KR102412628B1

KR102412628B1 - 전기분무 기술을 이용한 루프롤라이드 함유 서방성 미립구의 제조방법

Info

Publication number: KR102412628B1
Application number: KR1020170108842A
Authority: KR
Inventors: 조혜영; 이동석; 천성문; 신화진; 최고운
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-28
Filing date: 2017-08-28
Publication date: 2022-06-23
Also published as: KR20190023314A

Abstract

전기분무 기술을 이용한 루프롤라이드 함유 서방성 미립구의 제조 방법을 제공한다. 루프롤라이드의 서방성 미립구 제조에 있어서, 초기 과다방출 및 약물 손실율을 크게 개선시키고, 시험관 및 생체 내 조건에서 루프롤라이드를 유효농도로 장기간 동안 지속적으로 방출하도록 함으로써, 기존 서방성 미립구 제형에서 나타나는 문제점을 해결할 수 있다.

Description

전기분무 기술을 이용한 루프롤라이드 함유 서방성 미립구의 제조방법 {Method for manufacturing sustained release microsphere containing leuprolide prepared by electrospraying}

전기분무 기술을 이용한 루프롤라이드 함유 서방성 미립구 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

펩티드 및 단백질 약물은 높은 효능, 낮은 면역원성 등으로 제약 산업에서의 그 중요성이 점차 증가하고 있다. 그러나 이러한 펩티드 약물은 짧은 반감기와 낮은 생체이용률을 가지는 단점이 있다.

루프롤라이드(leuprolide)는 펩티드 약물의 일종으로서, 전립선암 등을 치료하기 위한 약물로서 이용되고 있다. 기존 1일 1회 피하 주사를 하는 제형으로서 시판되었으나 이후, 폴리(락타이드-코-글리콜리드)(PLGA)를 이용한 1개월용 서방형 미립구 주사 제형이 개발되어 상기한 단점들을 극복하였다.

서방성 미립구를 제조하는 일반적인 방법으로는 상분리법, 용매증발법 및 분무건조법 등이 알려져 있다. 그러나 이러한 방법들을 이용하여 제조한 서방성 미립구는 생리활성물질의 초기 과다방출, 제조 과정 중의 약물의 과다 손실, 펩티드 또는 단백질 약물의 열에 의한 변성, 불균일한 모양 등 여러가지 단점들을 가지고 있다.

일 양상은 전기분무 기술을 이용한 루프롤라이드를 함유하는 서방성 미립구를 제공한다.

다른 양상은 전기분무 기술을 이용하여 루프롤라이드를 함유하는 서방성 미립구를 제조하는 방법을 제공한다.

일 양상은 루프롤라이드 및 제1 용매를 포함하는 제1 용액; 및 생체적합성 고분자 및 제2 용매를 포함하는 제2 용액을 포함하고, 상기 제1 용액은 상기 제2 용액으로 둘러싸인 형태인, 루프롤라이드를 포함하는 서방성 미립구를 제공한다.

용어 "루프롤라이드"(leuprolide)는 9개의 펩티드를 포함하는 합성 펩티드 약물(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt (Pyr = L-Pyroglutamyl))을 의미하며, 루프로렐린(leuprorelin)이라고 불린다. 성선자극호르몬 수용체를 자극하는 황체형성호르몬 방출호르몬의 초-작용제(superagonist)로서 작용하며, 전립선암, 유방암, 자궁내막증, 자궁근종, 또는 성조숙증 등을 치료하는 효과가 있다고 알려져 있다. 본 명세서에서 용어 "루프롤라이드"는 특별히 다른 언급이 없는 한 루프로렐린, 또는 루프롤라이드 및 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 동질이상체, 수화물, 용매화물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 의미로서 사용된다.

용어 "생체적합성"('생분해성' 또는 '생체 흡수성'과 호환적으로 사용됨) 고분자는 생체 내에서 흡수되고, 이산화탄소, 질소, 물, 무기염류 등 의약학적으로 안전한 부산물만을 생성하며 분해될 수 있는 임의의 고분자 물질을 의미할 수 있다. 생체적합성 물질은 생체 내에서 화학적으로 분해되거나, 또는 화학적으로 분해될 필요는 없지만, 약물의 정상적인 생체 내 수명보다 상당히 긴 기간 동안 약물의 치료 효과량을 방출할 수 있는 방식으로 생체 내에서 분산되거나 용해되거나 또는 분해되는 물질을 포함할 수 있다. 생체적합성 물질은 생체 내에서 분해될 수 있는 무독성 고분자라면 모두 사용할 수 있는데, 예로는 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리안하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리카프로락톤, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 그들의 공중합체 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생체적합성 물질은 단일 중합체 또는 공중합체, 또는 중합체들의 임의의 조합 또는 블렌드일 수 있다. 생체적합성 중합체 물질의 예는 분해시 생리학적으로 허용되는 분해 생성물을 생성하는 에스터, 에테르, 무수물, 아마이드, 또는 오르쏘에스터와 같은 단량체로 이루어지는 중합체를 포함할 수 있다. 중합체 물질은 가교 결합되거나 비-가교 결합될 수 있다. 가교 결합되는 경우, 이들은 약하게 예를 들면, 5% 또는 1% 미만으로 가교 결합될 수 있다. 상기 생체적합성 고분자는 수불용성일 수 있다. 상기 생체적합성 고분자가 예를 들어 PLGA인 경우, PLGA 및 다른 생체적합성 고분자와의 공중합체의 비율이 30:70 내지 85:15이고, 분자량이 4,000 내지 240,000 달톤일 수 있다. 인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)이다. 또는 PLGA 및 다른 생체적합성 고분자와의 공중합체의 비율이 40:60 내지 60:40이고, 분자량이 7,000 내지 54,000 달톤일 수 있다. PLGA는 에보닉(Evonik)사로부터 Resomer R202S, R202H, R203S, 203H, RG502, RG502H, RG503, RG503H, RG504, RG504H, RG505, RG653H, RG752H, RG756S, RG858S 5050DLG, 6535DLG, 7525DLG 및 8515DLG등의 상품명으로 상업적 구매가 가능하다.

용어 "미립구(microsphere)"는 제형에 약물을 봉입시키기 위한 입자를 의미할 수 있으며, 미립자, 나노입자(nanoparticle) 또는 나노구(nanosphere)와 호환적으로 사용된다. 미립자는 미크론 또는 ㎛ 범위 정도, 또는 더 작은 크기의 입자, 예를 들면, 약 0.1 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 30 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 또는 약 40 ㎛ 내지 약 50 ㎛의 직경을 가진 임의의 입자들을 포함한다. 미립구는 예를 들면, 대략적인 구형(예컨대, 미소구체), 구형, 타원형, 원통형, 막대 모양 등과 같은 임의의 모양의 것일 수 있다. 일 양상에 따른 서방성 미립구의 직경은 약 6.0 내지 11.0 ㎛일 수 있다.

용어 "서방성"은 제형에 포함된 약학적 활성 물질이 의도된 기간 동안 지속적으로 방출될 수 있는 것을 의미한다. 서방성 제형은 적게는 수분 내지 수시간, 길게는 수일 내지 수개월간 제형 내 포함된 약학적 활성 물질을 방출할 수 있다. 다만, 방출량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 가변적일 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 제형의 투여량을 적절히 조절할 수 있다.

상기 제1 용매는 루프롤라이드에 대한 용해성이 높은 용매일 수 있다. 따라서, 상기 제1 용매는 수용성 용매일 수 있다. 상기 제1 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 제2 용매는 생체적합성 고분자에 대한 용해성이 높고, 루프롤라이드에 대한 용해성이 낮은 용매일 수 있다. 따라서 상기 생체적합성 고분자 및 상기 제2 용매는 수불용성일 수 있다. 상기 제2 용매는 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 서방성 미립구는 상기 제1 용액이 상기 제2 용액으로 둘러싸인 형태일 수 있다. 따라서, 상기 제1 용액에 포함된 루프롤라이드는 상기 제2 용액에 포함된 생체적합성 고분자에 의해 방출이 제어될 수 있다. 이러한 형태의 서방성 미립구는, 예를 들면, 제1 용액 및 제2 용액의 혼합액을 전기분무하여 제조할 수 있다.

상기 서방성 미립구는 상기 루프롤라이드 및 생체적합성 고분자를 1:20 내지 1:40의 중량비로 포함하는 것일 수 있다.

상기 제1 용액의 루프롤라이드의 농도는 0.5 내지 10 w/v%, 또는 1 내지 5 w/v%, 또는 약 2.5 w/v%일 수 있다.

상기 제2 용액의 생체적합성 고분자의 농도는 12.5 w/v% 내지 25 w/v% 일 수 있다. 생체적합성 고분자의 농도가 12.5 w/v% 미만일 경우, 전체 용액 및 함유된 루프롤라이드의 양에 대한 생체적합성 고분자의 비율이 낮아 전기분무 및 건조시 약물이 포함된 제1 용액이 제조된 미립구에 잘 봉입이 되지 않을 수 있고, 25 w/v%를 초과할 경우 섬유 상(phase)의 생체적합성 고분자가 제조되는 문제가 발생할 수 있다.

상기 제2 용액의 비율은 전체 혼합물에 대해 70 내지 90%, 또는 그 이상일 수 있다. 제2 용액(고분자상 용액)의 비율이 70% 이하일 경우, 혼합물에서 생체적합성 고분자가 다시 석출되는 문제가 발생할 수 있으며, 제1 용액(약물상 용액)의 용매가 불완전 건조되어 수득율이 저하될 수 있다. 고분자상 용액의 비율이 90% 이상일 경우 약물상 용액이 균일하게 분포되지 못할 수 있다.

일 양상에 따른 상기 서방성 미립구는 90% 이상의 루프롤라이드 봉입율을 가질 수 있다.

일 양상에 따른 상기 서방성 미립구는 개체에 투여 후 24시간 내에 상기 루프롤라이드의 20 내지 40%가 방출되고, 그 이후 15일 내지 30일간 남은 루프롤라이드가 방출되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 양상에 따른 실시예에서는, 루프롤라이드 및 PLGA를 1:20의 중량비로, 루프롤라이드는 메탄올에, 폴리(락타이드-코-글리콜리드)는 아세톤에 완전히 용해시키고 1:4의 부피비로 혼합한 후 20 cm의 노즐거리, 16.1내지 18.6 kV의 인가전압, 0.4 mL/h의 분사속도의 조건에서 전기분무하여 미립구를 제조하였다. 상기 미립구를 SEM (scanning electron microscopy), DSC (differential scanning calorimetry) 및 FTIR (fourier transform infrared spectroscopy)에 의해 물리화학적 성상을 평가하였으며, 제조된 미립구는 90.00% 이상의 봉입률을 나타냈다. 시험관 내 방출시험을 통해 제조한 서방성 미립구의 방출패턴 및 서방성을 평가한 결과, 50%의 루프롤라이드가 방출되는 시간이 2시간 내지 24일까지 다양하게 나타났으며, 본 발명의 일 실시예를 통해 약물의 방출을 용이하게 조절할 수 있음을 확인하였다. 특히 폴리(락타이드-코-글리콜리드) RG502H를 사용하여 제조한 제조예9의 경우 28일간의 방출시험 기간동안 균일한 속도로 루프롤라이드를 방출하였으며, 50% 루프롤라이드 방출시간이 12.6일로 비교예와 가장 유사하게 나타났다(11.5일). 또한 제조예9는 랫드에서의 약물동태학적 평가에서 C_max에서 루프롤라이드 용액에 대해 10.02배, 비교예 대해 1.97배 감소시키는 특성을 나타내었는데, 이는 본 발명의 일 양상에 따른 서방성 미립구가 초기 과다방출 특성을 유의적으로 감소시킬 수 있다는 것을 의미한다.

다른 양상은 상기 루프롤라이드를 포함하는 서방성 미립구를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%의 루프롤라이드를 포함할 수 있다. 또한, 루프롤라이드의 투여 용량은 0.01 mg 내지 10,000 mg, 0.1 mg 내지 1000 mg, 1 mg 내지 100 mg, 0.01 mg 내지 1000 mg, 0.01 mg 내지 100 mg, 0.01 mg 내지 10 mg, 또는 0.01 mg 내지 1 mg일 수 있다. 또한, 루프롤라이드의 투여 용량은 1.0× 10⁵ 내지 1.0× 10⁸ 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 흡입, 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 일 양상에 따른 서방성 미립구가 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 첨가물 중에 용해 또는 분산되어 있거나 또는 용해 또는 분산되어 있는 용액 상태로 동결된 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 루프롤라이드를 포함하고 있어, 루프롤라이드가 약학적 효능을 갖는다고 알려진 전립선암, 유방암, 자궁내막증, 자궁근종, 또는 성조숙증을 치료하는데 이용될 수 있다.

다른 양상은 루프롤라이드가 제1 용매에 용해된 제1 용액을 준비하는 단계; 생체적합성 수불용성 고분자가 제2 용매에 용해된 제2 용액을 준비하는 단계; 상기 제1 용액 및 제2 용액이 혼합된 혼합액을 준비하는 단계; 및 상기 혼합액을 전기분무하는 단계를 포함하는, 서방성 미립구를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 전기분무는 전기분무장치에서 분사속도 0.3 내지 0.5 mL/h으로 수행하는 것일 수 있다.

상기 전기분무는 전기분무장치에서 인가 전압 16.1 내지 18.6 kV으로 수행하는 것일 수 있다.

상기 전기분무는 전기분무장치에서 23 내지 25 게이지의 바늘 크기를 이용하여 수행하는 것일 수 있다.

루프롤라이드의 서방성 미립구 제조에 있어서, 초기 과다방출 및 약물 손실율을 크게 개선시키고, 시험관 및 생체 내 조건에서 루프롤라이드를 유효농도로 장기간 동안 지속적으로 방출하도록 함으로써, 기존 서방성 미립구 제형에서 나타나는 문제점을 해결할 수 있다.

도 1은 본원 실시예에서 사용한 단일 노즐 전자분무장치를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 중 제조예9 미립구의 주사형 전자 현미경(Scanning electron micrograph, SEM) 사진이다.
도 3은 (A) 루프롤라이드, (B) PLGA, (C) 전자분무를 이용한 루프롤라이드 함유 미립구의 시차주사열량계(differential scanning calorimetry, DSC) 패턴을 나타낸다.
도 4는 (A) 루프롤라이드, (B) PLGA, (C) 전자분무를 이용한 루프롤라이드 함유 미립구의 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR) 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 비교예(루크린데포주^®)와 제조예1, 6, 7, 8, 및 9의 시간에 따른 방출율(%)을 나타낸 체외 방출 시험 결과이다.
도 6은 비교예와 제조예1, 6, 7, 8, 및 9의 초기 과다 방출 양상(initial burst release)를 보기 위한 1일까지의 용출속도 나타낸 그래프이다.
도 7은 체외 방출 시험 이후 1일(a)과 28일(b)에서의 제조예9의 미립구의 주사형 전자 현미경(Scanning electron micrograph, SEM) 사진이다.
도 8은 랫드에서의 루프롤라이드 용액, 비교예 및 제조예1, 6, 7, 8, 9의 피하 주사 투여 시 시간-혈중농도 프로파일을 나타낸 것이다(n=5). 도 8a는 0일-14일, 도 8b는 0시간-8시간으로 측정한 것을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

루프롤라이드 아세테이트(순도 >98%)는 대웅제약 (성남, 한국)에서 제공받았다. 폴리락타이드-코-글라이콜라이드(Polylactide-co-glycolide, PLGA) RG502 및 RG502H와 아세트산은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, 미국)에서 구입하였다. 본 발명에서 실시예에 대한 비교예로서 루크린데포주 3.75 mg가 사용되었고, 루크린데포주 3.75 mg은 한국애브비 (서울, 한국)에서 제공받았다. 아세톤, 아세토나이트릴, 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트 및 메틸렌 클로라이드는 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, 미국)에서 구입하였다.

동물실험은 차 의과학대학교 실험동물센터에서 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 Guidelines for Ethical Conduct in the Care and Use of Animals 및 Good Laboratory Practice (American Psychological Association, 1992)에 따라 수행하였다.

실시예 1. 고분자상 용액의 용매 선정을 위한 용해도 및 전기분무 시험

7종의 용매 (메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토나이트릴, 물, 메탄올, 및 에탄올)를 이용하여, PLGA의 용해도 테스트 및 전기 분무 시험(ESR 100 Nano NC, Seoul, Korea)을 진행하였다.

그 결과는 아래 표 1과 같다.

용매	용해여부	용액의 점도	분무 형태	용매의 밀도 (g/ cm ³ )
메틸렌 클로라이드	O	낮음	균일한 뿔 모양	1.326
에틸 아세테이트	O	높음	불균일	0.895
아세톤	O	낮음	균일한 뿔 모양	0.785
아세토나이트릴	O	높음	불균일 및 실 모양	0.786
물	X	-	-	0.998
메탄올	X	-	-	0.791
에탄올	X	-	-	0.789

전자분무 미립구를 제조하기 위해서는 PLGA가 고분자상 용매에 거의 완전히 용해되어야 하고, 그 혼합 용액은 점도가 낮으며, 높은 혼화성을 지녀야 한다.

메틸렌 클로라이드는 높은 용해도와 균일한 뿔 모양의 분무형태를 보였다. 에틸 아세테이트는 분무형태가 불균일하였다. 아세톤은 PLGA에 대한 높은 용해도, 낮은 점도를 보였고 분무형태에서도 균일한 뿔 모양을 보였다. 또한, 아세톤의 밀도는 0.785 g/cm³으로 약물상 용액의 용매로 사용되는 물 및 메탄올과 유사한 값을 가진다.

실시예 2. 약물상 용액의 용매선정을 위한 용해도 및 전기분무 시험

7종의 용매 (메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토나이트릴, 물, 메탄올, 및 에탄올)를 이용하여, 루프롤라이드의 용해도 테스트 및 전기 분무 시험(ESR 100 Nano NC, Seoul, Korea)을 진행하였다.

조사된 용매 및 결과는 아래 표 2와 같다.

용매	용해도	메틸렌 클로라이드와의 혼화성	아세톤과의 혼화성	건고물의 건조정도	용매의 밀도 (g/ cm ³ )
메틸렌 클로라이드	낮음	O	O	-	1.326
에틸 아세테이트	낮음	O	O	-	0.895
아세톤	낮음	O	O	-	0.785
아세토나이트릴	높음	O	O	불완전 건조	0.786
물	높음	X	O	불완전 건조	0.998
메탄올	높음	O	O	완전 건조	0.791
에탄올	석출됨	O	O	불완전 건조	0.789

에탄올은 루프롤라이드를 용해시키는데 장시간이 소모되고, 쉽게 석출되는 문제점이 있었다. 물은 루프롤라이드에 대해 높은 용해도를 보였고, 아세톤과의 혼화성도 좋았으나, 건조상태가 좋지 않아 전기 분무된 미립구를 수득하기가 어려웠다. 메탄올은 루프롤라이드에 대해 높은 용해도를 보였고, 아세톤과의 혼화성 역시 좋았다. 전자분무된 미립구의 건조상태도 좋아 채취도 용이하였다.

실시예 3. 고분자상 용액과 약물상 용액의 혼합

전자분무 조건을 위한 요소 중 하나로 고분자상 용액 및 약물상 용액의 혼합 비율을 테스트하였다. 그 결과는 아래 표 3과 같다.

약물상 용액의 비율	고분자상 용액
10%	투명함
20%	투명함
30%	투명함
50%	뿌옇게 변함
70%	뿌옇게 변함
80%	석출됨
90%	석출됨

약물상 용액의 비율이 증가함에 따라 PLGA가 혼합 용액으로부터 석출되었다.

실시예 4. 루프롤라이드 함유 미립구의 제조

도 1에 나타난 바와 같이, 전기분무장치를 사용하여 루프롤라이드 미립구를 제조하였다 (ESR 100 Nano NC, Seoul, Korea). 생체적합성 수불용성 고분자로 PLGA Resomer RG502와 RG502H를 사용하였다. 구체적으로는 다음과 같다.

고분자 및 루프롤라이드를 각각 고분자상 용매 0.8 mL, 약물상 용매 0.2 mL에 용해시킨 후, 용해된 각 용액을 섞고 5분 동안 교반하여 완전히 혼합하였다. 각 제조예를 23 내지 25 게이지의 메탈 노즐이 장착된 1 mL 가스타이트 시린지(Hamilton Co, Reno, NV, USA)에 넣었다. 혼합용액으로 채워진 시린지는 노즐 끝과 알루미늄 호일 시트와의 거리가 20 cm가 되도록 전기분무장치에 장착시켰다. 상기 장치를 이용하여 0.3 내지 0.5 mL/h의 분사속도 및 16.1 내지 18.6 kV의 인가전압 조건하에 전기분무하였으며, 알루미늄 호일 시트 위에 수집된 미립구를 수득하였다. 각 제조예에 대한 고분자의 구성, 루프롤라이드 양, 용매 양, 바늘 크기, 인가 전압 및 분사속도는 아래 표 4에 기술하였다.

제조예	고분자 ( mg )	약물 ( mg )	고분자 및 약물 용매 (mL)	바늘 크기 ( gage )	인가 전압 ( kV )	분사속도 (mL/h)
제조예1	RG502 50 RG502H 50	루프롤라이드 5	아세톤 0.8 메탄올 0.2	23	16.1	0.4
제조예2	RG502H 200	루프롤라이드 5	아세톤 0.8 메탄올 0.2	23	18.6	0.4
제조예3	RG502H 100	루프롤라이드 5	아세톤 0.8 에탄올 0.2	23	18.6	0.3
제조예4	RG502H 100	루프롤라이드 5	메틸렌 클로라이드 0.8 메탄올 0.2	25	18.6	0.5
제조예5	RG502H 100	루프롤라이드 5	메틸렌 클로라이드 0.8 에탄올 0.2	23	18.6	0.4
제조예6	RG502 100 RG502H 0	루프롤라이드 5	아세톤 0.8 메탄올 0.2	23	17.4	0.4
제조예7	RG502 75 RG502H 25	루프롤라이드 5	아세톤 0.8 메탄올 0.2	23	16.1	0.4
제조예8	RG502 25 RG502H 75	루프롤라이드 5	아세톤 0.8 메탄올 0.2	23	16.1	0.4
제조예9	RG502 0 RG502H 100	루프롤라이드 5	아세톤 0.8 메탄올 0.2	23	18.6	0.4

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실시예 6. 루프롤라이드 함유 미립구의 약물 봉입률 확인

미립구 중의 루프롤라이드의 정량을 위해 HPLC-UV 장비를 사용하였다. 상기 제조예 1-9의 3 mg을 물 400 μL에 각각 첨가하였다. 미립구를 완전히 녹이기 위해 1 mL의 에틸아세테이트를 혼합하고, 3분 동안 교반하였다. 10,000 x g에서 5분간 원심 분리하였다. 그 다음에 수성층 200 μL를 깨끗한 튜브에 옮기고, 50 μL를 HPLC-UV 시스템에 주입하였다. 사용된 컬럼은 Waters Nova-Pak^®, C18 column (3.9mm×150mm, 4 μm particle size, Waters, Milford, MA, U.S.A.)이며, 이동상의 조성은 1:1.5 비율의 0.25 M 암모늄아세테이트와 메탄올을 사용하였다. 검출파장은 280 nm, 유속은 1.0 mL/min으로 설정하였다. 시험 결과는 아래 표 5와 같다.

제조예	평균 약물 봉입률( % ) (n=3)
제조예1	99.37
제조예2	83.46
제조예3	81.19
제조예4	72.48
제조예5	77.93
제조예6	98.67
제조예7	94.73
제조예8	93.49
제조예9	93.75

특히 제조예1, 제조예6, 제조예7, 제조예8, 및 제조예9는 90% 이상으로 우수한 약물 봉입률을 나타내었다.

실시예 7. 루프롤라이드 함유 미립구의 방출 시험

방출시험은 비교예(루크린데포주) 및 제조예(1, 6, 7, 8, 및 9)를 사용하여 28일 동안 수행하였다. 방출 양상은 heating dry bath (confido-S20H, Seoul, Korea)에서 300 rpm, 37℃로 설정하여 체내와 유사한 환경에서 28일간 관찰하였다. 방출액으로서 0.02% 트윈 80이 포함된 1 mL의 PBS가 사용되었고, 방출액에 10 mg의 비교예(루크린데포주) 및 제조예(1, 6, 7, 8, 및 9)를 첨가하여 방출시험을 실시하였다. 방출시험 시작 후 2시간, 8시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 10일, 13일, 18일, 23일 및 28일 뒤에 3000 × g로 3 분간 원심분리한 후 상층액 0.8 mL를 수집 하였고, 이어서 0.8 mL의 새 방출액을 보충하였다. 수집된 상층액 중의 루프롤라이드의 농도는 HPLC-UV로 분석하여 정량하였다.

그 결과, 도 5와 같이 실험한 모든 제조예에서 28일까지 60% 이상의 루프롤라이드가 방출되었다.

비교예(루크린데포주)와 제조예(1, 6, 7, 8, 및 9)의 용출 양상 비교를 위해 초기 과다 방출(initial burst release)을 평가하였다. 초기 과다 방출의 평가는 1일에서의 루프롤라이드의 방출 비율로 설정하였다.

도 6과 같이, 비교예(루크린데포주)의 초기 과다 방출율은 31.13%였고, 제조예9는 29.30%, 제조예1은 28.12%, 제조예7은 36.69%로 유사한 초기 과다 방출 양상을 보였다.

또한, 체외 방출시험에서의 미립구(제조예9)의 성상을 SEM을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 7과 같이 방출시험 후 1일에서의 성상에 비해 28일에서의 성상은 전체적으로 붕괴되고 응괴된 성상을 나타내고 있었다.

실시예 8. 루프롤라이드 함유 미립구의 생체 내 방출시험

Wistar 랫드(대한바이오링크, 음성군, 대한민국) 수컷 15마리를 실험 전 12시간 절식시키고 그룹 당 5마리씩 3그룹으로 나누었다. 각 그룹에 아래 표 6과 같이 루프롤라이드 용액, 비교예(루크린데포주) 또는 제조예9를 각각 피하주사 투여하였다. 투약 후 오른쪽 경정맥에서 15분(0.25시간), 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 11일, 14일 후에 약 300 μL 채혈하여 샘플을 얻었다. 채혈 즉시 12,000 x g에서 5분 동안 원심분리 하였고 분석 시까지 -80℃에서 보관하였다.

그룹	투여경로	투약 군	투여 용량 (mg/kg)	채혈 시간
1	피하	루프롤라이드 용액	0.1	0.25, 1, 2, 4, 8시간 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 14일
2	피하	비교예(루크린데포주)	0.1	0.25, 1, 2, 4, 8시간 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 14일
3	피하	제조예9	0.1	0.25, 1, 2, 4, 8시간 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 14일

이후, 랫드 혈장 10 μL에 내부표준물질인 루프롤라이드-d5 아세트산 (10 ng/mL in 50% 메탄올) 10 μL 및 아세토나이트릴 1 mL를 넣고 3분간 교반한 뒤, 10,000 × g에서 5분간 원심분리하였다. 이 용액의 상층액을 새 튜브에 옮기고 아세트산 20 μL 및 900 μL의 메틸렌 클로라이드를 넣고 3분 동안 교반한 뒤 10,000 × g에서 5분간 원심분리하였다. 이렇게 얻은 최종 용액의 수층액 10 μL UPLC-MS / MS 시스템에 주입하여 제형에 따른 시간대 별 혈중에서의 루프롤라이드를 정량하였다.

루프롤라이드 용액, 비교예(루크린데포주) 및 제조예9에 대한 C_max (Maximum plasma concentration), T_max (Time to reach C_max) 및 AUC (Area under the plasma concentration-time curve)를 포함한 매개 변수는 WinNonlin^® 소프트웨어를 사용하여 비구획분석 (Non-compartmental analysis)을 통해 얻었다.

아래 표 7과 같이, 비교예(루크린데포주)와 제조예9 간에서 C_max를 제외한 PK 변수 간에 통계적으로 유의 한 차이는 보이지 않았다. 비교예(루크린데포주)와 제조예9에서의 C_max에서 유의적인 차이를 보였는데(p<0.005), 제조예9에서의 C_max가 1.97배 정도 낮았다.

변수	루프롤라이드 용액	비교예(루크린데포주)	제조예09
T_max (h)	10.75 ± 0.40	0.57 ± 0.15	0.85 ± 0.15
C_max(ng/mL)	43.29 ± 1.68	8.53 ± 1.04	4.32 ± 0.72
AUC_inf(h·ng/mL)	51.49 ± 4.25	52.51 ± 4.91	48.19 ± 5.77
CL/F (mL/h)	485.54 ± 40.10	510.36 ± 62.89	559.39 ± 72.72

표 8 및 도 8은 랫드에서의 루프롤라이드 용액, 비교예(루크린데포주) 및 제조예1, 6, 7, 8, 9의 피하 주사 투여 시 시간-혈중농도 프로파일을 나타낸 것이다(n=5). 도 8a는 0일-14일, 도 8b는 0시간-8시간으로 측정한 것을 나타낸다.

루프롤라이드 용액 투여군은 투여 후 8시간 내에 완전히 체외로 배설되었으며, 비교(루크린데포주)예와 제조예9 투여군의 AUC에서도 유의적인 차이가 있었다. 0시간에서 8시간까지의 AUC를 비교해보면 루프롤라이드 용액 투여군에 비해 비교예(루크린데포주)는 약 0.4배 적었고, 제조예9는 약 0.3배 적었다. 이는 제조예9가 비교예(루크린데포주)에 비해 초기 과다 방출 영향을 덜 받는다는 것을 의미한다. 8시간에서 24시간 및 1일에서 14일에서의 AUC는 비교예(루크린데포주)와 제조예9 두 군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

Partial AUC (%)	0~8 시간	8~24 시간	24~336 시간
루프롤라이드 용액	100.0	-	-
제조예9	28.8	32.9	38.3
비교예(루크린데포주)	39.1	19.5	41.4

Claims

루프롤라이드 및 물, 메탄올, 및 에탄올로 구성된 군에서 선택되는 제1 용매를 포함하는 제1 용액; 및
폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)로 구성된 군에서 선택되는 생체적합성 고분자 및 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 아세토나이트릴, 및 에틸아세테이트로 구성된 군에서 선택되는 제2 용매를 포함하는 제2 용액을 포함하고,
상기 제1 용액은 상기 제2 용액으로 둘러싸인 형태인, 루프롤라이드를 방출 약물로서 포함하는 서방성 미립구를 포함하는 조성물.
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청구항 1에 있어서, 상기 제1 용액과 제2 용액의 비율은 10:90 내지 30:70인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 서방성 미립구는 직경 6.0 내지 11.0 μm의 서방성 미립구를 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 서방성 미립구는 90% 이상의 루프롤라이드 봉입율을 갖는 서방성 미립구를 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 서방성 미립구는 개체에 투여 후 24시간 내에 상기 루프롤라이드의 20 내지 40%가 방출되고, 그 이후 15일 내지 30일간 남은 루프롤라이드가 방출되는 것인 조성물.
청구항 1의 조성물을 포함하는 전립선암, 유방암, 자궁내막증, 자궁근종, 또는 성조숙증을 치료하기 위한 약학적 조성물.
루프롤라이드가 물, 메탄올, 및 에탄올로 구성된 군에서 선택되는 제1 용매에 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;
폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)로 구성된 군에서 선택되는 생체적합성 수불용성 고분자가 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 아세토나이트릴, 및 에틸아세테이트로 구성된 군에서 선택되는 제2 용매에 용해된 제2 용액을 준비하는 단계;
상기 제1 용액 및 제2 용액이 혼합된 혼합액을 준비하는 단계; 및
상기 혼합액을 전기분무하는 단계를 포함하는, 서방성 미립구를 제조하는 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 혼합액의 제1 용액과 제2 용액의 혼합비는 10:90 내지 30:70인 서방성 미립구를 제조하는 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 전기분무는 전기분무장치에서 분사속도 0.3 내지 0.5 mL/h으로 수행하는 것인 서방성 미립구를 제조하는 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 전기분무는 전기분무장치에서 인가 전압 16.1 내지 18.6 kV으로 수행하는 것인 서방성 미립구를 제조하는 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 전기분무는 전기분무장치에서 23 내지 25 게이지의 바늘 크기를 이용한 것인 서방성 미립구를 제조하는 방법.
청구항 10의 서방성 미립구를 제조하는 방법에 따라 제조된 서방성 미립구.