KR102337935B1

KR102337935B1 - Cosmetic composition for improving of skin barrier and moisturizing comprising lacritin

Info

Publication number: KR102337935B1
Application number: KR1020190045410A
Authority: KR
Inventors: 이동걸; 강승현; 김민지; 윤석균; 여현주; 박명삼
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2021-12-10
Also published as: CN111821210A; KR20200122569A

Abstract

본 발명은 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 라크리틴(lacritin)을 유효성분으로 포함하여 피부장벽 개선 및 보습 증진 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공한다.The present invention relates to a cosmetic composition for improving skin barrier and moisturizing enhancement, and more specifically, provides a cosmetic composition containing lacritin as an active ingredient to improve skin barrier and improve moisturizing effect.

Description

라크리틴을 포함하는 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물{Cosmetic composition for improving of skin barrier and moisturizing comprising lacritin}Cosmetic composition for improving of skin barrier and moisturizing comprising lacritin

본 발명은 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 라크리틴(lacritin)을 유효성분으로 포함하여 피부장벽 개선 및 보습 증진 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a cosmetic composition for improving skin barrier and moisturizing enhancement, and more particularly, to a cosmetic composition containing lacritin as an active ingredient to improve skin barrier and improve moisturizing effect.

피부는 외부 환경의 물리적, 화학적 자극으로부터 인체를 보호하는 동시에 수분 유지 및 체온 유지에 중요한 역할을 한다. 피부는 외부에서부터 표피, 진피, 피하 조직의 3개 층으로 구분되며, 표피는 외부로부터 각질층, 과립층, 유극층, 기저층의 순서로 구분된다. 각질층은 피부의 가장 바깥쪽에 위치하면서, 케라틴 단백질 약 58%, 천연보습인자(natural moisturizing factor, NMF) 약 38%, 지질 약 11%로 구성되어 있다. 천연보습인자는 각질층의 수분을 붙잡는 역할을 한다. 각질층은 단백질이 풍부한 각질 세포와 세라마이드(ceramide), 자유 지방산, 콜레스테롤과 같은 다양한 지질로 이루어진 각질세포 간 지질로 이루어져 있으며, 각질세포와 그 사이의 지질로 피부 장벽을 구성하게 된다.The skin plays an important role in maintaining moisture and body temperature while protecting the human body from physical and chemical stimuli from the external environment. From the outside, the skin is divided into three layers: epidermis, dermis, and subcutaneous tissue. The stratum corneum is located at the outermost part of the skin and is composed of about 58% keratin protein, about 38% natural moisturizing factor (NMF), and about 11% lipid. The natural moisturizing factor plays a role in holding moisture in the stratum corneum. The stratum corneum is composed of protein-rich keratinocytes and lipids between keratinocytes composed of various lipids such as ceramide, free fatty acids, and cholesterol, and the keratinocytes and the lipids therebetween constitute a skin barrier.

정상적인 각질세포의 수분이 10 내지 30% 정도로 유지되면 피부가 매끄럽고 부드러운 상태를 유지하는데, 각질세포의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부가 거칠어지고 피부 노화가 발생하며 각질세포가 벗겨져 나오는 스케일링(scaling) 현상이 발생하게 된다. 특히, 대부분의 초기 피부 노화는 피부의 건성화로인한 피부 탄력성 저하와 주름 발생으로부터 시작된다.When the moisture content of normal keratinocytes is maintained at about 10 to 30%, the skin remains smooth and soft. ) will occur. In particular, most of the early skin aging starts from the deterioration of skin elasticity and the occurrence of wrinkles due to the dryness of the skin.

이에 본 발명자들은 피부장벽을 개선하고 보습효과를 증진시키는 기능을 갖는 화장료 조성물을 개발하고자, 라크리틴(lacritin)에 주목하였다. 라크리틴은 본래 안구에 얇은 피막을 형성하여 안구를 보호하고 수분유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 펩타이드(peptide)로, 이를 직접적으로 사용한 사례가 거의 없으며, 특히 화장료 조성물에 포함한 경우가 없음에 주목하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors focused on lacritin in order to develop a cosmetic composition having a function of improving the skin barrier and enhancing the moisturizing effect. Lacritin is a peptide known to play an important role in protecting the eyeball and maintaining moisture by forming a thin film on the eyeball. Thus, the present invention was completed.

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본 발명은 상기와 같은 요구에 의해, 피부장벽 개선 및 보습 증진 효과가 좋은 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is to provide a cosmetic composition having a good skin barrier improvement and moisturizing effect according to the above requirements.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라크리틴(lacritin)을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a cosmetic composition for improving skin barrier and moisturizing enhancement comprising lacritin as an active ingredient.

일 구현예로서 본 발명은 라크리틴(lacritin) 효모 발효액을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a cosmetic composition for improving skin barrier and enhancing moisture, comprising a yeast fermentation broth of lacritin as an active ingredient.

상기 라크리틴 효모 발효액은, HAS3, AQP3, Claudin1, Desmocollin, ZO-1의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 한다.The lacritin yeast fermentation broth is characterized by increasing the expression levels of HAS3, AQP3, Claudin1, Desmocollin, and ZO-1.

또한, 상기 라크리틴 효모 발효액은, 화장료 조성물 총 중량 대비 1 중량% 내지 10 중량% 포함될 수 있고, 5 중량% 내지 10 중량% 포함되는 것이 더욱 바람직하며, 그 농도는 100ppm 내지 10000ppm일 수 있다.In addition, the lacritin yeast fermentation broth may be included in 1% to 10% by weight, more preferably 5% to 10% by weight relative to the total weight of the cosmetic composition, and the concentration may be 100ppm to 10000ppm.

본 발명은 또한, 스킨, 토너, 에센스, 로션, 크림, 파우더, 팩, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림 및 비누로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인, 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides any one formulation selected from the group consisting of skin, toner, essence, lotion, cream, powder, pack, cleansing foam, cleansing water, cleansing lotion, cleansing cream, and soap, improving skin barrier and promoting moisturizing A cosmetic composition is provided.

이에 더하여, 본 발명은 라크리틴 효모 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 개선 및 보습 증진용 의약외품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a quasi-drug composition for skin barrier improvement and moisturizing enhancement containing lactic acid yeast fermentation broth as an active ingredient.

본 발명은 라크리틴(lacritin)을 유효성분으로 포함하여, 피부 보습에 관여하는 mRNA인 HAS3, AQP3, Claudin1, Desmocollin, ZO-1 등의 발현량을 증가시킴으로써, 피부장벽 개선 및 보습 증진 효과를 나타낼 수 있다.The present invention contains lacritin as an active ingredient and increases the expression levels of mRNAs HAS3, AQP3, Claudin1, Desmocollin, ZO-1, etc., which are involved in skin moisturizing, thereby improving the skin barrier and moisturizing effect. can indicate

도 1은 HaCaT 세포에 라크리틴 효모 발효액을 조성물 전체를 기준으로 각 중량%별(0%, 0.1%, 1%, 10%)로 처리하였을 때, HAS3(Hyaluronan synthase 3)의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다.
도 2는 HaCaT 세포에 라크리틴 효모 발효액을 각 중량%별(0%, 0.1%, 1%, 10%)로 처리하였을 때, AQP3(Aquaporin 3)의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다.'
도 3은 HaCaT 세포에 라크리틴 효모 발효액을 각 중량%별(0%, 0.1%, 1%, 10%)로 처리하였을 때, claudin 1의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다.
도 4는 HaCaT 세포에 라크리틴 효모 발효액을 각 중량%별(0%, 0.1%, 1%, 10%)로 처리하였을 때, desmocollin의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다.
도 5는 각질형성세포 내 결합체의 구성을 나타낸 것이다.
도 6은 HaCaT 세포에 라크리틴 효모 발효액을 각 중량%별(0%, 0.1%, 1%, 10%)로 처리하였을 때, ZO-1의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다.1 shows the relative expression level of HAS3 (Hyaluronan synthase 3) when HaCaT cells were treated with each weight% (0%, 0.1%, 1%, 10%) of the yeast fermentation broth of lacritin based on the total composition. is shown as
Figure 2 shows the relative expression levels of AQP3 (Aquaporin 3) when HaCaT cells are treated with yeast fermentation broth for each weight percent (0%, 0.1%, 1%, 10%).'
3 is a graph showing the relative expression level of claudin 1 when HaCaT cells were treated with lacritin yeast fermentation broth for each weight% (0%, 0.1%, 1%, 10%).
Figure 4 shows the relative expression level of desmocollin when HaCaT cells are treated with yeast fermentation broth lacritin for each weight% (0%, 0.1%, 1%, 10%).
5 shows the structure of the complex in keratinocytes.
6 is a view showing the relative expression level of ZO-1 when HaCaT cells were treated with yeast fermentation broth lacritin for each weight% (0%, 0.1%, 1%, 10%).

본 발명은, 라크리틴(lacritin)을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention provides a cosmetic composition for improving skin barrier and moisturizing enhancement comprising lacritin as an active ingredient.

본 발명에서 라크리틴은 다양한 형태로 화장료 조성물 내에 포함될 수 있음은 물론이나, 효모를 통해 발효시킨 배양액의 형태로 사용되는 것이 바람직하다. 구체적으로, 효모 형질전환 시스템을 사용하여 라크리틴 효모 발효액을 제조할 수 있으며, 이러한 형태로 화장료 조성물에 포함되는 경우 피부 장벽 개선 효과가 더욱 강화될 수 있다.In the present invention, lacritin may be included in the cosmetic composition in various forms, but it is preferably used in the form of a culture solution fermented through yeast. Specifically, the yeast transformation system can be used to prepare a yeast fermentation broth for lacritin, and when included in the cosmetic composition in this form, the skin barrier improvement effect can be further strengthened.

본 발명의 화장료 조성물은, 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 1 중량% 내지 10 중량%로 라크리틴 효모 발효액을 포함할 수 있다. 라크리틴 효모 발효액의 함량이 1 중량% 미만일 경우 피부장벽 개선 및 보습 증진 효과를 달성하기 어려우며, 10 중량% 초과일 경우 제형화가 어렵고 사용감이 저하될 수 있으며, 제조 후 제형 분리 현상이 발생될 수 있으며, 제품의 향에 문제가 생길 수 있다. 또한, 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 5 중량% 내지 10 중량%로 라크리틴 효모 발효액을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.The cosmetic composition of the present invention may include lactic acid yeast fermentation broth in an amount of 1% to 10% by weight based on the total weight of the cosmetic composition. When the content of the yeast lactic acid fermentation broth is less than 1% by weight, it is difficult to achieve the effect of improving the skin barrier and moisturizing enhancement. There may be a problem with the smell of the product. In addition, it is more preferable to include the lactic acid yeast fermentation broth in an amount of 5% to 10% by weight based on the total weight of the cosmetic composition.

또한, 라크리틴 효모 발효액은 그 농도가 100 ppm 내지 10000 ppm인 것이 바람직하다. 100 ppm 미만인 경우 보습 효과가 미비하며, 10000 ppm 초과인 경우 농도 증가에 비해 유의미한 효과를 나타내지 못한다.In addition, it is preferable that the concentration of the yeast fermentation broth of lacritin is 100 ppm to 10000 ppm. If it is less than 100 ppm, the moisturizing effect is insignificant, and if it is more than 10000 ppm, it does not exhibit a significant effect compared to the increase in concentration.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 사용되는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제 및 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물에는 글리세린, 부틸렌글리콜, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 판테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트, 알란토인 등의 보조성분이 추가로 더 포함될 수 있고, 용제로는 헥산디올, 정제수 등을 포함할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may further include conventional adjuvants and carriers such as commonly used antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, fragrances, and the like. For example, the cosmetic composition may further include auxiliary components such as glycerin, butylene glycol, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, tocopheryl acetate, citric acid, panthenol, squalane, sodium citrate, allantoin, etc. The zero may include hexanediol, purified water, and the like.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물을 포함하는 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art. Specifically, the cosmetic composition is a lotion (skin lotion), skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisture cream, hand cream, foundation, essence, nourishing essence , pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, suspension, gel, powder, paste, mask pack or sheet or a formulation containing an aerosol composition.

상기 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.The composition of the formulation may be prepared according to a method conventional in the art. The cosmetic composition may further include preservatives, stabilizers, surfactants, solubilizers, moisturizers, emollients, UV absorbers, preservatives, disinfectants, antioxidants, pH adjusters, organic and inorganic pigments, fragrances, cooling agents or limiting agents, etc. have. The blending amount of the additional ingredients such as the moisturizer can be easily selected by those skilled in the art within the range that does not impair the purpose and effect of the present invention, and the blending amount is 0.001 to 5% by weight, specifically 0.01 to 3% by weight, based on the total weight of the composition % by weight.

이에 더하여, 본 발명은 라크리틴 효모 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 개선 및 보습 증진용 의약외품 조성물을 제공한다. 본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 의미한다.In addition, the present invention provides a quasi-drug composition for skin barrier improvement and moisturizing enhancement containing lactic acid yeast fermentation broth as an active ingredient. As used herein, the term "quasi-drug" refers to items that are not instruments, machines, or devices used for the purpose of diagnosing, treating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals, and their pharmacological effects on the structure and function of humans or animals. It means items that are not instruments, machines, or devices used for the purpose of giving

본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어 세정제, 헤어 유연제, 마스크 및 연고 등의 피부외용제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 제형일 수 있다.The quasi-drug composition of the present invention is not limited thereto, but preferably a body cleanser, disinfectant cleaner, cleaner, kitchen cleaner, cleaning agent, toothpaste, mouthwash, wet tissue, detergent, soap, hand wash, hair cleaner, hair softener, mask and It may be one or more formulations selected from the group consisting of external preparations for skin, such as ointments.

특히 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다. 본 발명의 의약외품 조성물에는 제형에 따른 차이점을 제외하고는, 상기 화장료 조성물에 대하여 설명한 바와 동일한 내용이 적용될 수 있다.In particular, the external preparation for skin may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof. The external preparation for skin is a component usually used in external preparations for skin such as cosmetics or pharmaceuticals, for example, an aqueous component, an oily component, a powder component, alcohol, a moisturizer, a thickener, an ultraviolet absorber, a whitening agent, a preservative, an antioxidant, a surfactant, a fragrance , colorant, various skin nutrients, or a combination thereof may be appropriately formulated as needed. The external preparation for skin includes metal-blocking agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belapamil, licorice extract, glablidine, and kaline. Fruit hot water extract, various herbal medicines, drugs such as tocopherol acetate, glitylithic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, glucoside ascorbate, arbutin, kojic acid, glucose, fructose , saccharides such as trehalose and the like can also be appropriately blended. The same contents as described for the cosmetic composition may be applied to the quasi-drug composition of the present invention, except for differences depending on the formulation.

한편, 본 명세서에서 "피부"라 함은, 개체의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 몸 등의 체표(體表)를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념으로 이해될 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부상태 개선, 예를 들어 피부 노화 개선, 또는 피부 주름 개선을 필요로 하는 개체일 수 있다.Meanwhile, as used herein, the term "skin" refers to a tissue covering the body surface of an individual, and is the broadest concept including not only tissues covering the body surface, such as the face or body, but also the scalp and hair. can be understood The subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat. The subject may be an individual in need of improving skin condition, for example, improving skin aging, or improving skin wrinkles.

이하에서는 본 발명 라크리틴 발효 조성물의 제조 방법 및 본 발명 조성물의 보습력을 평가한 결과를 상세히 설명한다. 이는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 제조예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the method for producing the fermented lacritin composition of the present invention and the evaluation result of the moisturizing power of the composition of the present invention will be described in detail. This is for illustrating the present invention by way of example, and the scope of the present invention is not limited by the following Preparation Examples and Experimental Examples.

제조예production example

1. 효모 형질전환 시스템을 이용한 라크리틴 효모 발효1. Lacritin Yeast Fermentation Using Yeast Transformation System

(1) 효모 배양(1) yeast culture

YM 배지(glucose 10.0 g/L, yeast extract 3.0 g/L, malt extract 3.0 g/L, peptone 5.0 g/L) 20.0 mL에 Kluyveromyces marxianus (KCCM 32422, 한국미생물보존센터) 한 개의 colony를 넣고, 43.0 ℃, 200 rpm 조건으로 18시간 이상 진탕 배양기에서 배양하였다. 상기 조건으로 배양한 Kluyveromyces marxianus(이하 K. marxianus으로 기재함) 배양액을 YM배지에 1%(v/v) 비율로 넣은 후, 43.0 ℃, 200 rpm 조건으로 진탕 배양기에서 배양하였다.In 20.0 mL of YM medium (glucose 10.0 g/L, yeast extract 3.0 g/L, malt extract 3.0 g/L, peptone 5.0 g/L), one colony of Kluyveromyces marxianus (KCCM 32422, Korea Microorganism Conservation Center) was added, and 43.0 It was cultured in a shaking incubator for at least 18 hours under conditions of ℃, 200 rpm. The Kluyveromyces marxianus (hereinafter referred to as K. marxianus) cultured under the above conditions was put into YM medium at a ratio of 1% (v/v), and then cultured in a shaking incubator at 43.0 °C and 200 rpm.

(2) 재조합 라크리틴 코돈 최적화 및 박테리아 발현 벡터로의 클로닝(2) Recombinant lacritin codon optimization and cloning into bacterial expression vectors

Homo sapiens의 lacritin(Uniprot Number of parent protein: Q9GZZ8, Entrez Gene ID of parent protein: AF238867.1)을 대장균의 codon usage에 따라 최적화시켜 박테리아 발현 시스템으로 발현하였다. 합성된 코돈으로 최적화된 Homo sapiens의 lacritin(이하 HsLacritin으로 기재함) 유전자에 BamHI 및 XhoI 제한 효소 부위를 사용하여 대장균 발현 벡터 pET32a(Novagen)에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드는 DNA시퀀싱 (Bionics Co., Korea)에 의해 서열을 확인하였다. Homo sapiens lacritin (Uniprot Number of parent protein: Q9GZZ8, Entrez Gene ID of parent protein: AF238867.1) was optimized according to the codon usage of E. coli and expressed in a bacterial expression system. It was cloned into the E. coli expression vector pET32a (Novagen) using the BamHI and XhoI restriction enzyme sites in the Homo sapiens lacritin (hereinafter referred to as HsLacritin) gene optimized with the synthesized codon. The recombinant plasmid was sequenced by DNA sequencing (Bionics Co., Korea).

(3) 효모 발현 벡터의 클로닝(3) Cloning of yeast expression vectors

HsLacritin 유전자를 효모 K. marxianus에서 발현하기 위하여, 효모 발현벡터인 pYEGα-HIR525를 EcoRI 및 SalI으로 제한하고, 효모신호서열인 MFα와 HsLacritin을 융합하여 발현되도록 하였으며, NdeI 및 NarI으로 제한하여 pFA6-kanMX4 벡터에서 증폭한 G418 내성 유전자인 KanMX 카세트를 넣어 G418 항생제에서 선별 가능하도록 하였다. 재조합 플라스미드(plasmid)는 DNA 시퀀싱에 의해 서열을 확인하였다.To express the HsLacritin gene in yeast K. marxianus, the yeast expression vector, pYEGα-HIR525, was restricted to EcoRI and SalI, and MFα and HsLacritin, the yeast signal sequences, were fused to be expressed, and NdeI and NarI were restricted to pFA6-kanMX4. The KanMX cassette, which is a G418 resistance gene amplified from the vector, was added to enable selection by G418 antibiotics. The recombinant plasmid was sequenced by DNA sequencing.

(4) 효모 형질전환체 선별 및 배양(4) Yeast transformant selection and culture

재조합 플라스미드는 (HsLacritin/pYEGα-G418)를 E. coli 내로 형질전환하여 배양한 후 mini-prep kit를 이용하여 회수하였다. 환형으로 회수된 plasmid를 BamHI으로 제한처리하여 선형화시킨 후, 효모 균주 K. marxianus에 LiAc/PEG 방법으로 형질전환하였다.The recombinant plasmid (HsLacritin/pYEGα-G418) was transformed into E. coli and cultured, and then recovered using a mini-prep kit. The circularly recovered plasmid was linearized by restriction treatment with BamHI, and then transformed into yeast strain K. marxianus by LiAc/PEG method.

효모 단일 집락을 2 ml YPD(1% yeast extracts, 2% peptone, 2% dextrose)에 접종하여 30 ℃에서 16시간 액체배양 시킨 후, 1 ml의 배양액을 회수하여 회수된 균체를 멸균된 증류수를 이용하여 한번 씻어 준 후, 100 ㎕의 멸균된 증류수를 이용하여 풀어주었다. 50 ㎕ K. marxianus 균주에 57% PEG 115 ㎕, 4 M LiAc 5 ㎕, 10 ㎕ salmon sperm DNA(10 mg/ml), 그리고 선형화 된 DNA 20 ㎕를 넣은 후, 1분간 vortexer로 잘 섞어준 후, 42 ℃에서 40분간 열처리를 하였다. 8,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 형질전환 시에 사용한 buffer 성분을 제거 한 후, 1 ml YPD를 첨가한 후, 30℃에서 2시간 배양 하여 200 μg/ml G418을 포함하는 YPD 고체배지에 도말하였다. 30 ℃에서 2~3일간 배양하여 형질전환체를 얻었다.A single yeast colony was inoculated into 2 ml YPD (1% yeast extracts, 2% peptone, 2% dextrose) and liquid cultured at 30 ° C for 16 hours, 1 ml of the culture solution was recovered and the recovered cells were sterilized using distilled water. After washing once, it was released using 100 μl of sterile distilled water. After putting 115 μl of 57% PEG, 5 μl of 4 M LiAc, 10 μl salmon sperm DNA (10 mg/ml), and 20 μl of linearized DNA into 50 μl K. marxianus strain, mix well with a vortexer for 1 minute, Heat treatment was performed at 42 °C for 40 minutes. After centrifugation at 8,000 rpm for 1 minute to remove the buffer component used for transformation, 1 ml YPD was added, and incubated at 30° C. for 2 hours, and plated on YPD solid medium containing 200 μg/ml G418. Transformants were obtained by culturing at 30 °C for 2-3 days.

선별된 균주를 YPD G418 액체배지에 3 ml 접종하여 30℃에서 overnight 배양 한 후 250 ml baffled flask의 액체배지 25 ml 에 1%가 되도록 접종하였다. YPDG (1% yeast extracts, 2% peptone, 1% dextrose, galactose 1%) 30 ℃에서 48시간 동안 배양하여 HsLacritin 유전자의 발현을 유도하였다.3 ml of the selected strain was inoculated into YPD G418 liquid medium, incubated overnight at 30°C, and then inoculated to 1% in 25 ml of liquid medium in a 250 ml baffled flask. YPDG (1% yeast extracts, 2% peptone, 1% dextrose, galactose 1%) was cultured at 30 °C for 48 hours to induce HsLacritin gene expression.

2. 라크리틴 효모 발효액의 제조2. Preparation of lactic acid yeast fermentation broth

YPDG(1% yeast extracts, 2% peptone, 1% dextrose, 1% galactose)를 물 1 L에 용해하여 121 ℃에서 15분 동안 고압멸균하고, 25 ℃로 냉각하여 사용하였다. 냉각된 YPDG media에는 발현에 사용될 종균(K. marxianus)을 1 ml 접종하고, 약 3일간 진탕배양하여(200 rpm) 발효액을 제조하였다. 발효가 완료된 발효물은 원심분리기를 사용하여 4,000 rpm 1시간 원심분리 후 0.4 μm 필터로 멸균하여 발효액을 획득하였다.YPDG (1% yeast extracts, 2% peptone, 1% dextrose, 1% galactose) was dissolved in 1 L of water, autoclaved at 121°C for 15 minutes, and cooled to 25°C before use. 1 ml of a seed strain (K. marxianus) to be used for expression was inoculated into the cooled YPDG media, and cultured with shaking (200 rpm) for about 3 days to prepare a fermentation broth. The fermented product was sterilized with a 0.4 μm filter after centrifugation at 4,000 rpm for 1 hour using a centrifuge to obtain a fermentation broth.

실험예Experimental example - 보습력 향상 관련 mRNA의 발현 정도 측정 - Measurement of mRNA expression level related to moisturizing improvement

피부 각질 세포(Keratinocyte)에서 유래한 HaCaT Cell을 세포주(Cell line)로 하여, 본 발명의 라크리틴 효모 발효액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 도포함으로써, 피부 보습에 관여하는 mRNA인 HAS3(Hyaluronan synthase 3, 히알루론산 합성효소 3), AQP3(Aquaporin 3, 아쿠아포린 3), Claudin1(클라우딘1), Desmocollin(데스모콜린), ZO-1(Zonula Occludens-1)의 발현량을 24시간 동안 측정하였다. 이하, 상대적인 각 mRNA 발현량을 나타낸 결과를 도면을 통해 설명한다.Using HaCaT Cell derived from keratinocyte as a cell line, and applying a cosmetic composition containing the lactic acid yeast fermentation broth of the present invention as an active ingredient, HAS3 (Hyaluronan, an mRNA that is involved in skin moisturizing) Expression levels of synthase 3, hyaluronic acid synthase 3), AQP3 (Aquaporin 3, aquaporin 3), Claudin1 (claudin1), Desmocollin (desmocollin), and ZO-1 (Zonula Occludens-1) were measured for 24 hours. did Hereinafter, the results showing the relative expression levels of each mRNA will be described with reference to the drawings.

도 1은, HaCaT 세포에 레티노산(Retinoic acid) 1 μM 용액을 처리한 것을 대조군으로 하고, 전체 조성물 함량을 기준으로 라크리틴 효모 발효액이 각 0.1%, 1%, 10% 중량% 함유된 조성물을 처리한 것을 실험군으로 하였을 때, HAS3의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다. HAS3은 피부 진피층에 존재하는 히알루론산(Hyaluronic acid) 합성에 관여한다. 히알루론산은 조직의 수분 유지 등에 관여하므로, 피부 내 히알루론산이 감소하면 피부 탄력이 감소하고 주름이 증가하는 원인이 된다. 라크리틴 효모 발효액 처리 시, HAS3의 발현량이 증가하며, 농도가 증가함에 따라 보습력이 증가함을 확인할 수 있었다.Figure 1, HaCaT cells treated with a 1 μM solution of retinoic acid (Retinoic acid) as a control, based on the total composition content Lacritin yeast fermentation broth 0.1%, 1%, 10% of each composition containing 10% by weight When treated with the experimental group, the expression level of HAS3 is shown relatively. HAS3 is involved in the synthesis of hyaluronic acid present in the dermal layer of the skin. Since hyaluronic acid is involved in the maintenance of moisture in tissues, when hyaluronic acid in the skin decreases, skin elasticity decreases and wrinkles increase. When the lacritin yeast fermentation broth was treated, the expression level of HAS3 increased, and it was confirmed that the moisturizing power increased as the concentration increased.

도 2는, HaCaT 세포에 레티노산(Retinoic acid) 1 μM 용액을 처리한 것을 대조군으로 하고, 전체 조성물 함량을 기준으로 라크리틴 효모 발효액이 각 0.1%, 1%, 10% 중량% 함유된 조성물을 처리한 것을 실험군으로 하였을 때, AQP3의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다. AQP3은 세포막에서 물 분자와 글리세롤(glycerol)을 선택적으로 통과시키는 아쿠아글리세로포린(aquaglyceroporin) 단백질의 일종으로서, 피부 보습과 상처 치료에 중요하게 작용한다. 1% 이상의 라크리틴 효모 발효액 처리 시, AQP3의 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다.Figure 2, HaCaT cells treated with a 1 μM solution of retinoic acid (Retinoic acid) as a control group, based on the total composition content, each 0.1%, 1%, 10% of the yeast fermentation broth containing lacritin composition by weight When treated with the experimental group, the expression level of AQP3 is relatively shown. AQP3 is a type of aquaglyceroporin protein that selectively passes water molecules and glycerol through the cell membrane, and plays an important role in moisturizing the skin and healing wounds. It was confirmed that the expression level of AQP3 was increased when the yeast fermentation broth was treated with 1% or more of lacritin.

도 3은, HaCaT 세포에 전체 조성물 함량을 기준으로 라크리틴 효모 발효액이 각 0.1%, 1%, 10% 중량% 함유된 조성물을 처리하였을 때, claudin 1의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다. claudin 1은 표피층의 타이트 정션(Tight junction)을 구성하는 단백질으로서 피부 장벽 강화에 중요하게 작용한다. 10%의 라크리틴 효모 발효액 처리 시, AQP3의 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다.3 shows the relative expression levels of claudin 1 when HaCaT cells were treated with a composition containing 0.1%, 1%, and 10% by weight of each of the yeast fermentation broth lacritin based on the total composition content. Claudin 1 is a protein constituting a tight junction of the epidermal layer and plays an important role in strengthening the skin barrier. It was confirmed that the expression level of AQP3 increased when treated with 10% lacritin yeast fermentation broth.

도 4는, HaCaT 세포에 전체 조성물 함량을 기준으로 라크리틴 효모 발효액이 각 0.1%, 1%, 10% 중량% 함유된 조성물을 처리하였을 때, desmocollin의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다.4 shows the relative expression levels of desmocollin when HaCaT cells were treated with a composition containing 0.1%, 1%, and 10% by weight of each of the yeast fermentation broth lacritin based on the total composition content.

Desmocollin은 피부 장벽 강화에 중요하게 작용한다. 각질형성세포에 존재하는 결합체는 표피에서 가시층 각질형성 세포간 결합과 세포내 케라틴으로 구성된 장력섬유를 구성하는 중간세섬유 세포골격(intermediate filament cytoskeleton)에 고정되어, 세포로 하여금 외부적인 기계적 자극으로부터 손상되지 않도록 보호하는 역할을 한다. 이 결합체는 구조가 견고하여 발달 과정 중 표피 세포의 중층화나 소기관의 구조 유지에 중요한 역할을 하게 된다. 결합체는 전자현미경 소견상 세포질 내 판 (plaque)과 세포막 사이의 코어(core)로 구성된 특징적인 형태를 보인다. 생화학적으로 분석해보면 판은 4가지 단백으로, 코어는 4가지 당단백으로 구성되어 있으며, 중요구성 성분을 보면 판에는 플라코글로빈(plakoglobin)과 데스모플라킨(desmoplakin)등이 있고, 코어에는 데스모글레인(desmoglein)과 데스모콜린(desmocollin) 등이 있다(도 5 참조).Desmocollin plays an important role in strengthening the skin barrier. The binder present in keratinocytes is fixed to the intermediate filament cytoskeleton, which constitutes the tension fibers composed of intracellular keratin and intercellular bonds in the spinous layer of keratinocytes in the epidermis, allowing the cells to be protected from external mechanical stimuli. It serves to protect it from damage. This complex has a strong structure and plays an important role in the stratification of epidermal cells or maintenance of the structure of organelles during development. The conjugate shows a characteristic morphology consisting of a cytoplasmic plaque and a core between the cell membrane as seen by electron microscopy. When analyzed biochemically, the plate is made up of 4 proteins and the core is made up of 4 glycoproteins. There are moglein (desmoglein) and desmocollin (desmocollin) and the like (see FIG. 5).

10%의 라크리틴 효모 발효액 처리 시, desmocollin의 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다.It was confirmed that the expression level of desmocollin increased when treated with 10% lacritin yeast fermentation broth.

도 6은, HaCaT 세포에 전체 조성물 함량을 기준으로 라크리틴 효모 발효액이 각 0.1%, 1%, 10% 중량% 함유된 조성물을 처리하였을 때, ZO-1의 발현량을 상대적으로 나타낸 것이다. ZO-1(Zonula occuluden-1)은 표피층의 타이트 정션(Tight junction)을 구성하는 단백질으로서 피부 장벽 강화에 중요하게 작용한다. 라크리틴 효모 발효액 처리 시, ZO-1의 발현량이 증가하며, 농도가 증가함에 따라 보습력이 증가함을 확인할 수 있었다.6 is a view showing the relative expression level of ZO-1 when HaCaT cells were treated with a composition containing 0.1%, 1%, and 10% by weight of each of the yeast fermentation broth lacritin based on the total composition content. ZO-1 (Zonula occuluden-1) is a protein constituting a tight junction of the epidermal layer and plays an important role in strengthening the skin barrier. It was confirmed that the expression level of ZO-1 increased when the lacritin yeast fermentation broth was treated, and the moisturizing power increased as the concentration increased.

mRNA 발현량 측정을 통해, 라크리틴 효모 발효액은 그 함량이 조성물 총 함량을 기준으로 1 중량% 내지 10 중량%인 경우 뛰어난 보습 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 5 중량% 내지 10 중량% 인 경우 더욱 뛰어난 효과를 확인할 수 있었다.Through the mRNA expression level measurement, it was confirmed that the yeast fermentation broth of lacritin exhibits an excellent moisturizing effect when the content is 1% to 10% by weight based on the total content of the composition. In addition, in the case of 5 wt% to 10 wt%, a more excellent effect was confirmed.

이상에서 설명한 본 발명은 단지 본 발명의 예시적인 것으로서, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미를 한정하거나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위하여 사용된 것은 아니다. 그러므로 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.The present invention described above is merely exemplary of the present invention, which is only used for the purpose of explaining the present invention and is not used to limit the meaning or limit the scope of the present invention described in the claims. Therefore, it will be understood by those skilled in the art that various modifications and equivalent other embodiments are possible therefrom. Therefore, the true technical protection scope of the present invention should be determined by the technical spirit of the appended claims.

Claims

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라크리틴 효모 발효액을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물.
A cosmetic composition for improving skin barrier and enhancing moisture, comprising lactic acid yeast fermentation broth as an active ingredient.

제2항에 있어서,
상기 라크리틴 효모 발효액은, 발효 효모로서 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 균을 유효성분으로 포함하고, HAS3(Hyaluronan synthase 3), AQP3(Aquaporin 3), 클라우딘1(Claudin1), 데스모콜린(Desmocollin), ZO-1(Zonula Occludens-1)의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물.
3. The method of claim 2,
The lacritin yeast fermentation broth, Kluyveromyces marxianus as fermented yeast, contains bacteria as an active ingredient, HAS3 (Hyaluronan synthase 3), AQP3 (Aquaporin 3), claudin 1 (Claudin1), desmo A cosmetic composition for improving skin barrier and moisturizing enhancement, characterized in that it increases the expression level of choline (Desmocollin) and ZO-1 (Zonula Occludens-1).

제2항에 있어서,
상기 라크리틴 효모 발효액은 화장료 조성물 총 중량 대비 1 중량% 내지 10 중량% 포함된, 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물.
3. The method of claim 2,
The lacritin yeast fermented liquid is included in 1% to 10% by weight relative to the total weight of the cosmetic composition, a cosmetic composition for improving skin barrier and enhancing moisture.

제2항에 있어서,
상기 라크리틴 효모 발효액은 화장료 조성물 총 중량 대비 5 중량% 내지 10 중량% 포함된, 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물.
3. The method of claim 2,
The lactic acid yeast fermentation broth is contained in 5% to 10% by weight relative to the total weight of the cosmetic composition, a cosmetic composition for improving skin barrier and moisturizing enhancement.

제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 라크리틴 효모 발효액은, 농도가 100ppm 내지 10000ppm인, 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물.
6. The method according to claim 4 or 5,
The lacritin yeast fermentation broth, the concentration of 100ppm to 10000ppm, skin barrier improvement and moisturizing cosmetic composition.

제2항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 스킨, 토너, 에센스, 로션, 크림, 파우더, 팩, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림 및 비누로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인, 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물.
3. The method of claim 2,
The cosmetic composition is any one formulation selected from the group consisting of skin, toner, essence, lotion, cream, powder, pack, cleansing foam, cleansing water, cleansing lotion, cleansing cream and soap, skin barrier improvement and moisturizing enhancement cosmetic composition for use.

라크리틴 효모 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 개선 및 보습 증진용 의약외품 조성물.A quasi-drug composition for skin barrier improvement and moisturizing enhancement containing lacritin yeast fermented liquid as an active ingredient.