KR102252855B1 - 나노화된 락토바실러스 속 사균체를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
나노화된 락토바실러스 속 사균체를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 항산회 또는 보습용 화장료 조성물에 활용될 수 있다.
Description
나노화된 락토바실러스 속 사균체를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 항산회 또는 보습용 화장료 조성물에 활용될 수 있다.
피부는 신체의 외부를 덮고 있는 하나의 막으로 여러 가지 외부의 자극, 장해, 건조 등의 환경요소로부터 신체를 보호해 주는 다양한 생리적 기능을 수행하여 내부 장기와 그 밖의 체내 기관을 보호 조절하는 역할을 한다.
그러나, 피부는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적 기능이 저하되어 신진 대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되게 된다. 또한 광 또는 열에 반복적인 노출로 인해 피부의 외양 또는 기능이 변하게 되는데, 이로 인해 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스 등은 피부의 정상 기능 저하, 멜라닌 침착에 의한 기미, 주근깨 등의 생성 및 피부 노화현상을 촉진하여 피부를 손상시키게 된다.
이러한 피부노화 및 손상을 방지하여 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위하여 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻어진 생리 활성 물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부의 고유 기능을 유지시키고 피부 세포를 활성화시켜 피부 신진대사를 촉진하여 피부 건강을 유지하고자 하는 노력이 계속되고 있으며, 이에 따른 화장품, 피부 외용제 등이 개발되고 있다.
그러나, 이들 물질은 피부 적용시 자극, 홍반, 발적 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 피부 기능 개선 효과를 기대기 어려웠다. 따라서, 기존의 피부 외용제 조성물 보다 생체에 안전하고 효과가 높은 새로운 피부 외용제 조성물의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 나노화된 락토바실러스(Lactobacillus) 속 사균체를 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항산화용 조성물을 포함하는 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 나노화된 락토바실러스 속 사균체 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 나노화된 락토바실러스(Lactobacillus) 속 사균체를 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 “사균체” 즉, 유산균의 사균체는 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어지는 생균과 대사산물들을 열처리에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록한 형태이다. 세포질cytoplasm), 세포벽(cell wall), 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균활성 물질, 다당류(polysaccharide), 유기산 등을 포함하는 것을 특징으로 한다. 유산균 사균체는 유산균 사균체, 유산균 배양물, 유산균 추출물, 유산균 균체성분 등의 용어로 사용되고 있다.
유산균 사균체는 생균과 비교하여 높은 안정성을 가지고 있다. 특히 내열성이 우수하며, 외부 환경에 대한 안정성이 높아 기존 유산균 제품보다 보관이 용이하고 유통기간을 늘일 수 있다는 장점을 가지고 있다. 따라서 사균체 제품은 건강기능식품, 식품첨가제, 의약품, 동물사료 등과 같은 기존의 유산균 생균이 적용되어 온 분야 외에도 화장품 원료로도 적용이 가능하다.
본 발명에서, “항산화”란, 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질과 산화억제물질이 균형을 이루고 있으나, 여러 가지 요인들로 인하여 이러한 균형 상태를 잃고 산화를 촉진하는 방향으로 기울게 되면, 생체 내에 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 세포손상 및 병리적 질환을 유발하게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 화학적으로 불안정하고 반응성이 높아 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 여러 생체물질과 쉽게 반응할 수 있으며, 생체 내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 암 등을 초래하게 되고, 노화의 직접적인 원인이 되기도 한다. 이러한 활성 산소종을 제거하거나 감소시킴으로써 항산화 효과를 얻어 노화를 방지하고 건강을 유지할 수 있게 된다.
한편, 본 발명에서는 제주도 김치에서 유산균을 분리하여 항산화 및 피부 보습에 효과가 우수한 미생물을 선별하였으며, 이를 동정한 결과 락토바실러스 파라플란타룸 AMI-1101(Lactobacillus paraplantarum AMI-1101), 락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(Lactobacillus plantarum AMI-1103) 및 락토바실러스 브레비스 AMI-1109(Lactobacillus brevis AMI-1109)인 것으로 밝혀졌다.
이에, 상기 락토바실러스 속 균주를 이용하여 사균체를 제조하였으며, 마이크로플루다이저(microfludizer)를 이용하여 사균체의 크기를 나노화하는 과정에서 항산화 효과가 현저히 향상될 수 있음을 규명하였는 바, 락토바실러스 속 나노 사균체를 제공하고자 한다.
구체적으로, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 파라플란타룸 AMI-1101(Lactobacillus paraplantarum AMI-1101), 락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(Lactobacillus plantarum AMI-1103) 및 락토바실러스 브레비스 AMI-1109(Lactobacillus brevis AMI-1109)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
구체적으로, 상기 사균체는 락토바실러스 파라플란타룸 AMI-1101(Lactobacillus paraplantarum AMI-1101), 락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(Lactobacillus plantarum AMI-1103) 및 락토바실러스 브레비스 AMI-1109(Lactobacillus brevis AMI-1109)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 락토바실러스 속 나노 사균체일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 사균체는 락토바실러스 파라플란타룸 AMI-1101(Lactobacillus paraplantarum AMI-1101), 락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(Lactobacillus plantarum AMI-1103) 및 락토바실러스 브레비스 AMI-1109(Lactobacillus brevis AMI-1109)를 포함하는 락토바실러스 속 복합 나노 사균체일 수 있다.
본 발명의 “락토바실러스 파라플란타룸AMI-1101(수탁번호 KCCM12383P)”는 제주도 김치로부터 분리 및 동정된 락토바실러스 파라플란타룸의 유산균의 일 종이다. 락토바실러스 파라플란타룸 AMI-1101균주에 관하여는 한국등록특허 제 10-1961149호를 참고할 수 있다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(KCCM12384P)”은 제주도 김치로부터 분리 및 동정된 락토바실러스 플란타룸의 신규한 유산균이다.
본 발명의 “락토바실러스 브레비스 AMI-1109(KCCM12385P)”은 제주도 김치로부터 분리 및 동정된 락토바실러스 브레비스의 신규한 균주이다. 락토바실러스 브레비스 AMI-1109균주에 관하여는 한국등록특허 제 10-1968242호를 참고할 수 있다.
상기 락토바실러스 속 나노 사균체는 마이크로플루다이저를 이용하여 특정 압력에서 나노화시킨 것일 수 있다. 구체적으로 상기 압력은 10,000 psi 내지 20,000 psi 일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 나노 사균체의 크기는 700 nm 이상 1,000 nm 이하일 수 있다. 보다 구체적으로는 750 nm 이상 990 nm 이하일 수 있다. 보다 더 구체적으로 790 nm 이상 990 nm 이하일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 나노 사균체의 크기를 측정한 결과, 일반 사균체의 크기는 1,000 nm 를 초과하는 반면, 락토바실러스 속 복합 사균체의 크기는 1,000 nm 이하임을 확인하였다(표 1).
본 발명의 일 실시예에서는 자유라디칼(free radical) 소거활성을 측정하여 항산화 효과를 확인한 결과, 나노 사균체의 항산화 효과가 일반 사균체와 비교하여 현저히 향상됨을 확인하였다(도 3).
상기 항산화용 조성물은 피부 보습 용도를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물은 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 필라그린(Filaggrin) 발현량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 나노 사균체를 접종하여 히알루론산 및 필라그린 발현량을 측정한 결과, 상기 보습 인자의 발현을 촉진시켰으며, 특히 일반 사균체에 비해 히알루론산의 발현 증가량이 뛰어남을 확인하였다 (도 4 내지 도 5).
본 발명의 다른 측면은 상기 항산화용 조성물을 포함하는 화장료 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 화장료 조성물은 항산화용 및/또는 피부 보습 용도일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 락토바실러스 속 나노 사균체의 피부 각질세포(HaCaT cell) 내 세포독성이 없음을 확인하였는 바(도 3), 상기 나노 사균체를 항산화용 및/또는 피부 보습용 화장료 조성물 또는 피부 외용제로 활용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
구체적으로 화장료 조성물에 있어서, 상기 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.005중량% 내지 30.0중량% 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는 0.01중량% 내지 20중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 우수한 피부 미백 효과가 나타나는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 피부에 직접 도포하거나 살포하는 등의 경피 투여 방법으로 사용될 수 있으며, 본 발명 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 사용량은 연령, 병변의 정도 등의 개인 차이나 제형에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 1일 1회 내지 수회 적?韜?을 피부에 도포하여 1 주일 내지 수개월 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 항산화 용도 및/또는 피부 보습 용도일 수 있다.
상기 식품 조성물은 사람, 반려동물 용도를 모두 포함하며, 예컨대 반려동물은 강아지, 고양이, 햄스터, 토끼, 닭, 이구아나, 기니피그, 저빌, 달팽이, 라쿤, 앵무새, 도마뱀, 열대어를 포함한 어류 등 인간과 더불어 살아가는 동물은 종류 불문하고 모두 포함한다.
본 발명의 락토바실러스 속 나노 사균체를 첨가할 수 있는 식품은 육류, 빵, 소시지, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조식품 등이 있다.
상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 정제 형태의 건강기능식품은 용암해수 미네랄수, 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 고미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 용암해수 미네랄수 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있다. 연질캅셀제는 용암해수 미네랄수 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 솔비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 환 형태의 건강기능식품은 용암해수 미네랄수, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
상기 과립 형태의 건강기능식품은 용암해수 미네랄수, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 고미제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 고미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 것으로 그 기능 등의 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품의 종류는 식품 첨가제일 수 있으며, 상기 식품 첨가제는 식품의 제조, 가공, 또는 보존을 위해 식품에 첨가, 혼합, 침윤 기타의 방법에 의해 사용되는 물질을 의미한다. 상기 식품 첨가제는 천연물과 합성품이 있으며, 기능과 용도에 따라 분류할 수 있다. 현재 한국에 식품첨가물로 허가되어 있는 품목은 화학적 합성품 370여종, 천연첨가물 50여종이며, 주로 용도에 따라 보존료, 살균제, 산화방지제, 착색료, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 증점제(호료) 및 안정제, 피막제, 껌 기초제, 소포제, 용제, 이형제, 방충제, 품질개량제와 기타 식품제조용 첨가제 등으로 분류되어 쓰이고 있다.
상기 식품첨가제의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액상 형태를 포함할 수 있으며 구체적으로는 캡슐의 형태일 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 a) 락토바실러스(Lactobacillus) 속 발효균체를 사멸시키는 단계; 및 b) 마이크로플루다이저로 10,000 내지 20,000 psi로 나노화하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 나노 사균체 제조방법에 관한 것이다.
상기 나노 사균체는 청보리에 락토바실러스 속 복합 균주를 접종하여 발효 균주를 수득한 뒤, 가열 멸균하여 사균체를 제조하였다. 상기 사균체를 마이크로플루다이저를 이용하여 10,000 psi 내지 20,000 psi의 압력으로 분쇄하여 제조할 수 있다.
구체적으로, 상기 a) 단계는 락토바실러스 속 발효균체를 100~160℃에서 10~60분간 가열하여 사멸시키는 단계일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 마이크로플루다이저 공법으로 나노 사균체를 제조함으로써 락토바실러스 속 복합 균체의 항산화 효과를 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다(도 2).
또한 본 발명의 일 실시예에서는 10,000 psi 또는 20,000 psi의 압력으로 마이크로플루다이저를 조절하여 사균체를 나노화시킬 경우, 자유라디칼 소거능 및 피부 보습인자 발현 촉진능이 현저히 향상되었는 바, 이는 마이크로플루다이저 공법을 이용한 나노 사균체 제조방법의 다양한 용도의 활용 가능성을 보여준다.
본 발명의 락토바실러스 속 나노 사균체는 항산화 및 피부 보습 효능이 우수하다.
또한, 상기 나노 사균체는 독성이 없으며, 인체에 적용하여도 부작용을 유발하지 않아 화장료 조성물 및 식품 조성물로의 활용도가 높다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야한다.
도 1은 락토바실러스 속 나노 사균체의 크기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 락토바실러스 속 나노 사균체의 항산화 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 락토바실러스 속 나노 사균체의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 속 나노 사균체의 히알루론산 생성량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 락토바실러스 속 나노 사균체의 필라그린 생성량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 락토바실러스 속 나노 사균체의 항산화 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 락토바실러스 속 나노 사균체의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 속 나노 사균체의 히알루론산 생성량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 락토바실러스 속 나노 사균체의 필라그린 생성량 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 서술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
실시예 1. 락토바실러스 속 복합 나노 사균체 제조
1-1. 청보리 발효물을 이용한 락토바실러스 속 사균체 제조
정제수로 세척하고 건조시킨 청보리 전초를 조분쇄하여 20배의 추출용매(정제수)로 121°C 15분간 고압 열수추출을 하였다. 발효를 위한 종균은 멸균된 유산균 배양배지(Lactobacillus MRS Broth, 디프코, 미합중국)에서 배양된 유산균 락토바실러스 플란타룸 AMI-1101(Lactobacillus paraplantarum AMI-1101), 락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(Lactobacillus plantarum AMI-1103) 및 락토바실러스 브레비스 AMI-1109(Lactobacillus brevis AMI-1109)을 사용하였으며 배양이 완료된 후 균체만 회수하여 1x107 cfu/ml 농도로 청보리 추출물에 접종하였다. 발효는 발효조를 이용하여 1~3일간, 25~35°C로 유지하며 진행하였다. 발효가 완료된 청보리 발효물은 0.2 μm 여과지를 이용하여 필터에 남은 균체를 분리하였다. 필터 표면에 남겨진 균체를 정제수로 씻어내어 회수 한 후, 원신분리기를 이용하여 침천된 균체만을 회수하였다. 상기 발효 균체를 100~160℃에서 10~60분간 가열하여 사멸시킨 후, 멸균하여 동결건조 분말화하였다.
1-2. 락토바실러스 속 복합 사균체의 나노화
동결건조 사균체 파우더를 70% EtOH에 0.01%로 혼합하여 준비된 샘플을 마이크로플루다이저(Microfludizer)를 이용하여 10,000, 15,000, 20,000 psi의 압력 별로 각 3회씩 반복하여 균질화 후 회수하였다. 회수한 나노 사균체를 40°C 저온 진공 농축 한 후, 동결건조하여 분말화하였다.
비교예 1. 일반 락토바실러스 속 복합 사균체 제조
정제수로 세척하고 건조시킨 청보리 전초를 조분쇄하여 20배의 추출용매(정제수)로 121°C 15분간 고압 열수추출을 하였다. 발효를 위한 종균은 멸균된 유산균 배양배지(Lactobacillus MRS Broth, 디프코, 미합중국)에서 배양된 유산균 락토바실러스 플란타룸 AMI-1101(Lactobacillus paraplantarum AMI-1101), 락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(Lactobacillus plantarum AMI-1103) 및 락토바실러스 브레비스 AMI-1109(Lactobacillus brevis AMI-1109)을 사용하였으며 배양이 완료된 후 균체만 회수하여 1x107 cfu/ml 농도로 청보리 추출물에 접종하였다. 발효는 발효조를 이용하여 1~3일간, 25~35°C로 유지하며 진행하였다. 발효가 완료된 청보리 발효물은 0.2 μm 여과지를 이용하여 필터에 남은 균체를 분리하였다. 필터 표면에 남겨진 균체를 정제수로 씻어내어 회수 한 후, 원신분리기를 이용하여 침천된 균체만을 회수하여 정제수로 제거된 추출물 상등액의 1/10만큼 다시 혼합한 후, 멸균하여 동결건조 분말화 하였다.
실험예 1. 락토바실러스 속 나노 사균체의 크기 확인
상기 실시예 및 비교예의 사균체를 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)으로 관찰하였다.
각 사균체의 크기는 하기 표 1에 나타내었다.
| 구분 | 일반 사균체 (비교예 1) |
나노 사균체 (10,000 psi) |
나노 사균체 (15,000 psi) |
나노 사균체 (20,000 psi) |
| 크기 | 1455.9 nm | 971.9 nm | 985.3 nm | 799.0 nm |
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 나노 사균체의 크기는 모두 10,000 nm 이하로 일반 사균체에 비해 크기가 작았으며, 구체적으로 10,000 psi의 압력에서 사균체의 크기가 971.9 nm이고, 15,000 psi의 압력에서 985.3 nm이며, 20,000 psi에서 799.0 nm임을 확인하였다(도 1).
실험예 2. 락토바실러스 속 복합 나노 사균체의 세포독성 확인
피부 각질 형성세포인 HaCaT 세포는 Cell Line Service GmbH.(Germany)에서 분양 받아 100 units/ml 페니실린-스트렙토마이신 및 10 % 태아 소 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2항온기에서 배양하였으며, 3~4일 간격으로 계대배양을 시행하였다.
실시예의 피부 안전성을 확인하기 위해, EZ-사이톡스 분석(EZ-cytox assay)법을 이용하여 세포 독성 평가를 수행하였다. EZ-사이톡스 분석(EZ-cytox assay)은 살아있는 세포의 탈수소효소(Dehydrogenase)와 반응하여 주황색의 수용성 formazan을 생성하는 원리를 이용하여 세포생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.
구체적으로, 피부각질형성세포에서의 독성을 확인하기 위하여 HaCaT 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1 X 105 세포/mL로 24 웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 세포를 부착 시키고, 무혈청DMEM으로 교환하고 실시예 1의 나노 사균체를 24시간 동안 처리하였다. EZ-사이톡스를 세포 배양액에 처리하여 반응시키고 마이크로플레이트리더 (microplate reader)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.
| 세포 독성(%) | ||||
| 농도(μg/ml) | 2.5 | 5 | 10 | 20 |
| 나노 사균체 (10,000 psi) |
93.94 | 91.81 | 98.32 | 98.95 |
| 나노 사균체(15,000 psi) | 95.08 | 96.68 | 93.24 | 104.36 |
| 나노 사균체(20,000 psi) | 90.54 | 100.14 | 93.11 | 98.25 |
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 상기 나노 사균체는 농도에 상관 없이 세포 생존율이 우수하게 나타났다. 이와 같은 결과는 나노사균체가 인체에 무해할 뿐만 아니라 인체 안전성이 우수함을 시사한다(도 2).
실험예 3. 락토바실러스 속 복합 나노 사균체의 항산화 효과 확인
ABTS+[2,2'-아지노-비즈(3-에틸 벤조티아졸린-6-술폰산(ABTS+[2,2'-Azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)]) 라디칼 소거활성은 수소 공여 항산화제(hydrogen-donating antioxidants)와 연쇄절단형 항산화제(chainbreaking antioxidants) 모두를 측정할 수 있으며 수용상(aqueous phase)과 유기상(organic phase) 모두에 적용 가능한 측정방법이다.
7 mM ABTS 용액에 과황화칼륨(potassium persulfate)이 2.45 mM 이 되도록 혼합한 후 암소에서 약 24시간 반응시키고 ABTS+ 용액을 시료와 혼합하여 암소에서 6분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 추출물 시료 처리군과 무처리군을 비교하여 하기 식 1을 이용한 계산을 통해 라디칼의 소거활성을 백분율(%)로 나타내었으며, 양성대조군으로 BHT를 사용하였다.
[식 1]
ABTS 소거활성(%) = [1 - (실시예 또는 비교예 시료처리군의 흡광도/ 시료 무처리군의 흡광도)] X 100
그 결과, 마이크로플루다이저로 나노화시킨 락토바실러스 나노 사균체의 항산화 효능이 일반 나노 사균체에 비해 현저히 향상 되었으며, 마이크로플루다이저를 10,000 psi 또는 20,000 psi의 크기로 락토바실러스 속 사균체를 나노화시킬 때 항산화 효과가 특히 뛰어남을 확인하였다(도 3).
실험예 4. 락토바실러스 속 복합 나노 사균체의 보습 효과 확인
4-1. 히알루론산(Hyaluronic Acid) 생성량 증가효과 확인
실시예 및 비교예의 보습 효과를 확인하기 위하여 히알루론산 생성량 증가효과를 확인하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, HaCaT 세포를 24 웰(well) 플레이트에 1.0 × 105 cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 무혈청DMEM으로 교환하고 실시예 1 및 비교예1을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양 배지를 걷어 15,000 rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 걷어내어 정량 전까지 냉동보관(-20℃) 하였다. 효소면역측정법(ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)은 히알루론산 ELISA 키트(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.
| 히알루론산(Hyaluronic Acid) 생성량 증가(%) | ||
| - | 농도 (μg/ml) | % |
| - | - | 100 |
| 일반 사균체 (비교예 1) |
2.5 | 108.67 |
| 5 | 117.99 | |
| 10 | 124.13 | |
| 20 | 132.04 | |
| 나노 사균체 (10,000 psi) |
2.5 | 122.92 |
| 5 | 124.60 | |
| 10 | 147.07 | |
| 20 | 147.87 | |
| 나노 사균체 (15,000 psi) |
2.5 | 112.19 |
| 5 | 118.44 | |
| 10 | 128.44 | |
| 20 | 128.58 | |
| 나노 사균체 (20,000 psi) |
2.5 | 127.41 |
| 5 | 122.22 | |
| 10 | 146.59 | |
| 20 | 153.08 | |
| 레티노익산 | 10 μM | 130.06 |
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 상기 락토바실러스 속 복합 나노 사균체를 처리할 때 일반 사균체와 비교하여 히알루론산 생성량이 현저히 증가됨을 확인하였다(도 4).
4-2. 필라그린(Filaggrin) 생성량 증가효과 확인
HaCaT 세포를 24 웰(well) 플레이트에 1.0 × 105 cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 무혈청DMEM으로 교환하고 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 각 군마다 배양액 제거 및 PBS로 세척 후 단백질 정량에 영향을 줄 수 있는 약물이 포함되지 않은 PBS를 처리하였다. 저온, 상온 인큐베이션(incubation)을 반복하여 세포를 용해시킨 후 단백질을 수거하였다. 정량은 Filaggrin-ELISA 키트(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었다.
| 필라그린(FLG) 생성량 증가(%) | ||
| - | 농도 (μg/ml) | % |
| - | - | 100 |
| 일반 사균체 (비교예 1) |
2.5 | 112.17 |
| 5 | 105.40 | |
| 10 | 138.70 | |
| 20 | 160.52 | |
| 나노 사균체 (10,000 psi) |
2.5 | 114.86 |
| 5 | 102.28 | |
| 10 | 137.46 | |
| 20 | 160.66 | |
| 나노 사균체 (15,000 psi) |
2.5 | 86.99 |
| 5 | 94.11 | |
| 10 | 152.52 | |
| 20 | 169.49 | |
| 나노 사균체 (20,000 psi) |
2.5 | 109.63 |
| 5 | 114.18 | |
| 10 | 114.47 | |
| 20 | 140.76 | |
| 레티노익산 | 10 μM | 122.89 |
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 상기 락토바실러스 속 복합 나노 사균체는 필라그린의 생성을 촉진시키며, 사균체의 농도 의존적으로 필라그린 생성량이 증가됨을 확인하였다(도 5).
상기와 같은 결과는 본 발명의 락토바실러스 속 복합 나노 사균체가 전반적으로 피부 보습 관련 인자의 생성을 촉진시키며, 특히 히알루론산 및 필라그린 생성 촉진 효과가 우수함을 보여주는 바 피부 보습 용도로써 다양하게 활용할 수 있음을 보여준다.
제조예 1. 락토바실러스 복합 나노 사균체를 함유하는 에센스 제조
하기의 표 5와 같이 에센스 제형의 화장료 조성물을 제조하였다(단위: 중량%).
| 원료명 | 함량(중량%) |
| 세테아릴알코올 | 2 |
| 세테아릴글루코사이드 | 1 |
| 호호바씨오일 | 5 |
| 실리카 | 0.5 |
| 글리세린 | 10 |
| 락토바실러스 속 복합 나노 사균체(실시예) | 0.01 |
| 정제수 | to 100 |
제조예 2. 락토바실러스 속 복합 나노 사균체 함유하는 크림 제조
하기의 표 6과 같이 크림 제형의 화장료 조성물을 제조하였다(단위: 중량%).
| 조성물 | 함량(중량%) |
| 락토바실러스 속 복합 나노 사균체 (실시예) |
0.01 |
| 스테아린산 | 15 |
| 에탄올 | 1 |
| 수산화칼륨 | 0.7 |
| 글리세린 | 5 |
| 프로필렌글리콜 | 3 |
| 방부제 | 적량 |
| 향 | 적량 |
| 정제수 | to 100 |
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단 일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12383P
수탁일자 : 20181112
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
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수탁일자 : 20181112
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12385P
수탁일자 : 20181112
Claims (10)
- 나노화된 락토바실러스(Lactobacillus) 속 사균체를 포함하며,
상기 락토바실러스 속 사균체는 락토바실러스 파라플란타룸 AMI-1101(Lactobacillus paraplantarum AMI-1101), 락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(Lactobacillus plantarum AMI-1103) 및 락토바실러스 브레비스 AMI-1109(Lactobacillus brevis AMI-1109)의 복합 발효 사균체인, 항산화 및 피부 보습용 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 사균체의 크기는 700 nm 이상 1000 nm 이하인, 항산화 및 피부 보습용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 히아루론산(Hyaluronic acid) 및 필라그린(Filaggrin) 발현량을 증가시키는 것인, 항산화 및 피부 보습용 조성물. - 제1항의 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는 식품 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 식품 조성물은 반려 동물용인 것인, 식품 조성물. - a) 락토바실러스(Lactobacillus) 속 발효 균체를 사멸시키는 단계; 및
b) 마이크로플루다이저(microfludizer)로 10,000 내지 20,000 psi로 나노화하는 단계를 포함하며,
상기 락토바실러스 속 발효 균체는 락토바실러스 파라플란타룸 AMI-1101(Lactobacillus paraplantarum AMI-1101), 락토바실러스 플란타룸 AMI-1103(Lactobacillus plantarum AMI-1103) 및 락토바실러스 브레비스 AMI-1109(Lactobacillus brevis AMI-1109)의 복합 발효 균체인, 나노화된 락토바실러스 속 사균체 제조방법. - 삭제
- 제8항에 있어서,
상기 a) 단계는 락토바실러스 속 발효 균체를 100~160℃에서 10~60분간 가열하여 사멸시키는 단계인, 나노화된 락토바실러스 속 사균체 제조방법.
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