KR102284766B1 - 고농도의 dna 추출이 가능한 측방 분리 추출 기반의 dna 추출 키트 - Google Patents

고농도의 dna 추출이 가능한 측방 분리 추출 기반의 dna 추출 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DNA 추출 키트에 관한 것으로, DNA 결합친화도에 따라 DNA가 측방으로 이동되어 추출되어, 짧은 시간 내에 효율적으로 DNA 추출이 가능하고, 샘플 내 불순물 제거 효과가 우수하여 고농도의 DNA 추출이 가능한 DNA 추출 키트를 제공하는 것이다.

Description

고농도의 DNA 추출이 가능한 측방 분리 추출 기반의 DNA 추출 키트{DNA extraction kit based on lateral separation extraction capable of high-concentration DNA extraction}
본 발명은 DNA 추출 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는 DNA 결합친화도에 따라 DNA를 추출하고자 하는 샘플로부터 DNA를 측방으로 분리시켜 추출해내는 것으로, 짧은 시간 내에 효율적으로 DNA 추출이 가능하고, 샘플 내 불순물 제거 효과가 우수하여 고농도의 DNA 추출이 가능한 DNA 추출 키트에 관한 것이다.
유전체학(genomics), 전사체학(transcrptomics), 단백질체학(proteomics), 조절체학(regulomics)의 급속한 발달로 인하여, 분자적, 세포적 메커니즘을 대규모로 분석할 수 있게 되었다. 이들 연구의 중요한 결과 중의 하나는 기능 유전체학(functional genomics)의 발전이었으며, 다른 개인으로부터 얻어진 세포는 게놈 구조, 유전자 및 단백질 발현 프로파일(expression profiles) 및 특정 세포 기능을 제어하는 조절 메커니즘에서 큰 차이를 갖는다는 것에 대한 이해가 발전하였다는 점이다. 이로 인하여, 1개 이상의 바이오 마커(biomarkers)의 존재, 부재 및/또는 농도를 통하여, 포유류의 현재 상태를 평가할 수 있는 바이오 마커를 검출 및/또는 바이어 마커를 정량화하는 것에 대한 관심이 초래되었다.
유전공학이 발전함에 따라 클로닝(Cloning), 제한효소 분석(Restriction enzyme analysis), PCR, 염기서열 분석(Sequencing) 및 기타 DNA를 이용한 실험이 급증하게 되었고, 이와 같은 실험에서는 DNA의 오염 여부가 실험에 중요한 변수로 작용하고 있다.
DNA가 오염되면 서던 블럿(Southern blot) 같은 혼성화(hybridization) 반응, 효소 반응 등과 같은 화학반응을 억제하거나 방해시키며, 또한 DNA의 오염 물질은 실험하고자 하는 DNA를 분해하고 DNA의 양을 측정할 때 오류를 범하게 된다. 이런 오염 물질로는 지방과 같은 저분자 물질, 저분자 효소 저해제 뿐만 아니라 단백질과 같은 효소, 다당체(polysaccharides) 및 폴리뉴클레오타이드 등이 있다.
분자생물학 방법의 응용에 적합한 오염 없는 DNA를 얻기 위해서 상기 문제를 해결하기 위한 많은 방법이 개발되었다. DNA를 얻기 위한 전통적인 방법은 효소적 혹은 화학적 방법으로 세포를 용해하여 DNA를 녹여 오염물질인 단백질, RNA 및 기타 물질들을 제거하는 것이다. 하지만, 상기 방법들은 많은 단계들을 포함하며, 그 성공 여부는 작업자의 노련성에 따라 크게 좌우된다.
따라서 이러한 방법을 반복적으로 응용하는 것은 경험이 없는 작업자의 수작업의 결과에 변화를 유발시킬 수 있다.
기존의 방법은 페놀/클로로포름 혹은 페놀/클로로포름/아이소아밀 알콜(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)을 사용하여 DNA를 추출하는 과정과 DNA를 회수하기 위한 에탄올(혹은 아이소프로판올) 침전을 포함하여 오염원을 DNA와 분리하는 과정을 거친다. 에탄올(혹은 아이소프로판올) 침전은 페놀/클로로포름에 의해 추출된 DNA의 액상 용액으로부터 DNA를 추출하고 DNA로부터 잔여 페놀과 클로로포름을 제거한다. 또한, 에탄올 침전 과정을 통해 뉴클레오사이드 트리포스페이트(nucleoside triphosphate) 일부와 짧은(30 베이스 이하) 올리고 뉴클레오타이드들도 제거할 수 있다.
하지만, 상기 페놀/클로로포름 추출 과정은 DNA를 추출하는데 많은 단계와 시간을 필요로 하고 인체에 유해한 페놀과 클로로포름을 사용하고 있어 매우 위험하다. 페놀은 피부에 닿으면 타버릴 정도로 매우 위험하고 클로로포름도 휘발성, 독성, 인화성이 매우 높다. 이런 위험한 페놀과 클로로포름을 사용하려면 후드(hood)안에서 실험을 해야하는 단점도 있다. 또한 페놀/클로로포름 추출과정을 거치면 페놀의 산화에 의해 DNA가 크게 훼손을 당하므로 새롭게 증 류한(redistilled) 페놀만 사용해야 한다.
이에, 페놀/클로로포름 추출 과정과 에탄올 침전 과정을 통한 전통적인 DNA 분리 과정보다 더 효과적이고 간단하며 DNA 분리 시간을 최소화하는 방법들이 고안되어 왔다. 이러한 방법들의 예로는 기존의 페놀/클로로포름과 염석하는 방법 외에 카오트로픽 염 및 실리카 수지를 사용하는 방법, 친화성 수지를 사용하는 방법, 이온 교환 수지 크로마토그래피법 및 자기성 비드를 사용하는 방법 등이 있다.
기존의 DNA 추출 방법들은 여러 가지 용액을 사용하여 세포를 용해하는 단 계, 용해 후 단백질을 분리하는 단계 및 DNA를 추출하는 단계 등으로 나뉘어져 있고, RNA를 제거하는 단계와 단백질 분리 단계에서는 각각의 반응 효소를 처리하여 일정 시간 효소 활성을 보이도록 반응시키는 단계들이 포함되어 있어서 시간이 많이 소요되며, 여러 단계를 거쳐야 하므로 불순물의 오염 가능성이 증가하고 반복적인 실험을 수행할 시에 재현성 있는 결과를 얻는데 어려움이 있었다.
최근에는 페놀/클로로포름 추출과 에탄올 침전 방법의 불편함을 극복하고 편리함을 도모하고자 컬럼을 이용한 키트가 게놈 DNA 추출의 기본이 되고 있는 추세이다. 이와 같은 컬럼을 통해 게놈 DNA를 추출하는 원리는 DNA와 특이하게 결합하는 유리 섬유(glass fiber)나 실리카 막(silica membrane)을 사용하는 것으로써 물 분자와 DNA와의 구조적 상호작용(structural interaction)의 원리를 이용하는 것이다. 이처럼 유리 섬유 혹은 실리카 막은 염, 단백질 및 기타 세포 내 물질과는 결합하지 않기 때문에 궁극적으로 DNA만을 순수하게 분리할 수 있다.
최근에는 유전공학이 발전함에 따라 대량의 시료를 처리해야 하는 실험이 많아지게 되었고 또한 반복적인 실험을 수행하였을 때 재현성 있는 결과를 얻을 수 있어야만 그 결과에 대하여 신뢰할 수 있으며 아울러 혈액 및 그 밖의 체액 등으로부터 게놈 DNA를 추출함에 있어서 더욱 간단하고 DNA를 추출하는데 필요한 시간을 줄일 수 있는 방법이 필요하게 되었다.
이에, 본 발명자들은 DNA를 추출하기 위한 신규한 디바이스를 제조하였고, 상기 디바이스를 이용하여 다양한 검체로부터 짧은 단계와 시간으로 재현성이 높게 DNA를 추출할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2018-0016031 A KR 10-1999-0010665 B1
본 발명의 목적은 DNA 결합친화도에 따라 DNA를 추출하고자 하는 샘플로부터 DNA를 측방으로 분리시켜 추출해내는 것으로, 짧은 시간 내에 효율적으로 DNA 추출이 가능한 DNA 추출 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 DNA를 추출하고자 하는 샘플 내 불순물 제거 효과가 우수하여 고농도의 DNA 추출이 가능한 DNA 추출 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 키트는 DNA를 추출하고자 하는 샘플이 주입되는 샘플 주입부; 상기 주입된 샘플이 DNA 분리부로 이동하기 위한 이동부; 상기 주입된 샘플로부터 세포 내 DNA를 분리시키기 위한 DNA 분리부; 상기 분리된 DNA로부터 불순물을 제거하기 위한 DNA 세척부; 상기 DNA를 농축하기 위한 DNA 농축부; 및 상기 농축된 DNA를 추출하기 위한 DNA 추출부; 를 포함한다.
상기 DNA를 추출하고자 하는 샘플은 샘플 주입부; 이동부; DNA 분리부; DNA 세척부; DNA 농축부; 및 DNA 추출부; 순으로 이동되어, DNA가 추출되는 것이다.
상기 이동부; DNA 분리부; 및 DNA 세척부; 는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리 섬유, 카툰(cotton), 나일론과 같은 다공성 겔로 이루어진 다공성 멤브레인을 포함한다.
상기 DNA 분리부는 알칼리 용액을 주입하기 위한 제 1 용액 주입부;를 포함하며, 상기 제 1 용액 주입부를 통해 주입된 알칼리 용액은 세포 내 DNA를 분리시키는 것이다.
상기 알칼리 용액은 pH 8 내지 pH12의 용액인 것이다.
상기 DNA 세척부는 DNA 세척 용액을 주입하기 위한 제 2 용액 주입부;를 포함하며, 상기 제 2 용액 주입부를 통해 주입된 DNA 세척 용액은 세포로부터 분리된 DNA의 오염원을 제거하는 것이다.
상기 DNA 세척 용액은 아이소아밀 알코올(isoamyl alcohol), 아이소프로판올(isopropanol), 에탄올(ethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 DNA 농축부는 DNA와의 결합친화도가 높은 섬유를 포함하며, 상기 섬유는 붕규산염 유리섬유(Borosilicate glass fiber), 알루미노실리케이트 유리섬유(alumino-silicate glass fiber) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 DNA 추출 키트를 이용한 DNA 추출 방법은 1) 상기 샘플 주입부에 DNA를 추출하고자 하는 샘플을 주입하는 단계; 2) 상기 샘플 주입 후, 제 1 용액 주입부를 통해 알칼리 용액을 주입하는 단계; 3) 상기 알칼리 용액 주입으로 인해 분리된 DNA를 세척하기 위해 제 2 용액 주입부에 DNA 세척 용액을 주입하는 단계; 4) 상기 DNA 세척 용액 주입으로 인해 불순물이 제거된 DNA는 DNA 농축부에 의해 DNA가 농축되는 단계; 5) 상기 농축된 DNA는 DNA 추출부를 통해 피펫으로 DNA가 추출되는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
다음에 소개되는 실시 예들은 통상의 실시자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 설명되는 실시 예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고, 도면들에 있어서, 발명의 크기 및 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조 번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다.
그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다. 도면에서 층 및 영역들의 크기 및 상대적인 크기는 설명의 명료성을 위해 과장될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시 예들을 설명하기 위한 것이며, 따라서 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 키트를 도시한 도면을 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 키트는 DNA를 추출하고자 하는 샘플이 주입되는 샘플 주입부(201); 상기 주입된 샘플이 DNA 분리부(102)로 이동하기 위한 이동부(101); 상기 주입된 샘플로부터 세포 내 DNA를 분리시키기 위한 DNA 분리부(102); 상기 분리된 DNA로부터 불순물을 제거하기 위한 DNA 세척부(103); 상기 DNA를 농축하기 위한 DNA 농축부(104); 및 상기 농축된 DNA를 추출하기 위한 DNA 추출부(204); 를 포함한다.
본 발명에서 샘플 주입부(201)는 DNA 추출 키트의 상단 부(200)에 주입 통로를 형성하는 것으로, DNA를 추출하고자 하는 샘플이 주입되도록 주입부의 폭은 다양하게 구성될 수 있으며, 필요에 따라 그 형상이 변형될 수 있다.
상기 DNA를 추출하고자 하는 샘플은 세포배양액, 타액, 혈액, 혈청, 인공 담액, 우유 등을 포함하며, 생리적 유체와 같은 어떠한 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있다.
상기 DNA 추출 키트의 상단부(200)는 하단부(100)의 상단을 커버하도록 구성될 수 있다.
또한, 상기 DNA 추출 키트는 상기 하단부(100) 상단에 탈착 가능하게 상단부(200)가 설치됨으로써 DNA 추출 후 본 발명의 이동부(101), DNA 분리부(102), DNA 세척부(103) 및 DNA 농축부(104)의 교체가 용이하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 이동부(101)는 DNA 추출 키트의 하단부(100)에 수용되는 것으로, 상기 샘플 주입부(201)를 통해 주입된 샘플로부터 세포가 DNA 분리부(102)로 이동하기 위해 구성되는 것이다. 그 크기와 형태는 제한하지 않고, 상기 구성요소 개수가 한 개 또는 복수 개인 것으로 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 사용할 수 있는 범위를 포함하는 것으로 정의한다.
즉, 상기 이동부(101)은 본 발명의 DNA 분리부(102), DNA 세척부(103) 및 DNA 농축부(104)를 연결하여, 세포 가 이동하면서 DNA를 추출할 수 있도록 하는 것이다.
상기 DNA 분리부(102)는 DNA 추출 키트의 하단부(100)에 수용되며, 상기 이동부(101) 상단에 인접하게 커버되도록 마련되는 것으로, 상기 주입된 샘플로부터 세포 내 DNA를 분리시키기 위해 구성되는 것이다. 그 크기와 형태는 제한하지 않고, 상기 구성요소 개수가 한 개 또는 복수 개인 것으로 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 사용할 수 있는 범위를 포함하는 것으로 정의한다.
상기 DNA 세척부(103)는 DNA 추출 키트의 하단부(100)에 수용되며, 상기 이동부(101) 상단에 인접하게 커버되도록 마련되는 것으로, 상기 DNA 분리부(102) 우측에 위치되어 상기 DNA 분리부(102)에 의해 분리된 DNA의 불순물을 제거하기 위해 구성되는 것이다.
상기 DNA 농축부(104)는 DNA 추출 키트의 하단부(100)에 수용되며, 상기 이동부(101) 상단에 인접하게 커버되도록 마련되는 것으로, 상기 DNA 세척부(103) 우측에 위치되어 상기 DNA 세척부(103)에 의해 세척된 DNA를 농축하기 위해 구성되는 것이다.
상기 DNA 추출부(204)는 DNA 추출 키트의 상단 부(200)에 추출 통로를 형성하는 것으로, 상기 DNA 농축부(104)를 통해 농축된 DNA를 추출되도록 추출 부의 폭은 다양하게 구성될 수 있으며, 필요에 따라 그 형상이 변형될 수 있다.
상기 DNA를 추출하고자 하는 샘플은 샘플 주입부(201); 이동부(101); DNA 분리부(102); DNA 세척부(103); DNA 농축부(104); 및 DNA 추출부(204); 순으로 이동되어, DNA가 추출되는 것이다.
상기 DNA 분리부(102), DNA 세척부(103) 및 DNA 농축부(104)는 일렬로 일정한 간격을 두어 설치되는 것으로, 상기 이동부(101) 상단에 인접하게 커버되도록 마련되고, 상기 DNA 분리부(102) 우측에 DNA 세척부(103)가 위치되며, 상기 DNA 세척부(103) 우측에 DNA 농축부(104)가 위치되는 것으로, 상기 DNA를 추출하고자 하는 샘플은 샘플 주입부(201), 이동부(101), DNA 분리부(102), DNA 세척부(103), DNA 농축부(104) 및 DNA 추출부(204) 순으로 순차적으로 이동되어 DNA가 추출되는 것이다.
상기 이동부(101); DNA 분리부(102); 및 DNA 세척부(103); 는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리 섬유, 카툰(cotton), 나일론과 같은 다공성 겔로 이루어진 다공성 멤브레인을 포함한다.
본 발명의 이동부(101), DNA 분리부(102) 및 DNA 세척부(103)은 다공성 멤브레인으로 이루어져 있기 때문에, 이동부(101), DNA 분리부(102) 및 DNA 세척부(103) 각각은 액체 흡수성을 갖는다.
바람직하게 본 발명의 이동부(101)는 비대칭 PES 멤브레인의 종류 중 하나인 vivid plasma separation-GF (Pall)인 것이며, DNA 분리부(102)는 conjugate pad (Pall), DNA 세척부(103)는 glass pad GF/F grade (Whatman)인 것이다.
본 발명의 DNA 추출 키트는 상기 이동부(101), DNA 분리부(102) 및 DNA 세척부(103)간의 액체 흡수성 차이로 인해, 샘플 주입부 기준 우측으로 전개되는 것으로, DNA가 추출되는 것이다.
보다 구체적으로, 이동부(101)의 액체 흡수력이 가장 낮으며, DNA 분리부(102), DNA 세척부(103)으로 갈수록 액체 흡수력이 커진다.
따라서 본 발명의 DNA 추출 키트에 주입된 DNA를 추출하고자 하는 샘플은 자연스럽게 DNA 추출부를 향하여 전개될 수 있다.
상기 DNA 분리부(102)는 알칼리 용액을 주입하기 위한 제 1 용액 주입부(202); 를 포함하며, 상기 제 1 용액 주입부(202)를 통해 주입된 알칼리 용액은 세포 내 DNA를 세포와 분리시키는 것이다.
상기 제 1 용액 주입부(202)은 DNA 분리부(102)와 대응되는 위치에 형성되며, 사용자는 상기 제 1 용액 주입부(202)를 통하여, DNA 분리부(102)에 알칼리 용액을 주입하는 것으로, 알칼리 용액이 주입되도록 주입부의 폭은 다양하게 구성될 수 있으며, 필요에 따라 그 형상이 변형될 수 있다.
상기 알칼리 용액을 주입하여 사용하는 경우, 종래 인체에 유해한 페놀과 작물 토양에 해로운 염화 나트륨의 환경오염물질을 사용하지 않고, DNA 추출하고자 하는 샘플 내의 타겟 세포를 파괴하여 타겟 세포로부터 DNA를 분리시키는 것이다.
상기 알칼리 용액은 pH 8 내지 pH12의 용액인 것이다.
상기 pH 8 미만의 알칼리 용액을 사용하는 경우보다 pH 8 이상의 알칼리 용액을 사용하는 경우에 DNA 추출 효율이 높았으며, pH 12 초과의 알칼리 용액을 사용하는 경우보다 pH 12 이하의 알칼리 용액을 사용하는 경우에 고순도의 DNA를 얻을 수 있다.
상기 DNA 세척부(103)는 DNA 세척 용액을 주입하기 위한 제 2 용액 주입부(203); 를 포함하며, 상기 제 2 용액 주입부(203)를 통해 주입된 DNA 세척 용액은 세포로부터 분리된 DNA의 오염원을 제거하는 것이다.
상기 제 2 용액 주입부(203)은 DNA 세척부(103)와 대응되는 위치에 형성되며, 사용자는 상기 제 2 용액 주입부(203)를 통하여, DNA 세척부(103)에 DNA 세척 용액을 주입하는 것으로, DNA 세척 용액이 주입되도록 주입부의 폭은 다양하게 구성될 수 있으며, 필요에 따라 그 형상이 변형될 수 있다.
DNA를 추출하고자 하는 경우 DNA의 오염 여부가 실험에 중요한 변수로 작용하고 있다. DNA가 오염되면 서던 블럿(Southern blot) 같은 혼성화(hybridization) 반응, 효소 반응 등과 같은 화학반응을 억제하거나 방해시 키며, 또한 DNA의 오염 물질은 실험하고자 하는 DNA를 분해하고 DNA의 양을 측정할 때 오류를 범하게 된다. 이런 오염 물질로는 지방과 같은 저분자 물질, 저분자 효소 저해제 뿐만 아니라 단백질과 같은 효소, 다당체(polysaccharides) 및 폴리뉴클레오타이드 등이 있다.
본 발명은 오염 없는 DNA를 얻기 위해 DNA 세척 용액을 주입하여 DNA 추출 시 오염 물질인 단백질, RNA 및 기타 물질들을 제거하는 것이다.
상기 DNA 세척 용액은 아이소아밀 알코올(isoamyl alcohol), 아이소프로판올(isopropanol), 에탄올(ethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 아이소아밀 알코올(isoamyl alcohol), 아이소프로판올(isopropanol), 에탄올(ethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 세척 용액을 통해 뉴클레오사이드 트리포스페이트(nucleoside triphosphate) 일부와 짧은 올리고 뉴클레오타이드들도 제거할 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA 세척 용액은 종래 DNA 추출을 위해 거치는 여러 단계들로 인해 불순물의 오염 가능성이 증가하고 반복적인 실험을 수행할 시에 재현성 있는 결과를 얻는데 어려운 문제점을 개선하기 위한 것으로, 본 발명의 DNA 세척 용액을 이용한 DNA 추출 방법은 하나의 용액을 통해 세포 용해와 단백질 분리, RNA 제거 및 DNA 추출을 동시에 가능하게 함으로써 DNA 추출하는 단계를 줄이고 동시에 DNA를 추출하는데 소요되는 시간을 줄일 수 있다.
특히, 여러 단계로 나뉘었던 기존 방식을 하나의 단계에서 모두 가능케 함으로써 작업자가 범할 수 있는 실수와 오차를 줄여 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다.
바람직하게 상기 DNA 세척 용액은 큰등갈퀴(Vicia pseudoorobus Fisch. & C.A.Mey.) 추출물, 선등갈퀴 (Vicia heptajuga Nakai) 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 추출물을 더 포함하는 것이다.
상기 큰등갈퀴(Vicia pseudoorobus Fisch. & C.A.Mey.)는 다년생 덩굴식물로, 길이 80~150cm의 줄기가 털이 다소 있거나 없다. 잎은 2~5쌍의 소엽으로 구성된 우상복엽이며, 끝에 있는 덩굴손은 갈라지거나 갈라지지 않는다. 소엽은 난형이고 예두 또는 둔두이며, 길이 3~5cm, 넓이 15~30mm로써 마르면 황갈색이 돌고 뒷면의 엽맥이 튀어나오며 탁엽은 녹색이고 뽀족하게 갈라진다. 꽃은 엽액에서 나오며, 길이 4~8cm로서, 화경이 길고 중앙 이상에서 한쪽으로 치우쳐서 많은 꽃이 총상으로 달린다. 꽃은 9월에 피며 길이 13-15mm로서 자주색이고 꽃받침잎은 낮은 삼각형이다. 잎은 은 2-5쌍의 소엽으로 구성된 우상복엽이며 끝에 있는 덩굴손은 갈라지거나 갈라지지 않는다. 소엽은 난형이고 예두 또는 둔두이며 길이 3-5cm, 나비 15-30mm로서 마르면 황갈색이 돌고 뒷면의 엽맥이 튀어나오며 탁엽은 녹색이고 뾰족하게 갈라진다.
상기 선등갈퀴 (Vicia heptajuga Nakai)는 산지에서 자라는 여러해살이풀로 잎은 어긋나기하고 4~6쌍의 소엽으로 구성된 짝수깃모양겹잎이며 끝에 덩굴손의 흔적이 있으며 밑은 둔하고 끝은 길게 뽀족하며 가장자리는 밋밋하다. 꽃은 6~7월에 홍자색으로 피며 잎겨드랑이에서 2~4cm의 화경이 나와 총상꽃차례로 한쪽으로 치우쳐 달린다.
상기 천연 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용하여 추출될 수 있다.
구체적으로, 천연 추출물을 제조하기 위해서는 천연물을 세척하는 단계; 세척 후 건조시키는 단계; 건조 후 천연물을 분쇄하는 단계; 유기 용매를 사용하여 상기 분쇄물을 침출시키는 단계; 시료를 침출 후 건조시키는 단계; 물을 이용하여 침출시키는 단계; 및 침출하는 단계를 포함하여, 천연 추출물을 획득할 수 있다.
상기 유기 용매를 사용하여 추출한 천연 추출물은 유기 용매를 사용하여 분획을 실시하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 침출법 및 환류 추출법 등 당업계의 통상적인 추출 방법일 수 있다. 구체적으로 세척 및 건조로 이물질이 제거된 천연물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 상기 용매들을 순차적으로 시료에 적용하여 추출한 추출물일 수 있다.
상기 환류 추출법은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 100 mL기준으로, 천연물의 분쇄물 10 내지 30g, 환류 시간 1 내지 3시간 및 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 물에 의한다. 보다 구체적으로, 탄소수 1 내지 6의 알코올 100 mL 또는 물 100mL 기준으로, 천연물의 분쇄물 10 내지 20g, 환류 시간 1 내지 2시간 및 70 내지 90%의 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 물에 의한 것이다.
상기 침출법은 15 내지 30℃, 24 내지 72시간 동안 진행하며, 추출 용매로 물 또는 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올을 이용한다. 보다 구체적으로는 20 내지 25℃, 30 내지 54시간 동안 진행하며, 추출 용매는 물 또는 70 내지 80%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다.
상기 초음파 추출법은 30 내지 50℃, 0.5 내지 2.5시간 동안 반응을 진행하며, 추출용매는 물 또는 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다. 구체적으로는 40 내지 50℃, 1 내지 2.5시간 동안 추출하며, 추출용매로 물 또는 70 내지 80%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다.
상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72시간 동안 방치될 수 있으며, 보다 구체적으로 24 내지 48시간 동안 방치될 수 있다.
추출 후, 추출물은 새로운 분획 용매를 순차적으로 적용하여 분획할 수 있다. 분획시 사용하는 분획 용매는 상기 용매는 물, 헥산, 부탄올, 에틸아세트산, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드이다.
추출물 또는 분획물을 얻은 후에는 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.
보다 바람직하게 본 발명의 DNA 세척 용액은 이소프로필 알코올 100 중량부에 대하여, 큰등갈퀴 추출물 20 내지 40 중량부 및 선등갈퀴 추출물 20 내지 40 중량부를 포함하는 것이다.
상기 범위내에 천연 추출물을 포함하는 경우, 아이소아밀 알코올(isoamyl alcohol), 아이소프로판올(isopropanol), 에탄올(ethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 세척 용액만을 사용하는 경우에 비해, DNA를 크게 훼손하지 않으면서 DNA를 제외한 불순물 및 오염원을 제거하는 효과가 우수하며, 휘발성, 독성 및 인화성이 없어 안전하게 사용이 가능하다.
상기 DNA 농축부(104)는 DNA와의 결합친화도가 높은 섬유를 포함하며, 상기 섬유는 붕규산염 유리섬유(Borosilicate glass fiber), 알루미노실리케이트 유리섬유(alumino-silicate glass fiber) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
바람직하게 본 발명의 DNA 농축부(104)는 붕규산염 유리미세섬유(Borosilicate glass microfiber)를 포함하는 것이다.
상기 붕규산염 유리미세섬유(Borosilicate glass microfiber)는 화학적으로 불활성 물질이며, 약산 약알칼리성에 저항성이고, 1.0㎛ 입자(particle)에서 수분의 흡수력이 탁월한 것으로, DNA와 특이하게 결합하는 유리 섬유(glass fiber)나 실리카 막(silica membrane)을 사용하는 것으로써 물분자와 DNA와의 구조적 상호작용(structural interaction)의 원리를 이용하는 것이다.
이처럼 붕규산염 유리미세섬유(Borosilicate glass microfiber)는 염, 단백질 및 기타 세포 내 물질과는 결합하지 않기 때문에 궁극적으로 DNA만을 순수하게 분리할 수 있다.
또한, 장기간 저장에도 미생물에 의한 오염문제가 없는 장점을 갖고 있으며 불순물을 제거하는 매우 우수한 능력을 갖는 규산염의 붕소화합물인 붕규산염(Borosilicate)을 포함하는 유리섬유로 강력한 DNA 흡착력을 발휘할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 DNA 추출 키트를 이용한 DNA 추출 방법은 1) 상기 샘플 주입부(201)에 DNA를 추출하고자 하는 샘플을 주입하는 단계; 2) 상기 샘플 주입 후, 제 1 용액 주입부(202)를 통해 알칼리 용액을 주입하는 단계; 3) 상기 알칼리 용액 주입으로 인해 분리된 DNA를 세척하기 위해 제 2 용액 주입부(203)에 DNA 세척 용액을 주입하는 단계; 4) 상기 DNA 세척 용액 주입으로 인해 불순물이 제거된 DNA는 DNA 농축부(104)에 의해 DNA가 농축되는 단계; 5) 상기 농축된 DNA는 DNA 추출부(204)를 통해 피펫으로 DNA가 추출되는 것이다.
본 발명의 DNA 추출 키트에 의하면 DNA 결합친화도에 따라 DNA가 측방으로 이동되어 추출되는 것으로, 짧은 시간 내에 효율적으로 DNA 추출이 가능하고, 샘플 내 불순물 제거 효과가 우수하여 고농도의 DNA 추출이 가능한 DNA 추출 키트를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 키트를 도시한 도면을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 세척 용액을 이용한 DNA 추출 후 DNA 양을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 알칼리 용액을 이용한 DNA 추출 후 DNA 양을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 친화도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예1: DNA 추출 키트의 제조]
본 발명의 DNA 추출 키트를 제조하기 위해, 이동부(101)는 비대칭 PES 멤브레인의 종류 중 하나인 vivid plasma separation-GF (Pall)를 사용하였으며, DNA 분리부(102)는 conjugate pad (Pall), DNA 세척부(103)는 glass pad GF/F grade (Whatman)가 사용되었고, DNA 농축부(104)는 붕규산염 유리미세섬유(Borosilicate glass microfiber)가 사용되었다.
상기 이동부(101)는 DNA 추출 키트의 하단부(100)에 부착시키고, 이동부(101) 상단에 인접하게 커버되도록 일정한 간격을 두어 DNA 분리부(102), DNA 세척부(103) 및 DNA 농축부(104)를 부착시켰다.
마지막으로. DNA 추출 키트의 상단부(200)를 덮어 본 발명의 DNA 추출 키트를 제조하였다.
[제조예2: DNA 세척 용액의 제조]
1. 천연 추출물의 제조
먼저, 큰등갈퀴를 세척하고 건조한 뒤 이를 분쇄하였다. 상기 분쇄물을 에탄올에 혼합하고 이를 2시간 동안 98 내지 100℃를 유지하고, 이를 냉각시킨 뒤 와트만 여과지로 여과하여 그 여액을 수득하여 큰등갈퀴 추출물(BE)로 제조하였다.
상기 제조된 큰등갈퀴 추출물(BE)의 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 선등갈퀴 추출물(VE)을 제조하였다.
2. DNA 세척 용액의 제조
상기 제조된 큰등갈퀴 추출물(BE) 및 선등갈퀴 추출물(VE)을 하기 표 1과 같은 함량 범위로 15%(v/v) 이소프로필 알코올과 혼합하여 DNA 세척 용액(DNA CC1 내지 DNA CC6)을 제조하였다.
DNA CC1 DNA CC2 DNA CC3 DNA CC4 DNA CC5 DNA CC6
이소프로필 알코올 100 100 100 100 100 100
BE - 10 20 30 40 50
VE - 10 20 30 40 50
(단위: 중량부)
[실험예1: DNA 세척 용액에 따른 DNA 추출 효율]
상기 제조예 2에서 제조된 DNA 세척 용액 (DNA CC1 내지 DNA CC6)에 따른 DNA 추출 효과를 확인하여 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
1. DNA 세척 용액의 독성 평가
DNA 세척 용액 (DNA CC1 내지 DNA CC6)의 독성을 실험하기 위하여 랫트 반복투여 독성실험에서 DNA 세척 용액 (DNA CC1 내지 DNA CC6) 투여 시 독성 및 부작용 발현의 차이를 확인하였다.
SD 개통의 6주령의 암수 랫트를 군당 10 마리(암수 각 5마리)씩으로 나누어 DNA 세척 용액 DNA CC1 내지 DNA CC6을 투여하였으며, 각각의 약물을 0.5% MC 용액에 용해한 후 매일 동일한 오전 시간대에 1회 경구 투여하는 것을 13주 동안 반복하였다.
1회 투여량은 3.75 mg/kg 내지 5mg/kg의 양으로 투여하였다. 이후 사망률, 일반증상, 체중변화, 사료 및 물 섭취량을 관찰하였다.
그 결과, 실험 기간 내에 사망개체는 발생하지 않았다. 상기 실험 결과에 비추어, DNA 세척 용액 DNA CC1 내지 DNA CC6은 독성에 문제되지 않음을 확인하였다.
2. DNA 추출
상기 제조예 1 내지 2에서 제조된 DNA 추출 키트 및 DNA 세척 용액 (DNA CC1 내지 DNA CC6)을 사용하여 그람 양성(gram-positive) 박테리아인 S.aureus의 DNA를 추출하였다.
DNA를 추출하고자 하는 샘플로 그람 양성(gram-positive) 박테리아인 S.aureus을 본 발명의 샘플 주입부(201)를 통하여 샘플 주입부(201)와 대응되는 이동부(101)에 주입하였다.
상기 S.aureus 세포 주입 후, 곧바로 본 발명의 제 1 용액 주입부(202)를 통하여 제 1 용액 주입부(202)와 대응되는 DNA 분리부(102)에 알칼리 용액으로 200mM NaOH를 주입하였다.
상기 200mM NaOH 주입 후, 제 2 용액 주입부(203)를 통하여 제 2 용액 주입부(203)와 대응되는 DNA 세척부(103)에 제조예 2에서 제조한 DNA 세척 용액 DNA CC1 내지 DNA CC6을 각각 주입하였다.
상기 샘플 주입부(201)를 통해 S.aureus 세포가 주입된 지 약 3분 경과 후 DNA 추출부(204)를 통해 피펫을 이용하여 DNA를 추출하였다.
3. DNA 추출 효율 측정
본 발명의 DNA 세척 용액(DNA CC1 내지 DNA CC6)에 따라, DNA를 추출하고자 하는 샘플의 단백질, RNA 및 다른 효소 등을 제거하여 DNA 추출 효율을 높이는 지를 확인하기 위하여, DNA 세척 용액에 따른 추출된 DNA 양을 비교하였다.
DNA 양을 확인하기 위해, 상기 S.aureus 세포 내 DNA는 ARES Alexa fluor 647 DNA labeling kit (Life Technologies, Carlsbad, CA)에 의하여 형광 표시되었으며, Chemi-Doc system에 의한 형광 강도를 DNA 양으로 나타내었다.
그 결과를 하기 도 2에 나타내었으며, 도 2에 도시된 바와 같이, 이소프로필 알코올만을 포함하는 DNA 세척 용액(DNA CC1)에 비해, 본 발명의 천연 추출물을 포함하는 DNA 세척 용액(DNA CC2 내지 DNA CC6)에서 우수한 DNA 양이 추출되었으며, 특히 DNA CC5에 의하는 DNA 세척 용액을 포함하는 경우, 가장 우수한 DNA 양이 추출됨을 확인하였다.
[실험예2: 알칼리 용액에 따른 DNA 추출 효율]
상기 실험예 1에서 확인한 DNA 세척 용액(DNA CC5)을 사용한 DNA 추출 키트에 알칼리 용액(200mM NaOH)의 pH에 따른 DNA 추출 효과를 확인하여 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
1. DNA 추출
상기 실험예 1의 DNA 세척 용액(DNA CC5)을 사용한 DNA 추출 키트에 알칼리 용액(200mM NaOH) pH를 pH 5, pH 8, pH 10, pH 12, 및 pH 15로 상이하게 투여하여, DNA를 추출하였다.
2. DNA 추출 효율 측정
본 발명은 알칼리 용액(200mM NaOH)의 pH에 따라, 샘플의 DNA를 제외한 세포 용해 효과로 DNA 추출 효율을 높이는 지를 확인하기 위하여, 알칼리 용액의 pH에 따라 추출된 DNA 양을 비교하였다.
DNA 양을 확인하기 위해, 상기 S.aureus 세포 내 DNA는 ARES Alexa fluor 647 DNA labeling kit (Life Technologies, Carlsbad, CA)에 의하여 형광 표시되었으며, Chemi-Doc system에 의한 형광 강도를 DNA 양으로 나타내었다.
그 결과를 하기 도 3에 나타내었으며, 도 3에 도시된 바와 같이, pH 5의 용액을 사용하는 경우보다 pH 8, pH 10 및 pH 12의 용액을 사용하는 경우에 DNA 추출 효율이 높았으며, pH 12를 초과하는 pH 15의 용액을 사용하는 경우 DNA가 손상되어 DNA 추출 효율을 떨어뜨리는 것을 확인하였다.
[실험예3: DNA 결합 친화도에 따른 DNA 유도 효과]
1. DNA 추출
상기 실험예 1 내지 2에서 확인한 DNA 세척 용액(DNA CC5) 및 pH 12의 알칼리 용액을 사용한 DNA 추출 키트로 그람 양성(gram-positive) 박테리아인 S.aureus의 DNA를 추출하였다.
그람 양성(gram-positive) 박테리아인 S.aureus을 본 발명의 샘플 주입부(201)를 통하여 샘플 주입부(201)와 대응되는 이동부(101)에 주입하였다.
상기 S.aureus 세포 주입 후, 곧바로 본 발명의 제 1 용액 주입부(202)를 통하여 제 1 용액 주입부(202)와 대응되는 DNA 분리부(102)에 알칼리 용액으로 200mM NaOH를 주입하였다.
상기 200mM NaOH 주입 후, 제 2 용액 주입부(203)를 통하여 제 2 용액 주입부(203)와 대응되는 DNA 세척부(103)에 제조예 2에서 제조한 DNA 세척 용액 DNA CC5를 주입하였다.
상기 샘플 주입부(201)를 통해 S.aureus 세포가 주입된 지 약 3분 경과 후 DNA를 추출하지 않고 본 발명의 이동부, DNA 분리부, DNA 세척부 및 DNA 농축부에 남아있는 DNA 양을 측정하였다.
2. DNA 결합 친화도
본 발명의 DNA 추출 키트는 다양한 다공성 물질들이 배치되어 있어 DNA 분자들이 상대적 친화도 차이에 따라 DNA가 유도되는 것으로, DNA 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 S.aureus 세포 내 DNA는 ARES Alexa fluor 647 DNA labeling kit (Life Technologies, Carlsbad, CA)에 의하여 형광 표시되었다.
본 발명은 이동부(101), DNA 분리부(102), DNA 세척부(103) 및 DNA 농축부(104) 순으로 DNA가 추출됨에 따라, 이동부(101), DNA 분리부(102), DNA 세척부(103) 및 DNA 농축부(104)에 남아있는 DNA를 측정하여 DNA 결합 친화도로 확인하였다.
그 결과를 하기 도 4에 나타내었으며, 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 이동부, DNA 분리부, DNA 세척부 및 DNA 농축부가 포함하는 다양한 다공성 물질들에 따라 각각 상이한 DNA 결합 친화도를 확인하였다.
본 발명의 이동부, DNA 분리부, DNA 세척부 및 DNA 농축부에 남아있는 DNA 양은 시간이 경과됨에 따라 이동부, DNA 분리부, DNA 세척부 및 DNA 농축부 순으로 높았으며, 특히, 붕규산염 유리미세섬유(Borosilicate glass microfiber)를 포함하는 DNA 농축부에서 남아있는 DNA 양이 가장 높아 DNA 결합 친화도가 우수함을 확인하였다.
죽, 시간이 경과됨에 따라 본 발명에 따른 DNA는 이동부, DNA 분리부, DNA 세척부 및 DNA 농축부 순으로 유도되는 것으로, DNA 결합 친화도에 따라 DNA가 추출될 수 있음을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
100: DNA 추출 키트의 하단부
101: 이동부
102: DNA 분리부
103: DNA 세척부
104: DNA 농축부
200: DNA 추출 키트의 상단부
201: 샘플 주입부
202: 제 1 용액 주입부
203: 제 2 용액 주입부
204: DNA 추출부

Claims (9)

  1. DNA를 추출하고자 하는 샘플이 주입되는 샘플 주입부;
    상기 주입된 샘플이 DNA 분리부로 이동하기 위한 이동부;
    상기 주입된 샘플로부터 세포 내 DNA를 분리시키기 위한 DNA 분리부로서, pH 8 내지 pH12의 알칼리 용액을 주입하기 위한 제 1 용액 주입부를 포함하고, 상기 제 1 용액 주입부를 통해 주입된 알칼리 용액은 세포 내 DNA를 분리시키는 것인 DNA 분리부;
    상기 분리된 DNA로부터 불순물을 제거하기 위한 DNA 세척부로서, 상기 DNA 세척부는 DNA 세척 용액을 주입하기 위한 제 2 용액 주입부를 포함하고, 상기 제 2 용액 주입부를 통해 주입된 DNA 세척 용액은 세포로부터 분리된 DNA의 오염원을 제거하는 것인 DNA 세척부;
    상기 분리된 DNA로부터 불순물을 제거하기 위한 DNA 세척부;
    상기 DNA를 농축하기 위한 DNA 농축부; 및
    상기 농축된 DNA를 추출하기 위한 DNA 추출부; 를 포함하고,
    상기 DNA를 추출하고자 하는 샘플은 샘플 주입부; 이동부; DNA 분리부; DNA 세척부; DNA 농축부; 및 DNA 추출부; 순으로 이동되어, DNA가 추출되는 것이고,
    상기 DNA 세척 용액은 큰등갈퀴(Vicia pseudoorobus Fisch. & C.A.Mey.) 추출물, 선등갈퀴 (Vicia heptajuga Nakai) 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 추출물을 포함하는 것인,
    DNA 추출 키트.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 이동부; DNA 분리부; 및 DNA 세척부; 는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리 섬유, 카툰(cotton), 및 나일론으로 이루어진 군으로 부터 선택된 다공성 겔로 이루어진 다공성 멤브레인을 포함하는
    DNA 추출 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 DNA 세척 용액은 아이소아밀 알코올(isoamyl alcohol), 아이소프로판올(isopropanol), 및 에탄올(ethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는
    DNA 추출 키트.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 DNA 농축부는 DNA와의 결합친화도가 높은 섬유를 포함하며,
    상기 섬유는 붕규산염 유리섬유(Borosilicate glass fiber), 알루미노실리케이트 유리섬유(alumino-silicate glass fiber) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는
    DNA 추출 키트.
  9. 1) 샘플 주입부에 DNA를 추출하고자 하는 샘플을 주입하는 단계;
    2) 상기 샘플 주입 후, 제 1 용액 주입부를 통해 pH 8 내지 pH12의 알칼리 용액을 주입하여 세포 내 DNA를 분리시키는 단계;
    3) 상기 알칼리 용액 주입으로 인해 분리된 DNA를 세척하기 위해 제 2 용액 주입부에 DNA 세척 용액을 주입하여 세포로부터 분리된 DNA의 오염원을 제거하는 단계;
    4) 상기 DNA 세척 용액 주입으로 인해 불순물이 제거된 DNA는 DNA 농축부에 의해 DNA가 농축되는 단계; 및
    5) 상기 농축된 DNA는 DNA 추출부를 통해 피펫으로 DNA가 추출되는 단계를 포함하고,
    상기 DNA 세척 용액은 큰등갈퀴(Vicia pseudoorobus Fisch. & C.A.Mey.) 추출물, 선등갈퀴 (Vicia heptajuga Nakai) 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 추출물을 포함하는 것인,
    청구항 1의 DNA 추출 키트를 이용하여 DNA를 추출하는 방법.
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