KR102194314B1 - 락토바실러스 람노서스 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 화장료 조성물 - Google Patents

락토바실러스 람노서스 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 람노서스를 이용한 녹차 발효 추출물에 관한 것이다. 상기 녹차 발효 추출물은 항산화, 미백 및 보습 효과가 우수한 프로바이오틱스 조성물로, 피부 미용 증진을 위한 용도에 다양하게 활용될 수 있다.

Description

락토바실러스 람노서스 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 화장료 조성물{ANTIOXIDANT OR SKIN MICROBIOME BALANCE COSMETIC COMPOSITION COMPRISING GREEN TEA FERMENTED EXTRACT FERMENTED BY INOCULATING LACTOBACILLUS RHAMNOSUS STRAIN}
본 발명은 락토바실러스 람노서스를 이용한 녹차 발효 추출물에 관한 것이다. 상기 녹차 발효 추출물은 항산화, 미백 및 보습 효과가 우수한 프로바이오틱스 조성물로, 피부 미용 증진을 위한 용도에 다양하게 활용될 수 있다.
피부는 신체의 외부를 덮고 있는 하나의 막으로 여러 가지 외부의 자극, 장해, 건조 등의 환경요소로부터 신체를 보호해 주는 다양한 생리적 기능을 수행하여 내부 장기와 그 밖의 체내 기관을 보호 조절하는 역할을 한다.
그러나, 피부는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적 기능이 저하되어 신진 대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되게 된다. 또한 광 또는 열에 반복적인 노출로 인해 피부의 외양 또는 기능이 변하게 되는데, 이로 인해 자유라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스 등은 피부의 정상 기능 저하, 멜라닌 침착에 의한 기미, 주근깨 등의 생성 및 피부 노화현상을 촉진하여 피부를 손상시키게 된다.
이러한 피부노화 및 손상을 방지하여 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위하여 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻어진 생리 활성 물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부의 고유 기능을 유지시키고 피부 세포를 활성화시켜 피부 신진대사를 촉진하여 피부 건강을 유지하고자 하는 노력이 계속되고 있으며, 이에 따른 화장품, 피부 외용제 등이 개발되고 있다.
그러나, 이들 물질은 피부 적용시 자극, 홍반, 발적 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 피부 기능 개선 효과를 기대기 어려웠다. 따라서, 기존의 피부 외용제 조성물 보다 생체에 안전하고 효과가 높은 새로운 피부 외용제 조성물의 개발이 요구되고 있다.
한국등록특허 제10-2074383호
본 발명의 목적은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, “녹차(Camellia Sinensis)”는 차나무과에 속하는 상록활엽관목으로, 이 잎을 건조한 차는 다방면에 활용되고 있다. 특히 항산화 작용, 항암작용, 심혈관계에 있어 혈중 지질 감소 작용, 혈액 순환 촉진 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 “추출물”은 녹차의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액들의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 추출물은, 상기 녹차의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.
상기 녹차 추출물의 추출용매 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있다.
본 발명에서 “발효”는 발효 균주 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미한다. 발효 균주를 통한 발효과정을 거친 원료는 발효 전보다 최소 2배에서 최대 수십배의 효과가 증대되는 것으로 알려져 있다. 특히 발효를 거친 대사물질은 피부에 좋은 각종 아미노산, 유기산, 항산화물질을 함유하여 피부대사를 촉진시켜 피부결을 매끄럽게 가꿔줄 수 있으며, 발효과정을 거치면서 입자가 작아지고 중금속 등의 독성이 분해되어 피부트러블이나 알레르기 부작용을 완화시켜줄 수 있다고 알려져 있다.
구체적으로, 상기 발효 균주는 락토바실러스 람노서스일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 락토바실러스 람노서스는 락토바실러스 람노서스 AMI-1301(Lactobacillus rhamnosus AMI-1301) KCCM12741P일 수 있다.
상기 “락토바실러스 람노서스 AMI-1301(Lactobacillus rhamnosus AMI-1301)”는 유아의 피부에서 분리 및 동정된 락토바실러스 람노서스의 신규한 유산균으로, 한국미생물보존센터에 2020년 6월 3일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM12741P).
본 발명에서, “항산화”란, 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질과 산화억제물질이 균형을 이루고 있으나, 여러 가지 요인들로 인하여 이러한 균형 상태를 잃고 산화를 촉진하는 방향으로 기울게 되면, 생체 내에 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 세포손상 및 병리적 질환을 유발하게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 화학적으로 불안정하고 반응성이 높아 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 여러 생체물질과 쉽게 반응할 수 있으며, 생체 내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 암 등을 초래하게 되고, 노화의 직접적인 원인이 되기도 한다. 이러한 활성 산소종을 제거하거나 감소시킴으로써 항산화 효과를 얻어 노화를 방지하고 건강을 유지할 수 있게 된다.
본 발명에서 “마이크로바이옴(microbiome)”은 미생물군집(microbiota) 및 유전체(genome)의 합성어로서 인간, 동식물, 토양, 바다, 호수, 암벽, 대기 등에 공존하는 미생물 군집과 유전체 전체를 의미한다. 그 중에서 피부 내 마이크로바이옴은 피부 내에 존재하는 미생물과 미생물, 숙주와 미생물 간의 복잡한 상호관계를 이루는 미생물군으로서, 인간 마이크로바이옴의 일부를 일컫는다.
상기 “피부 마이크로바이옴 균형 유지”는 피부 내 유익균을 증식시키거나, 피부 내 유해균의 증식을 억제함으로써 피부 내 미생물군집의 균형을 증진시키고, 피부 환경을 개선시키는 것을 의미한다.
본 발명에서는 녹차 추출물을 신규 균주인 락토바실러스 람노서스 AMI-1301 균주로 발효시킬 경우, 기존 공지된 락토바실러스 람노서스 균주를 이용한 녹차 발효 추출물에 비해 항산화 효과가 현저하게 증가하고, 피부 마이크로바이옴 균형 유지에 효과적임을 확인하였는 바, 락토바실러스 람노서스 AMI-1301 균주로 발효시킨 항산화 용도의 녹차 발효 추출물을 제공하고자 한다.
구체적으로 상기 마이크로바이옴 균형 유지는 피부 유익균을 증진시키거나 또는 피부 유해균을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 “피부 유익균 증진”이란, 피부 속에는 2 cm2당 약 1000가지 종류의 200만개 이상의 미생물이 존재하는데 이 중 피부 내 유익균의 생육 및 활성을 증진시킴으로써 피부 내 미생물 균형을 유지하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “피부 유해균 억제”란, 피부 내 유해균의 증식을 억제하거나 유해균을 불활성화 시킴으로써 피부 내 미생물 균형을 유지하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 녹차 추출물에 락토바실러스 람노서스 AMI-1301 균주로 접종하고 자유라디칼(free radical) 소거활성을 측정하여 항산화 효과를 확인한 결과, 상기 발효 추출물이 기존 공시 균주인 락토바실러스 람노서스로 발효시킨 녹차 발효 추출물에 비해 항산화 효과가 현저히 상승되는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2).
본 발명의 일 실시예에서는 상기 화장료 조성물이 피부 유익균의 증식을 촉진시키면서 유해균의 증식을 억제하여, 피부 속 마이크로바이옴 균형이 증진될 수 있음을 확인하였다(표 4 및 표 6).
상기 조성물은 피부 미백 또는 피부 보습 용도를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 “미백”이란, 피부의 톤을 밝게 하는 것으로, 멜라닌의 과도한 합성이나, 티로시네이즈 효소의 활성, 멜라닌의 생성 등으로 인한 기미, 주근깨 등의 다양한 색소 침착을 완화 또는 개선시키는 것이다. 상기 미백효과를 통해 피부톤 또는 안색이 개선될 수 있다.
본 발명에서 “피부 보습”이란 피부에 수분을 공급하여 보충하거나, 피부의 수분이 빠져나가지 않도록 보호하는 것을 모두 포함한다. 일반적으로 피부의 수분량은 진피층에서는 약 70% 정도이나 표피층으로 갈수록 감소하여 각질층에서는 약 10 내지 30%가 된다. 이러한 세포 층의 수분함량이 10% 이하로 되면 피부가 거칠어지고 신체 보호 기능이 약화되어 노화 현상이 나타나게 되는 바, 수분 공급 및 보습은 피부 보호에 중요하다.
본 발명의 일 실시예에서는 락토바실러스 람노서스 AMI-1301 균주를 이용하여 수득한 녹차 발효 추출물을 처리하는 경우, 티로시네이즈 활성 억제 효과가 현저히 증가하였는 바(도 3), 미백 용도, 전체적인 피부 안색 및 피부톤 개선 용도로 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 피부 보습인자인 히알루론산(Hyaluronic Acid)의 생성량을 측정한 결과, 락토바실러스 람노서스 AMI-1301로 발효시킨 녹차 발효 추출물에서 현저히 가하는 효과가 나타났는 바, 피부 수분 함량 증가를 통한 피부 보습에 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다(표 3).
상기 녹차 발효 추출물은 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 범위 내에서 우수한 항산화, 미백 및 보습 효과가 나타나는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 수딩젤, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 바디워시, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 폼 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 피부에 직접 도포하거나 살포하는 등의 경피 투여 방법으로 사용될 수 있으며, 본 발명 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 사용량은 연령, 병변의 정도 등의 개인 차이나 제형에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 1일 1회 내지 수회 적?韜?을 피부에 도포하여 1 주일 내지 수개월 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 락토바실러스 람노서스 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 식품 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 락토바실러스 람노서스는 락토바실러스 람노서스 AMI-1301(Lactobacillus rhamnosus AMI-1301) KCCM12741P일 수 있다.
상기 “녹차 발효 추출물”, “락토바실러스 람노서스 AMI-1301”에 관한 설명은 전술한 바와 동일하다.
상기 식품 조성물은 사람, 반려동물을 모두 포함하며, 예컨대 반려동물은 강아지, 고양이, 햄스터, 토끼, 닭, 이구아나, 기니피그, 저빌, 달팽이, 라쿤, 앵무새, 도마뱀, 열대어를 포함한 어류 등 인간과 더불어 살아가는 동물은 종류 불문하고 모두 포함한다.
본 발명의 녹차 발효 추출물을 첨가할 수 있는 식품은 육류, 빵, 소시지, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조식품 등이 있다.
상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 식품의 종류는 식품 첨가제일 수 있으며, 상기 식품 첨가제는 식품의 제조, 가공, 또는 보존을 위해 식품에 첨가, 혼합, 침윤 기타의 방법에 의해 사용되는 물질을 의미한다. 상기 식품 첨가제는 천연물과 합성품이 있으며, 기능과 용도에 따라 분류할 수 있다. 현재 한국에 식품첨가물로 허가되어 있는 품목은 화학적 합성품 370여종, 천연첨가물 50여종이며, 주로 용도에 따라 보존료, 살균제, 산화방지제, 착색료, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 증점제(호료) 및 안정제, 피막제, 껌 기초제, 소포제, 용제, 이형제, 방충제, 품질개량제와 기타 식품제조용 첨가제 등으로 분류되어 쓰이고 있다.
상기 식품첨가제의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액상 형태를 포함할 수 있으며 구체적으로는 캡슐의 형태일 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 녹차 발효 추출물을 식품용 조성물로 사용할 경우, 상기 녹차 발효 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 녹차 발효 추출물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 나아가, 피부 미용 증진 용도로서 각종 생활용품, 반려용품 등에 제한되지 않고 적용될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 람노서스를 이용한 녹차 발효 추출물은 항산화 활성을 통한 피부 노화 방지에 우수한 효과가 있을 뿐 아니라, 피부 미백 및 보습 효과를 가진다. 따라서, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 피부 노화방지, 미백 및 보습을 통하여 우수한 피부 미용 증진 효과를 나타낼 수 있기 때문에, 화장품, 기능성 식품의 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야한다.
도 1은 녹차 발효 추출물의 DPPH(2,2-Diphenyl 1-picrylhydrazyl radical) 자유라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 녹차 발효 추출물의 ABTS+[2,2'-Azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)] 자유라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 녹차 발효 추출물의 티로시네이즈 억제 활성(Tyrosinase inhibition assay)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 녹차 발효 추출물의 제조
정제수로 세척하고 건조시킨 녹차 전초를 조분쇄하여 20 배의 추출용매(정제수)로 121℃ 15분간 고압 열수추출 하였다.
발효를 위한 종균은 멸균된 유산균 배양배지(Lactobacillus MRS Broth, 디프코, 미합중국)에서 배양된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 사용하였으며, 배양이 완료된 후 1x109 cfu/ml 농도로 녹차 추출물에 접종하였다. 이때, 발효 균주는 유아 피부에서 직접 분리한 락토바실러스 람노서스 AMI-1301(Lactobacillus rhamnosus AMI-1301) KCCM12741P 를 이용하였다.
발효는 발효조를 이용하여 1~3일간, 25~35°C로 유지하며 진행하였다. 발효가 완료된 녹차 발효물은 원심분리하여 균체를 제거하고 0.2 μm 여과지를 이용하여 최종 여과하였다. 추출 여과된 녹차 추출물은 동결건조하여 사용하였다.
비교예 1. 녹차 추출물의 제조
정제수로 세척하고 건조시킨 녹차 전초를 조분쇄하여 20 배의 추출용매(정제수)로 121℃ 15분간 고압 열수추출 하였다.
비교예 2. 녹차 발효 추출물(락토바실러스 람노서스 공시 균주 이용)의 제조
상기 실시예 1과 녹차 발효 추출물의 제조방법은 동일하다. 다만, 락토바실러스 람노서스를 한국 미생물 보존센터에서 분양받은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCCM 32405를 이용하여 발효하였다.
실시예 및 비교예는 하기 표 1에 나타내었다.
구분 구성 발효 균주
실시예 1 녹차 락토바실러스 람노서스 AMI-1301 KCCM12741P
비교예 1 -
비교예 2 락토바실러스 람노서스 KCCM 32405
실험예 1. 녹차 발효 추출물의 항산화 효능 확인
1-1. DPPH 자유라디칼 소거 활성 평가
본 발명의 녹차 발효 추출물의 항산화 효능을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1 및 비교예 1, 2 녹차 발효 추출물의 자유라디칼 소거 활성(free radical scavenging activity)을 평가하였다.
DPPH 측정법은 억제제(inhibitor)가 안정한 라디칼 DPPH(2,2-Diphenyl 1-picrylhydrazyl radical)를 소거하여 탈색되는 정도를 515 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다. 구체적으로, DPPH 용액 100 μL 에 상기 녹차 발효 추출물 100 μL 를 첨가한 뒤 빛을 외부로부터 차단하여 20 분간 상온에서 반응시킨 다음 515 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 흡광도의 감소 비율로서 항산화 활성도를 나타내었다. 상기 대조군은 비타민C를 이용하였고, 라디칼 DPPH의 50% 소거하는 농도(SC50)를 측정하고, 이를 대조군과 비교하였다.
[식 1]
DPPH 소거활성(%) = [1 - (실시예 또는 비교예 시료처리군의 흡광도/ 시료 무처리군의 흡광도)] X 100
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 락토바실러스 람노서스 AMI-1301의 균주로 발효시킨 녹차 발효 추출물의 자유라디칼 소거능이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.
1-2. ABTS 자유라디칼 소거 활성 평가
실시예 1 및 비교예 1, 2의 녹차 발효 추출물의 자유라디칼 소거 활성(free radical scavenging activity)을 평가하였다.
ABTS 측정법은 항산화제가 청녹색의 라디칼 ABTS+[2,2'-아지노-비즈(3-에틸 벤조티아졸린-6-술폰산](ABTS+[2,2'-Azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)])을 소거하여 무색의 ABTS로 전환되는 정도를 700 nm에서 측정하는 방법이다. 구체적으로, 7 mM ABTS 용액에 과황산칼륨(potassium persulfate)이 2.45 mM이 되도록 혼합한 후 암소에서 약 24시간 반응시키고 ABTS+ 용액을 시료와 혼합하여 암소에서 20분간 반응시켜 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 대조군은 비타민C를 이용하였고, 라디칼 ABTS의 50% 소거하는 농도(SC50)를 측정하고, 이를 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 락토바실러스 람노서스 AMI-1301의 균주로 발효시킨 녹차 발효 추출물의 자유라디칼 소거능이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 녹차 발효 추출물이 녹차 추출물 또는 기존 공지된 락토바실러스 람노서스 균주와 비교하여 우수한 항산화 활성을 가짐을 보여주는 바, 상기 조성물을 항산화 활성 증진을 목적으로 활용할 수 있음을 시사한다.
실험예 2. 녹차 발효 추출물의 미백 효과 확인
락토바실러스 람노서스를 이용한 녹차 발효 추출물의 미백 효과를 확인하기 위하여 티로시네이즈 억제 활성(Tyrosinase inhibition assay)을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 0.1 M 포타슘 포스페이트 버퍼 (pH 6.8), 2 mM L-티로신(L-tyrosine), 2500 유닛(unit)의 티로시네이즈 및 각 시료들을 농도별로 준비하였다. 96 웰(well) 플레이트에 버퍼 105 μL, L-티로신 70 μL, 티로시네이즈 5 μL, 및 시료용액 20 μL를 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨 후, ELISA 리더기(reader)를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시네이즈 저해율의 식은 아래 나타내었다. 이를 바탕으로 티로시네이즈의 활성을 50% 저해시키는데 필요한 시료의 농도(IC50)를 계산하였다. 이때 양성 대조군(positive control)으로는 알부틴(arbutin)을 사용하였다.
[식 1]
티로시네이즈 억제 활성 (%) = [1 - (B - C)/A] × 100
A: 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 흡광도
B: 시료 반응용액의 흡광도
C: 시료만의 흡광도
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 락토바실러스 람노서스 AMI-1301의 균주로 발효시킨 녹차 발효 추출물의 티로시네이즈 활성 억제 효과가 녹차 추출물 또는 기존 공지된 락토바실러스 람노서스 균주에 비해 현저히 향상됨을 확인하였는 바, 이는 본 발명의 녹차 발효 추출물이 피부 미백에 우수한 효과가 있음을 시사한다.
실험예 3: 녹차 발효 추출물의 보습 효과 확인
3-1. MTT 세포 생존력 분석 결과 확인
MTT 세포 생존력 분석(MTT Cell Viability Assay)는 인간 표피 상피 세포주 HaCaT을 사용하여 분석을 진행하였다.
상기 세포를 10% 우태아 혈청 (Gibco) 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (Gibco)를 함유하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's media) 배지에서 37℃, 5% CO2하에 배양하였다. 상기 세포는 3~4일에 한번씩 계대배양하였다. 시료 처리는 HaCaT 세포를 24 웰에 각 웰당 1.0 x 105cells/mL로 분주한 후 24 시간 배양하고, 각 웰을 PBS로 2회 세척한 뒤 혈청이 없는(Free serum) 배지를 각 웰당 1 ml를 넣어 교환한 후 각 웰에 시료를 50~100 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 배양 후 MTT{3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide} 시약을 각 웰 당 500 μg/mL 농도로 배양액에 처리하고, 37℃에서 3시간 반응시킨 후 배양액을 제거하였다. 이후 세포 내 미토콘드리아의 산화환원효소에 의해 환원된 Formazan(보라색)을 DMSO로 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 측정하였다.
농도(μg/ml) MTT 세포 생존율
0 0
25 100
50 100.5
100 100.5
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 각 시료의 모든 농도에서 세포 독성은 확인되지 않았으며, 상기 결과는 상기 시료가 인체에 무해할 뿐만 아니라 인체 안정성이 우수함을 시사한다.
3-2. 보습인자 히알루론산(Hyaluronic Acid) 생성량 증가 효과 확인
히알루론산 함량 분석(Hyaluronic acid contents Assay)는 인간 표피 상피 세포주 HaCaT을 사용하였다. 상기 세포를 10% 우태아 혈청 (Gibco)와 1% 항생제 (페니실린 및 스트렙토마이신 50,000 units/mL, Gibco)를 함유하는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's media)에서 37℃, 5% CO2 하에 배양하였다. 세포는 3~4일에 한번씩 계대배양하였다. 샘플 처리는 HaCaT 세포를 24 웰에 각 웰당 1.0 x 105cells/mL로 분주한 후 24시간 배양하고, 각 웰을 PBS로 2회 세척 및 혈청이 없는(Free serum) 배지를 각 웰당 1 ml를 넣어 교환한 후 각 시료를 각 웰에 50~ 100 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 배양한 세포배양액을 수거하여 히알루론산 ELISA 키트(R&D Systems)를 이용해 히알루론산 농도를 측정하였다.
히알루론산(Hyaluronic Acid) 생성량 증가(%)
농도(ug/ml) 0 50
실시예 1 0 124.8
비교예 1 0 80
비교예 2 0 85.5
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 락토바실러스 람노서스를 이용한 녹차 발효 추출물이 녹차 추출물에 비해 보습 효과가 향상됨을 확인하였으며, 특히 락토바실러스 람노서스 AMI-1301로 발효시킨 녹차 발효 추출물의 히알루론산 생성량의 증가량이 현저함을 확인하였다.
실험예 4: 녹차 발효 추출물의 피부 마이크로바이옴 균형 유지 효과 확인
4-1. 피부 유익균 증식 효과 확인
유익균으로서 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 균주의 증식 촉진 효과가 있는지 여부를 확인하였다.
먼저, 스트렙토코커스 써모필러스는 케피어 그레인(Kefir grain)으로부터 선별배지를 활용하여 분리하였다. 0.002% BPB-MRS 배지를 사용하여 30℃에서 72시간 동안 혐기 배양을 하였다. 이후, 유산균 콜로니를 선택한 뒤 16S rRNA 시퀀싱을 실시하여 동정하였다.
이틀 전 미리 깨워 둔 균의 탁도를 2.0으로 맞춘 후 MRS 브로스 3 mL 가 담긴 튜브에 주입한 후, 101 CFU/mL로 희석시키고 초기 균 수를 측정하였다. 이후 3 mL MRS 브로스에 실시예 1의 조성물을을 5 mg 넣고 5분간 초음파 처리(50초 작동, 10초 간격, 5회 반복) 후, DMSO 0.1 % 주입하였다. 동일한 방법으로 3 mL MRS 브로스에 비교예 1 및 2 조성물을 첨가하였으며, 배양시킨 후 균수(CFU/mL)를 측정하였다.
구분 균수(CFU/mL)
실시예 1 3.25 x 107
비교예 1 4.46 x 106
비교예 2 4.45 x 106
그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 실시예 1에서 배양한 경우 비교예 1 및 2에서 배양한 것과 비교하여 생육이 현저히 증가함을 확인하였다.
4-2. 피부 유해균 증식 억제 효과 확인
25세에서 45세 사이의 여성 피험자(평균 연령 33. 8세) 10명을 대상으로 하기 표 5에 따라 제조한 에센스 제형의 화장료 조성물을 1일 2회 안면 피부에 도포한 후 2주 및 4주 후 안면 피부에서 유해균의 변화를 확인하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1 조성물,비교예 1 또는 2 조성물 10.0
세토스테아릴알콜 2.0
친유형글리세릴스테아레이트 1.5
글리세릴스테아레이트SE 1.5
피토스쿠알란 4.0
하이드로지네이티드폴리데센 3.0
디메치콘 0.5
폴리소르베이트 60 1.0
소르비탄세스퀴올리에이트 0.5
메틸파라벤 0.1
프로필파라벤 0.1
정제수 잔량
부틸렌글리콜 5.0
폴리아크릴레이트-13 0.5
합 100
먼저 온도와 습도가 일정한 상태(온도 23±2℃, 습도 50±5%) 안면의 양쪽 볼 부분 피부 표면 미생물을 스왑하였다. 스왑은 Quick Swab(3M 마이크로바이올로지, 미국)을 이용하였다. 이후 스왑한 헤드 부분을 멸균된 가위로 잘라 50 mL 코니칼 튜브에 넣고 FastDNA SPIN Kit(고마바이오텍, 한국)의 2X 비즈, 인산 나트륨(sodium phosphate), MT 버퍼를 넣고 20분간 볼텍싱한 후 미생물의 유전체를 추출한 후 Bac9F/Bac541R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(Meisel et al., 2016; Kong, 2016 참조). PCR 산물을 정제한 후 정제된 DNA 샘플을 Quant-iTTM PicoGreen® dsRNA 에세이 키트(인비트로젠, 미국)을 이용하여 정량하여 각각의 샘플이 동량의 DNA를 포함하도록 준비하였다. 이후 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 454 GS FLX 티타늄 시퀀싱 시스템(로쉐, 독일)을 이용하여 수행하였다. 상기 파이로 시퀀싱은 GS FLX 티타늄 시약을 이용하여 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
16S rDNA유전자로부터 OTUs를 기반으로 한 PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)의 생물 정보학 소프트웨어를 이용하여 미생물군집의 메타 유전자분석을 시행하였다. 유해균은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 대장균(Escherichia coli) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 대상으로 하였다.
구분 병원성 균주 시간에 따른 변화 (%)
0주 1주 2주
실시예 1 프로피오니박테리움 아크네스 70.04 61.09 38.31
대장균 0.025 0.020 0.009
황색포도상구균 0.055 0.014 0
비교예1 프로피오니박테리움 아크네스 70.04 63.05 45.15
대장균 0.025 0.022 0.018
황색포도상구균 0.055 0.009 0.004
비교예2 프로피오니박테리움 아크네스 70.04 63.80 44.21
대장균 0.025 0.022 0.015
황색포도상구균 0.055 0.011 0.002
그 결과, 상기 에센스를 피부에 일정기간 도포할 경우, 피부 유해균으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스, 대장균 및 황색포도상구균이 모두 감소됨을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명의 화장료 조성물이 피부 내 유익균 및 유해균의 생육을 조절하여 피부 마이크로바이옴 균형 유지에 효과적인 조성물임을 시사한다.
제조예 1. 본 발명의 락토바실러스 람노서스를 이용한 녹차 발효 추출물을 함유하는 에센스 제조
하기의 표 7과 같이 에센스 제형의 화장료 조성물을 제조하였다(단위: 중량%).
성분 함량(중량%)
녹차 발효 추출물(실시예 1) 10.0
세토스테아릴알콜 2.0
친유형글리세릴스테아레이트 1.5
글리세릴스테아레이트SE 1.5
피토스쿠알란 4.0
하이드로지네이티드폴리데센 3.0
디메치콘 0.5
폴리소르베이트 60 1.0
소르비탄세스퀴올리에이트 0.5
메틸파라벤 0.1
프로필파라벤 0.1
정제수 잔량
부틸렌글리콜 5.0
폴리아크릴레이트-13 0.5
합 100
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12741P 20200603

Claims (9)

  1. 락토바실러스 람노서스 AMI-1301(Lactobacillus rhamnosus AMI-1301) KCCM12741P 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로바이옴 균형 유지는 피부 유익균을 증진시키거나 또는 피부 유해균을 억제시키는 것인, 화장료 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 추출물의 용매는 물, 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매인, 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 피부 미백 또는 보습 용도를 추가로 더 포함하는 화장료 조성물.
  6. 락토바실러스 람노서스 AMI-1301(Lactobacillus rhamnosus AMI-1301) KCCM12741P 균주를 접종하여 발효시킨 녹차 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 식품 조성물.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 피부 미백 또는 보습 용도를 추가로 더 포함하는 식품 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 반려 동물용인 것인, 식품 조성물.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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KR102074383B1 (ko) 2019-04-26 2020-02-06 주식회사 락토메이슨 신규한 락토바실러스 람노서스 lm1011을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물
KR102119825B1 (ko) * 2019-10-15 2020-06-05 주식회사 아미코스메틱 현미, 녹차 및 포공영 발효 추출물을 포함하는 피부 내 마이크로바이옴 균형 유지용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법

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