KR20240003845A - Cd4+ 면역세포를 통한 hiv바이러스 치료효과 증대 - Google Patents
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Abstract
게놈 DNA(gDNA)를 방출시키거나 추출하기 위해 세포를 파쇄하는 방법 및 장치가 개시된다. 상기 방법은, 비드 비팅 파쇄 동안에 보다 큰 금속 볼 및 튜브 측면에 달라붙는 반건조 케이크를 형성하는, 미세한 유리 비드와 세포(예컨대, 포자)의 혼합물을 이용하여, 비드 비팅 공정의 효율을 크게 향상시킨다. 상기 장치는, 세포를 개방하기에 충분한 힘이 생성되고 금속 볼 충격이 용기의 내면에 걸쳐 분산되어 모든 세포 혼합물이 세포 파괴에 충분한 충격을 받도록 보장하는 무질서한 움직임을 생성한다. 결과적으로, 포자 및 그 밖의 파쇄하기 어려운 미생물을 수초 내에 개방시킬 수 있다. 이 방법은 DNA의 무결성을 유지하면서 파쇄하기 어려운 세포를 신속히 개방시킴으로써 단계의 개수 및 작업 시간을 감소시킨다.
Description
내부 세포로부터 게놈 DNA(gDNA)를 방출시키거나 추출하기 위해 세포를 파쇄하는 방법 및 장치가 개시된다. 개시된 방법은, 비드 비팅 파쇄(bead beating lysis) 동안에 보다 큰 금속 볼 및 튜브 측면에 달라붙는 반건조 케이크를 형성하는, 미세한 유리 비드와 세포(예컨대, 포자)의 혼합물을 이용하여, 비드 비팅 공정의 효율을 크게 향상시킨다. 세포가 유리 비드 및 금속 볼 상에서 케이크화되기 때문에, 볼이 용기의 측면에 부딪칠 때마다 세포가 충격을 받는다. 상기 장치는 이중의 목적으로 무질서한 움직임을 생성하도록 설계되는데, 첫째는 세포을 개방시키에 충분한 힘이 생성되도록 보장하는 것이고, 둘째는 금속 볼 충격이 용기의 내면에 걸쳐 분산되어 모든 세포 혼합물이 세포 파괴에 충분한 충격을 받도록 하는 것이다. 그 결과, 적절한 파쇄를 달성하기 위해서는 일반적으로 최대 30분 동안 비등시키거나 비팅해야 하는 포자 및 그 밖의 미생물을, 개시된 반건조 비드 비팅 방법을 이용하여 수초 내에 개방시킬 수 있다. 이 방법은 DNA의 무결성을 유지하면서 파쇄하기 어려운 세포를 신속히 개방시킴으로써 단계의 개수 및 작업 시간을 감소시킨다.
다수의 세포 기반 분석법 및 DNA 기반 분석법은, 분석을 용이하게 하기 위해서 세포 내부로부터 DNA를 포함한 세포 내용물을 방출시켜야 한다. 내용물을 방출하도록 세포를 개방시키는 것을 '파쇄'라고 지칭한다. 예를 들어, DNA 서열분석 기술을 이용하는 마이크로바이옴의 조사에 이용되는 방법은, DNA가 추출될 수 있도록 먼저
미생물의 파쇄를 필요로 한다. 대부분의 마이크로바이옴은 파쇄 기술에 대한 감수성이 매우 다양한 박테리아, 고세균 및 진균의 군집이다. 차등 감수성은, 파쇄하기 가장 힘든(일반적으로 그람 양성) 및 가장 쉬운(일반적으로 그람 음성) 박테리아가 원래의 샘플에서 그들의 개체군에 비례하여 나타나도록 보장하려는 미생물 개체군 연구자에게 큰 문제가 된다. 불행히도, 대부분의 미생물 파쇄 프로토콜은 일부 미생물에는 잘 작동하나, 그 밖의 미생물에는 잘 작동하지 않는다. (마이크로바이옴에 대한 파쇄 기술의 비교 - 문헌[Sanqing Yuan, Dora BCohen, Jacques Ravel, Zaid Abdo, Larry J Forney Evaluation of Methods for the Extraction and
Purification of DNA from the Human Microbiome PLoS ONE 7(3): e33865doi:101371/journalpone0033865]) 또한, 플라스미드 DNA를 회수하는 데 사용되는 신속하고 간단한 알칼리계 파쇄 기술은 일반적으로, 마이크로바이옴 스크리닝의 표적인 게놈 DNA도 제거한다(알칼리계 파쇄는 세포를 개방시키나, gDNA를 제거함 - 문헌[Birnboim, HC and Doly, J, A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res 7(6), 1979, 1513-1524]) 대조적으로, KOH 파쇄가 박테리아 게놈 DNA를 회수하기 위해 이용될 수 있다[Raghunathan, Arumugham et al "Genomic DNA Amplification from a Single Bacterium" Applied and Environmental Microbiology 716 (2005): 3342-3347
PMC Web 29 Sept 2016] 라이소자임(펩티도글리칸 세포벽에 대한 효소적 공격), 강염기(화학 공격), 세제(세포막을 가용화함), 비드 비팅 또는 진탕(기계적 붕괴)을 포함하는 다양한 생화학적 방법에 기초하여 세포 무결성을 공격하는, 당업계에 공지된 복수의 파쇄 기술이 있으며, 가열 DNA 추출법은 마이크로바이옴 프로파일링 결과에 영향을 미친다: 문헌[Wagner Mackenzie B, Waite DW, Taylor MW Evaluating variation in human gutmicrobiota profiles due to DNA extraction method and inter-subject differences Frontiers in Microbiology 2015;6:130 doi:103389/fmicb201500130] 대부분의 공개되었거나 상업적으로 이용 가능한
DNA 제조법은 상기 방법들 중 하나 이상을 이용하여, 특히 다수의 샘플을 한 번에 다룰 때, 일반적으로 상당한 시간이 소요될 수 있는 순차적 단계들로 세포를 파쇄한다. 수행하고자 하는 프로토콜에 있어서 불완전하거나 부분적인 파쇄도 충분한 DNA를 생성하는 적용에는 개개의 파쇄 방법이 일반적으로 충분하지만, 상기 개개의 파쇄방법은 종종 원래의 군집에 비례하여 마이크로바이옴 샘플로부터 DNA를 생성하지 않으며 특정 미생물을 완전히파쇄하지 못할 수도 있다. 예를 들어, 세제 기반의 파쇄는 약한 세포벽 및 강한 세포막을 갖는 세포의 서브세트를 파괴할 수 있으나, 강한 세포벽을 갖는 세제 저항성 미생물을 개방시키지 않아서, 생성된 DNA 조제물 중에세제 저항성 세포로부터의 DNA가 적게 나타나거나 없을 수 있다. 다른 예에서, 강한 세포막을 갖는 세포를 파쇄시키기에 충분한 미생물 비드 비팅은, 쉽게 파쇄되는 세포로부터 공정 초기에 방출되는 DNA를 전단 또는 파괴할수 있다. 또한, 다양한 파쇄 방법은 상용적이지 않은 경향이 있으며, 조합하여 이용되는 경우 순차적으로 수행되어야 한다. 예를 들어, 라이소자임은 세제 또는 강염기의 존재 하에서는 작용하지 않을 것이다. 특정 세제는강염기의 존재 하에서 침전된다. 비드 비팅은 가열 공정과 조합하기 어렵다. 별개의 파쇄 프로토콜들을 순차적으로 실행하면 개개의 단점들을 극복할 수는 있으나, 이는 관련된 복잡성, 시간 및 비용을 증가시킨다. 중요하게는, 파쇄 후에 세제, 예컨대 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 제거해야 하는데, SDS가 다운스트림 DNA 조작을 방해하기 때문이다. 또한, 특정 미생물은 프로토콜 순서에 따라, 순차적으로 실행되는 파쇄 프로토콜에 저항성이 있을 수 있다. 예를 들어, 강인한 펩티도글리칸 세포벽을 갖는 특정 미생물은 강염기 또는 라이소자임에 의한 초기 처리로부터 보호하는 지질 이중층의 외피를 가질 수 있다.
마이크로바이옴에 존재하는 박테리아와 같은 세포를 파쇄하기 위한 방법 및 장치로서, 짧은 시간, 예를 들어 1분 미만으로 완료될 수 있고, 중요하게는 박테리아 포자와 같이 파쇄하기 어려운 샘플로부터 개선된 품질 및 양의 게놈 DNA(gDNA)를 산출하는 방법 및 장치가 개시된다.
본원에 개시된 방법 및 장치는, 심지어 가장 어려운 미생물 포자(본원에는 바실러스 서브틸리스(Bacillussubtilis) 포자가 예로서 기재되어 있음)를 비롯한 세포들을 파쇄하도록 신속하게 작용하는 비드 비팅 절차를 이용하면서도, 비례적 파쇄가 바람직하거나 필연적인 적용 및 기술, 예컨대 고분해능 마이크로바이옴 특성화에
요구되는 큰 앰플리콘을 생성하기에 충분한 크기의 DNA를 보존한다. 그 결과는, 샘플 내의 모든 세포를 균일하게 개방시켜 각종 세포 구성성분을 함유하는 샘플, 예컨대 마이크로바이옴에서 보다 전형적인 DNA 프로파일을 생성하는 단순하고 신속한 프로토콜이다.
도 5는 본원에 기재된 방법에 의한 파쇄 후, 포자로부터의 DPA 방출 및 상응하는 DNA 방출을 나타내는 그래프이다. 포자 파쇄는 도 3에서와 같이 테르븀 형광 검정을 이용하여 측정하였다. DNA 양은 도 4에서와 같이 qPCR 정량화에 의해 측정하였다. 포자는 X-축에, 상세히 기술된 바와 같이 최대 10분 동안 비드 비팅되었다.
도 1은 단일의 45 밀리미터 강재(steel) 볼 및 005 그램의 100 마이크로미터 유리 비드를 함유하는 2 밀리리터의 마이크로 원심 분리 튜브를 도시한다.
본 발명으로서 간주되는 주제는, 본 명세서의 끝맺음에 있어서 청구범위에 구체적으로 명시되고 명백하게 청구되어 있다. 본 발명의 상기 및 그 밖의 목적, 특징 및 이점은, 첨부의 도면과 함께 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
실시양태에서, 유리 비드는 40 ∼ 99 중량%의 농도로 수성 용액에 첨가된다.
Claims (1)
- 포자 파쇄의 지표로서 각 시험에 대해 DPA의 방출을 측정하였다.
10 및 55 BPS(초당 비트)에서의 진탕은 현저한 포자 파쇄가 나타냈다. 대략 6 BPS에서의 진탕은 두 시험 중 하나에 대해 현저한 파쇄로 가변적이었으며, 이는 6 BPS 초과의 속도가 바람직하다는 것을 입증한다. 양성 대조군으로서 포자를 30분간 비등시켰다.
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