CA1123324A - Procede et reactifs de detection des substances cancerigenes et des substances anticancereuses - Google Patents
Procede et reactifs de detection des substances cancerigenes et des substances anticancereusesInfo
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Abstract
L'invention concerne un procédé de détection de substances cancérigènes, spécifiquement anticancéreuses, toxiques et neutres. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on suit, par mesure de l'ADN radioactif acido-précipi-table, la synthèse d'ADN sur matrice d'ADN témoin isolé de tissus sains, d'une part, et sur matrice d'ADN cancéreux isolé de tissus cancéreux, d'autre part, dans un milieu d'incubation contenant quatre désoxyribonucléoside-5'-triphos-phates dont un radioactif, et une enzyme ADN-polymérase, en présence de la substance à tester; l'action de la substance à tester est comparée sur quatre couples différents d'ADN, chaque couple d'ADN étant constitué par un ADN témoin et un ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées analogues. On reconnaît les substances cancérigènes à ce qu'elles stimulent plus fortement la réplication de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances spécifiquement anticancéreuses à ce qu'elles inhibent la réplication, l'initiation de la réplication ou l'élongation de la chaîne d'ADN en synthèse sur matrice ADN cancéreux, mais non sur matrice ADN témoin, les substances toxiques inhibant aussi bien la synthèse de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances neutres n'agissant ni sur la réplicatin de l'ADN cancéreux ni sur celle de l'ADN témoin.
Description
~lZ3324 L'invention a pour objet un procédé permettant de déceler, en un temps très court, de l'ordre de 1 à 3 heures, aussi bien les substances cancérigènes, que les substances ayant une activité "spécifiquement anticancéreuse", de même que les substances "toxiques" et les substances dites "neutres".
Le nouveau procédé selon l'invention consiste en un test biologique "in vitro" totalement différent des nombreux tests proposés antérieurement pour évaluer le potentiel cancé-rigène de certaines substances ~ partir d'une acti.on mutagène ou autre. Ce test permet de prévoir l`action d'une substance donnée sur le génome et donc sur la survie de la cel`lule saine et de la cellule cancéreuse.
--`` ~Z33Z4 Il est basé sur l'action comparée de la substance à
tester dans la réplication in-vitro des acides désoxyribonu-cléiques (ADN) provenant de cellules saines d'une part, et de cellules cancéreuses (ou tumorales) d'autre part.
Il permet ainsi, non seulement de sélectionner les substances à activité cancérigène et les substances toxiques, mais, en fait, de classer les substances testées en quatre groupes:
- Les substances cancéri~ènes qui stimulent forte-ment la réplication des ADN isolés de tissus (ou cellules) cancéreux, mais faiblement, quoique significativement, la réplication des ADN isolés de tissus (ou cellules) sains.
-Les substances neutres qui n'agissent ni sur la réplication des ADN des tissus sains, ni sur celle des ADN
des tissus cancéreux.
-Les substances "toxiques" qui, à des concentrations égales à celles des cancérigènes classiques inhibent la répli-cation des ADN, provenant aussi bien des tissus sains que des tissus cancéreux. Parmi elles, nombreuses sont celles qui, à
très faibles doses, manifestent leur pouvoir cancérigène.
-Les substances dites "s~écifiquement anticancéreuses"
n'inhibant que peu ou pas la réplication des ADN de tissus sains, alors qu'elles seraient de puissants inhibiteurs de la réplication des ADN de tissus cancéreux.
Plus précisément, l'invention concerne un procédé de détection de substances cancérigènes, spécifique-ment anticancéreuses, toxiques et neutres, caractérisé en ce que l'on suit, par mesure de l'ADN radioactif acido-préci-pitable, la synthèse d'ADN sur matrice d'ADN témoin isolé
de tissus sains, d'une part, et sur matrice d'ADN cancéreux isolés de tissus cancéreux, d'autre part, dans un milieu ~ ..
.
- ~Z33Z4 2a-d'incubation contenant quatre désoxyribonucléoside-5'-triphos-phates dont un radioactif, et une enzyme ADN-polymérase, en présence de la substance à tester l'action de la substance à tester étant comparée sur quatre couples différents d'ADN, chaque couple d'ADN étant constitué par un AD~ témoin et un ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées analogues , et qu'on reconna~t les substances - cancérigènes à ce qu'elles stimulent plus fortement la ré-plication de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances spécifiquement anticancéreuses, à ce qu'elles inhibent la réplication, l'initiation de la réplication ou l'é-longation de la chaine d'ADN en synthèse sur matrice ADN
cancéreux, mais non sur matrice ADN témoin, les substances toxiques inhibant aussi bien la synthèse de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances neutres n'agissant ni sur la réplication de l'ADN cancéreux ni sur celle de l'ADN
témoin.
La présente invention vise également un réactif pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-dessus, carac-risé en ce qu'il est constitué par l'ensemble de quatre ~ -préparations, chaque préparation comprenant un couple AD~ témoin-ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées ana-logues, l'ADN présentant un rapport d'absorbances dans 1' W à
260 nm variant de 2,0 à 2,1 et une teneur en protéines de 0,3 à 0,6%.
Pour réaliser le test, qui en lui-même est très ra-pide, on doit disposer de différentes préparations, préalablement et minutieusement contr81ées, d'ADN matriciels isolés de tissus sains (ADN témoin désigné ci-après ADN T) et d'ADN matriciels isolés de tissuqcancéreux (désignés ci-après ADN C).
.. ~ .
- `
llZ3324 Les préparations d'ADN C sont obtenues en utilisant comme matière première, différents tissus cancéreux ou tumeurs, provenant d'un organe humain ou animal, tels que sein, poumon, ovaire, neuro-carcinome, ascites, etc. On peut également utiliser des cultures de cellules cancéreuses telles que les cellules KB, les cellules Hela, etc.
Les préparations d'ADN T sont obtenues de même en utilisant comme matière première des tissus sains provenant de divers organes humains ou animaux, ou des cellules saines culti-vées "in-vitro" dans des milieux appropriés.
Pour chaque test, il faut disposer d'au moins quatre couples dlADN ma~riciels de provenance différente, chaque couple étant constitué par une préparation d'ADN T et une préparation d'ADN C provenant du même organe, d'une même espèce animale. On utilise, par exemple, au moins quatre couples choisis parmi les suivants : ADN T et ADN C isolés de tissus de poumon; ADN T et ADN C isolés de tissus de sein; ADN T et ADN C isolés de tissus d'ovaire; ADN T de cellules primaires de rein de singe (RS) ou de cellules "Vero", ou de cellules "SIRC" en culture et ADN C
de cellules KB ou de cellules ~ela, ou de cellules L, en culture.
La nécessité d'effectuer le test sur au moins quatre couples d'ADN provenant d'organes différents s'explique par le fait que certaines substances qui sont "neutres" vis-3-vis des ADN isolés d'un organe donné, se révèlent cancérigènes ou au contraire spécifiquement anti-cancéreuses vis-3-vis des ADN
isolé8 d'un autre organe, ou de cellules en culture.
Par ailleurs, certaines substances qui se comportent comme des substances "spécifiquement anticancéreuses" lorsqu'elles sont présentes ~ de relativement faibles concentrations dans le milieu réactionnel, deviennent toxiques à des concentrations plus ~levées. Il est donc nécessaire d'effectuer le test avec des milieux réactionnels contenant une gamme de concentrations de la substance à tester, entre O et 100 ~g.
Pour isoler l'ADN, soit à partir de tissus sains, soit 3 partir de tissus cancéreux, o~n utilise un procédé classique - ` ~.
.. ' ~'~
li~3324 4.-d'isolement et de purification ~. Marmur, J. Mol. Biol. 3, 208, 1961), modifié. Lorsqu'on utilise un tissu cancéreux ou une tumeur, il faut d'abord les débarrasser des tissus sains ou douteux avoisinants, et réciproquement les tissus sains doivent être exempts d,e tous tissus douteux.
Le tissu est, immédiatement après exérèse, soit congelé
à -20C, soit finement broyé au masticateur en présence de tampon 2SSC (contenant 17,4 g de NaCl et 10,7 g de citrate trisodique pour 1 litre d'eau distillée stérile) en solution aqueuse sté-rile (1 à 3 ml de tampon selon le volume de tissu) et d'une con-centration finale de 0,2% de laurylsulfate (par addition d'une solution mère aqueuse de laurylsulfate à 20%).
Pour éliminer les protéines et conserver l'ADN, plu-sieurs extractions sont pratiquées en présence de tampon 2SSC et lS de phénol (solution contenant 10% d'eau), suivies d'extractions au chloroforme et de centrifugations suivant la technique clas-sique d'isolement et de purification des ADN. L'ADN, présent dans les phases aqueuses,est précipité dans de l'alcool à 96, ramassé à la baguette en verre, dissous dans un faible volume de lSSC, puis traité par les ribonucléases pancréatiques et Tl, ! -ce qui nécessite tout un cycle supplémentaire de repurification au phénol, puis au chloroforme. L'ADN est dialysé contre une sblution de 2SSC ~24 heures à 4C) dosé par absorption dans l'ultraviolet et gardé congelé ~ -20C, plusieurs mois si néces-saire. Avant d'être utilisé, l'ADN est dialysé de nouveau pendant quelques heures contre de l'eau distillée stérile.
L'ADN est caract~risé par son absorbance dans l'ultra-violet à 260 nm et 280 nm. Le rapport typique 260/280 varie de
Le nouveau procédé selon l'invention consiste en un test biologique "in vitro" totalement différent des nombreux tests proposés antérieurement pour évaluer le potentiel cancé-rigène de certaines substances ~ partir d'une acti.on mutagène ou autre. Ce test permet de prévoir l`action d'une substance donnée sur le génome et donc sur la survie de la cel`lule saine et de la cellule cancéreuse.
--`` ~Z33Z4 Il est basé sur l'action comparée de la substance à
tester dans la réplication in-vitro des acides désoxyribonu-cléiques (ADN) provenant de cellules saines d'une part, et de cellules cancéreuses (ou tumorales) d'autre part.
Il permet ainsi, non seulement de sélectionner les substances à activité cancérigène et les substances toxiques, mais, en fait, de classer les substances testées en quatre groupes:
- Les substances cancéri~ènes qui stimulent forte-ment la réplication des ADN isolés de tissus (ou cellules) cancéreux, mais faiblement, quoique significativement, la réplication des ADN isolés de tissus (ou cellules) sains.
-Les substances neutres qui n'agissent ni sur la réplication des ADN des tissus sains, ni sur celle des ADN
des tissus cancéreux.
-Les substances "toxiques" qui, à des concentrations égales à celles des cancérigènes classiques inhibent la répli-cation des ADN, provenant aussi bien des tissus sains que des tissus cancéreux. Parmi elles, nombreuses sont celles qui, à
très faibles doses, manifestent leur pouvoir cancérigène.
-Les substances dites "s~écifiquement anticancéreuses"
n'inhibant que peu ou pas la réplication des ADN de tissus sains, alors qu'elles seraient de puissants inhibiteurs de la réplication des ADN de tissus cancéreux.
Plus précisément, l'invention concerne un procédé de détection de substances cancérigènes, spécifique-ment anticancéreuses, toxiques et neutres, caractérisé en ce que l'on suit, par mesure de l'ADN radioactif acido-préci-pitable, la synthèse d'ADN sur matrice d'ADN témoin isolé
de tissus sains, d'une part, et sur matrice d'ADN cancéreux isolés de tissus cancéreux, d'autre part, dans un milieu ~ ..
.
- ~Z33Z4 2a-d'incubation contenant quatre désoxyribonucléoside-5'-triphos-phates dont un radioactif, et une enzyme ADN-polymérase, en présence de la substance à tester l'action de la substance à tester étant comparée sur quatre couples différents d'ADN, chaque couple d'ADN étant constitué par un AD~ témoin et un ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées analogues , et qu'on reconna~t les substances - cancérigènes à ce qu'elles stimulent plus fortement la ré-plication de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances spécifiquement anticancéreuses, à ce qu'elles inhibent la réplication, l'initiation de la réplication ou l'é-longation de la chaine d'ADN en synthèse sur matrice ADN
cancéreux, mais non sur matrice ADN témoin, les substances toxiques inhibant aussi bien la synthèse de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances neutres n'agissant ni sur la réplication de l'ADN cancéreux ni sur celle de l'ADN
témoin.
La présente invention vise également un réactif pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-dessus, carac-risé en ce qu'il est constitué par l'ensemble de quatre ~ -préparations, chaque préparation comprenant un couple AD~ témoin-ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées ana-logues, l'ADN présentant un rapport d'absorbances dans 1' W à
260 nm variant de 2,0 à 2,1 et une teneur en protéines de 0,3 à 0,6%.
Pour réaliser le test, qui en lui-même est très ra-pide, on doit disposer de différentes préparations, préalablement et minutieusement contr81ées, d'ADN matriciels isolés de tissus sains (ADN témoin désigné ci-après ADN T) et d'ADN matriciels isolés de tissuqcancéreux (désignés ci-après ADN C).
.. ~ .
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llZ3324 Les préparations d'ADN C sont obtenues en utilisant comme matière première, différents tissus cancéreux ou tumeurs, provenant d'un organe humain ou animal, tels que sein, poumon, ovaire, neuro-carcinome, ascites, etc. On peut également utiliser des cultures de cellules cancéreuses telles que les cellules KB, les cellules Hela, etc.
Les préparations d'ADN T sont obtenues de même en utilisant comme matière première des tissus sains provenant de divers organes humains ou animaux, ou des cellules saines culti-vées "in-vitro" dans des milieux appropriés.
Pour chaque test, il faut disposer d'au moins quatre couples dlADN ma~riciels de provenance différente, chaque couple étant constitué par une préparation d'ADN T et une préparation d'ADN C provenant du même organe, d'une même espèce animale. On utilise, par exemple, au moins quatre couples choisis parmi les suivants : ADN T et ADN C isolés de tissus de poumon; ADN T et ADN C isolés de tissus de sein; ADN T et ADN C isolés de tissus d'ovaire; ADN T de cellules primaires de rein de singe (RS) ou de cellules "Vero", ou de cellules "SIRC" en culture et ADN C
de cellules KB ou de cellules ~ela, ou de cellules L, en culture.
La nécessité d'effectuer le test sur au moins quatre couples d'ADN provenant d'organes différents s'explique par le fait que certaines substances qui sont "neutres" vis-3-vis des ADN isolés d'un organe donné, se révèlent cancérigènes ou au contraire spécifiquement anti-cancéreuses vis-3-vis des ADN
isolé8 d'un autre organe, ou de cellules en culture.
Par ailleurs, certaines substances qui se comportent comme des substances "spécifiquement anticancéreuses" lorsqu'elles sont présentes ~ de relativement faibles concentrations dans le milieu réactionnel, deviennent toxiques à des concentrations plus ~levées. Il est donc nécessaire d'effectuer le test avec des milieux réactionnels contenant une gamme de concentrations de la substance à tester, entre O et 100 ~g.
Pour isoler l'ADN, soit à partir de tissus sains, soit 3 partir de tissus cancéreux, o~n utilise un procédé classique - ` ~.
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li~3324 4.-d'isolement et de purification ~. Marmur, J. Mol. Biol. 3, 208, 1961), modifié. Lorsqu'on utilise un tissu cancéreux ou une tumeur, il faut d'abord les débarrasser des tissus sains ou douteux avoisinants, et réciproquement les tissus sains doivent être exempts d,e tous tissus douteux.
Le tissu est, immédiatement après exérèse, soit congelé
à -20C, soit finement broyé au masticateur en présence de tampon 2SSC (contenant 17,4 g de NaCl et 10,7 g de citrate trisodique pour 1 litre d'eau distillée stérile) en solution aqueuse sté-rile (1 à 3 ml de tampon selon le volume de tissu) et d'une con-centration finale de 0,2% de laurylsulfate (par addition d'une solution mère aqueuse de laurylsulfate à 20%).
Pour éliminer les protéines et conserver l'ADN, plu-sieurs extractions sont pratiquées en présence de tampon 2SSC et lS de phénol (solution contenant 10% d'eau), suivies d'extractions au chloroforme et de centrifugations suivant la technique clas-sique d'isolement et de purification des ADN. L'ADN, présent dans les phases aqueuses,est précipité dans de l'alcool à 96, ramassé à la baguette en verre, dissous dans un faible volume de lSSC, puis traité par les ribonucléases pancréatiques et Tl, ! -ce qui nécessite tout un cycle supplémentaire de repurification au phénol, puis au chloroforme. L'ADN est dialysé contre une sblution de 2SSC ~24 heures à 4C) dosé par absorption dans l'ultraviolet et gardé congelé ~ -20C, plusieurs mois si néces-saire. Avant d'être utilisé, l'ADN est dialysé de nouveau pendant quelques heures contre de l'eau distillée stérile.
L'ADN est caract~risé par son absorbance dans l'ultra-violet à 260 nm et 280 nm. Le rapport typique 260/280 varie de
2,0 ~ 2,1 se~on la préparation. Le contenu de l'ADN en protélnes varie de 0,3 à 0,6%, et celui des polyribonucléotides ayant résisté à l'action des nucléases et contaminant l'ADN doit être compris entre 1 à 3%. L'ARN (acide ribonucléique) peut être éliminé par dégradation par KOH 0,3 M (concentration finale) pendant 16 heures à 36C, et l'ADN est ensuite dialysé et con-servé comme indiqué précédemment.
Une préparation d'ADN-polymérase est également nécessaire pour effectuer le test.
11233z~
Du fait que les ADN-polymérases isolées des tissus des mammifères synthétisent les ADN par un mécanisme identique ~
celui qu'utilise l'AD~-polymérase I d'~scherichia coli, on peut utiliser une ADN-polymérase ADN-dépendante et de préférence llADN-polymérase I isolée et partiellement purifiée ~ partir d'extraits d'E. coli M 500 Sho-R et à partir d'E. coli sauvage T 3000. L'enzyme doit être passée deux fois successivement sur colonne DEAE cellulose, selon la méthode d~crite afin de présenter un rapport 280~260 de l'ordre de 1,5 à 1,8 (M. PLAWECKI et M. BELJANSKI, C.R. Acad. Sci. Paris, 278, série D, 1974, p. 1413 et M. BELJANSKI et col., C.R. Acad.~Sci. Paris, 280, série D, 1975, p. 363).
Le milieu réactionnel, ou milieu d'incubation, dans lequel on suit la réplication de l'ADN en présence de la subs-tance à tester comprend, pour 0,15 ml (volume final) :
- 0,5 3 1 ~g d'ADN matriciel (ADN-T ou ADN-C) - 4 désoxyribonucléoside-5'-triphosphates (chacun 5 ~anomoles) - 25 ~ M de tampon tris-HCl ~pH exactement 7,65) - 0,- à 100 ~ de substance 3 tester - 2 ~g de Mg C12 - 40 à 80 ~g d'enzyme ADN-polymérase, ajoutée après tous les autres constituants du milieu.
Les quatre désoxyribonucléoside-5'-triphosphates comprennent :
- le désoxyguanosine-5'-triphosphate, - le désoxycytidine-5'-triphosphate, - le désoxyadénosine-5'-triphosphate, - le thymidine-5'-triphosphate, l'un d'entre eux étant radioactif (3H ou I~C ; 50.000 coups par minute). Comme composé radioactif, on utilise de préférence le (méthyl-3H)thymidine-5'-triphosphate.
La concentration de substance à tester dans le milieu varie de 0,- à 100 ~g, car certaines substances, cancérigènes lorsqu'elles sont fortement diluées, deviennent toxiques à des concentrations plus élevées.
Il faut donc effectuer l'essai avec une gamme de concentration en commençant par de faibles concentrations de la substance à tester.
L'incubation est effectuée pendant 10 minutes, ~ 36C, et la réaction est arrêtée par addition d'acide trichloracétique ~ATC) ~ 5~.
Sans attendre, le précipité, constitué par l'ADN
S synthétisé radioactif est filtré sur millipores en verre, lavé
~ l'ATC 5%, séché,et la radioactivité est déterminée dans un spectromètre Packard (compteur à scintillations) l'échantillon plongeant dans le liquide approprié au compteur.
On a ainsi étudié comparativement la synthèse in-vitro d'ADN sur matrices d'ADN témoins et d'ADN cancéreux enprésence de diverses substances chimiques connues comme ayant des propriétés cancérigènes :
- le 3-méthyl-cholantrène (MC) - la nicotine (NIC) - le 9,10-diméthyl-1,2-benzanthracène (DMBA) - le benzo (a) pyrène - le 4-benzènesulfonamido-S nitrobenzène (DCBN) - un extrait d'amiante, etc.
La figure 1 représente les courbes tracées pour les trois premiers composés ci-dessus (MC, NIC et DMBA) en portant en ordonnées la quantité d'ADN radioactif 3H synthétisé (en coups par minute) en présence d'ADN-T et d'ADN-C, en fonction de la quantité de substance à tester dans le milieu réactionnel.
On voit, d'après ces courbes, que chacune des subs-tances testées stimule la réplication de l'ADN, mais la stimula-tion est nettement plus forte pour l'ADN cancéreux que pour l'ADN témoin.
On a obtenu des résultats analogues pour toutes les substances cancérigènes testées.
Certaines substances cancérigènes, surtout les colo-rants, par exemple l'orange d'acridine, doivent être testées à
des concentrations très faibles, car à des concentrations élevées, elles deviennent toxiques et inhibent aussi bien la réplication de l'ADN témoin que celle de l'ADN cancéreux.
La figure 2 représente les courbes obtenues avec l'orange d'acridine, dans les memes conditions que celles ayant liZ3324 permis d'établir la figure 1. On voit sur cette figure qu'avec 0,005 ml d'orange d'acridine tO,l mg/ml) dans le milieu, la stimulation de la réplication de l'ADN-C est nettement plus forte que celle de l'ADN-T, mais entre 0,005 et 0,1 ml d'orange S d'acridine dans ~.e milieu, cette substance ralentit la synthèse, aussi bien de l'ADN-C que de l'ADN-T.
Un deuxième groupe de substances, dites "substances neutres" n'ont aucun effet, ni stimulateur, ni inhibiteur sur la réplication des ADN-T, ni sur celle des ADN-C.
La figure 3 représente les c,ourbes, obtenues dans des conditions analogues à celles ayant permis d'établir la figure 1, avec une substance neutre dénommée "Xabar" et qui est une association de nicotinate de réserpiline, de théophylline et de papavérine. L'acide nicotinique, la pipérazine, sont classer parmi ces substances neutres.
La figure 6 représente les courbes obtenues dans des conditions analogues à celles ayant permis d'établir la figure 1, en utilisant différentes hormones génitales (estrone et estradiol) aux concentrations indiquées sur la figure 6. L'estrone et l'es-tradiol stimulent faiblement la replication de l'ADN T isolé detissus sains de sein et très fortement celle de l'ADN C isolé
de tissus canc~reux de sein. Des résultats semblables ont été
observés avec l'ADN des ovaires. Par contre, les hormones géni-tales n'ont pas d'action sur la réplication de l'ADN.provenant .
de tissus témoins et cancéreux tels que tissus de poumon oude foie.
L'extrême sensibilité de la réaction de réplicati.on des ADN sains et cancéreux permet de déceler également un effet simplement toxique. En présence des substances toxiques à de faibles concentrations, on observe une inhibition de la réplica-tion des ADN sains, de même qu'une inhibition de la réplication des ADN cancéreux, essentiellement par inhibition de l'activité
enzymatique.
La figure 4 illustre cette inhibition non sélective pour le Diquat (dibro~nure d'éthylène-l,l-bipyridylium-2,2).
Le procédé selon l'invention p.ermet enfin de recon-naître les substances ayant des propriétés spécifiquement anti-.: ~
llZ3324 cancéreuses. Ces substances inhibent la réplication, l'initia-tion de celle-ci ou l'élongation (ou les deux) de la chaîne dlADN en voie de synthèse lorsque ces substances sont en présence de l'ADN cancéreux; par contre, elles ne doivent avoir que peu ou pas d'action sur la réplication des ADN-T.
Le propre(et la définition théorique) d'une substance "spécifiquement anticancéreuse" est de différencier un tissu cancéreux d'un tissu sain, puis de détruire l'un et non pas l'autre. D'après le procédé selon l'invention, seront rangées dans la catégorie "anticancéreux spécifiques" les substances capables de différencier les ADN d'origine cancéreuse des ADN
d'origine non cancéreuse, et d'inhiber la réplication du premier sans inhiber celle du second. Selon l'invention, la courbe théorique d'une substance spécifiquement anticancéreuse, c'est-à-dire inhibant la seule réplication de l'ADN-C doit se présenter se].on le schéma représenté dans la figure 5.
Le test selon l'inventiGn permet ainsi de sélectionner les substances selon l'action qu'elles exercent comparativement, sur la réplication de l'ADN témoin et sur celle de l'ADN cancéreux.
Il permet essentiellement de reconnaître, d'une part, des substances ayant un pouvoir cancérigène, d'autre part, des substances ayant une activité "spécifiquement anticancéreuse"
et peut ainsi servir à effectuer un premier tri avant l'étude pharmacologique dans la recherche de nouveaux médicaments anti-cancéreux.
Une préparation d'ADN-polymérase est également nécessaire pour effectuer le test.
11233z~
Du fait que les ADN-polymérases isolées des tissus des mammifères synthétisent les ADN par un mécanisme identique ~
celui qu'utilise l'AD~-polymérase I d'~scherichia coli, on peut utiliser une ADN-polymérase ADN-dépendante et de préférence llADN-polymérase I isolée et partiellement purifiée ~ partir d'extraits d'E. coli M 500 Sho-R et à partir d'E. coli sauvage T 3000. L'enzyme doit être passée deux fois successivement sur colonne DEAE cellulose, selon la méthode d~crite afin de présenter un rapport 280~260 de l'ordre de 1,5 à 1,8 (M. PLAWECKI et M. BELJANSKI, C.R. Acad. Sci. Paris, 278, série D, 1974, p. 1413 et M. BELJANSKI et col., C.R. Acad.~Sci. Paris, 280, série D, 1975, p. 363).
Le milieu réactionnel, ou milieu d'incubation, dans lequel on suit la réplication de l'ADN en présence de la subs-tance à tester comprend, pour 0,15 ml (volume final) :
- 0,5 3 1 ~g d'ADN matriciel (ADN-T ou ADN-C) - 4 désoxyribonucléoside-5'-triphosphates (chacun 5 ~anomoles) - 25 ~ M de tampon tris-HCl ~pH exactement 7,65) - 0,- à 100 ~ de substance 3 tester - 2 ~g de Mg C12 - 40 à 80 ~g d'enzyme ADN-polymérase, ajoutée après tous les autres constituants du milieu.
Les quatre désoxyribonucléoside-5'-triphosphates comprennent :
- le désoxyguanosine-5'-triphosphate, - le désoxycytidine-5'-triphosphate, - le désoxyadénosine-5'-triphosphate, - le thymidine-5'-triphosphate, l'un d'entre eux étant radioactif (3H ou I~C ; 50.000 coups par minute). Comme composé radioactif, on utilise de préférence le (méthyl-3H)thymidine-5'-triphosphate.
La concentration de substance à tester dans le milieu varie de 0,- à 100 ~g, car certaines substances, cancérigènes lorsqu'elles sont fortement diluées, deviennent toxiques à des concentrations plus élevées.
Il faut donc effectuer l'essai avec une gamme de concentration en commençant par de faibles concentrations de la substance à tester.
L'incubation est effectuée pendant 10 minutes, ~ 36C, et la réaction est arrêtée par addition d'acide trichloracétique ~ATC) ~ 5~.
Sans attendre, le précipité, constitué par l'ADN
S synthétisé radioactif est filtré sur millipores en verre, lavé
~ l'ATC 5%, séché,et la radioactivité est déterminée dans un spectromètre Packard (compteur à scintillations) l'échantillon plongeant dans le liquide approprié au compteur.
On a ainsi étudié comparativement la synthèse in-vitro d'ADN sur matrices d'ADN témoins et d'ADN cancéreux enprésence de diverses substances chimiques connues comme ayant des propriétés cancérigènes :
- le 3-méthyl-cholantrène (MC) - la nicotine (NIC) - le 9,10-diméthyl-1,2-benzanthracène (DMBA) - le benzo (a) pyrène - le 4-benzènesulfonamido-S nitrobenzène (DCBN) - un extrait d'amiante, etc.
La figure 1 représente les courbes tracées pour les trois premiers composés ci-dessus (MC, NIC et DMBA) en portant en ordonnées la quantité d'ADN radioactif 3H synthétisé (en coups par minute) en présence d'ADN-T et d'ADN-C, en fonction de la quantité de substance à tester dans le milieu réactionnel.
On voit, d'après ces courbes, que chacune des subs-tances testées stimule la réplication de l'ADN, mais la stimula-tion est nettement plus forte pour l'ADN cancéreux que pour l'ADN témoin.
On a obtenu des résultats analogues pour toutes les substances cancérigènes testées.
Certaines substances cancérigènes, surtout les colo-rants, par exemple l'orange d'acridine, doivent être testées à
des concentrations très faibles, car à des concentrations élevées, elles deviennent toxiques et inhibent aussi bien la réplication de l'ADN témoin que celle de l'ADN cancéreux.
La figure 2 représente les courbes obtenues avec l'orange d'acridine, dans les memes conditions que celles ayant liZ3324 permis d'établir la figure 1. On voit sur cette figure qu'avec 0,005 ml d'orange d'acridine tO,l mg/ml) dans le milieu, la stimulation de la réplication de l'ADN-C est nettement plus forte que celle de l'ADN-T, mais entre 0,005 et 0,1 ml d'orange S d'acridine dans ~.e milieu, cette substance ralentit la synthèse, aussi bien de l'ADN-C que de l'ADN-T.
Un deuxième groupe de substances, dites "substances neutres" n'ont aucun effet, ni stimulateur, ni inhibiteur sur la réplication des ADN-T, ni sur celle des ADN-C.
La figure 3 représente les c,ourbes, obtenues dans des conditions analogues à celles ayant permis d'établir la figure 1, avec une substance neutre dénommée "Xabar" et qui est une association de nicotinate de réserpiline, de théophylline et de papavérine. L'acide nicotinique, la pipérazine, sont classer parmi ces substances neutres.
La figure 6 représente les courbes obtenues dans des conditions analogues à celles ayant permis d'établir la figure 1, en utilisant différentes hormones génitales (estrone et estradiol) aux concentrations indiquées sur la figure 6. L'estrone et l'es-tradiol stimulent faiblement la replication de l'ADN T isolé detissus sains de sein et très fortement celle de l'ADN C isolé
de tissus canc~reux de sein. Des résultats semblables ont été
observés avec l'ADN des ovaires. Par contre, les hormones géni-tales n'ont pas d'action sur la réplication de l'ADN.provenant .
de tissus témoins et cancéreux tels que tissus de poumon oude foie.
L'extrême sensibilité de la réaction de réplicati.on des ADN sains et cancéreux permet de déceler également un effet simplement toxique. En présence des substances toxiques à de faibles concentrations, on observe une inhibition de la réplica-tion des ADN sains, de même qu'une inhibition de la réplication des ADN cancéreux, essentiellement par inhibition de l'activité
enzymatique.
La figure 4 illustre cette inhibition non sélective pour le Diquat (dibro~nure d'éthylène-l,l-bipyridylium-2,2).
Le procédé selon l'invention p.ermet enfin de recon-naître les substances ayant des propriétés spécifiquement anti-.: ~
llZ3324 cancéreuses. Ces substances inhibent la réplication, l'initia-tion de celle-ci ou l'élongation (ou les deux) de la chaîne dlADN en voie de synthèse lorsque ces substances sont en présence de l'ADN cancéreux; par contre, elles ne doivent avoir que peu ou pas d'action sur la réplication des ADN-T.
Le propre(et la définition théorique) d'une substance "spécifiquement anticancéreuse" est de différencier un tissu cancéreux d'un tissu sain, puis de détruire l'un et non pas l'autre. D'après le procédé selon l'invention, seront rangées dans la catégorie "anticancéreux spécifiques" les substances capables de différencier les ADN d'origine cancéreuse des ADN
d'origine non cancéreuse, et d'inhiber la réplication du premier sans inhiber celle du second. Selon l'invention, la courbe théorique d'une substance spécifiquement anticancéreuse, c'est-à-dire inhibant la seule réplication de l'ADN-C doit se présenter se].on le schéma représenté dans la figure 5.
Le test selon l'inventiGn permet ainsi de sélectionner les substances selon l'action qu'elles exercent comparativement, sur la réplication de l'ADN témoin et sur celle de l'ADN cancéreux.
Il permet essentiellement de reconnaître, d'une part, des substances ayant un pouvoir cancérigène, d'autre part, des substances ayant une activité "spécifiquement anticancéreuse"
et peut ainsi servir à effectuer un premier tri avant l'étude pharmacologique dans la recherche de nouveaux médicaments anti-cancéreux.
Claims (10)
sont définies comme suit:-
1. Procédé de détection de substances cancéri-gènes, spécifiquement anticancéreuses, toxiques et neutres, caractérisé en ce que l'on suit, par mesure de l'ADN radio-actif acido-précipitable, la synthèse d'ADN sur matrice d'ADN témoin isolé de tissus sains, d'une part, et sur matrice d'ADN cancéreux isolé de tissus cancéreux, d'autre part, dans un milieu d'incubation contenant quatre désoxyri-bonucléoside-5'-triphosphates dont un radioactif, et une enzyme ADN-polymérase, en présence de la substance à tester l'action de la substance à tester étant comparée sur quatre couples différents d'ADN, chaque couple d'ADN étant constitué
par un ADN témoin et un ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées analogues, et qu'on reconnaît les substances cancérigènes à ce qu'elles stimulent plus fortement la réplication de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances spécifiquement anticancéreuses, à ce qu'elles inhibent la réplication, l'initiation de la réplication ou l'é-longation de la chaîne d'ADN en synthèse sur matrice ADN
cancéreux, mais non sur matrice ADN témoin, les substances toxiques inhibant aussi bien la synthèse de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances neutres n'agissant ni sur la réplication de l'ADN cancéreux ni sur celle de l'ADN
témoin.
par un ADN témoin et un ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées analogues, et qu'on reconnaît les substances cancérigènes à ce qu'elles stimulent plus fortement la réplication de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances spécifiquement anticancéreuses, à ce qu'elles inhibent la réplication, l'initiation de la réplication ou l'é-longation de la chaîne d'ADN en synthèse sur matrice ADN
cancéreux, mais non sur matrice ADN témoin, les substances toxiques inhibant aussi bien la synthèse de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin, et les substances neutres n'agissant ni sur la réplication de l'ADN cancéreux ni sur celle de l'ADN
témoin.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que les quatres couples d'ADN sont choisis parmi les suivants:
-ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus de poumon, -ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus d'ovaire, -ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus de sein, -ADN témoin de cellules primaires de rein de singe (RS) ou de cellules "Vero" ou de cellules "SIRC", et ADN cancéreux de cellules KB, ou de cellules Hela, ou de cellules L.
en ce que les quatres couples d'ADN sont choisis parmi les suivants:
-ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus de poumon, -ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus d'ovaire, -ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus de sein, -ADN témoin de cellules primaires de rein de singe (RS) ou de cellules "Vero" ou de cellules "SIRC", et ADN cancéreux de cellules KB, ou de cellules Hela, ou de cellules L.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce qu'on fait agir la substance à tester, d'une part sur l'ADN témoin, d'autre part sur l'ADN cancéreux, dans un milieu d'incubation tamponné par du tris'HCl, contenant quatre désoxyribonucléoside-5'-triphosphates en quantités équimoléculaires et dont l'un est marqué par du 14C ou du 3H, en présence d'une enzyme ADN-polymérase, pendant 10 mn à
36°C, qu'on arrête la réaction par addition d'acide trichlora-cétique et qu'on mesure la radioactivité du précipité formé, constitué par l'ADN synthétisé.
en ce qu'on fait agir la substance à tester, d'une part sur l'ADN témoin, d'autre part sur l'ADN cancéreux, dans un milieu d'incubation tamponné par du tris'HCl, contenant quatre désoxyribonucléoside-5'-triphosphates en quantités équimoléculaires et dont l'un est marqué par du 14C ou du 3H, en présence d'une enzyme ADN-polymérase, pendant 10 mn à
36°C, qu'on arrête la réaction par addition d'acide trichlora-cétique et qu'on mesure la radioactivité du précipité formé, constitué par l'ADN synthétisé.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé
en ce que les quatre désoxyribonycléoside-5'-triphosphates présents dans le milieu d'incubation sont le désoxyguanosine-5'-triphosphate, le désoxyadénosine-5'-triphosphate, le désoxycy-tidine-5'-triphosphate et le thymidine-5'-triphosphate.
en ce que les quatre désoxyribonycléoside-5'-triphosphates présents dans le milieu d'incubation sont le désoxyguanosine-5'-triphosphate, le désoxyadénosine-5'-triphosphate, le désoxycy-tidine-5'-triphosphate et le thymidine-5'-triphosphate.
5. Procédé selon les revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le désoxyribonucléoside-5'-triphosphate marqué est le (méthyl-3H) thymidine-5'-triphosphate.
6. Procédé selon les revendications 1, 3 ou 4, caractérisé en ce que l'enzyme ADN-polymérase utilisée est une ADN-polymérase ADN-dépendante isolée d'E. coli, le pH de la réaction étant très exactement ajusté à 7,65.
7. Procédé selon les revendication 1, 3 ou 4, caractérisé en ce que l'enzyme ADN-polymérase utilisée est une ADN-polymérase ADN-dépendante I, le pH de la réaction étant très exactement ajusté à 7,65.
8. Procédé selon les revendications 1, 3 ou 4, caractérisé en ce qu'on utilise une dose de substance à tester de 0,- à 100 ug pour 0,5 à 1 ug d'ADN matirciel.
9. Réactif pour la mise en oeuvre d'un procédé
selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué
par l'ensemble de quatres préparations, chaque préparation comprenant un couple ADN témoin-ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées analogues, l'ADN présentant un rapport d'absorbances dans 1'UV à 260 nm et à 280 nm variant de 2,0 à 2,1 et une teneur en protéines de 0,3 à 0,6 %.
selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué
par l'ensemble de quatres préparations, chaque préparation comprenant un couple ADN témoin-ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées analogues, l'ADN présentant un rapport d'absorbances dans 1'UV à 260 nm et à 280 nm variant de 2,0 à 2,1 et une teneur en protéines de 0,3 à 0,6 %.
10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé
en ce que les quatres couples d'ADN sont choisis parmi les suivants:
-ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus de poumon, -ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus d'ovaire, -ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus de sein, -ADN témoin de cellules primaires de rein de singe (RS) ou de cellules "Vero" ou de cellules "SIRC", et ADN cancéreux de cellules KB, ou de cellules Hela, ou de cellules L.
en ce que les quatres couples d'ADN sont choisis parmi les suivants:
-ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus de poumon, -ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus d'ovaire, -ADN témoin et ADN cancéreux isolés de tissus de sein, -ADN témoin de cellules primaires de rein de singe (RS) ou de cellules "Vero" ou de cellules "SIRC", et ADN cancéreux de cellules KB, ou de cellules Hela, ou de cellules L.
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