JP2023546485A - Pd-l1の細胞外ドメインを含むキメラ抗原 - Google Patents
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Abstract
ネイティブPD-L1分子と比較してPD-1およびCD80受容体に対する結合能が低下した、プログラム死リガンド1(PD-L1)の細胞外ドメインの多量体凝集体を含むキメラ抗原。本発明はさらに、上記キメラ抗原および少なくとも薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む医薬組成物を開示する。キメラ抗原は、がんまたはその転移を処置するための薬物の製造に使用される。本発明はまた、がんまたはその転移の処置を必要とする対象においてがんまたはその転移を処置する方法であって、本明細書に記載のキメラ抗原を含む医薬組成物の治療有効量の投与を特徴とする方法を開示する。
Description
本発明は、バイオテクノロジーおよびヒトの健康の分野に関する。本発明は、PD-L1タンパク質の細胞外ドメインの200を超えるアミノ酸を含むキメラワクチン抗原の詳細を提供する。本発明はまた、上記抗原および少なくとも1つのアジュバントを含むワクチン組成物を提供する。この組成物は、PD-L1に特異的な免疫応答を誘導し、PD-L1が媒介する生物学的効果に対して中和活性を有し、したがって、がんおよびその転移の処置に使用することができる。
PD-L1として公知のプログラム死リガンド1は、B7ファミリーのメンバーである40kDaの1型膜貫通タンパク質受容体である。PD-L1は、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)およびCD80として公知の別の膜受容体と特異的かつ機能的な相互作用を有する。PD-L1は、ヒトゲノムの9番染色体上に位置するCd274遺伝子によってコードされる290アミノ酸のタンパク質である。正常組織では、PD-L1は、T細胞、B細胞、骨髄細胞、樹状細胞、非リンパ器官からの非造血細胞上に発現されるが、様々な種類の腫瘍でも発現される(Wang,et al.,OncoTargets and Therapy,2016:9:5023-39,Salmaninejad,et al.,Journal of Cellular Physiology,2019:234:16824-37)。
PD-1/PD-L1相互作用は、免疫系攻撃を回避する腫瘍誘導免疫抑制環境に関連する様々な機序に関与している。T細胞上のPD-1と腫瘍細胞上のPD-L1との間の結合は、Tリンパ球の増殖および分化を減少させることによって免疫応答の抑制を誘導する。さらに、この相互作用は、T細胞アポトーシス、アネルギーおよびそれらの機能的疲弊の活性化を誘導する。PD-L1は、多くの悪性腫瘍において過剰発現し、予後不良に関連する。
分子とこの天然受容体との相互作用を遮断する抗PD-L1モノクローナル抗体などの免疫治療剤の使用は、がんの処置における有望な代替法と考えられてきた。この抗体群の中で、FDAは、特に転移性尿路上皮癌、メルケル細胞癌、扁平上皮非小細胞肺がんおよび腎細胞癌を含む進行期腫瘍のいくつかのがん型を有する患者を処置するためにアテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブを承認している(Lee,et al.,Molecules,2019:24:1190)。
抗PD-L1モノクローナル抗体による処置は、いくらかの臨床的成功を示すが、治療薬の頻繁な投与および高い用量を必要とし、高コストにつながり、とりわけ、間質性肺炎、心筋炎、大腸炎などの有害作用をもたらす(Wang y Xu,JAMIA Open,2018:2:173-8)。多くの場合、これらの毒性の重度は、受動的治療の遅延または中断を引き起こす。
一方、他の戦略は、PD-L1を抗原とする能動的免疫治療アプローチをとることによってこれらの問題に対処しようとしたものであり、例えばタンパク質またはそのペプチドの大部分をカバーするポリペプチドを使用したものである。Munirらは、2つのPD-L1ペプチドを用いてインビトロ試験を行い、DCvaccと呼ばれるワクチンで処置した進行黒色腫がん患者から単離した末梢血単核細胞を刺激する能力を評価した。ワクチンは、腫瘍関連抗原p53およびテロメラーゼをコードするmRNAでトランスフェクトした樹状細胞の患者への投与を伴った。これらの患者からの末梢血単核細胞は、DCvaccに対する限られた反応性のみを有した。しかしながら、これらの細胞をPDLong1(本明細書において配列番号23として特定される)およびPDLong2(本明細書において配列番号24として特定される)と呼ばれる2つのPD-L1由来ペプチドでインビトロ刺激した場合、ワクチンに対するT細胞反応性が有意に増加した(Munir,et al.,Oncoimmunology,2013:2:e23991)。
上述の知見および他のさらなるデータに基づいて、抗原としてPDLong1ペプチドを使用して、PD-L1に対するペプチドワクチンを開発した。CD4+およびCD8+Tリンパ球のエピトープを含むこのペプチドをアジュバントMontanide(商標)と混合し、第I相臨床研究において多発性骨髄腫を有する患者に投与した。この抗原調製物は、ヒトにおいて安全かつ免疫原性であった。ワクチン接種がん患者の皮膚生検から得られたリンパ球をペプチドの存在下で活性化した。しかしながら、PD-L1特異的抗体応答は免疫化患者では検出されなかった(Jorgensen,et al.,HemaSphere,2019:3:631-2)。抗体応答がこの種の処置の有効性における関連因子であることが実証されているので、この要素は制限を表し得る。このリガンドに対する抗体は、PD-L1とその受容体との間の相互作用を遮断することができ、T細胞媒介性抗がん免疫も増強することができる。
デオキシリボ核酸(DNA)ワクチンに基づく能動的免疫治療戦略も開発されている。このDNAワクチンは、PD-L1の細胞外ドメインをコードするプラスミドで形質転換した弱毒生菌(サルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)種)を使用して口腔経路で投与される。この戦略は、国際公開第2018/167290号パンフレットに開示されている。細菌感染機序を利用して、細胞傷害性CD8+リンパ球を生成し、主要組織適合遺伝子複合体クラスIに関連するPD-L1ペプチドを提示する樹状細胞によって活性化した。これらの細胞傷害性リンパ球は、PD-L1陽性腫瘍細胞を排除することができた。免疫応答の細胞分岐の活性化に加えて、このワクチンは、PD-L1に特異的な抗体応答も誘導した。それにもかかわらず、誘発された抗体レベルは比較的低かった(Wieckowski,et al.,Journal of Clinical Oncology,2018:36:74)。この要素は、能動的免疫治療のこの変異体の成功にとって好ましくない可能性がある。
PD-L1の細胞外ドメイン(Phe 19-Glu 228)およびジフテリア毒素(DTT)に基づく融合ポリペプチドによる能動的免疫治療が、国際公開第2014/183649号パンフレットに記載されている。この第2のポリペプチドセグメントは、強いCD4+T細胞媒介性免疫応答を促進するために含められた。PD-L1の細胞外ドメインは、GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)発現系において産生された。この発現系は、その正しい折り畳みおよび三次元立体配座を保証し、融合タンパク質の構造的完全性を保証する。フロイントアジュバントと混合したワクチン抗原(43.5kDa)は、PD-L1特異的抗体応答および細胞傷害性Tリンパ球を誘導した。この免疫応答のエフェクターは、腫瘍成長および転移移植を阻害した(Lin,et al.,Molecular Therapy Oncolytics,2019:14:222-32)。しかしながら、誘発された抗体のレベルは、現在最も強いアジュバントと考えられているフロイントアジュバントの使用を考慮すると、比較的中程度と考えられ得る。
したがって、より高い免疫原性ならびに抑止された腫瘍促進活性を有する新しいPD-L1ベースのワクチン抗原の開発は、関心のある領域として残っている。この戦略は、投与される抗原の量を増加させる必要なく、活発な体液性および細胞性免疫応答を同時に生じさせることができなければならない。
本発明は、ネイティブPD-L1タンパク質と比較してPD-1およびCD80受容体に対する結合能が低下した多量体凝集体を形成するプログラム死リガンド1(PD-L1)の細胞外ドメインを含むキメラ抗原を提供することによって、前述の問題を解決する。上記キメラ抗原は構造的に凝集しており、これにより、このポリペプチド中に存在するPD-L1の細胞外ドメインの立体配座が、ネイティブリガンド中の上記ドメインの立体配座と比較して改変される。
本発明では、ヒトPD-L1の細胞外ドメインは、PD-L1のアミノ酸Phe 19~Arg 238の領域を指す。本発明の一実施形態では、PD-L1のヒト細胞外ドメインを含むキメラ抗原はまた、細菌におけるその発現を増加させるためのアミノ末端と、アフィニティークロマトグラフィーによるその精製を容易にするためのカルボキシル末端とを含む。本発明の一実施形態では、キメラ抗原は、配列番号1として特定されるアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
配列表において配列番号1として特定される抗原は、PD-L1分子の細胞外ドメイン(Phe 19~Arg 238)である、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)からのLpdAタンパク質のアミノ末端の最初の47アミノ酸を含む。両方の領域は、両方のポリペプチド間のリンカーとして機能する13個のアミノ酸によって分離されている。本発明の目的のタンパク質は、18個の部分的に重複するオリゴヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応技術による遺伝子の組み立てから出発して得られた。発現ベクターにおけるクローニングのために、発現ベクターの特徴に従って設計されたプライマーを使用し、DNAを挿入し、最終的に配列決定した。この配列を、識別子Q9NZQ7を有するUniProtKB/Swiss-Protデータベース(https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZQ7)で刊行されたPD-L1の細胞外ドメインについて報告された配列と比較し、その同一性を確認した。上記の方法によって得られたポリペプチドを、ウイルス、細菌、酵母、ファージ、植物または哺乳動物細胞中の発現ベクターにクローニングし、それに応じて挿入部位を変化させることができる。遺伝子構築が得られると、その配列は従来の自動配列決定法を使用して検証されなければならない。
特定の実施形態では、キメラポリペプチドを得るために、他の要素の中でもトリプトファンプロモーター、髄膜炎菌(N.meningitidis)のLpdAタンパク質のアミノ末端に対応する47アミノ酸をコードするヌクレオチド配列(欧州特許第0816506号明細書)、6つのヒスチジンのセグメントをコードするヌクレオチド配列およびT4ターミネーターを含むpM238大腸菌(Escherichia coli)発現ベクターを使用した。この発現ベクターはまた、選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を有する。得られた融合ポリペプチドをPKPD-L1と命名した。
キメラポリペプチドを精製したら、サイズ排除HPLCによる分析を実施し、これは、カラムの空隙体積で溶出し、カラムに適用された総タンパク質の90%を占める主要なピークを示した。この主要なピークは、670kDaより大きい分子量を有する凝集タンパク質PKPD-L1を含み、これは、PD-L1ネイティブタンパク質の細胞外ドメインに対応する26kDaの分子量とは異なる(例2)。驚くべきことに、この融合ポリペプチドは、高分子量凝集体の形成をもたらしたその構造の変化を有する。これらの凝集体の安定な形成は、以下の特徴を有するPD-L1変異体をもたらす:(1)天然PD-1/PD-L1またはCD80/PD-L1相互作用の特定の化学量論を改変し、生物学的に活性なネイティブPD-L1の変異体と比較して、融合ポリペプチドの上記受容体への結合の低下を引き起こす、いくつかのPD-L1分子の空間的配置、(2)いくつかのPD-L1分子の結合が、上記凝集の結果としてエピトープの反復露出をもたらし、これが、PD-L1がそのネイティブの三次元構造においてモノマーとして見出される場合に得られるものと比較して、免疫原性の増加を引き起こすこと。これらの知見は、がんの制御に適用することができる、はるかに有効かつより安全な新規治療法の開発を支持する。
本発明は、ヒトPD-L1(ネイティブ型のPD-L1と比較してPD-1およびCD80受容体に対する結合能が低下した多量体を形成する)の細胞外ドメインを含むキメラ抗原、ならびに少なくとも1つの薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む医薬組成物を開示する。構造的に凝集しているというPKPD-L1ポリペプチドの特有の特徴、および安全性プロファイルを損なうことなく、アジュバントと組み合わせた場合のその増強された免疫原性は、他のPD-L1変異体と比較した場合、このポリペプチドに免疫学的利点を与える。その安全性は、さらに利点を示す。すなわち、それが、特異的抗体による受動的免疫治療戦略と比較して(処置の慢性性のために)繰り返し投与されるワクチンの一部であるためである。これらの要素は、PKPD-L1を、PD-L1発現の増加に関連する疾患の処置のための高い可能性を有する抗原にする。本発明は、アジュバントと組み合わせた、ヒトPD-L1を代表する構造的に凝集した組換えキメラポリペプチドの投与を特徴とする特異的な能動的免疫治療を記載する。
本発明の一実施形態では、医薬組成物において、ワクチンアジュバントは、オイルアジュバント、鉱物塩、プロテオリポソームおよびガングリオシドにコンジュゲートしたプロテオリポソームによって構成される群から選択される。免疫応答の発生を刺激するために、本発明のキメラ抗原は、免疫増強剤および/またはアジュバントと組み合わせることができる。これらの化合物の性質は通常多様であり、例えば鉱物塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム);可溶性サイトカイン(すなわち、IL-2、IL-15、IL-12、GM-CSF、IFN-γ、IL-18);膜受容体(すなわち、CD40、CD154、主要組織適合遺伝子複合体I型の不変鎖、LFA3);サポニン(すなわち、QS21);CpGなどのオリゴヌクレオチド;リポ多糖などの糖脂質;エマルジョン(すなわち、フロイントアジュバント、合成アジュバント製剤(SAF)、MF59、Montanide(商標))、リポソーム、ナノ粒子およびビロソーム;微粒子アジュバント、ポロキサマー、ウイルス起源のアジュバント(すなわち、HBcAg、HCcAg、HBsAg)および細菌起源のアジュバント(すなわち、NAcGM3-VSSP、N-GliGM3-VSSP);粘膜アジュバント、例えば、熱不安定性エンテロトキシン、コレラ毒素および変異毒素(すなわち、LTK63およびLTR72)の化合物である。
免疫原は、毒性でなく、有害な治療効果を示さず、当業者に公知の医薬用途に許容されるビヒクル中で投与することができる。本発明で提示される例は、特定の緩衝液または緩衝液の組み合わせの使用、およびその安定性の増加に寄与する賦形剤の使用さえも決して制限しない。
別の実施形態では、本発明は、がんまたはその転移を処置するための薬物を製造するための、ネイティブ型のPD-L1と比較した場合にPD-1およびCD80受容体に対する結合能が低下した多量体を形成するヒトPD-L1の細胞外ドメインを含むキメラ抗原の使用を提供する。これは、タンパク質の非融合変異体またはPD-L1ペプチドの混合物と比較した場合に免疫原性特性を増加させる、融合ポリペプチドPKPD-L1のかなり安定な立体配座および高分子量に起因する。アジュバントであるリン酸アルミニウムまたはVSSP(非常に小さいサイズのプロテオリポソーム、米国特許第6149921号明細書;国際公開第201986056号パンフレット)と共に投与された融合タンパク質PKPD-L1は、自己分子に対する免疫寛容を破ることができ、ネイティブPD-L1に対する特異的な体液性および細胞性免疫応答を誘導することができるワクチンを作り出す。この免疫応答は、モノクローナル抗体による受動的免疫治療と比較した場合、またはネイティブPD-L1タンパク質もしくはPD-L1ペプチドの混合物に基づく抗原によって生じる免疫応答と比較した場合、定性的および定量的に優れている。PKPD-L1ポリペプチドの免疫原性におけるこの増加は、抗腫瘍活性における増大を促し、これは、他の評価された戦略によってもたらされるものよりも優れている。
本発明において実証された腫瘍成長に対する阻害効果は、それらの可能な組み合わせを除外することなく、異なる機序に基づくものであり得る。ワクチン接種によって生じたポリクローナル抗PD-L1抗体応答は、腫瘍細胞表面に発現されるPD-L1リガンドと細胞傷害性CD8+Tリンパ球の膜に発現されるPD-1との間の相互作用を遮断することができ、その機能的不活性化を回避する。一方、ワクチン接種によって生じた抗体は、内在化プロセスを通して、腫瘍細胞の表面上のPD-L1のレベルを減少させることができる。PD-L1の減少は、細胞傷害性CD8+Tリンパ球を不活性化する悪性細胞の能力の低下をもたらし得る。さらに、腫瘍細胞におけるPD-L1リガンドの低発現は、上皮細胞と同様の表現型を獲得することを促し、したがって、その転移能を負に調節する。抗体応答のポリクローナル性は、上記の生物学的事象の有効性における重要な因子である。
さらに、PKPD-L1による免疫化は、原発腫瘍細胞およびそれらの転移に対する特異的細胞傷害性リンパ球を誘導し、これらは、主要組織適合遺伝子複合体クラスIとの関連においてPD-L1ペプチドを潜在的に提示する。これは、より多数のリンパ球を生成するそれらの能力に加えて、CD4+およびCD8+Tリンパ球の両方を活性化し、それによってそれらのクローンの多様性を達成することができるという、PKPD-L1融合タンパク質による免疫化の利点である。PD-L1タンパク質の細胞外領域からの200個を超えるアミノ酸を含むキメラタンパク質で免疫することによって、(1)CD4+ヘルパーリンパ球および細胞傷害性CD8+リンパ球の両方を活性化することができる線状エピトープを同時に提示し、それにより腫瘍に対するより効果的な免疫応答を保証すること、(2)CD4+ヘルパーリンパ球および細胞傷害性CD8+リンパ球に対して制限されたいくつかのエピトープが存在し、両方の細胞型について異なる細胞クローンの存在を保証し、腫瘍に対するより効果的な免疫応答にさらに変換することができること、(3)いくつかのエピトープの存在がまた、MHCクラスIまたはIIの異なる対立遺伝子を有する患者の集団におけるワクチン接種との関連において、特異的抗PD-L1体液性応答および/または細胞性応答を有する個体の数の増加を可能にすることが保証される。これらの要素が構成する有益な利点は、免疫化が主要組織適合遺伝子複合体の1つの対立遺伝子のみに制限されたペプチドを含む場合、存在しないかまたは非常に限定される。
PKPD-L1タンパク質による免疫化後に生じた免疫応答のこれらの特性はすべて、ネイティブPD-L1分子による能動的免疫治療戦略と比較した場合、より大きな関連性を獲得する。重要な要素は、同じ量の抗原で優れた免疫応答が達成されることである。この特徴は、PKPD-L1を伴うヒトにおける免疫治療戦略が、生産的観点および安全性の観点からの利点を有することを暗示する。PKPD-L1ポリペプチドは、ネイティブ変異体と比較して生物学的活性が低い分子であり、したがって、高用量の抗原の投与はその安全性プロファイルを損なわない。
本発明はまた、a)ネイティブ形態のPD-L1と比較した場合、PD-1およびCD80受容体に対する結合能が低下した多量体を形成するヒトPD-L1の細胞外ドメインを含むキメラ抗原、ならびにb)少なくとも1つの薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む医薬組成物の治療有効量の投与を特徴とする、必要性のある個体におけるがんまたはその転移を処置するための方法を提供する。上述のキメラ抗原による免疫化を含むこの方法は、原発腫瘍の発生をより効果的に低減することができ、遠隔転移の発生を防止し、がん患者の生存を増加させるための利点を提供する。
本発明の一実施形態では、キメラ抗原を含む組成物の投与を含む方法は、受動的免疫治療または同時にもしくは順次に適用される標準的ながん治療と組み合わされる。この処置方法は、他の化学的、放射線学的または生物学的抗腫瘍剤と関連してまたは関連せずに、1番目または2番目の治療として使用することができる。
本発明の一実施形態では、キメラ抗原を含むワクチンの投与は、ボーラス注射、または腫瘍成長に関連する抗原もしくは腫瘍誘導免疫抑制に関与する抗原に特異的なモノクローナル抗体もしくはその断片の制御放出と組み合わされる。キメラ抗原を含むワクチン調製物は、治療有効量で哺乳動物、好ましくはヒトに投与されるが、それらの獣医学的使用を除外しない。免疫原としても公知の抗原-アジュバント混合物は、皮下、筋肉内、粘膜、腹腔内、リンパ内、局所を含む様々な経路によって、または吸入によって、投与することができる。好ましい実施形態では、キメラPKPD-L1抗原を含む免疫原の投与の経路は皮下である。本発明で示される例は、アジュバントとの抗原の使用または特定の投与経路の使用を制限しない。
使用される抗原用量は、異なるパラメータに従って確立することができる。これらの用量は、投与経路、問題の病態、および処置期間に依存する。以下の例に記載されているものとは異なる用量の投与間隔または投与経路の変更は、本発明の本質から逸脱するものではなく、PD-L1に対するより良好な特異的免疫応答を得るために免疫化スキームの最適化を達成することが可能である。
本発明の一実施形態では、キメラ抗原を用いた能動的免疫治療は、ヒトPD-L1リガンドまたはヒトPD-1受容体に対する抗体を用いて行われる受動的免疫治療と組み合わされる。
例
例1.組換えタンパク質PKPD-L1および変異体PD-L1CHOのクローニングおよび発現。
ヒトPD-L1の細胞外ドメインの成熟領域に対応するDNAを、識別子Q9NZQ7を有するUniProtKB/Swiss-Protデータベース(https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZQ7)の配列に従って増幅した。18個の部分的に重複するオリゴヌクレオチドを設計した(配列番号2~配列番号19)。KOD Hot Start Master Mix(商標)試薬セット(Novagen)を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して遺伝子を増幅および組み立てた。PD-L1の細胞外ドメインをコードする遺伝子の組み立て後、この目的を達成するように設計された2つのプライマーを使用して酵素の制限部位を加えた。これらのプライマーは、それぞれ酵素NheIおよびBamH Iの制限部位を含んでいた。次いで、得られたDNAをpM238発現ベクターにクローニングした(配列番号20および配列番号21)。PD-L1の成熟領域(Phe 19からArg 238までのアミノ酸)をコードするDNA配列をベクターpM238に含めることにより、このセグメントを、髄膜炎菌(N.meningitidis)のLpdAタンパク質のアミノ末端から47アミノ酸をコードするDNA配列に融合した(欧州特許第0816506号明細書)。これらの領域は、13アミノ酸のリンカーをコードするDNAによって接続されている。融合ポリペプチドのカルボキシル末端に向かって、その精製を容易にするために、6つのヒスチジンの領域を加えた。クローニングから得られたプラスミドをpPKPD-L1と命名した。このプラスミドのヌクレオチド配列は100%検証されている。配列表において、組換えタンパク質PKPD-L1のコード領域のヌクレオチド配列は、配列番号22として特定される。融合ポリペプチドはPKPD-L1と呼ばれ、そのアミノ酸配列は配列表において配列番号1として特定される。
例1.組換えタンパク質PKPD-L1および変異体PD-L1CHOのクローニングおよび発現。
ヒトPD-L1の細胞外ドメインの成熟領域に対応するDNAを、識別子Q9NZQ7を有するUniProtKB/Swiss-Protデータベース(https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZQ7)の配列に従って増幅した。18個の部分的に重複するオリゴヌクレオチドを設計した(配列番号2~配列番号19)。KOD Hot Start Master Mix(商標)試薬セット(Novagen)を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して遺伝子を増幅および組み立てた。PD-L1の細胞外ドメインをコードする遺伝子の組み立て後、この目的を達成するように設計された2つのプライマーを使用して酵素の制限部位を加えた。これらのプライマーは、それぞれ酵素NheIおよびBamH Iの制限部位を含んでいた。次いで、得られたDNAをpM238発現ベクターにクローニングした(配列番号20および配列番号21)。PD-L1の成熟領域(Phe 19からArg 238までのアミノ酸)をコードするDNA配列をベクターpM238に含めることにより、このセグメントを、髄膜炎菌(N.meningitidis)のLpdAタンパク質のアミノ末端から47アミノ酸をコードするDNA配列に融合した(欧州特許第0816506号明細書)。これらの領域は、13アミノ酸のリンカーをコードするDNAによって接続されている。融合ポリペプチドのカルボキシル末端に向かって、その精製を容易にするために、6つのヒスチジンの領域を加えた。クローニングから得られたプラスミドをpPKPD-L1と命名した。このプラスミドのヌクレオチド配列は100%検証されている。配列表において、組換えタンパク質PKPD-L1のコード領域のヌクレオチド配列は、配列番号22として特定される。融合ポリペプチドはPKPD-L1と呼ばれ、そのアミノ酸配列は配列表において配列番号1として特定される。
組換えプラスミドPKPD-L1を大腸菌(E.coli)BL21株に形質転換した。細菌を、5Lのバイオリアクター中、10%カゼイン加水分解物、グルコース40%および100μg/mLのアンピシリンを補充した5LのM9培地中、37℃で3時間培養した。pHを7.0に維持した。PKPD-L1の発現を誘導するために、3β-インドールアクリル酸を40μg/mLの最終濃度になるように添加し、培養物を28℃で16時間成長させた。
ネイティブPD-L1を代表するポリペプチドを得るために、哺乳動物細胞におけるその発現のための遺伝子構築を行った。このネイティブPD-L1変異体(PD-L1CHOと呼ばれる)は、pcDNA 3.1/myc-His Cベクター(Invitrogen)に挿入されたリガンドの細胞外ドメイン(Phe 19~Glu 238)をコードするDNAをCHO細胞にトランスフェクトすることによって得た。細胞培養上清を、100%コンフルエンスに達した7日後に回収した。タンパク質を、Ni-NTA樹脂(Qiagen)上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
例2.PKPD-L1ポリペプチドの凝集状態の取得、精製および評価。
細菌ペレット(例1に記載)を超音波処理して、リン酸緩衝液(50mM NaH2PO4;300mM NaCl;pH7.8)中で細胞構造を破壊した。細胞破壊後の不溶性画分を6M尿素による変性条件下でリン酸緩衝液に可溶化した。可溶性画分を、Ni-NTAマトリックス中の金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、続いてゲル濾過によるPKPD-L1タンパク質精製に使用した。
細菌ペレット(例1に記載)を超音波処理して、リン酸緩衝液(50mM NaH2PO4;300mM NaCl;pH7.8)中で細胞構造を破壊した。細胞破壊後の不溶性画分を6M尿素による変性条件下でリン酸緩衝液に可溶化した。可溶性画分を、Ni-NTAマトリックス中の金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、続いてゲル濾過によるPKPD-L1タンパク質精製に使用した。
N末端およびC末端の完全性を実証し、アミノ酸配列を検証するために、直交ハイブリッドQTOF-2TMタンデム質量分析計でのエレクトロスプレーイオン化質量分析によってタンパク質を特徴付けた。ESI-MSおよびMS/MSスペクトルにより、タンパク質のアミノ酸配列がcDNAから推測されたものと一致することが確認された。94%のアミノ酸配列を検証した。タンパク質のN末端およびC末端を含むGlu-Cペプチドを配列決定し、それらの配列決定は予想される配列と一致した。
PKPD-L1分子量を推定する目的で、予めPBSで平衡化したSuperdex(商標)200(GE Healthcare Life Sciences(商標))カラムにおけるサイズ排除分析HPLCを使用した。分子量は、ゲル濾過標準(BioRad(商標))と比較して、保持時間を用いて推定した(表1)。
カラムの空隙体積で溶出し、適用されたタンパク質PKPD-L1の90%を占める主要なピークが得られた。このピークは、670kDaより高い分子量(標準からの最高分子量)を有するタンパク質凝集体を含む。保持時間および標準成分の既知の分子量を用いて作成された曲線から得られた補間結果に基づいて、PKPD-L1凝集体の推定分子量は約1078kDaである。この値は、PKPD-L1ポリペプチドのモノマーの理論分子量(31kDa)とは異なる。したがって、調製物は融合ポリペプチドの多量体によって構成されていると推論することができる。PKPD-L1凝集体の推定分子量(1078kDa)はまた、リガンドPD-L1CHOの計算された分子量(32kDa)よりも高く、これは、それらのネイティブの立体配座で得られ、生物学的に活性な分子である。
例3.PD-1およびCD80受容体に対するPKPD-L1タンパク質の結合能の評価。
キメラタンパク質PKPD-L1の、PD-1およびCD80受容体に結合する能力を、Fc融合タンパク質としてこれらの分子の生物学的に活性な変異体を使用する間接ELISAによって測定した。PD-1/Fc(RγD Systems(商標))またはCD80/Fc(RγD Systems(商標))タンパク質をELISAプレートに固定化した。続いて、PD-L1/Fc(RγD Systems(商標))、PKPD-L1およびPD-L1CHOタンパク質を異なる濃度で添加した。最後に、受容体のそれらのリガンドへの結合を検出するために、ヒトPD-L1ビオチン化抗体(RγD Systems(商標))を添加し、続いてストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma(商標))を添加した。
キメラタンパク質PKPD-L1の、PD-1およびCD80受容体に結合する能力を、Fc融合タンパク質としてこれらの分子の生物学的に活性な変異体を使用する間接ELISAによって測定した。PD-1/Fc(RγD Systems(商標))またはCD80/Fc(RγD Systems(商標))タンパク質をELISAプレートに固定化した。続いて、PD-L1/Fc(RγD Systems(商標))、PKPD-L1およびPD-L1CHOタンパク質を異なる濃度で添加した。最後に、受容体のそれらのリガンドへの結合を検出するために、ヒトPD-L1ビオチン化抗体(RγD Systems(商標))を添加し、続いてストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma(商標))を添加した。
表2は、PD-L1/FcおよびPD-L1CHOに対するPD-1/FcおよびCD80/Fcの結合が類似していたことを示し、哺乳動物細胞で発現されたPD-L1CHOタンパク質が、市販の生物学的に活性なタンパク質と比較して類似の結合特性を有することを示した。それにもかかわらず、PD-1受容体に対するPKPD-L1ポリペプチドの結合は、PD-L1/Fc分子とPD-1との間の相互作用よりも1420倍弱かった。さらに、CD80受容体に対するPKPD-L1の結合は、同じ分子に対するPD-L1/Fcの同じ結合よりも689倍低かった。
これらの結果は、PKPD-L1ポリペプチドが、生物学的に活性なネイティブのPD-L1変異体と比較して、PD-1およびCD80受容体と相互作用する能力が低下していることを示している。おそらく、高分子量凝集体を形成する多くのPKPD-L1モノマーの空間的配置は、PD-1/PD-L1結合またはCD80/PD-L1結合の特定の化学量論を変化させる。この特性は、高い腫瘍促進活性を有するタンパク質の投与に関連するリスクを低減することができるので、好ましい。
例4.PKPD-L1タンパク質による免疫化後に生じた抗体応答。
PKPD-L1ポリペプチドの免疫原性を評価するために、雌ウィスターラットを、2つのアジュバントと組み合わせてこのポリペプチドで皮下免疫した。髄膜炎菌(N.meningitidis)のLpdAタンパク質にコンジュゲートした2つのPD-L1合成ペプチド(配列表において配列番号23および配列番号24として特定される)の混合物も評価した。生物学的に活性なポリペプチドPD-L1CHOをこの実験にさらに含めた。すべての場合において、各ラットは、用量あたり200μgのポリペプチドまたはコンジュゲートを受けた。リン酸アルミニウム(Brenntag Biosector(商標))およびsNAcGM3-VSSP(分子免疫学センター(キューバ、ハバナ)によって開発されたアジュバント)をアジュバントとして使用した。陰性対照として、ラットの群を各アジュバントと組み合わせた賦形剤(40mM Tris pH8.0)で免疫した。
PKPD-L1ポリペプチドの免疫原性を評価するために、雌ウィスターラットを、2つのアジュバントと組み合わせてこのポリペプチドで皮下免疫した。髄膜炎菌(N.meningitidis)のLpdAタンパク質にコンジュゲートした2つのPD-L1合成ペプチド(配列表において配列番号23および配列番号24として特定される)の混合物も評価した。生物学的に活性なポリペプチドPD-L1CHOをこの実験にさらに含めた。すべての場合において、各ラットは、用量あたり200μgのポリペプチドまたはコンジュゲートを受けた。リン酸アルミニウム(Brenntag Biosector(商標))およびsNAcGM3-VSSP(分子免疫学センター(キューバ、ハバナ)によって開発されたアジュバント)をアジュバントとして使用した。陰性対照として、ラットの群を各アジュバントと組み合わせた賦形剤(40mM Tris pH8.0)で免疫した。
sNAcGM3-VSSPアジュバント(200μg/用量)による免疫化スケジュールは、8回の毎週のワクチン接種を含んでいたが、その間に、リン酸アルミニウム(0.7mgのAL3+/用量)を使用し、スケジュールは、4回の隔週投与を含んでいた。最後の免疫化の1週間後に血清を収集した(各アジュバントに応じて)。
ヒトPD-L1に対する特異的抗体を検出するために間接ELISAを開発した。PD-L1/Fcタンパク質(RγD Systems(商標))を、ELISAプレートに固定化したヒトIgGのFc領域に特異的なポリクローナルヒツジ抗体で捕捉した。ラット血清を1:250希釈で添加した。最後に、PD-L1特異的抗体を検出するために、ラットIgG特異的ポリクローナル抗体(Sigma(商標))を使用した。
図1は、吸光度単位で表される、ヒトPD-L1に特異的なIgG抗体のレベルの評価からの結果を示す。PKPD-L1ポリペプチド(高分子量凝集体を形成する)を上述のアジュバントと組み合わせて投与することにより、PD-L1/Fc生物学的活性タンパク質に対する特異的抗体を生成することができた。sNAcGM3-VSSPと組み合わせたPKPD-L1ポリペプチドによる免疫化によって生じた抗体レベルは、PD-L1CHOの投与によって誘導された抗体レベル(テューキー検定、p<0.0001)およびPD-L1ペプチド混合物についての抗体レベル(テューキー検定、p<0.0001)よりも有意に高かった。リン酸アルミニウムアジュバントを使用した場合も同様の結果が得られ、ポリペプチドPKPD-L1によって生じた特異的抗体力価は、他の2つの研究された変異体によって誘導された力価より高かった(テューキー検定、p<0.0001)。これらの結果は、PKPD-L1ポリペプチドが、PD-L1合成ペプチドの混合物またはPD-L1ネイティブ分子と比較して、より高い免疫原性を有することを示している。PKPD-L1抗原特性の増大は、融合ポリペプチドの高い凝集によって説明することができる。この凝集により、ネイティブPD-L1タンパク質内に見出され得る数と比較して、抗原決定基の数が増加する。さらに、構造変化を生じさせることができ、構造中にあまり露出していない決定基の露出を支持し、これらのエピトープに対する免疫系の耐性が低いので、より高いレベルの免疫応答を誘導することができる。
例5.PD-1/PD-L1の結合に対する、PKPD-L1で免疫したラットからの血清の遮断活性の評価。
PKPD-L1で免疫したラットからの血清の、PD-L1とそのPD-1受容体との相互作用を遮断する能力を競合ELISAアッセイで評価した。例4に記載したように、1:100希釈で血清を得て、500ng/mLのPD-L1/Fcタンパク質と共に37℃で2時間インキュベートした。この混合物を、(例4でPD-L1タンパク質を捕捉したのと同様の条件を使用して)PD-1/Fcタンパク質を捕捉したELISAプレートに添加した。捕捉されたPD-1分子に結合したPD-L1の量を、特異的抗PD-L1ビオチン化抗体を用いて検出し、その後、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した。最大結合吸光度値は、PD-1とPD-L1との相互作用が競合剤の非存在下で進行する条件から得られた。血清によって引き起こされるPD-1とPD-L1との間の相互作用の阻害を、以下の式を使用して百分率として表した:
%阻害=100%-[(450nmの血清試料/450nmの最大結合)×100]。
PKPD-L1で免疫したラットからの血清の、PD-L1とそのPD-1受容体との相互作用を遮断する能力を競合ELISAアッセイで評価した。例4に記載したように、1:100希釈で血清を得て、500ng/mLのPD-L1/Fcタンパク質と共に37℃で2時間インキュベートした。この混合物を、(例4でPD-L1タンパク質を捕捉したのと同様の条件を使用して)PD-1/Fcタンパク質を捕捉したELISAプレートに添加した。捕捉されたPD-1分子に結合したPD-L1の量を、特異的抗PD-L1ビオチン化抗体を用いて検出し、その後、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した。最大結合吸光度値は、PD-1とPD-L1との相互作用が競合剤の非存在下で進行する条件から得られた。血清によって引き起こされるPD-1とPD-L1との間の相互作用の阻害を、以下の式を使用して百分率として表した:
%阻害=100%-[(450nmの血清試料/450nmの最大結合)×100]。
図2は、PD-1受容体とそのPD-L1リガンドとの間の相互作用に対する、PKPD-L1、PD-L1CHO、およびPD-L1ペプチドの混合物で免疫したラットにおいて誘導された、血清の遮断活性の結果を百分率で示している。sNAcGM3-VSSPまたはリン酸アルミニウムと組み合わせたPKPD-L1の投与は、PD-1受容体とそのPD-L1リガンドとの結合を遮断する高い能力を有する抗体応答を生じた。この遮断活性は、PD-L1CHO変異体またはPD-L1コンジュゲートペプチドの混合物による免疫化によって生成された抗体で得られたものよりも阻害率に関して高かった(テューキー検定、p<0.0001)。この結果は、前述のアジュバントを用いて得られた。
例6.PKPD-L1で免疫したラットからの血清の、PD-L1と上記リガンドに特異的なモノクローナル抗体との相互作用を遮断する能力の評価。
キメラPKPD-L1抗原による免疫化後に誘導された抗体がヒトPD-L1の異なる抗原決定基に対するものであるかどうかを評価するために、競合ELISAを実施した。ヒトPD-L1上の結合部位によるモノクローナル抗体アテゾリズマブ(MedChemExpress(商標))、デュルバルマブ(Selleckchem(商標))およびアベルマブ(MedChemExpress(商標))と競合する(例4の実験からの)血清の能力を評価した。これらの抗PD-L1モノクローナル抗体(mAb)は、異なる腫瘍の処置のためにFDAによって承認されており、PD-L1分子上の異なるエピトープを認識した(Tan,et al.,Protein&cell,2018:9:135-9)。競合ELISAを開発するために、モノクローナル抗体をビオチンにコンジュゲートし、PD-L1および前述のビオチン化mAbとの相互作用のEC50を決定した。キメラPD-L1/Fcタンパク質をELISAプレートに固定化した。続いて、ビオチン化mAbを異なる濃度で添加し、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて抗原抗体結合を検出した。PD-L1とビオチン化抗体アテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブとの相互作用について、それぞれ5.2ng/mL、5.8ng/mLおよび3.1ng/mLのEC50が得られた。条件が確立されると、競合ELISAが開発され、免疫血清(血清希釈1:25)がヒトPD-L1結合部位について(前述のEC50で)mAbと競合する。PD-L1と各モノクローナル抗体の各々との相互作用がラット血清の非存在下で起こる条件を用いて、最大結合に対応する吸光度値を得た。リン酸アルミニウムと組み合わせて、PKPD-L1で免疫したラットの血清によってもたらされる、モノクローナル抗体とPD-L1との相互作用に対する阻害を(例5に記載の式を使用して)百分率として表した。結果を表3に示す。40mM Tris pH8.0(賦形剤)およびリン酸アルミニウムで免疫したラットからの血清を陰性対照として使用した。
キメラPKPD-L1抗原による免疫化後に誘導された抗体がヒトPD-L1の異なる抗原決定基に対するものであるかどうかを評価するために、競合ELISAを実施した。ヒトPD-L1上の結合部位によるモノクローナル抗体アテゾリズマブ(MedChemExpress(商標))、デュルバルマブ(Selleckchem(商標))およびアベルマブ(MedChemExpress(商標))と競合する(例4の実験からの)血清の能力を評価した。これらの抗PD-L1モノクローナル抗体(mAb)は、異なる腫瘍の処置のためにFDAによって承認されており、PD-L1分子上の異なるエピトープを認識した(Tan,et al.,Protein&cell,2018:9:135-9)。競合ELISAを開発するために、モノクローナル抗体をビオチンにコンジュゲートし、PD-L1および前述のビオチン化mAbとの相互作用のEC50を決定した。キメラPD-L1/Fcタンパク質をELISAプレートに固定化した。続いて、ビオチン化mAbを異なる濃度で添加し、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて抗原抗体結合を検出した。PD-L1とビオチン化抗体アテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブとの相互作用について、それぞれ5.2ng/mL、5.8ng/mLおよび3.1ng/mLのEC50が得られた。条件が確立されると、競合ELISAが開発され、免疫血清(血清希釈1:25)がヒトPD-L1結合部位について(前述のEC50で)mAbと競合する。PD-L1と各モノクローナル抗体の各々との相互作用がラット血清の非存在下で起こる条件を用いて、最大結合に対応する吸光度値を得た。リン酸アルミニウムと組み合わせて、PKPD-L1で免疫したラットの血清によってもたらされる、モノクローナル抗体とPD-L1との相互作用に対する阻害を(例5に記載の式を使用して)百分率として表した。結果を表3に示す。40mM Tris pH8.0(賦形剤)およびリン酸アルミニウムで免疫したラットからの血清を陰性対照として使用した。
表3は、PKPD-L1ポリペプチドの投与(アジュバントであるリン酸アルミニウムと組み合わせて)が、PD-L1とモノクローナル抗体であるアテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブとの結合を遮断する特異的抗体を誘導したことを示す。遮断活性は、陰性対照群で得られたものと有意に異なっていた(対応のないスチューデントt検定、p<0.0001)。アジュバントと組み合わせたPKPD-L1抗原による免疫化後、ポリクローナル抗体応答が誘導され、異なるヒトPD-L1エピトープに向けられる。免疫血清は、異なるエピトープを認識する3つの抗PD-L1モノクローナル抗体の結合を損なった。さらに、免疫化は、PD-L1上の関連エピトープを標的とするポリクローナル抗体応答を誘導し、これは異なる腫瘍の処置に承認されたモノクローナル抗体アテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブによって遮断される。
例7.PKPD-L1で免疫した非ヒト霊長類の血清から精製したIgGによって示されるPD-1/PD-L1相互作用を遮断する能力の評価。
実験の目的は、PKPD-L1ポリペプチドによる免疫化後に誘導された抗体が、細胞ベースのアッセイにおいてPD-1とPD-L1との相互作用によって媒介される生物学的効果を遮断することができるかどうかを評価することであった。この目的のために、これらの2つの分子間の相互作用を遮断する生物製剤の作用機序を模倣するPromega(商標)J1250アッセイを使用した。アッセイは、2つの遺伝子改変細胞ラインに基づく。第1のものは、その細胞膜上にヒトPD-1および発光を誘導するシグナルを伝達するT細胞受容体(TCR)を発現する、いわゆるエフェクター細胞である。第2のもの、いわゆる抗原提示細胞は、ヒトPD-L1およびTCR活性化タンパク質を発現する。2つの細胞型が共培養される場合、PD-1/PD-L1相互作用は、TCRシグナル伝達によって媒介される発光の誘導を阻害する。しかしながら、PD-1/PD-L1軸の生物学的阻害剤の存在は、反対の効果を誘導する。
実験の目的は、PKPD-L1ポリペプチドによる免疫化後に誘導された抗体が、細胞ベースのアッセイにおいてPD-1とPD-L1との相互作用によって媒介される生物学的効果を遮断することができるかどうかを評価することであった。この目的のために、これらの2つの分子間の相互作用を遮断する生物製剤の作用機序を模倣するPromega(商標)J1250アッセイを使用した。アッセイは、2つの遺伝子改変細胞ラインに基づく。第1のものは、その細胞膜上にヒトPD-1および発光を誘導するシグナルを伝達するT細胞受容体(TCR)を発現する、いわゆるエフェクター細胞である。第2のもの、いわゆる抗原提示細胞は、ヒトPD-L1およびTCR活性化タンパク質を発現する。2つの細胞型が共培養される場合、PD-1/PD-L1相互作用は、TCRシグナル伝達によって媒介される発光の誘導を阻害する。しかしながら、PD-1/PD-L1軸の生物学的阻害剤の存在は、反対の効果を誘導する。
ヒト生物学に密接に関連する自己非ヒト霊長類モデルにおいて免疫応答を誘導するPKPD-L1ポリペプチドの能力を試験するために、クロロセブス・エチオプス・サバエウス(Chlorocebus aethiops sabaeus)サルにおいて免疫原性を評価した。霊長類を、リン酸アルミニウムでアジュバント添加した200μgのキメラポリペプチドで皮下免疫した。さらに、この実験では、リン酸アルミニウムでアジュバント添加した髄膜炎菌(N.meningitidis)のLpdAタンパク質(200μg/用量)にコンジュゲートした2つのPD-L1合成ペプチド(配列表において配列番号23および配列番号24として特定される)の混合物も評価した。アジュバント添加混合物(各抗原用量を0.7mgのAl3+と組み合わせた)を2週間ごとに投与し、合計4回の免疫化を行った。4回目の免疫化の1週間後に血清を収集した。
各実験群(n=5)から得られた血清をプールし、IgGをプロテインAアフィニティークロマトグラフィー(GE Healthcare(商標))によって精製した。細胞ベースのアッセイを製造者の説明書に従って実施し、PD-1/PD-L1相互作用を遮断するための陽性対照としてアテゾリズマブを使用した。さらに、PD-1+エフェクター細胞/PD-L1+宿主細胞系で評価した各条件も、PD-1+エフェクター細胞/PD-L1+宿主細胞陰性および最大発光制御系に供した。各場合において、6つの複製を各条件について評価した。両細胞ラインの同時培養の30分後に発光を読み取った。このアッセイでは、PD-1/PD-L1相互作用の遮断活性は、ルシフェラーゼ活性の増加によって証明される。その結果、遮断活性は発光値の増加に正比例する。
表4は、リン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせたPKPD-L1ポリペプチドの高分子量凝集体の投与が、陰性対照群(対応のないスチューデントt検定、p<0.0001)と比較して、ヒトPD-L1に対する生物学的に活性なIgG抗体を生成することができることを示す。精製血清IgG画分について検出され、PD-L1ポリペプチドで免疫した霊長類から得られた発光は、陰性対照群について観察された値よりも3.56倍高かった。PD-L1ペプチドによる能動的免疫化戦略の場合、この比は、対応する陰性対照群よりも1.4倍高かった(マン・ホイットニー検定、p<0.0022)。これらの結果は、PD-L1ペプチド混合物によって生成された抗体と比較して、PKPD-L1変異体によって誘導された特異的抗体の優れた生物学的活性を示している。PKPD-L1ポリペプチドで免疫したサルの血清から精製したIgG画分の生物学的活性は、20μg/mLにおいてアテゾリズマブ陽性対照と類似していた。
例8.PKPD-L1ポリペプチドで免疫したマウスからのリンパ球の、PD-L1発現腫瘍細胞を直接溶解する能力の評価。
PKPD-L1ポリペプチドが特異的細胞傷害性Tリンパ球を誘導することができるかどうかを評価するために、免疫適格性マウスの脾臓から単離されたリンパ球を腫瘍細胞と共培養するアッセイを開発した。リンパ球の細胞傷害性活性を腫瘍細胞の溶解率として表した。マウス株C57Bl6およびBalb/cとそれぞれ同系の腫瘍ラインMC38およびCT26を実験に使用した。これらの細胞は膜上でPD-L1を発現し、主要I型組織適合遺伝子複合体に関連するこのタンパク質のペプチドを提示することができる。
PKPD-L1ポリペプチドが特異的細胞傷害性Tリンパ球を誘導することができるかどうかを評価するために、免疫適格性マウスの脾臓から単離されたリンパ球を腫瘍細胞と共培養するアッセイを開発した。リンパ球の細胞傷害性活性を腫瘍細胞の溶解率として表した。マウス株C57Bl6およびBalb/cとそれぞれ同系の腫瘍ラインMC38およびCT26を実験に使用した。これらの細胞は膜上でPD-L1を発現し、主要I型組織適合遺伝子複合体に関連するこのタンパク質のペプチドを提示することができる。
C57Bl6およびBalb/cマウスを、アジュバントsNAcGM3-VSSP(100μg)と組み合わせた100μgの異なるPD-L1変異体で皮下免疫した。動物(n=5)に、上述のアジュバントと組み合わせたPD-L1CHO、PKPD-L1またはコンジュゲートペプチドの混合物を2ヶ月間にわたって毎週投与した。最後の免疫化の1週間後、脾臓を外科的に除去し、灌流し、赤血球を溶解した。続いて、10%ウシ胎児血清を補充したRPMI培地にリンパ球を懸濁した。このリンパ球(エフェクター細胞)を抗CD3(eBioscience(商標))抗体で標識し、フローサイトメトリーによって計数した。細胞ラインMC38およびCT26を蛍光試薬カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識し、RPMI培地に再懸濁し、標的細胞として使用した。CFSE標識細胞をフローサイトメトリーによって計数した。
C57Bl6マウスからのリンパ球(2×106個のCD3+)を直ちに2×104個のMC38細胞と混合した(100:1の比)。Balb/cマウスの脾臓から単離したリンパ球を、最初に30μg/mLのネイティブPD-L1タンパク質(PD-L1/Fc)でインビトロで6日間活性化し、3日目に10単位/mLのIL-2を添加した。活性化後、同じ比を使用して、エフェクター細胞をCT26標的細胞と共インキュベートした。両方の場合において、陰性溶解対照を使用し、エフェクター細胞を添加する代わりに、ウシ胎児血清を補充したRPMI培地と共に標的細胞をインキュベートした。エフェクター細胞を標的細胞と共に4時間インキュベーションした後、混合物をPBSに再懸濁し、CFSE陽性標的細胞をフローサイトメトリー(PARTECサイトメーター、ドイツ)によって計数した。結果を表5に示す。細胞傷害性を、発現に従って標的細胞(腫瘍細胞)の溶解の百分率として表した:
%溶解=100%-[(エフェクター細胞と共にインキュベートしたCFSE陽性標的細胞の数)/(培地と共にインキュベートしたCFSE陽性標的細胞の数)×100]
%溶解=100%-[(エフェクター細胞と共にインキュベートしたCFSE陽性標的細胞の数)/(培地と共にインキュベートしたCFSE陽性標的細胞の数)×100]
表5は、高分子量凝集体の形態で会合したPD-L1ポリペプチドの投与が細胞性免疫に対してプラスの効果を有することを示す。C57Bl6株を用いた実験では、対照群と比較して、PD-L1CHO(テューキー検定、p=0.0169);PKPD-L1(テューキー検定、p<0.0001)およびペプチド混合物(テューキー検定、p=0.0332)で免疫した群の脾臓から単離したリンパ球との共インキュベーション後に、MC38腫瘍細胞の溶解の有意な増加が検出された。PKPD-L1ポリペプチドは、ネイティブ変異体PD-L1CHOについて(テューキー検定、p<0.0001)、またはPD-L1ペプチド混合物について(テューキー検定、p<0.0001)得られたリンパ球よりも有意に高い細胞傷害性活性を有するリンパ球を生成することができた。
Balb/c株を用いた実験では、対照群と比較して、PD-L1CHO(テューキー検定、p=0.0065)およびPKPD-L1(テューキー検定、p<0.0001)で免疫した群の脾臓から単離したリンパ球で、CT26腫瘍細胞の溶解の有意な増加が検出された。それにもかかわらず、ペプチド混合物で免疫したマウスから単離したリンパ球は、細胞傷害性活性を誘導しなかった(テューキー検定、p=0.7857)。PKPD-L1ポリペプチドはまた、異なる遺伝的背景を有するこのマウス株において免疫原性における優位性を示した。PKPD-L1で免疫した後、単離されたリンパ球は、ネイティブ変異体PD-L1CHOで免疫したマウスから得られたリンパ球よりも高い活性を有していた(テューキー検定、p=0.0009)。
例9.PD-L1変異体による免疫化後のF3II乳癌マウスモデルにおける抗腫瘍および抗転移効果
アジュバントsNAcGM3-VSSPと組み合わせた異なるPD-L1変異体の投与後の抗腫瘍および抗転移活性を、F3II乳癌マウスモデルを使用して評価した。雌Balb/cマウス(9匹/群)を、例8に記載されているように、sNAcGM3-VSSPをアジュバント添加した100μgの抗原で皮下免疫した。F3II細胞ラインは、肺に自然に転移する能力を有するBALB/c移植可能乳癌のクローン亜集団から生成した。4回目の免疫化の4日後に、免疫化部位とは反対側の脇腹に、20万個のF3II細胞を背側領域に皮下投与した。腫瘍細胞を移植し、測定可能な成長を検出した後、腫瘍体積を記録した。
アジュバントsNAcGM3-VSSPと組み合わせた異なるPD-L1変異体の投与後の抗腫瘍および抗転移活性を、F3II乳癌マウスモデルを使用して評価した。雌Balb/cマウス(9匹/群)を、例8に記載されているように、sNAcGM3-VSSPをアジュバント添加した100μgの抗原で皮下免疫した。F3II細胞ラインは、肺に自然に転移する能力を有するBALB/c移植可能乳癌のクローン亜集団から生成した。4回目の免疫化の4日後に、免疫化部位とは反対側の脇腹に、20万個のF3II細胞を背側領域に皮下投与した。腫瘍細胞を移植し、測定可能な成長を検出した後、腫瘍体積を記録した。
腫瘍チャレンジの35日後、マウスを安楽死させ、続いて肺を除去した。マクロ転移を計数するために、肺をブアン溶液(Sigma(商標))に少なくとも48時間浸漬した。立体鏡(Zeiss(商標))を使用してマクロ転移を計数した。結果を表6に示す。
表6は、F3IIマウス腫瘍細胞によるチャレンジの18日後の腫瘍体積評価からの結果を示す。アジュバントsNAcGM3-VSSPを有するPKPD-L1ポリペプチドの投与は、陰性対照群と比較した場合、腫瘍成長を有意に低減した(テューキー検定、p<0.0001)。PD-L1CHO変異体の投与も腫瘍成長の低減を誘導したが、このパラメータへの影響は少なかった(テューキー検定、p=0.0052)。対照的に、コンジュゲートペプチドの混合物では腫瘍成長の減少は証明されなかった(テューキー検定、p=0.1598)。PKPD-L1ポリペプチドによる免疫化は、PD-L1CHOによる能動的免疫治療によって生じる効果と比較して、腫瘍体積のより大きな減少を引き起こした(テューキー検定、p<0.0058)。
表6はまた、異なるPD-L1変異体で免疫した動物における自然肺転移の数を示す。アジュバントsNAcGM3-VSSPとの関連で融合ポリペプチドPKPD-L1または変異体PD-L1CHOの投与は、アジュバントおよび賦形剤で処置した対照群の動物の肺に見られる転移と比較して、肺への転移の移植を阻害した(テューキー検定、p<0.0001)。対照的に、転移の移植の低減に対する効果は、コンジュゲートペプチドの混合物で免疫した場合には証明されなかった(テューキー検定、p=0.4311)。腫瘍体積に関して、PKPD-L1ポリペプチドによって生じた免疫応答は、ネイティブPD-L1変異体(テューキー検定、p=0.0004)またはこのリガンドからの2つのペプチドの混合物(テューキー検定、p<0.0001)による能動的免疫治療後に生じた免疫応答の効果と比較した場合、転移の数の低減において優れた能力を有していた。
例10.マウスにおける肺転移の処置におけるPKPD-L1ポリペプチドの投与の有効性。
肺転移は、がん死の主な原因である。PKPD-L1ポリペプチドによる免疫化は、強力な体液性および細胞性免疫応答を誘導する。この融合ポリペプチドの投与後に生じた免疫応答エフェクターの抗転移能をいくつかのモデルで評価した。12匹のマウスの群を、100μgのsNAcGM3-VSSPと組み合わせた100μgのポリペプチドで免疫した。マウスを2ヶ月間免疫し、1週間に1回用量を皮下投与した。各モデルの要件に従って腫瘍チャレンジを行った。転移負荷の分析は、肺重量によって、または解剖顕微鏡下での転移計数によって評価した。マウス株C57Bl/6での研究のために、転移性肺癌3LLD122の2.5×105個の細胞を、4回目の免疫化の3日後にフットパッドに接種した。原発腫瘍を移植の20日後に手術によって除去し、動物を手術の15日後に屠殺したが、これは肺自然転移の発生が予想される時間であった。この場合、肺の重量を各群で決定した。
肺転移は、がん死の主な原因である。PKPD-L1ポリペプチドによる免疫化は、強力な体液性および細胞性免疫応答を誘導する。この融合ポリペプチドの投与後に生じた免疫応答エフェクターの抗転移能をいくつかのモデルで評価した。12匹のマウスの群を、100μgのsNAcGM3-VSSPと組み合わせた100μgのポリペプチドで免疫した。マウスを2ヶ月間免疫し、1週間に1回用量を皮下投与した。各モデルの要件に従って腫瘍チャレンジを行った。転移負荷の分析は、肺重量によって、または解剖顕微鏡下での転移計数によって評価した。マウス株C57Bl/6での研究のために、転移性肺癌3LLD122の2.5×105個の細胞を、4回目の免疫化の3日後にフットパッドに接種した。原発腫瘍を移植の20日後に手術によって除去し、動物を手術の15日後に屠殺したが、これは肺自然転移の発生が予想される時間であった。この場合、肺の重量を各群で決定した。
第2の実験では、実験的転移モデルを使用した。C57Bl/6マウスに、マウスMB16F10黒色腫細胞(5×104個)を尾静脈によって、6回目の免疫化の4日後に接種した。17日後、動物を屠殺し、肺の黒色の着色コロニーを計数した。
BALB/cマウス株では、後眼窩叢を通して5×104個のCT26結腸直腸癌細胞を静脈内接種した後、4回目の免疫化の5日後に投与した後に、肺転移を評価した。腫瘍チャレンジの30日後にマウスを屠殺し、肺内のコロニーを計数した。これらの実験の結果を表7にまとめる。
対照に対する各PKPD-L1処置群からの結果の比較を、各実験モデルについて独立して行った。表7に観察されるように、研究したすべてのモデルにおいて、PD-L1で免疫したマウスからの肺における転移負荷は、それらの対照群と比較して有意に低かった(スチューデントt検定:3LLD122,p<0.0001;MB16F10,p=0.0475;CT26 p=0.0046)。
例11.PD-L1に特異的な受動的および能動的免疫治療の組み合わせ。
PD-L1に特異的な受動的免疫治療と能動的免疫治療との組み合わせの抗腫瘍活性をCT26マウス腫瘍モデルで評価した。雌Balb/cマウス(n=9/群)を、例4に記載のスキームを使用して、0.7mgのリン酸アルミニウムをアジュバント添加した200μgのPKPD-L1ポリペプチドで皮下免疫した。2回目の免疫化の12日後、免疫化部位とは反対側の背側領域に2×104個のCT26細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジの1日後、PD-L1遮断抗体(ラットIgG2bアイソタイプ;クローン10F.9G2;BIOXCELL)を週に1回投与して、4回の投与処置期間を完了した。抗体を12.5mg/kgの用量で腹腔内経路で投与した。免疫治療の各タイプについて、陰性対照群を使用した。受動的免疫治療では、対照抗体、ラットIgG2bアイソタイプ(BioXCell(商標)、BE0090)を投与し、能動的免疫治療では、PBSおよびリン酸アルミニウムアジュバントを受けた群を陰性対照として使用した。腫瘍細胞を移植し、測定可能な腫瘍を検出した後、腫瘍体積を記録した。
PD-L1に特異的な受動的免疫治療と能動的免疫治療との組み合わせの抗腫瘍活性をCT26マウス腫瘍モデルで評価した。雌Balb/cマウス(n=9/群)を、例4に記載のスキームを使用して、0.7mgのリン酸アルミニウムをアジュバント添加した200μgのPKPD-L1ポリペプチドで皮下免疫した。2回目の免疫化の12日後、免疫化部位とは反対側の背側領域に2×104個のCT26細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジの1日後、PD-L1遮断抗体(ラットIgG2bアイソタイプ;クローン10F.9G2;BIOXCELL)を週に1回投与して、4回の投与処置期間を完了した。抗体を12.5mg/kgの用量で腹腔内経路で投与した。免疫治療の各タイプについて、陰性対照群を使用した。受動的免疫治療では、対照抗体、ラットIgG2bアイソタイプ(BioXCell(商標)、BE0090)を投与し、能動的免疫治療では、PBSおよびリン酸アルミニウムアジュバントを受けた群を陰性対照として使用した。腫瘍細胞を移植し、測定可能な腫瘍を検出した後、腫瘍体積を記録した。
表8は、平均±標準偏差として示された、CT26マウス腫瘍細胞によるチャレンジの30日後の腫瘍体積測定値を示した。
ラット抗マウスPD-L1抗体の投与は、アイソタイプ対照で処置した群と比較して、腫瘍体積の有意な低減を示した(ダネット検定、p=0.003)。PKPD-L1ポリペプチドによる免疫も、賦形剤+アジュバントで処置した群と比較して、腫瘍体積の低減において有意な効果を示した(ダネット検定、p=0.0001)。組み合わせ処置は、PD-L1ベースの能動的免疫治療(ダネット検定、p=0.0233)および抗PD-L1抗体による受動的免疫治療(Dunnetの検定、p=0.0332)と比較して、腫瘍縮小に関して優れた結果を示した。これらの結果は、両方ともPD-L1を標的とする受動的免疫治療と能動的免疫治療とを組み合わせることの可能性を示唆している。
例12.流入領域リンパ節および腫瘍浸潤リンパ球における細胞亜集団に対するPKPD-L1投与の効果。
抗PD-L1治療がPD-L1誘導免疫抑制の復帰に対する効果を有するかどうかを評価するために、リンパ節および腫瘍内の細胞集団の割合を試験した。この実験では、Balb/cマウス(n=9)に、200μgのキメラPKPD-L1ポリペプチドとアジュバントとしての0.7mgのリン酸アルミニウムとの混合物を含有して、14日間のスケジュールで2回の皮下免疫化を行った。最初の免疫の3日後、免疫化の反対側に投与して、2×104個の結腸腫瘍細胞CT26をマウスの皮下にチャレンジした。2回目の免疫化の7日後、マウスを屠殺して腫瘍および流入領域リンパ節を抽出した。CD4+およびCD8+Tリンパ球における平均蛍光強度として測定された膜PD-1レベルを、試料において評価した。
抗PD-L1治療がPD-L1誘導免疫抑制の復帰に対する効果を有するかどうかを評価するために、リンパ節および腫瘍内の細胞集団の割合を試験した。この実験では、Balb/cマウス(n=9)に、200μgのキメラPKPD-L1ポリペプチドとアジュバントとしての0.7mgのリン酸アルミニウムとの混合物を含有して、14日間のスケジュールで2回の皮下免疫化を行った。最初の免疫の3日後、免疫化の反対側に投与して、2×104個の結腸腫瘍細胞CT26をマウスの皮下にチャレンジした。2回目の免疫化の7日後、マウスを屠殺して腫瘍および流入領域リンパ節を抽出した。CD4+およびCD8+Tリンパ球における平均蛍光強度として測定された膜PD-1レベルを、試料において評価した。
1グラムの腫瘍塊を酵素的(eBioscience(商標))および機械的解離に供した。死細胞を試薬キット(eBioscience(商標))を用いて腫瘍懸濁液から除去した。生存細胞懸濁液を、選択マーカーCD45および磁気ビーズ(eBioscience(商標))の使用による陽性白血球選択に供した。CD45+細胞懸濁液の溶出後、リンパ球を抗CD3、抗CD4または抗CD8および抗PD-1抗体(eBioscience(商標))による多重免疫染色に供した。流入領域リンパ節をRPMI培地中で柔らかくし、細胞懸濁液を30μMフィルターに通し、前の試料について記載したように多重標識に供した。流入領域リンパ節および腫瘍内に位置するCD4+およびCD8+T細胞サブセットの膜上のPD-1の存在の評価をフローサイトメトリーによって実施した。
表9に示すように;アジュバント添加PKPD-L1ポリペプチドで免疫したマウスからの流入領域リンパ節内のCD4+Tリンパ球集団は、陰性対照群のマウスからのリンパ球で見られたものよりも有意に低いPD-1膜レベルを有していた(対応のないスチューデントt検定、p=0.0056)。CD8+Tリンパ球集団の分析から同様の結果が得られた(対応のないスチューデントt検定、p=0.0014)。この実験的証拠は、CD4+(対応のないスチューデントt検定、p=0.0156)およびCD8+(対応のないスチューデントt検定、p=0.0240)腫瘍浸潤リンパ球についても得られた。したがって、キメラポリペプチドPKPD-L1をワクチン抗原として用いるPD-L1特異的能動的免疫治療は、活性化リンパ球の特有の表現型を有するCD4+およびCD8+T細胞を、具体的には腫瘍および流入領域リンパ節などの関連する免疫学的部位において生じさせる。
例13.PKPD-L1ポリペプチドおよびアジュバントであるリン酸アルミニウムまたはsNAcGM3-VSSPの投与後の安全性プロファイルの評価。
雌Balb/cマウス(n=5)および雌ニュージーランドウサギ(n=4)を、200μgのPKPD-L1キメラポリペプチドで皮下免疫化した。アジュバントとしてVSSPを用いた免疫化スキームは、8回の毎週のワクチン接種を含んでいた。マウスでは、キメラポリペプチドに100μgのsNAcGM3-VSSPをアジュバント添加し、ウサギでは200μgのsNAcGM3-VSSPをアジュバント添加した。
雌Balb/cマウス(n=5)および雌ニュージーランドウサギ(n=4)を、200μgのPKPD-L1キメラポリペプチドで皮下免疫化した。アジュバントとしてVSSPを用いた免疫化スキームは、8回の毎週のワクチン接種を含んでいた。マウスでは、キメラポリペプチドに100μgのsNAcGM3-VSSPをアジュバント添加し、ウサギでは200μgのsNAcGM3-VSSPをアジュバント添加した。
PKPD-L1とリン酸アルミニウムとの組み合わせの場合、200μgのキメラポリペプチドに0.7mgのリン酸アルミニウムをアジュバント添加し、用量を14日ごとに、合計4回の免疫化について投与した。抗原とアジュバントとの各組み合わせについて、陰性対照群を各抗原製剤の賦形剤およびそれらのそれぞれのアジュバントで免疫した。
マウス実験では、2つの追加の受動的免疫治療群を含めた。1つの群には、マウスPD-L1に特異的なラット抗体(BioXCell(商標)、クローン10F.9G2、12.5mg/kg)の4回の毎週の腹腔内投与を行った。他の群を、同じアイソタイプの無関係の抗体(BioXCell(商標)、クローンBE0090)で、同じ用量およびスケジュールを使用して処置した。
両方の研究において、毎週の体重評価を、免疫化の間の異なる時間に実施した。免疫化が完了すると、生物学的試料を抽出し、これは、両方の動物種の動物の100%で行うことができた。
マウスの場合、免疫化スキームの最後に、心臓、肺、脾臓および他の10個の器官を組織病理学のために処理した。肉眼および顕微鏡の両方で、器官の定性的評価を行った。顕微鏡的評価および組織学的診断のために、試料を各適切な方法で処理した。能動的または受動的免疫化群で変化が見られ、対応するプラセボ群では変化が検出されなかった場合、処置関連有害事象とみなした。
ウサギの場合、2つの血液試料を、一方は免疫化を開始する前に、他方は最後の免疫化の1週間後に収集した。各血液抽出物を使用して、血漿(血液学的決定のため)および血清(臨床生化学的決定のため)を得た。血液学的決定は、他のパラメータの中でも、様々な細胞型の計数および/または百分率を含んでいた。血液生化学的決定は、とりわけ、ヘモグロビン濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼ酵素濃度、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素濃度、クレアチニン濃度を含んでいた。各パラメータについて、免疫化の前および後に得られた値間、処置群と対応するプラセボ群との間で比較を行い、種について報告された参照生理学的範囲とも比較した。PKPD-L1ポリペプチドで免疫した群で変化が見られ、対応するプラセボ群では変化が観察されなかった場合、処置関連有害事象とみなした。
除去された器官のグロス分析は、マウスPD-L1に特異的なラット抗体による受動的免疫治療を受けた5匹のマウスのうち2匹の肺における出血の存在を示した。これら2匹のマウスのうち、1匹は胸腺出血も有していた。実験群の残りでは、器官は肉眼的変化を示さなかった。一方、顕微鏡分析により、2匹の上述のマウスにおいて肉眼レベルで検出された肺および胸腺で観察された出血事象が確認された。この群の他の3匹のマウスは、気管支のレベルで肺に炎症細胞の浸潤を有することを特徴とした。マウスPD-L1に対する特異的抗体で処置した5匹のマウスでは、すべて、結腸のレベルで粘膜炎を示した。この群に属する器官の残りは、いかなる種類の顕微鏡的変化も示さなかった。対照的に、異なるプラセボ群に属するマウスの器官、または両方のアジュバントと組み合わせたPKPD-L1ポリペプチドで免疫したマウスの器官では、顕微鏡的変化は観察されなかった。
血液学および臨床生化学の結果は、PKPD-L1ポリペプチドによるウサギの免疫化の前および後に行われた決定の間に有意な変化がないことを示した。免疫化群とその対応するプラセボ群との間に有意差はなかった。一般に、免疫化群およびプラセボ群のすべての血液学および生化学パラメータは生理学的範囲内であった。マウスおよびウサギの両方において、評価した時間が異なっていても、対応するプラセボ群で見られるものに対して、免疫化群の体重に有意な効果は検出されなかった。
これらの結果は、sNAcGM3-VSSPまたはリン酸アルミニウムの両方においてアジュバント添加されたキメラPKPD-L1ポリペプチドによる免疫化が安全な免疫応答を生じることを示している。この能動的免疫治療戦略は、有害作用がないため、特異的モノクローナル抗体による受動的免疫治療戦略に関連して利点を提供する。
配列表1 <223>人工配列の記載:キメラ抗原PKPD-L1
配列表20~21 <223>人工配列の記載:pM238をクローニングするための合成オリゴヌクレオチド
配列表22 <223>人工配列の記載:組換えタンパク質PKPD-L1のコード領域のヌクレオチド配列
配列表20~21 <223>人工配列の記載:pM238をクローニングするための合成オリゴヌクレオチド
配列表22 <223>人工配列の記載:組換えタンパク質PKPD-L1のコード領域のヌクレオチド配列
Claims (11)
- ネイティブ型のPD-L1と比較してPD-1およびCD80受容体に対する結合能が低下した多量体凝集体を形成するヒトプログラム死リガンド1(PD-L1)の細胞外ドメインを含む、キメラ抗原。
- 細菌におけるその発現を増加させるためのアミノ末端セグメントと、アフィニティークロマトグラフィーによるその精製を容易にするためのカルボキシ末端セグメントとを含む、請求項1に記載のキメラ抗原。
- 配列番号1として特定されるアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項2に記載のキメラ抗原。
- a)ネイティブ型のPD-L1と比較してPD-1およびCD80受容体に結合する能力が低下した多量体を形成するヒトプログラム死リガンド-1(PD-L1)の細胞外ドメインを含むキメラ抗原、ならびにb)少なくとも1つの薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む、医薬組成物。
- 前記ワクチンアジュバントが、オイルアジュバント、鉱物塩、プロテオリポソーム、およびガングリオシドにコンジュゲートしたプロテオリポソームによって構成される群から選択される、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記ワクチンアジュバントがアルミニウム塩である、請求項5に記載の医薬組成物。
- がんまたはその転移を処置するための薬物を製造するための、ネイティブ型のPD-L1と比較してPD-1およびCD80受容体に対する結合能が低下した多量体を形成するヒトプログラム死リガンド1(PD-L1)の細胞外ドメインを含むキメラ抗原の使用。
- がんを処置するための前記薬物が、能動的免疫治療のためのワクチンである、請求項7に記載のキメラ抗原の使用。
- a)ネイティブ型のPD-L1と比較してPD-1およびCD80受容体に対する結合能が低下した多量体を形成するヒトプログラム死リガンド1(PD-L1)の細胞外ドメインを含むキメラ抗原、ならびにb)少なくとも1つの薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む医薬組成物の治療有効量の投与を特徴とする、必要性のある個体におけるがんまたはその転移を処置するための方法。
- 前記キメラ抗原を含む前記組成物の前記投与が、受動的免疫治療または標準的ながん治療と同時にまたは順次に組み合わされる、請求項9に記載の方法。
- 前記受動的免疫治療が、ヒトPD-L1またはヒトプログラム細胞死タンパク質受容体1(PD-1)に対する抗体を用いて実施される、請求項10に記載の方法。
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