KR102281213B1 - 포괄적인 세포 용해를 위한 조합된 용해 프로토콜 - Google Patents

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Abstract

세 용해 단계-(1) 가열, (2) 계면활성제, 및 (3) 염기-를 단일 단계로 조합하고, 단기간 내에, 예컨대, 수분 이내에 완료될 수 있는, 세포, 예컨대, 마이크로바이옴에 존재하는 박테리아를 용해시키는 방법을 개시한다. 본 방법은 보통은 불상용성인 계면활성제 및 염기 용해를 조합하고, 용해 이후의 계면활성제 제거를 간소화시킬 수 있고, 중요하게는 용해시키기 어려운 박테리아로부터의 게놈 DNA (gDNA)를 개선된 양으로 수득한다.

Description

포괄적인 세포 용해를 위한 조합된 용해 프로토콜
세포 내부로부터 게놈 DNA (gDNA)를 유리시키거나, 또는 추출하기 위해 세포를 용해시키는 방법을 개시한다. 개시된 방법은 단일 튜브에서 가열, 계면활성제(detergent) 및 염기를 조합하고, 수분 이내에 완료될 수 있다. 본 방법은 보통은 불상용성인 계면활성제 및 염기를 조합하여 용해 이후, 추가 단계 없이 계면활성제의 제거를 용이하게 하며, 이러한 조합은, 예를 들어 마이크로바이옴 샘플 중 용해시키기 어려운 박테리아로부터의 gDNA의 표시를 개선시킴과 동시에 단계 수 및 실제 시험 수행 시간을 크게 단축시키는, 순차적인 처리 프로토콜에서는 없었던 예상 밖의 시너지를 생성한다.
다수의 세포 기반 및 DNA 기반 분석 방법은 분석을 용이하게 하기 위해 세포 내부로부터 DNA를 유리시키는 것을 필요로 한다. DNA를 유리시키기 위해 세포를 오픈하는 것이 '용해'로 불린다. 예를 들어, DNA 서열분석 기술을 사용하여 마이크로바이옴을 연구하는 데 사용되는 방법은 먼저 DNA를 추출할 수 있도록 미생물 용해를 필요로 한다. 대부분의 마이크로바이옴은 용해 기술에 대한 그들의 감수성에 있어 큰 차이를 보이는 박테리아, 고세균 및 진균으로 이루어진 군집이다. 차별적인 감수성이, 용해시키기 가장 어려운 (보통은 그람 양성) 박테리아 및 가장 쉬운 (보통은 그람 음성) 박테리아는 원래의 샘플 중 그의 집단에 비례하여 표시된다는 것을 확신하기를 원하는 연구원들에게는 상당한 문제를 제기한다. 불행하게도, 대부분의 미생물 용해 프로토콜은 일부 미생물에 대해서는 우수한 작용 효과를 보이지만, 그 나머지에 대해서는 불량하다. 추가로, 플라스미드 DNA를 회수하는 데 사용되는 신속하고, 간단한 알칼리성 용해 기술은 전형적으로 또한 마이크로바이옴 스크리닝을 위한 표적이 되는 미생물 게놈 DNA도 제거한다 (알칼리성 용해는 세포를 오픈하지만, gDNA를 제거한다 - 문헌 [Birnboim , H.C . and Doly , J, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res. 7(6), 1979, 1513-1524]; KOH 용해는 박테리아 게놈 DNA를 회수한다 - 문헌 [Raghunathan, Arumugham et al. "Genomic DNA Amplification from a Single Bacterium." Applied and Environmental Microbiology 71.6 (2005): 3342-3347. PMC. Web. 29 Sept. 2016]). 리소자임 (펩티도글리칸 세포벽에 대한 효소적 공격), 강염기 (화학적 공격), 계면활성제 (세포막 가용화), 비드 비팅 또는 진탕 (기계적 파괴) 및 가열을 비롯한 상이한 생화학적 방법에 기반한, 세포 무결성을 공격하는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있는 용해 기술이 다수 존재한다 (마이크로바이옴에 대한 용해 기술 비교 - 문헌 [Sanqing Yuan , Dora B. Cohen, Jacques Ravel, ZaidAbdo, Larry J. Forney. Evaluation of Methods for the Extraction and Purification ofDNA from the Human Microbiome. PLoS ONE 7(3): e33865. doi: 10.1371 /journal. pone.0033865]; DNA 추출 방법은 마이크로바이옴 프로파일링 결과에 영향을 미친다: 문헌 [Wagner Mackenzie B, Waite DW, Taylor MW. Evaluating variation in human gut microbiota profiles due to DNA extraction method and inter-subject differences. Frontiers in Microbiology. 2015;6: 130. doi: 10.3389/fmicb.2015.00130]). 공개 또는 상업적으로 이용가능한 DNA 제조 방법들은 대부분, 일반적으로는 특히 한 번에 다수의 샘플을 취급할 경우에는 상당한 시간이 소요될 수 있는 순차적인 단계로 세포를 용해시키는 데 상기 방법들 중 하나 이상의 것을 사용한다. 불완전하거나, 또는 부분적인 용해를 통해서도 수행되는 프로토콜에 충분한 DNA를 수득하는 적용 경우에는 보통 개별 용해 방법이 충분하지만, 대개는 마이크로바이옴 샘플로부터의 DNA를 원래의 군집에 비례하여 수득하지는 못하고, 특정 미생물을 완전히 용해시키지 못할 수도 있다. 예를 들어, 계면활성제 기반의 용해는 세포벽이 약하고, 세포막은 강한 세포 세브세트는 파괴시킬 수 있지만, 세포벽이 강한 계면활성제 내성 미생물은 오픈하지 못할 수 있으며, 이로 인해 생성된 DNA 제제 중 계면활성제 내성 세포로부터의 DNA는 과소표시되거나, 또는 부재인 것으로 나타날 수 있다. 또 다른 예에서, 세포막이 강한 세포를 용해시키는 데 충분한 것인 미생물 비드 비팅는 본 프로세스에서 쉽게 용해된 세포로부터 조기에 유리된 DNA를 전단하거나, 파괴시킬 수 있다. 추가로, 각종의 용해 방법은 서로 불상용성인 경향이 있고, 조합 사용된다면, 순차적으로 수행되어야 한다. 예를 들어, 리소자임은 계면활성제 또는 강염기의 존재하에서는 작용하지 못할 것이다. 특정 계면활성제는 강염기의 존재하에서 침전한다. 비드 비팅은 가열 프로세스와 조합하기 어렵다. 개별 단점은 별개의 용해 프로토콜을 연속적으로 수행함으로써 극복될 수는 있지만, 이는 관련된 복잡성, 시간 및 비용을 증가시킨다. 중요하게는, 계면활성제, 예컨대, 소듐 도데실 술페이트 (SDS)는 용해 이후에 제거되어야 하는데, 그 이유는 SDS가 하류 DNA 조작을 방해하기 때문이다. 추가로, 특정 미생물은 프로토콜 순서에 의존하여, 순차적으로 진행되는 용해 프로토콜에 대해 내성을 띨 수 있다. 예를 들어, 펩티도글리칸 세포벽이 강한 특정 미생물은 강염기 또는 리소자임을 이용하는 초기 처리로부터 보호하는 지질 이중층으로 된 외막 외피를 가질 수 있다. 오직 다중 방법의 동시 조합만이, 또는 긴 연속적 다단계가 샘플 중 모든 미생물로부터 DNA를 수득하는 데 효과적일 수 있다.
본원에 개시된 방법은 다중 용해 방법을, 예컨대, 마이크로바이옴과 같은, 상이한 세포 성분을 함유하는 샘플 전역에 걸쳐 더욱 잘 표시하는 DNA 프로파일을 제공하는 간단하고, 신속한 프로토콜로 조합함으로써, 마이크로바이옴 연구와 같이, 비례적 용해가 요구되거나, 또는 필요한 적용 및 기술을 위한 용해를 간소화시킨다.
세 용해 단계-(1) 가열, (2) 계면활성제, 및 (3) 염기-를 단일 단계로 조합하고, 단기간 내에, 예컨대, 수분 이내에 완료될 수 있는, 세포, 예컨대, 마이크로바이옴에 존재하는 박테리아를 용해시키는 방법을 개시한다. 본 방법은 보통은 불상용성인 계면활성제 및 염기 용해를 조합하고, 용해 이후의 계면활성제 제거를 간소화시킬 수 있고, 중요하게는 용해시키기 어려운 박테리아로부터의 게놈 DNA (gDNA)를 개선된 양으로 수득한다.
본원에서는 (a) 생물학적 세포를 함유하는 수용액을 (i) 이온성 계면활성제, 및 (ii) 이온성 계면활성제를 침전시킬 수 있는 염기와 혼합하는 단계; (b) 수용액을 이온성 계면활성제를 용해시키는 데 효과적인 시간 동안 적어도 50℃로 가열하는 단계; (c) 수용액을 이온성 계면활성제를 침전시키는 데 효과적인 시간 동안 40℃ 이하로 냉각시키는 단계; 및 (d) 침전물을 수용액으로부터 분리시키는 단계를 포함하고, 여기서, 생물학적 세포로부터 유리된 DNA는 침전물 분리 후 수용액 중에 존재하는 것인, 세포로부터 DNA를 유리시키기 위해 샘플 중 세포를 용해시키는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 이온성 계면활성제는 소듐 도데실 술페이트 (SDS), N-라우로일사르코신 소듐 염, 또는 소듐 데옥시콜레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이온성 계면활성제의 농도는 약 0.1% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 이온성 계면활성제는 약 1% 농도의 소듐 도데실 술페이트 (SDS)이다.
일부 실시양태에서, 염기는 수산화칼륨 (KOH), 수산화리튬 (LiOH), 수산화나트륨 (NaOH), 수산화루비듐 (RbOH), 수산화세슘 (CsOH), 수산화칼슘 (Ca(OH)2), 수산화스트론튬 (Sr(OH)2), 및 수산화바륨 (Ba(OH)2)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 염기의 농도는 약 0.05 몰 내지 약 1 몰이다. 일부 실시양태에서, 염기는 약 0.2 몰 농도의 수산화칼륨 (KOH)이다.
일부 실시양태에서, 계면활성제는, 저온에서는 계면활성제를 침전시키지만, 고온에서는 계면활성제가 용해되도록 허용하는 염기와 조합된다.
일부 실시양태에서, 이온성 계면활성제는 1중량% 농도의 소듐 도데실 술페이트 (SDS)이고, 염기는 0.2 몰 농도의 수산화칼륨 (KOH)을 함유하는 수용액이다.
일부 실시양태에서, 가열은 약 50℃ 내지 약 100℃ 온도 범위에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 가열은 약 65℃ 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 가열은 약 95℃ 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 가열은 적어도 1분 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 가열은 적어도 0.25분 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, 냉각은 약 4℃ 내지 약 40℃ 온도 범위에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 냉각은 약 20℃ 내지 약 25℃ 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 냉각은 적어도 30초 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 냉각은 적어도 0.25분 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, 분리는 원심분리, 여과, 중력 침강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행된다.
일부 실시양태에서, 생물학적 세포는 대변, 세포 용해물, 조직, 혈액, 종양, 혀, 치아, 구강상피 세포 면봉 채취물(buccal swab), 가래, 점액, 상처 면봉 채취물, 피부 면봉 채취물, 질 면봉 채취물, 또는 미가공 샘플, 복합 샘플, 혼합물, 및 마이크로바이옴 샘플을 포함한, 인간, 동물, 식물, 또는 환경 샘플로부터 원래 수득된 임의의 다른 생물학적 물질 또는 생물학적 체액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플로부터 기원하는 것이다.
일부 실시양태에서, 생물학적 세포는 다세포 유기체, 단세포 유기체, 원핵생물, 진핵생물, 미생물, 박테리아, 고세균, 원생동물, 조류 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원하는 것이다.
도 1a는 실온에서 흰색 SDS가 수산화칼륨 (KOH+SDS) 튜브에서 침전된다는 것을 보여주는 것이다 (좌측). 우측 튜브는 KOH 부재하의 투명 용액으로서의 1% SDS를 보여주는 것이다.
도 1b는 실온에서 흰색 SDS가 수산화칼륨 (KOH+SDS) 튜브에서 침전된다는 것을 보여주는 것이다 (우측). 좌측 튜브는 NaOH 존재하의 투명 용액으로서의 1% SDS를 보여주는 것이며, 이는 NaOH가 SDS를 침전시키지 않는다는 것을 입증하는 것이다.
도 2는 8개의 마이크로바이옴 샘플에 대한 16S rRNA 유전자의 PCR 바코딩 결과를 도시한 것이다. 8개의 각 레인에서 1,500 염기 앰플리콘은 상이한 DNA 바코드로 태그부착되어 있다.
도 3은 계면활성제 및 비드 비팅의 순차적 용해 단계 또는 본원에 기술된 조합된 용해 방법을 사용하여 용해된 다중 샘플 중 문 수준에서의 평균 미생물 존재비 비교를 보여주는 그래프이다. 쇼어라인 바이오메(Shoreline Biome) 방법 사용시, 용해시키기 더 어려운 피르미쿠테스(Firmicutes)가 더 높은 존재비로 존재한다.
도 4는 계면활성제 및 비드 비팅으로 이루어진 순차적 용해 단계, 또는 본원에 기술된 조합된 용해 방법을 사용하여 용해된 다중 샘플 중 속 수준에서의 평균 미생물 존재비 비교를 보여주는 그래프이다. 이는 도 3의 문 수준 존재비가 속 수준에서의 피르미쿠테스의 양 및 다양성 증가 출현에 상응한다는 것을 입증한다.
본 발명으로 간주되는 대상은 특히 본 명세서의 마지막의 청구범위에서 명시되어 있고, 명확하게 청구된다. 본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징, 이점은 첨부된 도면과 함께 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
마이크로바이옴 중 세포, 예컨대, 박테리아 및 고세균 내부에 위치하는 DNA는 세포를 용해시킴으로써 유리될 수 있다. 마이크로바이옴을 연구하기 위해, 표적 마이크로바이옴 중 세포를 용해시키고, 그 후, 본 설명에서 생성된 DNA는 직접 서열분석될 수 있거나 ('샷건' 서열분석, 제시되지 않음), 또는 PCR 증폭에서, 모든 박테리아 및 고세균에 존재하는 유전자 영역, 예컨대, 16S rRNA 유전자를 표적화하는 주형으로서 사용될 수 있다. 16S 유전자는 샷건 방법보다 ~1000x 더 적은 회차의 서열분석을 필요로 하면서, 미생물에 대한 '핑커프린트' 식별 방법으로서 사용될 수 있기 때문에, 본원에서 예로서 사용된다. 미생물은 모두 그러한 것은 아니지만, 대개의 박테리아 및 고세균에서 경미한 차이를 보이는 그의 16S rRNA 유전자 서열을 사용함으로써 확인될 수 있다. 16S 유전자 서열 변이는 개별 박테리아 및 고세균 종이 상기 종 또는 계통에 대한 식별자로서 작용하는 16S rRNA 유전자에 특징적인 DNA 변이 ('핑거프린트')를 가진다는 것을 의미한다. 키트, 프로토콜 및 소프트웨어를 통해 샘플 중의 미생물을 포괄적으로 핑거프린팅할 수 있고, 전장의 16S rRNA 유전자를 사용하여 고해상도로 한 번에 많은 샘플을 동시에 16S rRNA 핑거프린팅할 수 있다 (예를 들어, 마크 드리스콜(Mark Driscoll) 및 토마스 자르비에(Thomas Jarvie)에 의한, 미국 가특허 출원 번호 62/266,072 (발명의 명칭: "Methods for DNA Preparation for Multiplex High Throughput Targeted Screening") 참조, 상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다). 공지된 미생물은 16S 유전자의 DNA 서열을 공지된 리드의 데이터베이스로 맵핑함으로써 서열분석 후 확인될 수 있다. 알려지지 않은 미생물은 데이터베이스에서 어느 미생물과도 상이한 16S DNA 서열을 함유하겠지만, 이는 그의 고유 16S 서열을 사용하여 추적될 수 있다. 추가로, 샘플 중 각 미생물에 대하여 수득된 리드의 개수를 통해 샘플 중 각 미생물의 상대 존재비를 밝혀낼 수 있다. 특정 미생물의 상대 존재비는 각 개별 마이크로바이옴의 상태를 나타내는 중요한 지표가 될 수 있다. 미생물의 상대 존재비를 변화시키거나, 또는 특정 미생물로부터 완전히 DNA를 누락시키는 용해 기술은 연구되는 마이크로바이옴의 상태를 부정확하게 특징화하는 서열분석 결과를 초래할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 샘플로부터 미생물의 정확한 상대 존재비를 수득하는 데 사용될 수 있다.
용해 프로세스는, 16S rRNA 유전자 증폭 없이 용해 이후에 DNA 서열분석을 수행하는 '샷건' 마이크로바이옴 서열분석을 위해서도 사용될 수 있다. 샷건 방법은 연구원이 박테리아 및 고세균으로부터 16S 유전자만이 아닌 샘플 내 모든 DNA 서열을 판독하고자 하는 경우에 사용된다. 예를 들어, 고심도 샷건 마이크로바이옴 DNA 서열분석을 통해 알려지지 않은 박테리아/고세균 뿐만 아니라, 진균, 또는 다세포 진핵생물, 바이러스 DNA, 또는 임의의 다른 DNA 함유 유기체로부터의 전체 DNA 게놈 서열을 밝혀낼 수 있다. 전체 박테리아 게놈의 길이는 (16S 유전자보다 수천 배 더 큰) 수백만 개의 염기 길이일 수 있고, 진균 게놈의 길이는 1억 개 초과의 염기 길이일 수 있고, 진핵성 게놈의 길이는 수십억 개의 염기 길이일 수 있기 때문에, 샷건 마이크로바이옴 프로파일은 16S rRNA 유전자 마이크로바이옴 프로파일보다 수천 배 더 많은 서열분석과, 그에 상응하는 더 많은 시간과 비용을 필요로 할 수 있다. 비록 본 실시예에서는 오직 16S 프로파일링 방법만이 논의되고 있지만, 본원에 기술된 용해 프로토콜은 샷건 및 16S rRNA 마이크로바이옴 서열분석 접근법 둘 다에 동일한 이점을 제공한다.
하기는 16S rRNA 유전자 마이크로바이옴 서열분석 접근법에 대한 개시된 방법의 예이다:
단계 1. 2중량%의 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 함유하는 수용액에 마이크로바이옴 샘플을 분산시켰다.
단계 2. 0.4 M KOH를 첨가하였고, SDS 계면활성제가 흰색 응집체로서 침전하였다. 상기 예에서, 계면활성제 (1% SDS)는 염기 (0.2 M KOH)에 의해 침전된다.
단계 3. 튜브를 마개로 덮고, 가열하였다 (온도 범위는 약 50℃ 내지 약 100℃일 수 있다). SDS 50℃ 초과의 온도에서는 용해된다. 가열 및 KOH가 펩티도글리칸 세포벽을 공격하고, KOH 및 가열의 손상 효과로부터 미생물을 보호하는 막을 SDS가 가용화시킨다. 본원에 기술된 조합된 노출과 대조적으로, KOH, SDS, 및 가열에의 순차적인 노출은 미생물 세포벽 및 막의 구조화된 방식에 기인하여 동일한 결과를 얻을 수 없기 때문에, 상기의 단계 조합이 시너지가 있다. 가열은 SDS가 실제로 강염기 존재하에서 작용할 수 있게 허용하며, 그 결과로 3개의 상이한 용해 기술의 독특한 동시 조합이 이루어질 수 있다.
단계 4. 가열 후, 샘플을 다시 실온 (예컨대, 40℃ 미만)으로 복귀시켜 SDS 계면활성제를 침전시켰다.
단계 5. 샘플을 짧게 원심분리하여 SDS 계면활성제를 펠릿화하였다 (첨가 필요 없음, 계면활성제의 신속한 제거).
단계 6. 500 mM 트리스 완충제 또는 등가물 (pH 8.5)을 함유하는 튜브로 상청액을 이동시켰다. 이제, 유리된 DNA는 (하기 기술되는 바와 같은) 16S rRNA PCR에 의한 분석을 위해 준비된 상태이거나, 또는 보관되거나, 다른 용도로 추가로 정제될 수 있다.
고유 DNA 바코드를 각 샘플에 배정하는 방법인 PCR 증폭을 각 DNA 샘플에 대하여 수행하였다. 8개의 상이한 마이크로바이옴에 대한 PCR 반응의 예가 도 2에 제시되어 있으며, 여기서, 인간 대변 샘플 1-8을 상기 단계 1-6에 기술된 프로토콜에 따라, 또는 순차적인 계면활성제/비드 비팅 단계를 포함하는 표준 프로토콜에 의해 용해시켰다. 각 샘플을 각 샘플에 대하여 상이한 DNA 바코드와 함께, 1,500 bp 16S rRNA 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 후, 샘플을 DNA 서열분석을 위해 풀링하였다. 각 샘플로부터의 리드는 고유 식별 DNA 바코드를 함유하였는 바, 이는 서열분석 이후 샘플에 따라 분류될 수 있다. 서열분석기에 의한 판독 결과는 바코드를 이용하여 샘플에 따라 분류하고, 데이터베이스로 맵핑하여 공지된 미생물, 알려지지 않은 미생물, 및 각 샘플 내 그의 상대적 비율을 확인시켜 준다.
바코드에 의해 기원 샘플로 분류하고, 속에 의해 확인하고, 리드에 관한 소프트웨어 분석에 의해 각 속에 대한 리드 개수를 정량화한 후, 각 마이크로바이옴의 리드를 비교하였다. 실험 디자인에 따라, 결과를 비교할 수 있는 방법은 다수 존재한다. 도 3에서, 마이크로바이옴 중 각 미생물에 대한 양은 두 샘플의 경우 100% 누적 막대 플롯에 포함된다. 이 방법을 통해 마이크로바이옴을 간단하게 직접 비교할 수 있다. 다른 유용한 비교로는 문 수준 차이, 종 또는 계통 수준 차이, 또는 다른 분류상 수준을 포함한다.
다중 샘플의 경우, 계면활성제 및 비드 비팅으로 이루어진 순차적 용해 단계를 사용하는 표준 방법을 본원에 기술된 조합된 용해 방법과 비교하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, 그람 양성 피르미쿠테스의 존재비는 마이크로바이옴의 -30%에서 60% 초과로 증가하였다. 피르미쿠테스는 용해시키기 어려운 경향이 있는 강한 세포벽을 가지는 그람 양성 박테리아이다. 이는 본원에 기술된 용해 방법이 강한 세포벽을 가지는 미생물을 용해시키는 데 있어서 더욱 우수하다는 것을 입증하는 것이다. 100% 누적 막대 플롯 사용시 예상되는 바와 같이, 용해시키기 쉬운 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문 및 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia) 문은 비례하여 감소되었다.
도 4는 도 3에 제시된 것과 동일한 샘플에 대한 속 수준에서의 평균 존재비를 도시한 것이다. 도 4는 계면활성제 및 비드 비팅으로 이루어진 순차적 용해 단계를 사용하는 표준 방법 사용시 과소표시되는 피르미쿠테스에 대한 더 높은 고해상도 뷰이다. 속 수준에서의 존재비 차이에 관한 막대 플롯은 5개의 피르미쿠테스 속이 표준 순차적 용해 방법 사용시 과소표시되었고 (리스테리아(Listeria), 블라우티아(Blautia), 라크노스피라세아에 인세르타에 세디스(Lachnospiraceae Incertae Sedis), 부티로코쿠스(Butyrococcus), 루미노코쿠스(Ruminococcus)), 박테로이데스(Bacteroides) 및 아케르만시아(Akkermansia)의 상대적 표시는 표준 방법 사용시 인공적으로 높다는 것을 나타낸다. 이는 도 3에서의 문 수준 차이와 유사하며, 동시에 개별 피르미쿠테스 속 수준은 표준 방법 사용시 유의적으로 과소표시될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 다양하게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시양태도 하기 청구범위의 범주 내에 포함된다.

Claims (17)

  1. a) 샘플로부터 생물학적 세포를 함유하는 수용액을 (i) 일정량의 이온성 계면활성제(ionic detergent) 및 (ii) 일정량의 염기와 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계로서, 여기서 혼합 용액 내 이온성 계면활성제와 염기는, 혼합 용액에 이온성 계면활성제가 용해된 후에 세포의 용해를 통해 세포로부터 게놈 DNA를 유리시키는데 효과적인 농도이고, 이온성 계면활성제는 소듐 도데실 술페이트 (SDS)이고, 염기는 수산화칼륨 (KOH)인 단계;
    b) 이온성 계면활성제가 혼합물 중에 용해되는 시간 동안 혼합 용액을 약 50℃ 이상으로 가열하는 단계;
    c) 이온성 계면활성제를 침전시키는 데 효과적인 시간 동안 혼합 용액을 40℃ 이하로 냉각시켜, 이온성 계면활성제를 포함하는 침전물을 생성시키는 단계; 및
    d) 이온성 계면활성제를 포함하는 침전물을 혼합 용액으로부터 분리시키는 단계
    로 이루어진 순차적 단계를 포함하고,
    여기서, 생물학적 세포로부터 유리된 게놈 DNA가, 이온성 계면활성제를 포함하는 침전물을 혼합 용액으로부터 분리시키는 상기 단계를 통해 생성된 용액 중에 존재하고,
    여기서, 생물학적 세포로부터 유리된 게놈 DNA는 분석, PCR 증폭, 서열분석, 정제, 또는 보관될 준비가 된 것인,
    샘플 중 생물학적 세포를 용해시키는 것을 통해, 샘플 중 생물학적 세포로부터 게놈 DNA를 유리시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 혼합 용액 중의 이온성 계면활성제가 약 0.1중량% 내지 약 10중량%인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 혼합 용액 중의 이온성 계면활성제가 약 1중량%인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 혼합 용액 중의 염기가 약 0.05 몰(molar) 농도 내지 약 1 몰 농도인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 혼합 용액 중의 염기가 약 0.2 몰 농도인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 혼합 용액 중의 이온성 계면활성제가 1중량%이고, 단계 b)에서 혼합 용액 중의 염기가 0.2 몰 농도인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 약 50℃ 이상이 약 50℃ 이상 내지 약 100℃의 온도 범위인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 가열 단계가 약 95℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 가열 단계가 수행된 시간이 0.25분 이상인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 40℃ 이하가 약 4℃ 내지 40℃의 온도 범위인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 약 4℃ 내지 40℃의 온도 범위가 약 20℃ 내지 약 25℃인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 냉각 단계가 수행된 시간이 0.25분 이상인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 분리 단계가, 혼합 용액의 원심분리, 혼합 용액의 여과 및 혼합 용액의 중력 침강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 샘플이 인간, 동물, 식물, 또는 환경 유래 샘플, 미가공 샘플, 복합 샘플, 샘플의 혼합물, 및 마이크로바이옴 샘플로부터 수득된 대변, 세포 용해물, 조직, 혈액, 종양, 혀, 치아, 구강상피 세포 면봉 채취물(buccal swab), 가래, 점액, 상처 면봉 채취물, 피부 면봉 채취물, 질 면봉 채취물, 또는 생물학적 물질 또는 생물학적 체액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 샘플이 다세포 유기체, 단세포 유기체, 원핵생물, 진핵생물, 미생물, 박테리아, 고세균, 원생동물, 조류, 진균 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원하는 것인 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10428370B2 (en) * 2016-09-15 2019-10-01 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US11959125B2 (en) 2016-09-15 2024-04-16 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US11149246B2 (en) 2016-12-29 2021-10-19 Shoreline Biome, Llc Methods for cell lysis and preparation of high molecular weight DNA from modified cells
WO2020181082A1 (en) * 2019-03-07 2020-09-10 Shoreline Biome, Llc Methods for cell lysis and preparation of high molecular weight dna from modified cells
KR102370468B1 (ko) * 2020-03-18 2022-03-03 재단법인대구경북과학기술원 생체 시료 내 잔존하는 음이온 계면 활성제와 이와 결합한 지질 또는 단백질 결합체, 및 마이셀을 제거하는 조성물, 방법 및 이의 용도
WO2022015600A2 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
CN112626174B (zh) * 2020-12-16 2024-05-07 广州源井生物科技有限公司 一种细胞裂解液及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005073377A1 (ja) 2004-01-28 2005-08-11 Toudai Tlo, Ltd. 環境サンプルからのｄｎａの回収方法
JP2006517225A (ja) 2003-02-06 2006-07-20 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 核酸抽出のための生物学的試料の化学処理および該処理用のキット

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2574499A (en) * 1998-02-02 1999-08-16 Gentra Systems, Inc. Compositions and methods for using a lysing matrix for isolating dna
CN1057530C (zh) * 1998-02-12 2000-10-18 复旦大学 核酸快速抽提方法
CN1308130A (zh) * 2000-12-26 2001-08-15 李永武 从微生物细胞中制取核酸的方法
CA2477017A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Choicepoint Asset Company Selective extraction of dna from groups of cells
KR20050119128A (ko) * 2003-03-19 2005-12-20 알파 와슬만, 인크. 세포내 성분, 및 그로부터 유래된 단백질의 분리 및 축적
US8501402B2 (en) * 2003-03-24 2013-08-06 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Methods and devices for producing biomolecules
US7238522B2 (en) 2003-05-30 2007-07-03 Advisys, Inc. Devices and methods for biomaterial production
EP2333105A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-15 Koninklijke Philips Electronics N.V. Selective lysis of cells
US20130023655A1 (en) * 2010-04-08 2013-01-24 Qiagen Gmbh Method for precipitating anionic surfactant ions in the presence of nucleic acids
EP2576801B1 (en) * 2010-06-01 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Extraction of lipid from cells and products therefrom
JP5624487B2 (ja) 2011-01-31 2014-11-12 横河電機株式会社 核酸抽出方法
KR20140023326A (ko) * 2011-06-06 2014-02-26 비오까르띠 에스아 이온성 계면활성제에 의한 세포의 선택적 용해
WO2016024263A1 (en) * 2014-08-14 2016-02-18 Molecular Detection Israel Ltd. Methods for isolating microbial dna from a blood sample
US20170166956A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Shoreline Biome, Llc Methods for DNA Preparation for Multiplex High Throughput Targeted Sequencing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006517225A (ja) 2003-02-06 2006-07-20 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 核酸抽出のための生物学的試料の化学処理および該処理用のキット
WO2005073377A1 (ja) 2004-01-28 2005-08-11 Toudai Tlo, Ltd. 環境サンプルからのｄｎａの回収方法

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