CN109182556B - 一种与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的snp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记，位于瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在该基因序列的第26位存在一个SNP位点：碱基为G或C。本发明还公开了检测该分子标记的特异性引物、试剂盒和检测方法。经研究发现，瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置的基因26bp处的SNP位点的基因型是GG、GC或CC，与瓦氏黄颡鱼的体重、体宽、全长等生长性状息息相关，因此，本发明的SNP分子标记，可用于检测或辅助检测瓦氏黄颡鱼的生长性状，可用于瓦氏黄颡鱼的辅助选择育种。本发明对瓦氏黄颡鱼优良生长性状新品系的选育具有重要的指导意义。

Description

一种与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及一种与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记及应用，属于水产动物遗传及分子标记辅助选择育种技术领域。

背景技术

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)是黄颡鱼属鱼类中个体最大的一个物种(体质量达1800g)，与黄颡鱼(P.fulvidraco)并为该属最具经济价值的两个物种，目前养殖热度很高的水产新品系“黄优1号”黄颡鱼是采用瓦氏黄颡鱼作为父本、黄颡鱼作为母本杂交得来，具生长快、体色诱人、抗病力强等优势。在水产新品种培育中，重中之重的环节便是亲本选育，而目前水产新品系“黄优1号”黄颡鱼中作为父本的瓦氏黄颡鱼，相比母本黄颡鱼，在种质改良方面的研究明显滞后，鲜有报道。在瓦氏黄颡鱼繁养殖规模迅速扩大的同时，存在着诸多育种问题，如经济性状退化：原有的捕捞野生亲本进行繁殖制种方式导致野生资源及种质衰退严重，小型化趋势加剧，或多代近亲遗传方式进行制苗，生产的苗种质量良莠不齐，如生长缓慢、头长/体长增大、商品鱼颜色不纯。当务之急需对瓦氏黄颡鱼进行遗传改良，最有效的方法之一就是开发DNA分子标记，找到与生长性状连锁的标记，从而为该鱼的分子辅助育种提供遗传依据，这也是瓦氏黄颡鱼及“黄优1号”黄颡鱼繁养殖业可持续发展的必备前提。

相比传统的分子标记(SSR、AFLP或RAPD等)，SNP作为第三代分子标记技术的代表，具有多态性好、广泛分布于全基因组的特点。如今，SNP分子标记技术已广泛应用于水产动物生长性状相关SNP标记开发中，济鱼类半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是功能基因关联SNPs位点开发的一则成功案例，如生长激素受体(GHR1)中SNP 1357G/A位点GG、GA、 AA三种不同基因型与体重、性腺重、三碘甲素及GHR1mRNA表达量显著相关，并且GG型甲基化水平明显高于另两个基因型；垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)中SNP 151C/G位点， GG个体具有更高的甲基化水平并且生长速度更快；IGF1基因外显子中SNP 884C/A位点多态性对生长性状、血液生化指标和基因表达有显著影响；天然抗性相关巨噬细胞蛋白(Nramp) 中SNP 3125A/G位点等位基因(G)频率和基因型(GG)频率与半滑舌鳎抗鳗弧菌能力呈现极显著相关；IGF2基因中两个SNP位点与生长性状、血液生化和IGF2基因表达显著相关。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记，该分子标记可应用于该鱼生长性状的分子标记辅助选择育种，能为进行瓦氏黄颡鱼生长性状关联研究提供有用信息，有利于该鱼生长性状的遗传改良。本发明基于瓦氏黄颡鱼图谱QTL定位结果获取生长性状相关的SNP标记，运用目前国际上主流的基因分型方法KASP技术(即竞争性等位基因特异性PCR)开发可直接用于瓦氏黄颡鱼分子标记辅助育种的试剂盒，该技术准确率高，灵活性超强，无需昂贵的双色标记探针，最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增，快速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。其顺利实施必将产生创新性的成果，并加快我国瓦氏黄颡鱼及水产新品系“黄优1号”黄颡鱼良种选育的进程，促进我国黄颡鱼属鱼类良种产业的健康发展。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记，该分子标记位于瓦氏黄颡鱼14连锁群 41cM位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在该基因序列的第26位存在一个SNP位点：碱基为G或C。

SEQ ID NO:1(双下划线所示的碱基“s”，即为SNP位点，碱基为G或C)：

用于检测上述SNP分子标记的特异性引物，包括正向引物a、正向引物b、反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2～4所示；在三条引物上进行不同的荧光标记。

正向引物a：5′-catggccagaaaaatctctaatcctg-3′(SEQ ID NO:2)。

正向引物b：5′-catggccagaaaaatctctaatcctc-3′(SEQ ID NO:3)。

反向引物：5′-gtctcccttaaatgcaagagtgatttcta-3′(SEQ ID NO:4)。

优选的，三种荧光标记分别为FAM、VIC、COM。

用于检测上述SNP分子标记的试剂盒，包括上述特异性引物，以及检测分子标记所必需的常规试剂。

本发明的发明人经过实验研究发现，瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置的基因26bp处的 SNP位点的基因型是GG、GC或CC，与瓦氏黄颡鱼的体重、体宽、全长等生长性状息息相关：CC基因型个体，其体重、体宽、全长这三个生长性状明显优于(所谓优于，是指体重更重，体宽更宽，全长更长)GC基因型个体，GC基因型个体，其体重、体宽、全长这三个生长性状明显优于GG基因型个体。

鉴于上述实验研究成果，上述SNP分子标记，可用于检测或辅助检测瓦氏黄颡鱼的生长性状，包括体重、体宽、全长；可用于瓦氏黄颡鱼的辅助选择育种(在以生长性状为选育指标的瓦氏黄颡鱼遗传育种研究过程中，可以优先选择瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置的基因的26bp处的SNP位点的基因型为CC的个体为育种亲本，这对于瓦氏黄颡鱼优良生长性状新品系的选育具有重要的指导意义)。

一种检测瓦氏黄颡鱼生长性状的方法(检测上述SNP分子标记的方法)：提取待测瓦氏黄颡鱼的基因组DNA(利用少量尾鳍即可提取)，PCR扩增(可利用上述特异性引物或试剂盒进行PCR扩增)，检测瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置的基因的26bp处的SNP位点的基因型是 CC、GG还是GC(将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据荧光信号判断瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置的基因26bp处的SNP位点的基因型是CC、GG还是GC)。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA 3.5μl，特异性引物混合物0.1μl，2×KASP Master Mix 3.5μl；特异性引物混合物包括：正向引物a、正向引物b、反向引物和纯化水，正向引物a浓度为11.5μmol/ml，正向引物b浓度为11.5μmol/ml，反向引物浓度为28.25μmol/ml。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性15min；94℃变性28s，62～57℃梯度PCR，每循环降低0.5℃，共10个循环；复性28s，95℃变性18s，56℃复性及扩增68s，共28个循环；10℃保存。

本发明的与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记，可用于快速鉴定或辅助鉴定优良生长性状(体重、体宽、全长)，不受瓦氏黄颡鱼的年龄、性别等限制，可用于瓦氏黄颡鱼的早期选育，鉴定结果准确可靠，操作简单，成本低，可显著促进瓦氏黄颡鱼的育种进程，解决亲本选育中的盲目性。仅仅使用少量尾鳍即可进行优良生长性状的检测，为分子辅助育种提供科学工具。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

下述实施例中的所有引物均由南京集思慧远生物科技有限公司合成。本发明实验所用瓦氏黄颡鱼材料均来自南京师范大学海洋科学与工程学院鱼类遗传育种实验室。

实施例1

本发明的SNP分子标记来源于本实验室瓦氏黄颡鱼构建F1子代遗传图谱，后经过生长性状(体重、体宽、全长)QTL定位得来：

(1)挖掘SNPs分子标记并构建高密度遗传连锁图谱，采用来自不同地理群体、性状分离的亲本，建立相同条件下养殖>3个月的瓦氏黄颡鱼F1代家系，运用微卫星标记筛选出杂合度较高的家系，随机挑选200条全同胞F1代及父母本作为作图群体，记录该群体生长性状 (体重、体宽、全长等)数据，然后剪取尾鳍提取DNA，基于ddRAD-seq技术挖掘SNPs分子标记，并构建瓦氏黄颡鱼高密度遗传连锁图谱(Joinmap)。

(2)生长性状(体重、体宽、全长)进行QTL定位，基于高密度遗传连锁图谱对200条瓦氏黄颡鱼F1代生长性状进行QTL定位(WinCart QTL 6.0)，发现部分LOD值>4与体重、体宽、全长相关的QTL位点，从中筛选出能够有效区分性状、可直接用于瓦氏黄颡鱼分子辅助选择育种的SNP标记。

实施例2检测样本的SNP分子标记

自2017年7月下旬出膜后，在同一环境(温度、密度等)下养殖105天的450尾瓦氏黄颡鱼个体；将该450尾鱼置于水池(580L)适应2个星期，进行实验前停止投喂饲料2天，使用游标卡尺测量其体宽、全长，使用电子天平测量其体重；随机挑选193条瓦氏黄颡鱼，剪取尾鳍于95％乙醇-20℃保存，用于基因组DNA提取，具体步骤如下：

(1)取少量尾鳍，提取瓦氏黄颡鱼的基因组DNA；

(2)采用特异性引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描；

(3)根据所述荧光信号判断瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置26bp处的SNP位点的基因型是CC还是GC还是GG。

所述特异性引物组，由FAM正向引物、VIC正向引物、COM反向引物组成，核苷酸序列分别如下所示(如SEQ ID NO:2～4所示)。

FAM正向引物：5′-catggccagaaaaatctctaatcctg-3′。

VIC正向引物：5′-catggccagaaaaatctctaatcctc-3′。

COM反向引物：5′-gtctcccttaaatgcaagagtgatttcta-3′。

所述PCR扩增的反应体系为：DNA 3.5μl，KASP引物混合物0.1μl，2×KASP MasterMix 3.5μl；特异性引物混合物包括：FAM正向引物、VIC正向引物、COM反向引物和纯化水；FMA正向引物浓度为11.5μmol/ml，VIC正向引物浓度为11.5μmol/ml，COM反向引物浓度为28.25μmol/ml。

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性15min；94℃变性28s，62～57℃梯度PCR，每循环降低0.5℃，共10个循环；复性28s，95℃变性18s，56℃复性及扩增68s，共28个循环；10℃保存。

将利用上述方法检测到的瓦氏黄颡鱼基因型，与前期记录得到的体重、体宽、全长进行 Kruskal-Wallis test，得出如下结果(如表1、表2所示)，瓦氏黄颡鱼体重、体宽、全长的Kruskal-Wallis检验统计量分别为7.336、9.463和6.109，该结果显示：体重、体宽、全长与瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置的基因的26bp处的SNP位点的基因型是CC、GC还是 GG显著相关，根据待测瓦氏黄颡鱼的基因型，并经过进一步平均数据统计得到待测三种基因型的瓦氏黄颡鱼体重、体宽、全长关系为：CC>GC>GG。

表1同一环境下养殖的193尾瓦氏黄颡鱼体重、体宽、全长统计数据

表2瓦氏黄颡鱼基因型结合体重、体宽、全长数据的Kruskal-Wallis test结果

K*：the Kruskal-Wallis检验统计量；Significance levels:**:0.05，***:0.01。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110> 菏泽学院

<120> 一种与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记及应用

<141> 2018-10-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> DNA

<213> Pelteobagrus vachelli

<400> 1

catggccaga aaaatctcta atcctsagca tctgtctcat tctctcttca ctgaggaaca 60

attagaaatc actcttgcat ttaagggaga ctggtgtgaa aattaaacag gatgtgaaaa 120

tctataaccc ttactatctc acttgattta 150

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

catggccaga aaaatctcta atcctg 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

catggccaga aaaatctcta atcctc 26

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gtctccctta aatgcaagag tgatttcta 29

Claims (8)

1.用于检测与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记的特异性引物，其特征在于：包括正向引物a、正向引物b、反向引物，其核苷酸序列分别如下所示；

正向引物a：5′-catggccagaaaaatctctaatcctg-3′，如SEQ ID NO:2所示；

正向引物b：5′-catggccagaaaaatctctaatcctc-3′如SEQ ID NO:3所示；

反向引物：5′-gtctcccttaaatgcaagagtgatttcta-3′如SEQ ID NO:4所示；

所述与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记位于瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在该基因序列的第26位存在一个SNP位点：其中字母S指代的碱基为G或C。

2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于：所述正向引物a、正向引物b、反向引物上标记有不同的荧光标记。

3.根据权利要求2所述的特异性引物，其特征在于：所述正向引物a、正向引物b、反向引物上标记的荧光标记分别为：FAM、VIC、COM。

4.用于检测与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1～3中任一项所述的特异性引物；所述与瓦氏黄颡鱼生长性状相关的SNP分子标记位于瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在该基因序列的第26位存在一个SNP位点：其中字母S指代的碱基为G或C。

5.权利要求1～3中任一项所述的特异性引物或权利要求4所述的试剂盒在瓦氏黄颡鱼的辅助选择育种中的应用，所述瓦氏黄颡鱼的辅助选择育种的具体方法为：利用权利要求1～3中任一项所述的特异性引物或权利要求4所述的试剂盒进行PCR扩增，检测瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置的基因的26bp处的SNP位点的基因型是CC、GG还是GC；所述生长性状为体重、体宽、全长；其中，CC基因型个体，其体重、体宽、全长这三个生长性状明显优于GC基因型个体；GC基因型个体，其体重、体宽、全长这三个生长性状明显优于GG基因型个体；所谓优于，是指体重更重，体宽更宽，全长更长。

6.一种检测瓦氏黄颡鱼生长性状的方法，其特征在于：提取待测瓦氏黄颡鱼的基因组DNA，利用权利要求1～3中任一项所述的特异性引物或权利要求4所述的试剂盒进行PCR扩增，检测瓦氏黄颡鱼14连锁群41cM位置的基因的26bp处的SNP位点的基因型是CC、GG还是GC；所述生长性状为体重、体宽、全长；其中，CC基因型个体，其体重、体宽、全长这三个生长性状明显优于GC基因型个体；GC基因型个体，其体重、体宽、全长这三个生长性状明显优于GG基因型个体；所谓优于，是指体重更重，体宽更宽，全长更长。

7.根据权利要求6所述的检测瓦氏黄颡鱼生长性状的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：DNA 3.5μl，特异性引物混合物0.1μl，2×KASP Master Mix 3.5μl；特异性引物混合物包括：正向引物a、正向引物b、反向引物和纯化水，正向引物a浓度为11.5μmol/ml，正向引物b浓度为11.5μmol/ml，反向引物浓度为28.25μmol/ml。

8.根据权利要求6所述的检测瓦氏黄颡鱼生长性状的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性15min；94℃变性28s，62～57℃梯度PCR，每循环降低0.5℃，共10个循环；复性28s，95℃变性18s，56℃复性及扩增68s，共28个循环；10℃保存。