KR102282642B1 - 5가지 방향성 식물과 5가지 생약소재의 복합추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 5가지 방향성 식물인 유향나무(Boswellia carterii), 배초향(Agastache rugosa), 목향(Inula helenium), 클로브(Clove, Eugenia caryophyllus) 및 단향(Sandalwood, Santalum album)과 5가지 생약소재인 인삼(Panax ginseng), 감초(Glycyrrhiza uralensis), 육계나무(Cinnamomum cassia), 복령(Poria cocos) 및 천문동(Asparagus cochinchinensis)의 복합추출물을 유효성분으로 함유함으로써 피부병변 유발균에 대한 항균, 각질세포 이동 촉진을 통한 피부손상 회복 및 재생, 멜라닌 생성 억제를 통한 미백 및 콜라겐 생성 증가를 통한 주름개선의 효과가 우수한 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

5가지 방향성 식물과 5가지 생약소재의 복합추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing the extract of 5 aromatic herbs and 5 medicinal herb}

본 발명은 5가지 방향성 식물과 5가지 생약소재의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 방향성 식물인 유향나무(Boswellia carterii), 배초향(Agastache rugosa), 목향(Inula helenium), 클로브(clove, Eugenia caryophyllus) 및 단향(Sandalwood, Santalum album)과 생약소재인 인삼(Panax ginseng), 감초(Glycyrrhiza uralensis), 육계나무(Cinnamomum cassia), 복령(Poria cocos) 및 천문동(Asparagus cochinchinensis) 복합추출물을 유효성분으로 함유하여 피부병변 유발균에 대한 항균효과, 각질형성세포 이동 촉진효과, 멜라닌 생성 억제 및 콜라겐 생성 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

신종 인플루엔자, 중동호흡기증후군에 이어 최근 신종 코로나바이러스감염증까지 다양한 감염병이 유행하고, 이들 감염병에 의한 장시간 개인위생도구 착용, 외부활동 감소, 잦은 휴대폰 사용 등 생활방식이 변화하면서 다양한 피부문제가 발생하게 되었다. 특히 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes)는 이런 피부 트러블을 야기하는 대표적인 세균이다. 이들은 마스크 착용 시와 같은 고온, 다습한 환경에서 공존하고 상호작용하면서 여드름과 같은 피부질환을 유발한다.

S. aureus는 피부감염의 대부분을 유발하는 세균으로, 덥고 습한 환경에서 증가하며, 개인위생도구에 의한 세균성 피부질환 및 여드름의 주요 원인이 된다(Nuo-Ya Zhou et al., 2020). 또한 외부활동이 자유롭지 않아 스마트폰의 사용이 증가되면서 스마트폰의 단파장 가시광선이 S. aureus의 증식을 유도하여 여드름을 유발하기도 한다(M. Singh et al., 2020). 햇빛에 의해 생성된 비타민 D는 피부면역력을 증가시켜 S. aureus에 대한 항균활성을 증가시킨다(Jeffrey W. Wang et al., 2015). 그러나 생활방역을 위해 외부출입이 예전처럼 활발하지 않은 지금은 S. aureus에 대한 피부면역을 온전히 기대하기 어려워졌다.

C. acnes는 피부 세균총의 절반을 차지하는 상재균이지만, 피부 상태가 악화된 경우 여드름을 유발하는 세균이다(Chia-Jung Lee et al., 2017). 최근 보고에 따르면 여드름 피부에서 C. acnes의 양적인 변화는 관찰되지 않았으나, 이들 균에서 분비하는 바이오필름(biofilm)이 염증을 유발하고 항균제 내성을 일으켜 여드름 악화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Eftychia Platsidaki and Clio Dessinioti, 2018). 또한 C. acnes는 S. aureus와 피부에서 상호작용하여 S. aureus에 의한 피부 병변을 악화시킨다(Chih-Wei Lo et al., 2011).

개인위생도구의 장시간 착용은 피부에 다양한 트러블과 손상을 유발한다. 마스크 착용으로 발생한 여드름은 상처부위의 색소를 침착시키고, 마스크에 의해 반사된 태양빛은 눈가와 이마의 멜라닌 생성을 자극하여 피부를 칙칙하게 만들 수 있다. 또한 얼굴에 밀착시킨 개인위생도구는 피부에 물리적 상처를 남기고 깊은 주름을 유발한다.

여드름, 피부 손상, 피부 과색소 침착, 주름 생성 등은 감염병 상황에서 뿐만 아니라 평상시에도 많은 사람들에게 피부 고민을 안겨준다. 따라서 이러한 피부문제를 개선하는 효능을 나타내면서도 인체에 대해서는 좀 더 안전한 새로운 물질을 개발해야 할 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 이러한 효과를 나타내는 천연물 소재를 탐색하여 왔으며, 방향성 식물인 유향나무, 배초향, 목향, 클로브 및 단향과 생약소재인 인삼, 감초, 육계나무, 복령 및 천문동의 복합추출물이　S. aurues에 대한 항균효과, C. acnes의 바이오필름 생성 억제효과 뿐 아니라, 각질형성세포 이동 촉진효과, 멜라닌 생성 억제 및 콜라겐 생성 효과가 우수하여 피부 상태 개선에　효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(000１) 대한민국 등록특허 제10-2184758호 (2020.11.24) (000２) 대한민국 공개특허 제10-2018-0043580호 (2018.04.30.) (0003) 대한민국 등록특허 제10-2199858호 (2021.01.04) (0004) 대한민국 등록특허 제10-2010404호 (2019.08.07)

본 발명은 방향성 식물인 유향, 배초향, 목향, 클로브 및 단향과 생약소재인 인삼, 감초, 육계, 복령 및 천문동의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 유향, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계, 복령 및 천문동 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 복합추출물은 유향, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계, 복령 및 천문동이 각각 1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되어 추출 제조되는 것이다.

유효성분으로서의 상기 복합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유된다.

상기 화장료 조성물은 항균용인 것을 특징으로 한다. 상기 화장료 조성물은 피부재생용인 것을 특징으로 한다. 상기 화장료 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 한다. 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유향, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계, 복령 및 천문동 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 천연 추출물을 함유하여 안전하며, 그 상승작용에 의하여 우수한 항균효능, 피부재생 및 피부손상 회복 촉진, 피부미백 및 주름개선 효능을 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 발명의 내용을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따르면 5가지 방향성 식물인 유향나무, 배초향, 목향, 클로브 및 단향과 5가지 생약소재인 인삼, 감초, 육계나무, 복령 및 천문동의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

식물체에서 향기가 나는 대표적인 방향성 식물로는 소나무과, 녹나무과, 운향과, 정향과, 산형과, 꿀풀과, 국화과, 매나자무과, 물푸레나무과, 인동과 등이 있다. 고려시대 이후로 우리 선조들은 방향식물을 실생활에서 적극적으로 이용하기 시작하였는데, 행향(行香), 향의(香儀), 장례(葬禮), 향약(香藥)은 물론 일상생활에서도 음식, 치료, 목욕, 해충기피, 향장의 목적으로 이용하였다(홍민지 외, 2020).

유향나무는 감람나무과에 속하는 왜소관목으로, 줄기부분에 상처를 내면 우윳빛의 수액이 흘러나와 굳어지며 방향성의 수지가 되는데, 이것을 유향(乳香)이라 하여 예로부터 향수와 화장품의 재료로 사용해왔다. 또한 다양한 치료적 목적으로도 많이 사용하고 있는데 유향의 진통효과와 항염작용이 알려져 있으며, 최근에는 스트레스나 정신적 치료에도 효과적인 것으로 보고된 바 있다. 또한 유향은 독성이 없으면서 방부작용과 강력한 박테리아 성장 억제 효과를 가지고 있다(박정숙, 2017).

배초향은 꿀풀과에 속하는 다년생 초본으로 대표적인 한국의 방향식물이다. 배초향의 강한 향기로 인해 식품, 향신료 등 다양한 산업제품의 원료로 사용되고 있다. 또한 한방에서는 곽향(藿香)이라 불리며, 음식으로 인한 체증, 오한, 설사를 동반한 복통 증세에 곽향정기탕으로 널리 사용되어 왔다. 배초향 추출물의 생리활성으로는 항염증, 항산화, 항불안 등이 알려져 있으며, 배초향의 에센셜오일은 항균, 항진균, 항바이러스, 살충 등의 활성이 있다고 보고되었다(홍민지 외, 2020).

목향(木香)은 국화과에 속하는 다년생 초본으로, 목향에 대한 연구에서 항암, 항비만, 파골세포 분화, 항염증, 항당뇨 효과와 관련된 보고가 있었다(오재선 외, 2014). 또한 목향의 주요성분인 sesquiterpene 및 sesquiterpene lactone계 화합물이 항바이러스, 항균, 항염증, 암세포 증식 억제 등의 효능을 나타낸다고 알려져 있다(이아영 외, 2007).

클로브(Clove)는 도금양과에 속하는 상록 소교목으로, 특히 꽃봉우리가 녹색에서 홍색으로 될 때 그 꽃을 수확하여 건조한 것을 정향이라고 한다. 정향은 특이한 냄새가 강하고 맛이 강렬하여 오래전부터 우리나라에서는 향미강화, 나쁜 향미 억제 등의 목적에 사용되어 왔으며, 방충제, 곰팡이 방제 등의 목적으로 이용되고 있다. 정향의 생리활성으로는 백혈병 세포 분화에 미치는 효과, 알레르기 반응 억제 효과 등이 보고되었으며, 항산화, 항균, 항바이러스 효과 등이 알려져 있다(이진만 및 허상선, 2014).

단향(檀香)은 단향과에 속하는 상록교목으로 샌달우드라고도 불린다. 단향은 달콤하고 감미로운 향을 가지고 있고 지속성이 우수하여 방향제로 많이 이용되고 있다. 또한 예로부터 종교적 행사의 향료, 불상 등의 재료로서 신성하게 여겨졌으며 다양한 공예품의 원료로 사용되어왔다. 단향의 생리활성으로는 항바이러스, 항암, 진통감소, 항산화 효과 등이 알려져 있다(김태훈, 2008).

생약소재는 우수한 효능을 바탕으로 예로부터 다양한 질병의 예방, 진단, 개선 및 치료에 사용되어 왔으며, 사용자의 건강을 유지하고 삶의 질을 개선하는데 도움을 주고 있다. 최근 연구를 통해 기존에 알려진 효능뿐만 아니라 생약이 보유한 다양한 생리활성이 과학적으로 검증되고 있으며, 피부상태 개선 효능에 대해서도 다수의 연구가 진행되고 있다.

인삼(人蔘)은 오갈피나무과에 속하는 다년생 초본으로 뿌리를 중요한 약재로 사용하며 다양한 약재와 함께 처방되어 수많은 병증의 치료제로서 고대로부터 현재까지 사용되고 있는 가장 중요한 생약재 중 하나이다(이상명, 2014). 인삼의 주요 생리활성으로는 항스트레스, 면역기능 증강, 활력증진 및 항암 효과 등이 있으며, 피부와 관련된 효능으로는 항주름, 피부노화 억제, 미백 효능 등이 알려져 있다(이미정 외, 2008; 이현정 외, 2010).

감초(甘草)는 콩과에 속하는 다년생 초본으로 건조시킨 뿌리를 약재로 사용한다. 우리나라에서 가장 보편적으로 사용되어 온 한방처방집인 방약합편(方藥合編) 수재생약 293종 중 한약처방 빈도가 가장 높은 생약재이다(이상명, 2014). 감초는 중화 및 해독작용을 하는 것으로 알려져 있고, 피부와 관련해서는 콜라겐 생성 촉진, 미백, 항염, 항여드름, 항산화, 상처치유 등의 효능이 보고된 바 있다(이진영 외, 2012; Baocheng Hao et al., 2020).

육계(肉桂)나무는 녹나무과에 속하는 상록교목으로 주로 체질이 허약하고 기혈이 허한 사람을 위한 한방약재로 사용되고 있다. 또한 혈압강하, 진경작용, 혈당상승, 항알러지, 위장병 개선 등의 효과가 알려져 있다(박관하 외, 2001; 차재윤 외, 2018). 최근에는 육계의 우수한 항산화, 항염, 항히스타민, 항균 및 미백 효과가 보고되었으며, 천연 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 확인된 바 있다(이영숙 및 유민정, 2019).

복령은 구멍장이버섯과에 속하는 담자균류 버섯으로 침엽수, 특히 소나무의 뿌리에 기생하여 땅속에서 균사가 뭉쳐서 자란다. 예로부터 복령은 만성위염 완화, 이뇨작용, 면역증강, 식욕증진, 혈당강하, 정신안정 및 심장수축작용 등에 탁월한 효능이 있어 한방에서 많이 사용되어 온 생약 중의 하나이다(손미예, 2007). 또한 복령은 피부암에 효과가 있으며 항산화, 주름개선, 항염증, 미백, 항노화 등의 피부기능 개선 효과를 나타낸다고 알려져 있다(장영아 및 이진태, 2015; Chien-Liang Fang et al., 2020).

천문동(天門冬)은 백합과에 속하는 다년생 초본으로, 항염증, 이뇨, 진해, 항균, 신경안정, 타액분비 촉진, 해열 등의 다양한 치료효과가 있어 예로부터 전통한방의학에서 진정제 및 안정제와 같은 부가적인 효과와 함께 간염, 천식, 뇌질환, 피부염과 관련하여 염증질환을 치료하기 위해 이용되어왔다. 피부 생리활성과 관련된 연구 결과로는 피부염증 억제 효과, 항산화 효과 등이 알려져 있다(구경윤 외, 2016).

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 유향나무, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계나무, 복령 및 천문동 복합추출물은 다음과 같이 제조된다. 먼저 건조된 유향나무, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계나무, 복령 및 천문동을 혼합하여 혼합물을 제조한다.

이때, 유향나무의 껍질, 검(gum) 및 수지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 사용되며, 배초향의 전초, 줄기, 잎 및 캘러스(callus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 사용되며, 목향의 전초가 사용되며, 클로브의 전초, 줄기, 껍질, 싹, 꽃, 꽃봉오리 및 잎으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 사용되며, 단향의 전초, 목부 및 씨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 사용된다. 또한 인삼의 뿌리, 열매, 씨, 잎, 싹, 캘러스, 꽃 및 줄기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 사용되며, 감초의 전초, 뿌리, 싹, 잎 및 줄기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 사용되며, 육계나무의 껍질 또는 잎이 사용되며, 복령의 균핵, 자실체 및 균사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 사용되며, 천문동의 전초 또는 뿌리가 사용된다.

상기 유향, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계, 복령 및 천문동은 각각 1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되며, 동일 중량비로 혼합되어 추출되는 경우에 가장 우수한 활성을 나타내므로 더욱 바람직하다.

이어서 상기 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글라이콜 및 부틸렌글라이콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매를 가하여 통상의 방법에 따라 추출하고, 여과하고 건조하여 복합추출물을 제조한다. 상기 복합추출물은 각각의 추출물을 제조한 후, 상기 비율로 혼합하여 제조될 수도 있다.

이와 같이 제조되는 상기 유향나무, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계나무, 복령 및 천문동 복합추출물은 상승효과에 의하여 이들 각각의 추출물, 유향나무, 배초향, 목향, 클로브 및 단향의 방향성 식물 복합추출물 및 인삼, 감초, 육계나무, 복령 및 천문동의 생약소재 복합추출물과 비교하여 더욱 우수한 항균효과, 각질형성세포 이동 촉진효과, 멜라닌 생성 억제 및 콜라겐 생성 증가 효능을 나타내었다.

구체적으로는 본 발명의 상기 유향나무, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계나무, 복령 및 천문동 복합추출물은 피부유래 세포주의 생존률에 영향을 미치지 않으면서(시험예 1), 피부에 병변을 일으킬 수 있는 S. aureus의 세포막 손상과 사멸을 유도하고(시험예 2, 3), C. acnes의 바이오필름(biofilm) 생성을 억제하는 효능이 우수하였다(시험예 4). 또한 피부 각질형성세포 이동 촉진 효과(시험예 5), 멜라닌 생성 억제효과(시험예 6) 및 콜라겐 생성 증가 효과가 우수하였다(시험예 7). 또한 이들 복합추출물을 세럼 및 크림 제형에 적용하였을 때 실온, 냉장, 항온 조건에서 제형안정성을 나타내었다(시험예 8). 그러므로 상기 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항균용, 피부재생용, 피부미백용 또는 피부 주름개선용 화장품으로 유용하게 사용될 수 있다.

유효성분으로서의 상기 복합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 여성청결제, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1 - 5: 유향나무, 배초향, 목향, 클로브, 단향 추출물의 제조

건조된 유향나무 수지(제조예 1), 배초향 전초(제조예 2), 목향 전초(제조예 3), 클로브 꽃(제조예 4), 단향 전초(제조예 5) 각 100 g에 추출용매로서 정제수 : 부틸렌글라이콜 = 70:30 (w/w) 혼합용액 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80~100℃로 가열하여 2시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 각각 제조하였다.

제조예 6 - 10: 인삼, 감초, 육계나무, 복령, 천문동 추출물의 제조

건조된 인삼 뿌리(제조예 6), 감초 뿌리(제조예 7), 육계나무 껍질(제조예 8), 복령 균핵(제조예 9), 천문동 뿌리(제조예 10) 각 100 g에 추출용매로서 정제수 : 부틸렌글라이콜 = 70:30 (w/w) 혼합용액 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80~100℃로 가열하여 2시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 각각 제조하였다.

실시예 1 - 6: 복합추출물의 제조

건조된 유향나무 수지, 배초향 전초, 목향 전초, 클로브 꽃, 단향 전초, 인삼 뿌리, 감초 뿌리, 육계나무 껍질, 복령 균핵 및 천문동 뿌리를 하기 표 1의 중량비로 혼합한 혼합물 100g에 추출용매로서 정제수 : 부틸렌글라이콜 = 70:30 (w/w) 혼합용액 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80~100℃로 가열하여 2시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 복합추출물을 제조하였다.

원물	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	실시예 6
유향나무	1	-	1	1	2	1
배초향	1	-	1	2	1	1
목향	1	-	1	2	2	1
클로브	1	-	1	1	1	2
단향	1	-	1	1	1	1
인삼	-	1	1	1	1	2
감초	-	1	1	2	1	1
육계나무	-	1	1	2	2	1
복령	-	1	1	1	2	1
천문동	-	1	1	1	1	2

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

세포 독성 여부를 확인하기 위해 각질형성세포주인 HaCaT와 섬유아세포인 NHDF(normal human dermal fibroblast)를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 배양하였으며 96 well plate에 각각 5×10⁵ 및 3×10⁴의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 추출물을 시료농도가 1% 및 2%가 되도록 처리하고 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide, Sigma) 용액을 각 well에 100㎖씩 첨가한 후(3 ㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 ㎕의 디메틸 설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존률은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

세포생존률(%) = 시료첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도 × 100

구분	세포생존률(%)
	HaCAT		NHDF
	1 %	2 %	1 %	2 %
제조예 1	99	97	102	99
제조예 2	98	96	101	98
제조예 3	100	98	100	100
제조예 4	100	100	101	100
제조예 5	101	99	99	100
제조예 6	99	97	98	97
제조예 7	98	100	100	97
제조예 8	97	99	99	100
제조예 9	99	97	98	97
제조예 10	100	99	100	99
실시예 1	101	97	102	101
실시예 2	100	98	101	100
실시예 3	99	97	98	100
실시예 4	99	99	101	100
실시예 5	102	98	102	99
실시예 6	100	101	99	97

상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 제조예 및 실시예 모두에서 95% 이상의 세포생존율을 나타냄에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않았고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2: S. aureus 세포막 손상 유도 효과 확인

실험에 사용한 S. aureus 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC; Korea Collection for Type Culture)로부터 분양받았으며, 액체배지 또는 고체배지에서 증식한 신선한 배양균으로 2~3일 연속적인 계대 후에 사용하였다. 균주가 함유된 액체배지에 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 추출물을 시료농도가 1% 및 2%가 되도록 처리하고 35℃의 호기조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 0.22 μm pore size의 필터로 여과하고 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 S. aureus의 세포막 손상에 의한 DNA/RNA 누출량을 확인하였다. S. aureus의 세포막 손상률은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

S. aureus의 세포막 손상률(%) = ((시료첨가군의 흡광도－대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도) × 100

구분	S. aureus 세포막 손상률(%)
	1 %	2 %
제조예 1	13	24
제조예 2	14	25
제조예 3	12	22
제조예 4	15	23
제조예 5	13	24
제조예 6	5	13
제조예 7	8	15
제조예 8	4	13
제조예 9	6	17
제조예 10	7	14
실시예 1	28	35
실시예 2	19	28
실시예 3	36	47
실시예 4	30	38
실시예 5	32	38
실시예 6	31	36
1,2-Hexanediol	-	57

상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예 1~6의 복합추출물은 제조예 1~10의 각각의 추출물과 비교해 볼 때, S. aureus 균주의 세포막을 손상시키는 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 실시예 1의 방향성 식물의 복합추출물이 실시예 2의 생약소재 복합추출물보다는 더욱 우수한 효능을 나타내었으며, 이들이 모두 혼합되어 제조된 실시예 3의 복합추출물에서 가장 우수한 세포막 손상 유도 효능을 확인할 수 있었다.

시험예 3: S. aureus 에 대한 항균 효과 확인

24 well plate에 S. aureus 균주를 분주한 후, 제조예 및 실시예의 추출물을 1% 및 2%의 농도로 처리하고 35℃의 호기조건에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 배양배지를 96 well plate에 옮겨서 600 nm에서 흡광도를 측정함으로써 S. aureus의 사멸 정도를 확인하였다. S. aureus의 사멸 촉진을 통한 항균효과는 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

S. aureus에 대한 항균효과(%) = ((대조군의 흡광도－시료첨가군의 흡광도)/대조군의 흡광도) × 100

구분	S. aureus에 대한 항균효과(%)
	1 %	2 %
제조예 1	13	24
제조예 2	16	29
제조예 3	15	26
제조예 4	18	27
제조예 5	16	26
제조예 6	4	12
제조예 7	3	11
제조예 8	6	13
제조예 9	8	16
제조예 10	5	15
실시예 1	35	48
실시예 2	25	31
실시예 3	43	55
실시예 4	37	53
실시예 5	39	53
실시예 6	37	51
1,2-Hexanediol	-	61

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 복합추출물은 제조예 1~10의 각각의 추출물과 비교해 볼 때 S. aureus 균주에 대한 항균효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 특히 5가지 방향성 식물과 5가지 생약소재의 복합추출물인 상기 실시예 3에서 가장 우수한 항균효능을 나타내었다.

시험예 4: C. acnes 의 biofilm 생성 억제 효과 확인

24 well plate에 C. acnes 균주를 분주한 후, 제조예 및 실시예의 추출물을 1% 및 2%의 농도로 처리하고, 35℃의 혐기조건에서 72시간 동안 배양하였다. 이후 배양배지를 제거하고 well을 인산완충용액으로 세척하였다. Well에 0.1% crystal violet 용액을 넣고 20분간 염색한 후 well을 인산완충용액으로 세척하고 에탄올을 첨가하여 well에 남아있는 crystal violet을 용해하였다. 용해액을 96 well plate에 옮겨서 590 nm에서 흡광도를 측정함으로써 C. acnes의 biofilm 생성 정도를 확인하였다. C. acnes의 biofilm 생성억제율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 5에 나타내었다.

C. acnes의 biofilm 생성억제율(%) = ((대조군의 흡광도－시료첨가군의 흡광도)/대조군의 흡광도) × 100

구분	C. acnes의 biofilm 생성억제율(%)
	1 %	2 %
제조예 1	16	26
제조예 2	18	25
제조예 3	17	27
제조예 4	18	26
제조예 5	17	28
제조예 6	11	19
제조예 7	12	18
제조예 8	12	17
제조예 9	14	20
제조예 10	13	18
실시예 1	24	35
실시예 2	19	30
실시예 3	31	45
실시예 4	27	38
실시예 5	26	38
실시예 6	28	39
1,2-Hexanediol	-	54

상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예 1~6의 복합추출물은 제조예 1~10의 각각의 추출물과 비교해 볼 때 C. acnes의 biofilm 생성을 억제하는 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 실시예 1의 방향성 식물 복합추출물이 실시예 2의 생약소재 복합추출물보다 더욱 우수한 효능을 나타내었으며, 이들이 모두 혼합되어 제조된 실시예 3의 복합추출물에서 가장 우수한 biofilm 생성 억제 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

시험예 5: 각질형성세포의 이동 촉진 효과 확인

피부의 상처치유 과정에서 피부재생을 위하여 각질형성세포, 섬유아세포 등이 이동하게 되고, 이들은 다양한 세포 외 기질을 합성하여 피부 복원에 중요한 역할을 담당한다. 본 발명 제조예 및 실시예의 피부손상 회복 및 피부재생 효능을 확인해보기 위해 인간 각질형성세포주 HaCaT가 사용되었으며, ATCC(USA)로부터 구매하였다. 세포 배양을 위해 100 unit/ml의 penicillin, 100 ㎍/ml의 streptomycin 및 10% fetal bovine serum(FBS)가 함유된 DMEM을 사용하였으며, 37℃ 및 5% CO₂가 유지되는 습윤배양기에서 세포를 배양하였다. HaCaT 세포주를 2 × 10⁵ cells/well의 비율로 24 well plate에 가한 후 well에 가득 찰 때까지 배양하였다. 이후 well의 가운데 라인에 200 ㎕ pipette tip으로 바닥이 보이도록 긁어준 후 인산완충용액을 이용하여 세척하고 제조예 및 실시예의 추출물을 1% 및 2%의 농도로 처리하였다. 세포를 긁어낸 부위에서 세포가 이동하여 생긴 세포간 거리를 Image J software를 이용하여 수치화 시켰으며, 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

구분	세포간 거리(%)
	1 %	2 %
제조예 1	89	64
제조예 2	83	61
제조예 3	85	62
제조예 4	88	66
제조예 5	87	61
제조예 6	74	54
제조예 7	78	60
제조예 8	73	57
제조예 9	70	52
제조예 10	74	53
실시예 1	62	47
실시예 2	57	40
실시예 3	49	31
실시예 4	54	38
실시예 5	55	36
실시예 6	53	35

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예 1~6의 복합추출물은 제조예 1~10의 각각의 추출물과 비교해 볼 때, 각질형성세포의 이동을 촉진하는 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 실시예 2의 생약소재 복합추출물이 실시예 1의 방향성 식물 복합추출물보다는 우수한 효능을 나타내었으며, 이들이 모두 혼합되어 제조된 실시예 3의 복합추출물에서 가장 우수한 각질형성세포 이동 촉진 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

시험예 6: 멜라닌 생성 억제 효과 확인

B16F10 세포를 24 well plate에 각각 4×10⁵의 세포 농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)으로 1회 세척한 후, PBS를 각 well에 1 ml 씩 넣었다. 본 발명의 제조예 및 실시예 1~6의 추출물 시료를 각각 1% 및 2%로 배지에 첨가하여 세포에 처리한 후 72시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로는 arbutin을 사용하였으며 샘플은 매일 1회 교체하였다.

멜라닌 생성 억제율을 확인하기 위해 배지를 제거하고 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 이후 1 N의 NaOH를 각 well에 500 μl 씩 첨가하고 30분간 shaking하여 생성된 멜라닌을 녹여 multimicroplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 생성 억제율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 7에 나타내었다.

멜라닌 생성 억제율(%) = ((대조군의 흡광도－시료첨가군의 흡광도)/대조군의 흡광도) × 100

구분	멜라닌 생성 억제율(%)
	1 %	2 %
제조예 1	21	33
제조예 2	24	34
제조예 3	19	32
제조예 4	20	35
제조예 5	25	37
제조예 6	36	48
제조예 7	35	51
제조예 8	37	50
제조예 9	39	52
제조예 10	37	49
실시예 1	51	59
실시예 2	62	71
실시예 3	67	76
실시예 4	64	72
실시예 5	63	74
실시예 6	63	72
Arbutin	79	-

상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예 1~6의 복합추출물은 제조예 1~10의 각각의 추출물과 비교해 볼 때 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5가지 방향성 식물과 5가지 생약소재의 복합추출물인 상기 실시예 3에서 가장 우수한 멜라닌 생성 억제 효능을 나타내었다.

시험예 7: Procollagen type 1 생성증가 효능 확인

Procollagen type 1의 생성 억제 효능을 확인하기 위해 인간 섬유아세포인 NHDF 세포를 24 well plate에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 추출물을 시료농도가 1% 및 2%가 되도록 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 Procollagen type I c-peptide EIA kit(TAKARA, MK101)를 사용하여 procollagen type 1의 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척한 후 1N NaOH로 용해시켜 총 단백질 양을 측정하여, 일정 단백질 당 procollagen type-1의 생성량을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

구분	Procollagen type 1 생성량/총 단백질량
	1%	2%
대조군	4.8
제조예 1	5.4	5.9
제조예 2	5.3	6.1
제조예 3	5.6	6.2
제조예 4	5.6	6.3
제조예 5	5.5	6.0
제조예 6	6.9	7.9
제조예 7	6.7	7.6
제조예 8	6.5	7.6
제조예 9	6.8	8.0
제조예 10	6.7	7.8
실시예 1	7.2	8.1
실시예 2	7.8	8.4
실시예 3	8.7	9.3
실시예 4	8.0	8.7
실시예 5	8.2	8.9
실시예 6	8.2	8.8

상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예 1~6의 복합추출물은 제조예 1~10의 각각의 추출물과 비교해 볼 때 procollagen type 1의 생성을 더욱 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 2의 생약소재 복합추출물이 실시예 1의 방향성 식물 복합추출물보다 더 우수한 효능을 나타내었으며, 이들이 모두 혼합되어 제조된 실시예 3의 복합추출물에서 가장 우수한 콜라겐 생성 증가 효능을 나타내었다.

실시예 7: 복합추출물을 함유하는 세럼의 제조

상기 실시예 3의 복합추출물을 함유한 세럼을 하기의 표 9의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료(중량%)	실시예 7
복합추출물(실시예 3)	1.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
미네랄 오일	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

실시예 8: 복합추출물을 함유하는 크림의 제조

상기 실시예 3의 복합추출물을 함유한 크림을 하기의 표 10의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료(중량%)	실시예 8
복합추출물(실시예 3)	1.0
시어버터	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
미네랄 오일	10.0
디메치콘	3.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
세테아릴알코올	2.0
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.25
트리에탄올아민	0.25
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

시험예 8 : 제형안정도 확인

상기 실시예 7 및 8에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인 하였으며, 결과는 하기 표 11에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인(12주 보관)
	실시예 7			실시예 8
	변색	변취	분리	변색	변취	분리
실온(25℃)	0	0	0	0	0	0
냉장(4℃)	0	0	0	0	0	0
항온(50℃)	0	0	0	0	0	0

< 제형 안정 등급 >

0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화

상기 표 11에서 나타낸 바와 같이 실시예 7 및 8 제형 모두 25℃, 4℃ 및 50℃ 온도 조건 하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.

Claims (8)

1. 유향, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계, 복령 및 천문동이 각각 동일 중량비율로 혼합되어 추출 제조되는 유향, 배초향, 목향, 클로브, 단향, 인삼, 감초, 육계, 복령 및 천문동 복합추출물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유하는 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항균용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 재생용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.