KR102457344B1 - 항암 펩티드와 결합된 항원결합단편 플랫폼 - Google Patents

항암 펩티드와 결합된 항원결합단편 플랫폼 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암 펩티드와 결합된 암 치료용 항원결합단편 플랫폼에 관한 것으로 상기 플랫폼은 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트를 포함하며, 상기 컨쥬게이트는 항원결합단편에 의해 종양세포 표적화 능력이 우수하고, 항암 펩티드에 의해 종양세포를 사멸시킬 수 있으므로 암 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암 펩티드와 결합된 항원결합단편 플랫폼{ANTIGEN BINDING FRAGMENT PLATFORM CONJUGATED WITH ANTICANCER PEPTIDES}
본 발명은 항암 펩티드와 결합된 암 치료용 항원결합단편 플랫폼에 관한 것이다.
암 치료를 위한 화학요법은 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포의 증식 억제 및 세포 사멸을 야기하고, 비-종양 특이적(non-tumor specific) 전신 독성과 세포 독성을 유발하며, 약물의 장기 사용으로 인한 내성을 유도할 수 있다.
이에 반해 항체 의약품은 종양세포 표면의 특정 항원에 결합하므로 정상세포의 손상 없이 종양세포의 증식을 억제하고 사멸을 유도하는 장점이 있고, 또한 일반 저분자 약물에 비해 반감기가 매우 길기 때문에 투여 횟수를 줄일 수 있다. 따라서 종양세포 특이적이고, 항암 효능이 높으며 부작용이 적어 투여 횟수를 줄일 수 있는 항체 의약품이 차세대 항암제로 자리매김하고 있으며, 개발 가치가 높다.
최근에는 온전한 항체에 비해 크기가 작아 조직이나 종양으로의 침투율이 좋은 항체 단편을 많이 이용하고 있다. 항체 단편은 생체 진단용으로 사용될 수 있고, 박테리아의 독소와 접합하여 약물 전달용으로 사용되거나, 세포 독성 T 세포에 결합하는 항체 단편과의 이중특이적 항체로 제조되어 암 치료제로 개발될 수 있다. 실제로 다양한 형태의 항체 단편들이 치료용 개량항체로 개발되어 임상용으로 사용되고 있다(압식시맙(abciximab), 라니비주맙(ranibizumab) 및 서톨리주맙(certolizumab)).
본 발명자들은 항체 단편을 활용한 새로운 암 치료제를 연구하던 중, 항암 펩티드와 항체 단편의 컨쥬게이트가 종양 표적화 능력 및 항암 활성이 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1232454호
본 발명의 목적은 암 치료제로 사용될 수 있는 항암 펩티드와 결합된 암 치료용 항원결합단편 플랫폼을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 (a) 항원결합단편 중쇄; (b) 상기 항원결합단편 중쇄의 C 말단에 연결된 항암 펩티드 모듈; 및 (c) 상기 항원결합단편 중쇄에 결합된 항원결합단편 경쇄;를 포함하는 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "항원결합단편(antibody binding fragment, Fab)"은 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편(antigen binding site)을 말하며, 중쇄의 가변영역 한 개와 경쇄의 가변영역 한 개가 합쳐져 이루어진다. 항원결합단편을 이루는 중쇄 및 경쇄를 각각 Fab Fd 및 Fab Lc라고 부른다. 항원결합단편은 항원 결합 능력은 유지하면서 전장(full length) 항체보다 크기가 작아 조직이나 종양으로의 침투가 용이하므로 치료제로 많이 활용되고 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Fab Fd 및 Fab Lc는 이황화 결합과 같은 공유결합으로 연결되거나, 펩티드 링커 서열에 의한 공유결합으로 연결될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항원결합단편 중쇄 및 항원결합단편 경쇄는 세툭시맙 (cetuximab), 파니투무맙 (panitumumab), 베바시주맙 (bevacizumab), 퍼투주맙 (pertuzumab), 트라스투주맙 (trastuzumab), 리툭시맙 (rituximab), 오파투무맙 (ofatumumab), 오비누투주맙 (obinutuzumab), 이필리무맙 (ipilimumab), 라무시루맙 (ramucirumab), 니볼루맙 (nivolumab) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 세툭시맙을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항원결합단편은 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트에 표적화 능력을 부여하며, 자체의 항암 효과에 의해 종양세포를 사멸시킬 수도 있다. 예를 들어, 세툭시맙의 항원결합단편을 이용하면 상기 컨쥬게이트는 EGFR1이 발현된 종양세포에 결합할 수 있고, 항원결합단편 및 항암 펩티드의 작용으로 종양세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항원결합단편 중쇄 및 항원결합단편 경쇄는 N 말단에 신호 펩티드가 결합된 것일 수 있으며, 신호 펩티드는 항원결합단편 중쇄(Fd)에는 서열번호 7의 서열(H4), 항원결합단편 경쇄(Lc)에는 서열번호 8의 서열(L1)이 사용될 수 있다(도 3의 A 참조). 상기 신호 펩티드(SP 서열)는 합성된 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트의 세포외 분비 효율을 촉진시키는 역할을 하며, 합성된 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트가 소포체를 통과할 때 신호 펩티드 펩티다아제에 의해 정확히 절단될 수 있도록 한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항암 펩티드 모듈은 프로테아제 절단 서열(FK), 엔도좀 융합 유도 서열(S19) 및 전사 인자 CP2c 결합 서열(ACP)을 포함하며, 종양세포 침투 서열(iRGD)을 추가로 포함할 수 있다(도 3).
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항암 펩티드 모듈은 서열번호 4로 표시되는 프로테아제 절단 서열, 서열번호 5로 표시되는 엔도좀 융합 유도 서열, 서열번호 3으로 표시되는 전사 인자 CP2c 결합 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 종양 침투 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종양세포 침투 서열(iRGD)은 ACP를 세포 내로 유입시키기 위해 도입한 서열이며, 인테그린/뉴로필린 수용체에 특이적으로 결합할 수 있다. 인테그린/뉴로필린 수용체에 결합한 ACP는 sendR에 의해 세포 내로 이동하여 세포사를 유도한다. 상기 iRGD 서열을 포함함으로써 본 발명의 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트는 일차로는 항원결합단편으로 종양세포를 표적하고, 이차로는 iRGD 서열로 종양세포를 표적한다.
본 발명에서, 상기 프로테아제 절단 서열(FK)은 종양세포에 들어간 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트가 프로테아제에 의해 항원결합단편(Fab)과 전사 인자 CP2c 결합 서열(ACP)로 분리되도록 하기 위해 도입하였다. 유리된 ACP는 종양세포 내로 유입되어 세포사를 유도할 수 있다.
본 발명에서, 상기 엔도좀 융합 유도 서열(S19)은 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트가 엔도좀에서 쉽게 탈출하도록 유도하는 역할을 한다. 분리된 항암 펩티드는 암세포의 생장을 억제하고, 세포사를 일으키게 한다.
본 발명에서, 상기 전사 인자 CP2c 결합 서열은 암세포에서 많이 발현되는 유전자인 전사 인자 CP2c에 결합하여 암세포의 생장을 억제하고, 세포사를 유도하는 펩티드이다.본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항암 펩티드 모듈은 서열번호 11로 표시되는 서열에 의해 항원결합단편 중쇄의 C 말단에만 연결될 수 있다.
본 발명에서, 생체 내로 주사된 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트는 항원결합단편에 의해 종양세포 표면의 특이적 수용체에 결합하고, 수용체 매개 세포내 유입에 의해 세포 내로 도입된다. 이때 iRGD 서열에 의해 세포내 유입 증진효과가 나타나고, 유입에 따라 엔도좀에 갇힌 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트는 단백질 분해효소인 카텝신(cathepsin) B 효소에 의해 FK 서열이 잘림으로써 항원결합단편과 항암 펩티드 모듈(S19-ACP-iRGD)로 분리된다. 잘린 S19-ACP-iRGD 서열은 S19 서열 때문에 엔도좀을 쉽게 탈출하고, 탈출한 S19-ACP-iRGD 서열은 ACP의 작용으로 암세포를 사멸시킨다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트는 항원결합단편 중쇄-항암 펩티드, 항원결합단편 경쇄를 각각 발현시킨 후 공유결합으로 연결하여 제조할 수 있다. 예를 들어, ExpiCHO-S™ 세포에 항원결합단편 중쇄-항암 펩티드 발현벡터 및 항원결합단편 경쇄 발현 벡터를 형질전환시키면 발현된 항원결합단편 중쇄-항암 펩티드와 항원결합단편 경쇄 사이에 공유결합이 형성되어 컨쥬게이트 형태로 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 종양이 형성된 마우스에 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트를 주사한 결과, 종양 생장이 현저히 억제되는 것을 확인하였다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트는 항원결합단편에 의해 종양세포 표적화 능력이 우수하고, 항암 펩티드에 의해 종양세포를 사멸시킬 수 있으므로 암 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트의 구조를 개략적으로 나타낸다.
도 2는 다양한 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트의 구조(A) 및 발현 여부를 확인한 결과(B)를 나타낸다.
도 4는 도 3의 A에 나타낸 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트의 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트의 EGFR1 결합 능력을 ELISA(A) 및 FACS 분석(B)으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트의 항암 활성을 세포 실험으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 세툭시맙 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트의 항암 활성을 종양이 형성된 마우스에서 확인한 결과를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: Cet Fab-ACP 융합 단백질 발현
1-1. Cet Fab-ACP 융합 단백질 발현 벡터 제작
도 1에 도시된 구조를 갖는 벡터를 하기와 같이 제작하였다. 도 1에서 D1은 세툭시맙(cetuximab) Fab(antigen binding fragment, 항원 결합 단편)의 Fd(서열번호 1)에 ACP 모듈을 N 및 C 말단에 융합시킨 것이고, D2는 세툭시맙 Fab의 Lc(서열번호 2)에 ACP 모듈을 N 및 C 말단에 융합시킨 것이다. 세툭시맙의 Fab에서 Fd 및 Lc는 일부 서열을 인간화시켜 사용하였다(서열번호 1 및 2). ACP 모듈은 CB (cathepsin B cleavage site), EED (endosomal escape domain), ACP (CP2c 결합 펩티드; 서열번호 3) 및 TAT(transactivator of transcription) 서열을 포함하고, 신호 서열로 D1의 Fd에는 H4 서열(서열번호 7), D1의 Lc에는 L1 서열(서열번호 8)을 사용하였다.
D1 또는 D2 코딩 서열은 Genewiz에 의뢰하여 pUC57 벡터에 클로닝하였다 (pUC57 D1 및 pUC57 D2). 합성된 D1 또는 D2 코딩 서열을 각각 전방향 및 역방향 프라이머(서열번호 12 내지 15)로 PCR하고, PCR 산물은 pcDNA™ 3.4-TOPO® 벡터(Invitrogen, CA, USA)에 TA 클로닝하였다. Top10 세포와 상기 벡터를 혼합한 후 42℃로 열충격을 가하여 형질전환(transformation)시키고, SOC 배지에서 1시간 동안 배양한 뒤, 암피실린 항생제가 든 고체배지에 도말하여 밤새 키웠다. 다음날 생성된 콜로니 중에서 8개를 선택하여 CMV 전방향 프라미어, pcDNA™ 3.4 역방향 프라미어로 콜로니 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 아가로스 젤에 전기영동한 뒤 밴드 크기가 맞는 콜로니를 선별하여, 플라스미드 DNA를 분리하였다. 이후, 플라스미드 DNA를 서열분석(sequencing)하여 클로닝이 제대로 이루어졌는지 확인하였다.
N 말단 및/또는 C 말단에서 ACP 모듈이 제거된 발현 벡터(ΔB, ΔX)는 다음과 같이 제작하였다.
상기에서 제작한 pcDNATM 3.4-TOPO® D1, pcDNATM 3.4-TOPO® 벡터 각각에 BamHI 또는 XhoI을 처리한 후 불활성화시키고, T4 라이게이스(ligase)로 벡터를 다시 라이게이션시켰다. ΔBamHI, ΔXhoI 상태의 pcDNATM 3.4-TOPO® D1, pcDNATM 3.4-TOPO® 벡터 각각을 Top10 세포와 혼합한 후 42℃로 열충격을 가하여 형질전환시키고, SOC 배지에서 1시간 동안 배양한 뒤 암피실린 항생제가 든 고체배지에 도말하여 밤새 키웠다. 다음날 생성된 콜로니 중에서 8개를 선택하여 CMV 전방향 프라미어, pcDNA™ 3.4 역방향 프라미어로 콜로니 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 아가로스 젤에 전기영동하고, 밴드 크기가 맞는 콜로니를 선별하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리한 플라스미드 DNA에 제한효소를 처리하고, 산물을 전기영동하여 밴드 크기가 맞는 플라스미드를 선별하여 최종적으로 ΔB, ΔX 발현 벡터를 제작하였다. ΔX 발현 벡터에 BamHI을 처리하고, 상기 과정을 반복하여 ΔBX 발현 벡터를 제작하였다.
이하에서, N 말단에서 ACP 모듈이 제거된 발현 벡터는 D1ΔB 및 D2ΔB로 기재하고, C 말단에서 ACP 모듈이 제거된 발현 벡터는 D1ΔX 및 D2ΔX로 기재한다. N 말단 및 C 말단 모두에서 ACP 모듈이 제거된 발현 벡터는 D1ΔBX 및 D2ΔBX로 기재한다.
1-2. 재조합 단백질 발현
125 ㎖ 용량의 비-바플 플라스크(non-baffled flask)에 6ⅹ106 세포/㎖ 농도로 ExpiCHO-S™ 세포(Invitrogen)를 준비하였다. ExpiFectamine™ CHO Reagent(Invitrogen)(3.2 ㎕/medium ㎖)와 D1 및 D2 발현 벡터 모두를 OptiPRO™ SFM (40 ㎕/medium ㎖)에 희석한 뒤 혼합하여 1분 동안 정치시킨 후 상기 플라스크에 골고루 뿌려주었다. ExpiCHO-S™ 세포를 약 20시간 동안 배양한 후 ExpiCHO™ Enhancer를 첨가하여 D1 및 D2를 과발현시키고, ExpiCHO™ Feed를 추가하여 13일 동안 추가로 배양하였다.
배양 후 원심분리하여 상층액만 회수하고, 상층액을 0.3 ㎛ 필터 시린지로 여과한 뒤 KappaSelect 레진 (Capacity: 15 ㎎ Fab/㎖; GE Healthcare)과 혼합하여 4℃에서 2 내지 4시간 동안 레진과 항체의 결합을 유도하였다. PBS(Phosphate buffered saline) pH 7.4 (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M KCl, 0.14 M NaCl)로 KappaSelect를 여러 번 세척하고, 용출 버퍼(0.1 M glycine buffer, pH 2.5 내지 3.0)를 첨가하여 항체를 용출시켰다. 이후 바로 중화 버퍼 (1 M Tris, pH 7.5 내지 8.5)를 첨가하여 용출액의 pH를 pH 7.6으로 맞추었다.
D1 및 D2의 4종 컨스트럭트(전장(full length), ΔB, ΔX 및 ΔBX)를 각각 조합한 총 16종의 단백질 조합체를 상기 방법으로 발현시켰다. 이후 12% SDS-PAGE 젤에 각 단백질 조합체를 로딩하여 전기영동을 수행하고, SDS-PAGE 젤을 염색 및 탈색시켜 단백질 밴드를 확인하였다.
확인 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 16종의 단백질 조합체 중에서 D1ΔB+D2ΔBX 조합(Fd의 C 말단에만 ACP 모듈이 융합된 단백질)만이 발현에 성공하였다. 이 조합을 Cet Fab-ACP 융합단백질로 사용하려 했으나 융합단백질의 일부분만 발현되는 양상을 보였다. MALDI-TOF/TOF를 사용한 분자량 측정 결과, D1ΔBX와 D1ΔB는 약 3988 Da 차이가 나야 하는데, 겨우 368 Da 차이가 났고, D1ΔBX 와 D1ΔB의 아미노산 서열을 비교한 결과, D1ΔB가 D1ΔBX와 겹치는 부분 바로 이후 서열인 CB(GFLG(392 Da))에서 잘려나가는 것으로 확인되었다 (실험 결과는 제시하지 않음). 따라서, 하기 1-3에 개시된 바와 같이 융합 단백질 및 ACP 모듈을 변경하였다.
1-3. 최종 Cet Fab-ACP 융합 단백질 제작
pcDNATM 3.4에 클로닝된 D1ΔB 벡터에서 제한효소 XhoI 부위에 새로운 ACP 모듈(FK+S19+ACP+iRGD)을 클로닝하였고, 이를 D1'이라 한다(도 3의 A). 상기 새로운 ACP 모듈(FK+S19+ACP+iRGD)은 도 1의 CB 서열 사용이 불가하므로 FK 서열(서열번호 4)로 변경하고, EED는 효과가 더 좋을 것 같은 S19 서열(서열번호 5)로, TAT 서열은 효과가 더 좋을 것 같은 iRGD(서열번호 6)로 전체적으로 변경한 것이다.
D1ΔB의 ACP 모듈을 변경한 결과, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이 전체 단백질이 모두 발현되는 것을 확인할 수 있었으므로 D1'+D2ΔBX 조합을 최종 Cet Fab-ACP 융합단백질로 선정하였다.
도 3의 A에서 FK는 세포내 프로테아제에 의해 절단되어 약물을 방출할 수 있는 링커 서열(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27089329/)이고, S19는 특정 표적세포에 엔도좀을 융합시키는 서열이며, iRGD는 종양 침투 펩티드(tumor-penetrating peptide)이다.
도 4는 생산된 Cet Fab-ACP 융합 단백질(D1'+D2ΔBX)의 질량분석 결과이다.
실험예 1: Cet Fab-ACP 융합 단백질의 EGFR 결합 능력 확인
1-1. Enzyme-linked immunosorbent assay
탄산염/중탄산염 버퍼(carbonate/bicarbonate buffer)에 녹인 EGFR1을 이뮤노플레이트(Immunoplate)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 보관하여 플레이트의 각 웰을 코팅하였다. 다음날 버퍼 용액은 제거하고, PBST(0.05% tween20) 100 ㎕로 플레이트를 여러 번 세척하였다. PBS에 녹인 BSA 200 ㎕를 각 웰에 넣고 실온에서 1시간 동안 두어 EGFR1이 결합되지 않은 나머지 부분을 블록킹하였다. 이후 각 웰의 용액을 제거하고, 5 ng/㎖, 2.5 ng/㎖, 1.25 ng/㎖ 및 0.625 ng/㎖로 희석한 Cet Fab-ACP 단백질을 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 용액을 제거하고, PBST(0.05% tween20) 100 ㎕로 플레이트를 여러 번 세척하였다. 세척이 끝나면 PBS에 1/1000로 희석한 1차 항체(Anti-Human IgG in goat)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 용액을 제거하고, PBST(0.05% tween20) 100 ㎕로 플레이트를 여러 번 세척한 뒤 1% BSA(in PBS)에 1/3000로 희석한 2차 항체 (Anti-Goat IgG+HRP)를 100 ㎕씩 넣어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 용액을 제거하고, PBST(0.05% tween20) 100 ㎕로 플레이트를 여러 번 세척하였다. 플레이트의 각 웰에 TMB 100 ㎕를 넣고, 색이 푸른색으로 변할 때까지 몇 초에서 몇 분 동안 기다렸다. 색이 변하기 시작하면 1M HCl 100 ㎕를 넣어 반응을 중지시키고, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
측정 결과, 도 5의 A에 나타낸 바와 같이 세툭시맙의 Fab에 ACP 모듈을 결합시켜도 세툭시맙의 EGFR1 결합 능력에는 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. Flow cytometer titration
EGFR1이 과발현되는 세포주인 A431 세포를 배양하여 4x106개를 FACS 버퍼 (PBS, 2% FBS) 2 ㎖에 현탁시키고, v 모양 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 50 ㎕씩 분주하였다. 대조군인 세툭시맙, 0 내지 25 nM 범위로 희석한 Cet Fab-ACP 단백질을 플레이트의 세포가 들어있는 각 웰에 50 ㎕씩 분주하고, 세포들과 잘 섞이도록 한 뒤 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 4℃에서 300 g로 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 세포를 PBS 200 ㎕에 다시 현탁시키고, 4℃, 300 g로 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하는 세척 과정을 2회 반복하였다. PBS에 1/32로 희석한 항 인간 IgG(Fab 특이적)-FITC 항체(sigma, F5512)를 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여 혼합한 후 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 4℃에서 300 g로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포를 PBS 200 ㎕에 다시 현탁시키고 4℃, 300 g로 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하는 세척 과정을 2회 반복하였다. 이후 FACS 버퍼 300 ㎕에 세포를 현탁시키고, Flow Cytometer (BD FACSCalibur)로 FITC 수준을 측정하여 대조군인 세툭시맙과 비교하였다.
그 결과, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이 Cet Fab-ACP 단백질은 세툭시맙 및 Cetuximab Fab와 유사한 수준의 EGFR1 결합 능력을 나타내 암 표적성에 큰 변화가 없는 것을 알 수 있었다. 상기 결과는 Cet Fab에 ACP를 융합한 것은 표적 능력에 크게 영향을 주지 않으면서, ACP를 효과적으로 암 세포에 전달할 수 있음을 의미한다.
실험예 2: Cet Fab-ACP 융합 단백질의 항암 효과 확인
2-1. 세포 실험
Merck 사의 Erbitux를 PierceTM사의 Protein A 아가로스 (Capacity: 15 ㎎ Fab/㎖) 레진과 섞고 4℃에서 2-4시간 동안 방치하여 레진 결합을 유도하였다. 이후 PBS pH 7.4 (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M KCl, 0.14 M NaCl)로 Protein A 아가로스를 여러 번 세척하고, 용출 버퍼(0.1 M glycine buffer, pH 2.5-3.0)로 세툭시맙을 용출시켰다. 용출액에 즉시 중화 버퍼 (1 M Tris, pH 7.5-8.5)를 넣어 pH 7.6을 맞추고, 원심분리 필터로 농도 200 uM이 되도록 농축하였다. Cet Fab 및 Cet Fab-ACP 단백질은 상기 기재한 바와 같이 준비하고, ACP 모듈(FK+S19+ACP+iRGD)은 애니젠(광주)에서 합성하였다.
A431 암세포주를 96 웰 플레이트의 각 웰에 2,500개씩 분주하여 배양하고 (10% FBS, RPMI-1640), 다음날 배지를 제거하여 PBS로 1회 세척하였다. 이후 0% FBS 및 RPMI-1640 배지 90 ㎕로 교환하고, 200 uM로 저장된 각 샘플을 ½씩 순차 희석(serial dilution)하여 세포가 든 웰에 10 ㎕씩 처리하였다. 세포를 5일 동안 37℃ 배양기에서 배양하고, 각 웰에 CCK-8 용액을 10 ㎕씩 처리한 후 5 시간 뒤에 색이 변하면 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
측정 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 세포 실험에서 ACP는 암세포를 효과적으로 사멸시키지만, 세툭시맙(Cetuximab), Cet Fab 및 Cet Fab-ACP 단백질은 세포를 거의 사멸시키지 못하는 것을 알 수 있었다.
2-2. 마우스 실험
오리엔트바이오에서 5-7주령의 암컷 누드 BALB/c 마우스(nu/nu) (18 내지 20g)를 구입하여, 12시간 명암 주기의 무균 사육실에서 사육하였다. 음식과 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다. A431 종양세포를 마리당 1x107 세포/마리 농도로 배양한 후 수확하여 매트리겔(Matrigel; Corning) 100 ㎕에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 쥐의 왼쪽 옆구리에 피하주사하고, 약 2주일이 지나 종양이 자리를 잡으면 마우스를 무작위로 4개 그룹(n=5/그룹)으로 분리하였다. 종양의 크기가 150 ㎣에 도달하면 각 그룹에 해당하는 시료를 3일 간격으로 3 nmol씩 정맥 주사하였다. 실험 기간 동안 캘리퍼로 종양의 크기를 측정하고, 종양 부피는 다음 식으로 계산하였다: (단축2x장축)/2. 각 실험군에서 종양의 크기가 최소값과 최대값을 가지는 마우스는 제외하고 계산하였다.
실험 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 대조군(Mock) > ACP 투여군 > Cet Fab-ACP 투여군 > 세툭시맙 투여군 순서로 종양의 크기가 빠르게 성장하였으며, 인 비트로(in vitro) 실험에서는 볼 수 없었던 세툭시맙의 효과가 인 비보(in vivo)에서는 확실하게 드러났다. Cet Fab-ACP 투여군은 세툭시맙 투여군 대비 종양의 크기가 약간 증가하였으나, 인 비트로 실험에서 항암 효과가 우수했던 ACP 투여군보다 종앙 성장 속도가 현저히 감소한 것을 알 수 있었다. 이는 ACP 모듈 그 자체는 인 비보 내에서 종양을 특이적으로 표적하는 능력이 없음을 의미한다. 그러나 Cet Fab을 전달자로 사용한 Cet Fab-ACP 단백질은 Cet Fab에 의해 종양에 표적하여 ACP가 그 효과를 발휘할 수 있음을 알 수 있다.
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Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Ala Glu 210 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP (CP2c binding peptides) <400> 3 Asn Tyr Pro Gln Arg Pro 1 5 <210> 4 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FK sequence <400> 4 Phe Lys 1 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S19 sequence <400> 5 Pro Phe Val Ile Gly Ala Gly Val Leu Gly Ala Leu Gly Thr Gly Ile 1 5 10 15 Gly Gly Ile Gly Ser Gly 20 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> iRGD sequence <400> 6 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Gln Ser Asn Asp Thr 100 105 110 Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe 115 120 125 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Gly Ser Leu Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser 245 250 255 Phe Lys Pro Phe Val Ile Gly Ala Gly Val Leu Gly Ala Leu Gly Thr 260 265 270 Gly Ile Gly Gly Ile Gly Ser Gly Asn Tyr Pro Gln Arg Pro Cys Arg 275 280 285 Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys 290 295 <210> 10 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP-cetuximab Fab 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Claims (9)

  1. (a) 세툭시맙의 항원결합단편 중쇄;
    (b) 상기 항원결합단편 중쇄의 C 말단에 링커 펩티드에 의해 연결되는 항암 펩티드 모듈; 및
    (c) 상기 항원결합단편 중쇄에 공유결합으로 연결되는 세툭시맙의 항원결합단편 경쇄;를 포함하고,
    상기 항암 펩티드 모듈은 종양세포에 들어간 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트가 프로테아제에 의해 분리되도록 하는 프로테아제 절단 서열, 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트가 엔도좀에서 탈출하도록 유도하는 엔도좀 융합 유도 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 전사 인자 CP2c 결합 서열을 포함하며,
    상기 프로테아제 절단 서열, 엔도좀 융합 유도 서열 및 전사 인자 CP2c 결합 서열은 하나의 펩티드로 발현되는 것인 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원결합단편 중쇄 및 항원결합단편 경쇄는 N 말단에 컨쥬게이트의 세포외 분비를 촉진하는 신호 펩티드가 결합된 것인, 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 신호 펩티드는 서열번호 5로 표시되는 서열로 이루어지는 것인, 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 항암 펩티드 모듈은 C 말단에 종양세포 침투 펩티드를 추가로 포함하는 것인, 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항암 펩티드 모듈은 서열번호 4로 표시되는 프로테아제 절단 서열, 서열번호 5로 표시되는 엑소좀 융합 유도 서열, 서열번호 3으로 표시되는 전사 인자 CP2c 결합 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 종양 침투 서열을 포함하는 것인, 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 서열번호 11로 표시되는 서열을 포함하는 것인, 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트.
  9. 제1항에 따른 항원결합단편-항암 펩티드 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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