KR102406639B1 - 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 페디오코쿠스 이노피나투스는 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 간암 세포주(HepG2)에서 중성지방의 축적을 효과적으로 감소시키고, 알콜에 의해 증가된 혈중 ALT 및 TG 함량을 낮추고, 고지방식이를 통해 지방간이 유도된 동물모델에서 ALT 수치를 낮추고, 간무게를 감소시키며, 간에서 지방 대사 관련 유전자의 발현량을 감소시키는 효과가 있으므로, 본 발명의 조성물은 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 건강기능식품, 의약품, 사료 첨가제 또는 수의학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
국내 간질환 사망률은 인구 십만명 당 23.5명으로 매우 높으며, 40대 사망원인 1위(41.1명/10만 명), 50대 사망원인 2위(72.4명/10만 명), 30대 사망원인 3위(10명/10만 명)를 차지하는 등 간질환은 한국 중년층 인구의 주요 사망원인이다.
상기 간질환 중에서 지방간은 정상세포 내에는 존재하지 않는 중성지방이 간 세포 내에 비정상적으로 과도하게 침착되는 현상이 나타난 것을 말한다. 정상 간은 약 5%가 지방조직으로 구성되어 있으며 중성지방, 지방산, 인지질, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스터가 지방의 주요 성분이나, 일단 지방간이 발생하면 대부분의 성분이 중성지방으로 대체되며 중성지방의 양이 간 중량의 5% 이상이면 지방간으로 진단된다. 지방간이 악화되어 간세포 속의 지방 덩어리가 커지면 핵을 포함한 세포의 중요한 구성성분이 한쪽으로 밀려 간세포의 기능이 저하되며, 세포 내에 축적된 지방으로 인하여 팽창된 간세포들이 간세포 사이에 있는 미세 혈관과 임파선을 압박하여 간 내의 혈액과 임파액의 순환에 장애가 생기게 된다. 이렇게 되면 간세포는 산소와 영양공급을 적절히 받을 수 없어 간기능이 저하되는 것이다.
비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 알코올에 의한 간 손상이 아니라, 지방산이 중성지방의 형태로 간의 실질세포 내에 5% 이상 축적된 경우로 정의한다. 병리학적으로는 단순 지방간(simple steatosis)과 염증을 동반한 지방간염(steatohepatitis)으로 분류되는데, 장기간 방치 시, 간염, 간 섬유, 간경변 등의 심각한 간 질환으로 이행될 수 있다. 국내에서도 생활양식의 변화로 인해 비알코올성 간질환 발생빈도가 증가하는 추세이다.
또한, 알콜성 지방간은 과다한 음주로 인해 발생하는데, 개인별로 유전적인 특징, 성별에 따라 차이가 있지만, 하루 80g 이상의 알코올의 섭취를 하는 경우 알콜성 지방간과 같은 간질환이 발생할 가능성이 크다. 여성의 경우 이보다 적은 양으로도 알코올성 간질환이 발생할 가능성이 커진다. 일반적으로 소주 1잔, 맥주 1잔, 양주 1잔, 막걸리 1홉에 약 10g의 알코올이 포함된 것으로 계산할 수 있다. 증상으로는 가장 경미한 형태인 알코올성 지방간 환자들의 경우 대부분 무증상이지만, 경미한 간비대(간이 정상보다 크게 된 상태)가 나타난 경우 오른쪽 상복부에 가벼운 압통을 호소할 수 있다.
한편, 페디오코쿠스 이노피나투스 균주 관련 기술로는 한국등록특허 제1673450호에 콜레스테롤 저하 효과를 가진 Pediococcus pentosaceus KID7 균주 포함 생균제 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1611829호에 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 페디오코커스 펜토사세우스 CBT SL4 균주 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스는 간암 세포주(HepG2)에서 세포독성이 없고, 중성지방의 축적을 효과적으로 감소시키며, 알콜성 지방간이 유도된 동물모델에서 혈중 ALT 및 TG 함량을 감소시키는 것과, 고지방식이를 통해 지방간이 유도된 동물모델에서 ALT 수치를 낮추고, 간무게를 감소시키며, 간에서 지방 대사 관련 유전자의 발현량을 감소시키는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 인간을 제외한 동물의 지방간 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스는 간암 세포주(HepG2)에서 세포독성이 없으며, 중성지방의 축적을 효과적으로 감소시키고, 알콜에 의해 증가된 혈중 ALT 및 TG 함량을 낮추는 효과가 있고, 고지방식이를 통해 지방간이 유도된 동물모델에서 ALT 수치를 낮추고, 간무게를 감소시키며, 간에서 지방 대사 관련 유전자의 발현량을 감소시키는 효과가 있는 것이다.
도 1은 간암 세포주(HepG2)에 WiKim0108 균주를 처리한 후 세포 생존률(%)을 확인한 결과이다. N은 아무것도 처리하지 않은 정상세포이다.
도 2는 간암 세포주(HepG2)에 올레이트 및 팔미데이트가 2:1의 농도비로 혼합된 1.0mM의 유리지방산(FFA) 및 WiKim0108 균주를 처리한 후, 지방 축적(lipid accumulation)을 확인한 결과이다. ###은 정상군(N) 대비 올레이트 및 팔미테이트 혼합(2:1) 유리 지방산을 처리한 군(FFA)의 지방 축적이 통계적으로 유의미하게 증가했는 것으로, p<0.001이고, *, **, ***은 올레이트 및 팔미테이트 혼합(2:1) 유리 지방산을 처리한 군(FFA) 대비, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 처리한 군(WiKim0108)의 지방 축적이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *은 p<0.05이며, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다.
도 3은 알콜성 지방간을 유도한 동물모델에 WiKim0108 균주를 처리하고 혈중 ALT 함량 변화(A) 및 TG 함량 변화(B)를 확인한 결과이다. ##은 정상군 대비 vehicle군의 혈중 ALT 및 TG 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01이고, *는 vehicle군 대비 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 균주 또는 양성대조군인 밀크씨슬 처리군에서의 혈중 ALT 및 TG 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 4는 동물 모델에 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 투여한 후 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 간 기능 지표인 ALT 및 AST의 혈액내 함량을 확인한 결과이다. ##은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 혈액내 ALT 및 AST의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.01이다. *은 고지방식이군(Veh) 대비 페디오코쿠스 이노피나투스 균주(WiKim0108) 투여군의 혈액 내 ALT 함량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.05이다.
도 6은 실험동물에 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 투여한 후 간 무게(A) 및 형태학적 변화(B)를 확인한 결과이다. ##은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 간 무게가 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.01이다. *, **은 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 페디오코쿠스 이노피나투스 균주(WiKim0108) 투여군의 간 무게가 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다.
도 7은 간 조직 내 lipid droplets 관련 CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector C)의 상대적 mRNA 발현량을 확인한 결과이다. ###은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 CIDEC 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.001이다. **, ***은 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 WiKim0108 투여군의 CIDEC 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다.
도 2는 간암 세포주(HepG2)에 올레이트 및 팔미데이트가 2:1의 농도비로 혼합된 1.0mM의 유리지방산(FFA) 및 WiKim0108 균주를 처리한 후, 지방 축적(lipid accumulation)을 확인한 결과이다. ###은 정상군(N) 대비 올레이트 및 팔미테이트 혼합(2:1) 유리 지방산을 처리한 군(FFA)의 지방 축적이 통계적으로 유의미하게 증가했는 것으로, p<0.001이고, *, **, ***은 올레이트 및 팔미테이트 혼합(2:1) 유리 지방산을 처리한 군(FFA) 대비, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 처리한 군(WiKim0108)의 지방 축적이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *은 p<0.05이며, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다.
도 3은 알콜성 지방간을 유도한 동물모델에 WiKim0108 균주를 처리하고 혈중 ALT 함량 변화(A) 및 TG 함량 변화(B)를 확인한 결과이다. ##은 정상군 대비 vehicle군의 혈중 ALT 및 TG 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01이고, *는 vehicle군 대비 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 균주 또는 양성대조군인 밀크씨슬 처리군에서의 혈중 ALT 및 TG 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 4는 동물 모델에 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 투여한 후 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 간 기능 지표인 ALT 및 AST의 혈액내 함량을 확인한 결과이다. ##은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 혈액내 ALT 및 AST의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.01이다. *은 고지방식이군(Veh) 대비 페디오코쿠스 이노피나투스 균주(WiKim0108) 투여군의 혈액 내 ALT 함량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.05이다.
도 6은 실험동물에 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 투여한 후 간 무게(A) 및 형태학적 변화(B)를 확인한 결과이다. ##은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 간 무게가 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.01이다. *, **은 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 페디오코쿠스 이노피나투스 균주(WiKim0108) 투여군의 간 무게가 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다.
도 7은 간 조직 내 lipid droplets 관련 CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector C)의 상대적 mRNA 발현량을 확인한 결과이다. ###은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 CIDEC 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.001이다. **, ***은 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 WiKim0108 투여군의 CIDEC 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다.
본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주는 홍어 또는 홍어김치로부터 분리된 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 배양물의 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 지방간 질환은 비알코올성 또는 알코올성 단순 지방간; 비알코올성 또는 알코올성 지방간염; 및 비알코올성 또는 알코올성 간경변 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 유효성분은 간 조직 내 중성지방의 함량을 감소시키는 것이 특징이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 유효성분은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기에서 언급한 본 발명의 균주 또는 이의 배양액 등을 건강기능식품 조성물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 내지 10.0g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 식품을 섭취함으로써 지방간 질환의 예방 또는 개선 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 균주 또는 상기 균주 유래 소포체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 '약제학적으로 유효한 양'이란 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 용어 '개체'란 지방간 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 지방간 질환의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 경구 투여, 직장 내 투여 등의 경로를 통해 투여할 수 있으며 경우에 따라 목적에 따라 다른 경로로도 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 WiKim0108 균주가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제에 관한 것이다.
본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 인간을 제외한 동물의 지방간 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
1. 간암 세포주(HepG
2
)의 배양
간암 세포주(HepG2)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 사용하였다. 간암 세포주(HepG2)는 10% FBS, 1% 페니실린-스트립토마이신이 포함된 DMEM-F12(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지로 배양하였다. 상기 세포는 37℃에서, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 배양된 세포는 24웰 플레이트에 일정한 수의 세포(1×105 cells/500㎕ well)를 분주하여 실험하였다. 24웰 플레이트에 세포를 분주한 후, 세포가 24웰에 완전히 붙어 세포의 모양을 갖춘 후 세포가 75%의 포화도(confluence)에 도달했을 때 사용하였다.
2. 유리 지방산 (Free Fatty Acid; FFA) 제조
(1) 100mM 팔미테이트(시그마 P-0500) 및 100mM 올레이트(시그마 P-75010) 저장용액의 제조. 70℃에서 0.1M NaOH 용액을 용매로 이용하여 제조하고, 0.2㎛의 필터를 이용하여 여과한 후, 멸균하였다.
(2) 유리 지방산이 포함되지 않은 5%(W/v)의 BSA(시그마 A-6003) 용액의 제조. 3차 증류수를 용매로 이용하여 제조한 후 멸균하고, 4℃ 냉장보관하였다.
(3) 올레이트 및 팔미테이트의 농도가 2:1이 되도록 혼합한 5mM의 혼합지방산 저장용액 제조. 60℃에서, 상기 (2)에서 제조한 3차 증류수에 녹인 유리 지방산이 포함되지 않은 5%(w/v)의 BSA 용액을 용매로 이용하여 상기 (1)에서 제조한 각각의 지방산의 농도가 5mM이 되도록 지방산 저장용액 10㎖을 제조하였다.
상기 (1)에서 제조한 100mM 팔미테이트 및 100mM 올레이트 저장용액을 165㎕(1.65mM)의 팔미테이트(Palmitate) 및 330㎕(3.3mM)의 올레이트(oleate)를 취해 9,505㎕의 5%(w/v)의 BSA 용액에 방울방울 떨어뜨리면서 흔들며 섞어주었다(vortexing). 이후에 상온으로 식힌 다음, 0.2μm 필터로 여과하였다(상기 제조한 혼합용액은 -20℃에서 3~4주 동안 보관하여도 안정하다).
3. 알코올성 지방간 유도
C57BL/6J (12주령, 수컷, 27~30g, Japan SLC, Inc.)를 24℃, 50% 습도, 12시간 명암주기로 조절되는 SPF 실험동물시설에서 유지했다. 알코올 유동식은 중앙실험동물에서 Lieber-DeCarli Ethanol Rat Diet와 Lieber-DeCarli Regular Control Rat Diet를 사용했고, 최종 알코올 농도(%)에 맞춰서 식용 알코올을 추가로 첨가했다. 각 그룹당 8마리를 사용하였으며, 4마리씩 한 케이지에 넣고 유동식을 급식했다. 알코올 식이는 알코올 농도를 점증적으로 증가시켜 적응시켰는데, 0.5 및 1%에서 각각 1일씩; 1.5, 2.0 및 2.5%에서 각각 2일씩; 3 및 4%에서 각각 1일씩 알코올 농도를 증가시킨 후, 5% 알코올을 11일 동안 식이하였다.
이후, 12일 차에 정상군(normal)은 말토오즈를 경구투여한 후, 알코올 식이군은 알코올(20%)을 경구투여한 후, 혈액과 장기를 적출하였다.
3% 알코올 식이 일로부터 12일 동안 매일 1회 각 군별로 약물을 경구투여하였는데, 정상군은 SPF용 DW를 투여하였고, Vehicle군은 saline을 투여하였으며, 페디오코쿠스 이노피나투스 균주(WiKim0108) 투여군은 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 마리당 3×108 CFU의 양으로 투여하였고, 밀크씨슬 투여군은 양성대조군으로 50mg/kg의 밀크씨슬을 투여하였다.
4. 혈액분석
혈액 내 지표(ALT, TG) 분석은 Fuji dry-chem 700i을 사용하였다.
실시예 1. 페디오코쿠스 이노피나투스(
Pediococcus inopinatus
) WiKim0108의 분리 및 동정
(1) 신균주 분리
본 발명에서 사용한 신균주는 전라남도 나주시 영산포 홍어 영농조합법인으로부터 구입한 홍어김치(10g)를 취하여 멸균 생리식염수로 십진 희석한 후, MRS 유산균 분리용 고체배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양 후에 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하여 사용하였다. 분리한 미생물은 영양 최소배지(1% 글루코오스, 0.5% 효모 추출물)에서 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
(2) 유산균의 동정
홍어김치 미생물 WiKim0108은 16S ribosomal DNA 유전자 서열 분석을 통하여 동정하였다. 선발 미생물의 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 2회 세척한 후, DNeasy 조직 키트(Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 16S ribosomal DNA 유전자 증폭을 위하여 유니버설 프라이머; 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')(서열번호 1)와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')(서열번호 2) 프라이머를 사용하였다. PCR 반응시 0.4mM dNTP, 0.5 유닛의 Taq 폴리머라아제, 4mM Mg2+이 함유된 다카라 Perfect Premix(Takara, Japan) 10㎕에, DNA template(20㎍/㎖) 1㎕, 1.0μM 정방향 프라이머 및 1.0μM 역방향 프라이머를 각각 1㎕씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 제조하였다.
PCR 증폭은 마스터사이클러 그래디언트(Mastercycler gradient)(Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분(initial denaturation), 94℃에서 45초(denaturation), 52℃에서 45초(annealing), 72℃에서 1분(extension), 30 사이클을 실시하였고, 72℃에서 5분 동안 최종 연장(extension)을 실시하였다. 증폭된 약 1400bp의 fragment를 T 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시킨 후 형질전환하였다. T 벡터 시퀀싱 프라이머를 이용하여 염기서열 결정을 수행하였으며, 그 결과는 BLAST 분석 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 GenBank (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 ribosomal DNA 유전자 시퀀싱과 비교하여 동정하였다. 결정된 염기서열은 Clustal_W 및 BioEdit 프로그램으로 정렬하였고, 발생한 gap은 이후 분석과정에서 결여형질로 처리하였다. 염기서열 간의 유전적 거리 계산과 neighbor-joining, maximum-likelihood 및 parsimony 계통수의 제작은 Mega 프로그램을 사용하여 수행하였고 계통군의 지지도를 알아보기 위해 위의 세 가지 분석에 대해 각각 동일한 사양으로 bootstrap 분석하였다(1,000 replicates).
홍어김치로부터 분리한 유산균 WiKim0108 균주의 동정 및 분류를 위하여, 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, 신균주 WiKim0108은 Pediococcus inopinatus 표준 균주 BT와 97% 일치하였다(서열번호 3). 이후 상기 신균주를 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108(Pediococcus inopinatus WiKim0108)로 명명하였다. 또한, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108을 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2019년 3월 8일자로 기탁하여, 기탁번호 KACC 81091BP를 부여받았다.
실시예 2. WiKim0108 균주의 세포 독성 확인
상기 배양한 HepG2 세포에 24시간 동안 시료를 농도별로 희석하여 처리하고, MTS 어세이(CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 기법으로 세포 생존률을 490nm에서 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
그 결과 도 1에 개시한 바와 같이, 본 발명의 WiKim0108 균주를 처리하였을 때의 세포 생존률(%)이 정상군(N)과 거의 유사한 정도로 나타났다. 따라서 본 발명의 WiKim0108 균주는 세포독성이 거의 없다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. WiKim0108 균주의 처리에 따른 지방 축적(lipid accumulation)의 변화 확인
간암 세포주(HepG2)에서 상기 제조한 1mM의 올레이트 및 팔미테이트 혼합(2:1) 유리 지방산을 처리하여 증가한 지방 축적(lipid accumulation)이 WiKim0108 균주의 처리에 의해 감소하는지를 확인하였다.
그 결과 도 2에 개시한 바와 같이, WiKim0108 균주의 농도 의존적으로 지방 축적(lipid accumulation)이 감소한 것을 확인하였다.
실시예 4. WiKim0108 균주의 처리에 따른 혈중 ALT 및 TG 함량 변화 확인
(1) 혈중 ALT의 함량 변화
알콜 섭취에 의해 지방간이 유도된 동물모델에서 혈중 ALT 함량 변화를 확인한 결과, 도 3(A)에 개시한 바와 같이 정상군에 대비되는 알코올을 투여한 vehicle군의 혈중 ALT 함량은 유의미하게 증가하였고, 알콜로 인해 ALT 함량이 증가된 vehicle군에 대비되는 밀크씨슬(Milk thistle) 투여군(양성대조군) 및 WiKim0108 투여군의 혈중 ALT의 함량은 유의적으로 감소하였다.
(2) 혈중 TG 함량 변화
알콜 섭취에 의해 지방간이 유도된 동물모델에서 혈중 TG 함량 변화를 확인한 결과, 도 3(B)에 개시한 바와 같이 정상군에 대비한 알콜을 투여한 vehicle군에서의 혈중 TG 함량은 증가하였고, 알콜로 인해 TG 함량이 증가된 vehicle군에 대비되는 WiKim0108 투여군의 혈중 TG 함량은 유의적으로 감소하였다.
실시예 5. 동물 모델의 체중변화 확인
수컷 6주령의 C57BL/6J 마우스 순화 후, 60 kcal% fat diet(D12492, Research Diet, Inc)를 섭취시켜 비알콜성 지방간을 유도하였다. 평균 체중이 28∼29g에 도달하면, WiKim0108 균주를 10주 동안 경구 투여(1×108, 1×109 CFU/mice/day)하면서 매주 체중을 측정하였으며, 양성대조군으로 밀크씨슬(MT, 100mg/kg/day)를 투여하였다.
그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이, 정상군 대비 고지방식이군(HFD)의 체중이 증가하였으며, 이에 대비하여 본 발명의 WiKim0108 균주 투여군과 밀크씨슬 투여군(MT)의 체중이 약간 감소한 것을 확인하였다.
실시예 6. 혈액 내 간기능 지표(ALT, AST) 함량 확인
상기 실시예 5 이후, 심장천자법으로 상기 동물모델로부터 채혈한 혈액(혈청) 내 간 기능의 지표인 ALT 및 AST 함량을 측정하였다.
그 결과 도 5에 개시한 바와 같이, 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 혈액내 ALT 및 AST 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 고지방식이군(Veh) 대비 페디오코쿠스 이노피나투스 균주(WiKim0108) 투여군의 혈액내 ALT 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
실시예 7. 간 무게 및 간의 형태학적 변화
상기 실시예 6 이후, 실험동물을 희생시켜 간 조직 적출 후 무게 및 형태학적 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 6(A)에 개시한 바와 같이 정상군 대비 고지방식이군(HFD)의 간 무게가 증가하였으며, 이에 대비하여 본 발명의 WiKim0108 균주 투여군과 밀크씨슬 투여군(MT)의 간 무게가 통계적으로 유의미하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 6(B)에 개시한 바와 같이 간의 형태학적 변화를 확인하였으며, 고지방식이군(Veh)의 간이 정상군(N)에 비해 비대해졌고, 고지방식이군 대비 본 발명의 WiKim0108 균주 투여군의 간 형태가 정상군과 유사하다는 것을 확인하였다.
실시예 8. 지방대사 조절 및 지방산 흡수에 관여하는 유전자의 발현량 확인
상기 실시예 7에서 획득한 간 조직 30mg의 시료로부터 RNA를 분리하였으며, Taqman probe(ABI)를 이용한 역전사 및 Q-PCR을 실시를 통해 지방대사 조절에 관여하는 lipid droplets 관련 CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector C)의 상대적 mRNA 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 개시한 바와 같이, 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 CIDEC 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 페디오코쿠스 이노피나투스 균주(WiKim0108) 투여군의 CIDEC 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
[통계 처리]
본 발명의 실시예 2에서 획득한 결과는 SPSS ver 20.0 프로그램을 사용하여 LSD 테스트를 수행하여 대조군과 실시군 간의 유의성을 검정하였다.
실시예 3에서 획득한 결과는 평균±평균의 표준오차(SEM)로 나타냈고, 통계 분석은 GraphPad Prism 8.1.2에서 ANOVA를 수행하였고, 사후분석은 Dunnett's multiple comparisons test를 수행하여 유의성을 검정하였다.
본 발명의 실시예 5 내지 8에서 획득한 결과는 SPSS ver 20.0 프로그램을 사용하여 LSD 테스트 및 스튜던트 t-테스트를 수행하여 대조군과 실험군 간의 유의성을 검정하였다.
<110> Korea Institute of Oriental Medicine
Korea Food Research Institute
<120> Composition for preventing, ameliorating or treating fatty liver disease comprising Pediococcus inopinatus as effective component
<130> PN20184
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal primer; 27F
<400> 1
agagtttgat catggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal primer; 1492R
<400> 2
ggataccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1359
<212> DNA
<213> Pediococcus inopinatus
<400> 3
tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccagaa gtgggggata acacctggaa 60
acagatgcta ataccgcata ataaagtaaa ccgcatggtt ttcttttaaa agatggcttc 120
ggctatcact tctggatgga cccgcggcgt attagctagt tggtgagata aaggcccacc 180
aaggctgtga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 240
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg 300
agcaacgccg cgtgagtgat gaaggcttta gggtcgtaaa actctgttgt tggagaagaa 360
cgtgtgtgag agtaactgct catgcagtga cggtatccaa ccagaaagcc acggctaact 420
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta 480
aagcgagcgc aggcggtttc ttaagtctaa tgtgaaagcc ttcggcttaa ccgaagaagt 540
gcattggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 600
gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 660
acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg 720
taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 780
aagcattccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaagaatt gacgggggcc 840
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 900
tgacatcttc tgctaaccta agagattagg cgttcccttc ggggacagaa tgacaggtgg 960
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020
cccctattat tagttgccag cattaagttg ggcactctag tgagactgcc ggtgataaac 1080
cggaggaagg tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1140
gctacaatgg acggtacaac gagttgcgag accgcgaggt taagctaatc tcttaaaacc 1200
gttctcagtt cggactgcag gctgcaactc gcctgcacga agttggaatc gctagtaatc 1260
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1320
atgagagttt gtaacaccca aagccggtgg agtaacctt 1359
Claims (8)
- 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주 배양물의 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 지방간 질환은 비알코올성 또는 알코올성 단순 지방간; 비알코올성 또는 알코올성 지방간염; 및 비알코올성 또는 알코올성 간경변 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유효성분은 간 조직 내 중성지방의 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
- 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 인간을 제외한 동물의 지방간 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
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2017년도 한국미생물학회 국제학술대회 학술대회집 S18_3, 2017년 04월 26~28일. |
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