일시적이거나, 반영구적이거나, 영구적인 위치설정을 의미한다. 그 용어는 조성물의 특정 위치 또는 장소에의 영구적인 고정을 요구하지 않는다. 예시적인 생체내 위치는 상처, 외상 또는 질환의 부위를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

대상체에의 투여를 위하여, 실크 피브로인 조성물은 일반적으로 단위 투여량 주사가능한 형태로 조제될 수 있다. 주사에 적합한 조성물 및 조제용 물질은 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 담체는 예를 들어 물, 세포 배양 배지, 완충제(예를 들어, 포스페이트 완충 염수), 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 담체는 완충 용액(예를 들어 PBS)일 수 있다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 전달 장치, 예를 들어, 시린지로 투여될 수 있다. 따라서, 본원에서 기술한 추가의 측면은 출구를 구비한 적어도 하나의 챔버를 포함하는 전달 장치를 제공하는데, 적어도 하나의 챔버는 본원에서 기술한 사전설정된 양의 임의의 조성물을 포함하고, 출구는 챔버 내부에 고립된 조성물을 위한 출구를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술한 전달 장치는 작동기를 추가로 포함하여 출구를 통한 조성물의 방출을 제어할 수 있다. 이러한 전달 장치는 본원에서 기술한 임의의 조성물의 대상체에의 투여를 용이하게 하는 임의의 장치, 예를 들어 본원에서 기술한 임의의 조성물의 지속-방출 또는 제어 방출을 위한, 예를 들어, 시린지, 건조 분말 주사기, 비강 스프레이, 네뷸라이저, 또는 임플란트 예컨대 마이크로칩일 수 있다.

키트

본원에서 기술한 조성물 및 방법에 채택될 수 있는 샘플 수집 장치 및 키트를 또한 제공한다. 따라서, 본원에 제공된 또 다른 측면은 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플 또는 활성제를 수집하기 위한 챔버를 포함하는 샘플 수집 장치이고, 여기서 챔버는 실크 피브로인 조성물을 포함한다. 생물학적 샘플 또는 활성제와 실크 피브로인 용액의 접촉 시, 생물학적 샘플의 적어도 하나의 성분 또는 활성제의 생체 활성 중 적어도 하나의 특성은 일정 기간 동안 안정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 챔버에 존재하는 실크 피브로인 조성물은 용액, 분말, 현탁액, 또는 겔의 형태로 존재할 수 있다.

본 기술분야에 알려진 임의의 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플 수집 장치가 본원에서 적용될 수 있다. 장치의 비제한적인 예는 생물학적 시편 수집 튜브(예를 들어, 혈액 수집 튜브), 바이알, 시린지, 원심분리 튜브, 마이크로타이터 플레이트, 계량봉, 생물학적 시편 수집 백, 스폰지, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 장치는 혈액 수집 튜브 또는 백일 수 있다.

일부 실시양태에서, 장치의 챔버는 본원에서 기술한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치의 챔버는 항-응고 작용제, 안정화제, 겔화-유도 작용제, 프로테아제 또는 소화 효소, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 표적 성분의 안정화를 더욱 강화하는 데 사용될 수 있는 안정화제는 사카라이드, 당 알콜, 이온, 계면활성제, 아미노산, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴, 및 젤라틴 유도체, 항산화제, 본원에서 기술한 임의의 안정화제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 안정화제는 뉴클레아제 억제제 또는 프로테이나제 억제제일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 생물학적 샘플로부터 검출되고, 안정화제는 RNase 억제제 및/또는 DEPC를 포함할 수 있다.

겔화-유도 작용제는 실크-기재 물질, 예를 들어 그 내용이 본원에 참조로서 포함되어 있는 국제출원번호 WO/2012/031144에 기술된 관능성-활성화된 PEG를 형성하도록 실크 피브로인의 겔화를 유도할 수 있는 임의의 작용제일 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 챔버는 국제출원번호 WO/2012/031144에 기술된 제1 관능성-활성화된 PEG 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 생물학적 샘플 수집 장치는 제1 관능성 활성화된 PEG 성분과 반응할 수 있는 제2 관능성 활성화된 PEG 성분을 포함하는 추가의 챔버를 추가로 포함하여 고체-상태 실크-기재 물질을 형성할 수 있다.

장치가 혈액 수집 튜브인 일부 실시양태에서, 챔버는 통상적인 혈액 수집 튜브에서 공통으로 발견되는 적어도 하나의 첨가제를 추가로 포함할 수 있고, 이러한 첨가제는 예를 들어 응결 활성화제, 나트륨 헤파린, 리튬 헤파린, 트롬빈-기재 응결 활성화제, K₂EDTA, 액체 K₃EDTA, Na₂EDTA, 칼륨 옥살레이트, 플루오린화나트륨, 나트륨 폴리아네톨 술포네이트(SPS), 산 시트레이트 덱스트로스 첨가제(ACD)(시트르산삼나트륨 및 시트르산 포함), 시트르산나트륨, 시트레이트, 테오필린, 아데노신, 디피리다몰(CTAD)을 포함하는 혼합물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 기술한 생물학적 샘플 수집 장치의 하나 이상의 실시양태를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 예를 들어 국제출원번호 WO/2012/031144에 개시된 관능성 활성화된 PEG 성분을 포함하는 겔화-유도 작용제, pH-환원제(예를 들어, 산), 또는 이들의 조합을 함유하는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 키트는 실크-가용화제를 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 실크-가용화제의 실시예는 물, 완충 용액, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출되는 표적 성분은 단백질 또는 펩티드가 아니고, 실크-가용화제는 실크 피브로인을 분해하는 프로테이나제를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 키트는 안정화제를 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있고, 안정화제는 생물학적 샘플의 적어도 하나의 성분을 안정화시킨다. 예를 들어, 안정화제는 사카라이드, 당 알콜, 이온, 계면활성제, 아미노산, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴, 및 젤라틴 유도체, 항산화제, 본원에서 기술한 임의의 안정화제 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 안정화제는 뉴클레아제 억제제 또는 프로테이나제 억제제일 수 있다. 한 실시양태서, RNA가 생물학적 샘플로부터 검출되고, 안정화제는 RNase 억제제를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 키트는 생물학적 샘플의 상기 적어도 하나의 성분을 검출하기 위한 작용제를 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자형 결정 또는 표현 분석을 위한 키트의 목적에 따라 본 기술분야의 숙련자는 분석을 수행하기 위한 적당한 작용제를 결정할 수 있다. 단지 예로서, 작용제는 성분-정제 작용제(예를 들어 비-표적 성분, 예컨대 게놈 DNA로부터 표적 성분, 예컨대 RNA를 정제하는 작용제; 또는 생물학적 샘플로부터의 추출물 단백질); 핵산 증폭 작용제(예를 들어, 프라이머, 폴리머라제, 올리고뉴클레오티드에 제한되지 않음); 면역-친화도-기재 검출 작용제(예를 들어, 1차 및/또는 2차 항체, 및 압타머에 제한되지 않음), 표지제(예를 들어, 형광 염료, 비색 효소-기질 반응을 위한 작용제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 개별 발색 기질(예를 들어, TMB, DAB, ABTS), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

본원에서 기술한 조성물의 일부 실시양태에서, 실크 피브로인을 변형하여 그의 분해 및 따라서 활성제의 방출을 제어할 수 있는데, 예를 들어 방출은 시간 내지 일, 또는 월 범위의 기간 동안 발생한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술한 조성물은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있고 입수가능한 다른 타입의 전달 시스템과 조합될 수 있다. 이들은 예를 들어 중합체-기재 시스템 예컨대 폴리락트산 및/또는 폴리글리콜산, 폴리무수물, 폴리카프로락톤, 코폴리옥살레이트, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산, 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 전술한 중합체 함유 약물의 마이크로캡슐은 예를 들어, 미국특허번호 5,075,109에 기술되어 있다. 다른 실시예는 스테롤 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 및 지방산 또는 네우카 1 지방 예컨대 모노-, 디- 및 트리글리세리드를 포함하는 지질-기재인 비중합체 시스템; 히드로겔 방출 시스템; 리포솜-기재 시스템; 인지질 기재-시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기재 시스템; 또는 부분적으로 융합된 임플란트를 포함한다. 구체적인 예는 조성물이 매트릭스 내에 한 형태로 함유되어 있는 부식 시스템(예를 들어, 미국특허번호. 4,452,775, 4,675,189, 5,736,152, 4,667,014, 4,748,034 및 - 29 5,239,660에 기술되어 있음), 또는 활성 성분이 방출 속도를 제어하는 확산 시스템(예를 들어, 미국특허번호 3,832,253, 3,854, 480, 5,133,974 및 5,407,686에 기술되어 있음)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 제제는 예를 들어, 마이크로구체, 히드로겔, 중합체 저장소, 콜레스테롤 매트릭스, 또는 중합체 시스템일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 시스템은 조성물의 지속 또는 제어 방출이 예를 들어 조성물을 함유하는 제제의 확산 또는 부식/분해 속도의 제어를 통해 발생하게 할 수도 있다. 추가로, 펌프-기재 하드웨어 전달 시스템을 사용하여 본원에서 기술한 조성물 또는 조제용 물질의 하나 이상의 실시양태를 전달할 수 있다. 장기간 지속 방출 제제 또는 임플란트의 사용은 만성 조건, 예컨대 당뇨병의 치료에 특히 적합하다. 본원에서 사용한 바와 같은 장기간 방출은 제제 또는 임플란트가 본원에서 기술한 조성물 또는 조제용 물질을 적어도 30일 또는 적어도 60일 동안의 치료 수준으로 전달하도록 이루어지고 배열되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 장기간 방출은 활성제를 수개월 동안의 치료 수준으로 전달하도록 구성되는 제제 또는 임플란트를 의미한다.

특정한 예시적인 응용

본원에서 기술한 다양한 측면의 실시양태에 따르면, 실크 피브로인 및 생물학적 샘플을 포함하는 실크-기재 물질의 형성은 생물학적 샘플의 적어도 하나의 성분을 안정화할 수 있고, 이는 나중에 성분의 검출 및/또는 분석을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플을 포함하는 이러한 실크-기재 물질은 현재 생물학적 샘플을 저장 및 처리하여 인간 건강의 진단 평가를 위한 샘플 품질을 유지/보유하는 전형적인 방법인 냉장 또는 동결을 하지 않으면서 저장 및 운송할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서 기술한 실크-기재 물질 및 방법은 진단 용도에 유용할 수 있다. 예를 들어, 실크-기재 물질 및 방법은 저장 및/또는 운송 동안 또는 연속식 냉각 저장을 지원하는 최소 기반시설이 없는 몇몇 개발도상국 또는 원거리 필드 조건에서 생물학적 샘플의 품질을 유지 및/또는 보유하는 데 이용할 수 있어, 생물학적 샘플의 적어도 하나의 성분이 진단 용도를 위하여 분석될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에서 기술한 실크-기재 물질 및 방법은 이전에 기술한 다음의 조건, 즉 (a) 저장 및/또는 운송 동안 0℃ 초과의 온도(예를 들어, 적어도 약 실온 이상) (b) 저장 및/또는 운송 동안 광 노출(예를 들어, UV, 적외선, 및/또는 가시광선); 및 (c) 저장 및/또는 운송 동안 적어도 약 10% 이상의 상대 습도 중 적어도 하나 또는 임의의 조합하에서 생물학적 샘플의 품질을 유지 및/또는 보유하는 데 이용할 수 있다.

따라서, 본원에서 제공하는 또 다른 측면은 본원에서 기술한 실크-기재 물질을 사용하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 실크 피브로인 및 생물학적 샘플을 포함하는 실크-기재 물질의 하나 이상의 실시양태를 제공하고; (b) 생물학적 샘플의 적어도 하나의 성분을 적어도 한 번 분석한다.

일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 생물학적 샘플을 실크 피브로인과 접촉시킴으로써 형성할 수 있다. 실크-기재 물질을 형성하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 실크-기재 물질은 액체 상태일 수 있다. 다른 실시양태에서, 실크-기재 물질은 분해가능한 고체-상태 물질(예를 들어 가용성 실크-기재 필름, 또는 발포체에 제한되지 않음)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애의 진단이 필요한 대상체 또는 환자가 생물학적 샘플을 제공할 수 있고 생물학적 샘플을 실크 피브로인과 접촉시켜 실크-기재 물질을 형성할 수 있고, 이를 분석하기 위하여 진단 시험 실험실에 보낸다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 임상 환경 시 숙련된 진료의에 의해 대상체로부터 수집될 수 있고, 이어서 생물학적 샘플을 실크 피브로인과 접촉시켜 실크-기재 물질을 형성하여 분석을 위하여 진단 시험 실험실에 보낸다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 적어도 하나의 성분은 생물학적 샘플로부터 성분을 분리하지 않으면서 검출 및/또는 분석될 수 있고, 대안의 실시양태에서, 성분은 본 기술분야에 알려진 임의의 방법을 이용하여 검출 및/또는 분석하기 전에 실크-기재 물질의 적어도 일부로부터 추출 또는 회수될 수 있다. 본원에서 기술한 실크-기재 물질의 일부 실시양태에 따르면, 실크-기재 물질은 수용액(예를 들어, 물, 완충 용액, 또는 이들의 조합)에서 가용성일 수 있다. 셀룰로스-기재 기술, 예를 들어, 혈액이 여과지에 흡수되어 회수하기 어려운 건조된 혈액 반점과는 다르게, 본원에서 기술한 분해가능한 실크-기재 물질의 적어도 일부는 수용액(예를 들어, 물, 완충 용액, 또는 이들의 조합)에서 가용성으로 될 수 있다. 이어서 최종 실크/생물학적 샘플 용액은 추가 정제 없이 액체 검정, 예를 들어 실시예에서 기술한 일상적인 ELISA 및 루미넥스™ 검정할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법은 생물학적 샘플의 상기 적어도 하나의 성분을 적어도 한 번 분석하기 전에 실크-기재 물질의 적어도 일부를 수용액(예를 들어, 물, 완충 용액, 또는 이들의 조합)과 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

다양한 유형의 분석이 예를 들어 작용제/성분의 본질에 따라 생물학적 샘플의 활성제/표적 성분에 대하여 수행될 수 있다. 분석의 비제한적인 예는 유전자형 결정, 핵산 서열분석, 발현 분석(예를 들어, 단백질 수준, 또는 전사체 수준), 결합 친화도, 효소적 활성, 형질감염 효율, 세포 카운팅, 세포 식별, 세포 생존율, 면역원성, 감염성, 대사물 프로파일링, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 적어도 하나의 성분은 적어도 하나의 유전자형 결정 또는 핵산 서열분석, 발현 분석(예를 들어, 단백질 수준 및/또는 전사체 수준), 대사물 프로파일링, 또는 이들의 임의의 조합에 따라 분석된다. 이러한 분석을 수행하는 다양한 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 실시간 정량적 PCR, 마이크로어레이, 웨스턴 블롯, 면역조직화학적 분석, 효소 결합 흡광도 검정(ELISA), 질량 분광측정법, 핵산 서열분석, 유동 세포측정법, 기체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 핵 자기 공명(NMR) 분광분석법, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 핵산 서열분석을 위한 기법은 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 신생 서열분석, 차세대 서열분석, 예컨대 대량 병렬 서명 서열분석(MPSS), 폴로니 서열분석, 파이로시퀀싱, 일루미나 (솔렉사) 서열분석, SOLiD 서열분석, 이온 반도체 서열분석, DNA 나노볼 서열분석, 헬리스코프 단일 분자 서열분석, 단일 분자 실시간(SMRT) 서열분석, 나노포어 DNA 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석, 질량 분광측정법을 이용한 서열분석, 마이크로유체 생어 서열분석, 현미경검사-기재 서열분석 기법, RNA 폴리머라제(RNAP) 서열분석, 또는 이들의 임의의 조합에 제한되지 않는 핵산 또는 유전자 발현 측정을 결정하도록 성분을 검정하는 데 이용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 적어도 하나의 분석은 판독 기기 또는 시스템과 인터페이스할 수 있는 포맷으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 분석은 시스템상에서 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 분석 또는 실크-기재 물질과 수용액을 접촉시키기 전에, 실크-기재 물질은 더 작은 부분으로 감소 또는 등분될 수 있고, 예를 들어 그 중 몇몇은 나중에 분석하기 위하여 보관될 수 있고/거나 상이한 표적 성분(예를 들어, 단백질, 핵산, 및/또는 대사물)을 위하여 분석될 수 있다. 실크-기재 물질은 중량 또는 부피 기준으로 더 작은 부분으로 등분될 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 일부 실시양태 및 측면을 예시한다. 본 발명의 사상 또는 범위를 변경하지 않으면서 다양한 변형, 첨가, 치환 등이 수행될 수 있고, 이러한 변형 및 변화는 후술하는 청구범위에서 정의되는 본 발명의 범위 내에 포함된다는 점은 관련 기술분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 하기의 실시예는 본 발명을 어떤 식으로든 제한하지 않는다.

실시예 1: 실크 피브로인을 포함하는 조성물을 제조하는 데 사용되는 예시적인 물질 및 방법, 및 그의 특성화

실크 피브로인 용액. 문헌 [Sofia S et al. (2001) Journal of Biomedical Materials Research, 54, 139-148]에 기재된 바와 같은 변경된 추출 프로세스를 통해 누에 누에나방 고치를 정련하였다. 저분자량 실크 피브로인의 조성물을 제조하는 예시적인 프로토콜이 본 명세서에서 제공된다.

- 고치를 절단하여 고치 내부로부터 번데기, 번데기 껍질 및 모든 더러운 것을 제거한다.

- 약 60분 이상의 정련 시간을 이용하여 ~0.02M의 비등하는 탄산나트륨 (Na₂CO₃) 용액에서 고치 조각을 정련한다.

- 적어도 세 번, 매번 적어도 30분 동안, 물(예를 들어, 밀리-Q 워터)에서 정련된 실크 피브로인을 헹군다.

- 헹군 실크 피브로인을 공기 건조시킨다.

- 60℃의 9.3M 브로민화리튬 용액(미국 미주리주 소재 시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 리에이전트플러스(ReagentPlus) > 99%)에 실크 피브로인을 용해시키고, 예를 들어 슬라이드-에이-라이저 투석 카세트(미국 일리노이주 소재 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), MWCO 3,500)로 약 2일 동안 정기적으로 예를 들어 매 6시간마다 물을 교환하면서, 물(예를 들어, 밀리-Q 워터)에 대해 투석한다.

- 대략 11,000rpm으로 매번 20분 동안, 제조된 수성 실크 용액을 2회 원심분리 한다.

- 제조된 수성 저분자량 실크 피브로인 용액은 7% wt/vol 내지 9% wt/vol의 실크 피브로인 농도를 갖는다. 이 지점까지는, 실크 피브로인 용액은 정제된 상태 그대로의 용액이라 불린다. 정제된 상태 그대로의 실크 피브로인 용액에 추가의 오토클레이빙 단계를 행할 수 있고, 이후 실크 피브로인 용액을 오토클레이빙된 용액이라 한다.

- 실크 피브로인 용액을 4℃에서 저장한다.

고체-상태 실크 피브로인 제조. 정제된 상태 그대로의 또는 오토클레이빙된 실크 피브로인 용액에 도 1에 개략화된 바와 같이 동결 단계, 및 1차 건조, 또는 1차 및 2차 건조 단계의 조합을 행한다. 동결 단계 동안, 실크 피브로인 용액을 실온에서 -40℃까지 대기압에서 0.8℃/분의 비율로 동결하고, -40℃에서 480분 동안 유지한다. 1차 건조 동안, 실크 피브로인 용액을 -40℃에서 -20℃까지 100 mtorr에서 0.2℃/분의 경사 비율로 건조시키고, -20℃에서 2400분 동안 유지한다. 2차 건조 동안, 실크 피브로인 용액은 -20℃에서 4℃까지 100 mtorr에서 0.2℃/분의 경사 비율로 건조시키고, 4℃에서 620분 동안 유지한다. 동결 단계 및 1차 건조 단계 말미에 형성된 실크 피브로인 발포체를 1차 건조만의 발포체(P)라 한다. 동결 단계, 1차 건조 단계 및 2차 건조 단계 말미에 형성된 실크 피브로인 발포체를 1차+2차 건조 발포체(P+S)라 한다. 실크 발포체를 4℃, 22℃, 또는 37℃에서 저장한다. 이어서 도 1의 흐름도에 따라, 실크 발포체를 용해시킴으로써 실크 피브로인 용액을 제조할 수 있다.

특성화. 겔 전기영동을 사용하여 상이한 온도 저장 조건 및 비등 시간 하에서 실크 발포체로부터 제조된 실크 피브로인 용액의 분자량 분포를 측정한다. 도 2는 분자량 분포를 정량화하는 데 사용되는 방법을 도시한다. 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 피브로인 분자의 전기영동 이동성을 측정하였다. 해당 각 조건에 대해, 0.15%(1.5 mg/mL) 실크 피브로인 용액을 3 내지 8% 트리스 아세테이트 겔(NuPAGE, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 뉴욕 주 그랜드 아일랜드) 내로 로딩하였다. 겔에 기준(마크12 단백질 표준, 라이프 테크놀로지스)으로서 고분자량 래더를 실행하고, 콜로이드성 청색 염색 키트(라이프 테크놀로지스)로 염색하였다. 겔을 이미지화하고, 픽셀 음영 분석을 행하고, 하나의 피크 강도 값에 대해 모든 레인에 걸쳐 표준화함으로써(이미지제이, NIH, 미국 메릴랜드주 베데스다) 실크 용액의 분자량 분포를 측정하였다. 분자량 래더를 포함하는 직사각형 브래킷은 각 레인에 적용하였고, 이것을 기준 프레임으로서 사용하였다. 브래킷은 자국의 시작 바로 위에 위치하여, 21.5 kDa 마커 지점인 최하부 단백질 자국의 경계를 지나 연장되었다.

이미지제이 소프트웨어는 전 직사각형에 걸쳐 수평으로 픽셀 강도를 자동으로 평균을 내고, 이어서 자국의 길이 아래로 이 평균을 플롯팅한다(자국의 최상부=왼쪽, 자국의 최하부=오른쪽). 래더 위치를 이용하여 이하와 같은 브래킷을 생성한다:

1) 200 kDa 초과 (자국의 최상부로부터 200kDa 래더 위치까지)

2) 200 kDa - 116 kDa

3) 116 kDa - 66.3 kDa

4) 66.3 kDa - 36.5 kDa (분리할 수 있는 최저 분자량 위치)

각각의 분자량 브래킷의 분자량 분포 백분율을 정의하기 위해, 각 브래킷 내의 곡선 아래 면적(최소 백그라운드 경계 위)을 자국 경계의 최상부와 최하부 간의 총 면적으로 표준화한다. 이어서, 분자량에서의 변화를 세미-정량화하기 위해 상이한 비등 시간으로부터 제조된 샘플 전체에 걸쳐 브래킷된 범위를 플롯팅한다. 예를 들어, 도 2b에서, 200kDa 초과의 분자량을 갖는 실크 피브로인의 백분율을 이하의 공식을 이용하여 계산할 수 있다.

도 3, 4 및 5는 각각 4℃, 22℃, 및 37℃에서 저장된 실크 발포체로부터 수득한 실크 피브로인 용액의 분자량 분포를 도시한다. 각 저장 온도에 대해 2가지 유형의 실크 발포체를 사용하였다: 1차 건조를 통한 실크 발포체, 및 1차 및 2차 건조 둘 모두를 통한 실크 발포체. 검사한 모든 실크 발포체 샘플에 대해, 200kDa 이상의 분자량을 갖는 실크 피브로인의 백분율은 정련 시간이 증가함에 따라 감소하였다. 한편, 120kDa 이하의 분자량을 갖는 실크 피브로인의 백분율은 정련 시간이 증가함에 따라 증가하였다. 긴 정련 시간(60분 이상)의 결과, 본 명세서에 기재한 저분자량 실크 피브로인은, 집단 내의 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰) 또는 총 중량의 15% 이하가 200 kDa를 초과하는 분자량을 갖고, 집단 내의 실크 피브로인 단편의 총 수(또는 총 몰) 또는 총 중량의 50% 이상이 명시된 범위(명시된 범위는 약 3.5 kDa 내지 약 120 kDa이고, 또는 약 5 kDa 내지 약 125 kDa임) 내의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 분자량 분포를 갖는 실크 피브로인 단편의 집단을 포함한다.

도 1에 도시된 동결건조된 시스템으로부터의 분쇄된 실크 분말의 용해도 차이를 비교하기 위해 도 1의 가용화 비율 표에 따라 i) 비등 시간 및 ii) 분말 부하의 질량을 변경하면서 연구를 행했다. 용액의 실크 농도를 중량/부피%의 단위로 직접 측정하기 위해 각 회수된 용액으로부터 필름을 캐스팅하였다. 완전한 건조 및 칭량에 이어, 실크를 물에 불용성이 되게 하거나 또는 하류 응고 기술의 유용성을 억제할 수 있는 임의의 가교된 입체형태 상태의 부재를 확인하기 위해 FTIR을 이용하여 2차 구조에 대해 필름을 측정하였다. 가교된 수불용성 구조를 형성하는 능력을 입증하기 위해 이들 고체 필름을 메탄올로 처리하였다. 회수된 용액의 측정된 농도를 초기 실크 분말 부하 질량별로 그룹핑하여 도 6에 이하에 도시하였다. 참조로, "정제된 상태 그대로의" 및 "오토클레이빙된" 실크 시스템 둘 모두의 분자량 분포 또한 도 6에 포함되어 있다.

도 6에서 제조된 필름을 자스코(Jasco) FTIR 기계 상에서 평가하여 구조를 확인했다. 도 7에 도시된 바와 같이, 아미드 I 및 II 영역은 캐스팅된 그대로의 필름에 대해 1650 cm^-1 및 1525 cm^-1 주위를 중심으로 하는 특징적인 피크를 나타내며, 이는 대체로 무정형 "실크 I" 입체형태(즉, 비-가교됨)를 제안한다. 그러나, 이들 필름을 90% v/v 메탄올로 1시간 동안 처리하면, 아미드 I 영역은 오른쪽으로 시프트되고 1700 cm^-1에서 작은 숄더(shoulder)를 포함하는 반면, 아미드 II는 1535 cm^-1에서 더 넓은 숄더로 시프트한다. 이들 메탄올-유도된 변화는 "실크 II" 입체형태의 β-시트 구조 특성의 형성 때문이다.

6개월 발포체 안정성. 저장 6개월 후에 다양한 온도 조건에서 비등 시간을 달리하는 동결건조된 실크를 밀링함으로써 형성된 실크 분말의 용해도를 비교하는 실험을 행했다. 도 8은 1차 건조만을 이용하여 형성된 발포체로부터의 결과를 도시하는 반면, 도 9는 1차 및 2차 건조를 이용하여 형성된 발포체를 도시한다.

6개월 필름 안정성. 저장 6개월 후에 도 10에 도시된 바와 같은 다양한 온도 조건에서 두꺼운 실크 필름 및 얇은 실크 필름의 용해도를 비교하는 실험을 행했다.

실시예 2. 실크-혈액 샘플로부터 혈액 회수

물질 및 방법. 신선한 공여자 혈액(바큐테이너 관, Na-헤파린 항응고제, 리서치 블러드 컴포넌츠(Research Blood Components), 미국 매사추세츠주 브라이튼)이 취출된 지 1시간 내에 단일 공여자로부터 전달되었다. 이어서 관을 즉시 혈장 단리를 위해 1000xg에서 원심분리하였다. 이어서 혈장 분취물을 양성 대조군으로 사용하기 위해 즉시 동결시켰다. 상술한 바와 같이 누에 누에나방의 고치로부터 실크 용액을 제조하였다. 고치를 0.02M Na₂CO₃의 용액에서 비등시킴으로써 10, 20, 30 또는 60분 동안 정련하였다. 실크 필름을 폴리디메틸실록산(PDMS) 표면 상에 캐스팅하는데, 이때 혈액 또는 혈장 100㎕를 1.9mL의 실크 용액(비등 시간과 무관하게 물 중 ~8 중량%)과 혼합한 후, 두꺼운 필름(3 x 2.5cm 직경 캐스팅 표면) 또는 얇은 필름(3 x 표면 상의 7.5cm 직경 캐스팅)으로서 2 mL를 캐스팅하였다. 밤새(8시간) 필름을 건조한 후, 분석을 위해 샘플을 40 mg 쿠폰으로 분할하였다. 예비 실험에서, ELISA 판독을 위해 혈장 및 혈액 필름으로부터 10 mg 및 40 mg의 쿠폰을 제조하여 표준 곡선 내의 분석에 요구되는 질량 부하를 조율하였고, 40 mg 지점이 회수 연구에 대해 적합한 것으로 확인되었다(데이터 제시하지 않음). 필름을 희석제로서의 PBS 960㎕에 첨가하고, 5초 동안 와류시키고, 이어서 이용가능한 상청액을 사용하여 즉시 검정하였다. 모든 ELISA에 대해(표 1의 압캠(abCAM) 또는 R&D 시스템즈), 동결된 혈장 분취물을 제조업체의 권고사항(1:100 내지 1:8000)에 따라 희석시키면서, 이론적 회수 추정치에 기초하여 40x 더 작은 희석도로 용해된 혈액 및 혈장 필름을 시험하였다.

[표 1]

혈장 및 혈액의 회수율 계산. 혈액 및 혈장 쿠폰으로부터 회수된 단백질의 수치를 공여자-일치된 혈장에서 발견된 농도로 정확하게 변환하여 회수율 효율을 측정하기 위해, 혈액 및 혈장의 몇몇 물리적 측정을 행하였다. 흄 후드에서 24시간 동안 공지된 부피의 전혈 또는 전체 혈장을 건조시키고 잔류물을 측정함으로써, 혈액 또는 혈장의 wt/vol 분율(중량%)(즉, 단위 부피 [mL] 당 혈액 또는 혈장 고체 [g])을 측정하였다. 이어서, 혈액 중 혈장 부피를 55%로 가정함으로써 혈액 부피 당 혈장 고체의 중량 분율을 추정하였다. 각 필름의 중량 당 혈장 고체는, (표 2의 수치에 따라) ~20mg의 전혈 및 144mg의 실크가 매 100 ㎕의 혈액 캐스팅 용액에서 발견되고, 혈장 캐스팅 용액에서도 동일하다는 것에 의해 계산되었다.

[표 2]

최종적으로, 검정에서의 혈장 또는 혈액의 이론적 부하량은 상기 분율으로부터 계산할 수 있다. 각 20mg 쿠폰 중의 혈장 고체를 검정에서 측정된 혈장 농도[mg/mL]와 곱하고 이어서 이것을 소정의 [1.02 mL] PBS 재현탁 부피 중 총 혈장 고체 질량으로 표준화한다. 분석에 행해진 가정을 설명하기 위해, 또한 이론적 부하 값으로부터 정확한 회수 추정치를 측정하기 위해 물리적 혈액 및 혈장 파라미터를 어떻게 포함시켰는지를 보여주기 위해 이들 계산을 아래에 나타낸다.

혈장 및 혈액의 회수율 계산 섹션에서의 설명에 따라 샘플 회수율을 계산하였다. 동일한 공여자의 반복 샘플로부터의 3중 판독치에 기초하여 샘플 분산을 계산하였다. 그 결과를, 다수의 비교치를 갖는 이원 변량 분석 및 α=0.05 패밀리-방식 유의도 수준(family-wise significance level)에서의 터키 보정 시험(Tukey's correction testing)을 이용하여, 상이한 비등 시간 및 상이한 두께("두꺼운" 대 "얇은")를 이용하여 제조한 필름들 간에 비교하였다.

결과. 본 발명자들은 모델 마커로서의 CRP 및 피브리노겐에 대해, 실크로부터의 회수율이 통계학적으로 유의한 수준으로 비등 시간 및 필름 두께 둘 모두에 좌우된다는 것을 알았다(도 11 참조); 게다가, CRP의 경우에는, 혈액 및 혈장 회수율 둘 모두에 대해, 두께 및 비등 시간의 변수가 강력한 상호작용 효과를 가졌으며, 이는 실크 매트릭스로부터 회수율을 개선하는 것에 있어 추가적인 특징이 있음을 제안한다. 특정 비교에 관하여, 60분 동안 비등한 실크는 비등 시간 및 두께와 무관하게 최대 회수율을 제공하는 매트릭스를 형성한 반면, 저 비등 시간 시스템은 용량-의존 방식으로 회수능을 감소시켰다. 모든 비등 시간에 대해 유의한 것은 아니지만, 두꺼운 필름은 얇은 대응물에 비해 샘플 유형(혈액 대 혈장)에 관계 없이 분석물의 저장물을 방출하는 데 있어 특히 더 효과적이었다.

실시예 3. 실크 피브로인 용액에서의 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)의 안정화

전술한 누에 누에나방 고치로부터 실크 용액을 제조하였다. 0.02M Na₂CO₃ 용액에서 비등시킴으로써 10, 20, 또는 60분 동안 고치를 정련하였다. 실크 용액은 1x PBS를 포함하거나 완충제가 없는 1w/v% 또는 4 w/v%이다. 실크 용액은 정제된 상태 그대로이거나 오토클레이빙되었다. 다음의 대조군을 사용한다: 1x PBS 중의 0.1% BSA, 1x PBS 중의 1.0% BSA, 및 1x PBS. bFGF를 각 용액에 첨가하여 최종 농도 250 ng/mL가 되었다. 모든 bFGF-함유 용액을 회수율 측정 이전에 1주 동안 37℃에서 저장하였다. 도 12는 실크 피브로인 용액으로부터의 bFGF 회수율을 도시하며, 저분자량 실크 피브로인이 더 높은 회수율로 이어짐을 입증하고 있으며, 구체적으로는 PBS 중의 1%의 낮은 MW 실크가, 사용된 실크가 오토클레이빙되거나 또는 정제된 상태 그대로의 것 (즉, "순수한 실크")인지에 상관없이, 가장 유망한 bFGF의 회수율을 얻었다는 것을 입증하고 있다. 도 12a 및 12b의 빨간 점선은 PBS 대조군의 값을 도시한다.

겔화 모니터링 실험의 경우, bFGF가 첨가되지 않는다. 550 nm에서의 흡광도(마츠모토(Matsumoto)+, 2006)를 사용하여 겔화를 모니터하였다. 도 13a 및 13b는 정제된 상태 그대로의 실크 피브로인 용액 및 오토클레이빙된 실크 피브로인 용액에 대한 겔화 결과를 도시한다. 도 14는 각각 4℃, 22℃ 및 37℃에서의 (a) 정제된 상태 그대로의 실크 피브로인 용액 및 (b) 오토클레이빙된 실크 피브로인 용액에 대한 겔화의 상태를 도시한다.

상세한 설명 및 실시예에 언급된 모든 특허 및 기타 간행물은 어떠한 목적으로든 참조로서 본 명세서에 거명된다. 이들 간행물은 본원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 본 발명자들이 이전 발명에 의하여 또는 임의의 다른 이유로 인해 이러한 개시를 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이들 문서의 날짜에 관한 모든 언급 또는 내용에 관한 진술은 출원인이 입수가능한 정보에 기초하고 있으며, 이들 문서의 날짜 또는 내용의 정정에 관해서는 전혀 허가되지 않는다.

실시예 4: 실크 피브로인 매트릭스 중의 혈액 및 혈액 성분의 안정화

셀룰로스 기반 기술이 현재 생체시편 보존(biospecimen preservation)의 시장 점유율을 장악해오고 있다. 손가락, 발뒤꿈치, 또는 발가락으로부터 란세트(lancet)로 뽑은 혈액 몇 방울을 특별히 제조된 흡수제 여과지 상에 적용함으로써 건조된 혈액 반점(DBS) 시편을 수집한다. 이들 종이 매트릭스는 특허 약품 및/또는 내장된 효소 억제제를 갖도록 설계될 수 있다. 일단 건조되면, 실험실에서, 기술자가 자동화된 또는 수동의 구멍 펀치를 사용하여 포화된 종이의 작은 디스크를 시트로부터 분리하고, 그 디스크를 평평한 바닥의 마이크로타이터 플레이트 상에 떨어뜨린다. 혈액은 4℃에서 밤새 완충된 염수에서 용리된다. 용리된 물질을 함유하는 결과의 플레이트는 후속 시험을 위해 희석이 행해질 수 있는 "마스터"를 형성한다. 이와 같이, 1960년대 이후로 개별적 진단 및 공중 보건 목적용으로 혈액을 수집하기 위해 여과지를 사용하여 왔다(문헌 [Guthrie and Susi, 1963]). CDC는 그 웹사이트(www.cdc.gov/labstandards/nsqap_bloodspots.html) 상에 DBS를 이용하여 안정화된 물질의 활성 목록(지난 20-30년에 걸쳐 인용 문헌으로부터 엮은 것임)을 유지하며, CDC는 혈액 반점을 위한 독립적인 품질 관리 프로그램을 유지한다. 카드는 원래는 "와트만(Whatman) FTA 카드 기술"로서 와트만®에 의해 제조 및 마케팅되었으며, GE 헬스케어(GE Healthcare), 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline), 및 알투라스 아날리틱스(Alturas Analytics)에 의해 리패키징되어 판매되어 오고 있다. 알스트롬(Ahlstrom)과 같은 새로운 회사 또한 유사한 액체 여과 및 안정화 기능을 갖는 섬유 복합체를 마케팅하고 있다 (www.ahlstrom.com/en/products/enduseApplication/medicalAndHealthcare/laboratoryAndDiagn osticsFiltration/Pages/Diagnosticfiltration.aspx).

30년 이상 동안, 연구원들은 DBS 샘플의 많은 장애에 대한 마커의 온도/안정성 관계를 연구해 왔고, 특히 저-부피 분석 및 원거리 진단에 대한 요구 때문에 새로운 스크리닝 적용에 초점을 맞춰 왔다. 현재까지 연구원들은 종이 포맷은 관심이 있는 모든 분석물을 커버하기에 적합하지 않으며, 일부 마커는 화학적으로 변형된 카드를 이용하여 불충분하게 회수된다는 것을 발견했다. 이들 종이 기반 시스템의 몇몇 특정 결점 또한 광범위한 세트의 임상 상황의 수년간의 평가에서 밝혀져 왔다. DBS 시편은 달성할 수 있는 검출 하한치(LLOD) 및 적당한 정량적 식별이 되는 동적 범위에 제한을 둔다(문헌 [Andreotti et al., 2010]). 시편의 완전성을 보장하는 것 또한 RNA 바이러스(문헌 [Dineva et al., 2007; Puren et al., 2010])에 대한 분자 시험에서 수송 제한으로 남아있다. 따라서, 생물학적 샘플 및/또는 그의 성분을 (예를 들어, 주위 조건에서) 안정화할 수 있고, 검출 및/또는 분석용의 안정화된 샘플로부터 충분한 양의 다양한 분석물의 회수를 허용할 수 있는 개선된 기술 및/또는 제품이 필요하다.

대규모의 스크리닝 연구(역학 또는 독성학)에서, 현지의 숙련된 사혈 전문 의사의 부족 또는 정맥 천자와 같은 외과적 샘플링 기술에 대한 일반적인 혐오감 때문에, 대부분의 환자로부터 손가락 또는 발뒤꿈치를 찔러서 매우 작은 모세관 혈액 샘플을 얻을 수 있다. 게다가, 인간의 전혈 및 혈액 성분은 매우 불안정할 수 있는데, 따라서 인간 건강의 분석 평가를 위한 샘플의 질을 유지하고 보유하기 위해 특별한 취급을 필요로 한다. 채혈 또는 혈액의 분획(혈장, 혈청, 백혈구 연층, 적혈구 용적률 등)을 저장하고 취급하는 통상적인 방법은 동결(-20℃)에 의한 것이며, 또는 매우 불안정한 RNA의 경우에는 샘플의 완전성을 보존하기 위해 초-저온(-80℃)에서의 동결에 의한 것이다. 생물학적 샘플을, 직접 분석하기 위해 또는 추가의 혈장 단백질/RNA의 추출을 위해 수집 장소(필드, 병원 등)에서 연구실로 운송하는 것은 종종 매우 비용이 드는 일인데, 왜냐하면 이것은 스티로폼 박스 또는 드라이아이스 등의 부피가 큰 물질의 사용을 필요로 하기 때문이다. 이러한 부피가 큰 패키징은 종종 로컬 운송의 경우에도 비싼 운송 요금(표 3 참조)을 초래한다.

[표 3]

일부 개발도상국 또는 원거리 필드 조건에서는, 연속적인 냉장보관을 지원하는 최소한의 기반시설이 존재하지 않으므로, 행해질 수 있는 정밀 진단의 범위가 제한된다. 불행하게도, 약동학(PK) 스크리닝을 위해 또는 치료 효능을 모니터하고 2차 요법으로 적절한 전환을 안내하기 위해 저렴하고/내구성 있는 저장 포맷을 절실히 필요로 하는 것이 바로 이 한정된 자원 환경이다. 게다가, 연방 조직, 예컨대 질환 제어 및 예방 센터(Center for Disease Control and Prevention; CDC)에 의해 행해지는 범인구적인 역학 스크리닝은, 비침습적 소량 샘플 분량을 회수하는 것에만 의존하는 샘플 안정화에서의 보다 간소화된 접근방법(문헌 [Mei et al., 2001])으로부터 대단히 혜택을 받을 것이다. 제한적일지는 몰라도, 기존의 기반시설 환경을 통해 이들 단체가 생물학적 물질을 발송하는 단순하고 비싸지 않은 툴셋이 가능하다면, 우리는 세계적인 건강 모니터링의 패러다임에서의 변화를 볼 수 있을 것이며 더 많은 국제 단계 II/III 임상 연구를 용이하게 할 수 있을 것이다.

본 연구에서, 본 발명자들은 적절하게 제조되고 재구성된 실크 피브로인이 소정 시간 및 소정 범위의 저장 온도에 걸쳐 전혈 및 혈액 성분을 안정화시킬 수 있고 분석을 위한 성분의 회수를 가능하게 할 수 있다는 것을 입증할 수 있는 실험을 개시한다. 이 실크 단백질 용액은 액체 상태에서 이들 성분과 혼합되고, 이어서 안정화 포맷으로서 기능하는 박막 내에 생체/실크 착물로 공기 건조된다. 대안으로, 핵산을 함유하는 재구성된 실크 용액은 불안정한 저-존재비 핵산 분자가 실크 단백질을 사용하여 마찬가지로 안정화될 수 있음을 입증하는 급속 응고 기술을 제공하기 위해 동결건조될 수 있다. 본 명세서에 설명된 실크 안정화의 이들 실시양태는 활성제 및/또는 생물학적 샘플을 위한 예방보호제로서의 실크 단백질의 고유의 특징에 대한 최근 발견을 기초로 플랫폼을 더 확장시킨다. 예방보호제 또는 안정화제로서 실크 단백질을 사용하는 것에 추가하여, 본 발명자들은 본 명세서에서 실크 처리 특징의 제어가 적어도 부분적으로 최종 안정화 메트릭스의 용해도 특징을 측정할 수 있음을 보여주고 있고, 이것은 결과적으로 일부 치료 환경뿐만 아니라 진단에 사용되는 분석용 생물학적 샘플을 회수하는 기능에 영향을 줄 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명자들은 높은 수준의 혈장 단백질을, 동결된 액체 혈장 저장 포맷(황금 표준)에 비해 실크-안정화된 전혈 또는 혈장으로부터 단리할 수 있음을 구체적으로 입증하였다; 평가된 여러 마커의 경우, 실크 안정화 포맷은 황금 표준에 비교할 때 저-존재비 혈장 단백질의 보유성을 개선하였다. 핵산의 경우, 놀랍게도, 저장 온도에 상관없이 RNAse-비활성화된 실크 용액의 존재 시 RNA의 트랩핑 저장의 탁월한 회수를 발견하였다. 종합해보면, 이러한 조사 결과들은, 재구성된 실크 용액이 다양한 생성물, 예를 들어 진단 분야, 구체적으로는 케어 진단, 저장 및 다른 위치로 샘플의 이송, 및/또는 보존된 생체시편에 대해 향상된 진단이 행해질 필요가 있는 원거리 지역의 환자를 돌보기 위해 사용될 수 있는 다양한 생성물용으로 구성될 수 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 실크에서 안정화된 혈액 샘플은, (손가락 채혈 또는 정맥 채혈을 통해) 혈액을 추출하는 원거리 환경을 환자 건강의 마커를 위해 혈액 성분을 분석할 수 있는 중앙 연구소로 연결하는 콜드-체인(즉, 연속식의 중단되지 않는 냉장보관)을 면하는 것을 도울 수 있다.

혈액의 건식 저장에 대해 현재 마케팅하고 있는 유일한 다른 기술은 종이 기반 기술(와트만® FTA 건조된 혈액 반점 카드)이지만, 이 기술은 콜드-체인 성능 매트릭스와 매치할 수 없기 때문에 널리 채택되지 않는다. 이런 의미에서, 실크 안정화 기술이 온-페이퍼 장치를 대신하도록 사용될 수 있고, 콜드-체인 저장에 의존하는 것으로부터 멀어지도록 패러다임을 바꿀 수 있고, 실크 장치에 대한 새로운 시장을 열 수 있다. 추가로, 본 명세서에 제시된 다양한 측면의 일부 실시양태는 예컨대 소변, 타액 및 다른 체액 또는 세포로부터의 샘플 수집의 다른 형태에, 마찬가지의 진단 유용성을 위해 적용될 수 있다.

실시예 5. 실크 피브로인의 개선된/최적의 용해도에 대한 실크 처리 조절

실크 피브로인으로부터 유도된 물질의 성능 기능에 대한 상이한 처리 조건의 결과를 앞서 평가하였고, 이들 성능 메트릭스는 기계적 성능, 분해성, 및 생물학적 방출 특징을 조절하는 방식을 포함한다(문헌 [Altman et al., 2003; Pritchard et al., 2013; Vepari and Kaplan, 2007]). 그러나 주문형 및 완전한 방식으로 (임의의 종류의) 생물제제를 트랩핑하고 회수하기 위해 그 용해성을 최적화하는 명시적 목적을 위해 실크로부터 유도된 고체 메트릭스를 유전자조작하는 전략을 정의하는 문헌은 없다. 본 발명자들은 실크-유도된 메트릭스의 용해도 특징이 단백질-특정 처리 파라미터에 의해 조작될 수 있으며, 이 단백질-특정 처리 파라미터 중 일부는 상기 문헌에서 (이 목적으로 사용되지는 않았지만) 사전에 밝혀졌으며, 다른 신규한 변형도 여기에 설명되었음을 발견하였다. 여기에서, 단백질 처리 조절에 대한 방식(이것은 사전에 사용가능한 기술을 보강함)은 최적의 수단을 제공하며, 이 최적의 수단을 통해 실크 물질을 용해 및 트랩핑하여 각종 목적을 위해 의미있게 추출/분석되는 물질이 될 수 있음을 보여주고 있다. 덧붙여, 저장 실험은, 필드 환경에서 사용될 때 맞닥뜨릴 수 있는 다양한 온도 조건에 대해 안정성을 검증하기 위해 대표적인 실크 필름 및 동결건조된 발포체 제제를 이용하여 행해졌다.

본원에서는 실크 용해도에 대한 정련 시간의 영향을 평가하였다. 특히, 실크 용액을 비등 시간을 변경하면서 앞서 기재되어 있는 바와 같이 정제하였다 (문헌 [Pritchard et al., 2013]). 간략하게, 누에나방 누에 실크의 고치는 타지마 쇼지 캄파니, 리미티드(Tajima Shoji Co., LTD) (일본 요코하마켄 나카쿠 스미요시초 소재)로부터 구입하였다. 고치를 0.02M Na₂CO₃ 용액 중에서 10, 20, 30, 또는 60분 동안 비등함으로써 정련하였다. 정련된 피브로인을 세정하고, 이어서 주위 조건에서 밤새 건조시켰다. 건조된 피브로인은 슬라이드-에이-라이저 투석 카세트 (분자량 컷 오프 (MWCO) 3.5 kDa (피어스 써모 사이언티픽 인크., 미국 일리노이주 록포드)를 사용하여 2.5일 동안 증류수에 대해 투석된 9.3 M 수성 LiBr 중에 용해시키고, 원심분리하였다. 공지된 부피의 용액 샘플로부터 물을 증발시켜 실크 피브로인 농도 (w/v로)를 결정하였다. 모든 용액은 사용 전에 4℃에서 저장하였다.

실크 매트릭스는 약 10 내지 60분-비등 (MB) 용액을 사용하여 필름 캐스팅 또는 동결건조 방법에 의해 제조하였다. 또한 60MB 용액은 멸균된 대안물로서 표준 20분 오토클레이빙 조건을 사용하여 오토클레이빙하였다. 폴리디메틸실록산 (PDMS) 표면 상에 삼중으로 4 wt/v% 실크 용액을 피펫팅함으로써 실크 필름이 생성되었다. 얇은 필름은 PDMS 표면 상에 가능한 한 펼쳐지면서 동시에 여전히 연속 필름 구조로서 제거 가능하도록 설계되었다. 역으로, 두꺼운 필름은 상례적인 피펫팅 절차 하에 가능한 한 두껍도록 설계되었다. 이들 2가지 필름 캐스팅 절차는 다중-웰 플레이트, 페트리 디쉬, 또는 가능하게는 필드 조건에서 샘플을 피펫팅할 때 대면하는 실제 시나리오를 대표한다. 캐스팅 기술은 도 15에 도식적으로 나타낸다.

동결건조된 발포체 샘플의 경우, 실크 발포체 중에 모노클로날 항체를 안정화하는 것으로 앞서 기재되어 있는 프로토콜을 이용하여 1.5mL의 4 w/v% 용액 및 버티스 제네시스(VirTis Genesis) 25L 슈퍼 XL 동결 건조기를 사용하였다 (문헌 [Guziewicz et al., 2011]). 샘플은 우선 -20℃에서 및 표준 랩 동결기에서 동결하고, 이어서 1차 건조 (vac 100mT, -20℃)를 개시하기 전에 동결건조기를 사용하여 -45℃로의 샘플 냉각을 유지하였다. 샘플의 절반이 이 지점에서 완결되었고, 반면 절반은 실크로부터의 임의의 잔류하는 결합수를 제거하기 위하여 2차 건조 (vac 100mT, 35℃)에 추가로 노출시켰다.

실크 필름과 동결건조된 발포체 둘 모두의 경우, 샘플은 상이한 저장 온도 (4℃, 25℃, 37℃)에서 유지된 이후에 지정된 시점 (0일, 6개월, 및 1년 보류)에서 제거하였다. 실크 필름을 절단하고 분석용 저울을 사용하여 40 mg 샘플로 칭량하였다. 실크 발포체를 15초 동안 분석 밀을 사용하여 분쇄하였고, 분석용 저울을 사용하여 15 mg 샘플로 칭량하였다. 둘 모두의 경우, 샘플 당 60 mg 출발 질량이 추정되었다. 모든 샘플을 1mL의 초순수 (UPW)와 혼합하고, 10초 동안 와류시키고, 10분 동안 2mL 에펜도르프 관 중에서 1000xg에서 원심분리하였다. 재-용해도를 평가하기 위해서, 초기 실크 농도 평가를 위해 수행하였던 바와 같이 실크 w/v%의 측정을 위해 250μL 분취물을 제거하여 추가의 PDMS 표면 상에 캐스팅하였다.

결과 및 논의

생물제제 캡슐화 이전에, 완전-용해가능한 실크-기재 물질 포맷을 수득할 수 있는 실크 정제 기술 및 구성체 제조 방법을 찾도록 시도되었다. 도 16 및 17에 나타낸 바와 같이, 정제 스켐의 개시 시에 증가 시간 동안 (≤ 60분) 누에고치를 비등함으로써, 필름 및 발포체의 용해도를 각각 효과적으로 증가시킬 수 있다.

또한 도 18 및 19에 나타낸 바와 같이 다양한 온도 조건에서 6개월 저장 이후에 얇은 실크 필름 및 두꺼운 실크 필름의 용해도를 비교하였다. 이 결과는 실크 필름의 용해도 특징이 비등 시간과 관계 없이 매우 안정하다는 점, 및 이들 특징은 필드에서 사용하기 위해 높은 비등 시간이 선택되는 경우 트랩핑된 생물제제를 회수하는 능력을 저해하지 하지 않을 것이다는 점을 나타낸다.

재구성된 실크 피브로인 물질의 거동을 평가한 이후에, 용해도 및 온도 안정성에 대한 몇몇 실제 고려사항이 이하에 요약된다:

- 고체 매트릭스, 예컨대 필름 및 발포체 (또는 그의 분말)로 형성된 샘플은 분배 및/또는 주문식 사용을 위한 보관-안정성 실크 제제로서 이용될 수 있고, 이들은 일반적으로 용액 형태의 실크보다 훨씬 더 안정하다 (일반적으로 겔화 이전에 3 내지 4개월 보관 수명을 가짐). 게다가, 고체 매트릭스는 변동 온도 프로파일에 더하여 흔들림을 종종 대면하는 장기간 운송 조건의 경우 훨씬 더 회복력이 있다.

- 장기간 온도 안정성은 실크 물질이 트랩핑 매트릭스로서 사용되고 분석물의 회수가 지속된 용해도 특성에 일부 좌우되는 필드 조건에 바람직할 수 있다.

- 다른 트랩핑된 물질의 존재 하 또는 그 물질과의 혼합물 중의 실크의 용해도는 예를 들어, 실크에 대한 트랩핑된 생물제제의 비, 트랩핑된 물질의 유형 (예를 들어, 뇨, 혈액, 분변, 귀지, 정제된 또는 비-정제된 DNA/RNA/항체, 치료제 등이지만 이에 제한되는 것은 아님), 및/또는 이들 생물제제의 안정화를 돕도록 통상 적용되는 완충제/부형제에 좌우될 수 있다.

실크-기재 물질 또는 매트릭스의 용해도는 예를 들어 하기에 의해, 최적화될 수 있다:

물 중에 필름 또는 발포체의 부하를 감소시킴 (예를 들어, 각각 4% 미만 또는 1.5%w/v 미만). 본 발명자들은 이 연구를 위해 이들 값을 사용했지만, 용해도 최적화를 위해 부하 포화도가 사용될 수 있다.

필름의 건조 비율을 가속화하는 수단, 예를 들어 강제식 공기, 저감된 습도 (주위보다 더 낮음), 증가된 온도 등. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이 메카니즘이 아마도 본원에서 나타난 얇은 필름 용해도 개선에 일부 원인이 되는 것으로 생각된다.

발포체 품질 개선을 위한 동결건조 조건 및/또는 실크-기재 물질에서의 결정화를 유도할 수 있는 조건에 대한 노출 시간의 감소.

효소적 소화, 여과, 크로마토그래피 등에 의한 정제 동안 실크의 고분자량 분획 (예를 들어, 중쇄 및/또는 긴 소수성 시퀀스)을 선택적으로 제거하기 위한 60분보다 더 높은 비등 시간 또는 방법.

분자량 저감 및/또는 불용성 미립자 제거를 계속하는데 도움이 될 수 있는, 예를 들어 오토클레이빙 및 멸균 여과를 비롯한 멸균 수단.

실시예 6. 실크 피브로인-기재 물질 중 전혈 및 혈장의 안정화

진단 적용 공간에서, 용해도-최적화된 실크 매트릭스가 또한 장기간에 걸쳐 그리고 불리한 환경 조건에서 인간 전혈 및 혈액 성분을 안정화하는 데 사용될 수 있다는 점을 입증하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 본 발명자들은 우선 특정한 포맷의 재구성된 실크로부터 회수되자마자 다수의 공여자로부터 혈장 및 혈액 단백질의 상대적 존재비를 측정하기 위해 사용될 수 있는 임상-관련 분석 도구의 규모를 증명하기 위해서 예비 연구를 행하였다. 이들 측정법은 임상 후처리에 현재 사용되는 포맷인 공여자-일치된 새로운 또는 동결된 혈장 상에서 행해진 측정법과 일치해야 한다. 이 기능성을 증명하기 위해서, 공여자 정맥 혈액으로부터 혈장이 단리되었고, 분량의 전혈 또는 혈장 (혈액 프릭(prick)에 대한 당량 부피로)이 실크 피브로인 내에 트랩핑되었다. 실크/혈액 또는 실크/혈장 복합 매트릭스는 이어서 공기 건조되었다. 이들 매트릭스는 이어서 완충 염수 용액 중에 재-용해되었고 분석물이 용액 상태로 회수되었다.

처음에 실크 단백질과 별도로 혈액 중에 마커를 확인하기 위한, 또는 역으로 실크 간섭으로 인해 저해될 수 있는 특정 마커를 확인하기 위한 면역-친화도-기반 기술을 증명하기 위해 표준 ELISA 웰-플레이트 방법이 적용되었다. 이어서 ELISA 결과는 바이오마커 정량화를 위한 고처리량 접근법과 비교되었다. 특히, 루미넥스™ 플랫폼이 고처리량 방법으로 사용되었는데, 이는 동일한 샘플 내에서 다중 태그를 동시에 멀티플렉스하는 능력을 갖는다는 것을 제외하고는 유사한 항체-기반 검출을 적용하기 때문이다. 원칙적으로, 루미넥스™ 접근법은 더 많은 분석물의 검출을 가능하게 하고, 더 적은 샘플이 요구된다. 결국, 이 샘플 멀티플렉싱은 진단 신뢰에 다수의 상보적 및 확증적 바이오마커가 필요한 질환 (예를 들어, 심혈관 질환, CVD이지만 이에 제한되는 것은 아님)의 보다 빠른 검출을 가능하게 한다. 추가로, 이들 실험은 실용상 중요한 이슈, 예를 들어 안정화 매트릭스 (예를 들어, 가용화된 실크 필름으로부터의 잔유물)의 존재가 고분자량 단백질 잔류물에 의해 적용되는 유동체의 잠재적인 막힘으로 인해 루미넥스™ 플랫폼의 유용성을 저해할 수 있는지의 여부를 다룬다.

상기 기재된 바와 같은 실험을 행하기 위해서, 채취 1시간 이내에 새로운 공여자 혈액 (바큐테이너 관, Na-헤파린 항응고제, 리서치 블러드 컴포넌츠, 미국 매사추세츠주 브라이튼)이 3명의 별도의 공여자로부터 전달되었다. 이어서 즉시 관을 혈장 단리를 위해 1000xg에서 원심분리하였다. 이어서 혈장 분취물을 즉시 동결하여 양성 대조군으로 한다. 실크 용액은 이전에 기재된 누에나방 누에의 고치로부터 제조되었다 (문헌 [Lu et al., 2010]). 실크 필름을 폴리디메틸실록산 (PDMS) 표면 상에 캐스팅하고, 여기서 3명의 공여자 각각으로부터 100μL의 혈액 또는 혈장을 1.9mL의 실크 용액 (물 중 7.6 중량%)과 혼합하고, 그 후 공기-건조를 위해 큰 표면에 걸쳐 (8.5cm 직경 페트리 디쉬) 캐스팅하였다. 필름을 밤새 (8시간) 건조시킨 후에, 분석을 위해 샘플을 펀칭하였다. 예를 들어, 표준 곡선 내에 분석에 요구되는 질량 부하를 조율하기 위한 ELISA 판독을 위해 혈장 및 혈액 필름으로부터 10 mg 및 40 mg 쿠폰을 제조하였다. 모든 ELISAs (R&D 시스템즈)의 경우, 동결된 혈장 분취물은 1:10 및 1:100으로 희석한 반면 실크-기재 필름 중에 용해된 혈액 및 혈장은 희석하지 않고 시험하였다.

[표 4]

ELISA 마커, 단백질 특징 및 검출 한계

고처리량 분석 (예를 들어, 루미넥스™ CVD 키트를 사용, 이하 표 5)이 건조된 필름 샘플 및 혈장 분취물 상에서 행해졌다. 루미넥스™ 검정은 표준 곡선 검출 한계 범위에 속하도록 동결된 혈장 분취물의 희석 (1:2,000 및 1:20,000)이 요구되는 제조업체 설명서 (이엠디 밀리포어 코포레이션(EMD Millipore Corporation), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)에 따라서 실행되었다. 20 mg 혈액 및 혈장 쿠폰을 각각 1mL 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 넣고, 15초 동안 와류시키고, 이어서 육안으로 용해를 확인하기 위해 2분 동안 두었다. 혈장 분취물과 유사하게, 실크 필름 포맷에서의 이전의 발견에 기초하는 잠재적인 회수율을 확인하기 위해 실크-기재 쿠폰 (및 블랭크 실크 대조군) 중에 용해된 혈액 및 혈장을 키트 시약 중에 1:200 및 1:2,000으로 희석하였다.

[표 5]

루미넥스™ 마커, 단백질 특성 및 검출 한계

혈장 및 혈액의 회수율 계산: 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, 혈액 및 혈장 쿠폰으로부터 회수된 단백질의 값을 공여자-일치된 혈장에서 밝혀진 농도로 정확하게 변환하여, 회수 효율을 결정하기 위해서, 혈액 및 혈장의 몇몇 물리적 측정이 우선 이루어졌다.

루미넥스™ 검정 결과에 대한 통계: 2 세트의 독립 변수 사이의 샘플 오차원을 비교하기 위해 이원 변량 분석을 실행하였다: i) 3명의 공여자에 걸쳐 검출된 혈액 또는 혈장의 수준 및 ii) 동결된 혈장 분취물에서 취해진 판독으로부터 계산된 바와 같은 이론적 쿠폰 회수율과 비교되는 혈액 또는 혈장 쿠폰 회수율. 샘플 편차는 루미넥스™ 검정으로부터 3회 판독에 기초하여 계산되었고, 이 오차는 혈액 및 혈장 중량 분획과 같은 물리적 파라미터의 편차에 대한 조정 없이 쿠폰 회수율 계산값에 포함되었다. 결과는 P 값 < 0.05에서 유의한 것으로 간주되었다.

이들 결과는 30분 동안 실크를 비등시켜 형성된 얇은 필름 (PDMS-코팅된 8.5cm 페트리 디쉬의 전체 표면에 걸쳐 캐스팅)은 완전한 용해가 요망되는 용도에 이상적일 수 있음을 나타냈다. 실크/혈액 및 실크/혈장 혼합으로부터 형성된 필름은 추가의 분석을 위해 쉽게 용해되는 포맷이 되었다 (도 20 참조). 이 포맷에 40 mg 이하의 건조 매트릭스를 사용하였다.

ELISA 결과: 이어서 회수된 액체 분취물을 인간 혈장에 대한 다음의 제조업체 프로토콜에 따른 ELISA에 의해 시험하였다 (R&D 시스템즈, 상기 표 4). 제조업체에 의한 설명서에 따라, 공여자-일치된 혈액으로부터의 혈장 샘플을 PBS 중에 1:10 및 1:100으로 희석하였고, 이들을 실크 쿠폰으로부터 회수 효율을 결정하는데 사용하였다.

도 21의 그래프는 ELISA 키트가 분자량의 범위 (16 내지 150kDa) 및 농도 범위 (5.91 ng/mL 내지 16.7 mg/mL)에서 선택되는 바이오마커의 임상-관련된 양을 검출할 수 있음을 나타낸다. 특히, 이들 값은 높은 렙틴 수준 및 낮은 CRP 수준 (표 6)을 비롯한 공여자 프로파일 (아시아인, 여성, 25세, 무증상)과 일치하며, 이는 혈장의 검정 및 적절한 제조의 정확도를 나타낸다. 더 중요하게, 실크의 혼합, 건조, 캐스팅, 및 재-가용화 이후에 회수된 샘플의 값이 공여자 혈장의 직접적인 측정값과 유사하였다. 약 10 mg 및 약 40 mg 쿠폰 (각각 n=6 검정 측정값) 둘 모두의 경우, 검정 표준 곡선 내에 속하는 값이 나왔고, 10 mg 및 40 mg 그룹의 평균치를 평균하고 이론적 부하 값으로 표준화하여 % 회수율을 계산하였다 (하기 표 6에 요약됨). CRP 및 세르핀(Serpin) E1의 경우, 오직 40 mg 쿠폰만이 ELISA의 검출가능한 범위에 속하는 충분한 혈액을 방출하였고, 따라서 % 회수율은 단일 필름 질량에 대해 기록된다.

[표 6]

ELISA 결과의 요약

루미넥스 실험: 3개의 상이한 키트 및 3개의 상이한 공여자 혈액 샘플에 걸쳐 6개의 마커 상에서 루미넥스™ 시스템을 실행하였고, 이들 검정 결과는 도 22에 나타낸다.

실크 필름 내에 트랩핑 이전에, 3명의 공여자로부터의 혈액의 물리적 외관의 차이가 관찰되었다 - 정맥 채취 및 수송 이후에, 공여자 3은 분명한 용혈 징후를 나타냈다 (즉, 바큐테이너 튜브의 내부 상의 단리된 혈장 및 RBC 스미어링(smearing)의 적색화). 루미넥스 검정은 공여자 사이의 편차에 대하여, 및 모든 공여자에 걸쳐 정제된 혈장으로부터 단리된 단백질에 대한 전혈로부터 단리된 혈액 단백질의 상대량에 대하여 모두 민감한 것으로 드러났다. 혈장의 모든 이론값 및 측정값은 실제 혈액 농도보다 대략 60 내지 100% 더 컸다 (세포질 분획의 제거로 인함).

이원 변량 분석은 혈액 및 혈장 쿠폰의 경우 sVCAM 마커 및 혈액 쿠폰의 경우 tPAI-1 마커를 제외하고는, 루미넥스 시스템에 의해 측정된 바와 같이 혈액 및 혈장 비교값 둘 모두의 경우 공여자 간에 상당한 (및 대부분의 경우 매우 상당한) 편차를 나타냈다. 이는, tPAI-1, sVCAM-1 및 합토글로빈 검정의 민감성 및 적용된 표준 곡선으로 인한 것이었다. 예를 들어, 공여자 2는 심지어 이론적 비교를 덜 정확하게 하는 1:20,000x 희석의 경우에도, 최대 검정 표준 [50 ng/mL]을 초과한 혈장 합토글로빈 수준을 가졌다. 역으로, sVCAM-1 및 tPAI-1의 검출은 낮은 민감성 문제를 겪고 있었고, 따라서 1:20,000x 희석에서의 모든 혈장 값은 최저 검정 표준 (각각 0.08 및 0.016 ng/mL)이거나 또는 그 미만이었고; 이는 결국 쿠폰 회수율을 높은 신뢰도로 정량하는데 어려움을 초래하였다 (대부분의 공여자 및 쿠폰 유형의 경우 CV 값 > 20%). 실크의 경우 임의의 측정가능한 백그라운드가 없다는 것은 실크 단백질이 루미넥스™ 기기를 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.

CVD 패널에서의 마커 중 2개, 즉 SAP 및 CRP는 이론적 부하 수준 (동결된 혈장 분취물에 기초함)과 혈액 및 혈장 쿠폰 (실크 피브로인을 가짐)으로부터 회수된 수준 간에 우수한 일치를 나타냈다. 이들 2개의 마커의 경우, 이원 변량 분석은 공여자로부터 상당한 오차원을 야기했지만 동결된 혈장과 혈액 또는 혈장 쿠폰 사이에 유의차는 없었다 (p<0.05). 공여자 피브리노겐 및 합토글로빈 수준 사이의 차이는 또한 매칭된 혈액 및 혈장 쿠폰 수준 사이의 각각의 차이보다 훨씬 더 컸는데, 그 이유는 공여자 차이가 샘플 세트 내 편차의 >60%를 차지하였기 때문이다. 이들 발견은 ELISA 키트에 의한 이전 결과를 확증하는 것이며, 이는 캐스팅/건조/재가용화 방법론에 의해 제공되는 분석물의 적절한 회수율을 나타낸다. 게다가, CRP 시험은 특히 두 자리수 범위의 공여자 수준에도 불구하고 쿠폰 및 동결된 혈장 대조군 사이의 탁월한 정확도를 나타냈다. sVCAM-1, tPAI-1, 및 합토글로빈 검정에 의한 상기 이슈는 공여자 사이의 차이를 검출하는 우리의 능력을 저감시켰고; 따라서, 이들 3가지 경우, 공여자-공여자 차이로부터의 편차는 혈장 및 동결된 분취물 사이의 정확도보다 전체 샘플 편차에 대해 통계상 보다 유의한 기여인자로 간주되지 않았다. 종합하면, 이들 6개의 상이한 CVD 마커는 약간의 공여자-수준 보정이 필요하지만, 루미넥스 플랫폼이 우리의 실크 시스템에서 안정화된 혈액 검출에 사용될 수 있다는 점을 증명하였다.

ELISA 포맷으로부터 계산된 혈장의 절대 수준을 루미넥스 포맷과 비교할 때, ELISA를 사용한 모든 마커의 경우 루미넥스 검정과 비교하여 더 낮은 농도가 일관되게 발견되었다 (도 23 참조). 이들 차이는 사용된 마커 (CRP 및 PAI-1은 실시예로서 나타냄) 및 각각의 검정의 동적 범위 (10 내지 100,000 ng/mL로부터)에 따른 위치와는 관계 없이 관찰되었다. ELISA 및 루미넥스 사이에 관찰되는 차이는 분석물에 따라서 크기가 달라졌다 (예를 들어, CRP의 경우 10배 차이지만 PAI-1의 경우 단지 2 내지 3배 차이).

놀랍게도, 공여자 1 및 2로부터 단리된 혈장과 공여자 3으로부터의 용혈된 혈장 사이의 모든 마커에 걸쳐 큰 차이가 발견되었고, 이는 CRP의 경우 꽤 현저했다. CRP의 생리학적 역할은 보체계를 활성화하기 위해 죽거나 또는 죽고 있는 세포의 표면 상에서 또는 그의 핵 성분 중에 발현되는 포스포콜린을 결합하는 것이고 (문헌 [Chang et al., 2002]); 따라서, 혈액 채취시 세포 분획 (WBC 또는 RBC)에 대한 분열은 CRP가 혈장 제조 동안 펠릿화된 세포 용해물과의 결합을 일으키게 하여 혈장 내 검출에 사용할 수 없었다는 것이 가능하다. 그러나, 혈액 쿠폰은 또한 매우 낮은 CRP 수준을 나타냈기 때문에, 채취 또는 취급 동안 RBCs에 대한 시험관내 손상이 공여자에 대한 CRP 수준을 전반적으로 희석시켰거나, 또는 단순히 공여자 CRP 수준이 본질적으로 낮았다는 점 또한 가능하다. CRP용 ELISA 스크린은 도 22에 나타낸 바와 같이, 루미넥스 키트에 의해 기록된 바와 같은 공여자 3에 상응하는 낮은 값이 확인되었다. 추가로, ELISA 결과는 공여자 3이 공여자 1 및 2와 비교하여 렙틴의 2배 증가로부터 높은 지질 수준을 함유함을 나타냈다 (데이터는 나타내지 않음). 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 지질분해는 ELISA 방법에 의한 부정확한 CRP 판독의 원인일 수 있고 (문헌 [Martinez-Subiela and Ceron, 2005]), 이에 의해 다양한 지질, 예컨대 빌리루빈에 의한 동정 혈장의 도핑은 CRP 측정에서 용량-의존적 감소를 초래했다.

시간 경과 결과: 37℃ 또는 실온에서 30일 동안 저장한 후에, 3개의 상이한 공여자 혈액 샘플 사이의 6개의 마커 상에서 루미넥스™ 시스템을 실행하였고, 이들 검정 결과는 도 24에 나타낸다. 원래 0일째 관찰된 것과 유사한 경향이 30일째 측정되었다 (도 22). 루미넥스™ 검정은 공여자 사이의 편차에 대하여 및 모든 공여자에 걸쳐 정제된 혈장으로부터 단리된 단백질에 대한 전혈로부터 단리된 혈액 단백질의 상대량 모두에 대하여 민감하였다 (데이터는 나타내지 않음). 일부 실시양태에서, tPAI-1 및 VCAM-1 마커는 이들 샘플의 희석량을 감소시킴으로써 검출되었다. tPAI-1 검정에서 블랭크 실크 대조군으로부터의 일부 백그라운드가 측정되었고, 이는 이 마커에 사용된 항체 간에 일부 상호간섭이 있음을 나타내며, 이는 분석물 수준이 낮은 경우 악화되었다. tPAI-1의 경우 기준선 실크 필름 음성 대조군이 모든 필름-함유 샘플로부터 감해졌지만, 그럼에도 불구하고 쿠폰 tPAI-1 수준은 여전히 100% 기준선에 비해 올라가 있었다.

쿠폰으로부터 측정되고 이론적 부하 수준으로 변환되는 분석물의 모든 값은 CRP 및 합토글로빈에 대한 혈액 쿠폰 측정을 제외하고, 완전한 100% 회수율을 나타냈다. 이들 불일치에 대한 가능한 생물학적 기초는 상기에서 논의되었다. 이원 변량 분석은 상이한 저장 포맷 사이에 현저한 (및 일부 경우 매우 현저한, P<0.01) 편차를 나타냈다. 구체적으로, 실크-기재 쿠폰으로부터 측정된 피브리노겐 및 sVCAM-1 수준은 저장 조건에 대해 비민감성으로 나타났던 반면, 각각의 액체 혈장 수준은 감소되었고 37℃에서 상당히 현저했다.

도 24에 나타낸 바와 같이, 각 그래프 상에 회색 점선에 의해 나타낸 30일째 측정된 동결된 혈장 분취물 수준은, 0일째 기준선 값과 항상 매칭되지는 않았다. 구체적으로, CRP 수준은 0일 기준선의 80%인 반면, 피브리노겐 수준은 단지 이들 각각의 기준선의 48%였다. 이는 황금 표준 동결/해동 기술을 사용한 피브리노겐의 현저한 분해를 나타내는 것이며, 필름 안정화 기술의 사용을 피해야 하는 것으로 보인다. 실제로, 이전 보고서에서는 -80℃ 미만의 온도 (예를 들어 본원에서 사용된 -20℃ 조건)에서 동결된 헤파린 첨가된 혈액으로부터 단리된 혈장에서 작은 침전물이 형성될 수 있고, 이는 일반적으로 응고 인자의 생존성/재생성 손실에 주요 기여자라는 점을 제시하였다 (문헌 [Palmer et al., 1993]). 이 거동은 실온 및 37℃에서 액체 혈장 수준에서 취해진 상응하는 피브리노겐 마커의 분해에 의해 강조된다. 피브리노겐 및 다른 응고 인자의 민감성은 사용된 항응고제의 선택 및 실크 시스템과 비교하여 저장 온도의 함수로서 평가될 수 있다.

4개월째 (도 25), 실크 시스템으로부터 회수된 단백질 마커 수준은 많은 경우 감소되었지만, 여전히 피브리노겐의 경우 황금 표준 차가운 저장 조건에 걸쳐 현저한 성능 향상 및 SAP와 같은 다른 마커의 경우 매우 높은 수준의 유지성을 나타냈다.

실시예 7. 실크 피브로인-기재 물질 중 RNA의 안정화

본 실시예는 기능 상실 없이 RNA가 동결건조된 실크 용액 중에 트랩핑되고 회수될 수 있음을 나타낸다. RNA의 회수를 극대화하기 위해 최적의 용액 조건을 설정하기 위한 일련의 실험이 행해졌다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP)-코딩 mRNA는 3일 혼합, 동결건조, 및 회수 프로토콜을 수행한 실크 용액과 혼합되었다. 이 프로토콜에 이어서, mRNA는 초순수 중에 재-가용화에 의해 회수되었고, RNA-특이적 형광측정 검정을 사용하여 캡슐화 및 회수 효율을 정량하였다. 또한, 동결건조 프로토콜을 겪는 동안 용액 중에 RNA에 대한 손상을 완화하기 위해 상업적으로 입수가능한 RNAse 억제제의 혼입이 적용되었다. 이들 억제제/실크 시스템을 사용하여, 실크로부터 인출 이후 RNA 기능의 유지는 모델 세포주를 mRNA 분자의 회수된 분획으로 형질전환함으로써 평가되었다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및/또는 조성물은 장기간에 걸쳐 (예를 들어, 30 내지 120일) 안정적으로 유지할 수 있다.

실험을 행하기 위해, 시판원 (스템젠트(Stemgent)® eGFP mRNA, www.stemgent.com/products/show/222)으로부터 GFP-코딩 RNA를 구입하였다. 이 RNA 서열은 원래 워런(Warren) 등에 의해 선천성 항바이러스 반응을 극복하기 위해 변형된 합성 RNA의 투여를 기초로 세포를 재프로그래밍하기 위한 간단한 비-통합 (즉 비-바이러스성 또는 DNA-기재) 전략을 제공하기 위해 개발되었다 (문헌 [Warren et al., 2010]). 서열은 3가지 중요한 성분을 함유한다: i) 세포 세포질 중에 개선된 안정성을 위한 5' 구아닌 캡, ii) 번역을 개시하는 강한 코작 컨센서스 서열 및 iii) mRNA 폴리아데닐화에 필요한 말단 서열. GFP 서열은 PCR 앰플리콘에 의한 시험관내 전사 반응 주형을 사용하여 이 구성체로 합성 제작된다. 원액은 스템젠트®에 의해 높은 농도 (100jig/mL)로 판매되고 있고, 워런 등의 앞선 결과는 충분한 GFP의 번역이 짧은 기간 (8 내지 12시간) 내에 이루어질 수 있고, 이는 RNA-특이적 기능에 대한 검정을 필요로 하는 캡슐화 및 검색 연구에 이상적임을 제시한다.

실크 용액은 20분의 비등 및 용해 조건 (9.3M LiBr, 48시간 동안 diH₂O에 대한 투석)을 사용하여 제조되었고 최종 농도는 측정된 부피의 용액을 건조함으로써 평가되는 초순수 중 6 중량%였다. 이 용액을 보증된 RNAse-무함유 물을 사용하여 2%, 1% 또는 0.5% wt/v로 희석하였다. 트리스-EDTA (TE)는 각각 최종 작업 농도 10mM 내지 1mM을 달성하기 위해 첨가되었다. 실크 정제 과정이 DEPC-기재 RNAse 처리와 함께 사용될 수 없는 일부 실시양태에서, 예를 들어 실크 단백질을 변경할 수 있는 필요한 오토클레이빙 단계로 인해, mRNA 취급 동안 RNAse의 존재 또는 활성을 제거하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 보증된 RNAse/DNAse-유리 피펫 팁, 관, 및 용액은 앰비온(Ambion)®으로부터 구입한 대로 이용하였고 모든 외부 표면 상에 RNAzap가 사용되었다. 60jig의 GFP mRNA 원액 (1xTE로 공급됨)은 사용 시까지 -80℃로 저장되었고, 그 시점에 얼음 상에서 해동하였고 이어서 최종 단계로서 최종 mRNA 농도 20x10³ ng/mL를 위해 각 용기에서 v/v 비 20jiL mRNA/80jiL (실크 + TE) 용액으로 혼합되었다. mRNA 피펫팅 과정은 모든 샘플의 경우 5분 미만 지속하였다. 또한 블랭크 1xTE 완충제를 사용하여 mRNA 부하가 없는 매칭된 대조군이 제조되었다. 또한, 취급 동안 RNA를 추가로 보호하기 위해 이들 조건은 SUPERaseㆍInTM RNase 억제제 (앰비온®)를 첨가하여 (실크 단독 및 실크/RNA) 충분히 반복되었다.

실크/RNA 용액의 동결건조: 혼합 단계 다음에, 2mL 관에 저장된 모든 100μL 샘플은 즉시 버티스 제네시스 25L 슈퍼 XL 동결 건조기로 이동시켰고, 실크 발포체 중에 모노클로날 항체를 안정화하기 위해 앞서 기재된 프로토콜을 이용하였다 (문헌 [Guziewicz et al., 2011]). 샘플은 신속한 건조를 촉진하기 위해 캡을 그 옆으로 열어 두었고, 보다 정확하고 균일한 열 조절을 용이하게 하기 위해 관을 냉각 플레이트에 직접 접촉시켰다. 이 과정은 -20℃ 동결된 조건으로부터 램핑에 의해 개시되고, 여기서 샘플은 플레이트 상에 63분에 걸쳐 -45℃로 천천히 냉각되고 추가 8시간 동안 그 온도에서 유지된 후 -20℃로 다시 가온하였다. 비결합수를 제거하기 위해 100mT 진공 하에 -20℃에서 40시간 동안 예비 건조가 후속되었다. 샘플은 35℃로 다시 가온되고 결합수를 제거하기 위해 이차 건조 단계로서 620분 동안 유지되었다. 샘플은 이어서 회수 프로토콜이 개시될 때까지, 전형적으로 2 내지 3시간 -4℃에서 800mT 압력에서 저장되었다.

동결-건조 프로토콜 이후에 실크 피브로인-기재 물질이 재-가용화할 수 있도록 실크 용액의 농도 (실크 w/v 6-1%)가 최적화되었다. 이하 도 26에 나타낸 바와 같이, EDTA의 존재 또는 부재하에 (TE 완충제 중에) 독립된 발포체가 각 용액으로부터 생성되었다. 물 중에 재-가용화 시에, 비-용해된 실크 잔류물의 작은 분획이 초기 실크 부하에 의존하는 크기로 발견되었다. 그러나, 크기/용해도는 TE 완충에는 의존하지 않았다. 이들 발견에 기초하여, 용해도에 대한 농도 영향을 조사하기 위한 출발점으로서 2%w/v가 선택되었다.

RNA 내용물의 회수 및 측정: 스크리닝 연구 다음에, 2%, 1%, 및 0.5% 실크 용액이 RNA 회수 연구를 위한 유력한 후보로서 선택되었다. 상기 기재된 트랩핑 및 동결건조 프로토콜 다음에, 샘플을 -45℃ 동결건조기 저장 조건으로부터 제거된 즉시 2시간 동안 (검정 제조의 기간) 얼음 상에서 해동하였다.

RNA 회수율 정량화: 웹 (probes.invitrogen.com/media/pis/mp11490.pdf)으로부터 제조업체 가이드라인에 따라 정량-iTTM 리보그린(Ribogreen)® RNA 시약 및 키트를 제조하였다. 리보솜 RNA 표준을 사용하여 표준 곡선 (1000 내지 7.8125 ng/mL의 범위)을 만들고 동시에 -80℃에서 저장된 원액 GFP mRNA도 마찬가지로 얼음 상에서 해동하였고, 1:80으로 희석되었고, 리보그린 시약에 대한 순서를 다르게 하는 경우 표준 곡선의 결과를 보정하기 위한 내부 대조군으로서 사용하였다. 검정은 샘플 당 25μL를 필요로 하는 96-웰 포맷 상에서 실행하였다. 표준을 제조한 이후에, 얼음으로부터 동결건조된 실크 샘플 (및 0% 대조군)을 제거했고, 200μL의 DNAase/RNAse 무함유 물을 첨가했고, 15초 동안 와류시키고, 25μL의 샘플을 즉시 각 웰로 피펫팅하였다 (N=3 생물학적 복제에서 복제 검정 판독).

회수된 mRNA를 사용한 진핵 세포의 형질감염: 회수된 mRNA의 안정성 및 시험관내 번역 주형으로서 연속 사용을 위한 가능성을 증명하기 위해, 샘플 당 약 10μL를 보유하고 즉시 실크/억제제 복합물을 재-가용화하였다. mRNA의 회수 이전에, 293개의 섬유모세포를 96-웰 플레이트 내에 5x10⁴ 세포/cm²의 밀도로 시딩하고 둘베코의 변형된 이글즈의 배지 (DMEM, 인비트로젠) 중에 15% 혈청, 1% 항생제/ 항진균제의 존재하에 부착시켰다. 세포는 37℃에서 5% CO₂로 유지하였다.

제조업체의 권고에 따라서, 공개된 사용자 프로토콜 (스템젠트, www.stemgent.com/products/show/221)에 따라서 스템펙트™ 형질감염 키트를 사용하였다. 형질감염 시약을 형질감염 완충제와 조합하여 원액으로서 생성하고, 7.33μL 분취물로 분배한 후, 10μL의 회수된 mRNA와 배합하였다. 이 완충제/시약/mRNA 용액을 실온에서 15분 동안 평형시키도록 두었고 그 후 각 분취물로부터 15μL를 채취하여 96-웰 플레이트 중 개개의 웰로 적가하였다. 이어서 세포를 12시간 동안 상기와 같이 인큐베이션으로 복귀하고, 그 시점에 이들을 488nm (청색) 여기 및 510nm (녹색) 발광에 대한 필터 세트를 구비한 액시오버트(Axiovert) CFL 형광 현미경 상에서 이미지화하였다.

결과 및 논의

초기 연구의 결과는 도 27에 나타낸다. 리보그린 검정은 실크-단독 그룹에서 명백한 실크 단백질 (480nm에서 형광정량적으로 활성)뿐만 아니라, 또한 모든 그룹에서 회수된 RNA로부터의 대부분의 판독에서 작지만 상당한 백그라운드를 나타냈다. 그러므로 비-부하된 그룹을 사용하여 모든 각각의 농도로부터 실크-RNA 샘플에 대하여 표준화하였다. 1% 및 0.5% 그룹으로부터 회수된 RNA는 비-실크 0% 그룹에 상당하였지만 모든 이들 동결건조된 시스템은 동정 동결된 원액보다 훨씬 아래였다.

이들 결과에 따라서, 예를 들어 용액 저장 조건을 조정함으로써, RNA 회수의 효율을 증가시키고자 하였다. RNAse가 실크 용액 중에 적은 양으로 존재하였고 모든 조건에서 회수된 mRNA는 검정 제조 동안 회수 이후에 분해되기 쉬었다는 점이 추측되었고, 따라서 1U/μL의 작업 농도에서 SUPERaseㆍInTM RNase 억제제 (tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/sp_2694.pdf)가 검정에 포함되었고, 결과를 도 28에 나타낸다. 실크/TE 단독을 사용한 이전 검정 실행과 비교하여 (도 27), 억제제의 존재는 -80℃ 저장 조건과 비교하여 mRNA의 회수를 현저히 개선하였다. 추가로, 실크 성분의 간섭이 최소화되어, 1% 및 0.5% 그룹의 값은 비-실크 0% 그룹에 상응하였다.

이하 도 29에 나타낸 바와 같이, 동결된 원액 (-80℃ 저장) 및 모든 회수된 실크 그룹을 비롯하여 형질감염 시약 및 mRNA를 함유하는 모든 매질 조건에서의 세포는 12시간의 인큐베이션에 의해 293개의 섬유모세포에 의한 GFP 발현을 유도하였다. 또한, 아마도 mRNA-기재 형질감염의 용량-의존성 및 -80℃ 원액의 제한된 희석으로 인해, -80℃ 그룹이 접종된 웰에서 세포군체에 보다 광범위한 발현 패턴을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 실크 그룹 (0 내지 2%)으로부터 회수된 mRNA는 양성 형질감염 결과를 관찰하기 위해 필요한 최소 역가였던 것 같다.

본 실시예에서 동결건조된 실크 용액으로부터 RNA의 회수는 형질감염을 위해서는 충분하였지만, 절대 수준은 동결된 대조군 미만이었다. 그러나, 실크의 제제 및/또는 실크 처리의 방법은 동결건조된 실크 용액으로부터 RNA 회수를 증가시키도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 최대 가용성 용액 하위유형을 선택하도록 예비-가용화 고치 비등 시간을 변경할 수 있다. 도 17은 동결건조된 실크 용액으로부터 개선된 재가용화도로 RNA를 회수하기 위해 60분 또는 그 이상의 비등을 사용할 수 있음을 나타낸다.

특정 참고문헌

본 명세서 및 실시예에서 확인되는 모든 특허 및 다른 간행물은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 명시적으로 도입된다. 이들 간행물은 본원의 출원일 이전에 오로지 그들의 공개를 위해서만 제공된다. 이런 점에서 어떤 것도 발명자들이 종래 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유에 의해 이러한 공개에 선행 자격이 없는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 날짜에 관한 모든 진술 또는 이들 문헌의 내용에 대한 언급은 출원인들에게 입수가능한 정보에 기초한 것이고, 이들 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대해 임의의 승인을 구성하는 것이 아니다.

등가물

본원에는 바람직한 실시양태가 상세히 도시되고 기재되었지만, 본 발명의 취지로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형, 부가, 치환 등이 이루어질 수 있고 따라서 이들은 이하의 특허청구범위에서 규정된 바와 같이 발명의 범주 내인 것으로 간주된다는 점은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 이미 나타내지 않은 정도로, 본원에 기재되고 설명되는 다양한 실시양태 중 임의의 하나에 본원에 개시된 다른 실시양태 중 임의의 것에 나타낸 특징을 도입하도록 추가로 변형될 수 있다는 점은 당업자에 의해 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE <120> LOW MOLECULAR WEIGHT SILK COMPOSITIONS AND STABILIZING SILK COMPOSITIONS <130> <140> <141> <150> PCT/US2014/029636 <151> 2014-03-14 <150> 61/909,687 <151> 2013-11-27 <150> 61/883,732 <151> 2013-09-27 <150> 61/830,950 <151> 2013-06-04 <150> 61/792,161 <151> 2013-03-15 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(90) <223> This sequence may encompass 5-15 'Gly Ala Gly Ala Gly Ser' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 1 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 50 55 60 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser 85 90 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Val, Ile or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 5-15 'Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 2 Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa 1 5 10 15 Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa 20 25 30 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Ala Ala Ser 1 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(15) <223> May or may not be present <400> 4 Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(5) <223> Any amino acid and this region may encompass 1-4 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Any amino acid <400> 5 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Xaa 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ala, Ser, Tyr, Arg, Asp, Val or Trp <400> 6 Gly Gly Gly Xaa 1 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(12) <223> May or may not be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> This sequence may encompass 1-2 '(Ser)1-2 (Ala)1-4' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 7 Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Gly Leu Gly Gly Leu Gly 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Leu, Ile, Val or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu, Ile, Val or Pro <400> 9 Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly 1 5 <210> 10 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(14) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(29) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(44) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (44)..(44) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(59) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(74) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (65)..(65) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(71) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (74)..(74) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78)..(89) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(83) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(86) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (89)..(89) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(104) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (95)..(95) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (98)..(98) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (101)..(101) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(119) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (110)..(110) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (113)..(113) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(116) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (119)..(119) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (123)..(134) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (125)..(125) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (128)..(128) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (131)..(131) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (134)..(134) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (138)..(149) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (140)..(140) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (143)..(143) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (146)..(146) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (149)..(149) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (153)..(164) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (155)..(155) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (158)..(158) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (161)..(161) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (164)..(164) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (168)..(179) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (170)..(170) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (173)..(173) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (176)..(176) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (179)..(179) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (183)..(194) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (185)..(185) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (188)..(188) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (191)..(191) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (194)..(194) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (198)..(209) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (200)..(200) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (203)..(203) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (206)..(206) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (209)..(209) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (213)..(224) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (215)..(215) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (218)..(218) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (221)..(221) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (224)..(224) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (228)..(239) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (230)..(230) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (233)..(233) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (236)..(236) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (239)..(239) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (243)..(254) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (245)..(245) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (248)..(248) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (251)..(251) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (254)..(254) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (258)..(269) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (260)..(260) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (263)..(263) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (266)..(266) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (269)..(269) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (273)..(284) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (275)..(275) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (278)..(278) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (281)..(281) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (284)..(284) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (288)..(299) <223> This region may encompass 1-4 'Gly Gly Xaa' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (290)..(290) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (293)..(293) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (296)..(296) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (299)..(299) <223> Tyr, Val, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(300) <223> This sequence may encompass 3-20 'Gly Pro (Gly Gly Xaa)1-4 Tyr)' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 10 Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly 1 5 10 15 Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro 20 25 30 Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly 35 40 45 Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly 50 55 60 Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa 65 70 75 80 Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly 85 90 95 Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly 100 105 110 Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa 115 120 125 Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly 130 135 140 Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly 145 150 155 160 Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa 165 170 175 Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly 180 185 190 Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly 195 200 205 Xaa Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa 210 215 220 Tyr Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly 245 250 255 Pro Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro 260 265 270 Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr Gly Pro Gly 275 280 285 Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Tyr 290 295 300 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(24) <223> May or may not be present <400> 11 Gly Arg Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May or may not be present <400> 12 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Gln, Tyr, Leu, Ala, Ser or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Gln, Tyr, Leu, Ala, Ser or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Gln, Tyr, Leu, Ala, Ser or Arg <400> 13 Gly Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Xaa 1 5 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Thr Gly Ser Ser Gly Phe Gly Pro Tyr Val Asn Gly Gly Tyr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Tyr Glu Tyr Ala Trp Ser Ser Glu 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Ser Asp Phe Gly Thr Gly Ser 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Arg Arg Ala Gly Tyr Asp Arg 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Glu Val Ile Val Ile Asp Asp Arg 1 5 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Thr Thr Ile Ile Glu Asp Leu Asp Ile Thr Ile Asp Gly Ala Asp Gly 1 5 10 15 Pro Ile <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Thr Ile Ser Glu Glu Leu Thr Ile 1 5 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> Any amino acid <400> 22 Gly Pro Gly Xaa Xaa 1 5 <210> 23 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Leu, Tyr or Ile <400> 23 Gly Pro Xaa 1 <210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(22) <223> Ala, Thr, Val or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(22) <223> This region may encompass 3-20 residues, wherein some positions may be absent <400> 24 Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Claims (81)

1. 소정 범위의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편의 집단을 포함하는 저분자량 실크 피브로인 조성물로서,
   집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수의 15% 이하는 200 kDa을 초과하는 분자량을 갖고,
   집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수의 적어도 50%는 명시된 범위 내의 분자량을 갖고,
   상기 명시된 범위는 3.5 kDa 이상의 하한치와 120 kDa 이하의 상한치 사이고,
   상기 저분자량 실크 피브로인 조성물은 적어도 5%의 베타-시트 결정화도 함량을 포함하고,
   상기 저분자량 실크 피브로인 조성물은 고체 형태이고,
   상기 저분자량 실크 피브로인 조성물은 물에 재가용화되어 실크 피브로인 응집체가 실질적으로 없는 실크 피브로인 용액을 형성하는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는, 저분자량 실크 피브로인 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 명시된 범위의 하한치가 3.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 또는 115 kDa이고,
   상기 명시된 범위의 상한치가 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120 kDa인 저분자량 실크 피브로인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 명시된 범위가 (i) 5 내지 120 kDa; (ii) 10 내지 120 kDa; (iii) 15 내지 120 kDa; (iv) 20 내지 120 kDa; (v) 20 내지 110 kDa; (vi) 20 내지 100 kDa; (vii) 20 내지 90 kDa; (viii) 20 내지 80 kDa; (ix) 30 내지 120 kDa; (x) 30 내지 100 kDa; (xi) 30 내지 90 kDa; (xii) 30 내지 80 kDa; (xiii) 40 내지 100 kDa; 및 (xiv) 40 내지 90 kDa인 저분자량 실크 피브로인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 총 실크 피브로인 단편 집단의 35% 이하가 120 kDa 내지 200 kDa 범위 내의 분자량을 갖는 것인 저분자량 실크 피브로인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85%가 상기 명시된 범위 내의 분자량을 갖는 것인 저분자량 실크 피브로인 조성물.
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8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 실크 피브로인 조성물의 수용해도보다 높은 수용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 저분자량 실크 피브로인 조성물.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1 mg/s 내지 100 mg/s의 용해 속도를 갖는 것을 특징으로 하는 저분자량 실크 피브로인 조성물.
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13. 제1항의 저분자량 실크 피브로인 조성물을 포함하는 실크 피브로인 물품으로서, 필름, 시트, 겔 또는 히드로겔, 메쉬, 매트, 부직 매트, 직물, 스캐폴드, 튜브, 블록, 섬유, 입자, 분말, 3차원 구조물, 임플란트, 발포체, 바늘, 동결건조 물품, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 형태인 실크 피브로인 물품.
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15. 실크 피브로인 입자를 포함하는 조성물로서, 실크 피브로인 입자는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 저분자량 실크 피브로인 조성물을 포함하는 것인 조성물.
16. 제15항에 있어서, 적어도 1개월 동안 보관-안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제1항의 저분자량 실크 피브로인 조성물 및 저분자량 실크 피브로인 조성물 중에 분포된 활성제를 포함하는 조성물.
18. 제17항에 있어서, 필름, 시트, 겔 또는 히드로겔, 메쉬, 매트, 부직 매트, 직물, 스캐폴드, 튜브, 블록, 섬유, 입자, 분말, 3차원 구조물, 임플란트, 발포체, 바늘, 동결건조 물품, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 형태인 조성물.
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22. 제17항에 있어서, 조성물의 재가용화 후 검출가능한 양의 활성제를 회수할 수 있는 것인 조성물.
23. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 저분자량 실크 피브로인 조성물 및 기재를 포함하는 물품으로서, 실크 피브로인 단편이 기재 내에 분산되거나, 기재 상에 퇴적되거나, 또는 이들 둘 다인 물품.
24. 제23항에 있어서, 기재가 고체 다공성 기재이거나 또는 그를 포함하는 것인 물품.
25. 제13항의 실크 피브로인 물품 또는 제17항의 조성물을 물 중에 비포화 농도로 용해시켜, 실크 피브로인 응집체가 실질적으로 없는 실크 피브로인 용액을 형성하는, 실크 피브로인 용액의 형성 방법.
26. 제25항에 있어서, 용액 중의 용해된 실크 피브로인이 안정하게 유지되는 것인 방법.
27. 작용제를 저분자량 실크 피브로인 조성물과 접촉시켜 작용제-함유 조성물이 형성되도록 하는 것을 포함하는, 소정 시간의 기간 동안 작용제를 안정화하는 방법으로서,
    상기 저분자량 실크 피브로인 조성물은 소정 범위의 분자량을 갖는 실크 피브로인 단편의 집단을 포함하는 저분자량 실크 피브로인 조성물로서,
    집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수의 15% 이하는 200 kDa을 초과하는 분자량을 갖고,
    집단 내 실크 피브로인 단편의 총 수의 적어도 50%는 명시된 범위 내의 분자량을 갖고,
    상기 명시된 범위는 3.5 kDa 이상의 하한치와 120 kDa 이하의 상한치 사이고,
    상기 저분자량 실크 피브로인 조성물은 적어도 5%의 베타-시트 결정화도 함량을 포함하는 것을 특징으로 하고,
    상기 방법이 실크 피브로인 단편의 집단 및 그 안에 분포된 작용제를 포함하는 실크 피브로인 물품을 형성하는 것을 추가로 포함하고,
    상기 실크 피브로인 물품이 물에 재가용화되어 실크 피브로인 응집체가 실질적으로 없는 실크 피브로인 용액을 형성하는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는, 소정 시간의 기간 동안 작용제를 안정화하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 저분자량 실크 피브로인 조성물에 용매가 실질적으로 없고/거나, 접촉 단계가 용매가 실질적으로 없는 조건하에서 수행되는 것인 방법.
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30. 제25항에 있어서, 실크 피브로인 용액을 실온 또는 그 이상에서 소정 시간의 기간 동안 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
31. 제27항에 있어서, 작용제-함유 조성물을 실온 또는 그 이상에서 소정 시간의 기간 동안 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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34. 제27항에 있어서, 저분자량 실크 피브로인 조성물 또는 실크 피브로인 물품 중의 작용제를 실온 또는 그 이상에서 소정 시간의 기간 동안 유지시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
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