KR102414519B1 - Ptps-기반 항암 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 의학 분야에 관한 것이다. 보다 특히 펩티드, 이러한 펩티드를 함유하는 미세소포제, 이를 함유하는 조성물, 특히 백신, 및 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 의학 분야에 관한 것이고 전형적으로 치료법 및 예방법 분야에서 사용된다. 본 발명은 보다 구체적으로 7 내지 50개 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어진 초창기 번역 산물 (Pioneer Translation Product) ("PTP"), 이러한 PTP를 함유하는 미세소포(microvesicle), 이를 함유하는 조성물, 특히 백신 조성물, 및 대상체에서, 바람직하게 종양 항원에 대항하여 유도되는 면역 반응을 자극하기 위한 방법에 관한 것이다.
백신접종의 주요 목표는 인간에서 바이러스 감염성 질환 및 암을 제어할 수 있는 효과적인 면역 반응을 유도시키는 것이다. 면역계는 2종의 카테고리로 분류되는데, 한편으로는 선천성 면역계이고 다른 한편은 적응성 면역계이다. 감염되거나 또는 형질전환된 세포에 대항하는 세포 면역 반응은 적응성 면역계의 활성화를 요구한다. 이러한 활성화는 오직 항원-특이적 세포독성 T 림프구 예컨대 CD8+ T 세포, B 세포 및 T 헬퍼 T 세포 예컨대 CD4+ T 세포를 자극함으로써만 획득될 수 있다. 사실 세포독성 CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I 분자에 결합된 세포 표면 항원 상에 존재하는 암성 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 검출할 수 있다. 이러한 인식은 그 결과로서 감염된 세포 또는 종양 세포를 향한 T 세포의 직접적인 세포독성 작용을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 이들 상이한 상태에 대항하는 적절한 면역 반응은 교차 제시라고 불리는 과정을 통해서 외부 펩티드 물질을 흡수하여 그것들을 자신들의 MHC 클래스 I 분자 상에 제시하는 전문적인 항원 제시 세포 (pAPC), 예컨대 수지상 세포 및 마크로파지에 의한 CD8+ T 세포의 활성화를 요구한다. 직접 및 교차-제시 경로는 숙주에 위협이 되는 세포의 검출 및 제거를 위한 기본적인 과정이다. 이러한 과정은 MHC 클래스 II 분자에 결합된 외생성 단백질로부터 유래된 13 내지 20개 아미노산의 짧은 펩티드 형태인 항원을 인식하는 T 헬포 T 세포에 더욱 의존적이다.
수년 전에, MHC 클래스 I 제한적 경로에 직접 제시를 위한 펩티드의 공급원은 전체 길이 단백질의 분해로부터 유래되는 것이 아니라 소위 결함적 리보솜 생성물, 또는 DRiP로부터 유래된다고 상정되었다. 추가의 연구들은 클래스 I 경로에 대한 펩티드의 실제 공급원이 알려지지는 않았지만, 이러한 개념을 그 이후로 뒷받침해주었다. 발명자는 엡스타인 바(Epstein barr) 바이러스의 잠복기 단백질 EBNA1이 항원성 제시를 저해하기 위해 mRNA 번역에 영향을 미치고, 그러한 방식으로 이의 검출을 피한다는 것을 확인하였다. 게다가, 그들은 mRNA 번역 속도가 항원 제시와 밀접하게 관련되어 있다는 것을 관찰하였다. 또한, 일부 MHC 클래스 I-결합된 펩티드는 통상적이지 않은 번역 기전으로부터 세포에서 합성된 폴리펩티드를 의미하는 은성(cryptic) 번역에 의해 생성되는 것으로 기술되었다. 이들은 인트론, 인트론/엑손 접합부, 5' 및 3' 미번역된 영역 또는 교대식 번역 리딩 프레임에 의해 코딩되는 펩티드일 수 있다. 모든 이들 관찰은 항원 생성을 위한 핵심 과정으로서 그 초점이 단백질 분해에서 mRNA 번역으로 이동되게 만들었다. 보다 최근에, 발명자는 항원성 제시는 펩티드가 인트론으로 발현되건 엑손으로 발현되건 무관하게 균등하고, 전체 길이 단백질을 생기게 하는 정규 사건과 구별되는 번역 사건에 의해 생성되는, 소위 초창기 번역 생성물 (Pioneer Translation Product) (PTP)을 생기게 한다는 것을 확인하였다. 이전의 결과들은 mRNA가 핵에서 세포질로 이출되면, 차단되고, 항원성 제시가 엑손 및 인트론-코딩된 펩티드로부터 두드러지게 강화되었다는 사실에 의해 뒷받침되었다. 전체적으로, 발명자는 MHC 클래스 I 경로에 대한 항원성 펩티드가 대단한 정도로, 전체 길이 단백질을 생성시키고 핵 구획에서 새롭게 합성된 mRNA의 초기 스캐닝 동안 발생되는 것과 상이하고 독립적인 mRNA 번역 사건으로부터 유래된다는 것을 입증하였다 (Apcher, Millot et al. 2013, Apcher, Daskalogianni et al. 2015). 이들 PTP는 아마도 포착이 힘든 DRiP를 구성하는 듯 하다. 그들은 예를 들어 면역계가 어떻게 조직-의존적 선택적 스플라이싱 생성물을 "용인"할 수 있는지에 관한 설명을 제공하는 mRNA 스플라이싱이 일어나기 이전에 발생될 수 있다.
요즈음, 숙주 면역 매개된 종양 인식 및 파괴를 개선시키려는 목적의 암 면역요법에서 치료적 백신접종이 새로이 각광을 받고 있다. 그러나 1996년에, MAGE-1로부터 유래된 클래스 I 결합 합성 에피토프는 임상 시험에서 펩티드 기반 백신으로서 이미 시험되었다. 그럼에도 동일한 그룹과 다른 그룹들은, 합성 에피토프를 백신으로서 사용하여 흑색종 환자에서 임의의 유익한 임상적 반응을 확인할 수 없었다. 그러고 나서, 상이한 암에 대해 유도된 다른 짧은 펩티드가 다시 환자에서 임의의 유익한 T 세포 반응을 입증하지 않고 사용되었다. 이후에, 복수 펩티드 백신이 어떠한 획기적 발전없이 특히 흑색종에 대하여 사용되었었다. 최근에, 합성된 긴 펩티드 (20개 초과의 아미노산)에 의한 면역화가 보다 면역원성이며, 짧은 펩티드에서 관찰되는 면역화보다 양호한 항-종양 성장 효과를 갖는다는 것이 확인되었다. 최소의 짧은 항원성 에피토프를 함유하는 두 종류의 펩티드간 이들 차이는 보다 긴 펩티드가 그들의 3차 구조로 인하여 세포외 분해에 대해 보호될 수 있다는 사실 및 그들이 너무 길어서 임의 세포주의 MHC 클래스 I 분자에 직접적으로 결합할 수 없다는 사실에서 확인할 수 있을 것이다. 또한, 백신으로서 보다 긴 펩티드를 사용하는 이득은 그들이 내재화될 필요가 있고, 세포 표면에 제시되기 이전에 pAPC 내 프로테아솜에 의한 적절한 프로세싱을 요구하고 CD8+ T 세포를 활성화시킨다는 것이다. 게다가, 보다 긴 펩티드는 상이한 CD8+ T 세포의 활성화를 유도할 수 있고, 그래서 다수 면역 반응을 유도할 수 있는 몇몇 에피토프를 함유하는 보다 나은 기회를 갖는다.
면역 세포 또는 종양 세포에 의해 분비되는 엑소솜은 종양 면역요법에서 그들 잠재성에 대해 조사되었다. 엑소솜은 다중소포체 (MVB)의 내강내 소포체에서 발원되며, 특별한 단백질의 도입은 선택적이다. 엑소솜은 30 내지 100 nm의 직경을 갖는 소포체이다. 종양 유래된 엑소솜은 종양 항원을 함유할 수 있고 따라서 암-백신을 위한 종양 항원의 공급원으로서 사용될 수 있다고 가정되었다. 또한, 많은 그룹들은 수지상 세포 (DC)-유래된 엑소솜이 특이적 항-종양 면역성을 유도시키기 위한 유용하고 효과적인 작용제일 수 있다고 보고하였다. 그럼에도 증가되고 있는 증거들은, 종양-유래된 엑소솜은 그들이 예컨대 DC의 분화를 억제하거나 또는 NK 세포를 음성적으로 조절함으로써 상이한 경로에서 상이한 역할을 하여 종양 면역 회피를 유도시킬 수 있어서 불완전하다고 시사하고 있다 (Valenti, Huber et al. 2006, Clayton, Mitchell et al. 2008, Whiteside, Mandapathil et al. 2011).
발명자는 이제 본 명세서에서 종양 성장의 완전한 억제, 바람직하게 종양 파괴를 가능하게 하는 종양에 대항한 적절한 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도할 수 있는, 바람직하게 PTP를 함유하는 미세소포, 전형적으로 엑소솜과 조합된, 인트론 또는 엑손 서열로부터 생성된 PTP를 포함하는 백신 조성물을 설명한다.
본 발명은 특히 암 요법 및 예방법 분야에서 항원 특이적 면역 반응을 개선시키기 위한 생성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 7 내지 50개 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어지고, 전형적으로 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프를 포함하고, 바람직하게 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 및 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하는 초창기 번역 생성물 ("PTP")이 암을 앓는 대상체에서, 이러한 펩티드를 발현하는 종양에 대항하여 효율적인, 바람직하게 지속적인 면역 반응을 유도시킬 수 있다는 예상치 않은 발견을 기반으로 한다.
따라서, 본 발명의 제1 목적은 대상체에서 백신, 바람직하게 암 백신으로서 사용을 위한, 7 내지 50개 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어지고, 전형적으로 5 kDa 이하인 초창기 번역 생성물 ("PTP")에 관한 것이다. PTP는 전형적으로 인트론, 3' 또는 5' 미번역된 영역 (UTR), LncRNA (긴 비코딩 RNA (Long non coding RNA)), miRNA (마이크로RNA (microRNA)), 유전자간 서열 및 이의 조합으로부터 선택되는 서열에서 발현된다. PTP는 바람직하게 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함한다.
본 발명의 제2 목적은 적어도 하나의 PTP (바람직하게, 몇몇개의 PTP), 전형적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 PTP를 포함하는, 미세소포, 전형적으로 엑소솜 또는 균등한 종양-유래된 미세소포 예컨대 멜라노솜에 관한 것이고, 상기 PTP는 바람직하게는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함한다.
본 발명의 제3 목적은 적어도 하나의 PTP (바람직하게, 몇몇개의 PTP) 및/또는 미세소포, 전형적으로 엑소솜 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 종양-유래된 미세소포, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물, 특히 백신 조성물에 관한 것이다.
바람직한 백신 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 제1 PTP, 미세소포 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게, 미세소포는 7 내지 50개 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어진 적어도 하나의 제2 PTP를 포함하고, 상기 제2 PTP는 바람직하게 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하고, 미세소포는 임의로 제1 PTP를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 백신으로서 사용을 위한 PTP를 코딩하는 핵산 서열, 및 이러한 핵산 서열 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물, 특히 백신 조성물에 관한 것이다.
바람직한 양상에서, 본 명세서에 기술된 백신 조성물은 인간에서 사용을 위한 것이다.
본 발명은 또한 대상체에서 암을 예방하거나 또는 치료하기 위한 이러한 PTP, 미세소포, 핵산 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특이적 항원, 바람직하게 종양 항원에 대항하여, 대상체에서 면역 반응을 생성시키거나, 또는 대상체를 백신접종하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 대상체에게 상기 항원으로부터 유래된 본 발명에 따른 PTP, 상기 PTP를 포함하는 미세소포, 또는 상기 PTP를 포함하는 백신 조성물을 주사하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 목적은 대상체에서 암을 예방하거나 또는 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 대상체에게 본 발명에 따른 PTP, 바람직하게 대상체의 암성 종양에 의해 발현되는 폴리펩티드로부터 유래되는 PTP, 상기 PTP를 포함하는 미세소포, 또는 상기 PTP를 포함하는 백신 조성물을 주사하는 단계를 포함한다.
주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex) (MHC) 클래스 I 항원 제시 경로는 면역계가 자기(self)와 비자기(non-self)를 구별할 수 있게 한다. 항원성 펩티드의 프로세싱에 관한 대규모 연구에도 불구하고, 그들의 기원에 관하여 알려진 것이 거의 없다. 발명자는 초창기 번역 생성물 ("PTP")이라고 하는 독특한 부류의 펩티드가 mRNA 번역의 초창기 회차 동안 생성되고 MHC 클래스 I 경로에 직접 제시를 위한 항원성 펩티드 기질의 주요 공급원을 제공한다는 것을 밝혔다. 그들은 MHC 클래스 I 경로를 위한 기질의 주요 비율이 핵 내에서 비정규 번역 기전을 통한 mRNA 성숙화의 초기 단계 동안 및 인트론이 스플라이싱되어지기 이전에 합성된다는 것을 입증하였다 (Apcher et al., 2013). 이러한 기전은 전체 길이 단백질을 생성시키는 것과는 독립적이다. 발명자는 또한 PTP가 전체 길이 단백질보다 MHC 클래스 I 교차 제시 경로를 위한 펩티드의 보다 양호한 공급원이라는 것을 입증하였고 이제 본 명세서에서 이들 PTP가, 특히 미세소포와 조합시, 특히 암을 효율적으로 예방하거나 또는 치료하기 위한 백신으로서 사용될 수 있다는 것을 밝힌다.
따라서 본 발명의 제1 목적은 대상체에서 백신, 바람직하게 암 백신으로서 사용을 위한, 7 내지 50개 아미노산 잔기 또는 8 내지 50개 아미노산 잔기를 갖는 펩티드로 이루어진 초창기 번역 생성물 ("PTP")에 관한 것이다.
초창기 번역 생성물 ("PTP")은 인트론, 엑손, 3' 및 5' 미번역된 영역 (UTR), LncRNA (Long non coding RNA), miRNA (microRNA) 및/또는 유전자간 서열로부터 발현되는 비스플라이싱된 mRNA로부터 유래된 펩티드로서 본 명세서에서 정의된다. 바람직하게, PTP는 i) 인트론, 3' 또는 5' 미번역된 영역 (UTR), LncRNA (Long non coding RNA), miRNA (microRNA), 유전자간 서열 및 이의 조합, ii) 인트론, LncRNA (Long non coding RNA), miRNA (microRNA), 유전자간 서열 및 이의 조합 또는 iii) 인트론, LncRNA (Long non coding RNA), miRNA (microRNA) 및 유전자간 서열로부터 선택되는 서열에서 발현되는 7 내지 50개 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어진다. PTP는 핵 구획에서 새롭게 합성되는 mRNA의 초기 스캐닝 동안 발생되는 전체 길이 단백질을 생기게 하는 정규 사건과는 별개인 번역 사건에 의해 생성된다 (Apcher, Millot et al. 2013, Apcher, Daskalogianni et al. 2015). 이들 PTP는 바람직하게 바이러스 또는 박테리아 기원이 아니다. 그들은 전형적으로 7 내지 50개 아미노산 잔기의 서열로 이루어지고 5 kDa 이하, 전형적으로 3 kDa 이하의 원자 질량을 가진다. PTP는 바람직하게 7 내지 30개 아미노산 잔기, 예를 들어 7 내지 27개 아미노산 잔기의 서열로 이루어진다. PTP는 예를 들어 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. PTP는 전형적으로 MHC 클래스 I 에피토프를 포함한다. 종양 세포의 핵 구획으로부터 정제된 PTP [또한 본 명세서에서 "종양-연합된 PTP" (TA-PTP)와 동일시함]는 전형적으로 종양 세포가 유래된 종양에 대항하여 특이적 항-종양 CD8+ T 세포 반응을 유발시킨다. 본 발명에 따른 바람직한 PTP는 적어도 MHC 클래스 I 에피토프 및/또는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하고, MHC 클래스 II 에피토프는 항-종양 CD8+ T 세포 반응을 확장시키는, 면역계로부터의 장기간 지속성의 CD4+ T 세포 반응을 유발시킨다.
본 발명의 PTP는 표준 생화학적 접근법을 사용하여 치료/백신접종하려는 대상체에서 특이적 면역 반응을 유발시키고자 하는 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 항원으로부터 수득되거나 또는 정제될 수 있다 (그리고 "유래된다"고 함). 종양에서, PTP 추출은 세제 또는 염을 사용한 종양 세포의 용해에 이어서, 5 kDa 이하, 바람직하게 3 kDa 이하의 펩티드의 추출, 및 컬럼 상에서 음이온성 또는 소수성 크로마토그래피 및/또는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 표준 크로마토그래피 접근법에 의한 이의 정제를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, PTP로부터 유래된 항원성 에피토프는 시트레이트 포스페이트 완충액 (pH 3.3)에 의해서 종양 세포 표면으로부터 용리될 수 있다. 항원성 에피토프는 질량 분광분석법을 통해 분석할 수 있고 펩티드 드노보 시퀀싱(de novo sequencing)을 수행할 수 있다. 분석적 과정은 실제로 서열 데이타베이스를 사용하지 않고 탠덤 질량 스펙트럼 (MS / MS)으로부터 펩티드의 아미노산 서열의 추론을 가능하게 한다. 인트론, 엑손, 3' 및 5' UTR, LncRNA, miRNA 또는 유전자간 영역으로부터 에피토프의 동정 이후, 상이한 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 에피토프를 함유한 신규한 PTP를 합성할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 PTP는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 PTP는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 및 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함한다.
바람직한 구체예에서, PTP는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시키는 PTP이다.
본 명세서에 기술된 특정한 PTP는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23 (표 1 및 2 및 서열 목록을 참조함) 중 어느 하나로부터 선택되는 PTP이다.
바람직한 구체예에서, 대상체에서 암 백신으로서 사용을 위한 PTP는 대상체의 암 종양으로부터 유래되는 PTP ("종양-연합된 PTP" 또는 "TA-PTP")이다. 이러한 TA-PTP는 CD8+ T 세포를 활성화시키는 PTP로서 발명자가 동정하였다.
다른 바람직한 구체예에서, 이러한 PTP는 상응하는 전체 길이 단백질 또는 폴리펩티드, 즉 동일한 mRNA에 의하여 정규적으로 번역되는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이의 항원과 조합하여 암 백신으로서 사용된다.
본 발명의 다른 목적은 대상체에서 백신으로서 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 PTP를 코딩하는 핵산 서열 (DNA 또는 mRNA)이다.
본 발명의 추가의 목적은 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 PTP를 포함/발현하는, 미세소포, 전형적으로 엑소솜 또는 균등한 종양-유래된 미세소포에 관한 것이다.
엑소솜은 형질막과 후기 엔도솜 다중소포체의 융합 이후에 세포외 환경으로 분비되는 엔도솜 기원의 소포체이다 (Garin et al., 2001; Thery et al., 2002). 다양한 조직 유형 유래의 세포들, 예컨대 예를 들면 수지상 세포, B 림프구, 종양 세포 및 비만 세포는 엑소솜을 분비하는 것으로 확인되었다. 종양 세포로부터 유래되는 엑소솜은 본 명세서에서 종양-유래된 미세소포로서 동일시된다. 흑색종 세포로부터 수득된 엑소솜 또는 종양-유래된 미세소포는 본 명세서에서 "멜라노솜"으로서 동일시된다. 상이한 기원으로부터의 엑소솜은 별개 세트의 단백질 및 지질 모이어티를 나타낸다 (Thery et al., 1999, Thery et al., 2001). 그들은 현저하게 항원 제시 및 면역-조정에 관여되는 단백질을 함유하여 엑소솜이 면역 반응의 조정을 이끄는 세포 대 세포 통신에서 역할을 한다는 것을 시사한다. 실제로, 종양 항원으로부터 유래된 펩티드로 펄싱된 수지상 세포 (DC)로부터의 엑소솜은 일치되는 종양을 사용하는 동물 모델에서 항-종양 반응을 유발시킨다 (Wolfers et al., 2001, Zitvogel et al., 1998).
치료적 목적을 위해서 또는 연구 도구로서 엑소솜을 생성시키거나, 정제하거나 또는 사용하는 방법은 참조로 본 명세서에 편입되는, 예를 들어 WO99/03499, WO00/44389 및 WO97/05900에 기술되어 있다. 재조합 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 유래된 재조합 엑소솜이 당분야에서 기술되었다. 이러한 재조합 엑소솜은 플라스미드-코딩되는 재조합 단백질을 함유한다 (WO00/28001). 치료적 목적을 위해서 또는 연구 도구로서 엑소솜의 단백질 내용물을 조작하고 항원, 보조제 및 마커를 전개시키는 방법이 WO03/016522에 기술되었다.
따라서, 본 명세서에서 발명자는 대상체에서, 백신, 바람직하게 암 백신으로서 사용을 위한 본 명세서에서 정의된 바와 같은 PTP를 포함/발현하는, 미세소포, 전형적으로 종양 세포로부터 유래된 미세소포를 기술한다. 특정 구체예에서, 이러한 미세소포는 몇몇개의 PTP, 특히 상이한 길이 및 임의로 상이한 기원의, 즉 별개의 (비스플라이싱된) mRNA로부터 유래되는, 몇몇개의 PTP를 포함한다.
종양 세포에 의해 생성되는 종양-유래된 미세소포는 당분야에 공지된 기술에 따라서, 예컨대 원심분리, 크로마토그래피 등에 의해 수집될 수 있고/있거나 정제될 수 있다. 바람직한 기술은 본 명세서에 참조로 편입되는 WO00/44389 및 US09/780,748에 기술되어 있다.
본 명세서에서 발명자는 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 PTP를 함유/발현하는 기능화된 미세소포/엑소솜/멜라노솜을 제조하는 방법을 기술하고, 이 방법은
- PTP를 코딩하는 키메라 유전자 구성체를 제공하는 단계;
- 상기 구성체를 미세소포/엑소솜/멜라노솜-생성 세포에 도입시켜 상기 PTP를 함유/발현하는, 전형적으로 그들 표면에 상기 PTP를 제시하는 기능화된 미세소포/엑소솜/멜라노솜을 생성시키는 단계, 및
- 상기 기능화된 미세소포/엑소솜/멜라노솜을 수집 및/또는 정제하는 단계
를 포함한다.
이러한 세포에 의해 생성되는 미세소포는 당분야에 공지된 기술에 따라서, 예컨대 원심분리, 크로마토그래피 등에 의하여 수집될 수 있고/있거나 정제될 수 있다. 바람직한 기술은 참조로 본 명세서에 편입되는 WO00/44389 및 US09/780,748에 기술되어 있다.
본 명세서에서 발명자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 PTP를 생성시키는 방법을 더욱 기술하고, 이 방법은
- PTP를 코딩하는 키메라 유전자 구성체를 제공하는 단계;
- 상기 구성체를 미세소포/엑소솜/멜라노솜-생성 세포에 도입시켜 상기 PTP를 함유/발현하는, 전형적으로 그들 표면에 상기 PTP를 제시하는 기능화된 미세소포/엑소솜/멜라노솜을 생성시키는 단계,
- 상기 기능화된 미세소포/엑소솜/멜라노솜을 수집 및/또는 정제하는 단계, 및
- 상기 기능화된 미세소포/엑소솜/멜라노솜으로부터 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편을 회수 및/또는 정제하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 문맥 내에서, PTP로부터 유래된 항원성 에피토프 또는 PTP를 "포함/발현하는" 용어 미세소포 (엑소솜 또는 멜라노솜)는 그들 막에 부착된 PTP로부터 유래된 그러한 항원성 에피토프 또는 PTP를 함유하는 미세소포를 의미한다. PTP로부터 유래된 항원성 에피토프는 미세소포의 외부에 노출될 수 있고, PTP는 전형적으로 미세소포 내에 함유된다 (즉, 막의 내부 면에 부착되거나 또는 미세소포 내부에 부유됨). 전형적으로, 미세소포는 수지상 세포로 PTP(들)의 효율적인 수송을 가능하게 하고 수지상 세포 표면에서 PTP(들) 및 그로부터 유래된 항원성 에피토프(들)의 효율적인 교차-제시를 가능하게 한다.
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 키메라 유전자 구성체를 포함하는 벡터를 비롯하여, 상기 기술된 바와 같은 키메라 유전자 구성체 또는 벡터를 포함하는 재조합 세포를 추가로 포함한다.
벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 인공 염색체 등일 수 있다. 전형적인 예는 플라스미드, 예컨대 상업적으로 입수할 수 있는 플라스미드로부터 유래된 것들, 특히 pUC, pcDNA, pBR 등을 포함한다. 다른 바람직한 벡터는 바이러스로부터 유래되고, 예컨대 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV, 배큘로바이러스 또는 백시니아 바이러스가 있다. 벡터의 선택은 상기 벡터가 사용되어야 하는 재조합 숙주 세포에 따라서 당업자가 조정할 수 있다. 이와 관련하여, 포유동물 세포를 형질감염시킬 수 있거나 또는 감염시킬 수 있는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 실제로, 바람직한 재조합 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 이들은 초대 세포 또는 확립된 세포주일 수 있다. 예시적인 예는 섬유아세포, 근육 세포, 간세포, 면역 세포 등을 비롯하여, 그들의 선구 또는 전구 세포를 포함한다. 가장 바람직한 포유동물 세포는 엑소솜-생성 포유동물 세포이다. 이들은 예를 들어, 종양 세포, 수지상 세포, B 및 T 림프구 또는 비만 세포를 포함한다.
본 발명의 미세소포는 백신으로서 단독으로 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 미세소포는 표적 세포 또는 조직 (예를 들어, 종양)에 의해 발현되는 전체 길이 단백질 또는 폴리펩티드 및/또는 적어도 하나의 PTP, 전형적으로 상기 전체 길이 단백질 또는 폴리펩티드에 상응하는 비스플라이싱된 mRNA로부터 유래되는 몇몇개의 PTP와 조합하여 사용된다.
본 발명의 추가 목적은 본 명세서에 기술된 바와 같은 생성물, 전형적으로 적어도 하나의 PTP, PTP 전체 길이 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드, 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 미세소포 (엑소솜 또는 멜라노솜), 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 조성물, 특히 백신 조성물, 바람직하게 암 백신에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 조성물은 상이한 길이의 몇몇개의 PTP를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시키는 PTP를 포함한다.
존재할 경우, 미세소포는 전형적으로 PTP(들), 예를 들어 이처럼 조성물에 임의로 (적어도 하나의) 별개의 PTP(들)와 함께 존재하는 것과 동일한 PTP를 포함 (함유 또는 발현)한다.
바람직한 백신 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 제1 PTP, 미세소포 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게, 미세소포는 7 내지 50개 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어진 적어도 하나의 제2 PTP를 포함하고, 상기 제2 PTP는 바람직하게 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하며, 미세소포는 임의로 제1 PTP를 포함한다.
미세소포는 바람직한 PTP(들)를 발현하는 재조합 미세소포 및 치료하려는 대상체로부터 유래된 천연 미세소포, 예를 들어 치료하려는 대상체의 종양으로부터 유래된 미세소포 (종양-유래된 미세소포)를 포함하는 미세소포의 조성물일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 미세소포는 종양을 갖는 대상체의 CD8+ T 세포를 활성화시키는 PTP를 천연적으로 발현하는, CD8+ T 세포 활성화 미세소포, 전형적으로 엑소솜 또는 종양-유래된 미세소포, 예컨대 멜라노솜이다.
본 발명의 다른 별개의 구체예에서, 조성물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 PTP를 코딩하는 핵산 서열 (DNA 또는 mRNA) 또는 유전자 구성체를 포함하는 백신 조성물이다.
유전자 백신접종은 다양한 바이러스 벡터, 예컨대 백시니아, 폭스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연합 바이러스 등, 비(非)바이러스 벡터, 예컨대 다양한 지질성 또는 펩티드성 조성물과 연합된 핵산 서열을 사용하거나, 또는 순수한 (예를 들어, 나형(naked) 또는 달리 말해서 임의의 형질감염 촉진제 무함유) 핵산을 사용하여 수행될 수 있다. 백신접종은 근육내, 정맥내, 피하 또는 피내를 포함하는 다양한 주사 경로를 통해서 수행될 수 있다. 유전자총(gene gun) 또는 전기영동을 포함하는, 다양한 벡터 전달 장치 또는 기술이 유전자 백신접종에 사용될 수 있다. 대상체는 또한 벡터로 시험관내에서 형질감염된 세포주를 사용하여 면역화될 수 있다. 높은 수의 엑소솜의 방출을 위해 선택된 세포주가 특히 유리할 것이다.
바람직한 암 백신은 종양-연합된 PTP(들)를 엑소솜, 바람직하게 종양-유래된 미세소포, 및/또는 PTP 전체 길이 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함한다.
다른 바람직한 암 백신은 백신접종하려는 대상체의 종양으로부터 둘 모두 유래된 PTP 및 미세소포를, 적어도 하나의 별개의 PTP, 및/또는 동일한 PTP 및/또는 적어도 하나의 별개의 PTP를 발현하는 엑소솜, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함한다. 추가의 바람직한 암 백신은 추가적으로 PTP 전체 길이 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상황에서 이용할 수 있는, 약학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 또는 담체는 예를 들어 임의로 안정화제 예컨대 동질유전자 알부민 또는 임의의 다른 안정화 단백질, 글리세롤 등과 조합되는, 염수, 희석제, 등장화제, 또는 완충된 용액 예컨대 만니톨 20%이다.
적합한 보조제의 예는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 아폽토시스-유도 인자 (AIF), 열 충격 단백질 (HSP), Toll-유사 수용체 (TLR) 예컨대 TLR3 효현제 (폴리 I :C), 및 사이토카인 및 케모카인 예컨대 IL-7, IL-12, IL-15 및 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 포함한다.
본 발명은 또한 조성물, 특히 백신 조성물을 제조하거나, 대상체에서 질환, 특히 암을 예방하거나 또는 치료하기 위한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 생성물 (PTP, 미세소포, 핵산)의 용도에 관한 것이다. 전형적인 백신 조성물은 인간을 위한 것이다.
본 발명의 목적은 또한 특별한 표적, 바람직하게 종양 항원 또는 암/종양 세포에 대항하여, 대상체에서 면역 반응을 생성시키는, 전형적으로 대상체를 백신접종하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 상기 대상체에게, 상기 표적으로부터 유래되는 본 발명에 따른 PTP, 상기 PTP를 포함하는 본 발명에 따른 미세소포, 또는 본 발명에 따른 백신 조성물을 주사하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 대상체에서 암을 예방하거나 또는 치료하는 방법이고, 이 방법은 상기 대상체에게 본 발명에 따른 PTP, 바람직하게 대상체의 암성 종양에 의하여 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래되는 PTP, 상기 PTP를 포함하는 본 발명에 따른 미세소포, 또는 본 발명에 따른 백신 조성물을 주사하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용시, "치료" 또는 "치료하다"는 치료되는 대상체의 자연적 과정을 변경시키고자 시도되는 치료적 중재를 의미하고, 예방적 (예방법적) 또는 치유적 목적으로 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 제한없이, 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 호전된 예후를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 암의 발생을 연기시키거나 또는 암, 전형적으로 종양 성장의 진행을 지연시키는데 사용된다.
전형적으로, 치료는 대상체의 면역계의 치료적 반응, 전형적으로 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응(들)을 유도하게 될 것이다. T 세포 반응을 유도한다는 것은 본 명세서에서 일정 항원에 대해 유도된 T 세포 반응이 유발되는 것을 의미한다. 상기 유도 이전에, 상기 T 세포 반응은 존재하지 않았거나, 검출 수준 이하이거나 또는 기능적이지 않았다. T 세포 반응을 강화시킨다는 것은 본 명세서에서 일정 항원에 대하여 유도된 T 세포의 전체 작용이 상기 강화 이전 상기 T 세포의 전체 작용과 비교하여 더 높아지고/지거나 더 효율적이 된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 강화 이후에 상기 항원에 대해 유도된 T 세포가 더 많이 생성될 수 있다. 그 결과로서, 추가적으로 생성된 T 세포의 작용은 상기 항원에 대한 전체 작용을 증가시킨다. 대안적으로, 상기 강화는 상기 항원에 대해 유도된 T 세포의 작용의 증강을 포함할 수 있다. 상기 T 세포는 예를 들어 상기 항원과 더 강력하고/하거나 더 빠르게 반응할 수 있다. 물론, 상기 강화의 결과는 상기 T 세포의 작용의 증강과 함께 추가적인 T 세포의 생성일 수 있다. 대안적으로, 상기 강화는 오직 추가적인 T 세포의 생성, 또는 T 세포의 작용의 증강만을 포함할 수 있다.
치료, 전형적으로 백신은 대상체를 위해 의도된 것이다. 용어 "대상체" 또는 "개체"는 동물, 전형적으로 포유동물을 의미한다. 포유동물의 예는 인간 및 인간이외의 동물 예컨대, 제한없이, 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 인간이외의 영장류 (예컨대, 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 치료는 바람직하게 그 연령 또는 성별이 무엇이건, 이를 필요로 하는 인간을 위해 의도된 것이다. 특히 암을 앓는 대상체, 또는 예방되어야만 하는, 그러한 암이 "발생될 위험성이 있는" 것으로 여겨지는 것들을 이로써 간주한다. 환자는 전형적으로 종양을 갖는다. 본 개시에서 달리 명시하지 않으면, 종양은 암성 또는 악성 종양이다.
암 또는 종양은 임의 종류의 암 또는 신생물일 수 있다. 종양은 전형적으로 고형 종양, 특히 상피, 신경외배엽 또는 간엽 기원의 고형 종양이다. 흑색종, 육종, 암종, 림프종, 및 소아 종양 (신경교종), 예를 들어 흑색종 또는 육종으로부터 선택될 수 있다. 본 발명은 요법의 경우에서, 원발성 종양, 또는 속발성 침습, 국소 영역 또는 원격 전이에 적용가능하고, 예방법의 경우에, 속발성 악성 중추 신경계 관여 예컨대 흑색종, 폐암, 신장암, 유방암, 및 결장암으로부터 관찰된 침습 (전이)을 피하기 위해 적용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에서, PTP는 바람직한 표적 (병원체, 표적 세포)에 대항하여 소정 대상체의 면역계의 치료적 반응, 예를 들어 CD8+ T 세포 반응, 전형적으로 CD4+ T 세포 반응, 바람직하게 CD4+ 및 CD8+ T 세포 치료적 반응을 유발시키고, 질환, 바람직하게 암을 예방하거나 또는 치료하거나, 전형적으로 제어하기에 충분한 양으로 존재한다.
대상체가 포유동물, 바람직하게 인간인 경우에, 백신 조성물은 전형적으로 체중 1 kg 당 0.1 내지 10 mg의 PTP를, 임의로 체중 1 kg 당 0.1 내지 5 mg의 미세소포와 함께 포함한다.
본 명세서에서 기술된 치료적 면역 반응을 유도시킬 수 있는 생성물은 이를 필요로 하는 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간 대상체에게 생체 내에서 투여될 수 있다. 투여는 다양한 경로에 의해서, 예컨대 전신 주사, 예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내, 종양내, 피하 등에 의해서 수행될 수 있다.
치료적 면역 반응의 검출은 ELISA, ELISPOT, 지연형 과민성 반응, 세포내 사이토카인 염색, 및/또는 세포외 사이토카인 염색과 같은 기술 덕분으로 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예를 통해 더욱 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예 및 도면은 본 발명의 범주를 제한하려는 것으로서 임의 방식으로 해석되어서는 안된다.
도면
도 1: 종양 거부에서 초창기 번역 생성물 (PTP)의 역할.
A) (도 1a) 마우스에 MCA205 WT 종양 세포로, 또는 glob-인트론-SL8을 코딩하는 플라스미드, glob-엑손-SL8을 코딩하는 플라스미드 또는 오브알부민으로 형질감염된 MCA205를 피하 주사하였다. 각 그룹의 마우스 중 절반에게, 6일 또는 4일에 정맥내 OT1 세포를 주사하였다. 종양 크기를 20일까지 시간에 걸쳐 평가하였다. 데이타는 평균 ± SEM로 제공하였다. * p<0.05 (단측 스튜던트 t 검정).
B) (도 1b) 마우스에 B16F10 WT 종양 세포로, 또는 glob-인트론-SL8을 코딩하는 플라스미드, glob-엑손-SL8을 코딩하는 플라스미드, 또는 오브알부민으로 형질감염된 B16F10을 피하로 주사하였다다. 3일에, 각 그룹의 마우스 중 절반에게 정맥내 OT1 세포를 주사하였다. 종양 크기를 19일까지 시간에 걸쳐 평가하였다. 데이타는 평균 ± SEM으로 제공하였다. * p<0.05 (단측 스튜던트 t 검정).
C) (도 1c) 마우스에 CFSE로 표시된 2.106 OT1 세포를 정맥내 주사하였다. 3시간 후, WT 또는 플라스미드 glob-인트론-SL8 또는 glob-엑손-SL8 또는 Ova로 형질감염된 5.106 Hek 세포를 복강내 주사하였다. 3일 후, 림프절 및 비장으로부터 세포를 수집하였고 CD8 세포에서 CFSE 발현을 분석하였다. 점도표는 상이한 마우스에서 수득된 결과를 나타낸다.
도 2: 모든 PTP: 암-백신용 펩티드의 공급원
6마리 마우스의 그룹들을 125 ㎍ (PTP X1), 64 ㎍ (PTP X1/2), 32 ㎍ (PTP X1/4)의 PTP 또는 CpG+폴리 I:C (음성 대조군)에 유화시킨 8 ㎍ (SIINFEKL 1/25)의 SIINFEKL 에피토프 (MCA-205-Ova에 대한 양성 대조군 및 MCA-205 WT 세포에 대한 음성 대조군)로 백신접종하였다. 15일 이후에, 마우스의 우측 옆구리에 오브알부민을 발현하는 50.103 MCA-205 생세포 (A) 및 좌측 옆구리에 50.103 MCA-205 WT 생세포 (B) 를 피하로 접종하였다. 종양 성장은 각 종양 세포주에 대해서 7일마다 측정하였다. 각 선은 각 그룹의 6마리 마우스의 종양 크기 면적 (㎟)을 나타낸다.
도 3: 육종 세포주 유래의 특이적 PTP: 암-백신용 펩티드의 공급원.
6마리 마우스의 그룹들을 125 ㎍ (PTP-his X1), 64 ㎍ (PTP-his X1/2), 32 ㎍ (PTP-his X1/4)의 PTP 또는 CpG+ 폴리 I:C (음성 대조군)에 유화시킨 8 ㎍ (SIINFEKL 1/25)의 SIINFEKL 에피토프 (양성 대조군)로 백신접종하였다. 15일 이후에, 마우스의 우측 옆구리에 오브알부민을 발현하는 50.103 MCA-205 생세포 (A) 및 좌측 옆구리에 50.103 MCA-205 WT 생세포 (B)를 피하로 접종하였다. 종양 성장은 각 종양 세포주에 대해서 7일마다 측정하였다. 각각의 선은 각 그룹 내 6마리 마우스의 종양 크기 면적 (㎟)을 나타낸다.
도 4: PTP가 더해진 엑소솜: 신규한 암-백신.
A) (도 4a) FACS에 의한 MCA205-glob-인트론-SL8 세포로부터 정제된 엑소솜 중 CD9 및 CD81의 발현의 분석. 연회색은 미염색된 엑소솜이고 진회색은 WT 엑소솜이며 검은색은 glob-인트론-SL8-엑소솜이다.
B) (도 4b) 좌측 패널: BMDC (골수 수지상 세포 (bone marrow dendritic cell))를 MCA205 WT 또는 MCA205-glob-인트론-SL8로부터 정제된 엑소솜으로 펄싱하였다. 그들을 수집하고 OT1 세포와 배양하였다. IL-2m을 검출하기 위해 ELISA를 수행하였다. 데이타는 평균 ± SEM으로 제공하였다. 우측 패널: 엑소솜을 BMDC의 부재 하에서 OT1 세포에 첨가하였다. 적어도 18시간 이후 상청액에 생성된 mIL-2의 분량을 ELISA로 평가하였다. 데이타는 평균 ± SEM으로 표시하였다.
C) (도 4c) MCA205 세포 및 엑소솜 상에서 25D1 항체를 사용한 SIINFEKL 발현의 FACS 분석. 좌측 패널에서, 파선은 미염색된 MCA205 세포이고, 연회색은 WT MCA205이고 흰색은 Glob-인트론-SL8 구성체를 발현하는 MCA205 세포이다. 우측 패널에서, 연회색은 미염색된 엑소솜이고, 진회색은 MCA205 세포로부터 정제된 엑소솜이고 검은색은 Glob-인트론-SL8 구성체를 발현하는 MCA205 세포로부터 정제된 엑소솜이다.
D) (도 4d) 6마리 마우스의 그룹들을 64 ㎍ (PTP-his X1/2), 32 ㎍ (PTP-his X1/4)의 종양-유래된 PTP, 또는 64 ㎍ (PTP-his X1/2), 32 ㎍ (PTP-his X1/4)의 종양-유래된 PTP에 더해진 15 ㎍의 PTP를 함유하는 종양-유래된 엑소솜, 또는 양성 대조군으로서 CpG+폴리 I:C에 유화된 8 ㎍ (SIIN 1/25)의 SIINFEKL 에피토프로 백신접종하였다. 15일 이후에, 마우스의 우측 옆구리에 오브알부민을 발현하는 50.103 MCA-205 생세포를 피하로 접종하였다. 종양 성장은 7일마다 각 종양 세포주에 대해 측정되었다. 각각의 선은 각 그룹의 6마리 마우스의 종양 크기 면적 (㎟)을 나타낸다.
도 5: PTP 암-백신을 개선시키기 위한 CD4 에피토프의 첨가.
6마리 마우스의 그룹들을 64 ㎍ (PTP-his X1/2)의 종양-유래된 PTP, 또는 64 ㎍ (PTP-his X1/2) 종양-유래된 PTP에 더해진 1 mg의 정제된 오브알부민, 또는 양성 대조군으로서 8 ㎍ (SIIN 1/25)의 CpG+폴리 I:C에 유화된 SIINFEKL 에피토프로 백신접종하였다. 15일 이후에, 마우스의 우측 옆구리에 오브알부민을 발현하는 50.103 MCA-205 생세포, 및 좌측 옆구리에 50.103 MCA-205 WT 생세포를 피하로 접종하였다. 종양 성장을 각 종양 세포주에 대해서 7일마다 측정하였다. 각 선은 각 그룹의 6마리 마우스의 종양 크기 면적 (㎟)을 의미한다.
도 6: 오브알부민 cDNA 및 β-글로빈 유전자의 인트론 서열에서 SL8 항원성 에피토프의 상이한 위치를 예시하는 도면.
도 7 : 흑색종 세포주 유래의 특이적 PTP: 암-백신용 펩티드의 공급원.
6마리 마우스의 그룹들을 32 ㎍ 또는 16 ㎍의 PTP-His 또는 CpG + 폴리 I:C (음성 대조군)에 유화된 8 ㎍의 SIINFEKl 에피토프 (양성 대조군)로 백신접종하였다. 15일 이후에, 마우스의 우측 옆구리에 마트리겔(matrigel)과 함께 오브알부민을 발현하는 30.103 B16F10 생세포 (A) 및 좌측 옆구리에 30.103 B16F10 WT 생세포 (B)를 피하로 접종하였다. 종양 성장을 각 종양 세포주에 대해 3 내지 4일마다 측정하였다. 각각의 선은 각 그룹의 6마리 마우스의 종양 크기 면적 (㎟)을 의미한다.
도 8: 흑색종 세포주 유래의 엑소솜이 더해진 PTP.
6마리 마우스의 그룹들을 16 ㎍의 PTP-His, 15 ㎍의 B16F10 세포로부터 유래된 엑소솜, 또는 CpG + 폴리 I:C (음성 대조군)에 유화된 15 ㎍ 엑소솜과 함께 PTP-His 16 ㎍으로 백신접종하였다. 15일 이후에, 마우스의 우측 옆구리에 마트리겔과 함께 오브알부민을 발현하는 30.103 B16F10 생세포 (A) 및 좌측 옆구리에 30.103 B16F10 WT 생세포 (B)를 피하로 접종하였다. 종양 성장울 각 종양 세포주에 대해서 3 내지 4일마다 측정하였다. 각 선은 각 그룹의 6마리 마우스의 평균 종양 크기 면적 (㎟)을 의미한다.
도 9: 흑색종 세포주 유래 멜라노솜이 더해진 PTP
A) (도 9a) BMDC를 B16F10-glob-인트론-SL8 세포로부터 정제된 멜라노솜으로 펄싱하였다. 이어서, BMDC를 16시간 동안 SL8-특이적 CD8+ T-세포 하이브리도마 (B3Z)와 공동배양하였고 T-세포 활성화는 β-갈락토시다제를 측정하여 평가하였다. B) (도 9b) 및 C) (도 9c) 6마리 마우스의 그룹을 32 ㎍의 PTP-His 또는 CpG + 폴리 I:C (음성 대조군)에 유화된 30 ㎍의 B16F10로부터 유래된 멜라노솜으로 백신접종하였다. 15일 이후, 마우스의 우측 옆구리에 마트리겔과 함께 오브알부민을 발현하는 30.103 B16F10 생세포 (B) 및 좌측 옆구리에 30.103 B16F10 WT 생세포 (C)로 피하로 공격하였다. 종양 성장을 각 종양 세포주에 대해서 3 내지 4일 마다 측정하였다. 각 선은 각 그룹의 6마리 마우스의 평균 종양 크기 면적 (㎟)을 나타낸다.
본 출원 전반에서, 다양한 참조 문헌들은 본 발명이 속하는 분야의 기술 수준을 설명한다. 이들 참조문헌의 개시는 본 개시에 참조로 편입된다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 본 출원의 범주를 제한하려는 것이 아니라 예시로서 간주되어야 하는 하기의 실시예 부문에서 제공된다 (도 1 내지 6을 참조함).
실험 부분
실시예 1 - 엑소솜과 조합한 초창기 번역 생성물 (PTP): 새로운 암 백신.
재료 및 방법
세포 배양
MCA 205 마우스 육종 세포주는 표준 조건 하에 1% 글루타민, 1% 피루베이트, 1% 비필수 아미노산 및 10% FBS (Life Technologies)의 존재 하에서 RPMI 1640 배지 (Life Technologies) 중 5% CO2 하의 37℃에서 배양하였다. B16F10 (C57BL/6J 마우스와 동계)는 10% FCS, 2 mM L-글루타민 및 100 IU/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다.
MCA 205 및 B16F10 세포는 PTP의 정제를 위한 제조사의 프로토콜 (Ozyme)에 따라서 JetPrime을 사용하여 YFP-글로빈-인트론-SL8-his 플라스미드로 형질감염시켰다. 종양 거부 실험의 경우, 안정한 MCA 205-Ova 및 안정한 B16F10-Ova 세포를 제조하였다. 안정한 MCA 205-Ova는 표준 조건 하에 RPMI 1640 중에서 배양하였다. 오브알부민 단백질을 안정하게 발현하는 안정한 B16F10-Ova 세포는 표준 조건 하에 DMEM 중에 배양하였다.
동물 실험
C57Bl/6J 마우스는 Harlan에서 수득하였다. OT1 C57Bl/6J 마우스는 CERFE (C.Daviaud)가 관대히 제공해 주었고 구스타브 루시 (Gustave Roussy) 동물 시설에서 교배되었다. 7주령 C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리에 피하로 0.1 x 106 MCA205 또는 B16F10 종양 세포를 접종하였다. MCA205의 경우, 종양이 대략 20 ㎟ 크기에 도달했을 때, 마우스에 0.1 x 106 OT1 세포를 정맥내로 주사하였다. B16F10 모델에서, 0.2 x 106 OT1 세포를 종양 접종 이후 3일에 정맥내로 접종하였다. 모든 동물 실험은 프랑스 및 유럽의 법 및 규제를 준수하여 수행되었다.
PTP-his 정제
형질감염된 MCA 205 또는 B16F10 종양 세포를 10 mL의 6 M 구아니듐-HCl, 0.01 M Tris/HCl, pH 8.0, 5 mM 이미다졸 및 10 mM β-머캅토에탄올에서 초음파처리하였다. 다음으로, 용해물을 Ni2+-NTA-아가로스 비드 (Qiagen)와 4시간 동안 RT에서 인큐베이션시키고 회전시켰다. 비드를 연속하여 5분 동안 RT에서 8 mL의 각각의 하기의 완충액으로 세척하였다: 6M 구아니듐-HCl, 0.01 M Tris/HCl, pH 8.0 및 10 mM β-머캅토에탄올; 6 M 우레아, 0.01 M Tris/HCl, pH 8.0 및 10 mM β-머캅토에탄올; 6 M 우레아, 0.01 M Tris/HCl, pH 6.8, 10 mM β-머캅토에탄올 및 0.2% Triton X-100; 6 M 우레아, 0.01 M Tris/HCl, pH 6.8 및 10 mM β-머캅토에탄올; 6 M 우레아, 0.01 M Tris/HCl, pH 6.8, 10 mM β-머캅토에탄올 및 0.1% Triton X-100. 이후에, PTP를 비드에서 20분 동안 RT에서 400 mM 이미다졸, 0.15 M Tris/HCl, pH 6.8, 30% 글리세롤, 0.72 M β-머캅토에탄올 및 5% SDS 중에서 인큐베이션하여 용리시켰다. 용리물을 투석 튜브 MWCO 0.5kD (VWR)를 사용하여 밤새 RT에서 PBS 중에 투석하였다. 마지막으로, 용리물을 브래드포드(Bradford) 어세이 (ThermoFisher)에 의해 정량하였다.
모든 PTP 정제
다음으로, MCA 205 종양 세포를 10 mL의 6 M 구아니듐-HCl, 0.01 M Tris/HCl, pH 8.0, 5 mM 이미다졸 및 10 mM β-머캅토에탄올에서 용해시킨 후 초음파처리하였다. 용해물을 정제하였고 폴리펩티드를 3 kDa 원심분리 필터 (Merck Millipore)를 사용하여 농축하였다. 이 컬럼을 90분 동안 3000 g에서 원심분리하여 PTP의 정의인, 소형 폴리펩티드가 정제되도록 하였다. 하층부를 PBS 중에서 투석 튜브 MWCO 0.5 kDa (VWR)를 사용하여 밤새 RT에서 투석하였다. 마지막으로, 용리물을 브래드포드 어세이 (ThermoFisher)로 정량하였다.
고형 종양으로부터 펩티드 추출
고형 종양 붕해는 얼음 상에서 0.22 μm 세포 스트레이너를 사용해 물질을 부수어서 수행하였다. 가용화는 조직 중량의 10배로 1x SDS 완충액 (0.125 M Tris-HCl (pH 6.8), 2% 소듐 도데실 설페이트, 10% 글리세롤, 5% 2-머캅토에탄올)을 첨가하여 수행하였다. 붕해된 조직은 70℃에서 인큐베이션시켰고 1 400 rpm에서 10분간 진탕시켰다. 다음으로, 고형 조직을 침강시키고 제거하기 위해 13 200 g에서 5분간 RT에서 원심분리시켰다. D-Tube™ 투석기 (MerckMillipore)를 사용하여 5 kDa의 분자량 컷오프로 펩티드를 정제하고 농축하였다. 원심분리는 3 000 g에서 1시간 30분간 수행하였다. 마지막으로, 펩티드 농도는 BCA 단백질 어세이 키트 (Pierce)를 사용해 측정하였다.
백신접종
MCA205 세포에 대한 백신을 다음의 그룹에 따라서 제조하였다: PTP-his x1 (128 ㎍), PTP-his x1/2 (64 ㎍), PTP-his x1/4 (32 ㎍) -/+ 엑소솜, 엑소솜 (MCA 형질감염된 세포로부터 정제 (15 ㎍)), PTP-his x1/2 (64 ㎍) -/+ (1 mg/50㎕/마우스) 오브알부민 단백질 (Calbiochem), 모든 PTP x1 (128 ㎍), 모든 PTP x1/2 (64 ㎍), 모든 PTP x1/4 (32 ㎍), CpG (20 ㎍) (Invivogen) 및 폴리(I:C) (50 ㎍) (Invivogen), PBS (300 ㎕ 이하). 백신을 주사 전 2시간에 제조하여 얼음에 유지시켰다. 백신접종 이전에, C57BL/6 마우스를 3% 이소플루란으로 마취시켰다. 백신을 다리 (150 ㎕/다리) 및 족저부 (50 ㎕/발)에 피하로 주사하였다. 2주 이후에, 50*103 MCA 205 종양 세포 (우측 옆구리) 및 MCA 205 OVA 종양 세포 (좌측 옆구리)의 피하 주사를 제공하였다. 1주가 되면, 종양 크기가 300 ㎟에 도달할 때까지 종양 크기를 측정하였다.
B16F10 세포에 대한 백신을 다음의 그룹에 따라서 제조하였다: 32 ㎍ 또는 16 ㎍의 PTP-His, 엑소솜 (B16F10 형질감염된 세포로부터 정제, 15 ㎍), 멜라노솜 (B16F10 세포로부터 정제, 30 ㎍) 또는 8 ㎍의 SIINFEKL 에피토프 (양성 대조군), CpG (20 ㎍) (Invivogen) 및 폴리(I:C) (50 ㎍) (Invivogen). 백신을 주사 전 2시간에 제조하여 얼음에 유지시켰다. 백신접종 이전에, C57BL/6 마우스를 3% 이소플루란으로 마취시켰다. 백신을 다리 (150 ㎕/다리) 및 족저부 (50 ㎕/발)에 피하로 주사하였다. 2주 이후에, 30x103 B16F10 종양 세포 (우측 옆구리) 및 B16F10 OVA 종양 세포 (좌측 옆구리)의 피하 주사를 제공하였다. 1주가 되면, 종양 크기가 300 ㎟에 도달할 때까지 종양 크기를 측정하였다.
결과
종양 거부에서 초창기 번역 생성물 (PTP)의 역할
지난 십년간, PTP 및 DRiP는 내생성 MHC 클래스 I 경로에 대한 펩티드의 주요 공급원으로 제안되어 왔다. 특이적 CD8+ T 세포 항-종양 면역 반응을 매개하는데서 PTP의 역할을 정확하게 정의하기 위해서, 발명자는 2종의 상이한 종양 모델: 그들의 상이한 구성체를 안정하게 발현하는 MCA 육종 모델 및 B16F10 흑색종 모델을 사용해 개별 C57BL/6 마우스에 접종하였다 (도 6 참조). MCA 모델의 경우, 105 종양 세포를 C57BL/6 마우스에게 피하로 주사하였다. 다음으로, 종양을 대략 20 ㎟ 까지 성장할 수 있게 두었다. 이 시점에, 105 나이브 Ova-특이적 TCR-유전자이식 CD8+ OT-1 T 세포를 마우스에게 양자적으로(adoptively) 전달하였다. 이어서, 종양 성장을 2일마다 모니터링하여 기록하였다. 14일 이후, 발명자는 OT-1 T 세포의 양자적 전달이 Glob-인트론 또는 Glob-엑손 상황에서 SIINFEKL/SL8 에피토프를 독립적으로 안정하게 발현하는 MCA 종양의 발생을 방지한다는 것을 관찰하였다 (도 1a, 아래 및 위 패널). 그리고, 예상한 바와 같이, OT-I T 세포의 양자적 전달은 SL8-음성 MCA 종양의 성장을 방지하지 못하여 (도 1a, 아래 및 위 패널) 종양 세포주에서 발현된 항원에 대한 CD8+ T 세포의 특이적 인식을 확증해 주었고 항-종양 반응을 유도시 PTP의 특이적 역할을 확증해 주었다. B16F10 모델의 경우, 105 종양 세포를 C57BL6 마우스에 피하로 주사하였다. 3일 이후에, 105 나이브 Ova-특이적 TCR-유전자이식 OT-1 세포를 마우스에게 양자적으로 전달하였다. MCA 모델과 유사하게, OT-I T 세포의 양자적 전달은 한편으로 인트론 또는 엑손 서열에서 SIINFEKL/SL8 에피토프를 안정하게 발현하는 B16F10 종양의 발생을 방지하고 (도 1b, 위 및 아래 패널), 다른 한편으로는 SL8-음성 B16F10 종양의 성장을 방지하지 않아서 (도 1b, 위 및 아래 패널) 역시 PTP가 특이적 항-종양 반응을 유도한다는 아이디어를 뒷받침해주었다.
게다가, 마지막으로 PTP가 생체내 모델에서 교차 프라이밍에 기여할 수 있다는 것을 결론짓기 위해서, HEK-293 세포를 상이한 구성체로 형질감염시켰고 3시간 앞서서, CFSE로 염색된 나이브 OT-I CD8+ T 세포를 받은 CD45.1 유사유전자형 C57Bl/6 마우스에 피하 주사하였다. 엑손 및/또는 인트론 서열로부터 발현되는, PTP가 교차 프라이밍에 기여한다면, 그들은 CFSE 형광발광의 기간 동안 축소가 보일 것으로 예상되어, CD8+ OT-I T 세포의 증식을 입증한다. 도 1c에 도시된 바와 같이, 접종 3일 후, PTP는 HEK-293 세포가 오직 빈 벡터로만 형질감염된 경우 및 CD8+ OT-1 T 세포가 접종과 동일 시간 동안 증식되지 않은 경우의 음성 대조군과 비교하여 CD8+ OT-I T 세포 분열을 유도하였다. HEK-293 세포가 인간 기원이므로, 그들은 쥣과동물 CD8+ OT-1 T 세포에 대해서 직접적으로 PTP로부터 비롯된 항원을 직접적으로 제시할 수 없다. 그러므로, CD8+ T 세포의 증식은 PTP의 교차 프라이밍을 통해서만 일어날 수 있고, 종양 거부 결과를 뒷받침한다.
이들 결과는 PTP가 특이적 항원 종양 거부를 촉진하여 생체내에서 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 입증한다. 뿐만 아니라, 이들 결과는 내생성 경로에 대한 항원성 펩티드의 주요 공급원으로서 사용되는 것 이외에도, 또한 MHC 클래스 I 외생성 경로에 대한 외생성 펩티드의 공급원일 수도 있다는 것을 보여준다.
종양 폴리펩티드: 암-백신용 펩티드의 공급원
동시에 암 백신에 대한 주요 공급원으로서 MHC 클래스 I 에피토프를 보유하는 폴리펩티드의 특이적 역할을 확증하기 위해서, 발명자는 WT 종양 세포주로부터 PTP를 정제하였다. 그 목적을 위해서, MCA205 WT 종양 세포주를 용해시켰고 PTP의 정의로서, 5 kDa 또는 5 kDa 미만의 모든 폴리펩티드를 발명자의 관심 구성체로부터 비롯된 PTP에 대해 이전에 기술된 바와 같이, 정제하였고 마우스에서 백신으로 사용하였다. 6마리 마우스의 상이한 그룹들을 상이한 농도의 PTP, 또는 보조제 그 자체 (음성 대조군)로 백신접종하였다. 2주 후에, 오브알부민 구성체를 발현하거나 또는 발현하지 않는 50.104 MCA205 종양 세포를 마우스의 우측 옆구리 (MCA-205 Glob-인트론-SL8) 및 좌측 옆구리 (MCA-205 WT)에 피하 주사하였다. 발명자의 데이타는 종양 세포주의 핵 구획으로부터 정제된 5 kDa 또는 5 kDa 미만의 폴리펩티드가 종양이 발명자의 특이적 모델 에피토프를 발현하건 하지 않건 독립적으로 동일 종양의 결함을 유도할 수 있다는 것을 의미한다 (도 2a 및 2b).
동시에, 수 주 동안 마우스에서 성장시킨 고형 종양 유래의 폴리펩티드를 정제하였다. 고형 종양을 붕해시키고 나서, PTP를 함유하는 폴리펩티드를 5 kDa의 컷오프로 정제하였다. 정제된 폴리펩티드를, 이들 폴리펩티드가 정제된 동일한 종양 세포주로 2주 이후에 마우스에 접종할 백신으로서 사용하였다. 발명자의 데이타는 고형 종양으로부터 정제된 폴리펩티드가 발명자의 특이적 모델 에피토프를 종양이 발현하거나 또는 발현하지 않건 독립적으로 동일 종양의 결함을 유도할 수 있다는 것을 의미한다.
이들 실험은 종양 성장에 대한 상이한 길이의 종양-유래된 폴리펩티드로 구성된 백신으로서 특이적 효과를 밝혀주었고, PTP가 특이적 항-종양-T 세포 반응을 유발시키기 위한 백신으로서 사용될 수 있다는 아이디어를 뒷받침해준다.
PTP: 암-백신용 펩티드의 공급원
이 실험에서, 백신으로서 사용하기 전에, 육종 MCA205 및 흑색종 B16F10 세포주로부터 정제된 PTP를, 백신을 구성하는 상이한 폴리펩티드의 성질을 보다 면밀하게 조사하기 위해 질량 분광분석법으로 분석하였다. 표 1에 표시된 바와 같이, 백신은 상이한 길이의 상이한 폴리펩티드로 이루어진다.
표 1: MCA205 세포에 의해 생성된 엑소솜으로부터 유래된 펩티드의 질량 분광분석법 분석법. 인트론 서열로부터 유래된 SIINFEKL 펩티드에 상응하는 펩티드를 강조하였다.
SL8 에피토프는 나이브 Ova-특이적 TCR-유전자이식 CD8+ OT-1 T 세포에 의해 세포 표면에서 인식되어지고 결과적으로 특이적 CD8+ T 세포의 증식 및 종양 거부를 유도하게 되는 에피토프이다.
실험의 이전 부분에서, 발명자는 특이적 CD8+ T 세포의 도움으로 그들 PTP를 발현한 종양 세포의 종양 거부를 살펴보았고, 한편 실험의 이 부분에서 그들은 예방법적 방식으로 그들의 종양-유래된 PTP로 백신접종된 마우스가 백신접종되지 않은 마우스와 비교시 종양 성장의 결함을 보여주어, PTP가 백신으로서 종양 성장 결함 및 특이적 CD8+ T 세포 면역 항-종양 반응을 유도할 수 있다는 가설을 뒷받침하는 것을 입증하고자 하였다.
그 목적을 위해서, 6마리 마우스의 상이한 그룹을 상이한 농도의 PTP, 또는 보조제 그 자체 (음성 대조군), 또는 동일한 보조제에 유화된 SL8 에피토프 (양성 대조군)로 백신접종하였다. 이들 PTP는 Glob-인트론-SL8-His 구성체로 이전에 형질감염시킨 마우스 종양 세포주로부터 정제되었다. 2주 후에, 정제된 PTP와 동일한 PTP를 발현하는 형질감염된 MCA205 종양 세포주 유래의 50.104 세포를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 마우스의 좌측 옆구리에 50.104 야생형 MCA205 종양 세포를 유사하게 접종하였다. 발명자 데이타는 PTP가 야생형 (WT) 종양 세포주로부터가 아니라 PTP를 발현하는 종양 세포주로부터 종양 성장의 결함을 유도할 수 있다 (도 3a 및 3b)는 것을 의미하여, PTP 백신의 특이적 항-종양 효과가 입증되었다.
모든 이들 실험은 종양 성장에 대한 PTP의 특이적 효과를 밝혀주었고, PTP가 예방법적 및 치료적 방식으로 특이적 항-종양-T 세포 반응을 유발시키기 위해 마우스에서 백신으로서 사용될 수 있다는 개념을 뒷받침해준다.
PTP 및 엑소솜: 신규한 암-백신
발명자는 최근에 PTP가 전체 길이 단백질보다 MCH 클래스 I 교차 제시를 위한 보다 나은 펩티드 공급원이라는 것을 입증하였다. 발명자는 이제 소포체에 저장시 PTP가 더 나은 교차 제시를 가능하게 한다는 것을 보고한다. 사실 대부분의 세포에 의해 방출될 수 있는 세포하 분획은, 400 nm 미만일 때, 미세소포 또는 엑소솜 (30-100 nm)이라고 불린다. 이러한 아이디어에 따라서, 발명자는 PTP 전달이 도너 세포로부터 분비된 엑소솜에 의해 매개되고 골수 수지상 세포 (BMDC)에 의해 내재화된다고 가정하였다. MCA 205 세포주 유래의 엑소솜은 이전 보고서에 따라서 정제되었다. 정제된 물질이 엑소솜이라는 것을 확증하기 위해, FACS 분석을 수행하였다. 도 4a는 엑소솜의 일반적인 마커인 상이한 표면 단백질 CD9 및 CD81의 존재를 밝혀주어서, 상이한 세포주로부터 정제된 미세소포가 엑소솜이라는 것이 확증되었다. 다음으로, 이들 엑소솜을 직접적으로 BMDC 상에서 펄싱하였다. 도 4b (좌측 패널)는 MCA 205 종양-유래된 엑소솜을 삼킨 BMDC가 CD8+ OT-1 T 세포를 활성화시킬 수 있는 것을 보여준다. 엑소솜 정제된 분획은 Kb 분자를 내생적으로 발현하는 세포주인 MCA 종양 세포주에서 유래되었으므로, 발명자는 이 세포주 유래의 엑소솜이 CD8 + OT-1 T 세포를 직접적으로 활성화시키는지 여부가 궁금하였다. 유래된-MCA 엑소솜을 CD8 + OT-1 T 세포 상에서 직접적으로 펄싱하였다. T 세포의 활성화가 엑소솜의 첨가 이후에 확인되지 않았다 (도 4b, 우측 패널). 사실, 그들이 항-Kb 항체를 사용하여, FACS 분석에 의해 MHC 클래스 I Kb 분자의 발현을 조사했을 때, 그들은 예상한대로, 마우스 세포주의 세포 표면 상에서 Kb 분자를 검출할 수 있었고 동시에 그들은 엑소솜의 세포 표면 상에서는 Kb 분자를 검출할 수 없어서 (도 4c), CD8+ OT-1 T 세포를 활성화시킬 수 없다는 사실이 뒷받침되었다.
그래서 백신 디자인의 다음 단계는 PTP-기반 암 백신에, PTP가 정제된 동일한 종양 세포주의 엑소솜을 포함시켰다. 그 목적을 위해서, 발명자는 보조제 중 수 시간 동안 동일 종양 유래의 엑소솜과 MCA-205-Glob-인트론-SL8으로부터 정제된 PTP를 인큐베이션시켰다. 이어서, 6마리 마우스의 상이한 그룹을 상이한 농도의 PTP로, 엑소솜 (15 ㎍)과 함께 또는 없이, 또는 보조제 그 자체 (음성 대조군), 또는 동일 보조제에 유화된 SL8 에피토프 (양성 대조군)로 백신접종하였다. 발명자의 데이타는 종양-유래된 엑소솜과 종양-유래된 PTP로 구성된 백신이 종양-유래된 PTP로만 구성된 백신 (도 4d, 사각 선)보다 PTP로서 SL8 에피토프를 발현하는 종양 세포주 (MCA Ova 종양 세포)로부터의 종양 성장 (도 4d, 교차선)에서 더 나은 결함을 유도한다는 것을 의미한다.
PTP 암 백신을 개선시키기 위한 CD4 에피토프의 첨가
상기 결과로부터, 발명자는 PTP에 도입되고 엑소솜에서 확인되는 MHC 클래스 I 펩티드가 특이적 항-종양 반응을 마우스에서 유도한다는 것을 보여주었다. 그럼에도 백신접종 및 특히 암 치료에서의 주요 목표는 그것의 재발을 피하는 것이다. 그리고 이러한 재발을 피하기 위해서, 장기간 지속되는 면역성을 유도시키는 것이 필수적이다. CD4+ T 세포는 특이적 항-종양 CD8+ T 세포의 생명을 개시시키고 연장시킬 수 있고 더 나아가서 종양 부위에서 전문적인 항원 제시 세포 (pAPC)의 축적을 유도시키는 것이 잘 확립되어 있다. 이러한 축적은 종양에 의해 생성된 PTP가 전체 길이 단백질보다 pAPC에 의해 제시되는 MHC 클래스 I 경로에 대한 보다 양호한 공급원이므로 이득일 수 있다. 모든 그러한 이유로, 동일한 유전자 유래의 전체 길이 단백질과 조합하여 PTP로 구성된 백신을 사용하였다. 6마리 마우스의 상이한 그룹을 개별적으로 PTP 단독, 또는 단백질 오브알부민과 조합하여, 또는 보조제 그 자체 (음성 대조군), 또는 동일한 보조제에 유화된 SL8 에피토프 (양성 대조군)로 백신접종하였다. 발명자 데이타는 전체 길이 단백질과 조합하여 종양-유래된 PTP로 구성된 백신이 종양-유래된 PTP만으로 구성된 백신 (도 5, 사각 선)보다 PTP로서 SL8 에피토프를 발현하는 종양 세포주 (MCA Ova 종양 세포)로부터 종양 성장의 더 나은 결함 (도 5, 교차)을 유도하고 WT 종양 세포주의 성장에는 효과를 볼 수 없다는 것을 의미하여, 이는 PTP-전체 길이 단백질 백신의 특이적 항-종양 효과를 입증하는 것이고, 형질전환된 세포에 대한 더 나은 면역 반응을 위해서, 보다 양호하고 장기간 지속되는 항-종양 면역 반응을 유도하기 위해 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 활성화시키는 펩티드를 백신 중에 조합하는 것이 바람직하다는 것을 뒷받침하는 것이다.
실시예 2 - 흑색종에 대항한 백신
흑색종에 대한 PTP-기반 백신:
발명자는 육종 세포주 예컨대 MCA205로부터 정제된 PTP가 예방법적 방식으로 특이적 항-종양-T 세포 반응을 유발시키기 위한 백신으로서 마우스에서 사용될 수 있다는 것을 실시예 1에서 확인하였다. 항-암 백신으로서 PTP가 적합하다는 그들의 아이디어를 확대하기 위해서, 그들은 다른 유형의 암을 조사하였다. 그 목적을 위해서, 발명자는 흑색종 세포주 예컨대 쥣과동물 B16F10 세포주로부터 PTP를 정제하였다. 다음으로, 6마리 마우스의 상이한 그룹을 상이한 농도의 PTP, 보조제 그 자체 (음성 대조군), 또는 동일한 보조제에 유화된 SL8 에피토프 (양성 대조군)로 백신접종하였다. 이들 PTP는 발명자의 Glob-인트론-SL8-His 구성체로 이전에 형질감염시킨 마우스 B16F10 종양 세포주로부터 정제되었다. 2주 이후에, 정제된 것과 동일한 PTP를 발현하는 형질감염된 B16F10 종양 세포주 유래의 50.104 세포를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 마우스의 좌측 옆구리에 50.104 야생형 B16F10 종양 세포를 유사하게 접종하였다.
발명자의 데이타는 PTP는 야생형 (WT) 흑색종-종양 세포주가 아닌 PTP를 발현하는 흑색종 종양 세포주로부터의 종양 성장의 결함을 유도할 수 있다는 것을 의미하여, 이는 PTP 백신의 특이적 항-종양 효과를 입증한다 (도 7a 및 7b).
모든 이들 실험은 임의의 종양 성장 아형에 대한 PTP의 특이적 효과를 밝혀주었고, PTP가 예방법적 및 치료적 전략으로 특이적 항-종양-T 세포 반응을 유발시키기 위해 마우스에서 백신으로서 사용될 수 있다는 아이디어를 뒷받침한다.
흑색종에 대한 PTP-엑소솜 기반 백신:
발명자는 종양-유래된 엑소솜이 PTP를 함유하고, 이들 엑소솜은 암 백신으로서 사용하려는 그들이 종양 세포주로부터 정제된 PTP와 연합될 수 있다고 이전에 보고하였다. Glob-인트론-SL8 구성체를 발현하는 B16F10 세포주 유래의 엑소솜을 이전 보고서에 따라 정제하였다. 발명자는 보조제 중에 수 시간 동안 동일 종양 유래의 엑소솜과 B16F10-Glob-인트론-SL8로부터 정제된 PTP를 인큐베이션시켰다. 다음으로, 6마리 마우스의 상이한 그룹을 상이한 농도의 PTP로, 엑소솜 (15㎍)과 함께 또는 없이, 또는 보조제 그 자체 (음성 대조군), 또는 동일한 보조제에 유화된 SL8 에피토프 (양성 대조군)로 백신접종하였다. 발명자의 데이타는 종양-유래된 엑소솜과 종양-유래된 PTP로 구성된 백신이 종양-유래된 엑소솜만으로 구성된 백신 (도 8a, 원형 검은색 선)보다 PTP로서 SL8 에피토프를 발현하는 종양 세포주 (B16F10 Ova 종양 세포)로부터 더 나은 결함 (도 8a, 사각형 선)을 유도한다는 것을 의미한다. 이들 결과로부터 PTP를 함유하는 흑색종 세포주로부터의 종양-유래된 엑소솜은 MCA 205-유래된 엑소솜을 사용해 발명자가 확인한 것과 비교하여, 약한 특이적 면역 반응을 자극한다. 사실, 종양-유래된 PTP 및 종양-유래된 엑소솜의 조합은 그 효과가 완전한 종양 거부를 유도하기에 충분하지 않더라도 종양 성장 결함을 유도하는데서는 더 강력하다. 발명자의 데이타는 또한 흑색종 세포주로부터 정제된 엑소솜 및 PTP의 조합이 야생형 (WT) 종양 세포주가 아니라 PTP를 발현하는 종양 세포주로부터의 종양 성장에 약한 결함을 유도할 수 있다는 것을 의미하며 (도 8a 및 8b 비교), 이는 PTP-엑소솜 기반 백신의 특이적 항-종양 효과를 입증한다.
흑색종에 대한 PTP-멜라노솜 기반 백신:
흑색종 세포주 유래 엑소솜은 종양 성장에서 약한 결함을 유도하므로, 발명자는 흑색종 세포주가 방출하는 다른 소포체가 종양 성장에 대해 육종 엑소솜과 동일한 효과를 가질 수 있다고 가정한다. 흑색종 세포주는 엑소솜뿐만 아니라 멜라노솜을 분비하는 능력을 갖는다. 사실 멜라노사이트는 멜라노솜이라고 불리는 세포소기관에 저장되는 멜라닌 색소의 생성에 특수화되어 있다 (Raposo and Marks, 2007). 멜라노솜은 조직-특이적 리소솜-관련 세포소기관이고 (Raposo and Marks, 2007), 형태학 및 색소형성 수준을 기반으로 2개의 주요한 성숙화 단계로 분류된다 (Watabe, Kushimoto et al., 2005). 미성숙 (단계 I 및 II) 멜라노솜은 색소가 결여되어 있고 중심 세포질에 위치되며, 이들을 "조기 멜라노솜"이라고 한다. 성숙한, 심하게 색소형성된 멜라노솜 (단계 III 및 IV) 또는 "성숙한 멜라노솜"은 그들 분비의 주요 부위인, 원위 수지상 조직에서 우세하다.
발명자가 육종 엑소솜으로부터 보고한 바와 같이 PTP 전달이 흑색종 도너 세포로부터 분비된 멜라노솜에 의해 매개될 수 있고 골수 수지상 세포 (BMDC)에 의해 내재화될 수 있다는 아이디어를 따르기 위해서, B16F10 세포주로부터 분비된 멜라노솜을 이전 보고에 따라 정제하였다. 다음으로, 이들 멜라노솜을 BMDC 상에서 직접적으로 펄싱하였다. 도 9a는 B16F10 종양-유래된 멜라노솜이 삼킨 BMDC가 세포 표면에서 MHC 클래스 I Kb/SIINFEKL 복합체를 인식하는데 특이적인 B3Z 하이브리도마 세포주를 활성화시킬 수 있다는 것을 보여준다. 발명자는 다음으로 발명자가 이들 분비된 멜라노솜 내부에서 해당 PTP를 검출할 수 있는지 여부를 시험하였다. 그 목적을 위해서 발명자는 6xHis-태그가 인트론 내 SL8 에피토프 옆에 삽입된 B16F10 세포에서 구성체를 발현시켰다. 다음으로, 발명자는 니켈 아가로스 비드를 사용하여 정제 및 초음파처리된 분비된 단계 IV 멜라노솜 유래의 PTP를 농축하였고 이들 분획에 대해서 LC-MS/MS 질량 분광분석법 분석을 수행하였다. 표 2는 SL8 에피토프를 보유하거나, 또는 보유하지 않는 상이한 펩티드 단편을 보여준다. MS 분석을 통해 검출하려는 인트론-유도된 PTP의 충분한 농도를 충분히 산출하기 위해 농축 단계가 요구되었다는 것을 강조할만하다. 이것은 내생성 경로에 대한 탁월한 기질임에도 불구하고, PTP가 희귀한 생성물이라는 이전의 관찰과 일치한다.
표 2: Glob-인트론-SL8 구성체에 의해 형질감염된 B16F10 세포에 의해 생성되는 멜라노솜으로부터 유래된 펩티드의 질량 분광분석법 분석. 인트론 서열로부터 유래된 SIINFEKL 펩티드에 상응하는 펩티드가 강조되어 있다.
더욱이, 발명자는 상기 본 명세서에 기술된 바와 같은 PTP-기반 암 백신에, B16F10 멜라노사이트 유래의 정제된 분비된 단계 IV 멜라노솜을 포함시켰다. 그 목적을 위해서, 6마리 마우스의 상이한 그룹을 개별적으로, 30 ㎍의 분비된 단계 IV 멜라노솜, 16 ㎍의 B16F10-Glob-인트론-SL8로부터 정제된 PTP 및 보조제 그 자체 (음성 대조군)로 백신접종하였다.
발명자의 데이타는 단계 IV의 종양-유래된 멜라노솜으로 구성된 백신이 단지 종양-유래된 PTP로만 구성된 백신보다 PTP로서 SL8 에피토프를 발현하는 종양 세포주 (B16F10 Ova 종양 세포)로부터의 종양 성장의 보다 나은 결함을 유도한다는 것을 시사한다 (도 9b). 발명자의 데이타는 또한 멜라노솜이 야생형 (WT) 종양 세포주가 아니라, PTP를 발현하는 종양 세포주로부터의 종양 성장의 결함을 유도할 수 있다는 것을 의미하여 (도 9b 및 9c 비교), 이는 멜라노솜-함유 PTP 기반 백신의 특이적 항-종양 효과를 입증한다.
고찰
백신의 주요 목적이 숙주 면역계를 회피하려는 형질전환된 세포의 기회를 감소시키는 것이라면, 발명자는 이 실험에서 i) 전체 길이 단백질을 생기게 하는 정규 사건과는 별개의 번역 사건에 의해 초기에 생성되는 폴리펩티드 (PTP)가 특이적이고 강건한 암-백신으로서 사용될 수 있고, ii) 이러한 폴리펩티드 및 유사한 폴리펩티드를 보유하는 엑소솜의 조합이 형질전환된 세포에 대항하여 폭넓은 T 세포 레파토리를 촉발시키는 암 백신으로서도 보다 더 강력한 조합일 수 있으며, iii) 장기간 지속되는 면역 반응을 위해서, CD8 및 CD4 PTP의 조합이 요구된다는 것을 입증하고자 하였다.
MAGE-1 단백질로부터 유래된 클래스 I 결합 합성 에피토프는 이미 임상 실험에서 단일 펩티드 기반 백신으로서 시험되었다. 다음으로, 상이한 암에 대항하여 유도된 다른 짧은 펩티드가 그 이후에 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 모든 이들 실험에서, 백신으로서 단일 합성 에피토프를 사용하여, 예상되는 결과는 희망했던 만큼 좋지 않았는데, 그들이 흑색종 환자에서 임의의 유익한 임상적 반응을 목격할 수 있었기 때문이다. 이들 결과는 짧은 펩티드가 특이적 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있는 pAPC뿐만 아니라 수많은 유형의 세포에 직접적으로 결합할 수 있다는 사실로 설명될 수 있다. 짧은 펩티드가 비전문적인 세포에 대한 MHC 클래스 I 분자에 결합했을때 더 최악인 것은 그들이, 내성 면역 반응을 유도할 수 있다는 것이다. 또한, 이들 펩티드가 짧으므로, 그들은 임의의 3차 구조를 가질 수도 있어서 신속한 분해를 겪을 수 있다. 그러한 모든 이유들 때문에, 발명자의 PTP-기반 암 백신은 짧은 펩티드를 사용하는 것보다 더 나은 전략인 듯 하다. 다른 이유는 i) 발명자의 PTP가 6개 초과의 아미노산, 바람직하게 적어도 7 또는 8개 아미노산의 상이한 길이의 펩티드로 구성된 것으로 확인되었고, ii) 그들이 내생성뿐만 아니라 외생성 MHC 클래스 I 경로에 대한 펩티드의 주요 공급원인 것으로 확인되었으며, iii) 그들이 pAPC에 의해 흡수되고 적절하게 처리되어서 MHC 클래스 I 경로에 도달해 세포 표면에 제시되어야 할 필요가 있고, iv) 그들이 MHC 클래스 I 에피토프뿐만 아니라 MHC 클래스 II 에피토프로도 구성될 수 있다는 것이다. 이 마지막 이유는 백신의 주요 목적이 암에 대항하여 장기간 지속하는 면역 반응을 유도하는 것이라면 매우 중요하다. 사실, 발명자는 임의 유형의 암의 임의 재발을 피하도록 암 백신을 디자인하고 있다. 그들의 백신은 PTP 및 엑소솜이 이미 암이 발생된 환자로부터 정제되어야 할 필요가 있는 치료적 백신이다. 발명자의 백신의 목적은 완전한 종양 거부를 가지며 재발이 없는 것이다. 이들 목적을 위해서, 그들 백신은 세포독성 CD8+ T 세포의 활성화를 기반으로 신속한 면역 반응 기반을 유도시키는 것이 요구되지만 장기간 지속되는 반응을 위해서 백신은 또한 기억 반응을 유도시키는 것이 요구된다. 그러한 특정 사례에서, 기억 반응은 CD4+ T 세포의 역할을 기반으로 할 것이다. 사실 발명자는 WT 종양 세포주로부터 PTP를 정제하였을 때 (도 2a) 그들이 오직 하나의 MHC 클래스 I 에피토프를 사용하는 그들의 조작된 모델 구성체로부터 특이적으로 비롯된 PTP만을 사용했을 때보다 종양 성장의 더 나은 억제를 관찰하였다 (도 3a). 그 설명으로 그들은, WT 종양 세포주로부터 정제된 PTP에는, MHC 클래스 I 에피토프를 함유하는 폴리펩티드뿐만 아니라 MHC 클래스 II 에피토프를 함유하는 폴리펩티드도 정제된다고 믿는다는 것이다. 이러한 관찰은 그들이 전체 길이 오브알부민과 그들의 조작된 구성체로부터 정제된 PTP를 혼합하였을 때, 이러한 조합된 백신의 효과가 그들이 오직 PTP 자체만을 사용했을때보다 훨씬 더 강력하다는 사실에 의해 뒷받침된다 (도 5). CD4+ T 세포는 CD4+ T 세포와 pAPC 사이의 CD40-CD40L 상호작용임에도 기억 CD8+ T 세포의 유지에 필수적이라는 것이 확인되었고, 이것은 역시 백신접종의 성공에서 pAPC의 중요하고 특이적인 역할을 입증해 준다.
일련의 보고에 따라서, 종양-유래된 엑소솜은 상이한 경로에 대한 작용에 의해서, 예를 들어 DC의 분화를 억제하거나 또는 NK 세포를 음성적으로 조절하여 종양 면역 회피를 유도하는 면역억제인자인것으로 밝혀졌지만, 그들은 또한 특이적 종양-면역 반응을 유도함으로써 면역조정 효과를 갖는다고 보고되었다. 그들은 일반적으로 종양 항원을 함유하는 것으로 확인되었고 따라서 암 백신을 위한 종양 항원의 신규한 공급원으로서 사용되었다. 발명자의 결과로부터, PTP를 함유하는 종양-엑소솜은 특이적 면역 반응을 자극한다. 사실, 종양-유래된 PTP 및 종양-유래된 엑소솜의 조합은 종양-유래된 PTP 자체보다 종양 거부를 유도하는데 더 강력하다 (도 4). 이러한 결과는 그들이 엑소솜 내부에서, 그들의 조작된 구성체로부터 생성된, PTP를 정제하는데 성공하였고 엑소솜이 또한 종양 그 자체로부터 비롯된 MHC 클래스 II 에피토프를 함유할 수 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다.
일련의 보고에 따라서, 멜라노솜은 멜라노사이트로부터 케라티노사이트로 수송될 수 있다. 사실 일련의 실험들은 예를 들어 멜라노솜이 멜라노사이트로부터 이웃하는 케라티노사이트로 멜라닌의 수송을 담당하는 소포체라고 보고하고 있다. 그러나 발명자에게 보다 중요한 것은 또한 최근에 흑색종 세포가 분비된 멜라노솜의 도움으로 세포내 수송에 의해서 MHC 클래스 II 항원을 획득할 수 있다는 것이 확인되었다는 것이다. 여기서, 발명자는 MHC 클래스 II 에피토프뿐만 아니라 MHC 클래스 I 에피토프도 수송할 수 있다고 보고한다. 사실 발명자는 분비된 멜라노솜이 흑색종 세포주로부터 BMDC로 전달되고 그 결과로 특이적 CD8+ T 세포의 활성화가 일어날 수 있는 PTP를 함유한다는 것을 발견하였다. 더 나아가서, 발명자는 또한 멜라노솜이 흑색종 암 백신의 기초가 될 수 있다고 보고한다. 발명자는 흑색종 세포주가 접종된 마우스에서 주사된 멜라노솜이 중요한 종양 성장 결함을 유도할 수 있다는 것을 보여주어, 멜라노솜과 조합된 PTP가 적절한 흑색종 암 백신으로서 사용될 수 있다는 아이디어를 뒷받침해 주었다. 적절한 종양 면역 반응이 특이적 CD8 세포독성 T 세포의 동원 및 활성화에 의존적이고, CD4+ T 세포가 이들 과정에 필수적이라는 사실, 및 적절한 항-CD8 종양 면역 반응이 항종양-CD4+ T 세포의 부재 하에서 장기간 지속되는 T 세포 기억을 확립하는데 실패했다는 사실을 고려하여, 그들 결과는 분비된 멜라노솜이 MHC 클래스 II뿐만 아니라 MHC 클래스 I 에피토프를 함유하는, PTP-기반 흑색종 암 백신에 멜라노솜 사용의 중요성을 확인해 준다.
참조문헌
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ctaa 1204
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Claims (15)
- ⅰ) 인트론, 3' 또는 5' 미번역된 영역 (UTR), LncRNA (긴 비코딩 RNA, Long non coding RNA), miRNA (마이크로RNA, microRNA) 및 유전자간 서열로부터 선택되는 핵산 서열로부터 비정규 번역 기전을 통해 발현되는, 7 내지 50개 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어진 제1 초창기 번역 생성물 (Pioneer Translation Product, PTP), ⅱ) 미세소포 (microvesicle), 및 ⅲ) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 대상체에서 암을 예방 또는 치료하기 위한 백신 조성물로서,
제 1 PTP는 종양-연합된 초창기 번역 생성물 (tumor-associated Pioneer Translation Product, TA-PTP) 이고,
TA-PTP 및 미세소포 모두는 백신접종하려는 대상체의 암 종양으로부터 유래되고,
TA-PTP는 대상체의 종양 세포의 핵 구획으로부터 수득된 것인, 백신 조성물. - 제1항에 있어서, 미세소포가 7 내지 50개 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어진 제2 PTP를 포함하고,
상기 제2 PTP는, 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프 또는 양자 모두를 포함하고 대상체의 종양 세포의 핵 구획으로부터 수득되는 별개의 TA-PTP인, 백신 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 PTP에 상응하는 전체 길이 단백질을 추가로 포함하는 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 미세소포가 제1 및 적어도 제2 PTP 둘 모두를 발현하는 백신 조성물.
- 제4항에 있어서, 미세소포가 종양-유래된 미세소포 또는 멜라노솜인 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 양자 모두를 활성화시키는 PTP를 포함하는 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 포유동물, 또는 인간이고, 백신 조성물이 체중 1 kg 당 0.1 내지 10 mg의 PTP를, 임의로 체중 1 kg 당 0.1 내지 5 mg의 미세소포와 함께 포함하는 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 암이 육종 또는 흑색종인 백신 조성물.
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