KR102423993B1 - 저온-적응-바이러스-약독화(cava) 및 신규의 약독화 폴리오바이러스 균주 - Google Patents

저온-적응-바이러스-약독화(cava) 및 신규의 약독화 폴리오바이러스 균주 Download PDF

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Abstract

폴리오바이러스(PV) 균주가 신규의 저온-적응-바이러스-약독화(CAVA) 방법에 의해 약독화되었다. 생성된 약독화 재조합 PV인 CAVA-PV는 30℃에서 야생형 복제를 보여주지만, 37℃에서는 실질적인 복제를 보여주지 않는다. 37℃에서 복제 불능은 역가 측정(감염성 단위), qPCR(바이러스 RNA) 또는 전자 현미경(감염의 시각적 징후)에 의해 이 온도에서 감염 중 바이러스의 정량화 불능으로 정의된다. CAVA-PV는 생산 조건 하에서 유전적으로 안정하고, CAVA-PV의 캡시드를 코딩하는 서열을 상이한 PV 균주의 캡시드를 코딩하는 서열로 치환하는 것에 의해, 통상의 백신과 동일한 항원 프로파일을 갖는 약독화 균주를 생산하기 위한 백본으로서의 사용을 위한 효용을 보여준다. 더욱이, CAVA-PV에서 확인된 돌연변이는 추가의 CAVA-PV 균주를 얻기 위해 상이한, 야생형 및 신경발병성 폴리오바이러스 배경 균주로 조작될 수 있다.

Description

저온-적응-바이러스-약독화(CAVA) 및 신규의 약독화 폴리오바이러스 균주{COLD-ADAPTED-VIRAL-ATTENUATION(CAVA) AND NOVEL ATTENUATED POLIOVIRUS STRAINS}
본 발명은 바이러스 약독화 및 백신으로서 사용하기 위한 신규의 약독화 폴리오바이러스 균주의 개발 분야에 관한 것이다.
폴리오바이러스(PV)는 피코르나 바이러스과(Picornaviridae) 내의 장내바이러스 속에 속한다. 이들 소형 RNA 바이러스는 단일-가닥의 포지티브-센스 RNA 게놈을 갖고 비-외피성이다. 이들은 3 가지 혈청형; PV1, PV2 및 PV3으로 세분된다. PV 감염은 보통 무증상이지만, 사례의 1-2%에서는 마비성 급성 회백수염을 야기하고, 여기에서 바이러스-유도된 운동 뉴런의 파괴는 급성 이완 마비(Acute Flaccid Paralysis(AFP))로 불리는, 보통 사지에서의 마비를 야기한다. 이들 AFP 사례에서 5 내지 10%는 치명적으로, 바이러스가 뇌간 영역으로 전파하여 호흡 정지를 야기하고, 궁극적으로 사망을 야기하기 때문이다. (PV 및 발병의 검토를 위해서는, 예를 들어 (Minor 1999, Racaniello 2006, Pfeiffer 2010) 참조).
오늘날, 급성 회백수염은 2013년 및 2014년에 각각 406 및 359 사례만 있어 박멸 직전에 있다. PV에 대한 이런 성공적인 전쟁을 가능하게 만든 두 개의 사용 가능한 백신; 불활성화된 폴리오바이러스 백신(Inactivated Poliovirus Vaccine(IPV))(Salk 1953) 및 경구용 폴리오바이러스 백신(Oral Poliovirus Vaccine(OPV))(Sabin 1956)이 있다. IPV는 각각의 혈청형으로부터의 3 개의 포르말린-불활성화된(사멸된) 야생형(신경발병성) PV 균주(전형적으로, PV1, PV2 및 PV3로서 각각 마호니(Mahoney), MEF-1 및 소켓(Saukett))로 구성된다. OPV는 사빈 1(Sabin 1), 사빈 2(Sabin 2) 및 사빈 3(Sabin 3)으로 불리는 3 가지 생 약독화 균주로 이루어진다. 사빈 균주는 전체 유기체 및 세포 배양을 통한 3 개 양친 야생형 바이러스의 연속 계대를 통해 균주를 생성시킨 Albert Sabin의 이름을 따서 명명된 것이다(Sabin 1973). OPV의 낮은 비용과 투여의 용이성으로 인해(John 2009), 이것은 세계 보건 기구(WHO) 및 세계 소아마비 박멸 계획(Global Polio Eradication Initiative(GPEI))에 의해 1988년 박멸 프로그램을 위한 선택 백신으로서 발표되었다(WHO 1988). 그러나, OPV의 사용은 박멸 및 최종 단계 전략과는 상충하는데, OPV 백신 균주가 신경발병성 및 전염성 폴리오바이러스로 약독화 표현형의 복귀를 나타내기 때문이다(Henderson, Witte et al. 1964). 이들 백신 관련된 마비성 급성 회백수염(Vaccine Associated Paralytic Poliomyelitis(VAPP)) 사례는 500,000 백신 당 1 사례의 빈도로 발생한다(John 2004). 더욱이, 순환 백신 유도 폴리오바이러스(circulating Vaccine Derived Polioviruses(cVDPV))는 복귀된 백신 바이러스가 민감성 집단 내에서 전염성이 될 때 생성된다. OPV는 이제 VAPP 및 cVDPV 현상을 통한 급성 회백수염의 잠재적 원천으로서 인식되므로, 급성 회백수염의 완전한 박멸을 달성하기 위해서는 OPV의 사용이 없어져야 한다는 요구가 있다. 사실, 지난 10 년에 걸쳐, 규제 기관에서는 OPV 사용이 급성 회백수염의 박멸을 위해 중지되어야 한다는 것을 인식하였다(WHO 2005). IPV에서는, 백신 면역원이 포르말린-불활성화되고, 따라서 이 백신의 사용으로는 VAPP 및 cVDPV가 관찰되지 않는다. 그러나, 이 백신의 20-배 더 높은 비용은 저- 및 중간-소득 국가에서의 사용을 불리하게 한다(Heinsbroek and Ruitenberg 2010, Zehrung 2010). 이 목적을 위해, WHO 및 이의 협력 기관은 더 안전하고 보다 경제적인 IPV를 만들기 위한 전략의 개발을 위해 복합적 계획을 개시하였다(Zehrung 2010, Hawken and Troy 2012, Resik, Tejeda et al. 2013).
IPV는 실제로 VAPP 및 cVDPV에 관해서는 OPV 보다 더 안전한 대안이지만, 백신을 구성하는 야생형 바이러스는 생산 시설로부터 이들 바이러스가 돌발적으로 탈출하는 경우에는 박멸 후 시대 중 세계 집단에 대하여 위협을 제기할 수 있다. 더욱이, 박멸 후에는 야생형 폴리오바이러스가 이처럼 이미 값비싼 백신의 상품 비용을 더욱 증가시킬 수 있는 엄격한 생화학적 봉쇄 규제를 받게 될 것이다(WHO 2006, Verdijk, Rots et al. 2011). 사실, WHO에서는 이미 전세계에서 실험실로부터의 임의의 야생형 PV 균주의 파괴를 규정하였다. 이들 조치는 박멸이 가까워지면서 더욱 활발하게 시행될 것으로 추정된다(WHO 2009). 약독화 균주를 기반으로 하는 IPV 백신의 개발은 더 안전한 백신 제조 공정이고 산업 재해의 경우에 잠재적 질환 발병의 위험을 경감시킨다. 이러한 목적을 위해, 약독화 균주를 기반으로 한 IPV의 생산이 박멸 후 시대에 안전하고 경제적인 IPV의 생산을 위한 전략으로서 제안되었다. 다중 약독화 균주는 새로운 IPV 백신을 위한 기반으로서 제안되었고, 이의 대부분의 연구는 사빈 균주로부터 IPV를 만드는 데 투자되고 있다(Verdijk, Rots et al. 2011). 사빈-기반의 IPV는 최근 성공적인 II 상 임상을 독립형 백신(Liao, Li et al. 2012)으로서, 그리고 II 및 III 상 임상을 디프테리아, 파상풍 및 무세포성 백일해(DTaP)(Okada, Miyazaki et al. 2013)와의 조합으로 수행하였다. 더욱이, 일본에서는 사빈 기반의 IPV가 최근 DTaP(Mahmood, Pelkowski et al. 2013)와의 조합으로 허가되었다. 그러나, 사빈 바이러스의 캡시드는 통상의 IPV 야생형 바이러스와 상당히 다르고, 포르말린 불활성화 후 사빈 바이러스는 PV 감염에 대하여 항체 중화(및 이에 따른 보호)를 일으키도록 요구되는 상이한 항원 특성을 나타낸다. 실제로 사빈 IPV에 대한 면역 반응은 통상의 IPV에 대하여 일어나는 것과 비교하여 다른 것으로 관찰되었고, 따라서, 백신의 상이한 투여가 필요하다(Westdijk, Brugmans et al. 2011).
몇 가지 합리적으로 조작된 약독화 PV 균주가 존재하지만, 이들의 IPV 백신 균주로서의 잠재력은 아직 완전히 탐구되지 않았다. 이러한 약독화 균주의 후보 중 한 세트는, 새로운 IPV의 기반을 위한 사용뿐 아니라, 새로운 OPV 개발을 위해, 사빈 균주와 비교하여 우수한 생 백신 균주로서 유전적으로 안정화된 사빈 균주를 기반으로 한다(예를 들어, Macadam et al, 2006; WO 2008/017870; WO 2012/090000). 이들 균주는 생리적 온도에서 성장 가능하지만, 이 온도에서 유의미하게 감소된 감염성을 보인다.
박멸-후 시대를 위해, 야생형 균주를 기반으로 한 통상의 IPV와 유사한 면역 반응을 유도하고 신경발병성 형태로 복귀되지 않는 안전한 약독화 폴리오바이러스 균주를 기반으로 하는 IPV의 개발을 위한 요구가 남아있다.
본 발명은 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 개발하기 위한 신규의 방법뿐 아니라, 이에 따라 생성된 IPV의 기반으로서 사용될 수 있는 신규의 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공한다. 약독화된 백본(backbone)은 현재의 IPV 백신에 사용되는 야생형 균주의 캡시드를 포함하도록 재-조작되어, 바이러스 생산 및 백신 생산을 위한 규모-확대 중 약독화 표현형을 유지하면서 불활성화 후 야생형 항원성 프로파일을 야기할 수 있다. 재조합 약독화 폴리오바이러스는 생산 조건 하에서 유전적으로 안정하다. 더욱이, 37℃에서의 복제 불능으로 인해, 이들이 생산 시설로부터 (비)의도적 탈출하는 경우 돌발적 섭취 후에 신경발병성 형태로 복귀될 수 있을 것으로 생각하기는 매우 어렵다. 본 발명의 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주는 IPV 백신으로 사용하기 위해 포르말린-불활성화될 수 있다.
본 발명은, 간결성을 위해 참조로 본원에 도입되는, 이에 첨부된 독립 청구항 및 종속 청구항에 의해 각각 정의되는 일반적이고 바람직한 구현예에 관련된다. 본 발명의 다양한 양태의 다른 바람직한 구현예, 특징, 및 이점은 첨부된 도면과 함께 아래 기재된 구체적인 설명으로부터 명백할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는, 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 1 균주를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 2 균주를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 3 균주를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리오바이러스 균주 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기에서 폴리오바이러스 균주는 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 균주이고, 폴리오바이러스 균주는 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 선택적으로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기에서 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주 각각은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없고, 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주는 각각 마호니, MEF-1, 및 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주를 포함하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기에서 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주는 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없고, 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주는 각각 마호니, MEF-1, 및 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 IPV 조성물을 제공하는데, 여기에서 조성물 중의 폴리오바이러스는 불활성화되고, 불활성화되기 전 폴리오바이러스는 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 폴리오바이러스 균주이고, 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주는 각각 마호니, MEF-1, 및 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 IPV 조성물을 제공하는데, 여기에서 IPV 조성물은 불활성화된 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주를 포함하고, 불활성화되기 전 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주는 각각 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없고, 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주는 각각 마호니, MEF-1, 및 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 위에 기술된 IPV 조성물, 및 디프테리아, 파상풍, 백일해, 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b(Heamophilus influenzae type b(Hib)), B형 간염 바이러스(HBV) 등과 같은 다른 병원균으로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 조합 백신 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리오바이러스 감염 및/또는 급성 회백수염에 대한 예방 접종 방법을 제공하는데, 이 방법은 위에 기술된 IPV 조성물 또는 위에 기술된 IPV를 포함하는 조합 백신 조성물을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리오바이러스의 게놈의 보체 또는 게놈을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는데, 여기에서 폴리오바이러스는 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스이고, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스는 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리오바이러스를 포함하는 제제의 제조 방법을 제공하는데, 여기에서 폴리오바이러스는 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스이고, 폴리오바이러스는 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 선택적으로 포함할 수 있고, 이 방법은
a) 세포 배양물에서 세포를 폴리오바이러스로 감염시키고,
b) 세포 배양물에서 세포를 (폴리오바이러스의 복제를 허용하는 온도, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 33℃ 사이에서) 배양하여 폴리오바이러스를 증식시키고; 그리고,
c) 폴리오바이러스 균주를 세포 또는 세포 배양물로부터 분리하여 폴리오바이러스를 포함하는 제제를 얻는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 불활성화된 폴리오바이러스를 포함하는 제제의 제조 방법을 제공하는데, 여기에서 불활성화되기 전 폴리오바이러스는 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 균주이고, 폴리오바이러스는 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터 선택된 캡시드를 선택적으로 포함할 수 있고, 이 방법은:
a) 세포 배양물에서 세포를 폴리오바이러스로 감염시키고,
b) 세포 배양물에서 세포를 (폴리오바이러스의 복제를 허용하는 온도, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 33℃ 사이에서) 배양하여 폴리오바이러스를 증식시키고;
c) 폴리오바이러스 균주를 세포 또는 세포 배양물로부터 분리하여 폴리오바이러스를 포함하는 제제를 얻고; 그리고,
d) 폴리오바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 약제학적 조성물로서 적절한 제형에 불활성화된 폴리오바이러스를 포함하는 IPV의 제조 방법을 제공하는데, 여기에서 불활성화되기 전 폴리오바이러스는 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 균주이고, 폴리오바이러스는 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터 선택된 캡시드를 선택적으로 포함할 수 있고, 이 방법은:
a) 세포 배양물에서 세포를 폴리오바이러스로 감염시키고,
b) 세포 배양물에서 세포를 (폴리오바이러스의 복제를 허용하는 온도, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 33℃ 사이에서) 배양하여 폴리오바이러스를 증식시키고;
c) 폴리오바이러스 균주를 세포 또는 세포 배양물로부터 분리하여 폴리오바이러스를 포함하는 제제를 얻고;
d) 폴리오바이러스를 불활성화시키고; 그리고,
e) 불활성화된 폴리오바이러스를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 얻는 방법을 제공하는데, 이 방법은:
a) 양친(또는 개시) 폴리오바이러스 균주를 ≤30℃에서 충분한 계대 동안 계대하여 37℃에서 손상된 성장을 갖는 바이러스를 생산하고(예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 35 계대 동안);
b) 37℃에서 손상된 성장을 나타내는 바이러스 집단으로부터 둘 이상의 상이한 온도 감수성 클론을 분리하고;
c) 온도 감수성 클론의 게놈을 서열 분석하고;
d) 온도 감수성 클론의 서열을 양친 폴리오바이러스 균주의 서열과 비교하는 것에 의해 온도 감수성 클론의 게놈의 서열에서 돌연변이를 확인하고;
e) 둘 이상의 상이한 온도 감수성 클론으로부터의 돌연변이를 (예를 들어, 양친 또는 다른) 폴리오바이러스 균주의 게놈으로 결합시키는 것에 의해 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 합성하고; 그리고,
f) 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 구조하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 얻는 방법을 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주는 상이한 폴리오바이러스 균주로부터 선택되는 캡시드를 선택적으로 포함할 수 있고, 이 방법은:
a) 양친 폴리오바이러스 균주를 ≤30℃에서 충분한 계대 동안 계대하여 37℃에서 손상된 성장을 갖는 바이러스를 생산하고;
b) 37℃에서 손상된 성장을 나타내는 바이러스 집단으로부터 둘 이상의 온도 감수성 클론을 분리하고;
c) 온도 감수성 클론의 게놈을 서열 분석하고;
d) 온도 감수성 클론의 서열을 양친 폴리오바이러스 균주의 서열과 비교하는 것에 의해 온도 감수성 클론의 게놈의 서열에서 돌연변이를 확인하고;
e) 둘 이상의 상이한 온도 감수성 클론으로부터의 돌연변이를 (예를 들어, 양친 또는 다른) 폴리오바이러스 균주의 게놈으로 결합시키는 것에 의해 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 합성하고;
f) 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 구조하고; 그리고,
g) 선택적으로, 구조된 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열을 상이한 폴리오바이러스 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열로 치환하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 구조된 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열은 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열로 치환된다.
특정 구현예에서, 구조된 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열은 사빈 유형 1, 사빈 유형 2 또는 사빈 유형 3 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열로 치환된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 얻는 방법을 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주는 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터 선택되는 캡시드를 선택적으로 포함할 수 있고, 이 방법은:
h) 양친 폴리오바이러스 균주를 ≤30℃에서 충분한 계대 동안 계대하여 37℃에서 손상된 성장을 갖는 바이러스를 생산하고;
i) 37℃에서 손상된 성장을 나타내는 바이러스 집단으로부터 둘 이상의 온도 감수성 클론을 분리하고;
j) 온도 감수성 클론의 게놈을 서열 분석하고;
k) 온도 감수성 클론의 서열을 양친 폴리오바이러스 균주의 서열과 비교하는 것에 의해 온도 감수성 클론의 게놈의 서열에서 돌연변이를 확인하고;
l) 둘 이상의 상이한 온도 감수성 클론으로부터의 돌연변이를 (예를 들어, 양친 또는 다른) 폴리오바이러스 균주의 게놈으로 결합시키는 것에 의해 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 합성하고;
m) 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 구조하고; 그리고,
n) 구조된 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열을 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열로 치환하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 위에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공한다.
도 1: 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주(CAVA-PV백본)를 생산하기 위한 저온-적응-바이러스-약독화(Cold-Adapted-Viral-Attenuation(CAVA))에 의한 폴리오바이러스 균주의 약독화 방법에 대한 도식적 개요. 대표적인 선 그래프는 양친 또는 개시 폴리오바이러스 균주 및 3 개의 상이한 온도 감수성 클론에 대한 37℃에서의 성장을 보여준다. 양친 바이러스는 채워진 원형으로 나타내고 3 개의 온도 감수성 클론은 빈 마름모형, 빈 원형, 그리고 빈 사각형으로 나타낸다.
도 2: 4 개의 상이한 유형 1 PV 균주 및 대표적 CAVA-PV백본의 패널에 대한 현탁액 PER.C6(sPER.C6) 세포에서의 복제 동역학. 2A: 30℃에서의 성장. 2B: 37℃에서의 성장. CAVA-PV, 브룬힐데(Brunhilde), 마호니, 브루넨더스(Brunenders), 및 사빈 1 균주의 데이터는 각각 빈 원형, 채워진 마름모형, 빈 사각형, 채워진 삼각형, 및 채워진 사각형으로 나타낸다.
도 3: 브루넨더스 양친 PV 및 대표적 CAVA-PV백본에 대한 sPER.C6 세포에서의 평균 복제 동역학. 에러 바는 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다(N=3). 도 3A는 30℃에서의 성장을 보여주고 도 3B는 37℃에서의 성장을 보여준다. 브루넨더스 양친 PV는 채워진 삼각형으로 나타내고 CAVA-PV백본은 빈 원형으로 나타낸다.
도 4: 브루넨더스 양친 PV 및 대표적 CAVA-PV백본에 대한 HEK293 세포에서의 복제 동역학. 4A: 30℃에서의 성장, 4B: 37℃에서의 성장, 그리고 4C: 39.5℃에서의 성장. 브루넨더스 양친 PV는 채워진 삼각형으로 나타내고 CAVA-PV백본은 빈 원형으로 나타낸다.
도 5: 브루넨더스 양친 PV 및 대표적 CAVA-PV백본에 대한 L20B 세포에서의 복제 동역학. 5A: 30℃에서의 성장, 5B: 37℃에서의 성장, 그리고 5C: 39.5℃에서의 성장. 브루넨더스 양친 PV는 채워진 삼각형으로 나타내고 CAVA-PV백본은 빈 원형으로 나타낸다.
도 6: 브루넨더스 양친 PV 및 대표적 CAVA-PV백본에 대한 HeLa 세포에서의 복제 동역학. 6A: 30℃에서의 성장, 6B: 37℃에서의 성장, 그리고 6C: 39.5℃에서의 성장. 브루넨더스 양친 PV는 채워진 삼각형으로 나타내고 CAVA-PV백본은 빈 원형으로 나타낸다.
도 7: 브루넨더스 양친 PV 및 대표적 CAVA-PV백본에 대한 Vero 세포에서의 복제 동역학. 7A: 30℃에서의 성장. 7B: 37℃에서의 성장. 브루넨더스 양친 PV는 채워진 삼각형으로 나타내고 CAVA-PV백본은 빈 원형으로 나타낸다.
도 8: 브루넨더스 양친 PV 및 대표적 CAVA-PV백본에 대한 SK-N-MC 세포에서의 복제 동역학. 8A: 30℃에서의 성장. 8B: 37℃에서의 성장. 브루넨더스 양친 PV는 채워진 삼각형으로 나타내고 CAVA-PV백본은 빈 원형으로 나타낸다.
도 9: 브루넨더스 양친 PV 및 대표적 CAVA-PV백본에 대한 부착성 PER.C6 (adPER.C6) 세포에서의 복제 동역학. 9A: 30℃에서의 성장. 9B: 37℃에서의 성장. 브루넨더스 양친 PV는 채워진 삼각형으로 나타내고 CAVA-PV백본은 빈 원형으로 나타낸다.
도 10: 소규모에서, (A) 30℃에서; 그리고 (B) 37℃에서 (A) 예상된 생산 조건 하에 8(빈 원형) 계대 후 및 CAVA-PV백본(채워진 원형)의 복제 동역학.
도 11: 소규모에서, (11A, C, E) 30℃에서; 그리고 (11B, D, E) 37℃에서 예상된 생산 조건 하에 sPER.C6(N=3)에서의 5 계대 후 및 (11A, B) CAVA-PV마호니, (11C, D) CAVA-PVMEF -1　및 (E, F) CAVA-PV소켓의 복제 동역학. 채워진 마름모형은 개시의 스톡 바이러스의 성장을 나타내는 한편, 빈 사각형, 원형 및 삼각형은 각각의 3 계대의 바이러스(각각 N=1, 2 및 3)를 나타낸다.
도 12: 원래의 CAVA-PV백본 균주의 캡시드를 코딩하는 서열을 마호니, MEF-1, 및 소켓 균주의 캡시드를 코딩하는 서열로 교체한 후의 상이한 CAVA-PV 백신 균주의 도식적 개요. 캡시드 교체 후, 생성된 백신 균주는 각각 CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF-1 및 CAVA-PV소켓으로 호칭된다.
도 13: CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1 및 CAVA-PV소켓 및 양친 브루넨더스 균주의 복제 동역학. 12A: 30℃에서의 성장. 12B: 37℃에서의 성장. 에러 바는 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다(N=2 또는 3). 브루넨더스 양친 PV는 채워진 삼각형으로 나타내고, CAVA-PV마호니는 빈 원형으로 나타내고, CAVA-PVMEF -1은 빈 사각형으로 나타내고, 그리고 CAVA-PV소켓은 빈 마름모형으로 나타낸다.
도 14: 불활성화된 14A: CAVA-PV마호니, 14B: CAVA-PVMEF -1　또는 14C: CAVA-PV소켓으로 면역화된 래트의 바이러스 중화 역가.
도 15: 양친 브루넨더스 PV, 실시예 1의 CAVA-PV백본(브루넨더스 양친 균주와 비교하여 표 1의 31 돌연변이를 갖는), 그리고 실시예 10의 추가 CAVA-PV(표 4의 14 돌연변이를 갖는 양친 브루넨더스 균주에 상응함)에서의 복제 동역학. 15A: 30℃에서의 성장. 15B: 37℃에서의 성장. 양친 브루넨더스 PV에 대한 데이터는 채워진 삼각형으로 나타내고, 실시예 1의 CAVA-PV백본에 대한 데이터는 빈 원형으로 나타내고, 그리고 실시예 10의 CAVA-PV에 대한 데이터는 채워진 마름모형으로 나타낸다.
도 16: 양친 야생형 MEF-1, 실시예 1의 CAVA-PV백본(브루넨더스 배경에서 표 1의 31 돌연변이를 갖는) 및 실시예 11의 추가 CAVA-PV 균주(표 4에 나타낸 13 돌연변이를 갖는 양친 MEF-1 PV에 상응함)에서의 복제 동역학. 16A: 30℃에서의 성장. 16B: 37℃에서의 성장. MEF-1에 대한 데이터는 채워진 사각형으로 나타내고, 실시예 1의 CAVA-PV백본에 대한 데이터는 빈 원형으로 나타내고, 그리고 13 CAVA 돌연변이를 갖는 MEF-1(실시예 11의 CAVA-PV)에 대한 데이터는 빈 사각형으로 나타낸다.
도 17: 양친 사빈 3, 실시예 1의 CAVA-PV백본(브루넨더스 배경에서 표 1의 31 돌연변이를 갖는) 및 실시예 11의 추가 CAVA-PV 균주(표 4에 나타낸 12 돌연변이를 갖는 양친 사빈 3 PV에 상응함)에서의 복제 동역학. 17A: 30℃에서의 성장. 17B: 37℃에서의 성장. 사빈 3에 대한 데이터는 채워진 사각형으로 나타내고, 실시예 1의 CAVA-PV백본에 대한 데이터는 빈 원형으로 나타내고, 그리고 12 CAVA 돌연변이를 갖는 사빈 3(실시예 11의 CAVA-PV)에 대한 데이터는 빈 삼각형으로 나타낸다.
도 18: (A) 37℃에서 PBS(모의), (B) 37℃에서 마호니, (C) 37℃에서 CAVA-PV마호니, 그리고 (D) 30℃에서 CAVA-PV마호니로 감염 중 대표적인 세포의 EM 현미경사진.
도 19: (빈 사각형 및 원형) 30℃ 및 (채워진 사각형 및 원형) 37℃에서 감염 중 게놈 카피로 표현된 qPCR에 의해 측정된 바이러스 RNA 수준의 시간 경과에 따른 CAVA-PV마호니 감염(우측 Y-축에서 Log10 GC, 원형) 및 역가에 의해 측정된 감염 단위(좌측-Y 축에서 Log10 TCID50/mL, 사각형).
도 20: 양친 브루넨더스, 실시예 1의 CAVA-PV백본, 실시예 6의 CAVA-PV마호니 및 5'UTR에서 7 CAVA 돌연변이 또는 비-구조적 단백질에서 17 CAVA 돌연변이 중 하나를 갖는 2 가지 중간 바이러스의 복제 동역학. 20A: 30℃에서의 성장. 20B: 37℃에서의 성장. 브루넨더스 양친 균주에 대한 데이터는 채워진 원형으로 나타내고, 5'UTR에서 7 CAVA 돌연변이를 갖는 중간 바이러스에 대한 데이터는 채워진 삼각형으로 나타내고, 비-구조적 단백질에서 17 CAVA 돌연변이를 갖는 중간 바이러스에 대한 데이터는 채워진 사각형으로 나타내고, 실시예 1의 CAVA-PV백본에 대한 데이터는 빈 원형으로 나타내고, CAVA-PV마호니에 대한 데이터는 빈 삼각형으로 나타낸다.
본 발명에서는 재조합 약독화된 폴리오바이러스 균주인 저온-적응-바이러스-약독화 폴리오바이러스(CAVA-PV)를 생산하기 위한 신규의 저온-적응-바이러스-약독화(CAVA) 방법이 사용되었다. CAVA-PV는 저온(30℃)에서 높은 역가로 성장하지만, 생리적 온도(37℃)에서는 실질적으로 성장하지 않는다. 37℃에서의 실질적 복제 불능으로 인해, CAVA-PV 균주는 포유류 숙주 내부일 때는 비-복제 허용 온도에 접하여, IPV 백신의 기반으로서 사용하기에 적절한 약독화 표현형으로 된다. CAVA-PV 게놈 백본은 상이한 바이러스 캡시드(예를 들어, 통상의 IPV에 사용되는 3 개의 야생형 캡시드)를 코딩하는 서열을 포함하도록 재-조작되기 적절하므로, CAVA-PV의 약독화 표현형을 유지하면서 통상적인 백신의 항원성, 그리고 이에 따라, 아마도 동일한 면역원성 프로파일로 된다. 더욱이, 본 발명의 포르말린-불활성화 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주는 VAPP 및 cVDPV의 위험이 제거되면서, 시판되는 통상의 IPV 백신과 비교하여 유사한 면역 반응을 제공하는 IPV로서 사용될 수 있다.
본원에서 정의되는, "실질적으로 성장하지 않는다", "실질적으로 복제 불능", "실질적인 복제 없음", 및 "실질적으로 증식할 수 없다"는, 이론적인 투입/접종원과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 (계산된 MOI를 기반으로) 10% 이하, 또는 바람직하게는 5% 이하, 또는 더욱 바람직하게는 1% 이하이거나, 한층 더 바람직하게는 바이러스의 감염 단위의 수에서 측정 가능한 증가가 없는 것을 의미한다. 바이러스 감염 단위를 측정/적정하기 위한 분석(TCID50 분석)은 1.7 Log10 TCID50/mL의 검출 한계를 갖는다. 특정 구현예에서, "실질적으로 성장하지 않는다", "실질적으로 복제 불능", "실질적인 복제 없음", 및 "실질적으로 증식할 수 없다"는 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)에 의해 측정시 이론적인 투입/접종원(계산된 게놈 카피)과 비교하여 측정 가능한 바이러스 RNA(게놈 카피) 증가가 없는 것으로서 정의된다. 특정 구현예에서, "실질적으로 성장하지 않는다", "실질적으로 복제 불능", "실질적인 복제 없음", 및 "실질적으로 증식할 수 없다"는 광학 현미경으로 관찰시 감염의 시각적 징후(세포변성 효과)의 결여 또는 전자 현미경(EM)에 의해 감염의 시각적 징후(바이러스 유도 멤브레인 소낭 또는 바이러스 격자를 갖는 사멸 또는 자멸된(apoptotic) 세포)의 결여로서 정의된다.
본원에서 정의되는, "재조합"은 폴리오바이러스를 코딩하는 핵산 분자가 둘 이상의 상이한 원천, 예를 들어, 상이한 클론, 상이한 균주, 또는 상이한 유기체로부터의 유전적 구성 성분을 결합시키는 분자 생물학적 조작을 받은 것을 의미한다. 본 발명의 재조합 약독화 폴리오바이러스는 분자 DNA 클로닝에 의해 생성될 수 있거나, 해당 분야의 당업자에게 알려져 있고 통상적인 실무인 기법에 의해 화학적으로 합성(신생 DNA 합성)될 수 있다. 이는 계약 제조사(예를 들어, Genscript, GeneArt, BaseClear)에게 요망되는 재조합 서열 정보를 제공하는 것에 의해서도 수행될 수 있고, 그러면 이들은 일상적인 기법에 따라 이들 분자를 생산할 수 있다. DNA 기술에 대한 임의의 표준 설명서는 본 발명의 재조합 PV 균주를 생산하기 위해 사용될 수 있는 구체적인 프로토콜을 제공한다. 간단히, 이러한 재조합 바이러스의 구축을 위한 예시적인 지침은 아래 실시예에 제공된다.
본원에서 정의되는, "약독화(attenuated)"는 양친 또는 개시 바이러스와 비교하여 폴리오바이러스가 덜 병원성이지만 여전히 살아있도록 폴리오바이러스의 병독성이 감소된 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 약독화 폴리오바이러스는 야생형 균주와 비교하여 유의미하게 덜 신경발병성이고, 따라서, 혹시 있더라도, 유의미하게 저하된 마비 유발 능력을 갖는다. 특히, 본 발명의 바람직한 약독화 바이러스 균주는, 의도된 대로 불활성화된 형태로 투여될 때뿐만이 아니라 제조 시설로부터 탈출 및/또는 우발적 감염의 경우에도, 백신 균주로서 사용하기 안전할 것이다. 특정의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약독화 바이러스는 CD155 형질전환 마우스에서 대뇌내(i.c.) 투여로 투여시 1×107 TCID50 보다 큰 (P)LD50을 갖는다.
본원에서 사용되는 구절 "뉴클레오티드", "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA, RNA뿐만 아니라, DNA 및 RNA의 임의의 알려진 염기 유사체 또는 이로부터 형성된 키메라를 말한다. 따라서, "뉴클레오티드", "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 가닥 형태, 또는 이중-가닥 나선의 리보뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 폴리머 형태를 말한다. 이중 가닥의 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자라는 용어는 분자의 일차 및 이차 구조만을 말하고, 임의의 특정 삼차 형태로 이를 제한하지 않는다. 따라서, 이 용어는 선형 또는 원형 DNA 분자에서 발견되는 이중-가닥의 DNA(예를 들어, 제한 단편 또는 플라스미드)뿐만 아니라, 폴리오바이러스 게놈 및 이의 단편의 단일-가닥 포지티브-센스 RNA 분자를 포함한다. 특정 이중-가닥의 DNA 분자 또는 단일-가닥의 RNA 분자의 구조를 논의하는 데 있어서, 서열은 본원에서 폴리오바이러스 게놈의 단일-가닥 포지티브-센스 RNA 분자 또는 DNA의 비-전사 가닥(즉, mRNA와 상동 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 정상적인 협약에 따라 기술될 수 있다.
브루넨더스 폴리오바이러스 균주는 CAVA-PV백본의 생산을 위한 양친 균주로서 사용될 수 있다. 브루넨더스 균주는 혈청형 1의 것이고, 원래 브룬힐데 균주로 불리는 임상적 분리주로부터 유래되었다. 1956년 John Enders 박사에 의한 인간 기원의 조직 배양에서 12 연속 계대를 통한 브룬힐데 균주의 계대는 브루넨더스 균주를 생성하였다. 이 균주는 부분적으로 약독화된 것으로 보인다(Enders 1952, Sanders, Liu et al. 2015). 브루넨더스 균주의 대표적 서열은 SEQ ID NO: 1으로 제공된다. 이 브루넨더스 균주는 본 발명을 위한 양친 균주로서 사용되었지만, 바이러스 집단에서 일부 자연적인 변이는 일상적이다.
또한 본원에서 CAVA-PV 균주는 양친 균주로서 MEF-1(야생형이고 신경발병성인 유형 2 PV) 또는 사빈 3(약독화된 유형 3 PV)를 사용하여 제조될 수도 있어, 30℃에서 유의미한 성장 및 37℃에서 실질적 성장이 없는 표현형을 갖는 CAVA-PV 균주를 생성하기 위한 본 발명의 보편적 적용가능성을 보여준다. MEF-1 균주의 대표적 서열은 SEQ ID NO: 5로서, 그리고 사빈 3는 SEQ ID NO: 8로서 제공된다. 온도 감수성 표현형을 유도하는 돌연변이가 혈청형-특이적이 아니고, 따라서 예를 들어 마호니 또는 소켓 균주와 같은 다른 폴리오바이러스 균주 또한 본원에서 제공되는 교시에 따라 본 발명의 표현형을 갖는 추가의 CAVA-PV 균주를 생성하기 위한 양친 균주로서 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본원에서 정의되는 "양친 균주(parental strain)" 또는 "개시 균주(starting strain)"는 자연으로부터 분리되거나 유포되는 야생형 균주, 공지의 표준 실험실 균주, 또는 본 발명의 CAVA 방법을 이미 받지 않은 임의의 다른 폴리오바이러스 균주일 수 있다. 양친 균주의 비-제한적 예로는 브루넨더스, MEF-1, 마호니, 소켓, 사빈 1, 사빈 2 또는 사빈 3 균주가 있다. 대표적인 서열의 예는 다음과 같이 본원에서 이들 균주에 제공된다: 브루넨더스(SEQ ID NO: 1), MEF-1(SEQ ID NO: 5), 마호니(SEQ ID NO: 6), 소켓(SEQ ID NO: 7), 사빈 3(SEQ ID: NO 8), 사빈 1(SEQ ID: NO 9) 및 사빈 2(SEQ ID NO: 10).
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 얻는 방법을 제공한다: a) (양친) 폴리오바이러스 균주를 ≤32℃의 온도에서 충분한 계대 동안 계대하여 37℃에서 손상된 성장을 갖는 바이러스를 생산하고; b) 37℃에서 손상된 성장을 나타내는 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4 또는 5 이상의) 상이한 온도 감수성 클론을 분리하고; c) 온도 감수성 클론의 게놈을 서열 분석하고; d) 온도 감수성 클론의 서열을 양친 폴리오바이러스 균주의 서열과 비교하는 것에 의해 온도 감수성 클론의 게놈의 서열에서 돌연변이를 확인하고; e) 둘 이상의 상이한 온도 감수성 클론으로부터의 돌연변이를 양친 폴리오바이러스 균주의 게놈 또는 다른 폴리오바이러스 균주의 게놈으로 결합시키는 것에 의해 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 합성하고; 그리고, f) 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 구조하는 단계. 단계 a)에서 계대는 바람직하게는 낮은 감염다중도(multiplicity of infection(MOI))로, 예를 들어 0.0001 내지 1 사이, 예를 들어 0.001 내지 0.1 사이, 예를 들어 약 0.01의 MOI로 감염시키는 것에 의해 수행된다. 단계 a)에서 계대를 위한 온도는 32℃ 이하, 예를 들어 약 20℃ 내지 31℃ 사이, 예를 들어 약 24℃ 내지 30℃ 사이, 예를 들어 약 30℃이다. 이 온도에서 폴리오바이러스 성장에 허용되는 임의의 세포주, 예를 들어 Vero, PER.C6, HEK293 등이 사용될 수 있다. 당업자는, 저온-적응 표현형에 기여할 돌연변이는 임의의 계대에서 축적될 수 있으므로, 요구되는 계대의 수는 크게 중요하지 않고 분석된 바이러스 집단의 클론에서 37℃에서의 손상된 성장의 표현형에 대한 스크리닝에 의해 편리하게 결정할 수 있음을 인정할 것이다. 제한된 수의 계대 후, 이러한 표현형이 이미 관찰될 수 있고, 그렇지 않다면 추가의 계대가 이러한 표현형을 갖는 클론의 발견 기회를 증가시킬 수 있다. 그러므로, 특정 구현예에서, 단계 a)의 계대 수는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 또는 이보다 많을 수 있다. 본원에서 사용되는 37℃에서의 "손상된 성장"은 야생형 바이러스와 비교하여 최대 역가에서 적어도 10-배, 예를 들어 100- 내지 1000-배 감소로서 정의된다. 또한, 손상된 성장을 갖는 클론은 더 느린 성장, 즉, 야생형 또는 양친 바이러스와 비교하여 최대 역가에 도달하는데 요구되는 감염 시간이 더 긴 것을 나타낼 수도 있다. 특정 구현예에서, 더 낮은 온도(예를 들어, 30℃)에서 온도 감수성 클론의 성장 동역학은 개시(양친) 균주와 비교하여 더 빠를 수 있다. 일 구현예에서, CAVA-PV를 개발하기 위해 브루넨더스 양친 균주는 PER.C6 세포에서 30 회보다 많이 저온(≤30℃)에서 낮은 MOI(예를 들어, 0.01)로 연속 계대되었다. 결과로서 생성된 바이러스 집단은 생리적 온도(37℃)에서 손상된 성장 및 저온(30℃)에서 야생형 성장을 갖는 집단에서 온도 감수성 바이러스 클론을 확인하기 위해 분석된다. 3 개의 온도 감수성 클론(양친 브루넨더스 균주와 비교하여 37℃에서 손상된 성장뿐 아니라 30℃에서 더 빠른 성장 동역학을 보이는)이 37℃에서 바이러스 집단 중 대략 1000 클론의 스크리닝에 의해 발견되었다.
3 개의 온도 감수성 클론을 서열 분석하였고 총 31 돌연변이가 3 개의 상이한 클론에 걸쳐 발견되었다. 각각의 클론은 18 뉴클레오티드 돌연변이를 갖고, 이들 중 일부는 상이한 클론 사이에 공유되었고 일부는 클론에 독특한 것이었다. 이들 돌연변이는 5'UTR(미번역 영역), 캡시드, 및 비-구조적 단백질을 포함하여, PV 게놈의 4 개 상이한 영역 중 3 개에서 확인되었다. 3'UTR에서는 돌연변이가 확인되지 않았다. 5'UTR은 RNA를 캡시드 내로 둘러싸고 감염성 비리온을 형성하기 위해 게놈의 VpG 단백질(2B)로의 연결에 필요한 클로버잎 구조를 포함한다. 5'UTR의 나머지는 바이러스 RNA의 번역에 필수적인 IRES(Internal Ribosomal Entry Site; 내부 리보솜 진입 위치)이다. 이 영역은 어떠한 단백질도 암호화하지 않으므로(미번역), 이 요소는 상호작용하는 RNA/단백질 대응물에 직접적으로 결합함으로써 기능을 수행하고, 따라서, 이 도메인의 2차 구조는 그 기능에 중요하다. 캡시드 영역은 바이러스 입자의 외부 표면을 암호화하고, 캡시드로 알려진 비리온의 외부를 구성하는 4 개 단백질로 세분될 수 있다. 이들 4 개 단백질은 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 호칭된다. 비-구조적 단백질은 단백질 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D로 세분된다. 이 단백질은 성공적인 감염을 위한 바이러스 복제, 폴리단백질 처리, 번역 및 숙주 세포 구성요소와의 상호작용을 위해 요구된다. 예를 들어, 2A 프로테아제는 eIF4G의 절단을 통해 숙주 세포 단백질 번역을 차단한다(Skern and Liebig 1994). 3'UTR은 또한 보체 가닥 합성의 개시를 위해 요구되는 미번역 영역이다. 5'UTR에서와 같이, 요소의 구조는 그 기능을 가능하게 한다.
3 개 클론에 걸쳐 확인된 31 돌연변이는 IRES에서 7 돌연변이, 캡시드에서 7 돌연변이, 그리고 비-구조적 단백질에서 17 돌연변이를 포함하였다. 최초의 CAVA-PV백본은 브루넨더스 야생형 배경에서 모든 31 개 돌연변이를 결합시킴으로써 개발되었다(그리고, 이에 따라 최초 개발된 CAVA-PV는 유형 1 폴리오바이러스이다). 이 CAVA-PV백본을 생산하기 위해 결합된 31 돌연변이에 대해서는 실시예 1, 표 1을 참조한다. 또한 CAVA 방법 및 CAVA-PV백본 생성 방법의 도식적 개요에 대해서는 도 1을 참조한다.
하나의 바이러스 게놈에서 31 돌연변이의 조합은 상승적인 효과를 가졌다. CAVA-PV백본은 sPER.C6 세포 중 37℃에서 실질적인 복제를 보이지 않음으로써 3 개의 개별 클론과 비교하여 축적된 온도 감수성을 나타냈다. 반면, 동일 세포 중 30℃에서 CAVA-PV백본은 브루넨더스 양친 균주 및 다른 PV1 균주와 비교하여 유사한 성장 동역학, 또는 훨씬 더 빠른 성장을 보였다(실시예 2, 도 2 및 3). CAVA-PV백본의 성장 특성을 이어서 다양한 다른 포유류 세포주에서 시험하였고 37℃의 생리적 온도에서 CAVA-PV백본의 복제 불능은 시험된 모든 포유류 세포 유형에서 확인되었다(실시예 3, 도 4-9).
클론에서 발견된 돌연변이의 합성적 조합은 CAVA-PV 표현형(즉, 양친 브루넨더스 균주와 비교하여 30℃에서 유사한 성장 및 37℃에서 복제 불능)을 얻기 위해 필수적인 것으로 간주된다. 37℃에서 복제의 완전한 상실을 갖는 바이러스의 선택은 저온에서 브루넨더스 및 MEF-1의 30 계대 보다 많은 연속 계대에 의해 가능하지 않았다. 사실, 브루넨더스 및 MEF-1의 계대 중에 얻어진 대략 1000 개의 스크리닝된 클론 중 단지 2-3 개만이 37℃에서 성장의 손상을 보이는(도 1) 한편, 양친 균주와 비교하여 30℃에서 증가된 성장이 브루넨더스 및 MEF-1의 계대 후 클론에서 관찰되었다. 따라서, 여기에서 사용된 계대 조건은 30℃에서 개선된 성장에 대해서는 선택적 이점을 제공하지만 37℃에서 손상된 복제를 갖는 바이러스의 선택에는 유리하지 않았다. 3 개의 개별 클론에서 발견된 돌연변이의 브루넨더스 게놈으로의 합성에 의한 조합에서만 CAVA 표현형이 관찰되었다. 흥미롭게도, CAVA-PV 균주는 클론에서 관찰된, 30℃에서 양친 균주와 비교하여 더 나은 성장을 보이지 않았다(도 3). 따라서, 30℃에서 계대 중 이들 CAVA 돌연변이의 자연적인 조합(이는 CAVA 표현형을 위해 필요함)은 개시 클론과 비교하여 불리할 것이고, 따라서 자발적으로 일어나지 않을 것 같다. 이는 CAVA 표현형을 달성하기 위해 관찰된 돌연변이의 합성적 조합에 대한 전제조건을 강조한다.
따라서, 본 발명은 어떤 특정의 구현예에서, 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 133(A), 142(U), 146(G), 163(A), 579(G), 597(C), 및 609(G); 캡시드에서 805(A), 1787(C), 1905(U), 2756(U), 3236(C), 3323(C), 및 3376(A); 그리고 비-구조적 단백질에서 3476(C), 3486(G), 3852(A), 4120(U), 4253(C), 4301(U), 4428(A), 4563(A), 4811(A), 5436(G), 5705(A), 6059(C), 6210(A), 6488(C), 6848(G), 7079(U), 및 7102(U)(양친 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31을 포함한다: 5'UTR에서 133(A에서 G로), 142(U에서 C로), 146(G에서 A로), 163(A에서 G로), 579(G에서 A로), 597(C에서 U로), 및 609(G에서 A로); 캡시드에서 805(A에서 C로), 1787(C에서 U로), 1905(U에서 C로), 2756(U에서 C로), 3236(C에서 U로), 3323(C에서 U로), 및 3376(A에서 G로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3476(C에서 U로), 3486(G에서 A로), 3852(A에서 U로), 4120(U에서 C로), 4253(C에서 U로), 4301(U에서 C), 4428(A에서 G로), 4563(A에서 U로), 4811(A에서 G로), 5436(G에서 A로), 5705(A에서 G로), 6059(C에서 U로), 6210(A에서 G로), 6488(C에서 U로), 6848(G에서 A로), 7079(U에서 C로), 및 7102(U에서 C로).
또한, 생체내 폴리오바이러스 신경발병성을 평가하기 위해 사용되는 형질전환 CD155 마우스 모델(Koike, Taya et al. 1991)에서, CAVA-PV는 고도로 약독화된 것으로 나타났다(실시예 4, 표 2). 사실, CAVA-PV의 최고 가능한 용량으로 감염된 마우스 중 하나도 어떠한 마비 또는 어떤 다른 질환의 징후도 보이지 않았다. 시험에 또한 포함된 공지의 약독화 PV 균주인 사빈 1의 경우에는 이렇지 않다. 병원성의 저하 순서로, 신경발병성 마우스 모델에서 시험된 균주는 마호니, 브룬힐데, 소켓, 브루넨더스, 사빈 1-3 및 CAVA-PV였다. CAVA-PV는 부분적으로 약독화된 균주인 브루넨더스 보다 적어도 100 배 더 약독화되고, 급성 회백수염에 대한 경구용 예방접종을 위해 많은 나라에서 널리 사용되는 잘-알려진 약독화 균주인 사빈 균주만큼 적어도 약독화된 것으로 결정되었다.
더욱이, 상이한 폴리오바이러스 균주로부터의 캡시드를 포함하도록 CAVA-PV 백본을 재-조작함으로써, CAVA-PV는 현재 사용되는 야생형 IPV 백신의 항원성 프로파일을 갖지만 약독화 CAVA-PV 표현형을 갖는 IPV의 개발을 위한 약독화 백신 균주로서 사용하기에 적절하다. 예를 들어, CAVA-PV는 병원성 야생형 PV 균주(유형 1, 2 및 3, 예를 들어, 유형 1 균주 마호니, 유형 2 균주 MEF-1, 및 유형 3 균주 소켓)의 캡시드를 포함하는 약독화 폴리오바이러스의 생산을 위한 약독화 백본으로서 사용하기에 적절하다. 이는, 예를 들어 CAVA-PV 균주로부터의 캡시드 서열을 요망되는 캡시드 서열로 일상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 치환시키는 것에 의해 행하여질 수 있다(약독화 PV 균주 백본의 캡시드를 야생형 균주의 것으로 재-조작하는 예로서, 예를 들어, WO 2012/090000 참조; 그러나, 참조의 경우에 생성된 균주는, 본 발명의 CAVA-PV 균주와 달리, 37℃에서 실질적 복제가 여전히 가능하다). 따라서, CAVA-PV는 IPV를 위한 재조합 약독화 폴리오바이러스를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, CAVA-PV는 1952년부터 전 세계 인구를 성공적으로 면역시키는 데 사용된 야생형 IPV 균주와 동일한 캡시드 서열을 포함하도록 조작된다. 이는 사빈 균주에서 관찰된 바와 같이, 포르말린 불활성화 후, IPV를 위한 다른 약독화 균주로부터의 변경된 항원성(그리고, 이에 따라 예상되는 면역원성) 프로파일을 회피할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서는 이에 따라, CAVA-PV가 백본로서 사용되고 캡시드를 코딩하는 서열이 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 코딩하는 서열로 교환된다. 이는 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는, 각각 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주를 생성한다. 대안의 바람직한 구현예에서는, CAVA-PV 표현형을 야기하는 돌연변이(예를 들어, 브루넨더스 배경 균주에서 표 4에 나타낸 돌연변이의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14)가 양친 마호니, MEF-1 또는 소켓 균주의 상응하는 위치로 조작되고, 이는 각각 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 마호니, MEF-1 또는 소켓 균주(따라서 이러한 균주의 원래의 캡시드를 갖는)를 생성할 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법 및 이에 의해 얻을 수 있는 폴리오바이러스 균주를 제공한다. 또한, 이러한 균주는 캡시드 교환에 사용될 수 있는데, 예를 들어 CAVA-PV 표현형(30℃에서 성장, 37℃에서 실질적 성장 없음, 도 11)으로 유도하는 돌연변이를 포함하도록 이미 돌연변이된 MEF-1 균주를 기반으로 사용하여 추가의 유전자 조작에 의해 MEF-1 캡시드를 마호니 또는 소켓 캡시드로 교환할 수 있다.
아래 실시예 6에 기술된 바와 같이, 양친 브루넨더스 균주의 캡시드(SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 747 내지 3389)에 상응하는 CAVA-PV 캡시드를 코딩하는 서열을 치환시키는 것에 의해, 마호니, MEF-1 및 소켓으로부터의 캡시드를 코딩하는 서열을 CAVA-PV 게놈의 배경에 위치시켰다. 생성된 백신 균주는 CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF-1 및 CAVA-PV소켓으로, 각각 마호니, MEF-1 및 소켓 캡시드를 포함한다. 실시예 7에 기술된 바와 같이, 적절한 생산 세포주인 현탁액 PER.C6(sPER.C6) 세포에서 CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1 및 CAVA-PV소켓의 성장 동역학을 모두 브루넨더스 양친 균주의 성장과 비교하였다. CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1 및 CAVA-PV소켓 균주는 모두 30℃에서 양친 브루넨더스 균주와 유사한 성장 동역학을 보였다. 반면, 37℃에서, CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1 및 CAVA-PV소켓 균주는 실질적인 복제를 보이지 않았다. 이들 동일한 성장 동역학은 캡시드 교환이 없는 최초의 CAVA-PV백본에서 관찰되어, 바이러스의 온도 감수성은 캡시드 영역의 외부 돌연변이 내에 있음을 시사한다.
따라서, 본 발명은 특정 구현예에서, 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 133(A), 142(U), 146(G), 163(A), 579(G), 597(C), 및 609(G); 그리고 비-구조적 단백질에서 3476(C), 3486(G), 3852(A), 4120(U), 4253(C), 4301(U), 4428(A), 4563(A), 4811(A), 5436(G), 5705(A), 6059(C), 6210(A), 6488(C), 6848(G), 7079(U), 및 7102(U)(양친 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 PV 균주의 게놈은 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24를 포함한다: 5'UTR에서 133(A에서 G로), 142(U에서 C로), 146(G에서 A로), 163(A에서 G로), 579(G에서 A로), 597(C에서 U로), 및 609(G에서 A로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3476(C에서 U로), 3486(G에서 A로), 3852(A에서 U로), 4120(U에서 C로), 4253(C에서 U로), 4301(U에서 C), 4428(A에서 G로), 4563(A에서 U로), 4811(A에서 G로), 5436(G에서 A로), 5705(A에서 G로), 6059(C에서 U로), 6210(A에서 G로), 6488(C에서 U로), 6848(G에서 A로), 7079(U에서 C로), 및 7102(U에서 C로). 특정 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 브루넨더스 캡시드와 비교하여 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드로 치환된다. 대표적인 캡시드 아미노산 서열은 여기에서 마호니(SEQ ID NO: 2), MEF-1(SEQ ID NO: 3), 및 소켓(SEQ ID NO: 4)으로서 제공되고, 물론 당업자는 일부 자연적인 변이가 바이러스 집단 내에서 일상적임을 알고 있다.
상이한 유형의 PV 균주의 많은 게놈 사이에는 비교적 높은 정도의 상동성이 있기 때문에, 여기에 CAVA-PV에서 확인된 돌연변이가 다른 폴리오바이러스 균주로 추정될 수 있음은 또한 해당 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, CAVA-PV에서의 돌연변이에 상응하는 위치는, 상이한 균주의 게놈 서열을 정렬하는 것에 의해 폴리오바이러스의 상이한 균주에서 확인될 수 있다. 사실, 3 개 폴리오바이러스 혈청형 모두로부터의 샘플을 포함하는 정렬이 만들어졌다(Toyoda, Kohara et al. 1984). 이 방식으로, CAVA-PV의 약독화 표현형은 다른 균주로 이동하여 신규의 상이한 백본에서 약독화 CAVA-PV 표현형을 생산할 수 있다. 예를 들어, CAVA-PV에서 31 돌연변이 중 11 개는 CAVA-PV에 독특한 것이고 이들 위치에서 양친 브루넨더스 뉴클레오티드는 정렬에 사용된 모든 다른 PV 균주에서 보존된다(예를 들어, 뉴클레오티드 142는 CAVA-PV에서 C(시티딘)이지만, 이 위치에서 뉴클레오티드는 브루넨더스 양친 균주 및 브룬힐데, 마호니, 사빈 1, 사빈 2, 사빈 3, MEF-1, 및 소켓 균주에서 U(우리딘)이다). 또한, CAVA-PV에는 6 개의 다른 돌연변이가 있는데, 이 위치에서 양친 브루넨더스 뉴클레오티드는 정렬에 사용된 PV1 균주 모두에서 보존된다(브루넨더스, 브룬힐데, 마호니 및 사빈 1). 또한 CAVA-PV 및 사빈 1에서 공통인 1 돌연변이가 있지만, 이 위치의 뉴클레오티드는 다른 모든 균주에서 보존된다. 또한, 정렬에 사용된 다른 균주에서 보존되지 않은 위치에서 CAVA-PV에 6 돌연변이가 있다.
CAVA-PV 돌연변이 모두의 분석을 기반으로 하여, 14 돌연변이는 CAVA-PV의 온도 감수성(및 이에 따른 약독화) 표현형에 강한 기여를 제공하는 것으로 보임을 확인하였다. 14 돌연변이는 표 4에 나타낸다(또한 아래 실시예 10 참조). 돌연변이는 다음 기준에 근거하여 선택되었다: a) 다른 PV 균주 사이에서 보존; b) 37℃에서 계대 후 클론의 복귀를 기반으로 하는 실험적 증거; c) 37℃에서 여전히 성장 가능한 이전의 중간 계대 집단과 비교하여 클론의 신규 돌연변이; 그리고, d) 아미노산 변화를 야기하거나 필수적인 RNA 구조(즉, IRES)에서의 돌연변이. 14 돌연변이를 상이한 폴리오바이러스 배경 균주로 조작하였다. 이에 따라, 본 발명의 CAVA-PV는 표 4의 14 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 CAVA-PV는 또한 표 4의 14 돌연변이, 그리고 선택적으로 최초 확인된 CAVA-PV백본에서의 다른 17 돌연변이를 하나 더 포함할 수 있다. 본 발명의 CAVA-PV는 또한 표 4의 14 돌연변이, 그리고 선택적으로 야생형 균주와 비교하여 게놈의 다른 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 CAVA-PV는 또한 표 4의 14 돌연변이를 포함할 수 있고, 또한 선택적으로 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함할 수 있다. 본원에서의 교시를 사용하여, 표 4의 14 돌연변이의 부분집합(예를 들어, 브루넨더스 배경 균주 또는 다른 PV 배경 균주에서 상응하는 위치에서 이들 중 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 개)만을 갖는 추가의 CAVA-PV 균주를 만들고, CAVA-PV 표현형에 대하여 이러한 균주를 시험하고, 이러한 방식으로 추가의 CAVA-PV 균주를 잠재적으로 얻는 것이 당업자에게 가능하다는 것도 명백할 것이다.
따라서, 본 발명은 특정 구현예에서, 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 133(A), 142(U), 163(A), 597(C), 및 609(G); 그리고 비-구조적 단백질에서 3486(G), 3852(A), 4120(U), 4428(A), 4563(A), 5436(G), 6210(A), 6848(G), 및 7102(U)(양친 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 PV 균주의 게놈은 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함한다: 5'UTR에서 133(A에서 G로), 142(U에서 C로), 163(A에서 G로), 597(C에서 U로), 및 609(G에서 A로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3486(G에서 A로), 3852(A에서 U로), 4120(U에서 C로), 4428(A에서 G로), 4563(A에서 U로), 5436(G에서 A로), 6210(A에서 G로), 6848(G에서 A로), 및 7102(U에서 C로). 특정 바람직한 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 마호니, MEF-1, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드로 치환된다.
본 발명의 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주는 또한, 돌연변이를 CAVA-PV로부터 다른 폴리오바이러스 균주의 게놈의 상동 뉴클레오티드로 전사하는 것에 의해, 브루넨더스 균주와 다른 폴리오바이러스 균주(예를 들어, 브룬힐데, 마호니, 사빈 1, 사빈 2, 사빈 3, MEF-1, 또는 소켓 균주, 또는 임의의 이들 또는 다른 균주로부터 유래되는 균주)로부터 유래될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주는 브루넨더스 균주와 다른 폴리오바이러스 균주로부터 유래될 수 있고, 상이한 폴리오바이러스 균주로부터의 캡시드를 선택적으로 포함할 수 있다. PV 균주는 게놈 길이에서 일부 변화를 보이므로, 돌연변이의 정확한 뉴클레오티드 위치는 다양한 PV 서열의 정렬에 따라 달라질 수 있다. 그러므로, CAVA 돌연변이는, 서열이 정렬되는 방법에 따라, 브루넨더스 배경으로부터 MEF-1 균주 또는 다른 폴리오바이러스 균주로 추정시 뉴클레오티드 수에서 약간 상이하다. 마호니(PV1), MEF-1(PV2), 소켓(PV3), 사빈 1(PV1), 사빈 2(PV2) 및 사빈 3(PV3) 균주에서 CAVA 돌연변이의 상응하는 뉴클레오티드 위치는, 브루넨더스 균주의 넘버링과 비교하여 본원에 제공된다(표 4).
따라서, 추가의 비-제한적 예로서, 본 발명은 특정 구현예에서, 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 MEF-1 균주(SEQ ID NO: 5)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 134(A), 143(U), 164(A), 598(C), 및 610(G); 그리고 비-구조적 단백질에서 3481(A), 3847(A), 4115(U), 4423(A), 4558(A), 5431(G), 6205(A), 6843(G), 및 7097(U)(양친 MEF-1 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 MEF-1 균주(SEQ ID NO: 5)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함한다: 5'UTR에서 134(A에서 G로), 143(U에서 C로), 164(A에서 G로), 598(C에서 U로), 및 610(G에서 A로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3481(A에서 A로), 3847(A에서 U로), 4115(U에서 C로), 4423(A에서 G로), 4558(A에서 U로), 5431(G에서 A로), 6205(A에서 G로), 6843(G에서 A로), 및 7097(U에서 C로). 특정 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 마호니로부터, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드로 치환될 수 있다.
추가의 비-제한적 예에서, 본 발명은 특정 구현예에서, 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 마호니 균주(SEQ ID NO: 6)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 131(A), 140(U), 161(A), 593(C), 및 605(G); 그리고 비-구조적 단백질에서 3482(G), 3848(A), 4116(U), 4424(A), 4559(A), 5432(G), 6206(A), 6844(G), 및 7098(U)(양친 마호니 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 마호니 균주(SEQ ID NO: 6)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함한다: 5'UTR에서 131(A에서 G로), 140(U에서 C로), 161(A에서 G로), 593(C에서 U로), 및 605(G에서 A로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3482(G에서 A로), 3848(A에서 U로), 4116(U에서 C로), 4424(A에서 G로), 4559(A에서 U로), 5432(G에서 A로), 6206(A에서 G로), 6844(G에서 A로), 및 7098(U에서 C로). 특정 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 MEF-1으로부터, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드로 치환될 수 있다.
다른 추가의 비-제한적 예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 소켓 균주(SEQ ID NO: 7)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 133(A), 142(U), 163(A), 596(C), 및 608(G); 그리고 비-구조적 단백질에서 3472(A), 3839(A), 4107(U), 4415(A), 4550(A), 5423(G), 6197(A), 6835(G), 및 7089(U)(양친 소켓 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 소켓 균주(SEQ ID NO: 7)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함한다: 5'UTR에서 133(A에서 G로), 142(U에서 C로), 163(A에서 G로), 596(C에서 U로), 및 608(G에서 A로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3472(A에서 A로), 3839(A에서 U로), 4107(U에서 C로), 4415(A에서 G로), 4550(A에서 U로), 5423(G에서 A로), 6197(A에서 G로), 6835(G에서 A로), 및 7089(U에서 C로). 특정 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 MEF-1으로부터, 또는 마호니 균주로부터의 캡시드로 치환될 수 있다.
다른 추가의 비-제한적 예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 사빈 3 균주(SEQ ID NO: 8)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 133(A), 142(U), 163(G), 596(C), 및 608(G); 그리고 비-구조적 단백질에서 3473(A), 3839(A), 4107(U), 4415(A), 4550(A), 5423(G), 6197(A), 6835(G), 및 7089(U)(양친 사빈 3 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 사빈 3 균주(SEQ ID NO: 8)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함한다: 5'UTR에서 133(A에서 G로), 142(U에서 C로), 163(G에서 G로), 596(C에서 U로), 및 608(G에서 A로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3473(A에서 A로), 3839(A에서 U로), 4107(U에서 C로), 4415(A에서 G로), 4550(A에서 U로), 5423(G에서 A로), 6197(A에서 G로), 6835(G에서 A로), 및 7089(U에서 C로). 특정 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 마호니, MEF-1으로부터, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드로 치환될 수 있다.
다른 추가의 비-제한적 예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 사빈 1 균주(SEQ ID NO: 9)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 131(A), 140(U), 161(A), 593(C), 및 605(G); 그리고 비-구조적 단백질에서 3482(G), 3848(A), 4116(C), 4424(A), 4559(A), 5432(G), 6206(A), 6844(G), 및 7098(U)(양친 사빈 1 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 사빈 1 균주(SEQ ID NO: 9)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함한다: 5'UTR에서 131(A에서 G로), 140(U에서 C로), 161(A에서 G로), 593(C에서 U로), 및 605(G에서 A로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3482(G에서 A로), 3848(A에서 U로), 4116(C에서 C로), 4424(A에서 G로), 4559(A에서 U로), 5432(G에서 A로), 6206(A에서 G로), 6844(G에서 A로), 및 7098(U에서 C로). 특정 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 마호니, MEF-1으로부터, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드로 치환될 수 있다.
다른 추가의 비-제한적 예에서, 본 발명은 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 사빈 2 균주(SEQ ID NO: 10)의 게놈과 비교하여 다음 위치의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14에서 돌연변이를 포함한다: 5'UTR에서 131(A), 140(U), 161(A), 594(C), 및 606(G); 그리고 비-구조적 단백질에서 3481(G), 3847(A), 4115(U), 4423(A), 4558(A), 5431(G), 6205(A), 6844(G), 및 7098(U)(양친 사빈 2 균주에서의 뉴클레오티드는 그 위치 다음의 괄호 사이에 나타내고, 따라서 이는 본 구현예에서 상이한 뉴클레오티드로 돌연변이된다). 이의 어떤 특정의 구현예에서, 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 사빈 2 균주(SEQ ID NO: 10)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이 중 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함한다: 5'UTR에서 131(A에서 G로), 140(U에서 C로), 161(A에서 G로), 594(C에서 U로), 및 606(G에서 A로); 그리고 비-구조적 단백질에서 3481(G에서 A로), 3847(A에서 U로), 4115(U에서 C로), 4424(A에서 G로), 4559(A에서 U로), 5432(G에서 A로), 6206(A에서 G로), 6844(G에서 A로), 및 7098(U에서 C로). 특정 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 마호니, MEF-1으로부터, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드로 치환될 수 있다.
본 발명은 또한, 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 제공하는데, 여기에서 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 양친 폴리오바이러스 균주(여기에서 양친 폴리오바이러스 균주는 각각, 예를 들어 SEQ ID No: 1/5/6/7/8/9/10의 각각의 게놈 서열을 갖는, 예를 들어 브루넨더스/MEF-1/마호니/소켓/사빈 3/사빈 2/사빈 1 균주임)의 게놈과 비교하여 다음 위치, 또는 이들 4 균주에서의 서열 정렬에 근거하여 다른 PV 양친 균주에서의 상응하는 위치의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14에서 다음 뉴클레오티드를 포함한다: 5'UTR에서 위치 133/134/131/133/133/131/131에 G, 위치 142/143/140/142/142/140/140에 C, 위치 163/164/161/163/163/161/161에 G, 위치 597/598/593/596/596/593/594에 U, 및 위치 609/610/605/608/608/605/606에 A; 그리고 비-구조적 단백질에서 위치 3486/3481/3482/3473/3473/3482/3481에 A, 위치 3852/3847/3848/3839/3839/3848/3847에 U, 위치 4120/4115/4116/410741407/4116/4115에 C, 위치 4428/4423/4424/4415/4415/4424/4423에 G, 위치 4563/4558/4559/4550/4550/4559/4558에 U, 위치 5436/5431/5432/5423/5423/5423/5431에 A, 위치 6210/6205/6206/6197/5197/6206/6205에 G, 위치 6848/6843/6844/6835/6835/6844/6843에 A, 및 위치 7102/7097/7098/7089/7089/7098/7097에 C. 특정 구현예에서, 이러한 균주의 캡시드는 마호니로부터, MEF-1으로부터, 또는 소켓 균주로부터의 캡시드 서열을 포함한다.
본 발명은 따라서, 게놈이 다음 위치, 또는 예를 들어 표 4에 제공되는 다른 PV 균주에서의 상응하는 위치에서 다음 뉴클레오티드의 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함하도록, 야생형 폴리오바이러스 게놈(예를 들어, 브루넨더스, 마호니, MEF-1, 소켓, 또는 다른 PV 균주로부터의)에 돌연변이를 도입하는 것에 의해(예를 들어, 일상적인 유전자 조작을 통하거나, 또는 완전 폴리오바이러스 게놈의 신생 합성을 통해), CAVA-PV 균주를 생성시키는 추가의 방법을 또한 제공한다: 5'UTR에서 위치 133에 G, 위치 142에 C, 위치 163에 G, 위치 597에 U, 및 위치 609에 A; 그리고 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)에 대한 비-구조적 단백질에서 위치 3486에 A, 위치 3852에 U, 위치 4120에 C, 위치 4428에 G, 위치 4563에 U; 위치 5436에 A, 위치 6210에 G, 위치 6848에 A, 및 위치 7102에 C.
본 발명의 재조합 약독화 CAVA-PV 균주는 또한 전형적으로 예상되는 생산 조건 하에서 유전적으로 안정하고, 37℃의 생리적 조건에서 복제 불능으로 인해 이들이 생산 시설로부터의 탈출 및/또는 우발적 감염시 신경발병성 형태로 복귀되기는 매우 어려울 것으로 보인다. 37℃에서 CAVA-PV 균주의 연속 계대는 항상 제1 계대 후 바이러스 정량화의 불능을 유도하여, 10 보다 많은 블라인드 계대 후에도 37℃에서 복제 능력을 회복하기 위한, 이 온도에서의 복귀 불능을 나타낸다. 이는 생리적 온도에서 복제 가능한 다른 약독화 균주보다 CAVA-PV에 이점을 준다. 따라서, CAVA-PV는 산업 재해의 경우에 잠재적 질환 발생의 위험 경감으로 인해, IPV 백신의 개발을 위해 잠재적으로 더 낮은 생화학적 봉쇄 역치를 갖는 더 안전한 백신 제조 공정을 제공한다. 이 방식으로, IPV의 기초로서 CAVA-PV의 내재적 안전성은 IPV 제조 비용의 조절을 도울 수 있을 뿐 아니라, 야생형 PV로 제조하는 것이 금지되거나 높은 위험이 제기된 국가에서의 제조가 허용되도록 할 수 있다. 또한, CAVA-PV 균주는 PER.C6 세포의 현탁 배양에서 높은 밀도로 성장할 수 있어, 이는 높은 수율을 제공하고 이에 따라 이 생산 세포주의 사용은 또한 다른 세포주와 비교하여 IPV 생산의 비용을 유의미하게 낮추는 데 기여할 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허 제8,546,123호 및 Sanders, Edo-Matas et al.(2012)을 참조한다.
CAVA-PV 균주는 해당 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 증식될 수 있다. 예를 들어, CAVA-PV는 허용되는 세포주(예를 들어, PER.C6, 또는 Vero 세포, HEK293 세포, HeLa, L20B, 등)에서, 허용되는 온도(예를 들어, 20 내지 33℃, 26 내지 33℃, 28 내지 32℃, 또는 바람직하게는 약 30℃)로 배양하는 것에 의해 증식될 수 있다. 이러한 세포주를 위한 적절한 배지는 널리 알려져 있고 다양한 제조자로부터 입수 가능하다. 바람직하게는, 무-혈청 배지가 사용되고, 특정 구현예에서 세포는 현탁액 중에 배양된다. 바이러스의 수확은 전형적으로 최대 역가에 도달시 수행되고, 이는 사용되는 MOI 및 배양 온도에 의존한다. 일반적으로, 1의 MOI는 30℃에서 감염 후 12 내지 48 시간(hpi) 사이, 예를 들어, 18 내지 30 hpi, 예를 들어 대략 24 hpi에 최대 역가에 도달할 것이다.
폴리오바이러스 또는 바이러스 구성 요소의 수확 및 정제, 그리고 이로부터 백신의 생산을 위한 방법은 수십 년 동안 해당 분야에서 사용되고, 따라서 잘 알려져 있고 충분히 기술되어 있으며, 예를 들어, 모두 본원에 참조로 도입되는 WO 2007/007344; U.S. Pat. No.: 4,525,349; 및 (van Wezel, van Steenis et al. 1978, Montagnon, Fanget et al. 1984)를 참조한다.
일반적으로, 각각의 폴리오바이러스 균주는 별개의 공정으로 배양되고, 예를 들어 3 가지 유형의 폴리오바이러스를 포함하는 3가 백신이 제조될 경우, (IPV에서는, 불활성화된) 바이러스가 개별 투여 제제로 혼합 및 제형화된다. 예를 들어 특정 구현예에서, 최종 백신은 용량 당, 예를 들어 상이한 양의 각각의 CAVA-PV를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이는 CAVA 유형 1(CAVA-PV마호니), 유형 2(CAVA-PVMEF-1) 및 유형 3(CAVA-PV소켓) 균주를 가지고 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 최종 백신은 용량(예를 들어, 0.5 mL) 당 기준 제제와 비교하여 결정된, 예를 들어 10 내지 80, 예를 들어 40 D-항원 단위(DU)의 유형 1, 2 내지 20, 예를 들어 8 DU의 유형 2 및 8 내지 64, 예를 들어 32 DU의 유형 3을 포함할 수 있다.
CAVA-PV의 불활성화는 해당 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 포르말린 또는 β-프로피오락톤(BPL)으로 시행될 수 있으며, 예를 들어, (Jiang, Pye et al. 1986)을 참조한다. 특정 구현예에서, 불활성화는 포르말린으로, 예를 들어 다음 방법에 의해 수행된다: 정제된 바이러스 현탁액을 0.22 ㎛ 멤브레인으로 여과하고, 24 시간 동안 꾸준히 자석식 교반과 함께 37℃까지 가열한 후, 포르말린 용액을 가하여 4,000 당 1의 농도를 달성한다. 바이러스 현탁액을 37℃로 유지하면서, 자석식 교반을 최초 4 일 동안 계속한다. 제6 일에, 바이러스 현탁액을 0.22 마이크론 멤브레인으로 여과하고, 불활성화를 제12 일까지 37℃에서 현탁액 하에서 계속한다. 불활성화된 바이러스 현탁액을 균질화하고, 예를 들어 4℃에서 저장할 수 있다. 이 단계 이후, 예를 들어 요망되는 제제를 혼합하는 것에 의해, 투여를 위한 농축 및/또는 최종 배치를 제조할 수 있다.
특정 구현예에서, 정제된 CAVA-PV 또는 바이러스 구성 요소는 약제학적 조성물로 제형화된다. 이는 다양한 방법에 따라, 그리고 본 개시를 참고한 후 해당 분야의 당업자에게 잘 알려진 모든 일상적인 방법에 따라 다양한 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 이는 폴리오바이러스 및 적어도 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 조성물에 폴리오바이러스 입자를 넣는 것을 수반한다. 이러한 조성물은 당업자에게 알려진 조건 하에서 제조될 수 있고, 특정 구현예에서 인간에게 투여하기 적절하다. 특정 구현예에서, 조성물은 완충된 배지를 포함할 수 있는데, 이는 선택적으로, 특정의 등록된 통상의 IPV를 위한 제형화 완충액으로 사용되는 배지 M-199일 수 있다. 또한, 인산염 완충된 식염수도 사용될 수 있고, 최종 투여 제형은 항미생물 보존제로서 용량 당, 예를 들어 0.5%의 2-페녹시에탄올 및 최대 0.02%의 포름알데히드를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 및 희석제는 해당 분야에 잘 알려져 있고 광범위한 치료제 제품에 널리 사용된다. 바람직하게는, 담체가 백신에서 이 작업에 잘 적용된다. 특정 구현예에서, 백신은 추가로 애쥬번트, 예를 들어 알룸(alum)을 포함한다. 애쥬번트는 적용되는 항원 결정기에 대한 면역 반응을 추가로 증가시키기 위한 것으로 해당 분야에 알려져 있다.
인간에게 투여하기 위해, 본 발명은 CAVA-PV 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 이용할 수 있다. 본원에서, "약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 담체 또는 부형제가 이용된 투여량 및 농도에서 이들이 투여되는 대상에게 임의의 원치 않거나 유해한 효과를 야기하지 않을 것을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제는 해당 분야에 잘 알려져 있다.
정제된 불활성화 CAVA-PV 또는 이의 면역원성 부분은 바람직하게는 멸균 용액으로서 제형화되고 투여된다. 멸균 용액은, 예를 들어 멸균 여과에 의하거나 해당 분야에 알려진 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 이 용액은 다음에 동결건조되거나 약제학적 제형 용기로 충전된다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5, 예를 들어, pH 5.0 내지 7.5의 범위이다. 폴리오바이러스 또는 이의 면역원성 부분은 전형적으로 약제학적으로 허용 가능한 적절한 완충액을 갖는 용액 중에 있고, 폴리오바이러스의 용액은 또한 염을 포함할 수 있다. 선택적으로, 알부민과 같은 안정화제가 존재할 수 있다. 특정 구현예에서는, 세제가 첨가된다. 특정 구현예에서, 백신은 주사 가능한 제제로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효량의 폴리오바이러스 또는 이의 면역원성 부분을 포함하고, 멸균된 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조된 형태이고, 선택적으로 안정화제 또는 부형제를 포함한다.
본 발명에 따라 얻을 수 있는 CAVA-PV 백신은 한 가지 유형의 폴리오바이러스(유형 1, 2 또는 3)를 포함하는 1가, 또는 2가(두 가지 유형의 폴리오바이러스, 예를 들어 유형 1 및 2, 1 및 3, 또는 2 및 3을 포함하는), 또는 3가(3 가지 유형의 폴리오바이러스, 예를 들어 유형 1, 2 및 3을 포함하는)일 수 있다.
또한, 독립형 IPV로서의 사용에 더하여, 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 CAVA-PV 기반의 IPV는 표준 방식으로, 예를 들어 통상의 IPV에 대하여 보통 행하여지듯이, 예를 들어 디프테리아, 파상풍, 백일해, 헤모필루스 인플루엔자에(Heamophilus influenzae) 유형 b(Hib), B형 간염 바이러스(HBV) 등의 하나 이상에 대한 추가의 백신 성분을 선택적으로 포함할 수 있는 조합 백신의 형태로, 다른 백신과 조합될 수 있다(다양한 성분 및 조합 백신에 대해서는, 예를 들어, "Vaccines." 5th edition. S. Plotkin, W. Orenstein, P. Offit, 2008, Section 2 참조; 예를 들어, 챕터 25에서는 IPV 백신을 기술함[Plotkin, pp 605-630]. 따라서, 본 발명에 따라 얻을 수 있는 CAVA-PV 백신은 확대된 면역화 프로그램(expanded program on immunization(EPI))에서 사용하기 적절하고, 이 프로그램에서 백신과 조합될 수 있다. 통상적인 IPV와 유사하게, 본 발명에 따른 CAVA-PV 백신은 단일 투여량으로서, 또는 바람직하게는 다중 투여량의 백신이 적절한 시간 간격을 두고 투여되는 프라임-부스트(prime-boost) 요법으로 주어질 수 있다. 예를 들어, 높은 면역화 범위(>90%)를 갖는 국가에서 WHO에 의해 권장되는 바와 같이, 계획은 생후 2 개월에 시작되는 3 투여량의 1차 시리즈(예를 들어, 2, 3 및 4 개월에)를 포함할 수 있다. 추가로, 1차 시리즈가 더 일찍 시작될 경우(예를 들어 6-, 10- 및 14-주 계획), 부스터 투여량은 적어도 6 개월의 간격 후, 즉 4-투여량 계획으로 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 CAVA-PV 백신은 또한 통상의 IPV의 사용을 위해 WHO에서 제안한 바와 같이 OPV와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, WHO는 현재 OPV만을 사용하는 모든 국가에서 적어도 1 투여량의 IPV를 계획에 추가할 것을 권고한다. 소아마비-풍토병 국가 및 유입과 이어지는 확산에 대한 높은 위험이 있는 국가에서, WHO는 또한 출생시 OPV 투여량('영점 투여량'으로도 호칭)에 이어서, 3 OPV 투여량의 1차 시리즈 및 적어도 1 IPV 투여량을 권고한다. 궁극적으로, 최적 투여량 요법은 표준 의료 실무에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로 이용 가능한 IPV에 대한 것과 동일한 계획을 따를 것이다.
본 발명에 따라 얻을 수 있는 CAVA-PV 백신의 치료적으로 유효한 양은 투여 계획, 투여되는 재조합 폴리오바이러스의 단위 용량, 재조합 약독화 폴리오바이러스가 다른 치료제와 조합으로 투여되는지 여부, 그리고 환자의 건강 및 상태에 의존할 것임은 또한 해당 분야의 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 얻을 수 있는 CAVA-PV 백신 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 투여하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 본원에 개시되는 재조합 약독화 폴리오바이러스를 포함한다. 키트는 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 시린지와 같은 주입기, 및 이의 사용을 위한 교육용 자료를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 재조합 약독화 폴리오바이러스의 투여를 지시하거나 바이러스 증식을 위해 유용한 임의의 정보를 제공할 수 있다.
특허, 공개된 출원, 기술 문헌 및 학술 문헌을 포함할 수 있는 다양한 공보가 명세서 전체에 걸쳐 괄호 안에 인용되고, 각각의 전체 인용문은 명세서 끝에서 발견될 수 있다. 이들 인용된 문헌의 각각은 본원에 전체로서 참조로 도입된다.
본 발명의 다른 구현예, 특징 및 이점은 다음 실시예를 참고하여 추가로 설명된다.
실시예
추가의 설명 없이, 해당 분야의 당업자는 앞서의 설명 및 다음 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명을 만들고 이용하고, 청구된 방법을 실시할 수 있을 것을 알 수 있다. 다음 실시예는 이에 따라 본 발명의 특정 구현예를 구체적으로 지적하는 것이고, 어떠한 방식으로도 나머지 개시를 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 저온-적응-바이러스-약독화( CAVA ) 및 CAVA 폴리오바이러스( CAVA -PV)의 생산 방법
본 실시예에서는, 브루넨더스 양친 균주를 PER.C6 세포 중 저온(≤30℃)에서 낮은 MOI(0.01)로 4 mM L-글루타민이 보충된 PermexcisTM 배지(화학적으로 정의된 무-혈청 배지, 예를 들어, Lonza, cat. # BE02-039Q로부터 입수 가능)에서 34 회 연속 계대하였다. 생성된 바이러스 집단을 분석하여 집단 내 생리적 온도(37℃)에서 손상된 성장 및 저온(30℃)에서 야생형 성장을 갖는 온도 감수성 바이러스 클론을 확인하였다. 대략 1000 클론의 스크리닝에서, 3 클론(G12P5, F9P4, 및 G11P3로 명명)이 37℃에서 손상된 성장을 갖는 온도 감수성을 보이는 것으로 발견되었다. 손상된 성장은 양친 바이러스와 비교하여 최대 역가에서 100- 내지 1000-배 감소로서 정의되었다. 이 3 클론은 생리적 온도에서 여전히 복제 가능하지만 역가가 낮아졌다. 더 낮은 온도(30℃)에서 3 클론의 성장 동역학은 개시 양친 균주와 비교하여 더 빨랐다. 온도 감수성 클론을 서열 분석하였으며, 3 가지 상이한 클론에 걸쳐 총 31 돌연변이가 발견되었다. 각각의 클론은 18 뉴클레오티드 돌연변이를 갖고, 이중 일부는 다른 클론과 공유되고 일부는 각각의 클론에서 독특한 것이었다.
여기에서 저온-적응-바이러스-약독화 폴리오바이러스(CAVA-PV)로 언급되는 신규의 재조합 폴리오바이러스 균주를 생성하기 위해, 3 클론에서 확인된 31 돌연변이 모두를 백본으로서 양친 브루넨더스 서열을 사용하여 하나의 게놈으로 결합시켰다. 양친 브루넨더스 서열은 SEQ ID NO: 1으로 제공된다. CAVA-PV 서열을 합성하고 CAVA-PV백본을 구조하였다. 간단하게는, 재조합 약독화 폴리오바이러스 CAVA-PV백본 균주의 서열을 cDNA 플라스미드 형태로 합성하여 생성하였으며, 여기에서 바이러스 게놈 서열은 바이러스 RNA의 생산에 필요한 파지 T7 프로모터의 바로 하향에 있다. 구조를 위해, CAVA-PV백본 게놈 서열을 포함하는 cDNA 플라스미드를 T7 폴리머라제에 의해 중개되는 시험관내 전사를 위한 주형으로 사용하여 바이러스 RNA를 생산하고 이어서 세포의 형질감염 및 바이러스 구조에 사용하였다. 이 구조 절차는 해당 분야에서 빈번하게 사용되는데, 예를 들어 (van der Werf, Bradley et al. 1986)을 참조한다. 표 1은 CAVA-PV백본을 생산하기 위해 조합된 31 돌연변이를 보여준다. 도 1은 CAVA 방법 및 어떻게 최초 CAVA-PV가 생성되는지의 도식적 개요이다.
실시예 2: 다른 유형 1 PV 균주와 비교한 sPER . C6 세포에서의 CAVA - PV 백본 의 성장 동역학
생산 세포주인 현탁액 PER.C6(sPER.C6) 세포에서 CAVA-PV백본의 성장 동역학을 다른 유형 1 PV(PV1) 균주의 성장과 30 및 37℃에서 비교하였다. 다른 PV1 균주는 브룬힐데, 브루넨더스, 마호니, 및 사빈 1이었다. 브룬힐데는 브루넨더스의 양친 균주이고 이는 이어서 CAVA-PV백본의 양친 균주이다. 마호니는 전형적으로 소크(Salk) IPV의 유형 1 성분을 위한 백신 균주로서 사용되는 야생형 신경발병성 PV 균주이다. 사빈 1은 생 약독화 경구 폴리오바이러스 백신(OPV)을 위한 백신 균주로서 사용되는 약독화 균주이다. 감염시 현탁액 PER.C6 세포는 4 mM L-글루타민으로 보충된 Permexcis 배지 중 10x106 세포/mL의 세포 밀도를 가졌다. 세포를 2의 MOI로 감염시키고, 감염은 1 회 시행되었다(N=1). 바이러스 수확물을 30℃에서 TCID50 분석을 이용하여 역가 측정하여, mL 당 조직 배양 감염량 50%(Tissue Culture Infectious Dose 50%(TCID50))인 50%의 샘플이 감염(CPE)을 보이는 감염량을 구하였다. sPER.C6 세포에서 복제 동역학에 대한 선 그래프를 도 2에서 보여준다. CAVA-PV백본은 30℃에서 다른 PV1 균주와 비교하여 야생형 성장 동역학, 또는 훨씬 더 빠른 성장을 보여주었다. 반면, 37℃에서 CAVA-PV백본은 놀랍게도 유의미한 복제를 보이지 않아 3 가지 상이한 온도 감수성 클론으로부터의 돌연변이의 조합으로 상승적 축적 효과가 있음을 나타낸다. 다른 PV1 균주는 모두 정상적으로 복제하였고 37℃에서 sPER.C6 세포 중 유사한 성장 행동을 보였다.
sPER.C6 세포 중 CAVA-PV 및 브루넨더스의 성장 동역학을 3 가지 독립적인 실험에서 추가로 평가하고 평균 역가를 30℃ 및 37℃에서 시간 경과에 대하여 표시하였다. 평균 역가는 도 3에 표시하는데, 에러바는 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다. 성장 곡선은 30℃에서 두 바이러스 모두 유사한 동역학을 보이지만, 37℃에서 CAVA-PV백본은 복제하지 못하고; 투입 바이러스만이 이 분석 중에 측정된다. 양친 브루넨더스 균주는 37℃에서 성장에 손상을 보이지 않았다. 30℃에서 CAVA-PV백본의 평균 최대 역가는 9.82 Log10 TCID50/mL로, 이는 sPER.C6 세포 상에 야생형 균주에서 얻어진 역가와 유사하다(Sanders, Edo-Matas et al. 2012).
실시예 3: 브루넨더스 개시 바이러스와 비교한 다양한 세포주에서의 CAVA - PV 백본 의 성장 동역학
성공적인 감염은 바이러스와 숙주 세포 사이의 복잡한 상호작용이고, 따라서 온도 감수성은 숙주 세포 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 그러므로, 다양한 포유류 세포주의 패널을 바이러스 성장에 대하여 시험하여 생리적 조건에서 CAVA-PV백본의 복제 불능을 확인하였다.
도 4, 5 및 6은 각각 HEK293, L20B 및 HeLa 세포에서 CAVA-PV백본 및 브루넨더스의 복제 동역학을 보여준다. 각각의 세포주에서 1x106 세포를 3 가지 상이한 온도(30℃, 37℃ 및 39.5℃)에서 2의 MOI로 DMEM 배지+1% BCS 중에서 감염시켰다. 바이러스 역가를 30℃에서 HelaR19 세포에서의 플라크 분석에 의해 정량하였으며, 이는 바이러스 수확물 중 플라크 형성 단위(PFU)의 수를 야기한다. 결과는 CAVA-PV백본이 37℃ 또는 39.5℃에서 3 가지 모든 세포주 중에 복제하지 못하는 것을 확인한다. 그러나, 30℃에서 CAVA-PV백본의 성장 동역학은 양친 브루넨더스 PV 균주와 유사하다. 브루넨더스 바이러스는 임의의 온도에서 임의의 세포주 중에 복제의 손상을 보이지 않지만, 역가는 더 낮은 온도에서와 비교하여 39.5℃에서 약간 더 낮다.
도 7, 8 및 9는 각각 Vero, SK-N-MC 및 부착 PER.C6(adPER.C6) 세포에서 CAVA-PV백본 및 브루넨더스의 복제 동역학을 보여준다. 이들 감염은 30℃ 또는 37℃에서 2의 MOI로 MEM 배지+5% FBS(Vero 및 SK-N-MC 세포) 또는 DMEM+10% FBS+4.9 mM MgCl2(adPER.C6) 중에서 수행되었다. 바이러스 수확물을 30℃에서 TCID50 분석을 사용하여 역가 측정하였다. Vero 및 adPER.C6에서의 결과는 앞서 관찰된 것과 일치한다: CAVA-PV백본은 30℃에서만 브루넨더스 균주와 비슷한 복제를 보인다. 또한, 37℃에서 복제의 결여가 관찰된다.
SK-N-MC 세포주(도 8)의 경우, CAVA-PV백본은 두 온도에서 복제할 수 없었다. 이 세포주는 신경상피종으로부터 유래된 인간 신경 세포주이고 신경발병성의 시험관내 모델로서 사용된다(Jahan, Wimmer et al. 2011). 비록 이것이 바이러스 균주의 신경-약독화에 대하여 입증된 예측 시험관내 분석은 아니지만, 이 세포주 중에 30℃ 및 37℃ 둘 다에서 CAVA-PV백본의 억제된 바이러스 성장은 신경 세포주에서 복제 불능을 나타내고 신경-약독화를 예상할 수 있다.
실시예 4: CD155 형질전환 마우스에서 신경발병성 시험
시험관내 온도 감수성 표현형이 신경-약독화로 해석되는지 여부를 결정하기 위해, 생체내 형질전환 CD155 마우스 모델을 사용하였다(Koike, Taya et al. 1991). CD155 형질전환 마우스는 PV 감염에 대한 마우스의 민감성을 야기하는 폴리오바이러스 수용체(PVR 또는 CD155)를 발현하도록 유전적으로 변형된 것이다. CD155 마우스를 CAVA-PV 및 다른 선택된 PV 균주로 감염시켰다. 주어진 시험군에서 마우스의 50%에 마비 또는 사망을 야기하는 데 필요한 감염 단위의 수(TCID50으로 표현)에 상응하는 (마비 또는) 치사 용량 50((P)LD50)을 결정하기 위해 마우스를 다양한 용량을 가지고 대뇌내(i.c.), 근육내(i.m.) 또는 복막내(i.p.) 중 하나로 감염시켰다. (P)LD50이 낮을수록 바이러스는 더 신경발병성이다. 표 2는 생체내 신경발병성 시험의 결과를 보여준다. CAVA-PV(활성 CAVA-PV백본, CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1 및 CAVA-PV소켓)에서는, 마우스에 투여된 최대량의 바이러스가 주사 받은 어떠한 마우스에서도 어떠한 마비 징후도 야기하지 않았으며, 따라서 (P)LD50은 투여될 수 있는 최대 용량보다 큰 것으로(>) 주어진다. 신경발병성의 지표로서 다른 PV 바이러스의 (P)LD50을 또한 결정하였다. 브루넨더스 및 브룬힐데는 CAVA-PV의 양친 균주인 한편, 마호니, MEF-1, 소켓 및 사빈 바이러스는 각각 IPV 및 OPV의 백신 균주이다. 마호니는 가장 병원성인 바이러스이고, 다음이 브룬힐데, 소켓, 브루넨더스, MEF-1 및 사빈 균주이다. 이는 이들 균주의 문헌에서의 신경발병성 데이터와 일치한다. CAVA-PV는 임의의 야생형 균주보다 덜 신경발병성이다. CAVA-PV는 대뇌내 투여 경로(신경 세포를 파괴하고 마비를 야기하는 바이러스의 능력을 측정하기 위한, 여기에서 사용되는 가장 감수성인 경로)를 통해 마호니보다 적어도 1백만 배 더 약독화되어 있다. CAVA-PV는 부분적으로 약독화된 균주인 브루넨더스보다 적어도 100 배 더 약독화되어 있다. CAVA 균주가 사빈보다 더 약독화되어 있는지 여부를 확인하기 위해서는 신경발병성의 결정을 위한 더 감수성인 모델을 사용할 필요가 있는데, 이 모델은 사빈과 CAVA 균주 사이를 구분하기에 충분히 감수성이지 않기 때문이다. 그러나, 사빈 균주는 최고 용량으로 투여된 마우스 일부에서 마비를 유발한 반면, CAVA 균주는 그렇지 않았다.
두 가지 알려진 약독화 바이러스(RIPO 및 사빈 1의 (P)LD50은 동일한 신경발병성 모델에서 각각 >108 및 5x107 PFU로 보고되어 있다(Bouchard, Lam et al. 1995, Jahan, Wimmer et al. 2011). 그러나, 이들 값은 동일한 실험에서 결정된 것이 아니고, 따라서 이들 (P)LD50를 직접 비교할 때 주의해야 한다. RIPO 균주는 악성 신경교종을 치료하기 위한 임상 시험에서 사용하도록 허가된 약독화 종양세포 붕괴성(oncolytic) 폴리오바이러스 균주이다(Jahan, Wimmer et al. 2011). CAVA-PV 균주는 이들 약독화 균주와 유사한 방식으로 작용한다. 사실, 가능한 최고 용량의 CAVA-PV 균주로 감염된 마우스의 하나도 어떠한 질환의 징후도 보이지 않은 한편, 이는 다른 약독화 바이러스(예를 들어, OPV의 유형 1 성분인, 허가된 생 약독화 백신으로 매년 수백만의 아동에게 투여되는 사빈 1)에서 반드시 필요한 경우는 아니다. 따라서, 이 신경발병성 모델에서 CAVA-PV는 고도로 약독화된 것을 보여준다.
실시예 5: 생산 조건 하에서 CAVA - PV 의 유전적 안정성
CAVA-PV백본 균주를 예상되는 생산 조건(Permexcis 배지 중 10x106 vc/mL의 세포 밀도의 sPER.C6 세포, 1의 MOI로, 30℃에서) 하에서 소규모로 계대하고 24 hpi에서 수확하였다. 이 계대는 8 회 수행되었으며, 이는 이론적인 상업적 제조 배치를 넘는 5 계대를 나타낸다. 계대 후 전체 게놈을 서열 분석하였다. 바이러스로 도입된 31 돌연변이의 어느 것도 복귀되지 않았다. 계대 후 전체 게놈은, 아미노산 치환을 야기한 3A 유전자의 뉴클레오티드 5206에서 혼합된 집단을 보이는 하나의 뉴클레오티드를 제외하고는 개시 스톡과 동일하였다. 폴리오바이러스의 RNA 폴리머라제의 많은 에러율로 인해 본 발명자들은 이 돌연변이가 무작위이고 온도 감수성(및 약독화) 표현형의 임의의 복귀를 유도하지 않을 것으로 추정한다. 본 발명자들은 이어서 복제 동역학을 수행하여 온도 감수성 표현형을 확인하였고 8x 계대의 CAVA-PV가 CAVA-PV 개시 스톡과 비교하여 30℃ 및 37℃ 둘 다에서 유사한 성장 곡선을 보이는 것을 관찰하였다(도 10). 따라서, 신경약독화의 시험관내 지표인 CAVA-PV백본의 온도 감수성 표현형은 생산 조건 하에서 다중 계대 후에 안정적이다. 이는 CAVA-PV를 상업적 용도의 배치 생산을 위한 제조 공정에서 사용하기 적절하게 만들 것이다.
예상되는 백신 균주, 즉; CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1　 및 CAVA-PV소켓을 사용하여 동일한 유전적 안정성 시험이 수행되었다. 여기에서는, 바이러스를 예상되는 생산 조건(Permexcis 배지 중 10x106 vc/mL의 세포 밀도의 sPER.C6 세포, 1의 MOI로, 30℃에서, 그리고 24 hpi에서 수확) 하에서 소규모로 3 회 계대하였다(n=3). 계대 수는 5로, 이는 이론적인 상업적 롯트를 넘는 2 계대를 나타낸다. 도 11은 개시 스톡과 비교하여 모든 계대된 바이러스의 시험관내 표현형을 나타낸다. 모든 바이러스는 그들의 온도 감수성 표현형뿐 아니라, 그들의 생체내 약독화를 유지하였으며, 여기에서 PLD50은 연장된 계대 후 3 개 혈청형에서 여전히 >108였다. 도 11의 계대된 바이러스의 서열 분석은 돌연변이가 거의 일어나지 않았음을 보여주고, 위에 기술한 바와 같이, 이들 돌연변이는 생체내 및 시험관내 약독화에 영향을 미치지 않았다.
실시예 6: CAVA - PV 로 통상의 IPV 항원 프로파일의 도입
통상의 IPV와 동일한 면역 프로파일을 나타낼 수 있는 CAVA-PV 기반의 IPV를 생성하기 위해, 원래의 CAVA-PV백본 캡시드를 코딩하는 서열을 치환하는 것에 의해 몇 가지 예시적 바이러스의 캡시드를 코딩하는 서열을 CAVA-PV 게놈의 배경으로 배치하였다. 이 캡시드 교환은 의도적으로 CAVA-PV 내로 조작된 31 돌연변이 중 7 개를 제거하였다. 이 캡시드 교환은 먼저 인실리코 고안하고, 결과적으로 새로운 게놈의 화학적 합성에 의해 DNA를 생성하였다. 일단 플라스미드 DNA를 합성하였으며(Genscript에 외부 위탁) 이것을 사용하여 시험관내 전사를 통해 바이러스 RNA를 생성하고 결과적으로 형질감염을 통해 상이한 신규의 재조합 CAVA-PV를 구조하였다. 생성된 백신 균주를 CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1 및 CAVA-PV소켓으로 명명하였으며, 이들은 각각 마호니, MEF-1 및 소켓 캡시드를 포함한다. 대표적인 캡시드 아미노산 서열은 여기에 PV 유형 1 균주 마호니(SEQ ID NO: 2), PV 유형 2 균주 MEF-1(SEQ ID NO: 3), 및 PV 유형 3 균주 소켓(SEQ ID NO: 4)으로 제공된다. 도 12는 이들 상이한 CAVA-PV 백신 균주의 도식적 개요를 보여준다.
실시예 7: 양친 브루넨더스 균주와 비교한 sPER . C6 세포에서의 CAVA - PV 마호니 , CAVA-PV MEF-1 및 CAVA-PV 소켓 의 성장 동역학
생산 세포주인 현탁액 PER.C6(sPER.C6) 세포에서 CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1 및 CAVA-PV소켓의 성장 동역학을 30℃ 및 37℃에서 PV1 브루넨더스의 성장과 비교하였다. 감염 시 현탁액 PER.C6 세포는 4 mM L-글루타민으로 보충된 Permexcis 배지에서 10x106 세포/mL의 세포 밀도를 가졌다. 세포를 1의 MOI로 감염시켰으며, 감염은 CAVA-PV소켓 및 브루넨더스에서 2 회(N=2) 및 CAVA-PV마호니 및 CAVA-PVMEF -1에서 3 회(N=3) 수행하였다. 바이러스 수확물은 30℃에서 TCID50 분석을 사용하여 역가 측정하였다. sPER.C6 세포 중 복제 동역학의 선 그래프는 도 13에 나타낸다. CAVA-PV는 양친 브루넨더스 균주와 비교하여 30℃에서 야생형 성장 동역학을 보여주었고, 에러바는 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다. 반면, 37℃에서, CAVA-PV백본에서도 관찰된 바와 같이 CAVA-PV는 실질적인 복제를 보여주지 않아, 바이러스의 온도 감수성이 캡시드 영역 외부의 돌연변이 내에 위치함을 나타낸다. 브루넨더스 균주는 sPER.C6 세포 중 37℃에서 정상적으로 복제하였으며 유사한 성장 행동을 보여주었다.
30℃에서 CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1 및 CAVA-PV소켓의 평균 최대 역가는 각각 9.94, 9.91 및 9.74 Log10 TCID50/mL로, 이는 sPER.C6 세포 중 야생형 균주에서 얻어지는 역가와 유사하다(Sanders, Edo-Matas et al. 2012).
실시예 8: 통상의 IPV 균주 마호니, MEF -1 및 소켓과 비교하여 sPER . C6 세포 중 CAVA-PV 마호니 , CAVA-PV MEF-1 및 CAVA-PV 소켓 의 시험관내 항원 함량
IPV 투여량은 유럽 약전 모노그래프 0214에 기술된 것과 같이 실시하여, 시험관내 D-항원 ELISA(Beale 1961)에 의해 정량화된 D-항원 단위(DU)를 기반으로 한다. 야생형 IPV에서, 백신의 1 투여량은 불활성화된 마호니, MEF-1 및 소켓 바이러스를 각각 40, 8 및 32 DU 포함하는 것으로, 백신 수용자에서 보호성 면역 반응을 유도할 투여량에 상응한다(Grassly 2014). 활성 CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1　및 CAVA-PV소켓 바이러스의 D-항원 함량, 및 따라서 간접적으로 면역원성 효능을 D-항원 ELISA 분석에 의해 정량화하고 통상의 IPV 균주인 마호니, MEF-1 및 소켓과 비교하였다. 감염은 현탁액 중 PER.C6 세포에서 10x106 세포/mL의 세포 밀도로 1의 MOI에서 행하였다. 감염 온도는 CAVA-PV 균주에서 30℃ 및 야생형 균주에서 35℃였고, 이는 통상의 IPV 생산 온도이다.
표 3은 감염 수확물 밀리리터 당(DU/mL) 및 감염 단위 당(DU/TCID50)으로 표현된, 바이러스에서 얻어진 D-항원 값을 보여준다. 밀리리터 당 D-항원성(DU/mL)은 샘플에 존재하는 바이러스의 농도(역가 또는 TCID50/mL)에 의존하므로, 야생형 균주에 대한 CAVA-PV 균주의 감염 단위 당 특이적 항원 함량을 계산하였다. 이는 균주의 정당한 비교에 상응한다. 특이적 항원 함량은 이들의 야생형 상대에 대하여 CAVA-PV 균주에서 유사하여, CAVA-PV 및 이들의 야생형 상대 사이의 유사한 면역원 프로파일이 예상될 수 있음을 나타낸다. 바이러스는 동일한 캡시드 서열을 포함하므로 항원성은 유사할 것으로 예상되는데, 이는 얻어진 D-항원 결과에 의해 입증된다.
실시예 9: 래트에서 불활성화 및 정제된 CAVA - PV 마호니 , CAVA - PV MEF -1　 및 CAVA -PV 소켓 의 생체내 면역원성
CAVA 백신 균주: CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1　및 CAVA-PV소켓을 정제 및 불활성화하였다. 정제는 예상되는 생산 조건(Permexcis 배지 중 10x106vc/mL의 세포 밀도의 sPER.C6 세포를 포함하는 회전 병에서 2x250 mL, 1의 MOI, 30℃에서) 하의 감염으로부터 정화된 조(crude) 수확물을 사용하여 2 후속 크로마토그래피 단계에 의해 시행하였다. 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 Sartobind S 양이온 멤브레인을 사용하여 실시하고, 이후 용출된 물질을 이에 따라 크기 배제 크로마토그래피 단계를 사용하여 추가 정제하고(폴리쉬) 완충액을 교환하였다. SEC 용출액을 M199 및 글리신을 사용하여 불활성화 전에 처리하였다. 불활성화는 0.009% 포르말린(또는 3.3 mM 포름알데히드)의 첨가로 시행하였고 13 일 동안 37℃에서 배양하였다. 여과를 불활성화 제6 및 13 일에 시행하였다. 래트에서 생체내 면역원성 시험을 위해 불활성화된 벌크를 사용하였다. 4 군의 비스타(Wistar) 암컷 래트(n=10)를 각각의 불활성화된 CAVA 백신 균주의 1:1(전체 인간 용량), 1:2, 1:4 및 1:16 희석으로 면역화하였다. 전체 인간 용량은 각각 유형 1, 2 및 3의 40, 8 또는 32 D-항원 단위를 나타내고, 이는 통상의 IPV의 투여량이다. 래트를 채혈 후 21 일 동안 방치하고, Hep2C 세포 및 공격 바이러스로서 사빈 바이러스를 사용한 바이러스 중화 분석을 위해 혈청을 사용하였다. 도 14는 불활성화된 CAVA-PV마호니, CAVA-PVMEF -1　또는 CAVA-PV소켓 중 하나로 면역화 후 래트에서 일어난 중화 항체 역가를 보여준다. 3 개 백신 균주 모두 전체 백신 용량의 희석에서 용량-의존성 방식으로 높은 역가의 중화 항체의 생산을 유도하여 면역원성임을 보여주었다.
실시예 10: 추가의 CAVA - PV 균주의 생성
3 개의 독립적인 클론으로부터 유래된 31 돌연변이(실시예 1, 표 1 참조)에서 PV 균주의 패널 사이에 이들의 보존을 분석하였다. 본 발명자들은 CAVA-PV에서 관찰되는 온도 감수성 표현형을 제공하는 데 상당한 역할을 할 것으로 보이는 14 돌연변이를 확인하였다. 이들을 표 4에 나타낸다. 이 표에서, 단일 별표는 CAVA-PV에서 독특한 돌연변이를 나타내고 여기에서 이들 위치의 뉴클레오티드는 정렬에 사용된 모든 다른 PV 균주에서 보존되는데, 이들은 브루넨더스뿐 아니라 브룬힐데, 마호니, 사빈 1, 사빈 2, 사빈 3, MEF-1, 및 소켓이다. 이 표에서 이중 별표는 CAVA-PV에서 독특한 돌연변이를 나타내고 여기에서 이들 위치의 뉴클레오티드는 정렬에 사용된 다른 유형 1 PV 균주 모두에서 보존된다: 브루넨더스, 브룬힐데, 마호니 및 사빈 1. CAVA-PV에서 위치 4120에서의 뉴클레오티드 돌연변이는 사빈 1에서 공유되지만, 이 뉴클레오티드는 정렬에 사용된 다른 PV 균주 모두에서 이 위치에 보존된다.
본 발명자들은 표 4에 기술된 이들 14 돌연변이를 브루넨더스의 양친 서열로 삽입하여 온도 감수성에 대한 효과를 결정하였다. 바이러스를 실시예 1에 기술된 것과 같이 제조하였다. 간단하게는; 14 돌연변이를 갖는 브루넨더스 게놈을 포함하는 재조합 cDNA 플라스미드를 합성하였다. 생성된 플라스미드가 시험관내 전사 및 이후의 RNA 형질감염을 받도록 하였다. 복제 동역학은 4 mM L-글루타민으로 보충된 Permexcis 배지 중 mL 당 10x106 세포의 세포 밀도 및 1의 MOI로 30℃ 또는 37℃ 중 하나에서 세포를 감염시키는 것에 의해 PER.C6 세포에서 시행하였다. 샘플을 감염 후 0, 2, 8, 24 및 48 시간에 채취하고 역가 측정을 하였다.
도 15는 이들의 야생형 상대(브루넨더스 양친 균주)와 비교하여, 본 실시예에 기술된 14 돌연변이를 갖는 신규의 CAVA-PV 균주, 그리고 실시예 1의 CAVA-PV백본 균주(31 돌연변이)의 성장 곡선을 보여준다. 브루넨더스 양친 균주는 37℃ 및 30℃ 둘 다에서 야생형 균주로부터 예상된 성장 곡선을 보여주어, 각각 감염 후 10 및 24 시간 이내에 안정기 역가에 도달한다. 14 돌연변이를 도입한 후, 신규의 CAVA-PV 균주는 양친 균주와 비교하여 2 배 넘는 양의(즉, 31) 돌연변이를 갖는 실시예 1의 CAVA-PV백본 균주와 유사한 성장 표현형을 나타낸다. 37℃에서 복제는 관찰되지 않은 한편, 30℃에서는 복제가 야생형과 비슷하였다.
이들 결과는 생리적 온도에서 적응도의 손실이 이미 이들 14 돌연변이에 의해 유도될 수 있음을 보여준다. 더욱이, 위에 기술된 다양한 구현예에 추가하여, 본 실시예는 본 발명에 따른 CAVA-PV 균주의 또 다른 구현예, 즉 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 폴리오바이러스 균주를 제공한다.
실시예 11: 상이한 혈청형으로부터의 상이한 양친 균주로부터 CAVA - PV 균주의 생성
앞서의 실시예는 모두 다양한 CAVA-PV 균주의 생성을 위한 개시 또는 양친 균주로서 브루넨더스 균주(부분적으로 약독화된 유형 1 PV 균주)를 기술하였다. 본 실시예에서는 두 개의 매우 상이한 양친 균주, 즉 유형 2 신경발병성 야생형 MEF-1 균주 및 유형 3 신경약독화 사빈 3 균주를 배경(양친) 균주로서 사용하였다. MEF-1은 일상적으로 통상의 IPV 제제를 위한 유형 2 면역원으로서 사용되는 한편, 사빈 3은 OPV 제제의 구성 요소이다.
브루넨더스 균주와 관련하여 표 4에 기술된 14 돌연변이 중 13 개를 상응하는 뉴클레오티드 위치에 MEF-1 균주(SEQ ID NO: 5; MEF-1 균주는 이미 A를 위치 3481에 포함하고, 이 위치는 돌연변이되지 않았으므로 14 돌연변이 대신 13)로 삽입하여 온도 감수성에 대한 효과를 결정하였다. 사빈 3 게놈 서열(SEQ ID NO: 8, 사빈 3 균주는 이미 G 및 A를 각각 위치 163 및 3473에 포함하고, 이들 뉴클레오티드는 돌연변이되지 않았으므로 14 돌연변이 대신 12, 균주에 대한 CAVA 돌연변이의 구체적인 기술에 대해서는 표 4 참조)을 사용하여 동일하게 시행하였다.
MEF-1 및 사빈 3 바이러스를 실시예 1에 기술된 것과 같이 제조하였다. 간단하게는; 13 및 12 돌연변이를 갖는 MEF-1 및 사빈 3 게놈을 포함하는 재조합 cDNA 플라스미드를 먼저 합성하였다. 생성된 플라스미드가 시험관내 전사 및 이후의 RNA 형질감염을 받도록 하였다. 복제 동역학은 4 mM L-글루타민으로 보충된 Permexcis 배지 중 mL 당 10x106 세포의 세포 밀도 및 1의 MOI로 30℃ 또는 37℃ 중 하나에서 세포를 감염시키는 것에 의해 PER.C6 세포에서 시행하였다. 샘플을 감염 후 0, 2, 8, 24 및 48 시간에 채취하고 역가 측정을 하였다.
도 16은 야생형 MEF-1 균주와 비교하여, 본 실시예에 기술된 13 돌연변이를 갖는 MEF-1 기반의 신규 균주, 그리고 실시예 1의 CAVA-PV백본 균주(즉, 31 돌연변이를 갖는 브루넨더스 균주)의 성장 곡선을 보여준다. MEF-1 양친 균주는 37℃ 및 30℃ 둘 다에서 야생형 균주로부터 예상된 성장 곡선을 보여주어, 각각 감염 후 10 및 24 시간 이내에 안정기 역가에 도달한다. 13 돌연변이를 도입한 후, 신규의 MEF-1 기반의 균주는 브루넨더스 배경 균주를 기반으로 하고 양친 균주와 비교하여 2 배 넘는 양의 돌연변이를 갖는 실시예 1의 CAVA-PV백본 균주와 유사한 성장 표현형을 전개하였다. 37℃에서 복제는 관찰되지 않은 한편, 30℃에서는 복제가 야생형과 비슷하였다.
도 17은 약독화된 사빈 3 균주와 비교하여, 실시예 1의 CAVA-PV백본(즉, 31 돌연변이를 갖는 브루넨더스 균주)와 비교하여, 본 실시예에 기술된 12 돌연변이를 갖는 사빈 3 기반의 신규 균주의 성장 곡선을 보여준다. 사빈 3 OPV 균주는 37℃ 및 30℃ 둘 다에서 야생형 PV 성장과 비슷한 성장 곡선을 보여주어, 각각 감염 후 10 및 24 시간 이내에 안정기 역가에 도달한다. 12 돌연변이를 도입한 후, 신규의 사빈 3 기반의 균주는 브루넨더스 배경 균주를 기반으로 한 실시예 1의 CAVA-PV백본 균주와 유사한 성장 표현형을 나타내었다. 37℃에서 복제는 관찰되지 않은 한편, 30℃에서는 복제가 야생형과 비슷하였다.
데이터에서는 각각 13 및 12 돌연변이를 갖는 신규의 MEF-1 및 사빈 3 균주가 또한 CAVA-PV 표현형을 갖고, 따라서 본 발명에 따른 CAVA-PV 균주의 또 다른 구현예, 즉 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 실질적으로 증식시킬 수 없는 재조합 폴리오바이러스 균주임을 입증한다. 따라서, 총 14 돌연변이(이중 1 및 2는 신규 MEF-1 및 사빈 3 양친 균주에 이미 존재하였음)가 CAVA-PV 성장 표현형을 야생형 폴리오바이러스 균주로 전달하는 데 충분하다. 본 실시예는 추가의 CAVA-PV 균주를 생성하기 위한 대안의 방식을 여전히 보여주고, 이러한 균주는 상이한 폴리오바이러스 양친 균주로부터 제조될 수 있는 것으로 보인다. 특히, 이들 데이터는 양친 균주가 유형 1 PV 균주이거나 야생형 또는 부분적으로 약독화된 균주일 필요가 없음을 보여주는데, 본 실시예에서 양친 균주는 유형 2, 신경발병성 및 야생형 PV 균주일 뿐 아니라 유형 3 약독화 균주이기 때문이다. 본 실시예의 신규 균주는 MEF-1 야생형 캡시드 서열을 갖고, 따라서 유형 2 PV에 대한 안전하고 효과적인 IPV를 생성하기 위해 직접 사용될 수 있다. 이 캡시드를 마호니 또는 소켓 캡시드와 같은 다른 야생형 캡시드로 교환하는 것도 출발점으로서 사용될 수 있다. 당업자는 또한 본 실시예가 표 4의 14 돌연변이(또는 이의 서브셋)를 마호니, 소켓, 사빈 1 및 사빈 2 균주의 게놈에서 상응하는 위치로 도입하는 것이 IPV 생산을 위한 안전하고 효과적인 백신 균주로서 사용될 수 있는 추가의 CAVA-PV 균주를 생성할 것임을 타당하게 만드는 것을 인정할 것이다.
실시예 12: EM 에 의한 CAVA - PV 감염의 정량화
37℃에서 CAVA-PV 균주의 역가 측정(TCID50)에 의한 바이러스 감염의 정량화는 세포변성 효과(cytopathic effects(CPE))의 관찰을 야기하지 못하고, 따라서 역가 측정은 30℃에서 시행되어야 한다. 이는 37℃에서 감염 중 감염 단위의 증가를 나타내지 않는 CAVA-PV 균주의 복제 동역학 곡선에 의해 입증된다(도 2 내지 11, 13, 15 내지 17). 이는 바이러스가 이 온도에서 복제할 수 없음을 나타낸다. 그러나, 37℃에서의 복제 차단을 더욱 이해하기 위해, 본 발명자들은 PV 감염을 특성화하는 대안의 방법으로서 전자현미경 검사(EM)를 시행하였다. 도 18은 마호니, CAVA-PV마호니 또는 PBS(모의 감염)를 사용하여 30 및 37℃에서 MOI 1로 10x106 세포/mL의 세포 밀도로 sPER.C6 세포의 감염 후 EM의 결과를 보여준다.
EM 샘플은 0.1 M 카코딜레이트 완충액(pH 7.4) 중 1.5 % 글루타르알데히드에서 고정시키고 1% 오스뮴 테트록사이드로 염색하였다. 다음에 샘플을 0.14 M 카코딜레이트 완충액에서 세척하고 3% 한천으로 펠릿화한 후, 펠릿을 에탄올 시리즈로 서서히 탈수하였다. 다음에 샘플을 1:1 혼합물의 프로필렌 옥사이드 및 에폭시 LX-112 수지(Ladd Research)로 1 시간 동안 및 100% 에폭시 LX-112에서 추가로 1 시간 동안 침투시킨 후, 샘플을 48 시간 동안 60℃에서 중합시켰다. 50 nm 두께의 세포 절편을 절단하고, 카본-코팅의 포름바 그리드로 위치시켜 7% 아세트산우라닐 및 시트르산납으로 대비염색하였다. 120 kV로 작동하는 Tecnai 12 BioTwin 전송 전자현미경(FEI 컴퍼니)를 이미지화에 사용하였다.
도 18에서 EM 데이터는 각각의 감염으로부터 대표적 세포를 보여준다. 30℃에서 CAVA-PV마호니로 감염된 세포는 야생형 마호니 균주로 감염된 것과 유사하여, 대부분의 세포는 이미 사멸되고 용해 또는 자멸되었다. 자멸 세포는 크기가 줄어들고 색상이 매우 어두웠다. 이들 자멸 세포는 ER 멤브레인의 재배열을 포함할 뿐 아니라, 바이러스는 소낭 형성이 유도되었다. 폴리오바이러스 농도가 세포에서 높을 때, 고도로 조직화된 바이러스 격자가 형성될 수 있는데, 이는 마호니 및 CAVA-PV마 호니(30℃에서) 샘플에서 가시적이었다.
그러나, 37℃에서 CAVA-PV마호니 감염 세포는 PV 감염과 관련된 이들 특징의 어느 것도 보이지 않았다. 사실, 이들 세포는 샘플에서 세포의 어느 것도 감염의 어떤 징후도 없이 건강한 것으로 보였다. 37℃에서 배양된 CAVA-PV마호니 감염 세포는 PBS 모의 감염 세포와 유사하였다. 이 37℃ 배양 샘플의 CAVA-PV마호니 역가는 4.32 TCID50/mL로 측정되어, 이는 이론적 투입(알려진 역가의 투입 바이러스의 첨가된 용적의 계산된 MOI로서 7.0 TCID50/mL)보다 적은 것이지만, 이는 CAVA-PV마호니 바이러스가 임의의 감염 징후 유도 없이 실제로 감염에 첨가된 것을 확인한다.
실시예 13: qPCR 에 의한 CAVA - PV 감염의 정량화
EM에 사용된 샘플(실시예 12)에 대하여 정량적 PCR을 시행하여 감염 중 바이러스 RNA의 수준을 결정하였다. 바이러스 RNA를 감염 수확물로부터 QIAamp 바이러스 RNA 분리 키트를 사용하여 분리한 후, 3D 폴리머라제 유전자에 결합하는 프라이머를 사용한 RT-qPCR을 위해 PowerSYBR Green RNA-to-Ct 1 스텝 키트를 사용하였다. 도 19는 vRNA 수준을 나타내는데, 감염 수확물의 역가 측정에 의해 관찰되는 바와 같이, 바이러스 RNA 수준은 CAVA-1 마호니 감염이 37℃로 유지될 때 감소하지만, 감염 온도가 30℃일 때는 그렇지 않아, vRNA의 증가가 관찰된다. 따라서, RNA 복제에 결함이 있다는 결론을 내릴 수 있고, 이는 37℃에서 완전히 차단되는 것으로 보인다. 따라서, CAVA-PV 복제의 차단은 RNA 복제 수준에서, 또는 감염 주기의 더 이른 시기에 일어난다.
실시예 14: CAVA 표현형을 나타내지 못하는 PV 의 생성.
어느 돌연변이가 CAVA-표현형에 연루되는지 추가로 이해하기 위해, 신규의 중간 바이러스를 양친 브루넨더스 균주(SED ID NO: 1, 이들 두 영역에서의 CAVA 돌연변이에 대해서는 표 4 참조)의 배경에서 5'UTR의 7 CAVA 돌연변이 또는 비-구조적 단백질의 17 돌연변이 중 하나로 구축하였다. 실시예 6의 CAVA-PV 균주는 이미 캡시드에서 CAVA 돌연변이가 CAVA 표현형에 대한 영향 없이 제거될 수 있음을 입증하였고, 따라서 5'UTR 및 비-구조적 영역에서의 돌연변이만을 여기에서 조사하였다. 양친 브루넨더스 균주, 실시예 1의 CAVA-PV백본 및 실시예 6의 CAVA-PV마호니와 비교하여, 30 및 37℃에서 중간 바이러스의 복제 동역학에 대하여 시험하였다.
중간 바이러스는 실시예 1에서 기술된 것과 같이 제조하였다. 간단하게는; 5'UTR에서 7 CAVA 돌연변이 또는 비-구조적 단백질에서 17 CAVA 돌연변이 중 하나를 갖는 브루넨더스 게놈을 포함하는 재조합 cDNA 플라스미드를 먼저 합성하였다. 생성된 플라스미드가 시험관내 전사 및 이후의 RNA 형질감염을 받도록 하였다. 복제 동역학은 4 mM L-글루타민으로 보충된 Permexcis 배지 중 mL 당 10x106 세포의 세포 밀도 및 1의 MOI로 30℃ 또는 37℃ 중 하나에서 세포를 감염시키는 것에 의해 PER.C6 세포에서 시행하였다. 샘플을 감염 후 0, 2, 8, 24 및 48 시간에 채취하고 역가 측정을 하였다.
도 20은 야생형 브루넨더스 균주와 비교하여, 본 실시예에 기술된 돌연변이를 갖는 브루넨더스 양친 균주 기반의 신규 균주, 그리고 실시예 1의 CAVA-PV백본 균주(즉, 31 돌연변이를 갖는 브루넨더스 균주)의 성장 곡선을 보여준다. 중간 균주는 37℃에서 손상된 성장 곡선을 보여주는데, 여기에서 복제는 브루넨더스 양친 균주와 비교하여 제한되지만, CAVA-PV백본과 비교하여 파괴되지는 않았다. 여기에서 중간 바이러스는 브루넨더스 양친 균주와 비교하여 더 느린 속도로 성장할 뿐 아니라 최대 역가가 저하된다. 30℃에서, 중간 바이러스는 브루넨더스 양친 균주뿐 아니라, 각각 실시예 1 및 6의 CAVA-PV백본 및 CAVA-PV마호니 균주와 비교하여 동일한 성장 곡선을 보인다. 안정기 역가는 감염 후 24 시간 이내에 도달하였다. 5'UTR 또는 비-구조적 돌연변이를 도입한 후, 신규 균주는 CAVA-PV백본 및 CAVA-PV마호니 균주와 동일한 표현형을 갖지 않았고, 따라서 CAVA 표현형은 두 영역(5'UTR 및 비-구조적 단백질) 모두로부터의 돌연변이가 하나의 양친 게놈으로 결합될 때에만 유도될 수 있 다는 결론을 내릴 수 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> Cold-Adapted-Viral-Attenuation (CAVA) and Novel Attenuated Poliovirus Strains <130> 0235 WO 00 ORD <150> US 62/013,379 <151> 2014-06-17 <150> EP14176071.0 <151> 2014-07-08 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7444 <212> RNA <213> Poliovirus <400> 1 uuaaaacagc ucugggguug uucccacccc agaggcccac guggcggcca guacaccggu 60 accacgguac ccuuguacgc cuguuuuaua cuccccuccc cguaaacuag aagcacgaaa 120 cacaaguuca auagaagggg guacagacca guaccaccac gaacaagcac uucuguuccc 180 ccggugaggu cacauagacu guccccacgg ucaaaaguga cugauccguu auccgcucac 240 guacuucgga aagccuagua ccaccuugga aucuacgaug cguugcgcuc agcacucgac 300 cccggagugu agcuuaggcu gaugagucug gacguucccc acuggugaca gugguccagg 360 cugcguuggc ggccuaccug ugguccaaaa ccacaggacg cuaguaguga acaaggugug 420 aagagcccac ugagcuaccu gagaauccuc cggccccuga augcggcuaa ucccaaccac 480 ggagcaggua aucgcaaacc agcggucagc cugucguaac gcguaagucu guggcggaac 540 cgacuacuuu ggguguccgu guuuccuuuu auuuuuaugg uggcugcuua 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cuaaaaccaa aguggagcag ggaaaaucca gauugauuga agccuccagc uuaaaugauu 6540 caguagcuau gagaauggca uuuggaaauc ucuaugcagc auuccauaaa aacccaggag 6600 uuauuacugg cagugcaguu gguugugacc cagaucuguu cuggagcaag auuccaguac 6660 ugauggaaga aaagcuuuuc gccuuugacu auacaggcua ugaugcauca cucagcccag 6720 cuugguuuga ggcacucaaa augguauugg agaaaauugg auucggggac agaguggacu 6780 acauugacua ccucaaucau ucacaccacu uguacaagaa caaaacauac ugugucaagg 6840 gcggcaugcc aucuggcugc ucuggcaccu caaucuucaa cucgaugauc aacaaucuga 6900 ucauuaggac gcuuuugcua aaaaccuaca agggcauaga cuuagaccac cuaaaaauga 6960 uugccuaugg ugaugaugua aucgcuuccu acccccauga gguugacgcu agucuccuag 7020 cccaaucagg aaaagacuau ggacuaacua ugacuccagc agauaaaucu gccacuuuug 7080 aaacagucac augggagaau guaacauuuu ugaaaagauu cuucagagca gacgagaagu 7140 auccauuucu uauucaucca guaaugccaa ugaaggaaau ucaugaauca aucagaugga 7200 ccaaggaucc uagaaacaca caggaucacg uacgcucuuu gugcuuauug gcuuggcaca 7260 auggagaaga agaauacaac aaguuccuag cuaaaauuag gagcgugcca auuggaagag 7320 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guugugaauu caauggguug 1740 cgcaacauca cuguacccag aacucaaggg uugccagucu uaaacacucc aggaagcaac 1800 caguacuuaa cagcagacaa cuaucaaucc ccaugugcga uacccgaguu ugauguaaca 1860 ccacccauag acaucccggg ggaagugcgc aacaugaugg aauuggcaga gauagacacc 1920 augauaccuc ucaaucugac gaaccagcgc aagaacacca uggauaugua cagagucgaa 1980 cugaaugaug cggcucacuc ugacacacca auauuguguc ucucacuguc uccagcauca 2040 gauccuaggc uagcacacac uaugcuaggu gaaauacuga acuacuacac acacugggca 2100 gggucauuga aguucacauu ucucuucugc ggcucaauga uggccacugg uaaauugcua 2160 guguccuaug caccuccugg ugcggaagcc ccuaaaagcc gcaaagaagc gaugcucggc 2220 acccacguga ucugggacau cggauuacag ucaucaugca cuaugguggu accuuggauu 2280 agcaacacca cauacagaca aaccaucaac gauagcuuca cagaaggagg guacaucagu 2340 auguuuuacc aaacuagagu uguugugcca uuguccaccc cuagaaagau ggacauauug 2400 ggcuuugugu cagccugcaa ugacuucagu gugcgccugu ugcgugacac gacgcacaua 2460 agccaagagg cuaugccaca aggauugggu gauuuaauug aagggguugu ugagggaguc 2520 acgagaaaug ccuugacacc acugacaccu gccaacaacu ugccugauac acaaucuagc 2580 ggcccagccc acucuaagga aacaccagcg cuaacagccg uagagacagg ggccaccaac 2640 ccauuggugc cuucagacac gguacaaacu cgucacguca uccaaaagcg gacgcggucg 2700 gagucuacgg uugagucuuu cuucgcaaga ggagcuugug uggccauuau ugaaguggau 2760 aaugaugcuc caacaaagcg ugccaguaaa uuauuuucag ucuggaagau aacuuacaaa 2820 gacaccguuc aguuaagacg uaaguuggag uucuuuacau auucaagguu ugacauggag 2880 uucaccuuug ugguuacauc caauuauacc gaugcaaaca augggcacgc acuaaaucaa 2940 guuuaccaga uaauguacau accaccuggg gcaccgaucc cuggcaagug gaaugauuac 3000 acauggcaaa cgucaucuaa cccaucagug uuuuacacuu acggggcacc uccagcuaga 3060 auaucagugc ccuacguggg cauugccaau gcauauucuc auuuuuacga uggguuugcc 3120 aaaguaccac uagcaggcca agccucaaca gagggugacu cgcuguaugg agcggcuuca 3180 uugaaugacu ucggaucacu ggcuguucga guggugaaug accacaaccc uacgaaacuc 3240 acuucaaaaa ucagagugua caugaaacca aagcacguca gaguguggug uccgcgaccc 3300 ccucgagcag ucccauacua cggaccaggg guugacuaca aggauggacu agccccacug 3360 ccagggaaag gcuugacaac cuaugguuuu ggccaccaaa auaaggcagu guacacggca 3420 gguuacaaaa uuugcaauua ccaccucgcc acccaggaag acuuacaaaa ugcgguaaac 3480 auuaugugga uuagagaccu uuuaguagug gaauccaaag cccaaggcau agacacaauu 3540 gcuagaugua acugccacac uggaguguac uacugugaau ccaggaggaa guacuacccg 3600 gucucuuuua cuggccccac cuuucaguac auggaagcaa augaguacua uccagcccga 3660 uaccaauccc acauguuaau uggccauggu uuugcaucuc caggggacug uggugggauu 3720 cucaggugcc aacauggagu aauuggaauc auuacagcug gaggagaagg ccuagucgcu 3780 uucgcggaca ucagagaucu guacgcauac gaggaggagg cuauggagca gggagucucc 3840 aacuauauug agucccuugg ggcugcauuu gggaguggau ucacucagca aauaggaaac 3900 aaaauuucag aacucacuag cauggucacc agcacuauaa cugagaaacu acuaaagaau 3960 cucauuaaaa uaauuucauc ccuuguuauc aucaccagaa acuaugaaga cacgaccaca 4020 gugcuggcua cccuugcucu ccucgguugu gaugcguccc cauggcaaug gcuaaagaag 4080 aaagccugug acaucuugga aauccccuac aucaugcgac agggcgauag cugguugaag 4140 aaguuuacag aggcaugcaa ugcagccaag ggauuggaau gggugucuaa uaaaauaucc 4200 aaauuuauug acuggcucaa agagaagauc auuccacagg cuagagacaa gcuagaguuu 4260 guuaccaaac ugaagcaacu agaaauguug gagaaccaaa uugcaaccau ucaucaaucg 4320 ugcccaaguc aggagcauca agaaauccug uucaauaacg ugagaugguu auccauacag 4380 ucaaagagau uugccccgcu cuaugcgguu gaggcuaaga gaauacaaaa guuagagcac 4440 acgauuaaca acuacguaca guucaagagc aaacaccgua uugaaccagu auguuuguug 4500 gugcacggua gcccaggcac gggcaaguca guugccacca auuuaauugc cagagcaaua 4560 gcagagaagg agaacaccuc cacauacuca cuaccaccag aucccuccca uuucgauggg 4620 uacaagcaac aagguguggu gaucauggau gauuugaauc agaacccaga cggagcagac 4680 augaagcugu uuugucagau ggucuccacu guagaauuca uaccaccaau ggcuucgcua 4740 gaagaaaagg guauuuuguu cacaucuaau uacguuuugg ccucaaccaa uuccagucgc 4800 aucaccccac caacuguugc gcacagcgau gcccuagcca ggcgcuuugc auuugacaug 4860 gacauacaaa ucaugagcga guauucuaga gauggaaaau ugaacauggc gauggcaacu 4920 gaaaugugua agaacuguca ucaaccagca aacuucaaga gauguugccc auuggugugu 4980 ggcaaagcca uccagcugau ggacaaaucu uccagaguca gauauaguau agaucagauu 5040 acuaccauga uuauuaauga gaggaacaga agaucaagua ucgguaauug cauggaggca 5100 cuuuuccaag guccucuuca auacaaagac cugaaaauag acauuaagac cacaccuccu 5160 ccugagugca ucaaugauuu gcuccaagca guugauucuc aagagguaag agacuacugu 5220 gagaagaagg guuggauagu agacaucacu agucaggugc aaaccgaaag aaacaucaau 5280 agagcaauga cuauucuuca ggcggucacc acauuugccg caguugcugg agugguguau 5340 gugauguaca aacucuuugc agggcaucaa ggagcguaua cagggcuucc caauaagaga 5400 cccaaugucc ccaccaucag gacugccaag guucagggcc caggauuuga cuacgcagug 5460 gcaauggcca aaagaaacau ucuuacggca acuaccauua agggagaguu cacaaugcuc 5520 ggagugcaug auaauguggc cauucuacca acccacgcau caccggguga aacaauaguc 5580 auugauggca aggaaguaga gguacuggau gcuaaagccc uggaggacca ggccgggacc 5640 aaccuagaaa ucaccaucgu cacucuuaag agaaaugaga aguucaggga caucagacca 5700 cacaucccca cucaaaucac ugagacaaau gauggaguuu uaauugugaa cacuaguaag 5760 uaccccaaca uguauguucc ugucggugcu gugacugaac agggguaucu caaucucggu 5820 ggacgccaaa cugcucguac uuuaauguac aacuuuccaa cgagagcagg ucaauguggu 5880 ggaguuauca ccugcacugg caaggucauc gggaugcaug 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guacuccggu 60 auugcgguac ccuuguacgc cuguuuuaua cucccuuccc guaacuuaga cgcacaaaac 120 caaguucaau agaagggggu acaaaccagu accaccacga acaagcacuu cuguuucccc 180 ggugaugucg uauagacugc uugcgugguu gaaagcgacg gauccguuau ccgcuuaugu 240 acuucgagaa gcccaguacc accucggaau cuucgaugcg uugcgcucag cacucaaccc 300 cagaguguag cuuaggcuga ugagucugga caucccucac cggugacggu gguccaggcu 360 gcguuggcgg ccuaccuaug gcuaacgcca ugggacgcua guugugaaca aggugugaag 420 agccuauuga gcuacauaag aauccuccgg ccccugaaug cggcuaaucc caaccucgga 480 gcaggugguc acaaaccagu gauuggccug ucguaacgcg caaguccgug gcggaaccga 540 cuacuuuggg uguccguguu uccuuuuauu uuauuguggc ugcuuauggu gacaaucaca 600 gauuguuauc auaaagcgaa uuggauuggc cauccgguga aagugagacu cauuaucuau 660 cuguuugcug gauccgcucc auugagugug uuuacucuaa guacaauuuc aacaguuauu 720 ucaaucagac aauuguauca uaaugggugc ucagguuuca ucacagaaag ugggcgcaca 780 ugaaaacuca aauagagcgu auggugguuc uaccauuaau uacaccacca uuaauuauua 840 uagagauuca gcuaguaacg cggcuucgaa acaggacuuc ucucaagacc cuuccaaguu 900 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accaacacac uccaaggaaa uuccggcacu caccgcagug gaaacugggg ccacaaaucc 2640 acuagucccu ucugauacag ugcaaaccag acauguugua caacauaggu caaggucaga 2700 gucuagcaua gagucuuucu ucgcgcgggg ugcaugcgug accauuauga ccguggauaa 2760 cccagcuucc accacgaaua aggauaagcu auuugcagug uggaagauca cuuauaaaga 2820 uacuguccag uuacggagga aauuggaguu cuucaccuau ucuagauuug auauggaacu 2880 uaccuuugug guuacugcaa auuucacuga gacuaacaau gggcaugccu uaaaucaagu 2940 guaccaaauu auguacguac caccaggcgc uccagugccc gagaaauggg acgacuacac 3000 auggcaaacc ucaucaaauc caucaaucuu uuacaccuac ggaacagcuc cagcccggau 3060 cucgguaccg uauguuggua uuucgaacgc cuauucacac uuuuacgacg guuuuuccaa 3120 aguaccacug aaggaccagu cggcagcacu aggugacucc cuuuauggug cagcaucucu 3180 aaaugacuuc gguauuuugg cuguuagagu agucaaugau cacaacccga ccaaggucac 3240 cuccaaaauc agaguguauc uaaaacccaa acacaucaga gucuggugcc cgcguccacc 3300 gagggcagug gcguacuacg gcccuggagu ggauuacaag gaugguacgc uuacaccccu 3360 cuccaccaag gaucugacca cauauggauu cggacaccaa aacaaagcgg uguacacugc 3420 agguuacaaa auuugcaacu accacuuggc cacucaggau gauuugcaaa acgcagugaa 3480 cgucaugugg aguagagacc ucuuagucac agaaucaaga gcccagggca ccgauucaau 3540 cgcaaggugc aauugcaacg caggggugua cuacugcgag ucuagaagga aauacuaccc 3600 aguauccuuc guuggcccaa cguuccagua cauggaggcu aauaacuauu acccagcuag 3660 guaccagucc cauaugcuca uuggccaugg auucgcaucu ccaggggauu gugguggcau 3720 acucagaugu caccacgggg ugauagggau cauuacugcu gguggcgaag gguugguugc 3780 auuuucagac auuagagacu uguaugccua cgaagaagaa gccauggaac aaggcaucac 3840 caauuacaua gagucacuug gggccgcauu uggaagugga uuuacucagc agauuagcga 3900 caaaauaaca gaguugacca auauggugac caguaccauc acugaaaagc uacuuaagaa 3960 cuugaucaag aucauauccu cacuaguuau uauaacuagg aacuaugaag acaccacaac 4020 agugcucgcu acccuggccc uucuugggug ugaugcuuca ccauggcagu ggcuuagaaa 4080 gaaagcaugc gauguucugg agauaccuua ugucaucaag caaggugaca guugguugaa 4140 gaaguuuacu gaagcaugca acgcagcuaa gggacuggag ugggugucaa acaaaaucuc 4200 aaaauucauu gauuggcuca aggagaaaau uaucccacaa gcuagagaua aguuggaauu 4260 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guacaaacca guaccaccac gaacaagcac uucuguuucc 180 ccggugaugu uguauagacu gcucgcgcgg uuaaaagcga cggauccguu auccgcucau 240 guacuucgag aagccuagua uuaccucggg aucuucgacg cguugcgcuc agcacucaac 300 cccagagugu agcuuagguc gaugagucug gacauuccuc accggcgacg gugguccagg 360 cugcguuggc ggccuaccua uggcuaacgc cauaggacgc uaguugugaa caagguguga 420 agagccuauu gagcuacaug agaguccucc ggccccugaa ugcggcuaau cccaaccucg 480 gagcaggcga ucacaagcca gugauuggcc ugucguaaug cguaaguccg agacggaacc 540 gacuacuuug gguguccgug uuuccuuuua uuuuuaucau ggcugccuau ggugacaauc 600 agugauuguu gucauagagc gaauuggauu ggccauccgg ugaaaacaaa gucaauuacu 660 uucucacuug uuggaccuac acccgauacg cuuuaccccc aagcuaauua aaauuauuag 720 aaguuaggac uacgguguca caaugggagc ucaaguuucg ucccaaaaag uaggcgcuca 780 ugaaaauucc aaccgggccu ccgguggcuc caccaucaac uacaccacaa uuaauuauua 840 uaaagauucu gcuaguaaug cggcgucuaa gcaagacuac ucacaggacc cuucaaaguu 900 caccgagccg cuaaaggaug ugcucauaaa gacagcucca gcacucaauu caccaaaugu 960 ggaggcgugc ggguauagcg auagaguguu acaacucacu uuaggcaauu ccaccauuac 1020 uacacaggag gcagccaacu caguaguagc cuacggacgg uggccugaau ucauuagaga 1080 ugaugaagca aacccagugg aucaaccaac ugagccagac guugccacau gcagauuuua 1140 cacucuagac acuguaaugu ggggcaagga guccaaaggu ugguggugga aguugccuga 1200 ugcacugaga gacauggguc uguuuggaca aaacauguau uaccacuacc uaggaagauc 1260 uggguacacu gugcacgugc agugcaacgc uucuaaauuu caucaaggcg cacuaggggu 1320 guuugcgauu ccugaruauu gucuggcagg cgacagugac aagcaaaggu acacuaguua 1380 ugcaaaugca aauccaggcg aaaagggagg gaaauuuuac ucccaguuca acaaggauaa 1440 cgcaguaacg uccccaaaaa gagaguuuug cccaguggau uaucuccugg gaugcggggu 1500 guugcuggga aaugccuuug uauacccaca ccagaucauu aaucugagga ccaauaacag 1560 cgcaaccauu guccuaccau acgugaaugc uuuagcuauu gacucaaugg uuaaacacaa 1620 caacuggggc auugccauuu ugcccuuauc accguuggac uuugcucagg auucaucagu 1680 ugaaauuccg auuaccguga caauugcccc aauguguagu gaguucaaug gucuccgcaa 1740 cgugacugca cccaaauuuc aaggrcuacc agugcugaau acaccuggaa guaaccagua 1800 ccuaacauca gacaaccacc aaucaccaug cgcaaucccu gaauuugaug ucacuccgcc 1860 uaucgauauc ccaggygagg uuaaaaacau gauggagcuc gccgagauag acaccaugau 1920 cccccucaau uuggagaaua cuaagagaaa uacaauggac auguacaggg ucacucugag 1980 cgacagugcc gaucuaucgc aaccaauucu gugcuugucg cuaucuccgg caucugaucc 2040 gcgcuugucg cacaccaugc uuggggaagu gcugaacuau uauacucauu gggcuggauc 2100 uuugaaguuc acuuuucugu ucuguggcuc aaugauggcu acagggaaaa ucuuaguggc 2160 cuaugcacca ccgggcgcac aaccccccac cagucguaag gaggccaugu ugggcacaca 2220 ucucauuugg gaucuugguc ugcaaucauc cugcaccaug gugguaccau ggauuagcaa 2280 cgugacauac agacagacua cacaagauag cuucacugaa ggcggauaua uuagcauguu 2340 uuaccaaaca aggauuguag ugccacuauc cacccccaag aguaugaaca ugcugggguu 2400 ugugucagcc uguaacgacu uuagugugcg auugcuacga gacaccacuc acauuucaca 2460 aucagcgcuu ccacagggca uugaagaauu gauuuccgaa gucgcgcaag gcgcccuaac 2520 uuuaucacuc cccaagcagc aggacagcuu accugacacc aaggccagug gcccggcgca 2580 cuccaaggag gugccugcac ucacugcagu cgagacuggg gcuaccaauc cucugguacc 2640 auccgacaca guucaaacgc gccauguaau ccaacggcgu agcaggucag aguccacgau 2700 agaaucauuc uucgcacgcg gggcgugcgu ugcuaucauu gagguagaca acgaacaacc 2760 aaccacccgg gcacagaaac uuuuugccac guggcgcauu acguacaaag auacaguaca 2820 auuacgccgc aaauuggagu ucuuuacaua cucccguuuu gacauggaau ucaccuuugu 2880 aguaacugcu aacuucacca acgccaauaa cgggcaugcc cugaaccaag uguaccagau 2940 aauguacauc cccccaggag caccuacacc aaagucaugg gacgacuaca ccuggcaaac 3000 aucuuccaac ccgucuauau ucuacaccua uggggcugca ccggcgcgaa uuucaguacc 3060 auacgugggg uuggccaaug cuuacucaca cuuuuacgac ggcuuugcca aggugccacu 3120 gaaaacagac gccaacgacc aaauugguga uuccuuguac agugcuauga caguggacga 3180 cuuuggugug uuggcaauuc gaguugucaa ugaucacaac cccacuaarg uaaccuccaa 3240 aauccgcauu uacaugaaac ccaaacacgu gcgugucugg ugcccuagac caccacgcgc 3300 gguaccuuuu uauggaccag ggguggacua caaagacaac uugaaccccu ugucugygaa 3360 agguuugacc accuauggcu uuggacauca gaauaaggcu guuuauaccg cuggauacaa 3420 gauuuguaac uaucaccuug cuacccaaga ggaucuacaa aaugcugugu guaucaugug 3480 gaacagagau cuugugguug uugauucaaa agcucaaggc accgacucga uagcuagaug 3540 uaacugcaac gcaggggugu auuacuguga guccaggaga aaauacuacc cugugucauu 3600 cauaggaccc accuuucagu uuauggaggc caaugacuau uacccugcaa gguaucaguc 3660 ccacauguua auugggcacg guuuugccuc accaggcgau uguggcggca uucuuagaug 3720 ccagcauggc guuauuggga uuauaacagc ugguggugaa ggcuuggucg cauuuucaga 3780 cauaagagau cuuuaugcau augaagagga agcuauggag cagggaauau ccaauuacau 3840 agagucgcuc ggagcagcgu ucggcagcgg guuuacucag caaauagggg acaagaucuc 3900 agagcugacu agcaugguga ccagcacaau uacggagaaa uuacuaaaga accuaaucaa 3960 gaucaucuca ucacugguga ucauaaccag aaacuacgag gacaccacca cagugcuugc 4020 caccuuagcu cuccuuggau gugacaucuc gccauggcag ugguuaaaga agaaggcaug 4080 ugauauucug gaaauaccau augucauuaa acagggugau agcugguuga agaaguuuac 4140 ugaggcaugc aacgccgcca aggggcuaga gugggugucu aauaaaauuu caaaguuuau 4200 ugauugguua aaggagaaaa uuauuccaca ggcgagagau aaacuugagu uugucaccaa 4260 acuuaaacaa uuggaaaugc ucgaaaauca gauuuccacg auacaucaau cuugccccag 4320 ccaggaacac caggaaguuc uguucaacaa cgugcggugg uugucaauuc agucuaagaa 4380 guuugcgcca cuuuaugcgc uugaggccaa gagaauacaa aaguuagaac acaccaucaa 4440 uaauuacaua caguucaaga gcaaacaccg uauugaacca guguguuugu uggugcacgg 4500 gagcccaggc accggaaaau caguugcgac caaucuaauu gcuagagcca uagcagagaa 4560 agagaacaca uccaccuacu cacugccacc agacccgucu cacuuugaug guuauaaaca 4620 gcaaggugug gucaucaugg augauuugaa ccaaaaccca gauggggcag auaugaaacu 4680 cuuuugucaa augguaucua cuguggaguu caucccgccu auggccucac uggaagaaaa 4740 aggcauuuug uucacaucca auuaugucuu ggcuuccacc aacuccaguc guaucacacc 4800 acccacagua gcccauagug acgcgcuggc uaggagauuc gccuucgaua uggacauaca 4860 aguaaugggc gaguauucca gagaugguaa acucaacaug gcaauggcca cugagaugug 4920 uaaaaacugc caccaaccag caaacuucaa gagaugcugc ccuuuggugu guggcaaggc 4980 uauucaguug auggacaaau ccucuagagu uagauacagu auugaccaga ucaccacuau 5040 gauuaucaau gagagaaaca gaagauccaa cauagguaau ugcauggagg cucuauucca 5100 aggaccacuc caguacaaag accugaaaau ugacaucaaa acgagucccc ccccugagug 5160 uaucaaugac cugcuacaag caguugacuc 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ggtgcataca ctggtttgcc aaataaacga 5400 cccaatgtac ccactatcag gacagcaaaa gtgcaaggcc ctgggtttga ttacgcagtg 5460 gccatggcta aaagaaacat tgttacagca accaccagca aaggggagtt tacgatgttg 5520 ggagtctatg ataatgtggc catcttgcca acccacgcct cacctggtga aagcattgcg 5580 atcgacggta aagaggtgga aattcttgac gccaaagccc ttgaagatca ggcaggaact 5640 aatcttgaaa ttaccataat tacactaaag aggaacgaga agttcagaga tatcaggcca 5700 cacattccca cccaaatcac cgaaacaaat gatggagttt tgatcgtgaa cactagtaag 5760 taccccaaca tgtatgttcc cgttggtgct gtgaccgaac aggggtatct taatctcggt 5820 ggacgacaaa ccgctcgtac gctaatgtac aactttccaa ctagagcagg tcagtgtggt 5880 ggtgtcatca cgtgcactgg taaagtcatt gggatgcatg ttggtgggaa cggttcacat 5940 gggttcgcgg cggccctaaa gcggtcatac ttcactcaga ttcaaggtga gattcaatgg 6000 atgaaaccat caaaagaagt gggatacccg atcataaatg ctccgtccaa aaccaaactt 6060 gaacccagcg cttttcacta tgtgtttgaa ggggtgaagg aaccagcagt ccttaccaaa 6120 aatgatccca ggctcaggac agactttgaa gaagcaatat tctctaagta tgtaggcaac 6180 aagatcactg atgtggatga gtacatgaaa gaggcagtgg atcattacgc tggccaactc 6240 atgtctctag acatcaacac agaacaaatg tgcttggagg acgccatgta cggcaccgat 6300 ggcctggaag cacttgactt gaccactagt gctggatacc cttatgtagc aatgggaaag 6360 aaaaagagag acatcttgaa taagcagact agagacacca aggaaatgcg gagactctta 6420 gatacttatg gaattaactt accgcttgta acatatgtta aagatgaact aaggtcaaaa 6480 actaaggtgg agcagggaaa atccagattg attgaagcct ccagtttgaa tgattcagtg 6540 gccatgagaa tggcatttgg aaatctctat gcagcatttc acaaaaaccc aggagttgtc 6600 actggcagtg cagttggttg tgatccagat ctattttgga gcaagatccc agtgctaatg 6660 gaagagaagc tctttgcttt tgactacaca ggttatgatg catcactcag cccggcctgg 6720 tttgaggcac tcaaaatggt gctagagaaa atcggatttg gggacagggt ggattatatt 6780 gattacctca accattccca ccacctgtac aaaaacaaaa cttattgcgt aaaaggcggc 6840 atgccatctg gctgctcagg cacatcaatt tttaactcaa tgattaacaa cttaatcatt 6900 aggacactcc tactgaaaac ctacaagggc atagatttag atcacctaaa gatgattgcc 6960 tatggtgatg atgtaattgc ttcctacccc catgaggttg atgctagtct cctagcccaa 7020 tcaggaaaag actatggact aaccatgact ccagcagaca agtcagctac ctttgaaaca 7080 gtcacatggg agaatgtaac attcttgaaa agattcttta gagcggatga gaagtatccc 7140 ttcctcatac atccagtaat gccaatgaag gagattcatg aatcaattag atggacaaag 7200 gatcccagaa acacacagga tcacgtgcgc tcattgtgcc tattggcctg gcacaacggc 7260 gaagaagaat acaacaagtt cttagctaaa atcaggagtg tgccaattgg gagagcttta 7320 ttgctcccag agtactctac attgtaccgc cgttggctcg actcttttta gtaaccctac 7380 ctcagtcgaa ttggattggg tcatgctgtt gtaggggtaa atttttcttt aattcgggga 7440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 7468

Claims (20)

  1. 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로는 투입량(input)과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 5%이하인, 마호니(Mahoney), MEF-1, 또는 소켓(Saukett) 균주로부터의 캡시드를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주이고, 상기 재조합 폴리오바이러스 균주의 게놈은, 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)의 게놈과 비교하여, 다음 돌연변이: 5'UTR에서 133(A에서 G로), 142(U에서 C로), 163(A에서 G로), 597(C에서 U로), 및 609(G에서 A로); 및 비-구조적 단백질에서 3486(G에서 A로), 3852(A에서 U로), 4120(U에서 C로), 4428(A에서 G로), 4563(A에서 U로), 5436(G에서 A로), 6210(A에서 G로), 6848(G에서 A로), 및 7102(U에서 C로)를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주.
  2. 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로는 투입량(input)과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 5%이하인, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 1 균주이고, 상기 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 1 균주의 게놈은, 마호니 균주(SEQ ID NO: 6)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이: 5'UTR에서 131(A에서 G로), 140(U에서 C로), 161(A에서 G로), 593(C에서 U로), 및 605(G에서 A로); 및 비-구조적 단백질에서 3482(G에서 A로), 3848(A에서 U로), 4116(U에서 C로), 4424(A에서 G로), 4559(A에서 U로), 5432(G에서 A로), 6206(A에서 G로), 6844(G에서 A로), 및 7098(U에서 C로)를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주.
  3. 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로는 투입량(input)과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 5%이하인, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 2 균주이고, 상기 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 2 균주의 게놈은 MEF-1 균주(SEQ ID NO: 5)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이: 5'UTR에서 134(A에서 G로), 143(U에서 C로), 164(A에서 G로), 598(C에서 U로), 및 610(G에서 A로); 및 비-구조적 단백질에서 3847(A에서 U로), 4115(U에서 C로), 4423(A에서 G로), 4558(A에서 U로), 5431(G에서 A로), 6205(A에서 G로), 6843(G에서 A로), 및 7097(U에서 C로)를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주.
  4. 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로는 투입량(input)과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 5%이하인, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 3 균주이고, 상기 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 3 균주의 게놈은 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주의 게놈은 소켓 균주(SEQ ID NO: 7)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이: 5'UTR에서 133(A에서 G로), 142(U에서 C로), 163(A에서 G로), 596(C에서 U로), 및 608(G에서 A로); 및 비-구조적 단백질에서 3839(A에서 U로), 4107(U에서 C로), 4415(A에서 G로), 4550(A에서 U로), 5423(G에서 A로), 6197(A에서 G로), 6835(G에서 A로), 및 7089(U에서 C로)를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주.
  5. 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로는 투입량(input)과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 5%이하인, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 1 균주이고, 상기 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 1 균주의 게놈은 사빈 1 균주(SEQ ID NO: 9)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이: 5'UTR에서 131(A에서 G로), 140(U에서 C로), 161(A에서 G로), 593(C에서 U로), 및 605(G에서 A로); 및 비-구조적 단백질에서 3482(G에서 A로), 3848(A에서 U로), 4424(A에서 G로), 4559(A에서 U로), 5432(G에서 A로), 6206(A에서 G로), 6844(G에서 A로), 및 7098(U에서 C로)를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주.
  6. 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로는 투입량(input)과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 5%이하인, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 2 균주이고, 상기 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 2 균주의 게놈은 사빈 2 균주(SEQ ID NO: 10)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이: 5'UTR 에서 131(A에서 G로), 140(U에서 C로), 161(A에서 G로), 594(C에서 U로), 및 606(G에서 A로); 및 비-구조적 단백질에서 3481(G에서 A로), 3847(A에서 U로), 4115(U에서 C로), 4424(A에서 G로), 4559(A에서 U로), 5432(G에서 A로), 6206(A에서 G로), 6844(G에서 A로), 및 7098(U에서 C로)를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주.
  7. 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로는 투입량(input)과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 5%이하인, 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 3 균주이고, 상기 재조합 약독화 온도 감수성 폴리오바이러스 유형 3 균주의 게놈은 사빈 3 균주(SEQ ID NO: 8)의 게놈과 비교하여 다음 돌연변이: 5'UTR에서 133(A에서 G로), 142(U에서 C로), 163(G에서 G로), 596(C에서 U로), 및 608(G에서 A로); 및 비-구조적 단백질에서 3839(A에서 U로), 4107(U에서 C로), 4415(A에서 G로), 4550(A에서 U로), 5423(G에서 A로), 6197(A에서 G로), 6835(G에서 A로), 및 7089(U에서 C로)를 포함하는 재조합 폴리오바이러스 균주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리오바이러스 균주 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 폴리오바이러스 백신(IPV) 조성물.
  9. 제8항에 따른 조성물을 포함하는 불활성화된 폴리오바이러스 백신(IPV) 조성물에 있어서, 여기에서 조성물 중의 폴리오바이러스가 불활성화된 조성물.
  10. 제9항에 따른 IPV 조성물을 포함하고, 디프테리아, 파상풍, 백일해, 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b(Heamophilus influenzae type b(Hib)), 또는 B형 간염 바이러스(HBV)로부터의 하나 이상의 항원을 추가로 포함하는 조합 백신 조성물.
  11. 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주를 포함하는 조성물에 있어서, 여기에서 제1, 제2 및 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리오바이러스 균주로부터 선택되고, 제1의 재조합 폴리오바이러스 균주는 마호니 균주로부터의 캡시드를 포함하고, 제2의 재조합 폴리오바이러스 균주는 MEF-1 균주로부터의 캡시드를 포함하고, 제3의 재조합 폴리오바이러스 균주는 소켓 균주로부터의 캡시드를 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제11항에 따른 조성물을 포함하는, 불활성화된 폴리오바이러스 백신(IPV) 조성물이고, 여기에서 조성물 중의 폴리오바이러스가 불활성화된 폴리오바이러스 백신(IPV) 조성물.
  14. 제13항에 따른 IPV 조성물을 포함하고, 디프테리아, 파상풍, 백일해, 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b(Heamophilus influenzae type b(Hib)), 또는 B형 간염 바이러스(HBV)로부터의 하나 이상의 항원을 추가로 포함하는 조합 백신 조성물.
  15. 제8항에 있어서, 급성 회백수염(poliomyelitis)에 대한 예방 접종용인 조성물.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리오바이러스 균주의 게놈의 보체 또는 게놈을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
  17. 다음 단계를 포함하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리오바이러스를 포함하는 제제의 제조 방법:
    a) 세포 배양물에서 세포를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리오바이러스 균주로 감염시키고,
    b) 세포 배양물에서 세포를 배양하여 폴리오바이러스를 증식시키고; 그리고,
    c) 폴리오바이러스를 세포 또는 세포 배양물로부터 분리하여 폴리오바이러스를 포함하는 제제를 얻는 단계.
  18. 제17항에 있어서, 폴리오바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 따른 방법 및 불활성화된 폴리오바이러스를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함하는, IPV의 제조 방법.
  20. 30℃에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있고 37℃에서 세포 배양으로는 투입량(input)과 비교하여 바이러스의 감염 단위의 수에서의 증가가 5%이하인 재조합 약독화 폴리오바이러스 균주를 얻는 방법으로서,
    야생형 폴리오바이러스 게놈에, 브루넨더스 균주(SEQ ID NO: 1)의 게놈에 관하여 다음의 위치, 또는 다른 폴리오바이러스 균주의 상응하는 위치에 다음 뉴클레오티드 중 적어도 10, 11, 12, 13 또는 14를 포함하도록, 돌연변이를 도입하는 것을 포함하는 방법:
    5'UTR의 133 위치에 G, 142 위치에 C, 163 위치에 G, 597 위치에 U, 및 608 위치에 A, 그리고 비-구조 단백질의 3486 위치에 A, 3852 위치에 U, 4120 위치에 C, 4428 위치에 G, 4563 위치에 U, 5436 위치에 A, 6210 위치에 G, 6848 위치에 A, 및 7102 위치에 C.

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