KR100286896B1 - 유리미세섬유칼럼과 이를 이용한 플라스미드 ｄｎａ 제조 및 정제방법 - Google Patents

유리미세섬유칼럼과 이를 이용한 플라스미드 ｄｎａ 제조 및 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유리미세섬유 칼럼과 그를 이용한 플라스미드 DNA 제조 및 정제방법에 관한 것으로, 붕규산염 유리미세섬유 칼럼으로 구성된 키트는 고순도의 플라스미드 DNA를 간단하고 신속하게 별도의 정제과정 없이 다량 얻을 수 있고 또한 아가로오즈 겔 또는 폴리아크릴아마이드 겔로부터 DNA를 효과적으로 분리할 수 있으며 세포내 삽입 동위원소 정량, RNA 제조, 동위원소 프로브 정제, PCR 반응물의 정제 및 제조된 플라스미드 DNA 정제 등 다양하게 응용 가능한 뛰어난 효과가 있다.

Description

유리미세섬유칼럼과 이를 이용한 플라스미드 ＤＮＡ 제조 및 정제방법{Glass microfiber column, method of preparation and purification for plasmide DNA using the same}
본 발명은 유리미세섬유(Glass microfiber:GF)칼럼과 이를 이용한 플라스미드 DNA 제조 및 DNA 정제방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 활성 붕규산염 미세섬유막으로 구성된 플라스미드 DNA 제조 및 정제용 칼럼 키트 및 이를 이용한 플라스미드 DNA 제조 및 정제방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 DNA 흡착력이 미약한 붕규산염 또는 규산염 유리미세섬유에 구아니딘 하이드로크로라이드(Guanidine Hydrochloride )막을 형성하여 DNA 흡착력을 향상시킨 재질을 레진으로 사용한 플라스미드 DNA 제조 및 정제용 칼럼키트 및 이를 이용하여 단시간내에 고순도의 플라스미드 DNA를 다량 제조 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
플라스미드 DNA의 제조 및 정제방법은 분자생물학 연구에서 가장 기본적으로 널리 요구되는 기술이다. 종래에도 플라스미드 DNA를 제조하는 방법들이 공지되어 있다. 많은 연구실에서 플라스미드는 매뉼얼 방법(manual method)에 따라 제조되고 있으므로 시간이 많이 걸리고 신뢰할 만하지 못하여 연구여건이 좋은 연구실에서는 Qiagen(독일)이나 Promega(미국)에서 생산되는 제품들을 주로 사용하고 있다. 이들 종래 제품들은 주로 실리카 겔(silica gel)에 플라스미드 DNA가 결합하는 방법을 이용하고 있다. 한편, Vogelstein과 Gillespie의 논문(1978)에 의하면, 용융유리(flint glass)를 대형 융용유리 입자(large flint glass particle), 중형 용융유리 입자(medium flint glass particle), 분말형 용융유리 입자(flint glass powder)의 입자 크기별로 만든 다음 NaⅠ 용액하에서 DNA 결합(DNA bound)를 측정하여 용융유리(Flint glass)에 결합(binding)하는 원리로서 아가로스 겔로부터 DNA를 분리하는 방법이 공지되어 있다. 그리고 이 원리에 의한 제품이 'glass milk'라는 상품으로 이미 사용되고 있으며 아가로스 겔로부터 DNA를 분리하는데 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 이 제품에 따른 DNA 분리 효과를 보면 분말형 용융 유리(flint glass powder)에서 가장 효과적인 DNA 결합능을 나타냈으나 중형 용융유리 입자(medium flint glass particle)에서는 급격히 그 효과가 저하되며, 대형 용융유리 입자(large flint glass particle)에서는 그 효과가 더욱 현저히 저하되는 문제점이 있다. 또한, 유리의 재질이 다른 대형 붕규산염 유리 입자(large borosilicate glass particle)에서도 대형 용융유리 입자에서와 마찬가지로 DNA 결합능이 효과적이지 못하고, 유리섬유 여과(glass fiber filter)에서는 흡착력이 매우 미약하여 작은 용적에서의 수득율은 매우 낮은 문제점이 있었다. 그리고 다공성의 유리구슬(porous glass bead)을 사용할 때는 탁월한 DNA 결합활성을 보였으나 DNA를 결합하는데 오랜 시간이 소요되고 구슬로부터 수득시 DNA의 분해(degradation)가 발생하며, 수득율 역시 양적 분석에는 적합하지 못하다는 문제점이 있었다. 그리고 상기 실리카 젤은 분말형 용융 유리에서와 같이 매우 효과적인 DNA 결합 효과를 보이나 대사 조절(handle mechanically)의 문제가 있으며 수득율이 낮았다. 실리카겔은 플라스미드 DNA 제조용 칼럼키트로서 사용되고 있으며 'Qiagen'과 'Promega' 제품이 상품화되고 있다. 그러나 상기 제품들은 플라스미드 DNA 제조과정에서 낙하흐름(gravity flow)을 이용한 칼럼통과 방식을 이용하므로서 장시간이 요구되고 제조 DNA에 레진 슬러리(resin slurry)가 함유되어 별도의 정제과정이 요구되며, 엔도이눌레이즈(endonuclease)가 함유되어 장시간 보관시 자가소화(self digestion)가 일어나고, 엔도톡신(endotoxin)과 같은 단백질 불순물이 제거되지 못하여 포유류 세포(mammalian cell)의 트렌스팩션(transfection)시 세포독성을 유발하여 세포사멸이 일어나거나 동물실험에서는 면역반응을 유발하는 문제들이 야기되므로서 고순도의 DNA 정제가 요구되고 있다. 또한 이들 외국제품을 수입함에는 많은 비용이 소모되므로 간단한 공정으로 고순도의 플라스미드 DNA를 다량 얻을 수 있는 저가의 플라스미드 DNA 제조 칼럼 키트 개발의 필요성이 절실히 요구되어 왔다.
한편, DNA 정제는 동위원소 표지 프로브(Probe)의 정제, PCR 반응물의 정제, 이미 정제된 플라스미드 DNA의 RNA 및 엔도이뉼레이즈(endonuclease), 엔도톡신(endotoxin)과 같은 단백질 불순물을 제거하여 순도를 증카시키는 방법이다. 이외에도 세포증식(Cell proliferation assay)에 관한 실험시 배양세포에 동위원소를 투여하여 세포함유 배양액을 칼럼에 스핀(spin)으로 통과 시키면 세포내 삽입되지 않은 동위원소는 칼럼을 통과하게되고 세포내로 삽입된 동위원소만이 칼럼에 존재하게되어 별도의 고비용장치 없이 세포내 삽입 동위원소양을 정량한다. 따라서 본 발명자들은 상기와 같은 DNA 정량을 단시간에 고순도로 다랑 얻을 수 있도록 붕균산염 유리미세섬유를 레진으로 하는 신규한 칼럼키트를 제조하므로써 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명자들은 이화학적으로 불활성 물질이며, 약산 약알칼리성에 저항성이고, 1.0㎛ 입자(particle)에서 수분의 흡수력이 탁월하며, 로딩량(loading capacity)가 적어도 결과가 정확하고, 장기간 저장에도 미생물에 의한 오염문제가 없는 장점을 갖고 있으며 불순물을 제거하는 매우 우수한 능력을 갖는 규산염의 붕소화합물인 붕규산염(Borosilicate)에 구아니딘 하이드로크로라이드를 함유시키면 매우 강력한 DNA 흡착력을 발휘한다 것을 실리카겔과 비교하여 확인하므로써 이를 플라스미드 DNA 제조 및 정제용 칼럼 키트에 레진으로 사용하므로써 본 발명을 완성하였다. 구아니딘 하이드로크로라이드를 함유하는 붕균산염은 실리카겔 보다 DNA 흡착력이 2 ~ 4배 높았다.
본 발명의 목적은 활성 붕규산염 미세섬유막으로 구성된 플라스미드 DNA 제조 및 정제용 칼럼 키트를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 플라스미드 DNA 제조 및 정제용 칼럼 키트의 제조방법을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 플라스미드 DNA 제조 및 정제용 칼럼 키트를 사용하여 아가로스겔이나 폴리아크릴아마이드겔로부터 DNA 정제, 동위원소 표지 probe 정제, PCR 반응물 정제 및 이미 제조된 플라스미드 DNA의 정제, 게놈 DNA 제조, RNA 제조와 세포내 삽입된 동위원소 정량방법 등을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 유리섬유(galss fiber:GF) 소형, 중형 및 대형 칼럼키트용 붕규산염 유리미세섬유막 다층컬럼과 유리미세섬유막/파티클 칼럼 등을 제조하고 제조한 칼럼키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 고순도로 제조하고 제조된 플라스미드 DNA를 제한효소로 절단, 세포 트렌스펙션 및 형질도입, 35S 염기서열분석, 자동염기서열 분석, PCR 반응 산물의 염기서열분석, 정제한 DNA 산물의 단백질 발현 등을 조사하여 본 발명 플라스미드 DNA 제조 및 정제 칼럼 키트의 기능적 우수성을 증명하므로써 달성하였다.
도 1a는 붕규산염 유리미세섬유막 다층 칼럼 키트(GF mini column kit)의 분해도이다.
도 1b는 도 1a에 도시한 칼럼키트의 조립 단면도이다.
도 2는 붕규산염 유리미세섬유막의 증가에 따른 플라스미드 DNA 수득율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 대형 붕규산염 유리미세섬유막 다층컬럼키트의 분해도이다.
도 3b는 도 3a에 도시한 칼럼키트의 단면도이다.
도 4a는 유리미세섬유막/파티클 칼럼 키트(GF midi column kit)의 분해도이다.
도 4b는 도 4a에 도시한 칼럼키트의 조립 단면도이다.
도 5는 유리미세섬유 파티클의 증가에 따른 플라스미드 DNA 수득율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 붕규산염 유리미세섬유와 규산염 유리미세섬유의 재질에 따른 플라스미드 DNA의 수득율 비교 그래프이다.
도 7는 본 발명의 칼럼키트로 제조된 플라스미드 DNA의 제한효소 절단 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 칼럼키트로 제조된 플라스미드 DNA의 35S dATP 시퀀싱 분석 결과이다.
도 9a는 종래의 칼럼키트로 제조된 플라스미드 DNA의 트렌스팩션에서 β-갈락토시다제 단백질 생산에 의한 염색반응을 나타낸 사진이다.
도 9b는 본 발명의 칼럼키트로 제조된 플라스미드 DNA의 트렌스팩션시 β-갈락토시다제 단백질 생산에 의한 염색반응을 나타낸 사진이다.
도 10는 본 발명의 칼럼키트에 의하여 제조된 pGEM 7Z 플라스미드 DNA를 T7프라이머를 사용하여 자동 염기서열 분석한 분석표이다.
도 11은 본 발명의 키트에 의하여 제조된 pGEM 7Z 플라스미드 DNA를 Sp6 플라이머를 사용하여 자동 염기서열 분석한 분석표이다.
도 12는 본발명의 칼럼키트로서 제조된 ??라스미드 DNA를 주형으로 프라이머를 혼합하여 PCR 반응을 실시한후 반응물을 아가로스젤상에서 확인한 사진이다.
도 13은 본발명의 칼럼키트를 이용한 플라스미드 제조과정중 에탄올에 의한 세척과정을 생략하여 제조된 플라스미드에 함유된 RNA를 RNAse로서 반응한후 반응물을 본발명의 칼럼에 통과하여 플라스미드중 RNA 및 단백질 불순물을 제거하고 순도를 증가 시킨 것이다.
도 14은 아가로오즈 겔로부터 DNA 밴드를 잘라서 GF 소형 컬럼키트를 이용하여 분리한 후 아가로오즈 겔에서 전기영동한 사진이다.
본 발명은 붕규산염 유리섬유(Glass fiber:GF) 소형컬럼 키트용 유리 미세섬유 다층컬럼, 붕규산염 유리섬유 대형 칼럼 키트용 유리 미세섬유 다층컬럼, 붕규산염 중형 칼럼키트용 유리미세섬유막/파티클 칼럼, 소형 및 중형 칼럼키트용 붕규산염 유리 미세섬유 및 규산염 유리 미세섬유 다층컬럼 및 중형 칼럼키트용 실리카겔 칼럼과 실리카겔/붕규산염 유리 미세섬유 이중층 칼럼을 제조하고 상기 제조한 칼럼으로 플라스미드 DNA를 정제하여 수율을 조사하는 단계; E.coli 균주 배양액을 GF 소형컬럼키트, GF 중형 칼럼키트 또는 GF 대형 칼럼키트로 정제하여 고순도의 플라스미드 DNA를 제조하는 단계 및; 상기 제조한 플라스미드 DNA를 제한효소처리하여 절단, 35S 염기서열분석, 독일 Qiagen 사의 칼럼키트와 세포 트렌스펙션과 형질도입에 의한 단백질 발효효과 비교, 자동염기서열 분석기를 이용하여 정제된 DNA의 염기서열을 분석, PCR로 증폭시킨 DNA를 하나는 정제하고 다른 하나는 정제하지 않은 상태로 DNA를 얻은 후 겔상에서 전기영동하여 과잉 프라이머 제거 여부 조사, 본 발명 GF 매트릭스 대형 칼럼을 이용하여 균주 배양액으로 플라스미드 DNA를 WA 용액으로 세척한 후 칼럼에 통과시키는 방법, WA 용액으로 세척하지 않고 에탄올 침전하여 DW 용액에 녹인 후 칼럼에 통과시키는 방법, WA 용액으로 세척하지 않고 DW 용액에 녹인 후 Rnase를 가하여 불활성화시킨 후 칼럼에 통과시키는 방법으로 분리정제하여 수득율과 순도를 비교하고 또 PCR 증폭한 DNA를 전기영동으로 분리하고 이 분리액을 GF 소형컬럼으로 정제하여 DNA 분리성능을 조사하므로써 본 발명 칼럼의 DNA 분리성능을 조사하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예와 실험예에만 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 유리미세섬유 칼럼의 제조 및 플라스미드 DNA 수득
실험예 1: GF 소형 칼럼 키트용 유리 미세섬유막 다층컬럼제조 및 사용
붕규산염 유리미세섬유(Borosilicate glass microfiber)로 직경 8㎜ 원형을 만든 후 여러개를 겹쳐서 2 내지 10㎜ 복수층(13)으로 하여 직경 13㎜, 길이 31㎜의 작은 스핀 소형 컬럼(spin mini column)(11)에 삽입한 후 7.5㎜ 링(ring)(12)을 삽입하여 내용물을 고정하고 가스멸균하였다(도 1a). 제조된 유리섬유칼럼을 사용할 때에는 수집튜브(10)에 넣어 사용하였다(도 1b). 붕규산염 유리미세섬유막(Borosilicate glass microfiber membrane)의 다층 컬럼은 플라스미드 DNA의 순도와 수득율을 개선하기 위해 막의 두께를 2㎜씩 급격히 증가시켰다.
제조된 붕규산염 유리미세섬유막이 다층으로 구성된 GF 소형 칼럼을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리한 결과, 플라스미드 DNA 수득율은 도 2에서 볼 수 있듯이 8㎜에서 최대 약 200㎍의 플라스미드 DNA를 얻었다. 그러나, 10㎜ 이상에서는 더 이상의 수득율이 증가하지 않았다.
실험예 2: GF 최대 칼럼 키트용 유리 미세섬유막 다층 칼럼 제조 및 사용
실험예 1에서와 같은 방법으로 GF 대형 칼럼 키트용 유리 미세섬유막 다층 칼럼을 제조하였다. 도 3a에 나타낸 바와 같이 직경 22mm, 길이 86mm의 대형 컬럼(31)에 유리 미세섬유막(33)을 직경 22mm의 원형으로 잘라서 약 1 g을 최대 컬럼에 충진하고 십자형 링(32)으로 고정하였다. 제조된 대형 컬럼을 사용시에는 50 mL 팔콘 튜브(falcon tube)(30)를 수집튜브(collecting tube)로서 사용하였다(도 3b). 상기 컬럼을 사용하여 약 250 mL의 배양액으로부터 약 1.2 mg의 플라스미드 DNA를 수득하였다.
실험예 3: GF 중형 및 소형 매트릭스 칼럼 키트용 유리 미세섬유막/파티클 칼럼 제조 및 사용
붕규산염 유리미세섬유와 10mM Tris/HCl pH7.5, 1mM EDTA 용액을 믹서기에서 혼합하여 유리미세섬유 파티클(glass microfiber particle) 현탁액을 만들었다. 도 4a에 나타낸 직경 15㎜, 길이 80㎜ 폴리프로필렌 중형 칼럼(22)에 2㎜정도로 직경 8㎜ 원형 유리미세섬유 파티클(24)을 넣은 다음 유리미세섬유 파티클 현탁액을 넣고 스윙 로터 원심분리(swing rotor centrifuge)에서 스핀(spin)하여 5 내지 10㎜의 유리미세섬유막/파티클 이중 컬럼층을 만들고 직경 8㎜ 링 또는 직경 8㎜ 용융유리로 내용물을 고정하고 가스(gas) 멸균하였다. 제조된 유리섬유칼럼을 사용할 때에는 에펜도프튜브(21)을 받쳐서 수집튜브(20)에 넣어 사용하였다(도 4b). 유리미세섬유막의 증가에 따른 플라스미드 DNA 수득량 및 유리미세섬유 파티클의 용량증가에 따른 플라스미드 DNA 수득량은 각각 도 5에서 보는 바와 같이 증가되었다. 또 붕규산염 유리 미세섬유막을 직경 약 3mm 이하로 페이터 절단기(paper cutter)로 잘라서 약 0.1g의 레진을 소형 컬럼, 약 0.42g의 레진을 중형 컬럼에 충진하고 4.2 M 구아니딘 HCl을 로딩하고 스핀으로 통과 시켜 활성-컬럼(active-column)을 제조하였다. 소형 컬럼을 사용시에는 약 100 ug, 중형(midi column)을 사용시에는 약 200 ug의 플라스미드 DNA를 수득하였다. 이들 칼럼을 이용한 플라스미드 DNA 수득량 및 순도는 하기 표 1과 같았다.
소형 및 중형 칼럼별 플라스미드 DNA 순도 및 수득량
칼럼의 종류 E.coli JM109배양액 OD260/0D280 수득량
GF 매트릭스 소형 컬럼 10mL 1.7 ~ 1.9 ~ 100㎍
GF 매트릭스 중형 컬럼 100mL 1.7 ~ 1.9 ~ 200㎍
실험예 4: 붕규산염 유리 미세섬유 칼럼과 규산염 유리 미세섬유 칼럼에 의한 플라스미드 DNA 수득율의 비교
붕규산염 유리미세섬유(Borosilicate glass microfiber)와 규산염 유리미세섬유(glass microfiber particle)의 재질에 따른 플라스미드 DNA의 수득율을 비교하기 위하여 각각의 재질로서 실험예 1과 동일한 방법으로 컬럼을 제조하고 E.coli 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 각각 제조하여 수득율과 순도를 비교분석하였다. 실험결과, 도 6에서 보는 바와 같이 규산염 유리미세섬유칼럼(Silicate glass microfiber column)에서 수득율은 붕규산염 유리미세섬유칼럼(borosilicate glass microfiber column)에 비하여 약 20% 감소하였으며 순도 역시 OD260/OD280=1.5로서 붕규산염 유리미세섬유칼럼에 의하여 제조된 플라스미드 DNA 순도 OD260/OD280=1.7∼1.8에는 미치지 못하였다.
실험예 5: 실리카겔 칼럼과 실리카겔/붕규산염 미세섬유 이중층 칼럼에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 수득량과 순도의 비교
실험예 3에서 실시된 바와 같이 5개의 중형 컬럼에는 약 8㎜의 실리카겔을 채우고 다른 5개의 중형 컬럼에는 약 2㎜의 붕규산염 유리미세섬유막/파티클(borosilicate glass microfiber membrane/particle)층을 만든 후 그 위에 다시 약 6㎜층의 실리카 겔층을 만든 후 실험예 2에서와 같이 플라스미드 DNA를 제조하여 순수도 및 수득량을 분석하였다. 실험결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 실리카 겔 칼럼에 붕규산염 유리미세섬유층 도입시 수득율과 순도는 각각 실리카 겔 단독에 비하여 현저히 증가하였다. 이하, 모든 실험에 제공된 플라스미드 DNA는 붕규산염 유리미세섬유칼럼에 의하여 제조된 것을 사용하였다.
칼럼별 플라스미드 DNA 순도 및 수득량 실험결과
칼럼의 종류 E.coli JM109 배양액 OD260/OD280(순도) 수득량
실리카겔 200㎖ 1.2∼1.5 40∼80㎍
실리카겔/붕규산염 유리 미세섬유 200㎖ 1.5∼1.8 70∼90㎍
실시예 2: 플라스미드 DNA 제조
상기 실시예 1에 제조된 GF 소형 칼럼 키트, GF 중형 칼럼 키트 또는 GF 대형 칼럼 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 플라스미드를 함유한 E.coli 균주를 배양하고 이 균주배양액을 원심분리하여 펠렛를 얻었다. 이 펠렛을 Buffer A 용액(50mM Tris, 10mM EDTA pH8.0, 100㎍/㎖ RNase A.)에 녹인다음 Buffer B 용액(20mM NaOH, 1.0% SDS(W/V))으로 세포 라이시스한 후 Buffer C 용액(3.2mM Potassium acetate, pH5.0)에서 중화하였다. 중화처리한 용액을 원심분리하여 상등액을 상기 구아니딘 HCl로 활성화된 GF 칼럼키트에서 DNA와 결합시킨 다음 뉴클레이즈를 제거한 후 세척하고 용출시켜 고순도의 플라스미드 DNA를 얻었다. 이때, 뉴클레이즈를 제거하기 위해 4.2M 구아니딘 하이드로크로라이드를 사용하였고 세척용액으로서는 10mM Tris/HCl(pH7.5), 50mM NaCl, 0.1mM EDTA, 70% 에탄올을 사용하였다.
실시예 3: 제조된 플라스미드 DNA의 분자생물학적 평가 및 분석
실험예 1:제한효소 처리
상기 실시예 2에서 제조된 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoRI과 Hind Ⅲ로 절단시킨 결과 도 7에 나타낸 바와 같이 효과적인 DNA 절단이 이루어졌다.
실험예 2: 35S 시퀀싱 분석
실시예 2에서 제조된 플라스미드 DNA 10㎍과 독일 Qiagen 사 제품으로 제조된 플라스미드 DNA 10㎍을 α35S d-ATP를 이용하여 SequenaseTM버젼 2.0 DNA 시퀀싱 키트(United State Biochemical)에서 반응시켜 시퀀싱 겔로부터 분리한 후 자동 방사선그라피를 실시하였다. 실험결과, 도 8에서 보는 바와 같이 본 발명의 칼럼키트로 제조된 DNA의 시퀀싱 분석(sequencing analysis)은 선명하게 DNA 밴드가 분리된 반면, 독일 Qiagen사 제품으로 제조된 DNA의 시퀀싱 분석에서는 효과적으로 DNA 밴드의 분리가 이루어지지 않았다.
실험예 3: 세포 트랜스펙선과 형질도입
실시예 1에서 제조된 본 발명의 칼럼키트와 기존 칼럼키트(독일 Qiagen사)를 사용하여 세포 트렌스팩션(Cell transfection)과 형질도입(transduction)을 실시하였다. 실험결과, 도 9a 및 도 9b에서 보는 바와 같이, 본 발명의 칼럼키트로 제조된 플라스미드 DNA를 트렌스팩션(transfection)하였을 시에는 거의 모든 세포내에서 효과적인 단백질 발현이 이루어져 염색된 반면(도 9b) 종래제품의 칼럼키트(Qiagen)로 제조된 DNA를 트렌스팩션하였을시에는 효과적인 단백질 발현(도 9a)이 이루어지지 않았다.
실험예 4: 자동 염기서열 분석
본 실험예에서 자동염기서열분석은 ABI PRIMTM염색 말단 사이클 시퀀싱 준비 반응키트(ABI PRIMTMDye terminator cycle sequencing ready reaction kit)(Perkin Elmer)를 이용하여 실시하였으며, 말단 준비 반응 혼합물(terminal ready reaction mix) 8㎕, 주형 DNA 0.4㎍, 프라이머 3pmole을 20㎕ 반응 부피로 96℃/30min, 50℃/15sec, 60℃/4min 동안 반응을 Bio Rad Gene CyclerTM에서 25 사이클 반응 후 에탄올로서 침전하여 스피트 백(speed vac)에서 건조시킨 다음 자동염기서열분석기(Automatic sequencer; Applied Biosystem)로 분석하였다. 실험결과 도 10 및 도 11과 같이 매우 효과적인 시퀀스 분석이 이루어졌다. 이때, 상기에서 사용된 주형은 1.2kb 클론된 DNA 함유 pGEM7Z이고, 프라이머는 T7프라이머 또는 SP6 프라이머이다.
실험예 5: PCR 반응 및 PCR 반응물의 정제.
실시예 1에서 제조된 칼럼으로부터 얻은 CMV-TNF 플라스미드 DNA를 주형으로하여 PCR 반응을 실시하였다. 즉 20 ng CMV TNF 플라스미드, 1mM dNTP 2uL, 10x결합 buffer 5uL, Tag 2U 및 TNA 안티센스 프라이머 혼합물에 인접 프로모터 프라이머(proximal promoter primer) 혹은 원접 프로모터 프라이머(distal promoter primer)를 각각 넣고 95˚c에서 5 min 동안 반응 후 95˚c - 1 min, 55˚c - 1 min, 72˚c - 1 min의 조건으로 30 사이클 반응후 72˚c - 10 min 반응하였다. 반응물을 2 구룹으로 나누어 한 구룹은 같은 용적의 4.2M 구아니딘 HCl(Guanidinw HCl)을 혼합하여 마이크로 DNA 정제 컬럼(micro DNA purification column)에 통과시킨 후 WA 용액으로 세척하여 DNA를 수득하였다. 두구룹을 각각 아가로스 겔(agarose gel)상에서 전기영동한 결과 도 12에 나타낸 바와 같이 마이크로 DNA 정제 컬럼(micro DNA purification column)에서 정제된 PCR 반응물에서는 과잉의 프라이머(primer)가 완전제거되었다.
실험예 6: DNA 정제
실시예 1에서 제조된 GF 매트릭스 대형 컬럼(matrix maxi column)을 이용하여 세 구룹의 250 mL 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다. 첫째 방법은 WA 용액으로 세척하는 일반적인 방법이며, 두번째 방법은 WA 용액으로 세척하지 않고 에탄올 침전하여 500 uL DW 용액에 녹였으며, 세 번째 방법은 두 번째 방법으로 제조된 플라스미드 DNA를 250 uL 씩 나눈후 각각 20 uL RNase A(3mg/mL)를 가하여 37˚c에서 30분간 반응후 65˚c에서 10분간 불활성화한후 반응물을 마이크로 컬럼(micro column)에 통과시켰다. 이는 표 3에 정리한 바와 같이 각각의 플라스미드 DNA를 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 분리하였다. 이 결과를 도 13에 나타냈다. 에탄올 세척을 하지 않은 플라스미드 DNA는 고농도의 수득율을 보였으나 RNA 오염을 보였다. 한편, 이 플라스미드 DNA를 RNase A 처리 후 마이크로 칼럼에 통과시켰을 때에는 RNA 불순물이 완전 제거되었으며 DNA 순도( OD280/OD260) 역시 1.72에서 1.90으로 증가하였다. 따라서 상기방법으로 플라스미드 제조상의 고질적인 문제가 되고있는 RNA 오염문제를 완전제거하고 DNA 수득율 및 순도를 증가시킬 수 있었다.
GF 매트릭스 대형 칼럼을 사용한 DNA 정제
OD280/OD260 농도 전체 DNA
WA 세척 1.44 7.60 760㎍
세척안함 1.68 10.80 1.08㎍
세척안하고 컬럼정제 1.90 11.75 1.175mg
실험예 7: 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아마이드로부터 DNA 분리
아가로스 겔/TAE 또는 TBE로부터 전기영동하여 DNA를 분리하고, 밴드를 잘라서 투석백(dialysis bag) 속에 넣고 TAE 용액을 채운 다음 전기 영동하여 DNA를 겔로부터 분리하였다. 용액을 취하여 같은 용적의 4.2M 구아니딘 하이드로클로라이드를 더하여 본 발명의 GF 소형 컬럼에 넣고 스핀한 후 WA용액(10mM Tris/HCl pH7.5, 30mM EDTA, 70% 에탄올)으로 세척하고, 이어서 DW 50㎕를 넣고 스핀하여 분리하였다. 실험결과 도 14에 나타낸 바와 같이 우수한 DNA분리성능을 발휘하였다. 이 결과를 표 4에 요약하였다. 본 발명 칼럼키트는 첫째, 간단하고 신속하게 플라스미드 DNA를 제조하였고 둘째, DNA 수득율이 극히 우수하여 GF 소형 칼럼 키트에서는 기존의 스핀 칼럼 키트에 비하여 약 50∼100배(∼200㎍)까지의 DNA양을, GF 중형 칼럼 키트의 경우에는 약 400㎍의 DNA양을 얻었고, GF 대형 칼럼 키트의 경우에는 2.2 mg의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있으며 셋째, 유리미세섬유로 제조한 플라스미드 DNA는 분광광도계의 측정에 의하여 순도(OD260/OD280)=1.7∼1.9의 높은 순도의 플라스미드 DNA를 얻었다. 최대 플라스미드 수득량 및 효율적인 조건은 표 5에 나타냈다. 또 넷째, E.coli에서 흔히 나타나는 뉴클레이즈를 제거하고 JM109 균주에서 나타나는 카보하이드레이트를 제거하므로 효과적으로 뉴크레이즈 활성을 차단하였다.
카오트로픽 염 및 구아니딘 HCl에 의한 GF 중형 칼럼 키트를 사용하여 제조한 플라스미드 DNA의 효율성
제조방법 E.coli JM109배양액 플라스미드 종류 OD260/OD280(순도) 최대 DNA 수득량
카오트로픽 염 200㎖ pGem 7z 1.7∼1.8 50∼100㎍
구아니딘 HCl 200㎖ pGem 7z 1.7∼1.9 200∼400㎍
GF 칼럼 키트에 의한 효율적인 플라스미드 수득량 및 조건
제조방법 E.coliJM109배양액 플라스미드 종류 OD260/OD280(순도) GF 레진양 DNA 수득량
GF 소형 칼럼키트 10mL pGem 7% 1.7 ~ 1.8 0.1g ~ 70㎍
GF 중형 칼럼키트 100mL pGem 7% 1.6 ~ 1.9 0.42g ~ 200㎍
GF 대형 칼럼키트 250mL pGem 7% 1.7 ~ 1.9 1 ~ 1.34g 832㎍ ~ 2.2mg
GF 소형칼럼 및 GF 중형 칼럼은 GF 매트릭스 칼럼 방식으로 제조 된 것을 사용하였으며 GF 대형 칼럼은 GF 다층 칼럼방식으로 제조된 것을 사용하였다.
상기 실시예에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 유리미세섬유 칼럼은 간단하고 신속하게 플라스미드 DNA를 제조하여 고순도의 플라스미드 DNA를 다량 얻을 수 있는 효과가 있으며 제조된 플라스미드 DNA는 순도가 탁월하여 또 다른 정제과정 없이 다양한 반응에 사용될 수 있는 효과가 있다. 또한 본 발명의 칼럼 키트를 사용하여 아가로즈 겔 또는 폴리아마이드 겔로부터 DNA를 효과적으로 분리할 수 있으며, 세포내 삽입 동위원소 정량, RNA 제조, 동위원소 프로브 정제, PCR 반응물의 정제 및 이미 제조된 플라스미드 DNA 정제 등 다양하게 응용 가능한 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 3mm 이하 크기의 붕규산염 유리섬유 파티클과 4.2M 구아니딘 하이드로클로라이드를 주재로하여 만든 레진을 함유함을 특징으로 하는 유리미세섬유컬럼 제조방법.
  2. 제1항 기재의 방법으로 제조됨을 특징으로 하는 유리미세섬유 컬럼키트.
  3. 제3항 기재의 유리미세섬유 칼럼키트를 이용한 플라스미드 DNA의 제조방법.
  4. 제3항 기재의 유리미세섬유 칼럼키트를 이용한 아가로오스 겔 또는 폴리아크릴아마이드 겔로부터 DNA 분리방법.
  5. 제3항 기재의 유리미세섬유 칼럼키트를 이용하여 DNA에 혼합된 RNA 제거 및 불순 단백질을 제거하므로써 DNA의 순도를 증가시키는 DNA 정제방법.
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