KR20200002008A - Streptococcus salivarius sbk4 strain isolated from skin and functional cosmetic composition comprising Streptococcus salivarius sbk4 strain - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 피부 유래 신균주 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 및 이를 이용한 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a skin-derived new strain Streptococcus salivarius sbk4 and a functional cosmetic composition using the same.
현대인들의 경제수준이 향상되고 사회생활의 참여도가 높아지면서 피부 미용 건강에 대한 관심이 다양한 연령층에서 높은 수준으로 증가하고 있다. 피부노화를 방지하고 피부 스트레스를 억제하여 피부노화 방지 및 깨끗하고 건강한 피부를 유지하고자 하는 목적에 따라 많은 미용 관련 화장품 및 식품이 개발되고 있다.As the economic level of modern people improves and social participation increases, interest in skin care health is increasing to a high level among various age groups. Many cosmetic-related cosmetics and foods have been developed according to the purpose of preventing skin aging and preventing skin aging and maintaining clean and healthy skin.
자유라디칼이나 활성산소는 미토콘드리아, 식세포 또는 세포질 중 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)나 글루타티온 환원 효소(glutathion reductase)에 의한 정상적인 대사 과정 또는 자외선, 외부자극에 의한 염증 반응 등 여러 가지 생물학적 반응에 의해 형성된다. 이렇게 반응성이 큰 활성산소와 자유라디칼, 특히 그 중에서도 반응성과 파괴성이 매우 큰 과산화물(superoxide) 음이온 라디칼이 인체 내에 과량으로 축적되면, 염증 반응 이외에도 세포의 노화를 비롯하여 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관 장애, 고지혈증, 당뇨병, 신경퇴행성 질환 등 각종 인체 질환을 일으키게 된다. 따라서 상기 활성산소 또는 자유라디칼을 제거할 수 있는 소거물질은 이들 질병을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 것으로 보고되고 있으며, 미생물 및 식물체로부터 다양한 활성산소(또는 자유라디칼) 소거 물질을 개발하기 위한 연구가 계속되고 있다.Free radicals and free radicals are formed by various metabolic processes such as xanthine oxidase or glutathione reductase in mitochondria, phagocytes or cytoplasm, or by various biological reactions such as UV and external stimuli. do. When such highly reactive free radicals and free radicals, especially superoxide anion radicals that are highly reactive and destructive, accumulate excessively in the human body, in addition to inflammatory reactions, cell aging, stroke, myocardial infarction and diabetic vascular disorders , Hyperlipidemia, diabetes, neurodegenerative diseases will cause various human diseases. Therefore, scavengers capable of removing the active oxygen or free radicals have been reported to have an effect of preventing or treating these diseases, and researches for developing various active oxygen (or free radical) scavengers from microorganisms and plants have been reported. It is going on.
또한, 자유라디칼이나 활성산소의 생성을 억제하는 기능을 갖는 기능성 화장품의 개발도 이어지고 있는데, 합성화합물에 대한 소비자들의 낮은 기호도로 인해 최근 개발되고 있는 제품들은 천연물을 소재로 하여 기능성 화장품들이 개발되고 있다. In addition, the development of functional cosmetics having a function of inhibiting the production of free radicals or free radicals continues to develop. Due to the low preference of consumers for synthetic compounds, recently developed products are developing functional cosmetics based on natural products. .
한편, 유산균은 인체 내에서 유익한 역할을 하는 세균으로서 탄수화물과 같은 당을 이용하여 유산(젖산)을 생성하는 균이다. 지금까지 400여종이 발견되었으며 화장품의 제조에도 응용되고 있다. 이러한 유산균들을 일반적인 배양액, 예를 들어 스킴밀크, 웨이, 당류 등을 주성분으로 하는 배지 중에서 배양하여 얻어지는 발효액은, 미백, 보습, 각질층의 턴오버(turn over) 속도 증가에 의한 피부의 소프트닝(skin softning), 피부 주름 완화 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있으나, 실제 이들 발효액을 함유하는 화장품의 이러한 기능성 효과는 발효액 중의 유효성분에 의하기 보다는 화장품에 첨가된 다른 원료를 통하여 나타내는 경우가 대부분이다.On the other hand, lactic acid bacteria are bacteria that play a beneficial role in the human body to produce lactic acid (lactic acid) using sugars such as carbohydrates. To date, more than 400 species have been discovered and applied to cosmetics manufacturing. The fermentation broth obtained by culturing these lactic acid bacteria in a general culture medium, for example, a medium containing skim milk, wei, and saccharides, is used for skin softning by whitening, moisturizing, and increasing turnover rate of the stratum corneum. Although it is reported that it is effective in reducing skin wrinkles, the functional effect of cosmetics containing these fermentation broths is most often expressed through other raw materials added to cosmetics rather than by the active ingredient in the fermentation broth.
그러나 아직까지 피부개선 및 피부건강을 위한 기능성 화장품으로서 주원료를 유산균으로 하여 개발된 예가 없다.However, there are no examples of functional cosmetics for skin improvement and skin health.
이에 본 발명자들은 인체, 사람의 피부로부터 유래된 균주를 이용하여 항산화 활성이 우수하고 피부 장벽 개선능을 갖는 기능성 화장품을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors completed the present invention by confirming that the functional cosmetics having excellent antioxidant activity and skin barrier improvement ability can be prepared using strains derived from human skin and human skin.
따라서 본 발명의 목적은 본 발명은 피부로부터 분리된 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주(기탁번호: KCTC13872BP)를 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide a Streptococcus salivarius sbk4 strain (Accession No .: KCTC13872BP) isolated from the skin.
본 발명의 다른 목적은 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주(기탁번호: KCTC13872BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 또는 상기 균주의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a cosmetic composition having an antioxidant activity, comprising Streptococcus salivarius sbk4 strain (Accession Number: KCTC13872BP), a culture of the strain, a lysate of the strain, or an extract of the strain as an active ingredient. It is.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주(기탁번호: KCTC13872BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 또는 상기 균주의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽의 개선 또는 강화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention comprises a Streptococcus salivarius sbk4 strain (Accession Number: KCTC13872BP), a culture of the strain, a lysate of the strain or an extract of the strain as an active ingredient, for improving or enhancing skin barrier It is to provide a cosmetic composition.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 피부로부터 분리된 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주(기탁번호: KCTC13872BP)를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a Streptococcus salivarius sbk4 strain (Accession Number: KCTC13872BP) isolated from the skin.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 항산화 활성, 항염 활성 및 피부장벽 개선 활성을 갖는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the strain may have antioxidant activity, anti-inflammatory activity and skin barrier improvement activity.
또한 본 발명은 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주(기탁번호: KCTC13872BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 또는 상기 균주의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a cosmetic composition having an antioxidant activity, comprising a Streptococcus salivarius sbk4 strain (Accession Number: KCTC13872BP), the culture of the strain, a crush of the strain or an extract of the strain as an active ingredient.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능 또는 일산화질소 소거능을 갖는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the cosmetic composition may have a superoxide radical scavenging ability, ABTS radical scavenging ability or nitrogen monoxide scavenging ability.
또한 본 발명은 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주(기탁번호: KCTC13872BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 또는 상기 균주의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽의 개선 또는 강화용 화장료 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention comprises a Streptococcus salivarius sbk4 strain (Accession Number: KCTC13872BP), the culture of the strain, the lysate of the strain or extract of the strain as an active ingredient, cosmetic composition for improving or strengthening the skin barrier to provide.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 각질세포막(cornified envelope)의 형성을 촉진 또는 증진시키는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the cosmetic composition may be to promote or enhance the formation of a corneal envelope (cornified envelope).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition is a skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nutrition lotion, massage cream, nutrition cream, moisture cream, hand cream, essence, nutrition essence , Pack, soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, latex, lipstick, makeup base, foundation, press powder and loose powder have.
본 발명에 따른 피부로부터 분리 및 동정된 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주(기탁번호: KCTC13872BP), 이의 배양물, 세포 파쇄물 또는 추출물은 페놀 및 플라보노이드를 다량 함유하고 있으며 우수한 슈퍼옥사이드 라디칼 또는 ABTS 라디칼 소거능을 함유하고 있어 항산화 기능을 갖는 기능성 화장품의 제조에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 피부장벽 개선 활성이 우수하여 피부장벽 개선 및 피부장벽 강화를 위한 기능성 화장품의 제조에도 용이하게 사용될 수 있다.Streptococcus salivarius sbk4 strain (Accession No .: KCTC13872BP), its culture, cell lysate or extract thereof, isolated and identified from the skin according to the present invention contains a large amount of phenol and flavonoids and has excellent superoxide radical or ABTS radical scavenging ability. It can be used not only for the production of functional cosmetics having an antioxidant function, but also has an excellent skin barrier improving activity and can be easily used for the manufacture of functional cosmetics for skin barrier improvement and skin barrier enhancement.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 인체 피부로부터 분리 및 동정한 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4의 계통도를 모식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 피부각질세포에서 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 신균주의 파쇄물(SSC) 처리에 따른 수퍼옥사이드 라디칼 소거능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 피부각질세포에서 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 신균주의 파쇄물(SSC) 처리에 따른 일산화질소 소거능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 피부각질세포에서 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 신균주의 파쇄물(SSC) 처리에 따른 각질세포막(cornified envelope)의 형성 촉진능을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 1 is a schematic diagram showing the schematic diagram of Streptococcus salivarius sbk4 isolated and identified from human skin in one embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the results of analyzing the superoxide radical scavenging ability according to the treatment of the lysate (SSC) of the Streptococcus salivarius sbk4 mycobacteria of the present invention in the skin keratinocytes.
Figure 3 shows the results of the analysis of nitric oxide scavenging ability according to the treatment (SSC) of the Streptococcus salivarius sbk4 myococcal strain of the present invention in the keratinocytes.
Figure 4 shows the results of analyzing the ability to promote the formation of the corneal envelope (cornified envelope) according to the treatment (SSC) of the Streptococcus salivarius sbk4 myococcal strain of the present invention in the skin keratinocytes.
본 발명은 인체 피부로부터 분리 및 동정한 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주 및 상기 균주를 이용한 기능성 화장료 조성물을 제공함에 특징이 있다.The present invention is characterized by providing a Streptococcus salivarius sbk4 strain isolated and identified from human skin and a functional cosmetic composition using the strain.
본 발명자들은 유산균 자체를 주요성분으로 하며, 항산화 활성이 우수한 기능성 화장품 제조의 원료가 될 수 있는 새로운 유산균을 동정하기 위해 연구하던 중, 인간의 피부로부터 스트렙토코쿠스 살리바리우스에 속하는 신균주를 분리하였고, 이를 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주라 명명하였으며 이의 우수한 항산화 활성을 확인함으로써, 상기 균주를 항산화 화장품의 제조에 사용할 수 있음을 확인하였다.The inventors of the present invention isolated a new strain belonging to Streptococcus salivarius from human skin, while researching to identify a new lactic acid bacterium, which has lactic acid bacteria itself as a main ingredient and can be a raw material for producing functional cosmetics having excellent antioxidant activity. It was named Streptococcus salivarius sbk4 strain and by confirming its excellent antioxidant activity, it was confirmed that the strain can be used for the manufacture of antioxidant cosmetics.
구체적으로 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 인체의 피부시료로부터 피부에 존재하는 신규 미생물을 분리하였고, 동정된 균주들의 16s rRNA 서열을 분석하여, 종래 밝혀진 바 없었던 새로운 균주인 스트렙토코쿠스 살리바리우스 속 균주를 동정하였으며, 이를 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주라 명명하였고, 한국생명공학연구원에 2019년 06월 26일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC13872BP를 부여받았다.Specifically, according to one embodiment of the present invention, the present inventors have isolated a new microorganism present in the skin from the skin sample of the human body, and analyzed the 16s rRNA sequence of the identified strains, Streptococcus which is a new strain that has not been previously known A strain of genus Salivarius was identified, which was named Streptococcus salivarius sbk4 strain, and was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on June 26, 2019 and was given accession number KCTC13872BP.
나아가, 본 발명에서는 동정된 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주에 대한 생리활성을 연구한 결과, ABTS 라디칼 및 슈퍼옥사이드 라디칼에 대한 우수한 소거능을 가지고 있음을 확인하였다.Furthermore, in the present invention, as a result of studying the physiological activity of the identified Streptococcus salivarius sbk4 strain, it was confirmed that it has excellent scavenging ability against ABTS radicals and superoxide radicals.
그러므로 본 발명자들은 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주를 항산화 활성을 갖는 화장품의 제조에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, the present inventors have found that the Streptococcus salivarius sbk4 strain of the present invention can be usefully used for the preparation of cosmetics having antioxidant activity.
따라서 본 발명은 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공할 수 있다.Therefore, the present invention can provide a cosmetic composition comprising Streptococcus salivarius sbk4 strain, its culture, its lysate or its extract as an active ingredient.
본 발명의 화장료 조성물은 항산화 활성을 가지며, 특히 슈퍼옥사이드 라디칼 또는 ABTS 라디칼에 대한 우수한 소거능을 갖는다.The cosmetic composition of the present invention has antioxidant activity and in particular has excellent scavenging ability against superoxide radicals or ABTS radicals.
뿐만 아니라, 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주의 파쇄물을 각질형성세포인 HaCaT 세포에 처리한 후, 각질세포막(cornified envelope)의 형성정도를 분석하여 피부장벽에 미치는 영향을 분석하였다.In addition, in one embodiment of the present invention, after treating the lysate of the Streptococcus salivarius sbk4 strain of the present invention to HaCaT cells, keratinocytes, the degree of formation of the cornified envelope is analyzed on the skin barrier. The impact was analyzed.
그 결과, 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주의 파쇄물을 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 각질세포막(cornified envelope)의 형성이 증가한 것으로 나타나, 본 발명의 균주가 피부 장벽을 개선시키는 작용이 있음을 알 수 있었다.As a result, the group treated with the lysate of Streptococcus salivarius sbk4 strain of the present invention showed an increase in the formation of a cornified envelope compared to the group not treated, and the strain of the present invention improved the skin barrier. I could see that this is.
피부는 체내 수분을 보유하고 외부 침입 인자의 내부 침입을 보호하는 필수적인 장벽기능을 수행하면서 면역반응을 나타내는 대표적인 장기이다. 피부장벽의 가장 중요한 역할은 약 80%의 물로 구성된 우리의 몸을 건조한 외부환경으로부터 안전하게 지켜주는 것이며 이러한 장벽기능은 피부 바깥층인 표피에서 생성, 유지되고 있다. 피부장벽을 포함한 표피층은 인체의 조직 가운데에서도 가장 역동적인 기관으로 끊임없는 표피세포의 형성, 분화 및 탈각과정이 끊임없이 반복되면서 표피의 항상성(Epidermal homeostasis)을 유지한다.Skin is a representative organ that has an immune response, retaining moisture in the body and performing an essential barrier function to protect the internal invasion of external invading factors. The most important role of the skin barrier is to keep our body composed of about 80% water safe from the dry external environment, and this barrier function is produced and maintained in the epidermis, the outer layer of the skin. The epidermal layer, including the skin barrier, is the most dynamic organ among human tissues, and maintains epidermal homeostasis as the process of continuous epithelial cell formation, differentiation and defecation is repeated repeatedly.
이러한 피부 장벽기능은 각질세포(corneocyte), 각질세포외막(cornified envelope), 각질세포간 지질(lamellar membrane lipid, intercorneocyte lipid), 각질교소체(corneodesmosome)로 구성된 각질층 구조체를 통해 나타나며 피부장벽에 관련된 단백질 성분으로는 외피단백질(envelope protein)이 잘 알려져 있다.This skin barrier function is expressed through the stratum corneum structure consisting of corneocytes, cornified envelope, interlaminar membrane lipids and intercorneocyte lipids, and corneodesmosomes, and proteins related to skin barriers. Envelope protein is well known as a component.
따라서 피부 장벽기능에 관여하는 상기와 같은 인자들이 형성되지 않거나 이상이 있는 경우, 피부 장벽이 약화되어 다양한 피부질환이 발생될 수 있다.Therefore, when the above factors are not formed or abnormally involved in skin barrier function, the skin barrier is weakened and various skin diseases may occur.
이러한 점에서 본 발명의 균주, 구체적으로 sbk4 균주의 파쇄물이 피부각질형성세포에서 cornified envelope (CE)의 형성 및 증식을 촉진시킬 수 있는 활성이 있음을 확인함에 따라 본 발명의 균주가 피부 장벽을 개선 또는 강화시킬 수 있음을 알 수 있었다. In this regard, the strain of the present invention improves the skin barrier as the fragment of the present invention, specifically, the sbk4 strain, has the activity of promoting the formation and proliferation of cornified envelope (CE) in keratinocytes. Or it could be strengthened.
본 발명에서 상기 배양이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미한다. 또한 상기 배양물은 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 균체 파쇄물, 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the culturing means all the activities performed to grow the microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions. The culture also includes any form of processing for lactic acid bacteria known to those skilled in the art, as well as live bacteria obtained from the culture medium, including but not limited to cell lysates, dried products, frozen products, and the like.
나아가 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. Furthermore, the components included in the cosmetic composition of the present invention may include components commonly used in cosmetic compositions in addition to Streptococcus salivarius sbk4 strain, its culture, its lysate or its extract as an active ingredient, such as antioxidants, Conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings, and carriers.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art and include, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing , Oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays, and the like, but are not limited thereto. More specifically, the cosmetic composition of the present invention may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components. Can be. When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan. When the formulation of the present invention is a suspension, liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol, suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, and microcrystals are used as carrier components. Soluble cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used. When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, and especially in the case of spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether. When the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing, the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide ether. Sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.When the cosmetic composition of the present invention is a soap, a surfactant-containing cleansing formulation or a surfactant-free cleansing formulation, it may be wiped off, peeled off or washed with water after application to the skin. As a specific example, the soap is liquid soap, powdered soap, solid soap and oil soap, the surfactant-containing cleansing formulation is a cleansing foam, cleansing water, cleansing towel and cleansing pack, the surfactant-free cleansing formulation is a cleansing cream , Cleansing lotion, cleansing water and cleansing gel, but are not limited thereto.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are intended to illustrate the present invention more specifically, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
<실시예 1><Example 1>
피부 유래 유산균의 분리 및 동정Isolation and Identification of Skin-derived Lactic Acid Bacteria
<1-1> 시료 채취 및 유산균 분리<1-1> Sampling and Lactobacillus Isolation
11세 남자 아이의 볼 부분에서 피부 표면 미생물을 스왑하였다. 스왑은 Quick Swab kit를(3M Microbiology, USA) 이용하였고, swab 방법은 swab kit 제조사에서 권장하는 방법을 기준으로 검사대상의 표면적 약 12 cm2를 기준으로 채취하였다. 스왑된 각 샘플들은 한천이 함유된 고형 EM배지에 화염멸균한 백금이를 이용하여 획선 도말하여 접종하였고 싱글 콜로니가 확인될 때까지 3일간 37℃의 호기 조건에서 배양한 뒤 다시 독립된 집락인 싱글 콜로니를 새로운 플레이트에 획선 도말하는 방법으로 3회 계대배양하여 균주의 생육 활성을 높였으며, 상기 과정으로 배양된 싱글 콜로니를 분리하여 분리된 균주의 염기서열을 분석하였다. Skin surface microbes were swapped in the cheeks of an 11-year-old boy. The swab was used for the quick swab kit (3M Microbiology, USA), and the swab method was collected based on the surface area of about 12 cm 2 based on the method recommended by the swab kit manufacturer. Each swabbed sample was inoculated with agar using a flame sterilized platinum paste on solid EM medium containing agar and incubated in aerobic conditions at 37 ° C for 3 days until a single colony was identified. Was cultured three times by a method of streaking on a new plate to increase the growth activity of the strain, and the nucleotide sequence of the isolated strain was analyzed by separating the cultured single colonies.
<1-2> 염기서열 분석<1-2> sequencing
상기 <1-1>의 과정에서 순수 분리된 균주에 대한 16S rRNA의 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석은 염색체 DNA 추출키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였고 얻어진 gDNA로부터 유니버설 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하여 염기서열을 분석하였다. 16s rRNA 시퀀싱 수행으로 얻어진 결과에 대한 상동성 검사는 NCBI에서 제공하는 BLAST 서치 데이터베이스를 통해 수행하였다. In the process of <1-1>, sequencing of 16S rRNA was performed on purely isolated strains. In the sequencing analysis, genomic DNA was isolated using a chromosomal DNA extraction kit, and nucleotide sequences were analyzed by PCR using universal primers from the obtained gDNA. Homology testing of the results obtained with the 16s rRNA sequencing run was performed through the BLAST search database provided by NCBI.
염기서열 분석 결과, 본 발명에서 분리한 유산균은 스트렙토코쿠스 살리바리우스 속에 속하는 균주라는 것을 알 수 있었고, 16s rRNA의 염기서열 분석 결과 본 발명의 균주가 종래 없었던 신균주인 것으로 확인하였으며, 따라서 본 발명자들은 상기 분리 및 동정한 균주를 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주라고 명명하였고, 이를 한국생명공학연구원에 2019년 06월 26일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC13872BP를 부여받았다.As a result of the sequencing analysis, the lactic acid bacteria isolated from the present invention were found to belong to the genus Streptococcus salivarius, and the sequencing analysis of the 16s rRNA confirmed that the strain of the present invention was a new strain that had not been conventionally present. They named the isolated and identified strain Streptococcus salivarius sbk4 strain, which was deposited on June 26, 2019 by the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology and was given accession number KCTC13872BP.
또한, 본 발명에서 분리 및 동정한 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4의 16s rRNA의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.In addition, the nucleotide sequence of 16s rRNA of Streptococcus salivarius sbk4 isolated and identified in the present invention is shown in SEQ ID NO: 1.
<실시예 2><Example 2>
스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주의 항산화 활성분석Antioxidant Activity of Streptococcus salivarius sbk4 Strains
<2-1> 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4의 배양물 제조<2-1> Preparation of culture of Streptococcus salivarius sbk4
상기 본 발명에서 분리한 유산균인 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주를 MRS 브로스 배지에 접종하여 37℃에서 48 시간 동안 호기성 조건으로 배양 후 배양액을 원심분리(3,000g, 10분)하여 펠렛을 회수하였고, 이를 PBS로 3회 세척 후 다시 PBS에 재현탁 하였다. 3회 세척한 세포현탁액을 Ice bath상에서 10분간 초음파로 파쇄한 후 10,000g, 10분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 상등액만을 회수한 다음, 막필터(filter (0.45 μm))로 여과하여 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주의 배양물인 세포 파쇄물을 얻었다. The pellet was recovered by inoculating Streptococcus salivarius sbk4 strain, the lactic acid bacterium isolated from the present invention, in an aerobic condition at 37 ° C. for 48 hours, and then centrifuging the culture solution (3,000 g, 10 minutes). This was washed three times with PBS and then resuspended in PBS. After washing three times the cell suspension ultrasonically in an ice bath for 10 minutes, and centrifuged for 10,000g, 10 minutes to remove the cell debris, and recovered only the supernatant, and then filtered with a membrane filter (filter (0.45 μm)) Cell debris which was a culture of the Streptococcus salivarius sbk4 strain of was obtained.
<2-2> 총 폴리페놀 함량 분석 <2-2> Total Polyphenol Content Analysis
상기 <2-1>에서 수득한 본 발명의 균주의 세포 파쇄물(시료) 10 μL를 취해 증류수 90 μL를 첨가한 후, 1 N Folin-Ciocalteu 시약 10 μL를 넣고 실온에서 5분간 반응시켰다. 7% Na2CO3 용액 100 μL 을 첨가하고 10분간 반응시킨 후에 분광광도계를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 갈릭산을 증류수에 용해시켜 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정한 후 작성한 표준 검량선에 대입하여 산출하였다.After taking 10 μL of the cell lysate (sample) of the strain of the present invention obtained in the above <2-1> and adding 90 μL of distilled water, 10 μL of 1 N Folin-Ciocalteu reagent was added and reacted at room temperature for 5 minutes. After 100 μL of 7% Na 2 CO 3 solution was added and reacted for 10 minutes, the absorbance was measured at 750 nm using a spectrophotometer. The total phenol content was calculated by dissolving gallic acid in distilled water and measuring the absorbance in the same manner as above and substituting the standard calibration curve.
<2-3> 총 플라보노이드 함량 분석 <2-3> Total Flavonoid Content Analysis
상기 <2-1>에서 수득한 본 발명의 균주의 세포 파쇄물(시료) 25 μL에 1 N NaOH 25 μL를 가하고 혼합 후, diethylene glycol을 250 μL 첨가하고 실온에서 1시간 반응시킨 후에 분광광도계를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로 naringin을 사용하여 표준곡선을 작성하였고, 총 플라보노이드 함량은 mg naringin equivalent로 표기하였다.25 μL of 1 N NaOH was added to 25 μL of the cell lysate (sample) of the strain of the present invention obtained in the above <2-1> and mixed, followed by adding 250 μL of diethylene glycol and reacting at room temperature for 1 hour using a spectrophotometer. Absorbance at 420 nm was measured. A standard curve was prepared using naringin as the standard reagent, and the total flavonoid content was expressed as mg naringin equivalent.
분석 결과, 본 발명의 균주의 배양물에는 총 페놀과 총 플라보노이드의 함량이 다량 포함되어 있는 것으로 나타났다. As a result, the culture of the strain of the present invention was found to contain a large amount of total phenol and total flavonoids.
<2-3> ABTS 소거능 측정<2-3> ABTS Clearance Measurement
본 발명자들은 상기 <2-1> 및 <2-2>의 실험을 통해 본 발명의 균주 배양물, 특히 균주의 세포 파쇄물이 페놀 및 플라보노이드를 다량 함유하고 있음을 확인함에 따라 실제적으로 항산화 활성이 있는지 확인하기 위해, ABTS 라디칼 소거능을 분석하였다. 이를 위해 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 암소에서 12시간 동안 반응시켰다. 96-웰 플레이트의 웰 당 10 μL의 본 발명에 따른 균주 세포 파쇄물을 넣고 희석한 ABTS 용액 290 μL를 가하여 30분간 반응시킨 다음 750 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 시료에 의하여 라디칼 소거되는 만큼의 흡광도가 감소되는 정도를 측정하였고 이때 활성 비교를 위하여 양성대조군으로는 항산화 효과가 있다고 알려진 아스코르빅산(ascorbic acid)을 사용하였다.The inventors have conducted the experiments of <2-1> and <2-2> to find out whether the strain culture of the present invention, in particular, the cell lysate of the strain, contains a large amount of phenol and flavonoids, and therefore, is there actually an antioxidant activity. To confirm, ABTS radical scavenging ability was analyzed. To this end, 7.4 mM ABTS and 2.6 mM potassium persulfate were reacted in the dark for 12 hours. 10 μL of the strain cell lysate according to the present invention was added per well of a 96-well plate and 290 μL of the diluted ABTS solution was added thereto, followed by reaction for 30 minutes, and the absorbance was measured at 750 nm. The degree of absorbance decrease as much as radical scavenging by the sample was measured. As a positive control group, ascorbic acid, which is known to have an antioxidant effect, was used as a positive control.
그 결과, 본 발명에 따른 균주인 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4는 ABTS 라디칼 소거능이 있는 것으로 나타났고, 그 활성은 양성대조군으로 사용된 아스코르빅산에 비해 더 우수한 것으로 나타났다. As a result, the strain Streptococcus salivarius sbk4 according to the present invention was shown to have an ABTS radical scavenging activity, and its activity was better than that of ascorbic acid used as a positive control.
<2-4> 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능 측정<2-4> Superoxide radical scavenging activity
나아가 본 발명자들은 본 발명의 sbk4 균주에 대한 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능 활성 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 이를 위해, HaCaT 세포를 2 × 105 cells/well 조건으로 6-well plate에서 24시간 동안 배양한 후에 TNF-α (10 ng/mL)를 2시간 동안 전 처리 하였으며 이후 본 발명의 sbk4 균주의 파쇄물 시료(ssc) 20μL 및 80μL를 각각 24시간 동안 처리한 후, 세포 배양 상층액을 취한 후 남은 세포를 1X HBSS 버퍼 1 mL/well 조건으로 두 번 세척 후에 1X HBSS 버퍼에 녹인 100 μM DCFH-DA 용액 500 μL/well 으로 처리하였다. 37℃ CO2 인큐베이터에서 30분 정도 반응 후에 1X HBSS 버퍼 1 mL/well 조건으로 두 번 세척하고, 4% formaldehyde 용액으로 4℃에서 2시간 이상 고정시켰다. 그런 뒤 1X HBSS 버퍼 1 mL/well 조건으로 두 번 세척하여 4% formaldehyde 용액을 제거하였고, 최종적으로 1X HBSS 버퍼 800 μL/well 조건에서 세포를 수득한 후, 96 well 플레이트에 200 μL씩 loading 하고 luminometer 527 nm에서 측정하였다.Furthermore, the present inventors performed the following experiment to confirm the superoxide radical scavenging activity of the sbk4 strain of the present invention. To this end, HaCaT cells were incubated for 24 hours in a 6-well plate at 2 × 10 5 cells / well condition, followed by pretreatment with TNF-α (10 ng / mL) for 2 hours, followed by lysates of the sbk4 strain of the present invention. 100 μM DCFH-DA solution dissolved in 1X HBSS buffer after 20 μL of sample (ssc) and 80 μL, respectively, for 24 hours, and after taking cell culture supernatant, washing the remaining cells twice with 1 mL / well of 1X HBSS buffer. Treated at 500 μL / well. After 30 minutes of reaction in a 37 ° C. CO 2 incubator, washed twice with 1 mL / well of 1 × HBSS buffer and fixed at 4 ° C. for more than 2 hours with 4% formaldehyde solution. Then, 4% formaldehyde solution was removed by washing twice with 1 mL / well of 1X HBSS buffer. Finally, cells were obtained at 800 μL / well of 1X HBSS buffer, and then 200 μL was loaded on a 96 well plate and a luminometer was used. Measurement was made at 527 nm.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, HaCaT 세포주에 TNF-α를 처리하여 증가된 수퍼옥사이드 라디칼이 본 발명의 균주 파쇄물 시료(ssc) 80 μL 처리 시, 현저하게 감소되는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 통해서 본 발명의 sbk4 균주의 세포 파쇄물은 세포 및 조직의 손상을 유발하는 수퍼옥사이드 라디칼의 소거능이 있음을 확인하였고, 본 발명의 균주 파쇄액은 피부 조직에서 광산화적 스트레스에 대한 방어 효능을 가질 수 있음을 알 수 있었다. As a result, as shown in Figure 2, the treatment of HaCaT cell line with TNF-α increased the superoxide radical was found to be significantly reduced when 80 μL treatment of the strain lysate sample (ssc) of the present invention. Through these results, it was confirmed that the cell lysate of the sbk4 strain of the present invention has a scavenging ability of the superoxide radical causing damage to cells and tissues, and the strain lysate of the present invention has a protective effect against photochemical stress in skin tissue. It was found that it can have.
<실시예 3><Example 3>
스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주의 항염활성 분석Anti-inflammatory Activities of Streptococcus salivarius sbk4 Strains
본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주에 대한 항염 활성을 확인하기 위해, 일산화질소의 소거능을 분석하였다. 일산화질소(nitric oxide, NO)는 생체 내에서 염증을 유발하는 매개인자로써, NO synthase (NOS)에 의해 L-arginine이 L-citrulline 분해되는 과정에서 생성되는 것으로 알려져 있다. 따라서 향장소재의 nitrite oxide의 소거능은 피부염을 완화시키는 기능성 화장품으로서의 중요한 역할을 한다. 또한, 외부의 유해 자극 및 손상에 의해서 피부조직에서 염증반응이 유발될 때 대식세포들로부터 염증을 일으키는 염증성 사이토카인인 TNF-α를 분비하여 각질형성세포 (HaCaT)를 자극하게 되는데 이때 분비되는 nitric oxide 피부조직의 염증을 더욱 악화시키는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 균주가 TNF-α자극에 의해 유도되는 nitric oxide를 매개로한 염증반응에 대한 항염 활성이 있는지를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.In order to confirm the anti-inflammatory activity against the Streptococcus salivarius sbk4 strain of the present invention, the scavenging ability of nitric oxide was analyzed. Nitric oxide (NO) is a mediator of inflammation in vivo, and it is known that NO synthase (NOS) produces L-arginine in the process of L-citrulline degradation. Therefore, scavenging ability of nitrite oxide of cosmetics material plays an important role as functional cosmetics to alleviate dermatitis. In addition, when inflammatory reactions are induced in skin tissues by external harmful stimuli and damage, inflammatory cytokines TNF-α, which cause inflammation from macrophages, are secreted to stimulate keratinocytes (HaCaT). oxide is known to make skin tissue worse. The present inventors confirmed whether the strain of the present invention has anti-inflammatory activity against the inflammatory response mediated by nitric oxide induced by TNF-α stimulation through the following experiment.
이를 위해, HaCaT 세포주를 2 × 105 cells/well 조건으로 6-well plate에서 24시간 동안 배양한 후에 TNF-α (10 ng/mL)를 2시간 동안 전 처리 하였으며 본 발명의 균주 파쇄물을(ssc) 20 μL 및 80 μL씩 각각 24시간 동안 처리한 후, nitrite를 측정하기 위해서 배양 상층액을 500 μL 취하였다. HaCaT 배양 상층액 50 μL에 Griess reagent 50 μL 첨가 하였으며 상온에서 10분간 반응시킨 후에 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 nitrite 양은 NaNO2 (64 μM ~ 0 μM) 용액을 이용하여 흡광도를 측정한 후에 얻어진 표준 검량선 (standard curve)에 대입하여 nitrite 양을 산출하였다.To this end, the HaCaT cell line was incubated for 24 hours in a 6-well plate at 2 × 10 5 cells / well condition, followed by pretreatment with TNF-α (10 ng / mL) for 2 hours, and the strain lysate of the present invention (ssc ) 20 μL and 80 μL each were treated for 24 hours, and then 500 μL of the culture supernatant was taken to measure nitrite. 50 μL of Griess reagent was added to 50 μL of HaCaT culture supernatant, and the reaction was measured at 540 nm using a spectrophotometer after 10 minutes of reaction at room temperature. The total nitrite content was measured by absorbance using NaNO 2 (64 μM to 0 μM) solution, and then the nitrite content was calculated by substituting the standard curve obtained.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, HaCaT 세포주에 TNF-α를 처리하여 증가된 nitrite는 본 발명의 균주 파쇄물(ssc) 처리에 의해 nitrite의 양이 감소되는 것으로 나타났고, 이러한 효과는 양성대조군인 아스코르빅산(ascobic acid; AA) 1mM 처리하였을 때와 거의 유사한 수준으로 나타났다. 이와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 sbk4 균주가 우수한 항염 활성이 있다는 것을 알 수 있었다. As a result, as shown in Figure 3, the nitrite increased by treatment of the HaCaT cell line TNF-α was shown to decrease the amount of nitrite by treatment of the strain ssc (ssc) of the present invention, this effect is a positive control group Ascorbic acid (AA) 1mM treatment was almost the same level. Through these results, the present inventors have found that the sbk4 strain of the present invention has excellent anti-inflammatory activity.
<실시예 4><Example 4>
스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주의 피부장벽 개선 및 강화활성 분석Skin Barrier Enhancement and Enhancing Activity of Streptococcus salivarius sbk4 Strains
피부 장벽능 (skin barrier function)은 가능성 화장품 개발에 있어서 중요한 타겟이 되고 있다. 피부 장벽능이 저하되면 보습, 항염증, microbiota 패턴의 변화등 부정적인 효과가 나타나며, 특히 아토피 염증 등 피부 염증 질환들이 유발되는 원인이 되고 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 균주 파쇄물이 피부 장벽을 개선하는 활성이 있는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. Skin barrier function has become an important target in the development of potential cosmetics. Decreased skin barrier function has negative effects such as moisturizing, anti-inflammatory, and microbiota pattern changes, and is especially the cause of skin inflammatory diseases such as atopic inflammation. The present inventors performed the following experiment to determine whether the strain lysate of the present invention has an activity to improve the skin barrier.
각질형성세포인 HaCaT 세포를 10% heat-inactivated FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco’ modified eagle medium (DMEM) 배지에서 세포를 배양하였다. 6 × 105 cells/well 조건으로 6-well plate에서 세포를 24시간 동안 배양하였으며 FBS-free 배지로 교체 후에 sbk4 균주의 세포 파쇄물 시료 (ssc)를 2일 마다 20 μL, 80 μL를 각각 처리하여 약 5일간 배양하였다. 세포를 PBS로 세척한 뒤 2% Sodium dodecyl Sulfate (SDS)와 20 mM Dithiothreitol (DTT) 를 포함한 용액 1 mL 넣고 3분 동안 교반하고 20분간 95 ℃에서 열을 가한 후에 cornified envelope (CE)를 추출하여, cross-linked envelope 양을 310 nm에서 흡광도 측정을 통해 분석하였다. HaCaT cells, keratinocytes, were cultured in Dulbecco 'modified eagle medium (DMEM) medium containing 10% heat-inactivated FBS and 1% penicillin-streptomycin. Cells were incubated for 24 hours in a 6-well plate at 6 × 10 5 cells / well. After replacement with FBS-free medium, 20 μL and 80 μL of sbk4 strains were treated every 2 days. Incubated for about 5 days. After washing the cells with PBS, add 1 mL of a solution containing 2% Sodium dodecyl Sulfate (SDS) and 20 mM Dithiothreitol (DTT), stir for 3 minutes, heat at 95 ℃ for 20 minutes, and extract the cornified envelope (CE). The amount of cross-linked envelope was analyzed by absorbance measurement at 310 nm.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 균주 파쇄물 시료(ssc)를 처리하지 않은 군에 비해 본 발명의 균주 파쇄물을 처리한 군에서는 cornified envelope (CE)의 형성이 증가되는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 균주가 피부장벽을 구성하는 성분 중 하나인 cornified envelope (CE)의 형성 촉진활성을 가지고 있으므로, 피부 장벽을 개선 및 강화시키는 활성이 있다는 것을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 4, the formation of cornified envelope (CE) was increased in the group treated with the strain lysate of the present invention compared to the group not treated with the strain lysate sample (ssc) of the present invention. Therefore, the present inventors have found that the strain of the present invention has an activity of promoting the formation of cornified envelope (CE), which is one of the components constituting the skin barrier, thereby improving and strengthening the skin barrier.
<실시예 5>Example 5
스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주를 함유한 화장품의 제조Preparation of Cosmetics Containing Streptococcus salivarius sbk4 Strain
<5-1> 토너 제조<5-1> Toner Manufacturing
상기 실시예에서 수득한 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주(기탁번호: KCTC13872BP)의 파쇄물을 함유한 토너를 하기 표에 기재된 종류의 성분을 각 첨가량으로 혼합하여 종래 토너제조와 동일한 방법을 사용하여 기능성 화장품인 토너를 제조하였다. 이때 유상과 수상부분을 각각 계량하여 80℃까지 가온을 한 후 혼합하여 유화를 유도하여 제조 하였으며, 본 발명의 균주 파쇄액의 함량이 높아질수록 색상이 진해지고 약간의 특이한 냄새가 나긴 했지만 pH, 점도 등에 유의한 차이는 보이지 않았고 특히, 제형의 변화가 보이지 않았기 때문에 본 발명의 균주 파쇄액의 함량을 최대 5%로 결정하였다.A toner containing a crushed product of the Streptococcus salivarius sbk4 strain (Accession No .: KCTC13872BP) of the present invention obtained in the above Example was mixed with each of the ingredients of the types shown in the following table by using the same method as in the conventional toner production Toner, which is a functional cosmetic, was prepared. At this time, the oil phase and the water phase were respectively measured and heated to 80 ° C., and then mixed to induce emulsification. The higher the content of the strain crushing solution of the present invention, the darker the color and a slight peculiar smell were observed. There was no significant difference, and the like, and in particular, since the change of the formulation was not seen, the content of the strain crushing solution of the present invention was determined to be up to 5%.
<5-2> 크림 제조<5-2> cream manufacturing
본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주의 파쇄물을 함유한 토너를 하기 표에 기재된 종류의 성분을 각 첨가량으로 혼합하여 종래 크림 제조와 동일한 방법을 사용하여 기능성 화장품인 크림을 제조하였다. The toner containing the crushed product of the Streptococcus salivarius sbk4 strain of the present invention was mixed with each of the ingredients of the kind shown in the following table to prepare a cream which is a functional cosmetic using the same method as the conventional cream preparation.
디스테아레이트Polyglyceryl-3 Methyl Glucose
Distearate
<< 실시예Example 6> 6>
기호도 평가Preference Rating
20명의 20~50대 여성 패널들에게 본 발명의 균주가 함유된 크림과 에센스 제품의 샘플을 제공하고 2주간 사용하게 한 후 선호도를 각 항목에 대해 5점 척도로 조사하였다. Twenty female panelists in their 20s to 50s were provided with samples of creams and essence products containing the strains of the present invention and allowed to use for two weeks, and then preferences were examined on a five-point scale for each item.
평가 결과, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 토너 및 크림 화장품 모두 대체적으로 기호도가 우수한 것으로 나타났다. 특히 평균 점수를 고려했을 때 토너에서는 흡수성이 가장 높은 평가를 받았고, 크림제품에서는 향취와 끈적임이 적은 부분이 가장 높은 평가를 받았다.As a result of the evaluation, as shown in Table 3, both the toner and the cream cosmetics produced using the strain of the present invention were generally excellent in preference. In particular, considering the average score, the toner had the highest absorbency, and the cream product had the highest odor and stickiness.
따라서 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 본 발명의 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 균주를 항산화 활성이 우수하고 피부장벽 개선 또는 강화 활성을 갖는 기능성 화장품의 제조에 용이하게 활용할 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, the present inventors have found that the Streptococcus salivarius sbk4 strain of the present invention isolated and identified in the present invention can be easily used for the preparation of functional cosmetics having excellent antioxidant activity and skin barrier improvement or strengthening activity.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. Those skilled in the art will appreciate that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential features of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in descriptive sense only and not for purposes of limitation. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the scope will be construed as being included in the present invention.
<110> Shebah biotech Inc <120> Streptococcus salivarius sbk4 strain isolated from skin and functional cosmetic composition comprising Streptococcus salivarius sbk4 strain <130> NPDC69825.01 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus salivarius sbk4 16rRNA sequence <400> 1 taatgcagta gaacgctgaa gagaggagct tgctcttctt ggatgagttg cgaacgggtg 60 agtaacgcgt aggtaacctg ccttgtagcg ggggataact attggaaacg atagctaata 120 ccgcataaca atggatgaca catgtcattt atttgaaagg ggcaattgct ccactacaag 180 atggacctgc gttgtattag ctagtaggtg aggtaacggc tcacctaggc gacgatacat 240 agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300 gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg gggcaaccct gaccgagcaa cgccgcgtga 360 gtgaagaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgtaagtc aagaacgagt gtgagagtgg 420 aaagttcaca ctgtgacggt agcttaccag aaagggacgg ctaactacgt gccagcagcc 480 gcggtaatac gtaggtcccg agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc 540 ggtttgataa gtctgaagtt aaaggctgtg gctcaaccat agttcgcttt ggaaactgtc 600 aaacttgagt gcagaagggg agagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 660 atggaggaac accggtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa 720 agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780 aggtgttgga tcctttccgg gattcagtgc cgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg 840 ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900 gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcccgatgct 960 atttctagag atagaaagtt acttcggtac atcggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020 agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct attgttagtt 1080 gccatcattc agttgggcac tctagcgaga ctgccggtaa taaaccggag gaaggtgggg 1140 atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggttggt 1200 acaacgagtt gcgagtcggt gacggcaagc taatctctta aagccaatct cagttcggat 1260 tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc 1320 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac 1380 acccgaagtc ggtgaggtaa cctttggagc ca 1412 <110> Shebah biotech Inc <120> Streptococcus salivarius sbk4 strain isolated from skin and functional cosmetic composition comprising Streptococcus salivarius sbk4 strain <130> NPDC69825.01 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus salivarius sbk4 16rRNA sequence <400> 1 taatgcagta gaacgctgaa gagaggagct tgctcttctt ggatgagttg cgaacgggtg 60 agtaacgcgt aggtaacctg ccttgtagcg ggggataact attggaaacg atagctaata 120 ccgcataaca atggatgaca catgtcattt atttgaaagg ggcaattgct ccactacaag 180 atggacctgc gttgtattag ctagtaggtg aggtaacggc tcacctaggc gacgatacat 240 agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300 gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg gggcaaccct gaccgagcaa cgccgcgtga 360 gtgaagaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgtaagtc aagaacgagt gtgagagtgg 420 aaagttcaca ctgtgacggt agcttaccag aaagggacgg ctaactacgt gccagcagcc 480 gcggtaatac gtaggtcccg agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc 540 ggtttgataa gtctgaagtt aaaggctgtg gctcaaccat agttcgcttt ggaaactgtc 600 aaacttgagt gcagaagggg agagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 660 atggaggaac accggtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa 720 agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780 aggtgttgga tcctttccgg gattcagtgc cgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg 840 ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900 gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcccgatgct 960 atttctagag atagaaagtt acttcggtac atcggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020 agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct attgttagtt 1080 gccatcattc agttgggcac tctagcgaga ctgccggtaa taaaccggag gaaggtgggg 1140 atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggttggt 1200 acaacgagtt gcgagtcggt gacggcaagc taatctctta aagccaatct cagttcggat 1260 tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc 1320 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac 1380 acccgaagtc ggtgaggtaa cctttggagc ca 1412
Claims (7)
상기 균주는 항산화 활성, 항염활성 및 피부장벽 개선 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.The method of claim 1,
The strain is characterized in that it has antioxidant activity, anti-inflammatory activity and skin barrier improvement activity.
상기 화장료 조성물은 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능 또는 일산화질소 소거능을 갖는 것을 특징으로 하는, 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물.The method of claim 3,
The cosmetic composition has a superoxide radical scavenging ability, ABTS radical scavenging ability or nitrogen monoxide scavenging ability, characterized in that the cosmetic composition having an antioxidant activity.
상기 화장료 조성물은 각질세포막(cornified envelope)의 형성을 촉진 또는 증진시키는 것을 특징으로 하는, 피부장벽의 개선 또는 강화용 화장료 조성물.The method of claim 5,
The cosmetic composition is characterized in that to promote or promote the formation of a corneal envelope (cornified envelope), the cosmetic composition for improving or strengthening the skin barrier.
상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 되는 것을 특징으로 하는 피부장벽의 개선 또는 강화용 화장료 조성물.The method of claim 5,
The composition includes skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nutrition lotion, massage cream, nutrition cream, moisture cream, hand cream, essence, nutrition essence, pack, soap, shampoo, cleansing foam , For cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, latex, lipstick, makeup base, foundation, press powder and loose powder for improving or strengthening the skin barrier, characterized in that the formulation Cosmetic composition.
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