KR102386849B1 - 면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체는 전달체의 접착성을 통해 표적부위에서 항체의 유지시간을 증진시키고 특정 효소에 반응하여 선택적으로 항체를 방출함으로써 효율적으로 항체를 전달할 수 있다.

Description

면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 이의 제조방법 {Bioresponsive therapeutic antibody delivery platform for immunotherapy and method for preparing the same}
본 발명은 면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
우리 몸의 면역체계를 조절하여 질병을 치료하는 면역요법(immunotherapy)이 현재 선진적인 치료법으로 각광을 받고 있고, 특히 항암 면역 치료와 조직이나 장기 이식 후 면역억제 요법 등으로 활발히 사용되고 있다. 특히, 암 치료에 있어서 화학 약물 치료, 혹은 방사선 치료가 많이 이루어지고 있지만, 정상세포에서의 부작용으로 인하여 치료에 한계가 있다. 따라서 정상 세포에는 영향을 주지 않으면서 표적 세포만을 공격할 수 있는 면역 치료에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 면역요법에서 항체 치료란, 치료 목적으로 체외에서 만들어진 항체(antibody, Ab)를 인체에 투여하여 면역체계를 조절함으로써 치료하는 방법으로 항암 치료에서는 암세포에 대한 면역세포의 활성을 증가시켜 더욱 효과적인 암 치료가 가능할 뿐만 아니라, 면역억제 요법을 통해 외부 치료 물질에 대한 면역반응을 감소시켜 조직 및 이식 거부에 대한 예방치료를 하고 있다.
하지만, 다량의 항체를 지속적으로 투여하게 되면 정상 세포와 조직에 nonspecific binding에 의한 부작용이 발생하고, 특히 너무 많은 양의 항체의 방출로 인한 면역세포의 비특이적 반응(off-targeting)과 over-activation을 유발하여 자가면역(autoimmune)의 문제점이 있다. 또한, 국소 치료를 위해 항체를 표적 부위에 투여하여도 혈액 등에 의해 대부분의 항체가 표적 부위에서 흘러나가게 되어 효과적인 치료 효능을 얻기 어렵다. 따라서 표적부위에서 항체의 유지시간을 증진시켜줄 수 있는 전달체의 개발이 필요하다.
효과적인 항체의 작용을 유도하기 위하여, 항체전달체는 표적 부위에서 항체의 유지시간을 증진시켜줄 뿐 아니라 항체를 효율적으로 방출해야 한다. 이를 위하여 pH, 산화환원 전위, 혹은 효소와 같은 세포내의 자극에 의하여 항체의 방출을 자동적으로 조절할 수 있는 제어방출시스템을 가진 전달체가 개발되고 있다. 특히 표적부위에서 특이적으로 높게 발현되는 효소를 이용하여 전달체로부터 항체를 분리시켜 방출을 유도하는 효소 반응형 시스템은 다른 자극과 달리 여러가지의 표적 효소에 맞추어 전달체를 개발할 수 있어 다양한 질병 치료에 응용될 수 있다.
홍합은 족사에 존재하는 접착단백질을 이용하여 수중에서도 뛰어난 접착력을 가지고 있다. 이러한 홍합접착단백질(mussel adhesive protein, MAP)은 라이신이나 도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌, DOPA) 등과 같은 아미노산을 통해 전기적 상호작용, 수소결합, 혹은 공유결합 등을 통해 효과적인 수중 접착이 가능하며, 수분 환경을 지닌 생체내에서도 조직 표면과 접착이 가능하다. 또한, 높은 생체적합성과 생분해성을 지니고 면역반응을 유도하지 않아 의료용 소재로 활발히 연구되고 있다. 골바인더, 피부봉합, 혹은 방광 누공 치료 등 다양한 질병치료를 위한 수중 접착제로서 활용된 사례가 보고되어 있으며, 또한 접착성 나노입자로 제조하여 국소 약물 전달체로 활용된 사례가 보고되어 있다.
하지만, 현재까지 홍합접착단백질을 이용하여 환경 반응형 항체전달체로 제조하거나 응용하려는 시도는 없었다.
이에, 본 발명자들은 홍합접착단백질을 이용한 환경 반응형 항체전달체를 개발하기 위해 노력한 결과, 홍합접착단백질과 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드를 접합시켜 환경 반응형 접착성 항체전달체를 제조하고, 상기 항체전달체는 홍합접착단백질의 접착성을 통해 표적부위에서 항체의 유지시간을 증가시키며, MMP2 효소에 의해 절단되면서 세포 내 환경에서 항체를 자동적으로 분리방출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드가 접합된 홍합접착단백질을 포함하는 환경 반응형 접착성 항체전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 항체를 포함하는 면역요법 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역요법 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 면역요법 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드가 접합된 홍합접착단백질을 포함하는 환경 반응형 접착성 항체전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 항체를 포함하는 면역요법 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역요법 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역요법 조성물을 포함하는 항암보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드의 C 말단에 홍합접착단백질을 공유결합시키는 단계;를 포함하는 환경 반응형 접착성 항체전달체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드의 N 말단에 항체를 공유결합시키는 단계; 및 상기 항체가 결합된 MM2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 C 말단에 홍합접착단백질을 공유결합시키는 단계;를 포함하는 면역요법 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체는 전달체의 접착성을 통해 표적부위에서 항체의 유지시간을 증진시키고 특정 효소에 반응하여 선택적으로 항체를 방출함으로써 효율적으로 항체를 전달할 수 있다.
도 1은 홍합접착단백질(MAP)을 Ab(항체)에 공유적으로 접합시켜 제조한 imuGlue의 개요를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 imuGlue 분사(spray) 시스템의 특성을 규명한 결과를 나타낸 도이다. 도 2의 a는 유리 Ab(Alexa488-표지된 Ab), MAP 및 Ab의 단순 혼합물 및 MAP 접합된 Ab(MAP-Ab)의 방출 스펙트럼을 나타낸 도이다. 도 2의 b는 MMP2 존재 또는 부존재 하의 MAP-Ab의 방출 스펙트럼을 나타낸 도이다. 도 2의 c는 200 μl/분 유속에서의 MAP-Ab와 유리 Ab의 QCM 분석 결과를 비교한 도이다. 도 2의 d는 SFA의 비대칭 모드에서의 유리 Ab 및 MAP-Ab의 표면 접착력 측정 개요(좌) 및 측정 결과(우)를 나타낸 도이다. 도 2의 e는 SFA에 의해 측정된 유리 Ab 및 MAP-Ab의 표면 접착력(**p < 0.01, 오차 막대는 평균의 포준 오차를 의미함)을 나타낸 도이다. 도 2의 f는 MAP-Ab(녹색, Alexa488-표지 된 Ab) 분무 후 돼지 피부 조직 표면의 광학(상단) 및 형광(하단) 이미징 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 imuGlue의 수중 접착력을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 a는 QCM 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 b는 MAP-Ab 분사된 유리 표면의 형광 이미지를 나타낸 것으로, 녹색 신호는 Alexa488-표지된 Ab를 나타낸다(scale bar = 100 μm).
도 4는 MMP2-반응성 Ab의 방출 프로파일을 나타낸 도이다. 도 4의 a는 유리 표면 상에 분무된 MAP-Ab는 7일 동안 PBS에서 안정하게 유지되는 반면, 7일째의 MMP2의 첨가는 Ab 방출을 용이하게 유도함을 확인한 도이다(scale bar = 100 μm). 도 4의 b는 MMP2의 존재 또는 부존재 하의 MAP-Ab로부터의 누적적 Ab 방출 프로파일을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 imuGlue 사용 시 in vivo에서의 증진된 항체 유지력(retention)을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 a는 유리 Ab(Alexa488-표지된 Ab) 및 Ab에 접합된 MAP(MAP-Ab)의 피하 주사 후 각 시점에서의 마우스의 생체 내 형광 이미징 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 b는 평균 통합 형광 강도(n=3)를 나타낸 도이다(* p <0.05, ** p <0.01, 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냄). 도 5의 c는 유리 Ab 및 MAP-Ab의 피하 주사 후 6시간 및 24시간에 측정된 Alexa488-표지된 Ab의 혈청 수준을 나타낸 도이다. 도 5의 d는 유리 aPD-L1 및 MAP-aPD-L1 처리 후 7일째의 종양 절편의 면역 형광 이미지를 나타낸 도이다(자주색: aPD-L1, 청색: 핵). 도 5의 e는 트랜스웰 시스템에서 MMP2 처리 또는 미처리 된 MAP-aPD-L1과 공동 배양한 MDA-MB 231 암세포의 공초점 이미지를 나타낸 도이다. 녹색 및 청색 신호는 각각 aPD-L1, 세포막 및 핵을 나타낸다(scale bar = 20 μm).
도 6은 본 발명에 따른 imuGlue에서 방출된 aPD-L1의 생체활성(bioactivity) 유지력을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 a는 MMP2의 존재 하에서 방출된 aPD-L1의 생체 활성을 확인하기 위해 사용된 트랜스웰 구조를 도식화한 것이다. MAP-αPD-L1을 MMP2를 함유하는 PBS 또는 PBS와 함께 상부 구획에 배치하고, 암 세포는 하부 구획에서 배양 하였다. 도 6의 b는 트랜스웰 시스템에서 MMP2 처리되거나 처리되지 않은 MAP-aPD-L1과 공동 배양된 B16F10 암세포의 공초점 이미지를 나타낸 것이다. 적색, 녹색 및 청색 신호는 각각 aPD-L1, 세포막 및 핵을 나타낸다(scale bar = 20 μm).
도 7은 본 발명에 따른 imuGlue를 사용하여 삼중 음성 유방암의 생체 내 재발 감소를 확인한 도이다. 도 7의 a는 불완전한 종양 절제 모델을 이용한 국소 면역요법의 실험 프로토콜을 나타낸 도이다. 도 7의 b는 10일 째 대부분의 종양을 외과적으로 제거한 후 aPD-L1과 동일한 용량(2 mg/kg)을 사용하여 단일 용량의 PBS, aPD-L1 또는 MAP-aPD-L1로 처리된 GFP-발현 MDA-MB-231 종양의 생체 내 형광 이미징 결과를 나타낸 도이다. 각 처리군 당 4마리의 대표적인 마우스가 제시되었다(각 처리군 별로 n=6). 도 7의 c 및 d는 상이한 처리군의 개별 및 평균 종양 성장 곡선을 나타낸 도이다. 빨간색 화살표는 1차 종양의 외과적 절제 시점 및 후속 치료 시점을 나타내며, 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다(** p <0.01, *** p <0.005). 도 7의 e는 각 처리군의 생존 곡선을 나타낸 도이다.
도 8은 외과적 수술 없이, 본 발명에 따른 imuGlue의 단일 종양 내 주사에 따른 항종양 효능을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 8의 a는 imuGlue의 주사로서의(injectable) 적용을 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도이다. 도 8의 b는 상이한 처리군의 평균 종양 성장 곡선(n = 4)을 나타낸 것으로, 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다(* p <0.05, ** p <0.01).
도 9는 본 발명에 따른 imuGlue의 T 세포-매개된 항종양 면역 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 9의 a는 B16F10 흑색종 마우스 모델을 사용한 실험 프로토콜을 나타낸 도이다. 도 9의 b는 21일 째에 PBS, aPD-L1 및 MAP-aPD-L1 처리된 실험군의 대표적 종양 크기를 나타낸 도이다. 도 9의 c는 PBS, aPD-L1 및 MAP-aPD-L1 처리된 실험군의 종양 무게를 측정한 결과를 나타낸 도이다. 도 9의 d는 종양으로의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 침윤을 나타내는 B16F10 종양 절편의 면역 형광 이미지를 나타낸 도이다(적색: CD4+ T 세포, 황색: CD8+ T 세포, 청색: 핵, scale bar = 20 μm). 도 9의 e는 종양으로부터 분리된 CD4+ 및 CD8+ 종양-침윤 림프구(TIL)의 대표적인 FACS 플롯을 나타낸 도이다. 도 9의 f는 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 자극된 TIL로부터 분리된 CD8+ T 세포에서 사이토카인 IFN-γ의 세포 내 염색 결과를 나타낸 도이다. 도 9의 g는 TIL 내의 CD4+ Foxp3+ T 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 9의 h, i, j는 각각 도 9의 e, f 및 g에 따른 CD4+ 및 CD8+ T 세포(h), CD8+ IFN-γ+ T 세포 (i) 및 CD4+ Foxp3+ T 세포(j)의 정량 분석 결과를 나타낸 도이다(PBS 및 MAP-aPD-L1 처리군은 n=10, aPD-L1 처리군은 n=8). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.005).
도 10은 IDO-차단제와의 병용 면역 요법에 따른 항종양 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 10의 a는 B16F10 흑색종 마우스 모델을 사용한 1-MT 및 imuGlue의 병용요법 프로토콜을 나타낸 도이다. 도 10의 b, c는 상이한 처리군으로부터의 개별 및 평균 종양 성장 곡선을 나타낸 도이다(n=6). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다(* p <0.05, ** p <0.01). 도 10의 d는 실험 기간 동안의 평균 체중을 나타낸 도이다. 도 10의 e는 종양으로의 CD8+ T 세포 침윤을 나타내는 서로 다른 처리군의 종양 절편의 대표적인 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다(scale bar = 20 μm).
도 11은 암 면역요법에 사용되는 본 발명에 따른 imuGlue 분무(spray) 시스템의 개요를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드가 접합된 홍합접착단백질을 포함하는 환경 반응형 접착성 항체전달체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드(MMP2-cleavable peptide)는 항체와 홍합접착단백질을 연결하는 링커 역할을 하면서도, 암세포에서 과발현되는 MMP2(matrix metalloproteinase-2) 효소에 의해 분해되어 상기 항체전달체가 종양 미세 환경에서 항체를 선택적으로 방출하도록 한다.
상기 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드 결합을 포함하는 5 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있으며, 예를 들어, 상기 펩타이드는 CGPLGVRGG(서열번호 12), GPVGLIGK(서열번호 13), GPLGIAGQ(서열번호 14), GPLGV(서열번호 15) 또는 PVGLIG(서열번호 16)의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 Cys-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Gly(C-G-P-L- G-V -R-G-G, 서열번호 12)의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 사용하였으며, 상기 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 MMP2 효소에 의해 Gly-Val(G-V) 펩타이드 결합이 절단되어 본 발명에 따른 환경 반응형 접착성 항체전달체에서 펩타이드 링커로서 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 항체전달체는 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 C 말단에 링커를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 링커로 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 사용하였다.
Figure 112019104461044-pat00001
Figure 112019104461044-pat00002
EDC NHS
본 발명에 있어서, “홍합접착단백질”은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)에서 유래한 홍합접착단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 홍합접착단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mefp-4, Mefp-5, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mgfp-2, Mgfp-3, Mgfp-4 및 Mgfp-5, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mcfp-2, Mcfp-3, Mcfp-4, 및Mcfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp-1(서열번호 1), fp-2(서열번호 2), fp-3(서열번호 3), fp-4(서열번호 4), fp-5(서열번호 5) 및 fp-6(서열번호 6)으로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합접착단백질은 WO2006/107183호 또는 WO2005/092920에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-151(서열번호 7), fp-131(서열번호 8), fp-353(서열번호 9), fp-153(서열번호 10) 및 fp-351(서열번호 11)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 홍합접착단백질은 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합접착단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg-Gly-Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 홍합접착단백질은 전체 타이로신 잔기의 10~100%가 도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌, DOPA)로 변형된 것일 수 있다. 대부분의 홍합접착단백질의 전체 아미노산 서열에서 타이로신이 차지하는 비중은 약 20-30%이다. 천연 홍합접착단백질 내의 타이로신은 수화 과정을 통하여 -OH기가 첨가되어 도파의 형태로 변환된다. 그러나, 대장균에서 생산된 홍합접착단백질은 타이로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 타이로신 잔기를 도파로 변환시키는 변형(수정) 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 홍합접착단백질에 포함된 타이로신 잔기를 도파로 변형하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 타이로시나제를 사용하여 타이로신 잔기를 도파 잔기로 수정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 버섯 타이로시나제를 이용한 in vitro 효소 반응을 통해 상기의 도파 전환율을 만족시키는 홍합 접착 단백질을 생산하였다.
상기 본 발명에 따른 환경 반응형 접착성 항체전달체는 고유한 수중 접착력을 보유하는 홍합접착단백질을 포함함에 따라 표적부위에서 항체의 유지시간을 증진시킬뿐만 아니라, MMP2에 반응하여 선택적으로 항체를 분리방출함으로써 효율적으로 항체를 전달할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 항체를 포함하는 면역요법 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서는, 바이오엔지니어링된 MAP를 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커(서열번호 12)를 통해 aPD-L1에 공유결합으로 접합시키고, 상기 항체 및 이와 접합된 항체전달체를 모두 가리켜 imuGlue라 명명하고 이를 실험에 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 N 말단에 위치하는 시스테인(cysteine)에 직접 또는 링커를 통해 결합될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 항체(Ab)에 Sulfo-SMCC를 첨가하여 교반한 후, 상기 혼합물에 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드를 첨가하고, 생성된 혼합물을 EDC 및 NHS와 함께 추가로 배양하여 본 발명에 따른 imuGlue를 제조하였다.
Figure 112019104461044-pat00003
Sulfo-SMCC
본 발명에 있어서, 상기 항체는 항체에 존재하는 아민기(amine group)와 링커의 공유결합을 통해 본 발명에 따른 환경 반응형 접착성 항체전달체와 접합될 수 있는 것이라면 제한되지 않고 사용가능하며, 예를 들어 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 키메릭 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한 이중특이적 항체(bispecific antibody) 등의 변형 항체나, 항체 단편 등도 모두 사용 가능하다. “항체 단편”은 적어도 항원에 대한 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 단쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd, scFv, 도메인 항체, 미니바디, 스캡(single chain antibody, scAb), 항체 불변영역의 유도체들, 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)에 기초한 인공항체 등을 포함한다.
경우에 따라서, 상기 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 항체는 구체적으로, 암 특이 항원, 세포 표면 수용체 단백질, 세포 표면 단백질, 막횡단 단백질, 신호전달 단백질, 세포생존 조절인자, 세포 증식 조절인자, 조직 발달 또는 분화와 연관된 분자, 림포카인, 사이토카인, 세포 주기 조절에 관련된 분자, 혈관형성에 관련된 분자 또는 혈관신생에 관련된 분자에 대한 결합능과 특이성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 암 특이 항원에 대한 항체일 수 있다.
바람직하게는, 상기 항체는 면역체계를 불활성화시키는 암세포의 표면단백질(예를 들어, PD-L1, PD-L2 등)을 억제하거나 T세포 표면 단백질(예를 들어, PD-1 등) 또는 세포독성 T림프구 항원(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4)(예를 들어, CTLA-4 등)을 억제시켜 T세포를 활성화시키는 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitors, ICI)일 수 있으며, 구체적으로 항-PD-L1 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-CTLA4 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-LAG-3 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-OX40 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-TIM3 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 항-PD-1 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 PD-L1 항체를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 따른 면역요법 조성물(예를 들어, imuGlue)의 기술적 특징은 항체의 종류와 무관하게 항체와 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드가 접합된 홍합접착단백질을 결합하여 제조되는 것에 있으며, 따라서 본 발명에 따른 면역요법 조성물은 세포 내 환경, 바람직하게는 종양 미세 환경에서 항체를 분리방출시켜 환경 반응형 접합성 항체전달체 플랫폼 기술로 유용하게 활용될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 MMP2에 노출되면 본 발명에 다른 환경 반응형 접착성 항체전달체 내 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드가 절단됨으로써 항체를 분리방출시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 분무(spray)제 또는 주사(injection)제 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 종양의 대부분을 제거하기 위한 외과적 시도로서 1차 종양 외과적 절제 부위에 본 발명에 따른 imuGlue를 분무 시 종양 성장이 유의하게 억제되고, 나아가 항종양 효과를 실질적으로 향상시켜 암의 재발(recurrence)을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 imuGlue를 외과적 수술 없이 종양 내 주사(intratumoral injection)로 적용하는 경우에도 강화된 항종양 효과를 나타냄을 확인하여, 외과적 수술이 어려운 암의 치료에도 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역요법 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 피부암, 흑색종, 위암, 식도암, 결장암, 직장결장암, 췌장암, 대장암, 직장암, 담관암, 간암, 뇌종양, 백혈병, 육종, 골암, 유방암, 갑상선암, 폐선암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 전립선암, 두경부암, 방광암, 내분비선암, 요도암, 난소암, 고환암, 신장암, 방광암, 전립선암 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 IDO 억제제(indoleamine (2,3)-dioxygenase inhibitor)와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 IDO 억제제는 종양 미세 환경 내의 면역억제인자를 억제하는 약물로 바람직하게는 1-MT(1-methyl-tryptophan), 1-메틸-트립토판의 D 이성질체 또는 NLG919일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 IDO 억제제로 1-MT를 사용하여, imuGlue와 1-MT를 병용 처리 시 T 세포 매개된 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 IDO 억제제와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역요법 조성물을 포함하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명에 있어서, “항암 보조제”는 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 의미한다. 상기 항암 보조제는 항암보조제는 처리농도에 따라 항암제 또는 항암보조제로서 사용할 수 있으며, 항암제의 감수성을 증진시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암 보조제는 암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병용하여 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드의 C 말단에 홍합접착단백질을 공유결합시키는 단계;를 포함하는 환경 반응형 접착성 항체전달체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드의 N 말단에 항체를 공유결합시키는 단계; 및 상기 항체가 결합된 MM2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 C 말단에 홍합접착단백질을 공유결합시키는 단계;를 포함하는 면역요법 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 공유결합은 바람직하게는 링커(linker)가 매개된 공유결합일 수 있다.
상기 공유결합을 매개하는 링커는 항체에 존재하는 아민기(-NH2)와 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 N 말단을 공유결합시키는 링커이거나(링커 1), 또는 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 C 말단과 홍합접착단백질에 존재하는 아민기(-NH2)를 공유결합시키는 링커(링커 2)라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 링커 1로 Sulfo-SMCC를, 상기 링커 2로 EDC 및 NHS를 사용하였다. 구체적으로, (1) “항체 - 링커 1 - 펩타이드” 결합에 있어서, 상기 항체의 아민기와 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 싸이올기(-SH)를 Sulfo-SMCC와 함께 반응시켜 공유결합시켰다. 그 후, (2) EDC/NHS를 첨가하여 30분 동안 반응시키고, (3) Zeba 스핀 탈염 컬럼으로 과량의 시약을 제거한 뒤, (4) 홍합접착단백질을 첨가하여 2시간 동안 반응시킴으로써 “펩타이드 - 링커 2 - 홍합접착단백질” 결합에 있어서 상기 펩타이드의 카르복실기(-COOH)와 홍합접착단백질의 아민기(-NH2)를 EDC/NHS를 통해 공유결합시켜 본 발명에 따른 imuGlue를 제조하였다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험재료 및 방법
세포주 및 항체
MDA-MB-231 인간 유방암 세포(ATCC No. HTB-26), 루시페라제/GFP 이중-표지된 MDA-MB-231 세포(GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) 및 B16-F10 마우스 흑색종 세포(ATCC No. CRL-6475)는 10%(v/v) 소태아혈청(FBS; HyClone) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM; HyClone, UT, USA)에서 배양하였다. 세포들은 37℃, 5%, CO2의 습윤 환경에서 배양하고, 마이코플라즈마(mycoplasma) 오염여부를 정기적으로 확인하였다.
항-인간 PD-L1(클론 29E.2A3) 및 항-마우스 PD-L1(클론 10F.9G2) 항체는 BioXCell(미국 NH, West Lebanon)로부터 구입하였다. Alexa594-표지된 항-PD-L1 항체는 BioLegend(San Diego, CA, USA)로부터 수득하였다. 항-CD4(클론 RM4-5), 항-CD8(클론 53-6.7), 항-Foxp3(클론 FJK-16) 및 항-IFN-γ(클론 XMG1.2) 항체는 BioLegend 및 eBioscience(San Diego, CA, USA)로부터 수득하였다. Alexa488-표지된 Ab(항-마우스 IgG 또는 항-토끼 IgG) 및 DiO 세포-표지 용액은 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
세포독성( cytotoxicity ) 실험
MAP는 다양한 농도로 폴리스티렌 표면에 코팅하였고, 각 표면에 MDA-MB-231 세포를 웰 당 5 x 104 세포의 밀도로 시딩하여 24시간 동안 배양하였다. 이어서, CCK-8 시약(Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)을 각 표면의 세포에 첨가하고 3시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 흡광도 분광광도계(PerkinElmer)를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.
공초점 현미경 분석
0.45μm 기공 필터를 갖는 24-웰 트랜스웰 플레이트를 사용하여 imuGlue로부터 방출된 Ab의 생체 활성을 관찰하였다. Alexa594-표지된 aPD-L1에 접합된 MAP를 트랜스웰 플레이트의 상부 구획에 분무하고, MDA-MB 231 또는 B16F10 세포(웰당 2 × 105 세포)를 하부 구획에 시딩하였다. 10 μg/ml의 MMP2를 함유하는 PBS 또는 PBS와 함께 상부 구획에서 24시간 동안 배양한 후, 60x/1.35 이머젼 오일 대물렌즈(Olympus)가 장착된 공초점 현미경(FLUOVIEW FV3000; IX83; Olympus)을 사용하여 세포 이미지를 획득하였다.
종양 절편 이미징 분석을 위해, 실험 종료 시 종양 조직을 절제하고 10% 포르말린(Sigma-Aldrich)으로 고정시켰다. 샘플을 동결, 동결 절편하고 유리 슬라이드에 마운팅하였다. PBS로 절편을 재수화(rehydration)한 후, 1% BSA로 차단하기 전 구연산(citrate) 완충액(pH 6.0)에서 끓여 항원을 회수하였다. 그 후, 상기 절편을 1시간 동안 실온에서 CD4 및 CD8에 대한 1차 항체와 함께 배양하고, 형광표지된 2차 항체를 첨가하고, 공초점 현미경을 사용하여 분석하였다.
유세포 분석법
FVD(Fixable viability dyes; eBioscience) 염색을 통해 죽은 세포를 제외시켰다. 표면 염색을 위해, 세포를 형광-표지 된 항-CD4 및 항-CD8 항체로 염색하였다. 세포 내 염색의 경우, Foxp3 염색 키트(eBioscience)를 사용하여 표면 염색된 세포를 고정 및 투과시키고 항-Foxp3 및 항-IFN-γ 항체로 염색하였다. 세포 내 사이토카인 염색의 경우, Golgi-Plug(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 또는 Golgi-Stop(BD Biosciences)의 존재 하에 PMA(phorbol myristate acetate) 및 이오노마이신으로 6시간 동안 세포를 자극하였다. 5개의 레이저가 장착된 유세포 분석기(LSR Fortessa; BD Biosciences)를 사용하여 염색된 세포로부터의 데이터를 수집하고 FlowJo 소프트웨어(Treestar, Ashland, OR, USA)로 분석하였다.
실시예 1. 본 발명에 따른 imuGlue의 제조
1-1. imuGlue의 준비
종양 미세 환경에서 aPD-L1의 유지(retention)시간을 증진시키고, 최적의 항체 방출을 제공하기 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체를 제조하기 위해, 본 발명자들은 바이오엔지니어링된 MAP를 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커를 통해 항체(aPD-L1)에 공유결합으로 접합시키고, 상기 항체 및 이와 접합된 항체전달체를 모두 가리켜 imuGlue라 명명하였다. 상기 imuGlue는 종양 미세 환경에 존재하는 MMP2에 노출되는 경우 항체(aPD-L1)를 방출시킨다.
먼저, 바이오엔지니어링된 MAP(Mussel Adhesive Protein, 홍합접착단백질)는 Hwang, D.S. et al(2007)에 보고된 바와 같이 대장균(Escherichia coli) 시스템에서 생산하였다. 바이오엔지니어링된 MAP의 티로신 잔기를 DOPA로 전환하기 위해, MAP를 최종 농도 1.5mg/ml에서 변형 완충액(100mM 인산이나트륨, 20mM 붕산 및 25ml 아스코르브산; pH 6.8)에 용해시키고, 버섯 타이로시나제(100 μg/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 함께 1시간 동안 배양한 후 1%(v/v) 아세트산에서 투석하였다. DOPA로 변형된 MAP의 수율은 아미노산분석기(S4300; SYKAM, Eresing, Germany)를 사용하여 156℃에서 5% 물-포화 페놀로 6N HCl에서 가수 분해한 후 아미노산 조성 분석을 통해 결정되었고, 티로신 잔기가 높은 효율로 DOPA로 전환된 MAP를 실험에 사용하였다.
imuGlue는 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커 CGPLGVRGG(서열번호 12, Peptron, Daejeon, Korea)를 통해 MAP를 Ab(aPD-L1 또는 Alexa488-표지된 Ab)에 공유결합을 이용하여 접합시킴으로써 제조되었다. 구체적으로, Ab를 PBS(pH 7.4)에서 최종 농도 1mg/ml로 희석한 후, 30μl DMSO 중 0.3mg의 Sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate; TCI Chemicals, Tokyo, Japan)를 1ml의 Ab에 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그 후, MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드(0.25 mg)를 실온에서 1시간 동안 교반하면서 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 6μM의 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; Sigma-Aldrich) 및 12μM의 NHS(N-hydroxysuccinimide; Sigma-Aldrich)와 함께 30분 동안 추가로 배양하였다.
과량의 시약은 Zeba 스핀 탈염 컬럼(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 pH 6.5에서 0.5M NaCl로 100mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충액과 완충액 교환을 통해 제거하였다. 다음으로, 상기 반응 혼합물을 실온, pH 6.5 조건에서 2시간 동안 0.5M NaCl을 사용하여 100mM MES 완충액 중 7mg의 MAP와 함께 배양하였다.
1-2. 제조된 imuGlue의 MAP- Ab 접합 여부 확인
MAP-Ab 접합체(conjugate)를 가시화하기 위해, MAP에 Texas Red-X, 숙신이미딜 에스테르(Life Technologies)로 표지하였다. 생성된 Texas Red-표지된 MAP를 상기 기재한 바와 같이 Alexa488-표지된 Ab에 추가로 접합시켰다. 상기 MAP-Ab 접합체를 유리 슬라이드 상에 분무한 후, PBS로 헹구어 결합되지 않은 MAP-Ab를 제거하였다. 그 후, 유리 슬라이드를 in vivo 형광 이미징 시스템(Neoscience, Gyeonggi, Korea)을 사용하여 이미지화 하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 녹색 및 적색 “ImuGlue”는 각각 Alexa488로 표지된 Ab 및 Texas Red로 표지된 MAP를 나타내며, 이는 병합된 이미지에서 중첩된 신호인 노란색으로 나타남을 확인하여, MAP-Ab가 안정적으로 접합되었음을 확인하였다(scale bar = 50 μm).
또한, 제조된 imuGlue에서 MAP 대 Ab의 접합(conjugation) 비율을 평가하기 위해, MAP를 Alexa488-표지된 Ab에 접합시킨 후, 분획 분자량(molecular weight cuff-off, MWCO) 50kDa의 투석막을 사용하여 투석하여 미반응 MAP를 제거하였다. 그 후, 488nm의 여기 파장(excitation wavelength) 및 525nm의 방출 파장(emission wavelength)에서 형광분광계(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 통해 Alexa-488 형광을 측정함으로써 Ab 농도를 계산하였다. 이어서, 브래드포드 분석법(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해 측정된 MAP-Ab의 총 단백질 농도로부터 Ab 농도를 빼서 MAP 농도를 결정하였다. 그 결과를 도 2의 a, b에 나타내었다.
도 2의 a에 나타낸 바와 같이, 유리 Ab 및 MAP와 Ab의 단순 혼합물과 비교하여 MAP-Ab 접합체의 방출 스펙트럼에서 약간의 적색 편이(~3nm)가 나타남을 확인하여 MAP와 Ab가 접합되었음을 확인하였다(도 2의 a). 상기 적색 편이는 Ab의 형광단(fluorophore)과 MAP의 근위 페놀 고리와의 분자 상호작용에 의한 것으로 추측되었다. 또한, 도 2의 b에 나타낸 바와 같이, MMP2 처리 시에는 MAP-Ab 방출 스펙트럼에서 청색 편이가 관찰되었으며, 이는 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 절단에 의해 Ab와 MAP의 거리가 증가된 것에 기인함을 확인하였다. 한편, 정제된 MAP-Ab의 분광학적 측정에 의해, MAP 대 Ab 의 몰비에 따른 평균 접합 비율은 약 7.2임을 확인하였다.
실시예 2. imuGlue의 표면 접착력
DOPA는 홍합 족사(byssus)의 표면 접착 및 응집에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 바이오엔지니어링된 MAP는 주요 성분인 DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)에 기인한 우수한 수중 접착력이 입증된 바 있다. 본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 imuGlue에 MAP의 고유한 수중 접착 특성이 부여되었는지를 확인하기 위해, QCM(quartz crystal microbalance) 분석을 수행하여 유동 중에 MAP-Ab의 접착력을 정량적으로 측정하고 이를 자유 Ab의 접착력과 비교하였다.
구체적으로, 금-코팅된 석영(8.9 MHz)의 공명 주파수를 QCM(QCM922A; Seikon EG&G, Tokyo, Japan)을 사용하여 모니터링하여 MAP-Ab 및 Ab의 표면 접착력을 평가하였다. 석영 크리스탈 센서를 평형화하기 위해, QCM 플로우 셀에 증류수(DW)를 10분 동안 주입하였다. 그 후, 주파수가 안정될 때까지 MAP-Ab 또는 Ab(1 mg/ml)를 10분 동안 200 μl/분의 유속으로 유량 모듈(flow module)에 주입하고, 석영 크리스탈 결정을 증류수로 세척하여 부착되지 않은 Ab를 제거하였다. 전체 과정에서 주파수 이동값(frequency shift values)을 측정하였다. 그 결과를 도 2의 c에 나타내었다.
도 2의 c에 나타낸 바와 같이, 증류수로 평형화한 후 200 ㎕/분의 유속에서 MAP-Ab의 공명 주파수변화 (Δf)는 자유 Ab보다 약 7배 높았으며, 이는 세척 단계 동안에도 유지되어 MAP-Ab가 석영 표면에 안정적으로 부착되었음을 확인하였다.
또한, Israelachvili, J. et al(2010)에 보고된 바와 같이 SFA(Surface Force Apparatus, 표면 힘 측정기)의 비대칭 모드(SurForce LLC, Goleta, CA, USA)를 사용하여 MAP-Ab의 수중 표면 접착력(Underwater surface adhesion)을 측정하였다. 구체적으로, 샘플을 운모 표면의 한쪽 면에 코팅하고, 샘플 용액 (0.1M MES 중 40 μg/ml, pH 6.5)을 새로 절단된 운모 표면에 침착시키고 10분 동안 배양하였다. 운모 표면을 0.1M MES 완충액을 사용하여 헹구었다. 노출된 운모 표면 및 코팅된 운모 표면을 5분 동안 압축하고 0.1M MES 완충액에서 추가로 5분 동안 유지하였다. 그 후, 운모 표면을 압축 속도와 동일한 속도인 초당 1 나노미터 속도로 분리하였다. 표면 부착력은 파손 직후의 이격 거리에 따라 결정되었다. 또한, Johnson-Kendall-Roberts 접착 이론에 기초하여 접착 에너지를 계산하였다. 모든 실험은 서로 다른 접촉점 및 운모 표면에 대하여 독립적으로 여러 번 수행되었고, 그 결과를 도 2의 d 내지 e에 나타내었다.
도 2의 d 및 e에 나타낸 바와 같이, MAP-Ab의 표면 접착력(-53.68 ± 1.76 mN/m)은 자유 Ab의 표면 접착력(-6.82 ± 2.84 mN/m)보다 약 8배 더 높았다. 한편, MAP-Ab의 표면 접착력은 MAP46에 대해 이전에 보고된 것과 유사하게 나타났으며, 상기 결과를 통해 Ab의 접합은 MAP의 고유한 수중 접착 특성에 영향을 거의 미치지 않고, MAP-Ab는 MAP에 기인한 우수한 수중 접착력을 보유함을 확인하였다.
실시예 3. imuGlue의 유지력 (retention) 확인
돼지 피부 조직(Stellen Medicine, St Paul, MN, USA) 및 유리 슬라이드를 이용하여 본 발명에 따른 imuGlue의 유지력을 확인하였다. 구체적으로, 돼지 피부 조직표면의 절반을 알루미늄 호일로 덮어 단백질 코팅이 되는 것을 방지하고, 다른 절반은 Alexa488-표지된 Ab에 접합된 MAP를 분무하였다. 돼지 피부 조직 표면을 37℃에서 PBS에서 24시간 동안 진탕배양하고, PBS로 세척한 후 형광현미경(BX60; Olympus, Tokyo, Japan)을 통해 관찰하였다.
동일한 방법으로 유리 표면상에서 Alexa488-표지된 Ab에 접합된 MAP의 접착력을 검사하였다. MAP 용액(100mM MES 완충액 중 7mg/ml)을 문자 "MAP" 형태의 구멍이 있는 마스크로 차폐된 유리 표면에 분무하였다. MAP-분무된 표면을 쿠마시-블루(Sigma-Aldrich)로 염색하여 1, 3, 7, 14일 동안 PBS에서 진탕배양하고, 광학현미경(Olympus)을 이용하여 MAP의 수중 접착 특성을 분석하였다. 상기 결과를 도 2의 f 및 도 3에 나타내었다.
도 2f 및 도 3에 나타낸 바와 같이, MAP의 고유한 접착력은 수성 조건 하에서 돼지 피부 조직 및 유리 표면 상에 분무된 MAP-Ab를 2주 넘게 유지시킴을 확인하였다.
실시예 4. imuGlue의 환경 반응성 방출 확인
MMP2에 대한 노출에 따른 imuGlue의 Ab 방출 프로파일을 관찰하기 위해, Alexa488-표지된 Ab에 접합된 MAP를 48-웰 플레이트에 분무하고, 37℃에서 10 μg/ml의 MMP2(Sino Biological, Wayne, PA, USA)를 함유하는 PBS 또는 PBS에서 배양하였다. 방출된 Ab를 함유하는 상청액(supernatants)을 수집하고 Alexa488 형광을 측정하여 정량화하였다. 또한, Alexa488-표지된 Ab에 접합 된 MAP를 유리 표면에 분무하고 7일 동안 배양한 후 10 μg/ml MMP2를 첨가하였다. 형광 현미경을 사용하여 Ab의 방출을 가시화하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 a에 나타낸 바와 같이, 유리 표면에 분무된 MAP-Ab는 7일 동안 수성 조건 하에서 안정적으로 유지된 반면, 7일째의 표면에 대한 MMP2 처리는 Ab 방출을 유발함을 확인하였다. 또한, 도 4의 b에 나타낸 바와 같이, 누적 Ab 방출 프로파일은 imuGlue가 MMP2의 존재 하에서 24시간 동안 분무된 Ab의 75%를 방출할 수 있음을 시사하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 imuGlue는 종양 미세 환경에 대한 반응, 즉 MMP2에 노출되었을 때 MAP-Ab로부터 Ab가 효율적으로 in situ 방출되어 환경 반응성을 가짐을 확인하였다.
실시예 5. 암 동물 모델을 이용한 in vivo 에서의 imuGlue의 효과 확인
5-1. Ab의 생체 내 유지력 관찰
모든 동물 연구는 동물 보호 기관 및 포항공대의 사용위원회(POSTECH IACUC-2016-0044-R2)의 승인을 얻어 수행되었다. 본 발명에 따른 imuGlue가 Ab의 생체 내 유지시간을 증진시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 암 동물 모델에 Alexa488-표지된 Ab에 접합된 MAP를 주사하여 Ab의 유지력(retention)을 평가하였다.
구체적으로, BALB/c 누드 마우스의 우측 옆구리에 Alexa488-표지된 Ab 또는 유리 Ab에 접합된 MAP를 Ab와 동일 용량(1 mg/kg)으로 피하 주사하고, 노출 시간이 1초인 in vivo 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미지를 획득하여 Ab의 생체 내 유지력을 관찰하였다. 통합 밀도(면적 x 강도 단위)의 평균은 이미징 소프트웨어 NEOimage(Neoscience)를 이용한 관심 영역의 정량화를 통해 결정하였다. 또한, Alexa488-표지된 Ab에 접합된 MAP 또는 Alexa488-표지된 Ab의 피하 주사 6시간 및 24시간 후 마우스로부터 혈액을 수집하고, 샘플을 14,000 xg로 10분 동안 원심분리하여 혈장을 수득하였다. Ab 농도는 형광분광계를 사용하여 Alexa488 형광을 측정함으로써 계산하였다. 그 결과를 도 5의 a 내지 c에 나타내었다.
도 5의 a 및 b에 나타낸 바와 같이, MAP-Ab는 1주일 이상의 기간 동안 유의한 손실 없이 생체 내 Ab를 유지시킨 반면, 유리 Ab는 주사 후 3일 째에 거의 검출되지 않음을 확인하였다. 또한, 피하 주사 후 수집한 혈청에서 Alexa488-표지된 Ab 수준을 측정한 결과, 도 5의 c에 나타낸 바와 같이 유리 Ab를 주사한 후 24 시간 이내에 혈청에서 높은 수준의 순환 Ab가 검출되었으며, 이는 전신 순환에 따른 Ab의 유실(dissemination)을 시사하였다. 반면, MAP-Ab의 경우 주사 후 6시간 및 24시간 째의 혈청에서 무시할 수 있는 수준의 Ab가 검출되었는데, 이는 imuGlue가 Ab의 생체 내 유지시간을 현저히 증진시킴을 의미한다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 imuGlue는 면역 작용제에 대한 광범위한 전신 노출을 효과적으로 예방할 수 있고 나아가 표적 외 염증 증상을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
나아가, 본 발명에 따른 imuGlue가 생체 내에서 암에 대한 aPD-L1의 선호적 유지(preferential retention)를 촉진시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 추가적으로 aPD-L1에 접합된 MAP(MAP-aPD-L1)를 종양 조직(~200mm3)에 분무하고, 처리 7일 후 종양 조직을 수집하여 면역형광 이미징을 수행하여 aPD-L1의 유지력을 평가하였다. 그 결과, 도 5의 d에 나타낸 바와 같이, 종양 절편의 공초점 이미지를 통해 MAP-aPD-L1 처리가 유리 aPD-L1 처리 시와 비교하여 종양 미세 환경에서의 aPD-L1 유지시간을 유의하게 증가시켰음을 확인하였다. 상기 결과는 유리 aPD-L1 처리 시에는 전신 순환 및 다른 조직으로 aPD-L1이 빠르게 유실되는 반면, MAP와 접합되는 경우 종양 부위에서 항체의 유지시간이 현저히 증진됨을 시사한다.
5-2. 방출된 aPD -L1의 활성 평가
종양 부위에서 aPD-L1의 유지시간을 증진시키는 것뿐만 아니라, 종양 미세 환경에서 aPD-L1의 생체 활성을 유지하여, 방출된 aPD-L1이 종양의 PD-L1 항원에 효과적으로 결합하여 PD-L1/PD-1 신호전달경로를 차단할 수 있는지 여부도 매우 중요하다. 이에, 트랜스웰 시스템(도 6의 a)을 사용하여 MMP2의 존재하에 imuGlue에서 방출된 aPD-L1의 생체 활성을 평가하고, 그 결과를 도 5의 e 및 도 6의 b에 나타내었다.
도 5의 e 및 도 6의 b에 나타낸 바와 같이, 방출된 aPD-L1은 암세포에 성공적으로 결합하였으며, 이를 통해 MMP2에 의해 imuGlue로부터 방출된 aPD-L1는 생체 활성을 유지함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 imuGlue 플랫폼은 생체 내 항체의 유지시간을 개선할 뿐만 아니라 종양 미세 환경에서 필요에 따라 생체 활성 치료제의 방출을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. imuGlue 사용에 따른 암의 재발(recurrence) 감소
본 발명에 따른 imuGlue가 수술 후 암 재발의 위험을 줄일 수 있는지 여부를 추가적으로 확인하기 위해, 삼중 음성 유방암(triple-negative breast cancer)의 불완전한 종양 절제 모델을 확립하여 수술 후 암의 국소 재발을 모방하였다(도 7의 a). 구체적으로, 암컷 BALB/c 누드 마우스(5 주령) 및 C57BL/6 마우스(6-10 주령)는 OrientBio(Seongnam, Korea)에서 구입하였고, BALB/c 누드 마우스의 우측 옆구리에 1 × 107 루시페라제/GFP 이중-표지된 MDA-MB-231 세포를 피하로 주사하여 종양 이종 이식편 모델을 제조하였다. 상기 루시페라제/GFP 이중-표지된 MDA-MB-231 종양 보유 마우스를 무작위로 3개의 그룹으로 나누고(n=6), 종양 부피가 대략 100 mm3에 도달하면 이소플루란(isoflurane)으로 마취시켰다. 다음으로, 불완전한 종양 절제 모델을 확립하기 위해 GFP-표지된 MDA-MD-231 종양 세포의 접종 10일 후 대부분의 1차 종양(~80%)을 외과적으로 제거하고, 절제 부위에 단일 용량의 PBS, aPD-L1 또는 MAP-aPD-L1(2mg/kg)을 분무한 뒤, 수술 부위를 6-0 Vicryl 봉합사(Ethicon, Somerville, USA)로 봉합하였다. In vivo 이미징시스템을 사용하여 암 세포로부터 방출되는 GFP 형광을 통해 전체 80일의 기간 동안 종양 성장을 모니터링하였다(도 7의 b). 종양의 부피는 전자 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정한 다음, (넓이2 x 길이 x 0.5)로 계산하여 추정하였다. 생존율은 카플란-마이어 곡선으로 나타내었고, 종양 부피가 1,000 mm3에 도달했을 때 생존 종료점을 결정하였다.
그 결과, 도 7의 c 내지 e에 나타낸 바와 같이, MAP-aPD-L1로 처리된 마우스는 종양 성장이 유의하게 억제되었고, 6마리 중 4마리는 검출 가능한 종양이 없었다. 반면, 유리 aPD-L1로 처리된 마우스의 경우 종양 성장의 현저한 억제가 관찰되지 않았으며, 종양 재발의 정도는 PBS 대조군과 유사하였다. 또한, 마우스 생존율은 종양 크기에 상응하여, MAP-aPD-L1 처리된 마우스의 경우 암 재발이 강력하게 억제되었지만, PBS 처리군에서 생존한 마우스는 없었고, aPD-L1 처리군의 생존율은 ~20%로 현저히 낮음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 imuGlue는 종양 부위에서 aPD-L1의 유지시간을 증진시키고 이를 최적으로 방출함으로써 암 치료 시 수술 후 면역 요법의 항종양 효과를 실질적으로 향상시켜 암의 재발을 방지할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. imuGlue 플랫폼의 다양한 활용
상기 실시예들을 통해 생체 내 항종양 활성이 확인된 본 발명에 따른 imuGlue 플랫폼이 분무 형태뿐만 아니라 수술 없이 종양 내 주사(intratumoral injection)에 의한 국소 치료용도로도 적용 가능한지 확인하였다. 구체적으로, BABP/c 누드 마우스의 우측 옆구리에 1 x 107 MDA-MB-231 세포를 접종하고, 종양 부피가 대략 100 mm3에 도달한 10일 째에, aPD-L1(2 mg/kg)에 사용한 것과 동등한 용량으로 PBS, aPD-L1 또는 MAP-aPD-L1를 단일 용량으로 마우스에 종양 내 주사하였다(도 8의 a). 그 후, 실시예 6에 기재한 것과 동일한 방법으로 35일차까지 종양 성장을 모니터링하였다. 그 결과를 도 8의 b에 나타내었다.
도 8의 b에 나타낸 바와 같이, 종양이 약 100mm3의 부피에 도달한 10일째에 단일 용량의 PBS, aPD-L1 또는 MAP-aPD-L1을 종양 내 주사한 결과, PBS 또는 유리 aPD-L1 처리군과 비교하여 MAP-aPD-L1 처리군이 현저히 강화된 항종양 효과를 나타냄을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 imuGlue 플랫폼은 면역관문억제제(immune checkpoint blocker, ICB) 요법의 항암 효능을 증가시키는데 효과적일 뿐만 아니라 다양한 형태로 적용가능하며, 따라서 절제 불가능한 국소 진행성 암 치료에 적합한 치료 방법으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. imuGlue의 T 세포- 매개된 항종양 면역에 대한 효과 확인
aPD-L1 요법의 치료적 한계는 암 면역에 중요한 역할을 하는 림프구 침윤(lymphocyte infiltration)이 충분하지 않음에 기인하는 것일 수 있다. imuGlue 처리가 종양 내로의 면역세포 침윤에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 면역원성이 낮은 B16F10 마우스 흑색종 모델(도 9의 a)을 사용하여 실험을 수행하였다. 구체적으로, C57BL/6 마우스에 B16F10 암세포를 피하로 접종하고, 무작위로 3개의 그룹으로 나눈 뒤 8일, 10일 및 12일 차에 PBS, aPD-L1 또는 MAP-aPD-L1을 종양 내 주사하였다. 그 결과를 도 9의 b 내지 h에 나타내었다.
도 9의 b 및 c에 나타낸 바와 같이, 유방암 재발 모델의 결과와 동일하게, MAP-aPD-L1 처리된 마우스는 PBS 및 유리 aPD로 처리된 마우스와 비교하여 종양의 크기 및 중량이 현저히 감소됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 imuGlue는 종양 진행에 대한 보호 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 도 9의 d에 나타낸 바와 같이, MAP-aPD-L1의 처리는 종양으로의 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 침윤을 증가시키는 반면, PBS 또는 유리 aPD-L1 처리 시에는 T 세포 침윤이 제한됨을 확인하였다. 나아가, 처리 9일 후 종양으로부터 수집한 종양 침윤 림프구(TIL)를 유세포 분석법을 사용하여 추가로 분석한 결과, MAP-aPD-L1로 처리된 종양에서 CD8+ T 세포의 백분율이 PBS 및 유리 aPD-L1로 처리된 종양에서와 비교하여 2~3배 증가되었음을 확인하였다(도 9의 e 및 h). MAP-aPD-L1 처리군의 CD8+ TIL은 항암 면역반응의 중요 효과기(effector) 사이토카인인 IFN-γ 생산량이 현저히 증가하고(도 9의 f 및 i), 종양 침윤 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포의 경우, 조절 T 세포(Treg) 백분율의 감소에도 불구하고 MAP-aPD-L1 처리된 종양에서 CD8+ 및 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 증가가 관찰되어 imuGlue에 따른 증진된 T 세포-매개된 항종양 면역 반응이 유도됨을 확인하였다(도 9의 g 및 j).
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 imuGlue는 aPD-L1을 종양 미세 환경에 효과적으로 전달하고, T 세포-매개된 항종양 면역을 강화시켜 현저하게 증진된 항종양 효과를 유도함을 확인하였다.
실시예 9. 병용 면역치료에의 imuGlue의 적용
단일 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI) 약물에 대한 낮은 반응성의 한계를 극복하기 위해, 화학 요법, 방사선 요법 및 기타 면역 요법과 같은 치료 전략과의 병용 요법이 널리 사용되고 있다. 이들 조합 전략 중 다수는 항종양 효과를 향상시키는 것으로 나타났지만, 이들 약물의 공동 투여는 전신적으로 면역 독성을 현저히 증가시킨다는 문제가 있다. 이에, 본 발명자들은 imuGlue를 이용한 aPD-L1 치료와 함께, 종양 및 수지상세포에서 과발현되어 T 세포의 증식 및 활성화를 억제하는 면역 억제 효소 IDO(Indoleamine 2,3-dioxygenase)의 억제제인 1-MT(1-methyl-tryptophan)를 병용하여 다중 면역 조절 약물의 효과적인 전달을 위한 국소 병용 요법 플랫폼으로서의 imuGlue를 평가하고자 하였다.
먼저, 병용 면역치료를 위해, 종양 절제 없이 BALB/c 누드 마우스의 우측 옆구리에 1 × 107 개의 B16F10 세포를 피하로 주사하여 공격형 흑색종 B16F10 흑색종 모델을 확립하였다(도 10의 a). 종양 부피가 대략 100 mm3에 도달했을 때 B16F10 종양-보유 마우스를 5개의 그룹(n=6)으로 무작위로 분류하여 imuGlue를 종양 내 주사하였다. 구체적으로, 6일차 및 8일차에, aPD-L1(2 mg/kg)와 동일한 용량의 PBS, aPD-L1, MAP-aPD-L1를 각각 1-MT(2.5 mg/kg)와 병용하여 순차적으로 마우스에 종양 내 주사하였다. 종양 성장 및 체중은 전체 실험 기간 동안 관찰되었다. 그 결과를 도 10의 b 내지 e에 나타내었다.
도 10의 b 및 c에 나타낸 바와 같이, MAP-aPD-L1 및 1-MT로 처리된 마우스는 다른 실험군과 비교하여 종양 성장이 현저히 지연된 반면, 유리 aPD-L1 및 1-MT의 병용 치료는 방출된 약물이 다른 조직으로 빠르게 확산되어 유리 aPD-L1 단독 처리시와 비교할 때 상승적인 항종양 효과를 유도하지 못함을 확인하였다. 또한, 체중 측정 결과 병용 치료로 인한 명백한 독성 징후가 없음을 확인하였고(도 10의 d), 면역 형광 이미지를 통해 MAP-aPD-L1 및 1-MT의 병용 치료가 CD8+ T 세포의 종양 내 침윤을 현저히 증가시킴을 확인하였다(도 10의 e). 이를 통해, imuGlue와 1-MT의 국소적인 공동운반(codelivery)에 따른 병용 요법은 T 세포 매개된 항종양 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
상기 실험 결과를 통해, 본 발명에 따른 imuGlue는 1차 종양 절제 부위에서 항체의 유지 기간을 늘리고, 종양 성장에 반응하여 항체의 in situ 방출을 가능하게 한다. 또한, 이와 같이 필요에 따라 방출된 항체는 생체 활성(bioactivity)을 높은 수준으로 유지하여 종양 항원에 효과적으로 결합하고, 암 치료 시 수술 후 항종양 효과를 실질적으로 향상시켜 암의 재발을 방지할 수 있게 한다. 뿐만 아니라, 분무 형태 외에 종양 내 주사 형태로 적용될 수 있어 절제 불가능한 국소 진행성 암 치료에 유용하게 사용될 수 있고, T 세포-매개된 항종양 면역을 강화시키며, 단일 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI) 약물과 같은 다른 면역요법과 병용하여 사용되는 경우 T 세포 매개된 항종양 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있다.
결과적으로, 본 발명에 따른 환경 반응형 접착성 항체전달체는, 홍합접착단백질 기반의 접착성을 통해 표적부위에서의 항체전달율을 증진시키면서도 효소에 반응하여 특이적으로 항체의 방출이 가능하여 효율적인 면역치료가 가능하여 항암 면역을 비롯한 다양한 면역요법에서 새로운 플랫폼으로서 유용하게 사용될 수 있다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Bioresponsive therapeutic antibody delivery platform for immunotherapy and method for preparing the same <130> POSTECH1-79P <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 800 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 165 170 175 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 180 185 190 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 195 200 205 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 210 215 220 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 225 230 235 240 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 245 250 255 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 260 265 270 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 275 280 285 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 290 295 300 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 305 310 315 320 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 325 330 335 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 340 345 350 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 355 360 365 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 370 375 380 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 385 390 395 400 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 405 410 415 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 420 425 430 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 435 440 445 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 450 455 460 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 465 470 475 480 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 485 490 495 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 500 505 510 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 515 520 525 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 530 535 540 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 545 550 555 560 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 565 570 575 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 580 585 590 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 595 600 605 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 610 615 620 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 625 630 635 640 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 645 650 655 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 660 665 670 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 675 680 685 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 690 695 700 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 705 710 715 720 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 725 730 735 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 740 745 750 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 755 760 765 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 770 775 780 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 785 790 795 800 <210> 2 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-2 <400> 2 Leu Phe Ser Phe Phe Leu Leu Leu Thr Cys Thr Gln Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Thr Asn Arg Pro Asp Tyr Asn Asp Asp Glu Glu Asp Asp Tyr Lys Pro 20 25 30 Pro Val Tyr Lys Pro Ser Pro Ser Lys Tyr Arg Pro Val Asn Pro Cys 35 40 45 Leu Lys Lys Pro Cys Lys Tyr Asn Gly Val Cys Lys Pro Arg Gly Gly 50 55 60 Ser Tyr Lys Cys Phe Cys Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Cys Asn 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ala Cys Lys Pro Asn Gln Cys Lys Asn Lys Ser Arg Cys 85 90 95 Val Pro Val Gly Lys Thr Phe Lys Cys Val Cys Arg Asn Gly Asn Phe 100 105 110 Gly Arg Leu Cys Glu Lys Asn Val Cys Ser Pro Asn Pro Cys Lys Asn 115 120 125 Asn Gly Lys Cys Ser Pro Leu Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Thr Cys 130 135 140 Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Val His Ala Cys Lys Pro 145 150 155 160 Asn Pro Cys Lys Asn Lys Gly Arg Cys Phe Pro Asp Gly Lys Thr Gly 165 170 175 Tyr Lys Cys Arg Cys Val Asp Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gln Glu 180 185 190 Asn Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Ser Ala 195 200 205 Asp Lys Phe Gly Asp Tyr Ser Cys Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Phe Gly 210 215 220 Pro Glu Cys Glu Arg Tyr Val Cys Ala Pro Asn Pro Cys Lys Asn Gly 225 230 235 240 Gly Ile Cys Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Cys Arg Cys Lys 245 250 255 Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Lys Val Asn Val Cys Lys Pro Thr 260 265 270 Pro Cys Lys Asn Ser Gly Arg Cys Val Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Asn 275 280 285 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gly Glu Asn Val 290 295 300 Cys Lys Pro Asn Pro Cys Gln Asn Arg Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Asn 305 310 315 320 Ser Asp Asp Gly Phe Lys Cys Arg Cys Val Gly Gly Tyr Lys Gly Pro 325 330 335 Thr Cys Glu Asp Lys Pro Asn Pro Cys Asn Thr Lys Pro Cys Lys Asn 340 345 350 Gly Gly Lys Cys Asn Tyr Asn Gly Lys Ile Tyr Thr Cys Lys Cys Ala 355 360 365 Tyr Gly Trp Arg Gly Arg His Cys Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Pro Asn 370 375 380 Pro Cys Val Val Ser Lys Pro Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Ile Trp 385 390 395 400 Asn Gly Lys Ala Tyr Arg Cys Lys Cys Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg 405 410 415 His Cys Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Lys Asn Pro Cys Ala Ser Arg Pro 420 425 430 Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Thr Asp Lys Gly Asn Gly Tyr Val Cys 435 440 445 Lys Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Tyr Cys Ser Leu Lys Ser Pro 450 455 460 Pro Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Tyr 465 470 <210> 3 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-3 <400> 3 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 4 <211> 750 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-4 <400> 4 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Glu Pro Ser Gly Tyr Ala Asn Ile Gly His 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Tyr Glu Arg Ala Ile Ser Phe His Arg His Ser His Val 20 25 30 His Gly His His Leu Leu His Arg His Val His Arg His Ser Val Leu 35 40 45 His Gly His Val His Met His Arg Val Ser His Arg Ile Met His Arg 50 55 60 His Arg Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Asn 65 70 75 80 His Val His Arg His Ser Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg 85 90 95 Val Leu His Arg His Val His Arg His Asn Val Leu His Gly His Val 100 105 110 His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu 115 120 125 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg 130 135 140 His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys 145 150 155 160 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr His Arg 165 170 175 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Leu 180 185 190 His Lys His Gln Val Leu His Gly His Ile His Thr His Arg Val Leu 195 200 205 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr 210 215 220 His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys 225 230 235 240 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Met His Arg 245 250 255 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Val 260 265 270 His Lys His His Val Val His Lys His Val His Ser His Arg Val Leu 275 280 285 His Lys His Val His Lys His Arg Val Glu His Gln His Val His Lys 290 295 300 His His Val Leu His Arg His Val His Ser His His Val Val His Ser 305 310 315 320 His Val His Lys His Arg Val Val His Ser His Val His Lys His Asn 325 330 335 Val Val His Ser His Val His Arg His Gln Ile Leu His Arg His Val 340 345 350 His Arg His Gln Val Val His Arg His Val His Arg His Leu Ile Ala 355 360 365 His Arg His Ile His Ser His Gln Ala Ala Val His Arg His Val His 370 375 380 Thr His Phe Glu Gly Asn Phe Asn Asp Asp Gly Thr Asp Val Asn Leu 385 390 395 400 Arg Ile Arg His Gly Ile Ile Tyr Phe Gly Gly Asn Thr Tyr Arg Leu 405 410 415 Ser Gly Gly Arg Arg Arg Phe Met Thr Leu Trp Gln Glu Cys Leu Glu 420 425 430 Ser Tyr Gly Asp Ser Asp Glu Cys Phe Val Gln Leu Leu Glu Gly Asn 435 440 445 Gln His Leu Phe Thr Val Val Gln Gly His His Ser Thr Ser Phe Arg 450 455 460 Ser Asp Leu Ser Asn Asp Leu His Pro Asp Asn Asn Ile Glu Gln Ile 465 470 475 480 Ala Asn Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln Ser Thr Asp Gly Asp Ile 485 490 495 Asn Asp Phe Ala Asp Thr His Tyr Asn Asp Val Ala Pro Ile Ala Asp 500 505 510 Val His Val Asp Asn Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asn His Val Lys Asn 515 520 525 Ile Ala Gln Thr Ala His His His Val Asn Asp Val Ala Gln Ile Ala 530 535 540 Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Gln Thr Ala Tyr Asp His Val Asn 545 550 555 560 Asn Ile Gly Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln Thr 565 570 575 Ala Asp Asp His Val Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val 580 585 590 Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Asp 595 600 605 Thr Ala Asn Ser His Ile Val Arg Val Gln Gly Val Ala Lys Asn His 610 615 620 Leu Tyr Gly Ile Asn Lys Ala Ile Gly Lys His Ile Gln His Leu Lys 625 630 635 640 Asp Val Ser Asn Arg His Ile Glu Lys Leu Asn Asn His Ala Thr Lys 645 650 655 Asn Leu Leu Gln Ser Ala Leu Gln His Lys Gln Gln Thr Ile Glu Arg 660 665 670 Glu Ile Gln His Lys Arg His Leu Ser Glu Lys Glu Asp Ile Asn Leu 675 680 685 Gln His Glu Asn Ala Met Lys Ser Lys Val Ser Tyr Asp Gly Pro Val 690 695 700 Phe Asn Glu Lys Val Ser Val Val Ser Asn Gln Gly Ser Tyr Asn Glu 705 710 715 720 Lys Val Pro Val Leu Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gly Lys Val Ser 725 730 735 Ala Leu Ser Asp Gln Gly Ser Tyr Asn Glu Gly Tyr Ala Tyr 740 745 750 <210> 5 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5 <400> 5 Lys His His His His His His Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly 20 25 30 Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys 35 40 45 Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys 50 55 60 Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Ser Ser <210> 6 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-6 <400> 6 Ile Ala Ala Leu Cys Gly Ile Val Lys Ser Ile Asp Ser Asp Asp Ser 1 5 10 15 Asp Tyr Asp Tyr Lys Gly Arg Gly Tyr Cys Thr Asn Lys Gly Cys Arg 20 25 30 Ser Gly Tyr Asn Tyr Phe Gly Asn Lys Gly Tyr Cys Lys Tyr Gly Glu 35 40 45 Lys Ser Tyr Thr Tyr Asn Cys Asn Ser Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro 50 55 60 Arg Asn Pro Tyr Gly Lys Leu Lys Tyr Tyr Cys Thr Asn Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Cys Pro Asn Asn Tyr Tyr Phe Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Leu 85 90 95 Glu His His His His His His 100 <210> 7 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151 <400> 7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Lys Pro Ser Tyr 130 135 140 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 145 150 155 160 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 165 170 175 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 180 185 190 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 195 200 <210> 8 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-131 <400> 8 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala Asp 50 55 60 Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn 85 90 95 Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr 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Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 145 150 155 160 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser 165 170 175 <210> 10 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-153 <400> 10 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Tyr Gly 130 135 140 Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg 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Claims (18)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 종양 특이 항체-MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드-홍합접착단백질의 복합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고;
    상기 종양 특이 항체는 상기 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 N 말단에 결합되며;
    상기 종양 특이 항체는 MMP2에 노출되는 경우 분리방출되고;
    상기 홍합접착단백질은 상기 MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드의 C 말단에 결합되며;
    상기 홍합접착단백질은 fp-1(서열번호 1), fp-2(서열번호 2), fp-3(서열번호 3), fp-4(서열번호 4), fp-5(서열번호 5), fp-6(서열번호 6), fp-151(서열번호 7), fp-131(서열번호 8), fp-353(서열번호 9), fp-153(서열번호 10) 및 fp-351(서열번호 11) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는,
    암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 종양 특이 항체는 상기 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 N 말단에 위치하는 시스테인(cysteine)에 직접 또는 링커를 통해 결합되는 것을 특징으로 하는,
    암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    상기 항체는 항-PD-L1 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-CTLA4 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-LAG-3 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-OX40 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-TIM3 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 항-PD-1 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는,
    암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 분무제 또는 주사제 조성물인 것을 특징으로 하는,
    암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 제5항에 있어서,
    상기 암은 피부암, 흑색종, 위암, 식도암, 결장암, 직장결장암, 췌장암, 대장암, 직장암, 담관암, 간암, 뇌종양, 백혈병, 육종, 골암, 유방암, 갑상선암, 폐선암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 전립선암, 두경부암, 방광암, 내분비선암, 요도암, 난소암, 고환암, 신장암, 방광암, 전립선암 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는,
    암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 IDO 억제제(indoleamine (2,3)-dioxygenase inhibitor)와 병용하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 IDO 억제제와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 다음 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한, 종양 특이 항체-MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드-홍합접착단백질의 복합체의 제조방법:
    (a) MMP2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 절단 가능한 펩타이드의 N 말단에 종양 특이 항체를 공유결합시키는 단계로서,
    상기 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고;
    상기 종양 특이 항체는 MMP2에 노출되는 경우 분리방출되고; 및
    (b) 상기 항체가 결합된 MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드의 C 말단에 홍합접착단백질을 공유결합시키는 단계로서,
    상기 홍합접착단백질은 fp-1(서열번호 1), fp-2(서열번호 2), fp-3(서열번호 3), fp-4(서열번호 4), fp-5(서열번호 5), fp-6(서열번호 6), fp-151(서열번호 7), fp-131(서열번호 8), fp-353(서열번호 9), fp-153(서열번호 10) 및 fp-351(서열번호 11) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는,
    암의 예방 또는 치료를 위한, 종양 특이 항체-MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드-홍합접착단백질의 복합체의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 공유결합은 링커(linker)가 매개된 공유결합인 것을 특징으로 하는,
    종양 특이 항체-MMP2에 의해 절단 가능한 펩타이드-홍합접착단백질의 복합체의 제조방법.
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